JP2783361B2 - ほ乳類サイトカイン、il−11 - Google Patents
ほ乳類サイトカイン、il−11Info
- Publication number
- JP2783361B2 JP2783361B2 JP9051468A JP5146897A JP2783361B2 JP 2783361 B2 JP2783361 B2 JP 2783361B2 JP 9051468 A JP9051468 A JP 9051468A JP 5146897 A JP5146897 A JP 5146897A JP 2783361 B2 JP2783361 B2 JP 2783361B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- cell
- sequence
- protein
- dna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/20—Interleukins [IL]
- A61K38/2073—IL-11
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/5431—IL-11
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
細胞の機能を刺激する新規サイトカイン、およびこの因
子を得る方法および組換え遺伝子工学技術によるその製
法に関するものである。
節蛋白質の増加しつつある一群が同定された。これらの
調節分子はサイトカインとして知られている。サイトカ
イン類の多くは、造血および免疫系細胞の生長および発
達、並びに生物活性を制御することが見出されている。
これらの調節分子には、コロニー刺激因子(例、GM−
CSF、G−CSF、M−CSFおよびマルチCSFま
たはインターロイキン−3)、インターロイキン類(IL
−1ないしIL−9)、インターフェロン類(アルファ、
ベータおよびガンマ)、腫よう壊死因子(アルファおよび
ベータ)、エリスロポイエチン、マクロファージ阻止蛋
白質、腫よう増殖因子および白血病阻止因子(LIF)
が全て含まれる。これらのサイトカインは、骨髄、末梢
血、胎児肝臓、および他のリンパまたは造血器官からの
標的細胞による広い範囲の生物活性を呈する。例えば、
F.R.バークウィルおよびF.バーク、「イミュノロ
ジー・トゥデイ」、10(9):299(1989)、G.ウォン
グおよびS.クラーク、「イミュノロジー・トゥデ
イ」、9(5):137(1988)並びにS.C.クラークおよ
びR.カーメン、「サイエンス」、236:1229−1237(1
987)参照。ある種のサイトカイン類の生化学的および生
物学的同定および特性検定は、天然供給源、例えば血液
および尿から入手され得る少量の天然因子により妨害さ
れた。最近、サイトカイン類の多くは、分子クローン化
され、異種的に発現され、均一に精製された。これらの
精製因子の幾つかは、GM−CSF、M−CSF、G−
CSF、IL−1、IL−2、IL−3、IL−6、I
L−7、TNF、インターフェロン類およびエリスロポ
イエチンを含め、インビボ造血および免疫系に対して調
節作用を示すことが見出されている。
造血細胞の発達を刺激または促進し、医薬用途に適し
た、天然供給源から精製されるかまたは別法により均一
形態で製造される追加的蛋白質が要望されている。
のほ乳類蛋白質を含まない、IL−11と呼ばれる新規
ほ乳類サイトカインを提供する。この蛋白質は、組換え
遺伝子工学技術により製造され得る。また、それは、因
子を自然にまたは他の因子により誘導されて産生する細
胞供給源から精製され得る。また、IL−11は、化学
技術または上記で列挙した技術の組み合わせにより合成
され得る。
シル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド・ゲル電気泳
動においてIL−11cDNAトランスフェクションC
OS−1細胞から誘導された35Sメチオニン標識上清液
を分析することにより測定すると、約20kdの見かけ上
の分子量を特徴とする、約178アミノ酸蛋白質であ
る。成熟蛋白質について計算された分子量もまた約20
kdである。
で生物活性を表し、様々な造血および免疫機能の一般的
刺激因子としてのその役割を示している。この発明のI
L−11蛋白質は、IL−6依存性マウス・プラズマサ
イトーマ・セルライン、T1165において増殖活性を
示す。またIL−11は、予備検定においてB細胞の成
熟を直接的または間接的に刺激する能力を立証した。具
体的には、IL−11は、B細胞のT細胞依存的発達を
刺激すると考えられている。さらにそれは、血小板生成
細胞の増殖を刺激する検定でIL−3との相乗作用を示
すが、他の系列にも同様に作用し得る。
白質の発現をコードするDNA配列である。このDNA
配列は、上述されているほ乳類IL−11蛋白質の発現
をコードする単離されたDNA配列を含み得る。活性I
L−11をコードするDNA配列は、第1表と同一また
は実質的に同一のヌクレオチド配列またはそのフラグメ
ントを含むことを特徴とする。このDNA配列は、IL
−11暗号化配列に近接する5'および3'ほ乳類非暗号
化配列を含み得る。また、DNA配列は、アミノ末端シ
グナルペプチドをコードし得る。第1表は、これらの非
暗号化5'および3'近接配列並びに霊長動物セルライン
PU34から単離され、COS−1細胞で発現されたほ
乳類IL−11のシグナル配列を示している。
これらのフランキング(flanking)またはシグナル配列
の幾つかまたは全部を除外し得るものと理解される。さ
らに、生物活性ほ乳類IL−11蛋白質をコードする本
発明のDNA配列はまた、表1の単離されたDNA配列
と、適当な条件下でハイブリダイゼーションし得るか、
または遺伝子コードの縮重がなければ前記条件下でハイ
ブリダイゼーションし得るDNAを含み得る。すなわ
ち、この発明のDNA配列は、対立遺伝子的改変、種改
変または意図的な修飾に基づいた非暗号化配列、シグナ
ル配列または暗号化配列における修飾を包含または含有
し得る。
換えDNA分子およびほ乳類IL−11をコードするD
NA配列を提供する。DNA分子は、選択された宿主細
胞においてIL−11の複製および発現を指図し得る調
節配列を機能し得る形で随伴したIL−11DNAを提
供する。また、本発明は、組換えIL−11蛋白質の発
現に使用される、前記DNA分子により形質転換された
宿主細胞を提供する。
は、別の態様、すなわち組換えほ乳類IL−11蛋白質
またはそのペプチドフラグメントの新規製造方法で使用
される。この方法において、蛋白質発現を制御し得る適
当な調節または発現制御配列を機能し得る形で随伴した
IL−11蛋白質またはそのフラグメントの発現をコー
ドするDNA配列(または上記組換えDNA分子)によ
り形質転換されたセルラインは、組換えDNAの発現を
可能にする適当な条件下で培養される。次いで、この発
現されたIL−11蛋白質を、適当な慣用的手段により
宿主細胞または培養培地から採取する。この主張されて
いる方法は、蛋白質発現用宿主細胞として若干の既知細
胞を使用し得る。現時点でIL−11の製造に好ましい
セルラインは、ほ乳類セルラインおよび細菌細胞であ
る。
またはその1種もしくはそれ以上の生物活性ペプチドフ
ラグメントの治療有効量を含む医薬組成物を提供する。
これらの蛋白質またはペプチドフラグメントは、医薬的
に許容し得る賦形剤により製剤化され得る。これらの医
薬組成物は、造血細胞の数または活性レベルの欠乏を特
徴とする疾患状態の処置方法において、単独または他の
適当な薬剤と組み合わせた形で使用され得る。IL−1
1を含む医薬組成物はまた、免疫系の疾患、例えば免疫
不全症の処置に使用され得る。
作用した状態で血小板生成細胞の生長および分化を刺激
するのに使用され得る。追加的な使用領域には、血小板
形成、後天的な化学療法または骨髄関連血小板減少症が
ある。また、IL−11は、エフェクター分子として作
用することにより、他のサイトカインの機能を改善する
と思われる。IL−11組成物はまた、B細胞の産生ま
たは機能を直接的または間接的に刺激するのに有用であ
り得る。すなわち、IL−11組成物は、癌治療、感染
症の処置、創傷治癒の促進および免疫系全般の刺激に使
用され得る。IL−11はまた、ある種の抗原、特にワ
クチンに対する免疫応答を強化するのに使用され得る。
者に対し、適当な医薬用担体と共にIL−11またはそ
のペプチド・フラグメントの治療有効量を投与すること
による、これらおよび/または他の病的状態の処置方法
である。これらの治療方法は、IL−11またはそのペ
プチドフラグメントと同時またはそれに続いて少なくと
も1種の他のサイトカイン、ヘマトポイエチン、インタ
ーロイキン、成長因子または抗体の有効量を投与するこ
とを含み得る。
11またはそのペプチドを指向した抗体である。従っ
て、この態様の一部として、本発明は、前記の抗体を分
泌し得るセルラインおよびそれらの製造方法を主張して
いる。
記の本発明の好ましい態様の詳細な記載中に記載されて
いる。
び蛋白質様物質の随伴を実質的に含まない形態での、生
物活性ほ乳類サイトカイン、IL−11を提供する。こ
の蛋白質は、治療適用に有用な純粋活性IL−11の大
量生産を可能にする組換え技術により製造され得る。別
法として、この蛋白質は、それを分泌または発現するほ
乳類セルラインから精製された均一蛋白質として入手さ
れ得る。さらにIL−11またはその活性フラグメント
は、化学的に合成され得る。
健康なマカークサルから得られた骨髄細胞を置き、それ
らをレトロウイルスU19−5で感染させることにより
生長させた霊長動物セルラインから単離された[ドクタ
ー・ロジャー・コーン、タフツ・メディカル・スクー
ル]。適当な抗生物質とのインキュベーション後、PU
34と命名された生きたセルラインを、その生長特性に
関して選択し、エシェリヒア・コリで発現させたIL−
1アルファにより誘導した。条件培地は、IL−6に対
する中和性抗体の存在下、IL−6依存性マウス・プラ
ズマサイトーマ細胞を用いた増殖検定において活性を示
した。例えばG.G.ウォング等、「サイエンス」、2
28:810−815(1985)、Y.C.ヤング等、「セ
ル」、47:3−10(1986)、およびA.E.ナーメン
等、「ネイチャー」、333:571−573(1988)に
既に記載されている発現クローニング方法に従い、IL
−1−刺激(24時間2μ/mlIL−1)PU34細胞
mRNAからcDNAライブラリーを製造した。
てcDNA挿入体の発現を可能にする発現ベクター中に
ライブラリーを構築した。200−500cDNAクロ
ーンのプールから製造された5μgのDNAでCOS−
1細胞をトランスフェクションすることにより、ライブ
ラリーのスクリーニングを行った。T1165検定で活
性に関して上清液を検定することにより、IL−11活
性を発現するcDNAクローンが同定された。
pPU34−TRA(pC1R6とも呼ばれる)と命名さ
れ、配列決定された。表1は、IL−11ポリペプチド
の霊長動物およびヒト・クローンの両方のcDNA配列
およびアミノ酸配列(1文字コード)を示す。霊長動物
配列における1−721位のヌクレオチド配列は、pC
1R6から得られた。残りのヌクレオチド721−11
02は、pC1R6とのハイブリダイゼーションにより
単離された第2霊長動物cDNAから配列決定された。
IL−11のプラズマサイトーマ刺激活性をコードする
ヒトcDNAは、pPU34−TRA(pC1R6)から
の挿入体との直接ハイブリダイゼーションにより、ヒト
肺セルラインMRC5[ジャコブス等、「ネイチャ
ー」、227:43(1970)により記載]から製造されたc
DNAライブラリーから単離された。ヒトIL−11ヌ
クレオチド配列から見出される差異は、表1において霊
長動物配列の上に示されており、アミノ酸配列に生じた
変化は霊長動物配列における適当なアミノ酸の下に示さ
れている。
対を含む。霊長動物配列は、72塩基対の5'非暗号化
配列を含む。また、表1の配列は、431塩基の3'非
暗号化配列を示す。同じくヒト・ヌクレオチド配列は、
597ヌクレオチドの単一の長い転写解読枠を含んでい
た。
1の霊長動物ヌクレオチド73位から始まる非プロセシ
ング199アミノ酸ポリペプチドを予測させる単一の長
い転写解読枠を特徴とする。霊長動物およびヒト・クロ
ーンの両方から得られたIL−11の予測されたアミノ
酸配列における(1)位Metから(21)位Alaまでの最初
の21アミノ酸は、慣用的ほ乳類分泌リーダー配列
[D.ペールマン等、「ジャーナル・オブ・モレキュラ
ー・バイオロジー」、167:391−409(1983)]
と類似した疎水性アミノ酸の範囲を含む。成熟IL−1
1蛋白質のN−末端(表1の下線部)は、アミノ酸配列
PRO−GLY−PRO−PRO−PRO−GLYによ
り構成される。当該蛋白質は、まず199個のアミノ酸
から成る前駆体として合成され、これが21位と22位
のアミノ酸の間で蛋白質加水分解酵素的に開裂して、ア
ミノ酸22−23位の配列Pro−Glyから始まり、ヌク
レオチド671−672位のTGA終止コドンのアミノ
酸199位の後で終わる成熟178アミノ酸ポリペプチ
ドを与える。成熟蛋白質の計算された分子質量は、IL
−11cDNAトランスフェクションCOS−1細胞か
ら誘導された上清液のSDS−PAGE(還元条件)に
より現れた新規蛋白質帯の見かけ上の分子量と完全に対
応しており、両場合とも約20kdである。
を、ジェンバンクに記録されたヌクレオチド配列と比較
した。他の蛋白質の公表されたDNA配列とのヌクレオ
チド配列の重要な類似性は、全く見出されなかった。I
L−11のリーダー配列およびガンマ・インターフェロ
ンおよびIL−6の前記配列間からは、軽い相同性しか
見出されなかった。IL−11の暗号化配列および他の
公表されたポリペプチド配列間からは、重要な相同性は
全く見出されなかった。
れている通り、IL−11は、始原細胞のIL−3依存
性増殖の相乗的因子である。相乗作用の成果は、幹細胞
のG0期間の短縮である。少なくとも一つの培養システ
ムにおいて、IL−11は、IL−6と同様、血小板生
成細胞コロニー形成の促進においてIL−3と相乗的に
作用する[S.R.パウル等、「プロシーディングス・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシー
ズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリ
カ」、87:7512−7516(1990)]。すなわち、
IL−11、並びにG−CSFおよびIL−6は、初期
および後期造血リネッジと相互作用すると思われる。し
かしながら、同じく上記の相乗的因子であるIL−6と
は対照的に、IL−11は、貯蔵された芽細胞の二次培
養物においてマクロファージ増殖のみを優先的に刺激す
る。すなわち、IL−11は、他の既知リンホカイン
類、因子および蛋白質とは異なると思われる。IL−1
1はまた、リンパ様リネッジ内でのある役割を演じる場
合に関与し、その結果、防御系の多重アームを刺激す
る。すなわち、IL−11は、実験および臨床目的の両
方に関する幹細胞の操作に有用であると予測される。
11の生物活性は、適当な発現制御配列の制御下、クロ
ーン化配列によりトランスフェクションされたほ乳類細
胞により産生された機能的ポリペプチドから検出され
た。表1に記録された通りプラスミドpPU34−TR
A(pC1R6)におけるクローン化された霊長動物配
列は、1989年11月14日付けでメリーランド、ロ
ックビル、パークローン・ドライブ12301のアメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクションにATCCナ
ンバー68172として寄託された。ヌクレオチドおよ
びアミノ酸レベルの両方で霊長動物配列からの修飾によ
り表1に示されたクローン化されたヒト配列は、199
0年3月30日付けでメリーランド、ロックビル、パー
クローン・ドライブ12301のアメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクションにATCCナンバー6828
4として寄託された。
T1165検定において活性を示す。初めの試験におい
て、IL−11は、1:500程度の高い最終希釈率で
も、標準ネズミひ臓細胞プラーク形成検定において免疫
グロブリン分泌性B細胞の形成を顕著に向上させること
が見出された。このシステムでは、ひ臓の正常な細胞構
成成分から成る状況において特異的免疫原、4−ヒドロ
キシ−3−ニトロフェニル−アセチル修飾ウマ赤血球細
胞(NP−HRBC)に応答する培養中におけるB細胞
の発達が測定される。ひ臓細胞培養物からのT細胞のT
hy1補体による消耗の結果、応答が完全に廃棄され、N
P−応答性B細胞の増加は、霊長動物IL−11の存在
下でも、少なくとも部分的にT細胞の存在に左右される
ことが立証された。従って、B細胞ミトゲン、例えばリ
ポ多糖類はT細胞の非存在下でNP−特異的プラーク形
成細胞の形成を刺激するため、IL−11の活性は、直
接的B細胞有糸分裂促進作用に帰属し得ない。すなわ
ち、IL−11は、TおよびBリンパ球の増殖、分化お
よび活性化を調整し得る。
1の作用の分析により、血小板生成細胞の発達に対する
著しい作用が証明された。標的としてネズミ骨髄細胞を
用いた場合、IL−11は単独ではほとんど効果を示さ
ないが、IL−3により助けられると血小板生成細胞コ
ロニー形成を3倍促進した。IL−3およびIL−11
によるCFU−Meg形成は、陽性対照として使用される
形成不能性イヌ血清の場合を凌いでいた。
ポリペプチドには、表1の組換えIL−11の配列と類
似しているが、自然にまたは意図して工学的に修飾が加
えられた配列によりコードされる因子が含まれる。すな
わち、本発明はまた、他の霊長動物蛋白質をコードし、
IL−11ポリペプチドの発現をコードするDNA配列
の随伴を欠く、これらの新規DNA配列を包含する。こ
れらのDNA配列には、上記で示したDNA配列および
そのフラグメントと同一または実質的に同一の配列、お
よび厳密なハイブリダイゼーション条件[T.マニアチス
等、「モレキュラー・クローニング(ア・ラボラトリー
・マニュアル)」、コールド・スプリング・ハーバー・
ラボラトリー(1982)387−389頁参照]下で表1の
DNA配列とハイブリダイゼーションする配列が含まれ
る。上記の厳密な一ハイブリダイゼーション条件の一例
は、65℃で4XSSC、次いで65℃で1時間0.1
XSSC中で洗浄を行うハイブリダイゼーションであ
る。別法として、厳密なハイブリダイゼーション条件の
一例は、42℃で50%ホルムアミド、4XSSCであ
る。
下でIL−11またはその活性フラグメントに対する配
列とハイブリダイズし、発現に際してIL−11の生物
学的特性をもつIL−11ペプチドをコード化するDN
A配列は、また新規なIL−11ポリペプチドをコード
化している。このような非ストリンジエントハイブリダ
イゼーション条件の例は、4XSSC50℃または42
℃で30−40%ホルムアミドを用いるハイブリダイゼ
ーションである。例えば、IL−11配列と顕著な相同
性をもつ領域を共有しIL−11の生物学的性質の1種
以上をもつ蛋白質をコード化するDNA配列は、たとえ
そのDNAが第1表のIL−11配列またはIL−11
活性をもつペプチドをコード化するそのフラグメントと
ストリンジエントにハイブリダイズしなくとも、明らか
にIL−11ポリペプチドをコード化している。
化するが遺伝子コードの縮重によりコドン配列が異なる
DNA配列もまたこの発明に含まれる。IL−11蛋白
配列およびIL−11の生物活性を示すペプチドフラグ
メントをコード化するDNA配列におけるアレル性変異
体並びにその類似体または誘導体もまたこの発明に含ま
れる。点突然変異またはそれがコード化するポリペプチ
ドの生物活性、半減期もしくは産生のようなIL−11
蛋白質のある種の特性を増強する修飾導入により起こっ
たIL−11DNA配列のその他の変異体もこの発明に
含まれる。
使用に加えて、この発明のIL−11ポリペプチドはま
た既知の慣用化学合成により製造することができる。合
成的手段によりこの発明のポリペプチドを構築する方法
は当業者に知られている。合成構築されたIL−11ポ
リペプチド配列または表1のアミノ酸残基連続配列を複
製しまたは部分的に複製するフラグメントもまたこの発
明の一部をなす。この合成構築IL−11ポリペプチド
配列は、天然IL−11ポリペプチドと1次、2次また
は3次構造的および立体的特性を共有するため、IL−
11の生物特性を共通して有し得る。すなわち、これら
は天然の精製IL−11ポリペプチドの生物学的に活性
なまたは免疫学的な代替物として治療および免疫学的方
法に使用し得る。
蛋白質、ペプチドまたはDNA配列における修飾は、公
知技術を用いて当業者が行なうことができる。IL−1
1配列において関心がもたれる修飾には、コード配列中
の1種以上の選択アミノ酸の置換、挿入または欠失が含
まれる。このような置換、挿入または欠失の変異誘発技
術は当業者に周知である。[例えば、米国特許第451
8584号参照。]
チド配列のその他の特異的変異は、例えば1種以上のグ
リコシル化部位の挿入を含み得る。アスパラギン結合グ
リコシル化認識部位をアミノ酸の欠失、置換または付加
によりペプチド配列に、またはヌクレオチドのそれらに
よりDNA配列に、挿入し得る。このような変化は、O
−結合炭水化物の付加により修飾される分子の任意の部
位または分子中の他の部位になし得る。このような変化
したヌクレオチドまたはペプチドの発現により、その部
位がグリコシル化され得、薬理学的または生物学的性質
が変化または改善され得る変異体を産生する。
持すると期待されるその他のIL−11配列の類似体お
よび誘導体も、この明細書の開示を与えられた当業者は
容易に作ることができる。このような修飾の1つは、I
L−11配列に存在するリジン残基へのポリエチレング
リコール(PEG)の結合、または1個以上のリジン残
基もしくはPEGもしくはPEG誘導体と反応する他の
アミノ酸残基を配列中に挿入してPEG部分の結合を可
能にすることである。このような修飾はこの発明に含ま
れると考えられる。
フラグメントの製造法を提供する。この発明の方法の1
つは、発現ベクターにIL−11ポリペプチドコード化
cDNAを導入してIL−11発現システムを作ること
を含む。選択した宿主細胞をベクターで形質転換し培養
する。それ故、この発明の方法は、既知の調節配列の制
御下にIL−11ポリペプチドまたはそのフラグメント
の発現をコード化するDNA配列で形質転換した適当な
細胞またはセルラインを培養することを含む。発現され
た因子を当業者に公知の適当な手段により培地(または
細胞内発現の場合細胞)から採取し、分離し、精製す
る。
は、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)または
3T3細胞のような哺乳類細胞であり得る。適当な哺乳
類宿主細胞および形質転換法、培養法、増幅法、スクリ
ーニング法および生成物の産生、精製法の選択は当技術
において知られている。例えばゲチングおよびサムブル
ック、ネイチャー293巻620−625頁(1981
年)、またはカウフマン等、モレキュラー・アンド・セ
ルラー・バイオロジー5巻(7号)1750−1759頁(1985
年)またはハウリー等、米国特許第4419446号参
照。その他の適当な哺乳類セルラインはさるのCOS−
1セルラインおよびCV−1セルラインである。哺乳類
宿主細胞の別の例は、特に、形質転換セルラインを含め
た霊長類セルラインおよびげっ歯類セルラインを含む。
正常な2倍体細胞、一次組織のインビトロ培養で得られ
る細胞株、および一次外植体もまた適当である。候補細
胞は、選択遺伝子において遺伝子型として欠乏している
か、または優勢に作用する選択遺伝子を含み得る。その
他の適当な哺乳類細胞としては、ヒーラ(Hila)、マ
ウスL−929細胞、スイス系由来の3T3、Balb−c
もしくはNIHマウス、BHKまたはHakハムスターセ
ルラインを含むが、これらに限定されるものではない。
当な宿主細胞は細菌細胞である。例えば、エシエリキア
・コリの種々の株(例えばHB 101およびMC 10
61)はバイオテクノロジー分野で宿主細胞として知ら
れている。バチルス・サブチリス、シュードモナス、そ
の他の桿菌の種々の株等もこの方法で使用し得る。
発明のポリペプチドの発現用宿主細胞として入手でき
る。さらに、所望ならば、昆虫細胞もこの発明の宿主細
胞として使用できる。例えば、ミラー等、ジエネティッ
ク・エンジニアリング8巻277−298頁(プレナム
・プレス、1986年)およびその引用文献参照。
チドの発現に用いる組換え体DNA分子またはベクター
を提供する。これらのベクターは、この発明のIL−1
1ポリペプチドをコード化する新規単離DNA配列を含
有する。別法として、上記のような修飾配列をとり込ん
だベクターもこの発明の態様であり、IL−11ポリペ
プチドの生産に有用である。この方法で用いるベクター
はまた、この発明の配列をコード化するDNAと機能可
能に結合し宿主細胞中で複製および発現を指示し得る選
択した調節配列を含み得る。
[Y.C.ヤング等、セル47巻3−10頁(1986年)]で
ある。この明細書に記載する哺乳類細胞発現ベクター
は、当業者に周知の技術により合成することができる。
ベクターの成分、例えばレプリコン、選択遺伝子、エン
ハンサー、プロモーター等は、公知の方法により天然源
から得られまたは合成できる。カウフマン等、ジャーナ
ル・オブ・モレキュラー・バイオロジー159巻511
−521頁(1982年)およびカウフマン、プロシーディン
グス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンシズ・ユーエスエイ82巻689−693頁(1985
年)。別法として、ベクターDNAは、ラレパピローマ
ウイルスゲノム[ラッキー等、セル36巻391−40
1頁(1984年)]の全部または一部を含み得、また安定な
エピソーム要素としてC127マウス細胞のようなセル
ライン中にとり込むことができる。適当な宿主細胞に対
するこれらのベクターによる形質転換はIL−11ポリ
ペプチドの発現をもたらす。
び細菌発現について当技術で知られるその他の適当な発
現ベクターもまたこの目的に用いることができる。細胞
源から均質になるまで精製され、または組換え体もしく
は合成で製造されたIL−11は免疫不全または障害の
処置のための医薬製剤または処方に使用することができ
る。IL−11はまた、造血始原細胞または幹細胞の不
全または関連障害の処置に使用することができる。IL
−11組成物は、がんおよびその他の疾患、放射線もし
くは薬剤への露出から生ずる病理学的状態であって例え
ば白血病、細菌もしくはウイルス感染、貧血、B細胞も
しくはT細胞欠乏(骨髄移植後の免疫細胞または造血細
胞欠乏を含む)の処置に使用することができる。IL−
11はまた、種々のワクチンに対する免疫応答を増強
し、長期持続性で効果が大きな免疫を作り出すために用
いることができる。前述のように、IL−11組成物は
B細胞および巨核球の分化刺激に使用することができ
る。IL−11ポリペプチド組成物によるこのような疾
患状態の治療処置は、現在入手できる薬剤による処置で
起る望ましくない副作用を回避するものである。
は他のサイトカイン類、ヘマトポイエチン類、インター
ロイキン類、成長因子類または抗体と組合わせて、上記
症状の処置に用いることができる。
法および組成物を提供する。このような組成物は、この
発明のIL−11ポリペプチドの治療的有効量を、医薬
として許容される担体と混合して含有する。この組成物
は非経口的に全身投与し得る。別法として、組成物は静
脈内投与できる。所望ならば、組成物は皮下または局
所、例えば傷害部位に適用できる。全身投与の場合、こ
の発明の治療用組成物は発熱性物質不含有の非経口投与
上許容される水溶液である。このような医薬として許容
されpH、等張性、安定性等に必要な注意を払った蛋白
質溶液の製造法は当技術の範囲内にある。
は、薬剤の作用を修飾する種々の要因、例えば患者の症
状、体重、性別および食事、感染の重度、投与時期およ
びその他の臨床的因子を考慮して担当医師により定めら
れる。一般に、1日用量はポリペプチド1−1000mg
またはポリペプチド50−5000単位(1単位はT1
165アッセイで最高の50%の刺激をもたらすポリペ
プチド濃度)(体重1kg当り)の範囲内である。
のひと因子との同時投与を含み得る。この用途のための
サイトカインまたはヘマトポイエチンの例としては、公
知の因子であるIL−1〜IL−9、GM−CSF、M
−CSF、MIF、Meg−CSF、インターフェロン
類、TNFおよびエリスロポイエチンが含まれる。IL
−11療法に関与するに特に望ましい候補品は、IL−
3およびIL−6を含み得る。B細胞成長因子、B細胞
分化因子または好酸球分化因子類のような成長因子もま
たIL−11との同時投与に有用であることがわかっ
た。上記の用量は治療用組成物の追加的成分と相殺する
ように調整することができる。処置される患者の経過は
慣用手段により監視することができる。
インビトロまたはインビボ診断および治療法用の標準的
方法による抗体の発生である。このような抗体には、公
知方法で製造したモノクローナルおよびポリクローナル
抗体、並びにキメラ抗体または「組換え体」抗体が含まれ
る。またこの発明により、選択した哺乳類に抗原として
IL−11またはそのフラグメントを与え、その後その
動物細胞を公知技術によりある種のがん細胞と融合させ
て不死化細胞を作ることにより生ずるセルラインが提供
される。このようなセルラインの生成およびこの発明の
哺乳類のIL−11ポリペプチドの全部または一部に対
する抗体の生成に用いる方法もまたこの発明に包含され
る。
な標識または標識系と結合させることにより、インビボ
およびインビトロ診断法に用いることができる。別法と
して、これらの抗体は、例えば当業者に公知のある種の
毒性または治療用化合物またはその一部分と結合させる
ことにより、インビボおよびインビトロの治療目的に用
いることができる。
ング、哺乳類IL−11の発現および製造、並びに他の
方法および製品を例示的に記述するものである。これら
の実施例は説明を目的とするもので、この発明の範囲を
限定するものではない。
イブラリーの構築 霊長類セルライン、pU34を成長させると、実施例7
のT1165検定においてIL−6に対する中和抗体の
存在下、有意な活性を生じるのが見出された。PU−3
4間質セルラインは、両方向性欠損形質転換レトロウィ
ルスベクター(a defective amphotropic transforming
retroviral vector)で不死化することにより、長期間
の霊長類骨髄培養より得られた。U19レトロウィルス
プラスミドは以前に報告されたように構築し[P.S.ジ
ャットら、ジャーナル・オブ・ビロロジー59巻746
−750頁(1986年)]、SV40ラージT抗原配列およ
びG418−耐性をコードしモロネイ・ネズミ白血病ウ
ィルス末端反復配列から離れて発現するネオーホスホト
ランスフェラーゼ配列を含有する。両方向性産生クロー
ンは、パッケージング・セルラインψAM[R.コーン
ら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンス・オブ・ジ・ユナイテッド・ステー
ツ・オブ・アメリカ81巻6349−6353頁(1984年)]をψ
2U19−5[P.S.ジャット、上記で引用]からのエコ
トロピック・ウィルスの収穫物で感染させ、続いて0.
75mg/mlのG418中で選別することにより産生し
た。
IH/3T3細胞で検定した場合、5×103 G41
8−耐性CFU/mlの力価の組換えSV40ウィルスを
産生する。長期骨髄培養物(LTMC)は常法で完成さ
れ、10%ウシ胎仔血清、10%ウマ血清、100単位
/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシ
ン(シグマ・ケミカル・カンパニー、セント・ルイス・
ミズーリー州)完全長期培養培地を補充したイスコフ改
変ダルベッコ培地(IMOM)中で維持した。
にψAMU19−BLウィルス貯蔵物2mlで、8μg/m
lポリブレーン(アルドリッヒ・ケミカル・カンパニー
・インコーポレーティッド、ミルウォーキー、ウィスコ
ンシン州)の存在下33℃で2.5時間感染させた。感染
後最初の3日間は、培養物を0.5mg/mlG418中で
選別した。感染後14日にG418耐性コロニーをと
り、マルチウェルプレート(コーニング・グラスウェ
ア、コーニング、ニューヨーク)に広げた。
らし培地を長期培養物中の始原細胞を保持する能力に基
づいて広範に分析した。このセルラインは多分化能ヒト
および霊長類始原細胞を、培養中3週間まで維持する能
力があることを示した。IL−6、IL−7、GM−C
SF、M−CSF、G−CSFおよびLIF/HILD
Aを含む既知の成長因子活性に加え、IL−1−の刺激
したPU−34ならし培地は、T1165ネズミ・プラ
スマ細胞腫セルラインの増殖を刺激する能力があること
が判明したが、これは通常IL−6に反応する[R.P.
ノールダンら、上記で引用]のだが、ヒトIL−6に対
する中和抗血清の存在下でさえも反応する。この生物検
定は、PU−34から得られたcDNAライブラリーの
発現クローニングの間に用いられた。生物検定について
の詳細は以下の実施例7で記載する。
以下のように調製した。PU−34細胞をIL1−α
で、2単位/mlの濃度で24時間刺激した。ポリアデニ
ル化RNA(ポリA+RNA)を常法によりこれらの細胞
から調製した。全RNAをチルグウィンら、バイオケミ
ストリー18巻5294−5299頁(1979年)の方法に準じて、
刺激したpU34細胞から抽出した。mRNAは、オリゴ
(dT)−セルロース・クロマトグラフィーにより調製し
た[H.アビブら、プロシーディング・オブ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ジ・ユナイテ
ッド・ステーツ・オブ・アメリカ69巻1408−1412頁(1
972年)]。
記で引用)により報告されたように、DNAポリメラー
ゼIで、および2本目の鎖の反応においてはRNAアー
ゼHで[T.マニアティスら、上記で引用]、二本鎖cDN
Aを合成した。Cos−1細胞発現ベクターpXM[Y.C.
ヤングら、セル47巻3−10頁(1986年)]を独特なXh
o I部位で直線化し、同等モル量のセミ−Xho I適合c
DNAに連結した。連結反応を用いてエシエリキア・コ
リ形質転換能細胞(HB101株)に形質転換し[Y.C.
ヤングら、上記で引用]、約500000個のアンピシ
リン耐性コロニーのライブラリーを得た。
胞のトランスフェクション G.G.ウォングら(上記で引用)により以前に報告され
た発現クローニング系を用いて、以下のようなIL−1
1活性をコード化するcDNAを単離した。細菌性コロ
ニーをニトロセルロース膜上に写した。各膜からコロニ
ーをL−ブロース中にかきとり、プラスミドDNAを前
述の方法[J.A.メイヤーズら、ジャーナル・オブ・バ
クテリオルジー127巻1529−1536頁(1976年)]により
単離した。各々の最初のDNA試料を200−500コ
ロニーのプールから調製した。
1mMクロロキンを添加したジエチルアミノエチル−デ
キストラン(DEAE)試験計画によりCos−1細胞を
トランスフェクトした[L.M.ソンパイラックら、プロ
シーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンス・オブ・ジ・ユナイテッド・ステーツ・オブ
・アメリカ78巻7575−7578頁(1981年)およびH.ルー
スマンら、タクル.アシッズ・レス・11巻1295−1308
頁(1983年);Y.C.ヤングら、上記で引用]。トランス
フェクトしたCos−1細胞の培養上清を、トランスフェ
クション後72時間に収穫し、T1165刺激剤活性を
検定した(実施例7参照)。
検出可能な量のIL−6(抗IL−6抗体で中和するこ
とにより測定)を含有し、T1165検定において抗I
L−6抗体の存在下に活性が残存する2個の陽性プール
からのプラスミドDNAを、Cos−1細胞中に再びトラ
ンスフェクトし、トランスフェクトした上清をT116
5検定において活性を再びふるい分けした。このような
活性を有する1個のプールを選別し、含有するクローン
の数がより少なくなるようにさらに分割した。この群か
ら、検定においてプールを全て集めたものよりも高い活
性を示すプールを選別した。このプールから個々のクロ
ーンを取り出した。これらのDNAを調製し、トランス
フェクトし、トランスフェクトした上清をT1165検
定において活性を試験した。2個の陽性のクローンを固
定した。1個はIL−6活性を発現し、もう1個は抗I
L−6抗体により中和されない活性を発現した。この後
者のプールをさらに分割し、択一的にpC1R6かまた
はpPU34−TRAと称する、新規なT1165増殖
活性をコードする単一の陽性プラスミドが得られるまで
トランスフェクションを繰り返した。このクローンを実
施例7の検定において再び試験した。
1細胞のならし培地の活性をもまた、その他のサイトカ
イン、例えばネズミおよびヒトIL−6、並びにネズミ
GM−CSFと比較した。ならし培地はT1165細胞
による測定可能な3H−チミジンの取り込みを、最終的
に1:1000まで希釈した時でさえ刺激した。至適濃
度では、新規なサイトカインは基底値の100倍以上の
取り込みを助けた。
結法により、超螺旋鋳型上で合成オリゴヌクレオチドプ
ライマーを用いて配列決定した。[F.サンガーら、プロ
シーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンス・オブ・ジ・ユナイテッド・ステーツ・オブ
・アメリカ74巻5463−5467頁(1977年)]。表1に示すp
C1R6のcDNAのヌクレオチド配列は予想される1
99アミノ酸ポリペプチドをコードする597ヌクレオ
チドの単一の長い転写解読枠を含有する。17−20個
の疎水性アミノ酸の広がりが推定上の開始コドンに直ぐ
近接して存在し、これは通常のタンパク分泌性先導配列
に類似している。
完全であることが判明したが、さらにcDNAを分析
し、この転写物がサイトカイン遺伝子発現の重要な制御
要素であると考えられるRNA不安定配列、ATTTA
の多重コピーを有する約420塩基対の3'非コード化
配列を含有することが明らかになった[G.シャウら、セ
ル46巻659−667頁(1986年)]。
プチドをパルス標識化実験を用いて同定した。クロロキ
ンで誘導後48時間に、IL−11クローンの組み換え
DNAでトランスフェクトしたCos−1細胞の培養上清
を除去し、細胞を1.0mlのDMEM中の0.5mCi[35
S]メチオニンで、37℃で4時間パルス標識化した。
放射線標識した上清の試料10μlを回収し、ラエムリ
緩衝液系で12%ゲルの15%SDS−PAGE[U.
K.ラエムリ、ネイチャー227巻680−685頁(19
70年)]に供した。電気泳動後、ゲルを蛍光光度法増強溶
液(エンハンス;ニュー・インブランド・ニュークレ
ア、ボストン、マサチューセッツ州)中に浸し、乾燥
し、X線フィルムに爆露した。
ランスフェクトしたCos−1細胞のならし培地のSDS
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)
分析により、約180個のアミノ酸分泌タンパクに予想
される分子量に合致する偽トランスフェクトした対照に
は存在しない、主に20キロダルトンの種が存在するこ
とが示された。
質性の欠如は、アスパラギン結合炭水化物の添加するた
めのコンセンサス配列(Asn−X−Thr/Ser)R.J.ウ
ィンツラー、「ホルモナル・プロテインズ・アンド・ペ
プタイスセ」リー,C.H.編(アカデミック・プレス・ニ
ューヨーク)1頁〜(1973年)]が存在しないことに一致す
る。成熟タンパクの予期されるアミノ酸配列にはシステ
イン残基は含まれず、これはその他の任意のサイトカイ
ン遺伝子では見られない様相である。
ルライン 2個のヒト・セルラインを、少なくとも1種のIL−1
1の源泉として同定した。具体的には、ヒト肺線維芽細
胞セルライン、MRC−5[アメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクションより受け入れ番号ATCC CC
L 171で入手可能]を、1単位/mlの組み換えヒト
IL−1−アルファ(ジェネティックス・インスティテ
ュート、インコーポレーテッド)および10-7Mフォル
ボール12−13ジブチレート(シグマ)で誘導して、
T1165検定で試験した。誘導したならし培地が、I
L−6の飽和量より大きなカウント/分を呈する、すな
わちPU34の誘導ならし培地により呈するのと類似の
活性が観察された。IL−11が存在すれば低IL−6
信号を増強するであろうということは注目されている。
さらに、以下に詳細に記載するように、このセルライン
のノーザン・ブロットにより、IL−11のメッセージ
が存在することが示される。
30−1(ATCCより、受け入れ番号CRL1583
で入手可能)もまた、ノーザン・ブロットにおいてIL
−11メッセージの存在を誘導しないことが示される。
その他のIL−11のヒト源泉もまた、本発明の教示に
より入手でき、容易に同定できる。
NA5μgを、2.2Mホルムアルデヒド含有1.2%ア
ガロースゲルを通して電気泳動した[H.レーラッハら、
バイオケミストリー16巻4743頁(1977年)]。ホルムア
ルデヒド−変性RNAを報告されたとおりナイロン膜
(ゼータバインド;クノー、メリーデン、コネチカット
州)に移し[E.M.サザーン、ジャーナル・オブ・モレ
キュラー・バイオロジー98巻503−514頁(1975
年)]、32P標識化cDNAプローブでプローブした。
入物をXhoIで制限酵素で開裂することにより作り、プ
ライマーとして無作為なオリゴヌクレオチドを用いて、
DNAポリメラーゼIの大きな断片の存在下32P−dCT
Pで挿入物を標識化した[A.P.フェイルベルグら、ア
ナリティカル・バイオケミストリー132巻6−13頁
(1983年)]。ナイロン膜を65℃で4時間予めハイブリ
ダイズし、4×SSC、0.5%SDS 5×デンハー
ト溶液および100μg/ml変性サケ精子DNAからな
るハイブリダイゼーション溶液中65℃で16時間、32
P−dCTP標識化cDNAプローブでハイブリダイズし
た。その他の用いたプローブには、ヒト(rh)IL−1
α、rhIL−2、rhIL−3、rhIL−4、rhIL−
5、rhIL−6、rhIL−7、rhIL−9、rhGM−C
SF、rhM−CSF、LIF/HILDAおよび霊長類
IL−11がある。
SC/0.1%SDSで65℃で30分間、次に0.2×
SSC/0.1%SDSで65℃で30分間の2回洗浄
した。ついで膜を乾燥し、−70℃でカルシウム・タン
グステート・インテンシファイング・スクリーンの存在
下X線フィルムに適用した。
34 mRNAが約2.5キロベースおよび約1.5キロ
ベースの大きさのメッセージを有し、pC1R6プロー
ブでハイブリダイズされる2重のIL−11転写物を含
有することが示された。上記表IのcDNA配列の大きさ
は、より小さなメッセージとよく相関する。この違い
は、さらにcDNAクローンを単離および分析すること
により示されるように、別々にスプライシングして大き
な転写物中さらに3'非コード化配列を生じる結果であ
る。PU34細胞による2個の転写物の存在は、IL−
1α誘導がない場合は明白な転写物がないので、IL−
1α制御されるようである。
はヒト胎盤からのヒトTセルラインC10−MJ2[レ
アリーら、ブラッド69巻953頁(1987年)]、C5−
MJ2[アリアら、サイエンス223巻1086頁(1984年)]
およびMo[ゴルデら、プロシーディング・オブ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ジ・ユナ
イテッド・ステーツ・オブ・アメリカ77巻593頁(1
980年)]からのmRNA調製物中、RNAブロット分析に
より同定される転写物はない。従って、唯一同定される
IL−11の源泉は、間充組織由来の付着細胞である。
コブスら、ネイチャー227巻43頁(1970年)に報告さ
れるように、50ng/mlの酢酸フォルバール・ミリステ
ート(PMA)および1単位/mlのIL−1αで刺激
後、両方の転写物を発現することが見出された。上記で
PU34RNAに関して記載されるように、2種の転写
物は、このセルラインにおいて、約2.5キロベースお
よび約1.5キロベースの同一の大きさのメッセージで
同定された。MRC−5セルラインから単離されるヒト
cDNA配列の分析により、霊長類およびヒトのコード
化部域は、ヌクレオチドレベルで約95%の同一性を共
有することが示された。
0−1に関して、同じプローブを用い、同じ方法を実施
した場合、大きな約2.3キロベースのIL−11メッ
セージのみが同定された。
列を、報告されるように[G.G.ウォングら、およびY.
C.ヤングら、上記で引用]、Bal31ヌクレアーゼ消化
による重複断片の順序をもった組の生成およびM13ベ
クターへのサブクローニングにより決定した[M.ポンク
ツら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンス・オブ・ジ・ユナイテッド・ステ
ーツ・オブ・アメリカ79巻4298−4302頁(1982年);お
よびJ.メッシングら、ジーン、19巻269−276
頁(1982年)]。1本鎖DNAを調製し、ヌクレオチド配
列をジデオキシヌクレオチド鎖終結法により決定した
[F.サンガーら、プロシーディング・オブ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ジ・ユナイテ
ッド・ステーツ・オブ・アメリカ、74巻5463−5467頁
(1977年)]。このヌクレオチド配列は上記表1に示す。
[R.P.ノルダンら、サイエンス233巻566頁(1986
年);ドクター・ノルダン、ナショナル・インスティテュ
ーツ・オブ・ヘルスより入手]は10%加熱不活化ウシ
胎仔血清、2mMグルタミン、100単位/mlペニシリ
ン、100μg/mlストレプトマイシン(全てギブコ、
グランド・アイランド、ニューユーク)5×10-5Mベ
ーター・メルカプトエタノール(シグマ・ケミカル・カ
ンパニー、セント・ルイス、ミズーリー州)を補充し、
およびCHO細胞で産生させた10−20単位/mlの組
み換えヒトIL−6(ジェネティックス・インスティテ
ュート・インコーポレーテッド)を補充したRPMI中
で通常どおり成長させる。2−4日経過後、細胞を培養
から取り出し、洗浄して残留IL−6を除去し、7.5
×104−1×105セル/mlの濃度で再懸濁する。
C1R6−トランスフェクトしたCos細胞ならし培地)
を96ウェルマイクロタイタープレート上、IL−6不
含培養培地100μlで2検体ずつ連続希釈する。次に
上記細胞懸濁液を各ウェルに加え、プレートを37℃で
2−3日間恒温培養する;3H−チミジンの0.5μCi
[デュポント、ウィルミントン、デルウェア州]を検定の
最後の6時間、各ウェルに加える。細胞をGFC型C濾
紙(LKB)上に収穫し、水およびエタノールで洗浄
し、乾燥する。濾紙を次にシンチレーション用液中に浸
し、LKB平面シンチレーションカウンターで計数す
る。3H−チミジンの取り込みにより増殖を測定する。
IL−6の飽和量よりも多いT1165細胞の増殖を引
き起こし、これは別の因子の存在を示唆している。ヒト
IL−6に対する抗体の存在下で検定した場合、低いが
有意な活性がならし培地に残存する。非常に低量のIL
−6を含有するIL−1誘導PU34のならし培地の分
画化試料をもまたヒトIL−6に対する抗体の存在下お
よび不在下で検定し、その結果は、程度は低いが単独で
増殖でき、低量のIL−6とで相乗する能力がある因子
の存在が示唆された。
ョンからのCos細胞上清もまた、単独およびヒトIL−
6に対する抗体+至適量内のネズミIL−6のカクテル
の存在下、活性を検定した。抗体はPU34細胞により
産生される霊長類IL−6を中和できるが、ネズミIL
−6を中和することができない。従って相乗因子はライ
ブラリーに存在するPU34 IL−6からの干渉をう
けることなくふるい分けできる。表1の成熟IL−11
タンパクは、この検定において、100希釈単位/mlの
最大活性の半分であるという特徴がある。
ル・オブ・イムノロジー141巻2935−2842頁(1988年)
に報告されている方法に準じてIL−10発現Cos細胞
に関して実施した。ネズミプラーク形成検定は、本来の
C57B1/6マウスからの7.5×106脾臓細胞を3
×106 4−ヒドロキシ−3−ニトロフェニル−アセ
チル改変ウマ赤血球(NP−HRBC)と共に0.75m
lの5%ウシ胎仔血清を補充したミッシェル−ダットン
培地[R.I.ミッシェルら、ジャーナル・オブ・エクス
ペリメンタル・メディシン126巻423−442頁(1
967年)]中、試験試料(IL−11含有Cos細胞ならし
培地)と共に、または伴なわずに5日間恒温培養するこ
とにより実施した。NP−共役ウマ赤血球(H−RB
C)またはヒツジ赤血球(S−RBC)を、以前に報告
されたように[P.B.ハウスマンら、ジャーナル・オブ
・イムノロジー134巻1388−1396頁(1985年)]、1ml
のパックしたH−RBCまたはS−RBC(コロラド・
セリューム・カンパニー、デンバー、コロラド州)と共
に、ジメチルホルムアミド(シグマ・ケミカル・カンパ
ニー、セントルイス、ミズーリー州)中、10mgのNP
−サクシンイミド(ケンブリッジ・バイオケミカル、イ
ンコーポレーティッド、ケンブリッジ、英国)を反応さ
せることにより調製した。
有するが試験試料(ならし培地)を含まない補充用培地
を、毎日さらに0.1ml供給した。NP−反応性Bセル
は、ドレッサーら、「ハンドブック・イン・エクスペリ
メンタル・イムノロジー」(D.W.ワイヤー、ブラックウ
ェル、オックスフォード)、271頁(1973年)に報告さ
れるようにNP−共役−ヒツジRBCプラーク検定を用
いて培養期間の最後に同定し、IL−11含有ならし培
地で支持される培養物から得られるプラークの数を培地
のみを補充した培養物から得られるプラークの数と比較
することにより、反応率を算出した。典型的な実験で
は、外来性因子の欠如した基底反応では、プレートした
7.5×106セルあたり、6000NP−特異性プラー
ク形成細胞を産生した。
反応のパーセントは、NP−HRBCで刺激し、pC1
R6−トランスフェクトしたCos−1細胞ならし培地の
規定の希釈により支持される本来の脾細胞の5日間の培
養中のNP−反応性Bセルの成長の増強を、培地のみを
補充した対照培養物と比較する。Cos産生哺乳動物IL
−11は、この検定においてプラーク形成単位/培養物
が2 1/2−3倍に増強され、このことは、IL−1
1がBセル刺激および分化に直接的に働くか、またはT
セル刺激に間接的に働き、Bセルの反応に影響を及ぼす
その他のサイトカインを分泌する。
ー形成検定においてS.クリアら、エクスプ.ヘマトー
ル.15巻896−901頁(1987年)に報告されるよう
に実質的に行い、および2%仔ウシ血清を添加して改変
した方法で、活性を試験した。簡単に記載すると、ネズ
ミコロニー形成単位巨核球(CFU−Meg)検定は、
2.5×105ネズミ骨髄細胞を20%ウシ胎仔血清を補
充したIMDMの0.4ml中、6ウェル皿にプレートし
て実施した。クロット形成は0.25mgフィブリノーゲ
ンおよび0.25単位のスロンビン(シグマ・ケミカル
・カンパニー、セントルイス、モンタナ州)を37℃で
添加することにより開始した。種々に希釈した試験試料
をフィブリンクロットに加え、続いて培養物を37℃で
6日間、恒温培養した。クロットをS.クリヤら、上記
で引用、およびA.ナケフら、プロシーディング・オブ
・ザ・ソサイエティー、フォー・エクスペリメンタル・
バイオロジー・アンド・メディスン151巻587−5
90頁(1976年)に報告されるように、2.5%グルター
ルアルデヒドで固定し、0.5mg/mlのアチセルチオコ
リン・ヨーダイドで染色した。陽性のコロニー(巨核球
のみを含有)は直接検鏡して数えた。コロニーの数は2
検体ずつ評価した。
ヌ無形成貧血血清の1:10希釈;(2)150単位/ml
のネズミIL−3;(3)刺激剤なし;および(4)1:1
0もしくは(5)1:50希釈のpC1R6−トランスフ
ェクトしたCos−1細胞ならし培地のみ、または(6)
1:10もしくは(7)1:50希釈の150単位/mlの
ネズミIL−3を補充したpC1R6−トランスフェク
トしたCos−1細胞ならし培地により支持されるマウス
骨髄細胞の6日間培養物中の巨核球コロニー(アセチル
コリンエステラーゼが陽性細胞)の全数を表す。
合、反応はほとんど検出されなかった。しかしながら、
この検定ではIL−11を組み換えネズミIL−3の存
在下試験した場合、検定結果は、IL−11およびIL
−3の組み合わせによりこの検定において巨核球細胞の
産生および成熟を有意に刺激することを示した。この検
定は、哺乳動物IL−11が巨核球の成長の刺激におい
て、IL−3と相乗効果を有することが示された。
施例5においてヒトIL−11 mRNAとハイブリダ
イズしたPU34 IL−11 cDNAを用いて、前
述のヒト肺線維芽細胞セルライン、MRC−5から調製
したcDNAライブラリーをふるい分けした。このライ
ブラリーからの組み換え体をプレートし、2連のニトロ
セルロース・レプリカーゼをプレートから作る。これら
のレプリカーゼは機会的プライミング標識化法[A.P.
フェインベルグ、上記で引用]を用いて32P−dCTPで
標識化した哺乳動物のIL−11 cDNAと共に、標
準的なハイブリダイゼーション溶液(4×SSC)中6
5℃で一晩ハイブリダイズした。次に膜を0.2×SS
Cで、同温で、放射活性の基底値が特異的なハイブリダ
イジング配列の検出を可能にする値まで低下するまで洗
浄した。重複膜上で哺乳動物のIL−11プローブにハ
イブリダイズするのが見出されたコロニーを取り、プラ
スミドDNAの調製に用いた。
ラインから哺乳動物IL−11を単離するための前述の
方法と同様の方法に準じて決定した。ヒト配列もまた表
1に示す。ヒト配列ヌクレオチドが霊長類の配列と異な
る場合は、表1でヒトヌクレオチドを霊長類のヌクレオ
チド配列の上に記す。
クローニングの目的で適当な制限部位を有する表1の配
列、およびIL−11のヒトDNA配列を得るために用
いられるポリメラーゼ連鎖反応から構築してもよい。例
えば以下のオリゴヌクレオチドが合成される:
−5またはTPA30−1のcDNAライブラリーにお
けるポリメラーゼ連鎖反応に用い、そこからヒトIL−
11のDNA配列を得る。PCR法は、現在当業界で標
準的な方法に準じて実施する。得られたPCR産生物を
次に適当に消化したpXM、またはその他の発現ベクタ
ーにサブクローン化する。上記のオリゴヌクレオチドに
関しては、pXMベクターサブクローニングするために
BamHIおよびHindIIIで消化する。
方法としては、プローブとして表1の配列を用いてヒト
ゲノムライブラリーをふるい分けする方法がある。
ために、それをコード化するcDNAを適当な発現ベク
ターに移す。この発現ベクターは標準的な分子生物学的
技術による哺乳動物、昆虫、酵母、菌類および細菌類の
発現用に非常に多くの型が当業界で公知である。例えば
Y.C.ヤングら、セル47巻3−10頁(1986年)を参照
されたい。
されているように、ヒトIL−11のcDNAは標準的
な技法を用いて合成され、発現ベクター、pXMでクロ
ーン化される(ヤングら、上記で引用)。このベクターは
哺乳動物細胞、例えばCos−1細胞でcDNA挿入物の
発現を可能にする。pXMはSV40エンハンサー、主
要アデノウィルス後期プロモーター、3部分先導配列、
および小さなハイブリッド介在配列、DHFRコード化
配列、SV40後期メッセージポリA添加部位並びにア
デノウィルスVaI遺伝子を含有する。このベクターをエ
ンドヌクレアーゼ酵素XhoIで直線化し、相補的な付着
末端を生じる合成オリゴヌクレオチドを添加して予め改
変したIL−11 cDNAの同等モル量に連結するこ
とができる。このようなオリゴヌクレオチドは市販によ
り入手できる[コラボラティブ・リサーチ・レキシント
ン、マサチューセッツ州]。
ることが認められているもう1つのベクターは、pEM
C2B1である。このベクターはアメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクション(ATCC)、ロックビル、
メリーランド州(米国)に受け入れ番号ATCC403
48で寄託されているpMT2pcから誘導できる。DN
Aは、プラスミドをPstIで消化することにより直線化
する。次にDNAをT4DNAポリメラーゼを用いてブ
ラントする。オリゴヌクレオチド5'TGCAGGCG
AGCCTGAATTCCTCGA3'を次にDNAに
連結し、5'末端にPstI部位を再生し、DHFR cD
NAのATGの前にEcoRI部位およびXhoI部位をつけ
加える。このプラスミドをpMT21と称する。pMT2
1を、プラスミドを2個の隣接するクローニング部位で
開裂するEcoRIおよびXhoIで切断する。508塩基対
のEMCV断片を制限酵素EcoRIおよびTaqαIでpM
T2ECAT1[S.K.ジョングら、ジャーナル・オブ・
ビロロジー63巻1651−1660頁(1989年)]から切断し
た。68ヌクレオチドの長さの1対のオリゴヌクレオチ
ドを合成し、ATGまでEMCV配列を重複させた。A
TGをATTに変え、Cを1個加え、3'末端でXhoI部
位を作る。TaqαI部位は5'末端に位置する。オリゴヌ
クレオチドの配列は:5' CGAGGTTAAAAAA
CGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGG
ACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACG
ATTGC 3'およびこれらの相補的鎖であった。
をEMCV EcoRIからTaqαIまでの断片およびTaq
αI/XhoIオリゴヌクレオチドに連結し、ベクターpE
MC2B1を産生した。このベクターはSV40の複製
開始点およびエンハンサー、アデノウィルス主要後期プ
ロモーター、アデノウィルス3部分先導配列の大部分の
cDNAコピー、小さなハイブリッド介在配列、SV4
0ポリアデニル化信号およびアデノウィルスVA I遺
伝子、DHFRおよびβ−ラクタマーゼマーカー、並び
にEMC配列を、哺乳動物細胞中望ましいcDNAを高
量発現させるのに適当な関係で含有する。EMC2B1
ベクターはエンドヌクレアーゼ酵素EcoRIで直線化
し、続いて発現を構築するEcoRI相補的末端を生じる
合成オリゴヌクレオチドを加えることにより予め改変し
たIL−11をコードするcDNAに同等モル量で別々
に連結する。
次に、通常の遺伝子工学の技術により適当な宿主細胞に
導入する。標準的な技法を用いて形質転換した細胞を培
養し、発現したIL−11を回収し、培養培地から精製
する。
を得るために、IL−11 DNA配列を含有するpX
Mベクターを実施例2に記載のとおりCos細胞にトラン
スフェクトする。トランスフェクトしたCos細胞のなら
し培地は、T1165検定で測定されるIL−11生物
学的活性を含有する。同様にIL−11のcDNAを含
有するpEMC−2B1の構築物をCHO細胞にトラン
スフェクトする。
らのIL−11のDNA配列をXhoIで挿入し、周知の
組み換え遺伝子工業の技術並びにpJL3およびpJL4
[ゴーフら、エンボ.ジェイ.4巻645−653頁(1985
年)]およびpMT2(pMT2−VWF、ATCC#67
122で出発;PCT出願PCT/US87/0003
3参照)のようなその他の既知ベクターを用いて、pX
M/IL−11ベクターに匹敵するその他の哺乳動物発
現ベクターを構築することもできる。
転換することにより、結果的にIL−11ポリペプチド
を発現させることができる。Cos細胞以外の哺乳動物宿
主細胞も、IL−11の発現に用いることができる。例
えば、共に通常の方法によりベクターDNAを安定して
完成させ、完成したベクターDNAを続いて増幅させる
のが好ましく、そのために選り抜きの哺乳動物宿主細胞
としてCHO細胞を用いることができる。
転換すると、標準的な免疫学的なまたは酵素検定によ
り、安定した形質転換体を、IL−11の発現に関して
ふるい分ける。IL−11ポリペプチドをコードするD
NAまたはmRNAの存在は、標準的な方法、例えばサ
ザーンまたはノーザンブロッティングにより検出でき
る。発現ベクターDNAを適当な宿主細胞に導入後数日
間、ポリペプチドをコードするDNAの一過性の発現
は、培養培地のタンパクの活性または免疫学的検定、例
えばT1165検定により、選別せずに測定される。
ゆる哺乳動物の制御配列を排除し、細菌の配列を挿入し
て細菌性ベクターを作ることによりIL−11の配列を
操作し、細菌細胞により本発明のIL−11ポリペプチ
ドを細胞内または細胞外に発現させることができる。
性の発現のための種々コドンを含有するように改変で
き、これは当業界で公知である。成熟IL−11配列
(表1で21−199アミノ酸をコードするヌクレオチ
ド)は、分泌性リーダーポリペプチドをコードするヌク
レオチド配列に効果的に枠内で結合し、成熟した種々タ
ンパクの細菌性発現、分泌および加工を可能にするのが
好ましく、これも当業界で公知である。次に細菌宿主細
胞で発現される化合物を全て既知の方法により回収し、
精製し、並びに/または物理化学的、生化学的および/
もしくは臨床パラメーターに関して特性化できる。
コリ中に細胞質タンパクとして発現させてもよい。この
場合、分子は塩酸グアニジンで完全に変性した後、必ず
再び折りたたまなければならないようであるが、この方
法も当業界で公知である。現在のところエシエリキア・
コリにおいて、IL−11を発現させる好ましい方法で
は、ヒトIL−11配列の最初の31コドンを除去す
る。次に以下の配列:
[例えば発行欧州特許出願第155476号に記載され
た方法を参照されたい]ために同様の操作を行うことが
できる。酵母細胞により本発明のタンパクを細胞内また
は細胞外に発現させるために、酵母制御配列を用いて酵
母ベクターをも構築できる。[例えば、発行PCT出願
WO第86/00639号および欧州特許出願EP第1
23289号に記載されている方法を参照されたい。]
HOセルラインの構築 哺乳動物から本発明のIL−11ポリペプチドの高量を
産生する1つの方法には、異種のIL−11遺伝子の多
重コピーを含有する細胞の構築が含まれる。カウフマン
・アンド・シャープ、ジャーナル・オブ・モレキュラー
・バイオロジー、上記(1982年)の方法に準じて異種遺伝
子を増幅可能なマーカー例えば、増加した遺伝子コピー
を含有する細胞をメソトレキセート(MTX)の濃度上
昇中に伸長用に選別できるためのジヒドロホレート・リ
ダクターゼ(DHFR)に結合できる。この方法は多種
細胞型で用いることができる。別法として、IL−11
cDNAおよび薬剤耐性選別遺伝子(例えばDHFR)
を同じベクターに導入することができる。この方法で好
ましいベクターはpEMC2B1である。
関連し、それのおよびDHFR発現プラスミドpAdA2
bSV(A)3[カウフマン・アンド・シャープ・モル・セ
ル・ビオール.3巻9号1598−1608頁(1983年)]の発現を
可能にするIL−11遺伝子含有pXMベクターは、リ
ン酸カルシウム共沈およびトランスフェクションにより
DHFR欠損CHO細胞、DUKX−BIIに同時導入
できる。
効に関連し、それの発現を可能にするIL−11遺伝子
含有pEMC−2B1ベクターを、原形質体融合および
トランスフェクションによりDHFR−欠損CHO細胞
に導入する。IL−11遺伝子およびDHFRマーカー
遺伝子は共に、IL−9をpEMC2B1に導入した場
合に効果的に発現する。IL−11遺伝子を前述のとお
りpMT2に導入でき、その結果できたベクターはpXM
/IL−11およびpAdA26SV(A)3の代わりに用
いることができる。
血清を有するアルファー培地中の成長から選択する。形
質転換体を生物検定、免疫検定またはRNAブロッティ
ングによりIL−9の発現に関して検査し、続いて陽性
プールを選択して、カウフマンら、モル.セル.ビオール
5巻1750頁(1983年)に報告されるように、MTXの濃度
上昇中(逐次的に0.02、0.2、1.0および5μM
MTX)に成長を増幅させる。増幅した系列をクロー
ニングし、生物学的に活性なIL−11ポリペプチド発
現をT1165検定により監視する。IL−11ポリペ
プチド発現はMTX耐性の水準の増強と共に増加するこ
とが予想される。
られたセルラインは適当な薬剤を選別することによりさ
らに増幅でき、結果的に得られたセルラインを再びクロ
ーニングし、発現量を本明細書で記載したT1165検
定を用いて評価できる。IL−11発現CHOセルライ
ンは血清不含培地中成長するように適合させることがで
きる。レクチン親和クロマトグラフィー、逆相HPLC
FPLC等のような技術を含む当業界でよく用いられ
る方法を用いて、セルラインのならし培地から、同一の
IL−11が単離できる。
増殖に対するIL−11の作用 メチルセルローズ細胞培養物を35mmラックス懸濁培養
皿(#5221R、ヌンク、インコーポレイテッド、ネ
イパービル、IL)中で確立した。5−フルオロウラシ
ル(5−FU)(アドリア・ラボラトリーズ、コロンビ
ア、OH)を、10〜15週令雌BDF1マウス(ARS
スプラーク・ドーリー、インディアナポリス、IN)に
尾静脈から150mg/kg体重を静脈注射により投与した
(ツダら、ジャーナル・オブ・セルラー・フィジオロジ
ー、117:308〜318(1983)およびG.S.ホジソ
ンら、ネイチャー、281:381〜382(1979))。
三匹のマウスから集めた大腿または脾臓から単一の細胞
懸濁液を調製した。低密度(<1077)単核細胞を40
0gにて遠心分離後、フィゴル−パクの界面から集め
た。これらの細胞をプラスチック製皿に一夜付着させた
後、非付着単核(骨髄および脾臓)細胞を5−FU注射
後、各2日および5日に採取した。
104個、5−FU−処理マウスの骨髄細胞5×104個
または脾臓細胞1×106個、α−培地(フロー・ラボ
ラトリーズ、インコポレイテッド、マックリーン、V
A)、1.2%1500cpsメチルセルローズ(フィッシ
ャーサイエンチフィク・コーポレーション、ノルクロ
ス、GA)、30%胎子牛血清(FCS)(ハイクロン・ラ
ボラトリーズ、インコーポレイテッド、ロガン、U
T)、1%脱イオン化フラクション・V・ウシ血清アル
ブミン(BSA)(シグマ・ケミカル・コーポレーショ
ン、セントルイス、MO)、1×10-4M2−メルカプ
トエタノール(イーストマン・オーガニック・ケミカル
ズ、ロチェスター、NY)および造血因子を含有した。
皿を37℃にて5%CO2を通気した加湿雰囲気中でイ
ンキュベートした。血小板生成細胞を除いて、細胞50
個以上からなるコロニーをインキュベーション後の所定
の日に倒立顕微鏡で計数した。4個以上の血小板生成細
胞が含まれるときは血小板生成細胞を計数した。コロニ
ーの型の省略記号を下記に記載する:GM、顆粒球/マ
クロファージ;Mast、乳房細胞コロニー;E、赤血球
バースト;M、血小板生成細胞コロニー;GEMM、顆
粒球/マクロファージ/血小板生成細胞コロニー[T.ナ
カタら、ジャーナル・オブ・セルラー・フィジオロジ
ー、111:239−246(1982)];GMM、顆粒球/
赤血球/マクロファージ/血小板生成細胞コロニー[T.
ナカタら、上掲;およびA.A.フォーザーら、ブラッ
ド、52:1243−1248(1978)];およびBl、芽球細胞
コロニー[T.ナカタら、プロシーディング・オブ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンス、79:3843
−3847(1982);およびT.スダら、上掲]。
分化細胞コロニー再平板培養により測定した。インキュ
ベーション5〜15日間に、50〜150個の細胞を含
む個々の芽球細胞コロニーをエッペンドルフピペットで
取り上げ、ヒト尿エリスロポイエチン(Ep)[1mg当り3
70Uの活性、カワキタ・マコト博士より入手、熊本医
科大学、熊本、日本]2U/ml、WEHI−3細胞の1
%濃縮(×20)培養物上清を含む二次メチルセルロー
ズ培養物中に再平板培養した。
効果が直接的であるのか、または他の因子によるものか
を調査するための造血細胞の純粋標的集団として用い
た。組換えネズミIL−3の100U/mlの存在下、5
−FU後4日の脾臓細胞100万個を培養した。遺伝子
工学的に高い力価(約30000U/ml)まで、ネズミI
L−3を産生するように計画されたチャイニーズ・ハム
スター卵巣(CHO)細胞によって調製された。培養8
日目に、各芽球細胞コロニー(50〜150個の細胞)
を培養物から取り上げ、集め、培地で2度洗浄し、種々
の因子の組合わせを含む各二次培養物中に再平板培養し
た。
換えヒトIL−6をエシェリキァ・コリ中に発現させ
た。ネズミ形質細胞腫−刺激活性をコード化したcDN
Aで形質導入されたCOS−1細胞により訓化された培
地(CM)あった。[S.R.ポールら、プロシーディン
グ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
ス、USA印刷中(1990)]
形成 正常骨髄細胞からのコロニー形成をIL−11により維
持した。Ep2U/mlの存在下または不存在下で、IL
−11は投与量−依存的にコロニーを生じさせた。1:
100稀釈のIL−11は最大のコロニー形成を維持し
た。しかしながら、IL−11とのインキュベーション
8日目または16日目に検出されたコロニーの総数は、
IL−3との培養物中よりも顕著に低かった。IL−1
1−含有培養物中に見られたコロニーはGM型が優勢で
あったが、数種の多系統(GMMおよびGEMM)コロニ
ーも観察された。1:100稀釈のIL−11は、イン
キュベーション16日目に3個の芽球細胞コロニーの形
成を維持した。
のコロニー形成 IL−11、IL−6、IL−3、単独および各種組合
わせの存在下で確立された培養物中150mg/kgの5−
FU [T.スダら、上掲およびG.S.ホジソンら、上掲]
の注射後2日目に採取された骨髄細胞からのコロニー形
成を検討し、IL−11が初期の始原細胞の増殖の維持
においてIL−3と相乗的に働くかどうかを調べた。
IL−11の、IL−3の最適濃度への添加はコロニー
形成を顕著に増強した。特に、IL−11の1:100
稀釈およびIL−3の存在下で、コロニー形成の動態は
各種因子により維持される動態に比較すると促進され
た。コロニー形成の時間的経過および維持されたコロニ
ーの総数はIL−6およびIL−3の組合わせで観察さ
れたのと類似している。1:100稀釈中のIL−11
単独は長期のインキュベーション後わずかなコロニー形
成を維持した。これらの結果はIL−11が初期の始原
細胞のIL−3依存性増殖を促進することを示してい
る。各相乗的因子の作用に関連する5−FU後2日の骨
髄細胞からのコロニー形成の動力学に対するIL−11
およびIL−6の組合わせの効果を別に検討した。IL
−6およびIL−11はIL−3依存性コロニー形成を
顕著に促進した。しかしながら、IL−6およびIL−
11の組合わせの効果は個別の効果と異ならなかった。
芽球細胞のコロニー発達の連続的観察 各種芽球細胞コロニーの成長率を培養図研究法により連
続的にプロットした。結果は、IL−11の相乗的効果
は幹細胞が休眠状態にある時期中に減少し、成長率がこ
れらの培養系で統計学的に異ならないから、IL−6ま
たはG−CSFで観察された効果と非常に類似した作用
をもたらすことを示した。
比較 IL−11およびIL−6に対応する芽球細胞コロニー
の増殖能力を再平板培養実験により検討した。すでに報
告されたように[K.イケブチら、ブラッド、72:2007
−2014(1988)]、各芽球細胞コロニーのうちに、二次再
平板培養効率中に顕著な変化が見られた。しかし、3種
の異なる一次培養条件で生長させた芽球細胞コロニーの
再平板培養効率には顕著な差はなかった。
に、二次コロニー中の二次GEMMコロニーの百分率お
よび未分化細胞胚芽細胞コロニー当りの二次GEMMコ
ロニーの発生率は、IL−3単独を含む培養物中に見ら
れる一次未分化細胞コロニーよりも、IL−11または
IL−6を含む培養物中に確認された一次未分化細胞コ
ロニーからの方が著しく高かった。これらのパラメータ
ーは、IL−11+IL−3を含む培養物およびIL−
6+IL−3を含む培養物間に顕著な差はなかった。
の相乗的活性が類似しており、二次GEMMコロニーの
発生率の増加が、芽球細胞コロニー形成中の幹細胞の
G.期間の短縮によるかもしれないことを示す[K.イ
ケブチら、上掲]。
細胞を集めて得られた標的細胞をGMコロニー形成に対
するIL−11およびIL−6の直接的効果を比較する
ために用いた。集めた芽球細胞は間質細胞を欠き、非常
に高い平板培養効率を示した。
〜150個を含む芽球細胞を取り、集め、Ep2U/ml
の存在中、IL−11、IL−6、またはIL−3を含
む二次培地に再平板培養する。これらのデータは芽球細
胞の少なくとも70%が造血始原細胞であることを示
す。
および多系統のコロニー形成を維持したが、IL−11
およびEpはマクロファージコロニーのみの産生を維持
した。IL−6およびEpの組合せほぼ同数数の純粋マ
クロファージコロニーだけでなく、好中球/マクロファ
ージのコロニーの形成も維持した。IL−11により維
持されたマクロファージコロニーはIL−6により維持
されたマクロファージコロニーより小さかった。
異なる始原細胞サブセットを除いて重複して相互に作用
すること、および優先的にマクロファージ始原細胞群を
維持することを示した。
L−6抗体中和効果 IL−11とIL−6間の直接コロニー維持活性がCos
細胞CMのそのものの性質の結果でなかったことを確認
するために、Cos−由来IL−6を阻害することで知ら
れる抗IL−6抗体の中和を、休止始原細胞からのIL
3−依存増殖に対するIL−11およびIL−6の相乗
効果の検討に用いた。
抗体の不在中で、5FU投与後5日の脾臓細胞からのコ
ロニーの発達は8日目のコロニー数により示されるよう
に顕著に促進された。抗IL−6抗体が存在したとき、
IL−6の相乗効果を完全に消失したが、IL−11の
効果は消失しなかった。抗体の効果は16日まで持続し
た。これらの結果は、Cos細胞CM中の明白な相乗効果
がIL−6により仲介されるという可能性を全く退け
た。
細胞の馴化培地(CM)は、培養中の多効能性始原細胞
のIL−3−依存増殖を促進することが判明し、活性は
独自にIL−6に関連した。促進の機構は休止幹細胞の
G.期間の短縮と思われる。
施態様を詳述したものである。この発明の実施において
多数の修飾および変更が当技術の熟練者に考えられるこ
とと思われる。そのような修飾および変更もまたこの発
明の範囲に含まれる。
る。 (1) 実質的に他の蛋白質様物質の随伴を欠くほ乳類I
L−11蛋白質。 (2) 表1のアミノ酸#22−アミノ酸#199のアミ
ノ酸配列またはその生物活性フラグメントを含む、1記
載の蛋白質。 (3) ヒトIL−11アミノ酸配列を含む、2記載の蛋
白質。 (4) 表1に示されたDNA配列と同じかまたは実質的
に同じDNA配列、そのフラグメントまたはそこにハイ
ブリダイズし得るDNA配列の全部または一部によりコ
ードされる、1記載の蛋白質。 (5) 下記特性: 1) SDS−PAGEにおける還元条件下での見かけ上
の分子量が約20kd、 2) 計算された分子量が約20kd、 3) T1165検定における生物活性、 4) IL−3の存在下での血小板生成細胞コロニー形成
検定における生物活性、 5) B細胞プラーク形成検定における生物活性 のうちの一つまたはそれ以上を有する、1記載の蛋白
質。
し得る発現制御配列を機能し得る形で随伴した10記載
のDNA配列により形質転換された細胞を培養し、IL
−11蛋白質をその条件培地から回収することにより製
造されるIL−11蛋白質。 (7) 実質的に他の蛋白質様物質の随伴を欠くヒトIL
−11蛋白質。 (8) ヒトIL−11蛋白質の複製および発現を指図し
得る発現制御配列を機能し得る形で随伴した、ヒトIL
−11蛋白質またはそのフラグメントの発現をコードす
るcDNA配列により形質転換されたセルラインを培養
することを含む、ヒトIL−11蛋白質またはそのフラ
グメントの製造方法。 (9) IL−11をコードし、第1表に示されたヌクレ
オチド塩基配列と同じかまたは実質的に同じ配列、その
フラグメントまたはそこにハイブリダイズし得るDNA
配列の全部または一部を含むDNA配列。 (10) 発現制御配列を機能し得る形で随伴した9または
19記載のDNA配列により形質転換された細胞。
記載の細胞。 (12) 9または19記載のDNA配列を含むプラスミド
・ベクター。 (13) さらに追加的なサイトカイン、ヘマトポイエチ
ン、生長因子または抗体の治療有効量を含む、12記載
の医薬。 (14) さらに追加的なサイトカイン、ヘマトポイエチ
ン、生長因子または抗体の治療有効量を含む、13記載
の組成物。 (15) サイトカインが、IL−1ないしIL−9、GM
−CSF、G−CSF、M−CSF、インターフェロン
類、Meg−CSF、MIF、LIF、TNFおよびエリ
スロポイエチンから成る群から選択される、14記載の
組成物。
−6である、15記載の組成物。 (17) 免疫系または造血系の刺激またはそれに関連した
疾患の処置に適した医薬組成物の製造における2または
3記載のIL−11蛋白質の用途。 (18) IL−6の非存在下でのT1165検定において
生物活性を有する均一ほ乳類IL−11。 (19) 発熱物質不含有の非経口投与に関して許容し得る
水性賦形剤中に2または3記載のIL−11蛋白質の有
効量を含む、免疫系または造血系の刺激またはその疾患
の処置を目的とする注射可能製剤。
る、pC1R6-トランスフェクションcos−1細胞条件
培地によるネズミNP−反応性B細胞の発達の向上性を
描いた図である。
における、pC1R6-トランスフェクションcos−1細
胞条件培地によるIL−3依存性ネズミ血小板生成細胞
コロニーの発達の向上性を描いた図である。
Claims (4)
- 【請求項1】 下記DNAのいずれかにより形質転換さ
れた宿主細胞を培養し、この培養物からT1165検定
において活性を示す蛋白質を回収することを特徴とす
る、蛋白質の製造法: (a)次のいずれかのヌクレオチド配列を有するDN
A: 【表1】 又は 【表2】 (b)(a)のDNAとストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズし得るDNA及び(c)(a)又は(b)
のDNAと縮重の関係にあるDNA。 - 【請求項2】 蛋白質が哺乳類IL−11蛋白質であ
る、請求項1記載の製造法。 - 【請求項3】 蛋白質がひとIL−11蛋白質である、
請求項2記載の製造法。 - 【請求項4】 蛋白質がさるIL−11蛋白質である、
請求項2記載の製造法。
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US44110089A | 1989-11-22 | 1989-11-22 | |
US441100 | 1989-11-22 | ||
US07/526,474 US5215895A (en) | 1989-11-22 | 1990-05-21 | Dna encoding a mammalian cytokine, interleukin-11 |
US526474 | 1990-05-21 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP3500597A Division JP2688539B2 (ja) | 1989-11-22 | 1990-11-20 | ほ乳類サイトカイン、il―11 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH104982A JPH104982A (ja) | 1998-01-13 |
JP2783361B2 true JP2783361B2 (ja) | 1998-08-06 |
Family
ID=27032674
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP3500597A Expired - Lifetime JP2688539B2 (ja) | 1989-11-22 | 1990-11-20 | ほ乳類サイトカイン、il―11 |
JP9051468A Expired - Lifetime JP2783361B2 (ja) | 1989-11-22 | 1997-03-06 | ほ乳類サイトカイン、il−11 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP3500597A Expired - Lifetime JP2688539B2 (ja) | 1989-11-22 | 1990-11-20 | ほ乳類サイトカイン、il―11 |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
US (4) | US5215895A (ja) |
EP (1) | EP0504177B1 (ja) |
JP (2) | JP2688539B2 (ja) |
KR (1) | KR970005050B1 (ja) |
AT (1) | ATE199096T1 (ja) |
CA (1) | CA2069428C (ja) |
DE (1) | DE69033700T2 (ja) |
DK (2) | DK0504177T3 (ja) |
ES (1) | ES2156852T3 (ja) |
GR (1) | GR3035627T3 (ja) |
HU (1) | HU215233B (ja) |
MX (1) | MX9203439A (ja) |
WO (1) | WO1991007495A1 (ja) |
Families Citing this family (54)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5215895A (en) * | 1989-11-22 | 1993-06-01 | Genetics Institute, Inc. | Dna encoding a mammalian cytokine, interleukin-11 |
AU651152B2 (en) * | 1990-08-29 | 1994-07-14 | Genetics Institute, Llc | Multidomain hematopoiesis stimulators |
JP2752819B2 (ja) * | 1990-11-08 | 1998-05-18 | 三共株式会社 | 新規サイトカイン |
KR100259827B1 (ko) | 1991-11-04 | 2000-06-15 | 브루스 엠. 에이센, 토마스 제이 데스로저 | 재조합 골형태 형성 단백질 헤테로다이머, 그 조성물 및 사용방법 |
US5460810A (en) * | 1992-09-02 | 1995-10-24 | Genetics Institute, Inc. | Method for maintaining gut epithelial cells by treatment with a cytokine such as interleukin 11 |
US5602301A (en) * | 1993-11-16 | 1997-02-11 | Indiana University Foundation | Non-human mammal having a graft and methods of delivering protein to myocardial tissue |
EP0755263A4 (en) * | 1994-03-31 | 2005-02-09 | Amgen Inc | COMPOUNDS AND METHODS FOR STIMULATING MEGAKARYOCYTE GROWTH AND THEIR DIFFERENTIATION |
US5795569A (en) * | 1994-03-31 | 1998-08-18 | Amgen Inc. | Mono-pegylated proteins that stimulate megakaryocyte growth and differentiation |
US6270757B1 (en) * | 1994-04-21 | 2001-08-07 | Genetics Institute, Inc. | Formulations for IL-11 |
US5582821A (en) * | 1994-07-22 | 1996-12-10 | Genetics Institute, Inc. | Methods for treating bleeding disorders |
US6274547B1 (en) | 1996-06-14 | 2001-08-14 | Genetics Institute, Inc. | Methods comprising the use of human interleukin-11 receptor proteins |
AU717928B2 (en) | 1994-12-22 | 2000-04-06 | Genetics Institute, Llc | Human interleukin-11 receptor |
US5760189A (en) * | 1995-06-02 | 1998-06-02 | Genetics Institute, Inc. | Protein recovery & purification methods |
US5824789A (en) * | 1995-06-07 | 1998-10-20 | Systemix, Inc. | Human growth factors, nucleotide sequence encoding growth factors, and method of use thereof |
EP0833656A4 (en) * | 1995-06-09 | 1999-02-03 | Yeda Res & Dev | RESTRICTINE P / ACTIVINE A CONTAINING PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS AND THEIR USE AS IL-6 OR / AND IL-11 ANTAGONISTS |
US6126933A (en) * | 1995-06-27 | 2000-10-03 | Genetics Institute | Methods of treating inflammatory bowel diseases by administering IL-11 |
US5679339A (en) * | 1995-06-27 | 1997-10-21 | Keith; James | Method of using IL-11 for treating spondyloarthropies |
US6887461B1 (en) | 1998-10-26 | 2005-05-03 | Genetics Institute, Llc | Method of using IL-11 for treating mucositis |
US6540993B1 (en) | 1995-06-27 | 2003-04-01 | Wyeth | Method of treating inflammatory bowel disease using a topical formulation of IL-11 |
US5686246A (en) * | 1995-08-03 | 1997-11-11 | Kornman; Kenneth S. | Detecting genetic predisposition to periodontal disease |
EP0871472A4 (en) * | 1995-10-27 | 2001-05-30 | Amrad Operations Pty Ltd | CYTOKINES AND THEIR USE IN THE TREATMENT AND / OR PROPHYLAXIS OF BREAST CANCER |
KR100426286B1 (ko) * | 1996-01-09 | 2004-06-30 | 주식회사 엘지생명과학 | 효모를이용한인간인터루킨-11의제조방법 |
AUPO439396A0 (en) | 1996-12-24 | 1997-01-23 | Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research, The | A method of treatment and prophylaxis |
AU764292B2 (en) * | 1998-01-23 | 2003-08-14 | Genetics Institute, Llc | Method of using IL-11 to enhance cell mediated immunity for treating various viral and parasitic infections and cancer |
CA2237915A1 (en) * | 1998-05-19 | 1999-11-19 | Stephen Shaughnessy | Osteoporosis treatment |
US6265165B1 (en) * | 1998-11-12 | 2001-07-24 | The Regents Of The University Of California | Methods for EST-specific full length cDNA cloning |
US6953777B2 (en) * | 1999-03-11 | 2005-10-11 | Genetics Indtitute LLC | Use of interleukin-11 to prevent immune-mediated cytotoxicity |
AU3738300A (en) * | 1999-03-11 | 2000-09-28 | Genetics Institute Inc. | Use of interleukin-11 to prevent immune-mediated cytotoxicity |
WO2001007076A1 (en) * | 1999-04-15 | 2001-02-01 | Genetics Institute, Inc. | Use of interleukin-11 to treat gastrointestinal disorders |
US6274135B1 (en) * | 1999-06-22 | 2001-08-14 | Genetics Institute, Inc. | Method of using IL-11 for inflammation associated with acute pancreatitis |
NZ516664A (en) * | 1999-07-15 | 2003-06-30 | Inst Genetics Llc | Formulations and compositions for interleukin-11 |
WO2003049693A2 (en) * | 2001-12-06 | 2003-06-19 | Wyeth | Method and composition for inducing weight loss |
US6982080B2 (en) * | 2002-03-15 | 2006-01-03 | Wyeth | Hydroxyethyl starch—containing polypeptide compositions |
CA2498931A1 (en) * | 2002-09-16 | 2004-03-25 | Wyeth | Delayed release formulations for oral administration of a polypeptide therapeutic agent and methods of using same |
PL1675608T3 (pl) | 2003-09-12 | 2007-11-30 | Wyeth Corp | Stałe fosforanowo wapniowe pałeczki do wstrzyknięć dla dostarczania białek osteogennych |
WO2005085283A1 (ja) * | 2004-03-03 | 2005-09-15 | Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd. | 修飾インターロイキン−11及びそれを含有する医薬組成物 |
WO2006081379A1 (en) * | 2005-01-26 | 2006-08-03 | Wyeth | Use of sfrps as markers of bmp activity |
WO2007067602A1 (en) * | 2005-12-06 | 2007-06-14 | Wyeth | Interleukin-11 compositions and methods of use |
US20080069796A1 (en) * | 2006-07-31 | 2008-03-20 | Kim Jong-Mook | Low Dose Treatment with an Interleukin-11 Analog |
WO2011151716A1 (en) | 2010-06-04 | 2011-12-08 | Lupin Limited | Process for the purification of recombinant human il-11 |
WO2012048298A2 (en) | 2010-10-08 | 2012-04-12 | Caridianbct, Inc. | Methods and systems of growing and harvesting cells in a hollow fiber bioreactor system with control conditions |
US9320777B2 (en) | 2011-05-13 | 2016-04-26 | Bolder Biotechnology, Inc. | Methods and use of growth hormone supergene family protein analogs for treatment of radiation exposure |
EP3068867B1 (en) | 2013-11-16 | 2018-04-18 | Terumo BCT, Inc. | Expanding cells in a bioreactor |
WO2015148704A1 (en) | 2014-03-25 | 2015-10-01 | Terumo Bct, Inc. | Passive replacement of media |
CN106715676A (zh) | 2014-09-26 | 2017-05-24 | 泰尔茂比司特公司 | 按计划供养 |
WO2017004592A1 (en) | 2015-07-02 | 2017-01-05 | Terumo Bct, Inc. | Cell growth with mechanical stimuli |
US11229683B2 (en) | 2015-09-18 | 2022-01-25 | Bolder Biotechnology, Inc. | Hematopoietic growth factor proteins and analogs thereof and angiotensin converting enzyme inhibitors for treatment of radiation exposure |
US11965175B2 (en) | 2016-05-25 | 2024-04-23 | Terumo Bct, Inc. | Cell expansion |
US11104874B2 (en) | 2016-06-07 | 2021-08-31 | Terumo Bct, Inc. | Coating a bioreactor |
US11685883B2 (en) | 2016-06-07 | 2023-06-27 | Terumo Bct, Inc. | Methods and systems for coating a cell growth surface |
JP7227159B2 (ja) * | 2017-01-16 | 2023-02-21 | ナンシャ・バイオロジックス・(ホンコン)・リミテッド | 酵母における組換えil-11の生産のためのシステムおよび方法 |
US11624046B2 (en) | 2017-03-31 | 2023-04-11 | Terumo Bct, Inc. | Cell expansion |
WO2018184028A2 (en) | 2017-03-31 | 2018-10-04 | Terumo Bct, Inc. | Cell expansion |
JP2024511064A (ja) | 2021-03-23 | 2024-03-12 | テルモ ビーシーティー、インコーポレーテッド | 細胞捕獲及び増殖 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4863727A (en) * | 1986-04-09 | 1989-09-05 | Cetus Corporation | Combination therapy using interleukin-2 and tumor necrosis factor |
US5215895A (en) * | 1989-11-22 | 1993-06-01 | Genetics Institute, Inc. | Dna encoding a mammalian cytokine, interleukin-11 |
US5371193A (en) * | 1990-05-21 | 1994-12-06 | Genetics Institute, Inc. - Legal Affairs | Mammalian cytokine, IL-11 |
JPH0571866A (ja) * | 1991-09-17 | 1993-03-23 | Matsushita Refrig Co Ltd | 断熱箱体 |
-
1990
- 1990-05-21 US US07/526,474 patent/US5215895A/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-20 CA CA002069428A patent/CA2069428C/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-20 DK DK90917548T patent/DK0504177T3/da active
- 1990-11-20 US US07/949,516 patent/US5700664A/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-20 JP JP3500597A patent/JP2688539B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-20 WO PCT/US1990/006803 patent/WO1991007495A1/en active IP Right Grant
- 1990-11-20 EP EP90917548A patent/EP0504177B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-20 AT AT90917548T patent/ATE199096T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-11-20 KR KR1019920701213A patent/KR970005050B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1990-11-20 DE DE69033700T patent/DE69033700T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-20 HU HU9201712A patent/HU215233B/hu unknown
- 1990-11-20 MX MX9203439A patent/MX9203439A/es unknown
- 1990-11-20 ES ES90917548T patent/ES2156852T3/es not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-05-21 DK DK066692A patent/DK66692A/da unknown
-
1997
- 1997-03-06 JP JP9051468A patent/JP2783361B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1997-03-10 US US08/814,459 patent/US5854028A/en not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-07-24 US US09/122,525 patent/US6066317A/en not_active Expired - Fee Related
-
2001
- 2001-03-23 GR GR20010400472T patent/GR3035627T3/el not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DK66692A (da) | 1992-07-22 |
DK0504177T3 (da) | 2001-04-02 |
CA2069428A1 (en) | 1991-05-23 |
KR920703819A (ko) | 1992-12-18 |
MX9203439A (es) | 1992-08-01 |
AU644389B2 (en) | 1993-12-09 |
EP0504177B1 (en) | 2001-02-07 |
HU215233B (hu) | 1998-11-30 |
US5854028A (en) | 1998-12-29 |
HUT64595A (en) | 1994-01-28 |
ATE199096T1 (de) | 2001-02-15 |
CA2069428C (en) | 2001-07-31 |
US5215895A (en) | 1993-06-01 |
JPH104982A (ja) | 1998-01-13 |
KR970005050B1 (ko) | 1997-04-11 |
DK66692D0 (da) | 1992-05-21 |
WO1991007495A1 (en) | 1991-05-30 |
DE69033700D1 (de) | 2001-03-15 |
GR3035627T3 (en) | 2001-06-29 |
HU9201712D0 (en) | 1992-09-28 |
EP0504177A1 (en) | 1992-09-23 |
JP2688539B2 (ja) | 1997-12-10 |
US5700664A (en) | 1997-12-23 |
DE69033700T2 (de) | 2001-09-13 |
US6066317A (en) | 2000-05-23 |
ES2156852T3 (es) | 2001-08-01 |
AU6757890A (en) | 1991-06-13 |
JPH05504560A (ja) | 1993-07-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2783361B2 (ja) | ほ乳類サイトカイン、il−11 | |
US5580753A (en) | DNA encoding the human cytokine, interleukin-9 | |
US4877729A (en) | Recombinant DNA encoding novel family of primate hematopoietic growth factors | |
Palacios et al. | IL3-dependent mouse clones that express B-220 surface antigen, contain Ig genes in germ-line configuration, and generate B lymphocytes in vivo | |
AU615630B2 (en) | Production and use of il-6 | |
KR970003518B1 (ko) | 신규 영장류 조혈성장인자족(family) | |
EP0494268B1 (en) | Method for inhibiting growth of stem cells | |
JP3261124B2 (ja) | ナチュラルキラー細胞刺激因子 | |
KR920003822B1 (ko) | 인체 과립구 대식 세포 및 호산성 세포 성장 인자 활성을 나타내는 폴리펩티드 | |
JPH04502164A (ja) | 犬科・猫科動物における感染の治療または予防のための化学組成物及び方法 | |
US5371193A (en) | Mammalian cytokine, IL-11 | |
JPH04504111A (ja) | ヒトマクロファージ遊走阻止因子 | |
AU644389C (en) | A mammalian cytokine, IL-11 | |
EP0544719A1 (en) | Cytokine production | |
AU662295B2 (en) | Cytokine production | |
Fletcher et al. | Recent progress in the discovery and invention of novel hematopoietic cytokines | |
KR970004941B1 (ko) | 신규 영장류 조혈 성장 인자족(family) 발현용 벡터 및 형질전환체 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 19980407 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090522 Year of fee payment: 11 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100522 Year of fee payment: 12 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100522 Year of fee payment: 12 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110522 Year of fee payment: 13 |
|
EXPY | Cancellation because of completion of term | ||
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110522 Year of fee payment: 13 |