JP2783361B2 - ほ乳類サイトカイン、ｉｌ−１１ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、免疫および造血系
細胞の機能を刺激する新規サイトカイン、およびこの因
子を得る方法および組換え遺伝子工学技術によるその製
法に関するものである。

【０００２】

【発明の背景】免疫系の細胞間にシグナルを送達する調
節蛋白質の増加しつつある一群が同定された。これらの
調節分子はサイトカインとして知られている。サイトカ
イン類の多くは、造血および免疫系細胞の生長および発
達、並びに生物活性を制御することが見出されている。
これらの調節分子には、コロニー刺激因子(例、ＧＭ−
ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦおよびマルチＣＳＦま
たはインターロイキン−３)、インターロイキン類(ＩＬ
−１ないしＩＬ−９)、インターフェロン類(アルファ、
ベータおよびガンマ)、腫よう壊死因子(アルファおよび
ベータ)、エリスロポイエチン、マクロファージ阻止蛋
白質、腫よう増殖因子および白血病阻止因子（ＬＩＦ）
が全て含まれる。これらのサイトカインは、骨髄、末梢
血、胎児肝臓、および他のリンパまたは造血器官からの
標的細胞による広い範囲の生物活性を呈する。例えば、
Ｆ.Ｒ．バークウィルおよびＦ．バーク、「イミュノロ
ジー・トゥデイ」、１０(９)：２９９(1989)、Ｇ.ウォン
グおよびＳ．クラーク、「イミュノロジー・トゥデ
イ」、９(５)：１３７(1988)並びにＳ.Ｃ.クラークおよ
びＲ.カーメン、「サイエンス」、２３６：1229−1237(1
987)参照。ある種のサイトカイン類の生化学的および生
物学的同定および特性検定は、天然供給源、例えば血液
および尿から入手され得る少量の天然因子により妨害さ
れた。最近、サイトカイン類の多くは、分子クローン化
され、異種的に発現され、均一に精製された。これらの
精製因子の幾つかは、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−
ＣＳＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、Ｉ
Ｌ−７、ＴＮＦ、インターフェロン類およびエリスロポ
イエチンを含め、インビボ造血および免疫系に対して調
節作用を示すことが見出されている。

【０００３】当業界では依然として、免疫応答性および
造血細胞の発達を刺激または促進し、医薬用途に適し
た、天然供給源から精製されるかまたは別法により均一
形態で製造される追加的蛋白質が要望されている。

【０００４】

【発明の要旨】一態様において、本発明は、実質的に他
のほ乳類蛋白質を含まない、ＩＬ−１１と呼ばれる新規
ほ乳類サイトカインを提供する。この蛋白質は、組換え
遺伝子工学技術により製造され得る。また、それは、因
子を自然にまたは他の因子により誘導されて産生する細
胞供給源から精製され得る。また、ＩＬ−１１は、化学
技術または上記で列挙した技術の組み合わせにより合成
され得る。

【０００５】活性を示す成熟ほ乳類ＩＬ−１１は、ドデ
シル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド・ゲル電気泳
動においてＩＬ−１１cＤＮＡトランスフェクションＣ
ＯＳ−１細胞から誘導された³⁵Ｓメチオニン標識上清液
を分析することにより測定すると、約２０kdの見かけ上
の分子量を特徴とする、約１７８アミノ酸蛋白質であ
る。成熟蛋白質について計算された分子量もまた約２０
kdである。

【０００６】この発明のＩＬ−１１蛋白質は様々な検定
で生物活性を表し、様々な造血および免疫機能の一般的
刺激因子としてのその役割を示している。この発明のＩ
Ｌ−１１蛋白質は、ＩＬ−６依存性マウス・プラズマサ
イトーマ・セルライン、Ｔ１１６５において増殖活性を
示す。またＩＬ−１１は、予備検定においてＢ細胞の成
熟を直接的または間接的に刺激する能力を立証した。具
体的には、ＩＬ−１１は、Ｂ細胞のＴ細胞依存的発達を
刺激すると考えられている。さらにそれは、血小板生成
細胞の増殖を刺激する検定でＩＬ−３との相乗作用を示
すが、他の系列にも同様に作用し得る。

【０００７】本発明の別の態様は、ほ乳類ＩＬ−１１蛋
白質の発現をコードするＤＮＡ配列である。このＤＮＡ
配列は、上述されているほ乳類ＩＬ−１１蛋白質の発現
をコードする単離されたＤＮＡ配列を含み得る。活性Ｉ
Ｌ−１１をコードするＤＮＡ配列は、第１表と同一また
は実質的に同一のヌクレオチド配列またはそのフラグメ
ントを含むことを特徴とする。このＤＮＡ配列は、ＩＬ
−１１暗号化配列に近接する５'および３'ほ乳類非暗号
化配列を含み得る。また、ＤＮＡ配列は、アミノ末端シ
グナルペプチドをコードし得る。第１表は、これらの非
暗号化５'および３'近接配列並びに霊長動物セルライン
ＰＵ３４から単離され、ＣＯＳ−１細胞で発現されたほ
乳類ＩＬ−１１のシグナル配列を示している。

【０００８】しかしながら、この発明のＤＮＡ配列は、
これらのフランキング（flanking)またはシグナル配列
の幾つかまたは全部を除外し得るものと理解される。さ
らに、生物活性ほ乳類ＩＬ−１１蛋白質をコードする本
発明のＤＮＡ配列はまた、表１の単離されたＤＮＡ配列
と、適当な条件下でハイブリダイゼーションし得るか、
または遺伝子コードの縮重がなければ前記条件下でハイ
ブリダイゼーションし得るＤＮＡを含み得る。すなわ
ち、この発明のＤＮＡ配列は、対立遺伝子的改変、種改
変または意図的な修飾に基づいた非暗号化配列、シグナ
ル配列または暗号化配列における修飾を包含または含有
し得る。

【０００９】また、本発明は、ベクターＤＮＡを含む組
換えＤＮＡ分子およびほ乳類ＩＬ−１１をコードするＤ
ＮＡ配列を提供する。ＤＮＡ分子は、選択された宿主細
胞においてＩＬ−１１の複製および発現を指図し得る調
節配列を機能し得る形で随伴したＩＬ−１１ＤＮＡを提
供する。また、本発明は、組換えＩＬ−１１蛋白質の発
現に使用される、前記ＤＮＡ分子により形質転換された
宿主細胞を提供する。

【００１０】本発明のＤＮＡ分子および形質転換細胞
は、別の態様、すなわち組換えほ乳類ＩＬ−１１蛋白質
またはそのペプチドフラグメントの新規製造方法で使用
される。この方法において、蛋白質発現を制御し得る適
当な調節または発現制御配列を機能し得る形で随伴した
ＩＬ−１１蛋白質またはそのフラグメントの発現をコー
ドするＤＮＡ配列（または上記組換えＤＮＡ分子）によ
り形質転換されたセルラインは、組換えＤＮＡの発現を
可能にする適当な条件下で培養される。次いで、この発
現されたＩＬ−１１蛋白質を、適当な慣用的手段により
宿主細胞または培養培地から採取する。この主張されて
いる方法は、蛋白質発現用宿主細胞として若干の既知細
胞を使用し得る。現時点でＩＬ−１１の製造に好ましい
セルラインは、ほ乳類セルラインおよび細菌細胞であ
る。

【００１１】この発明の別の態様は、ほ乳類ＩＬ−１１
またはその１種もしくはそれ以上の生物活性ペプチドフ
ラグメントの治療有効量を含む医薬組成物を提供する。
これらの蛋白質またはペプチドフラグメントは、医薬的
に許容し得る賦形剤により製剤化され得る。これらの医
薬組成物は、造血細胞の数または活性レベルの欠乏を特
徴とする疾患状態の処置方法において、単独または他の
適当な薬剤と組み合わせた形で使用され得る。ＩＬ−１
１を含む医薬組成物はまた、免疫系の疾患、例えば免疫
不全症の処置に使用され得る。

【００１２】ＩＬ−１１含有組成物は、ＩＬ−３と相乗
作用した状態で血小板生成細胞の生長および分化を刺激
するのに使用され得る。追加的な使用領域には、血小板
形成、後天的な化学療法または骨髄関連血小板減少症が
ある。また、ＩＬ−１１は、エフェクター分子として作
用することにより、他のサイトカインの機能を改善する
と思われる。ＩＬ−１１組成物はまた、Ｂ細胞の産生ま
たは機能を直接的または間接的に刺激するのに有用であ
り得る。すなわち、ＩＬ−１１組成物は、癌治療、感染
症の処置、創傷治癒の促進および免疫系全般の刺激に使
用され得る。ＩＬ−１１はまた、ある種の抗原、特にワ
クチンに対する免疫応答を強化するのに使用され得る。

【００１３】従って、この発明のさらに別の態様は、患
者に対し、適当な医薬用担体と共にＩＬ−１１またはそ
のペプチド・フラグメントの治療有効量を投与すること
による、これらおよび／または他の病的状態の処置方法
である。これらの治療方法は、ＩＬ−１１またはそのペ
プチドフラグメントと同時またはそれに続いて少なくと
も１種の他のサイトカイン、ヘマトポイエチン、インタ
ーロイキン、成長因子または抗体の有効量を投与するこ
とを含み得る。

【００１４】本発明のさらに別の態様は、ほ乳類ＩＬ−
１１またはそのペプチドを指向した抗体である。従っ
て、この態様の一部として、本発明は、前記の抗体を分
泌し得るセルラインおよびそれらの製造方法を主張して
いる。

【００１５】本発明の他の態様および利点は、さらに後
記の本発明の好ましい態様の詳細な記載中に記載されて
いる。

【００１６】

【発明の詳細な記載】本発明は、他のほ乳類蛋白質およ
び蛋白質様物質の随伴を実質的に含まない形態での、生
物活性ほ乳類サイトカイン、ＩＬ−１１を提供する。こ
の蛋白質は、治療適用に有用な純粋活性ＩＬ−１１の大
量生産を可能にする組換え技術により製造され得る。別
法として、この蛋白質は、それを分泌または発現するほ
乳類セルラインから精製された均一蛋白質として入手さ
れ得る。さらにＩＬ−１１またはその活性フラグメント
は、化学的に合成され得る。

【００１７】ほ乳類ＩＬ−１１は、最初、長期培養中に
健康なマカークサルから得られた骨髄細胞を置き、それ
らをレトロウイルスＵ１９−５で感染させることにより
生長させた霊長動物セルラインから単離された[ドクタ
ー・ロジャー・コーン、タフツ・メディカル・スクー
ル]。適当な抗生物質とのインキュベーション後、ＰＵ
３４と命名された生きたセルラインを、その生長特性に
関して選択し、エシェリヒア・コリで発現させたＩＬ−
１アルファにより誘導した。条件培地は、ＩＬ−６に対
する中和性抗体の存在下、ＩＬ−６依存性マウス・プラ
ズマサイトーマ細胞を用いた増殖検定において活性を示
した。例えばＧ.Ｇ．ウォング等、「サイエンス」、２
２８：８１０−８１５(1985)、Ｙ.Ｃ.ヤング等、「セ
ル」、４７：３−１０(1986)、およびＡ.Ｅ.ナーメン
等、「ネイチャー」、３３３：５７１−５７３(1988)に
既に記載されている発現クローニング方法に従い、ＩＬ
−１−刺激（２４時間２μ／mlＩＬ−１）ＰＵ３４細胞
mＲＮＡからcＤＮＡライブラリーを製造した。

【００１８】ほ乳類細胞、例えばＣＯＳ−１細胞におい
てcＤＮＡ挿入体の発現を可能にする発現ベクター中に
ライブラリーを構築した。２００−５００cＤＮＡクロ
ーンのプールから製造された５μgのＤＮＡでＣＯＳ−
１細胞をトランスフェクションすることにより、ライブ
ラリーのスクリーニングを行った。Ｔ１１６５検定で活
性に関して上清液を検定することにより、ＩＬ−１１活
性を発現するcＤＮＡクローンが同定された。

【００１９】Ｔ１１６５活性を有する単離クローンは、
pＰＵ３４−ＴＲＡ（pＣ１Ｒ６とも呼ばれる）と命名さ
れ、配列決定された。表１は、ＩＬ−１１ポリペプチド
の霊長動物およびヒト・クローンの両方のcＤＮＡ配列
およびアミノ酸配列（１文字コード）を示す。霊長動物
配列における１−７２１位のヌクレオチド配列は、pＣ
１Ｒ６から得られた。残りのヌクレオチド７２１−１１
０２は、pＣ１Ｒ６とのハイブリダイゼーションにより
単離された第２霊長動物cＤＮＡから配列決定された。
ＩＬ−１１のプラズマサイトーマ刺激活性をコードする
ヒトcＤＮＡは、pＰＵ３４−ＴＲＡ（pＣ１Ｒ６）から
の挿入体との直接ハイブリダイゼーションにより、ヒト
肺セルラインＭＲＣ５[ジャコブス等、「ネイチャ
ー」、２２７：４３(1970)により記載]から製造されたc
ＤＮＡライブラリーから単離された。ヒトＩＬ−１１ヌ
クレオチド配列から見出される差異は、表１において霊
長動物配列の上に示されており、アミノ酸配列に生じた
変化は霊長動物配列における適当なアミノ酸の下に示さ
れている。

【００２０】霊長動物ヌクレオチド配列は１１００塩基
対を含む。霊長動物配列は、７２塩基対の５'非暗号化
配列を含む。また、表１の配列は、４３１塩基の３'非
暗号化配列を示す。同じくヒト・ヌクレオチド配列は、
５９７ヌクレオチドの単一の長い転写解読枠を含んでい
た。

【００２１】霊長動物およびヒト配列は、両方とも、表
１の霊長動物ヌクレオチド７３位から始まる非プロセシ
ング１９９アミノ酸ポリペプチドを予測させる単一の長
い転写解読枠を特徴とする。霊長動物およびヒト・クロ
ーンの両方から得られたＩＬ−１１の予測されたアミノ
酸配列における(１)位Ｍetから(２１)位Ａlaまでの最初
の２１アミノ酸は、慣用的ほ乳類分泌リーダー配列
[Ｄ．ペールマン等、「ジャーナル・オブ・モレキュラ
ー・バイオロジー」、１６７：３９１−４０９(1983)]
と類似した疎水性アミノ酸の範囲を含む。成熟ＩＬ−１
１蛋白質のＮ−末端（表１の下線部）は、アミノ酸配列
ＰＲＯ−ＧＬＹ−ＰＲＯ−ＰＲＯ−ＰＲＯ−ＧＬＹによ
り構成される。当該蛋白質は、まず１９９個のアミノ酸
から成る前駆体として合成され、これが２１位と２２位
のアミノ酸の間で蛋白質加水分解酵素的に開裂して、ア
ミノ酸２２−２３位の配列Ｐro−Ｇlyから始まり、ヌク
レオチド６７１−６７２位のＴＧＡ終止コドンのアミノ
酸１９９位の後で終わる成熟１７８アミノ酸ポリペプチ
ドを与える。成熟蛋白質の計算された分子質量は、ＩＬ
−１１cＤＮＡトランスフェクションＣＯＳ−１細胞か
ら誘導された上清液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元条件）に
より現れた新規蛋白質帯の見かけ上の分子量と完全に対
応しており、両場合とも約２０kdである。

【００２２】

【表３】

【表４】

【表５】

【００２３】ＩＬ−１１cＤＮＡのヌクレオチド配列
を、ジェンバンクに記録されたヌクレオチド配列と比較
した。他の蛋白質の公表されたＤＮＡ配列とのヌクレオ
チド配列の重要な類似性は、全く見出されなかった。Ｉ
Ｌ−１１のリーダー配列およびガンマ・インターフェロ
ンおよびＩＬ−６の前記配列間からは、軽い相同性しか
見出されなかった。ＩＬ−１１の暗号化配列および他の
公表されたポリペプチド配列間からは、重要な相同性は
全く見出されなかった。

【００２４】さらに、実施例１１でさらに詳細に記載さ
れている通り、ＩＬ−１１は、始原細胞のＩＬ−３依存
性増殖の相乗的因子である。相乗作用の成果は、幹細胞
のＧ₀期間の短縮である。少なくとも一つの培養システ
ムにおいて、ＩＬ−１１は、ＩＬ−６と同様、血小板生
成細胞コロニー形成の促進においてＩＬ−３と相乗的に
作用する[Ｓ.Ｒ.パウル等、「プロシーディングス・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシー
ズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリ
カ」、８７：７５１２−７５１６(1990)]。すなわち、
ＩＬ−１１、並びにＧ−ＣＳＦおよびＩＬ−６は、初期
および後期造血リネッジと相互作用すると思われる。し
かしながら、同じく上記の相乗的因子であるＩＬ−６と
は対照的に、ＩＬ−１１は、貯蔵された芽細胞の二次培
養物においてマクロファージ増殖のみを優先的に刺激す
る。すなわち、ＩＬ−１１は、他の既知リンホカイン
類、因子および蛋白質とは異なると思われる。ＩＬ−１
１はまた、リンパ様リネッジ内でのある役割を演じる場
合に関与し、その結果、防御系の多重アームを刺激す
る。すなわち、ＩＬ−１１は、実験および臨床目的の両
方に関する幹細胞の操作に有用であると予測される。

【００２５】この配列によりコードされるほ乳類ＩＬ−
１１の生物活性は、適当な発現制御配列の制御下、クロ
ーン化配列によりトランスフェクションされたほ乳類細
胞により産生された機能的ポリペプチドから検出され
た。表１に記録された通りプラスミドpＰＵ３４−ＴＲ
Ａ（pＣ１Ｒ６）におけるクローン化された霊長動物配
列は、１９８９年１１月１４日付けでメリーランド、ロ
ックビル、パークローン・ドライブ１２３０１のアメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクションにＡＴＣＣナ
ンバー６８１７２として寄託された。ヌクレオチドおよ
びアミノ酸レベルの両方で霊長動物配列からの修飾によ
り表１に示されたクローン化されたヒト配列は、１９９
０年３月３０日付けでメリーランド、ロックビル、パー
クローン・ドライブ１２３０１のアメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクションにＡＴＣＣナンバー６８２８
４として寄託された。

【００２６】ＩＬ−１１ポリペプチドは、下記の通り、
Ｔ１１６５検定において活性を示す。初めの試験におい
て、ＩＬ−１１は、１：５００程度の高い最終希釈率で
も、標準ネズミひ臓細胞プラーク形成検定において免疫
グロブリン分泌性Ｂ細胞の形成を顕著に向上させること
が見出された。このシステムでは、ひ臓の正常な細胞構
成成分から成る状況において特異的免疫原、４−ヒドロ
キシ−３−ニトロフェニル−アセチル修飾ウマ赤血球細
胞（ＮＰ−ＨＲＢＣ）に応答する培養中におけるＢ細胞
の発達が測定される。ひ臓細胞培養物からのＴ細胞のＴ
hy１補体による消耗の結果、応答が完全に廃棄され、Ｎ
Ｐ−応答性Ｂ細胞の増加は、霊長動物ＩＬ−１１の存在
下でも、少なくとも部分的にＴ細胞の存在に左右される
ことが立証された。従って、Ｂ細胞ミトゲン、例えばリ
ポ多糖類はＴ細胞の非存在下でＮＰ−特異的プラーク形
成細胞の形成を刺激するため、ＩＬ−１１の活性は、直
接的Ｂ細胞有糸分裂促進作用に帰属し得ない。すなわ
ち、ＩＬ−１１は、ＴおよびＢリンパ球の増殖、分化お
よび活性化を調整し得る。

【００２７】様々な造血培養システムにおけるＩＬ−１
１の作用の分析により、血小板生成細胞の発達に対する
著しい作用が証明された。標的としてネズミ骨髄細胞を
用いた場合、ＩＬ−１１は単独ではほとんど効果を示さ
ないが、ＩＬ−３により助けられると血小板生成細胞コ
ロニー形成を３倍促進した。ＩＬ−３およびＩＬ−１１
によるＣＦＵ−Ｍeg形成は、陽性対照として使用される
形成不能性イヌ血清の場合を凌いでいた。

【００２８】また、本発明により提供されるＩＬ−１１
ポリペプチドには、表１の組換えＩＬ−１１の配列と類
似しているが、自然にまたは意図して工学的に修飾が加
えられた配列によりコードされる因子が含まれる。すな
わち、本発明はまた、他の霊長動物蛋白質をコードし、
ＩＬ−１１ポリペプチドの発現をコードするＤＮＡ配列
の随伴を欠く、これらの新規ＤＮＡ配列を包含する。こ
れらのＤＮＡ配列には、上記で示したＤＮＡ配列および
そのフラグメントと同一または実質的に同一の配列、お
よび厳密なハイブリダイゼーション条件[Ｔ.マニアチス
等、「モレキュラー・クローニング(ア・ラボラトリー
・マニュアル)」、コールド・スプリング・ハーバー・
ラボラトリー(1982)３８７−３８９頁参照]下で表１の
ＤＮＡ配列とハイブリダイゼーションする配列が含まれ
る。上記の厳密な一ハイブリダイゼーション条件の一例
は、６５℃で４ＸＳＳＣ、次いで６５℃で１時間０.１
ＸＳＳＣ中で洗浄を行うハイブリダイゼーションであ
る。別法として、厳密なハイブリダイゼーション条件の
一例は、４２℃で５０％ホルムアミド、４ＸＳＳＣであ
る。

【００２９】リラックスなハイブリダイゼーション条件
下でＩＬ−１１またはその活性フラグメントに対する配
列とハイブリダイズし、発現に際してＩＬ−１１の生物
学的特性をもつＩＬ−１１ペプチドをコード化するＤＮ
Ａ配列は、また新規なＩＬ−１１ポリペプチドをコード
化している。このような非ストリンジエントハイブリダ
イゼーション条件の例は、４ＸＳＳＣ５０℃または４２
℃で３０−４０％ホルムアミドを用いるハイブリダイゼ
ーションである。例えば、ＩＬ−１１配列と顕著な相同
性をもつ領域を共有しＩＬ−１１の生物学的性質の１種
以上をもつ蛋白質をコード化するＤＮＡ配列は、たとえ
そのＤＮＡが第１表のＩＬ−１１配列またはＩＬ−１１
活性をもつペプチドをコード化するそのフラグメントと
ストリンジエントにハイブリダイズしなくとも、明らか
にＩＬ−１１ポリペプチドをコード化している。

【００３０】同様に、ＩＬ−１１ポリペプチドをコード
化するが遺伝子コードの縮重によりコドン配列が異なる
ＤＮＡ配列もまたこの発明に含まれる。ＩＬ−１１蛋白
配列およびＩＬ−１１の生物活性を示すペプチドフラグ
メントをコード化するＤＮＡ配列におけるアレル性変異
体並びにその類似体または誘導体もまたこの発明に含ま
れる。点突然変異またはそれがコード化するポリペプチ
ドの生物活性、半減期もしくは産生のようなＩＬ−１１
蛋白質のある種の特性を増強する修飾導入により起こっ
たＩＬ−１１ＤＮＡ配列のその他の変異体もこの発明に
含まれる。

【００３１】組換え体技術における上記cＤＮＡ配列の
使用に加えて、この発明のＩＬ−１１ポリペプチドはま
た既知の慣用化学合成により製造することができる。合
成的手段によりこの発明のポリペプチドを構築する方法
は当業者に知られている。合成構築されたＩＬ−１１ポ
リペプチド配列または表１のアミノ酸残基連続配列を複
製しまたは部分的に複製するフラグメントもまたこの発
明の一部をなす。この合成構築ＩＬ−１１ポリペプチド
配列は、天然ＩＬ−１１ポリペプチドと１次、２次また
は３次構造的および立体的特性を共有するため、ＩＬ−
１１の生物特性を共通して有し得る。すなわち、これら
は天然の精製ＩＬ−１１ポリペプチドの生物学的に活性
なまたは免疫学的な代替物として治療および免疫学的方
法に使用し得る。

【００３２】ＩＬ−１１またはその活性フラグメントの
蛋白質、ペプチドまたはＤＮＡ配列における修飾は、公
知技術を用いて当業者が行なうことができる。ＩＬ−１
１配列において関心がもたれる修飾には、コード配列中
の１種以上の選択アミノ酸の置換、挿入または欠失が含
まれる。このような置換、挿入または欠失の変異誘発技
術は当業者に周知である。[例えば、米国特許第４５１
８５８４号参照。]

【００３３】この明細書に記載するＩＬ−１１ポリペプ
チド配列のその他の特異的変異は、例えば１種以上のグ
リコシル化部位の挿入を含み得る。アスパラギン結合グ
リコシル化認識部位をアミノ酸の欠失、置換または付加
によりペプチド配列に、またはヌクレオチドのそれらに
よりＤＮＡ配列に、挿入し得る。このような変化は、Ｏ
−結合炭水化物の付加により修飾される分子の任意の部
位または分子中の他の部位になし得る。このような変化
したヌクレオチドまたはペプチドの発現により、その部
位がグリコシル化され得、薬理学的または生物学的性質
が変化または改善され得る変異体を産生する。

【００３４】ＩＬ−１１の活性全体またはその一部を保
持すると期待されるその他のＩＬ−１１配列の類似体お
よび誘導体も、この明細書の開示を与えられた当業者は
容易に作ることができる。このような修飾の１つは、Ｉ
Ｌ−１１配列に存在するリジン残基へのポリエチレング
リコール（ＰＥＧ）の結合、または１個以上のリジン残
基もしくはＰＥＧもしくはＰＥＧ誘導体と反応する他の
アミノ酸残基を配列中に挿入してＰＥＧ部分の結合を可
能にすることである。このような修飾はこの発明に含ま
れると考えられる。

【００３５】この発明はまたＩＬ−１１またはその活性
フラグメントの製造法を提供する。この発明の方法の１
つは、発現ベクターにＩＬ−１１ポリペプチドコード化
cＤＮＡを導入してＩＬ−１１発現システムを作ること
を含む。選択した宿主細胞をベクターで形質転換し培養
する。それ故、この発明の方法は、既知の調節配列の制
御下にＩＬ−１１ポリペプチドまたはそのフラグメント
の発現をコード化するＤＮＡ配列で形質転換した適当な
細胞またはセルラインを培養することを含む。発現され
た因子を当業者に公知の適当な手段により培地（または
細胞内発現の場合細胞）から採取し、分離し、精製す
る。

【００３６】この方法に適する細胞またはセルライン
は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）または
３Ｔ３細胞のような哺乳類細胞であり得る。適当な哺乳
類宿主細胞および形質転換法、培養法、増幅法、スクリ
ーニング法および生成物の産生、精製法の選択は当技術
において知られている。例えばゲチングおよびサムブル
ック、ネイチャー２９３巻６２０−６２５頁（1981
年)、またはカウフマン等、モレキュラー・アンド・セ
ルラー・バイオロジー５巻（７号）1750−1759頁（1985
年)またはハウリー等、米国特許第４４１９４４６号参
照。その他の適当な哺乳類セルラインはさるのＣＯＳ−
１セルラインおよびＣＶ−１セルラインである。哺乳類
宿主細胞の別の例は、特に、形質転換セルラインを含め
た霊長類セルラインおよびげっ歯類セルラインを含む。
正常な２倍体細胞、一次組織のインビトロ培養で得られ
る細胞株、および一次外植体もまた適当である。候補細
胞は、選択遺伝子において遺伝子型として欠乏している
か、または優勢に作用する選択遺伝子を含み得る。その
他の適当な哺乳類細胞としては、ヒーラ（Ｈila）、マ
ウスＬ−９２９細胞、スイス系由来の３Ｔ３、Ｂalb−c
もしくはＮＩＨマウス、ＢＨＫまたはＨakハムスターセ
ルラインを含むが、これらに限定されるものではない。

【００３７】同様に宿主細胞として有用でこの発明に適
当な宿主細胞は細菌細胞である。例えば、エシエリキア
・コリの種々の株（例えばＨＢ １０１およびＭＣ １０
６１）はバイオテクノロジー分野で宿主細胞として知ら
れている。バチルス・サブチリス、シュードモナス、そ
の他の桿菌の種々の株等もこの方法で使用し得る。

【００３８】当業者に公知の酵母細胞の種々の株がこの
発明のポリペプチドの発現用宿主細胞として入手でき
る。さらに、所望ならば、昆虫細胞もこの発明の宿主細
胞として使用できる。例えば、ミラー等、ジエネティッ
ク・エンジニアリング８巻２７７−２９８頁（プレナム
・プレス、1986年）およびその引用文献参照。

【００３９】この発明はまた、新規ＩＬ−１１ポリペプ
チドの発現に用いる組換え体ＤＮＡ分子またはベクター
を提供する。これらのベクターは、この発明のＩＬ−１
１ポリペプチドをコード化する新規単離ＤＮＡ配列を含
有する。別法として、上記のような修飾配列をとり込ん
だベクターもこの発明の態様であり、ＩＬ−１１ポリペ
プチドの生産に有用である。この方法で用いるベクター
はまた、この発明の配列をコード化するＤＮＡと機能可
能に結合し宿主細胞中で複製および発現を指示し得る選
択した調節配列を含み得る。

【００４０】下記の実施例で用いたベクターはpＸＭ
[Ｙ．Ｃ．ヤング等、セル４７巻３−１０頁(1986年)]で
ある。この明細書に記載する哺乳類細胞発現ベクター
は、当業者に周知の技術により合成することができる。
ベクターの成分、例えばレプリコン、選択遺伝子、エン
ハンサー、プロモーター等は、公知の方法により天然源
から得られまたは合成できる。カウフマン等、ジャーナ
ル・オブ・モレキュラー・バイオロジー１５９巻５１１
−５２１頁(1982年)およびカウフマン、プロシーディン
グス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンシズ・ユーエスエイ８２巻６８９−６９３頁(1985
年)。別法として、ベクターＤＮＡは、ラレパピローマ
ウイルスゲノム[ラッキー等、セル３６巻３９１−４０
１頁(1984年)]の全部または一部を含み得、また安定な
エピソーム要素としてＣ１２７マウス細胞のようなセル
ライン中にとり込むことができる。適当な宿主細胞に対
するこれらのベクターによる形質転換はＩＬ−１１ポリ
ペプチドの発現をもたらす。

【００４１】数々の型が哺乳類、昆虫、酵母、真菌およ
び細菌発現について当技術で知られるその他の適当な発
現ベクターもまたこの目的に用いることができる。細胞
源から均質になるまで精製され、または組換え体もしく
は合成で製造されたＩＬ−１１は免疫不全または障害の
処置のための医薬製剤または処方に使用することができ
る。ＩＬ−１１はまた、造血始原細胞または幹細胞の不
全または関連障害の処置に使用することができる。ＩＬ
−１１組成物は、がんおよびその他の疾患、放射線もし
くは薬剤への露出から生ずる病理学的状態であって例え
ば白血病、細菌もしくはウイルス感染、貧血、Ｂ細胞も
しくはＴ細胞欠乏（骨髄移植後の免疫細胞または造血細
胞欠乏を含む）の処置に使用することができる。ＩＬ−
１１はまた、種々のワクチンに対する免疫応答を増強
し、長期持続性で効果が大きな免疫を作り出すために用
いることができる。前述のように、ＩＬ−１１組成物は
Ｂ細胞および巨核球の分化刺激に使用することができ
る。ＩＬ−１１ポリペプチド組成物によるこのような疾
患状態の治療処置は、現在入手できる薬剤による処置で
起る望ましくない副作用を回避するものである。

【００４２】この発明のポリペプチドは、単独で、また
は他のサイトカイン類、ヘマトポイエチン類、インター
ロイキン類、成長因子類または抗体と組合わせて、上記
症状の処置に用いることができる。

【００４３】この発明はまた、上述の症状の処置用治療
法および組成物を提供する。このような組成物は、この
発明のＩＬ−１１ポリペプチドの治療的有効量を、医薬
として許容される担体と混合して含有する。この組成物
は非経口的に全身投与し得る。別法として、組成物は静
脈内投与できる。所望ならば、組成物は皮下または局
所、例えば傷害部位に適用できる。全身投与の場合、こ
の発明の治療用組成物は発熱性物質不含有の非経口投与
上許容される水溶液である。このような医薬として許容
されpＨ、等張性、安定性等に必要な注意を払った蛋白
質溶液の製造法は当技術の範囲内にある。

【００４４】上述の状態の処置方法に用いる用量、用法
は、薬剤の作用を修飾する種々の要因、例えば患者の症
状、体重、性別および食事、感染の重度、投与時期およ
びその他の臨床的因子を考慮して担当医師により定めら
れる。一般に、１日用量はポリペプチド１−１０００mg
またはポリペプチド５０−５０００単位（１単位はＴ１
１６５アッセイで最高の５０％の刺激をもたらすポリペ
プチド濃度)(体重１kg当り)の範囲内である。

【００４５】この発明の治療法および組成物はまた、他
のひと因子との同時投与を含み得る。この用途のための
サイトカインまたはヘマトポイエチンの例としては、公
知の因子であるＩＬ−１〜ＩＬ−９、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ
−ＣＳＦ、ＭＩＦ、Ｍeg−ＣＳＦ、インターフェロン
類、ＴＮＦおよびエリスロポイエチンが含まれる。ＩＬ
−１１療法に関与するに特に望ましい候補品は、ＩＬ−
３およびＩＬ−６を含み得る。Ｂ細胞成長因子、Ｂ細胞
分化因子または好酸球分化因子類のような成長因子もま
たＩＬ−１１との同時投与に有用であることがわかっ
た。上記の用量は治療用組成物の追加的成分と相殺する
ように調整することができる。処置される患者の経過は
慣用手段により監視することができる。

【００４６】これらの新規ポリペプチドの他の用途は、
インビトロまたはインビボ診断および治療法用の標準的
方法による抗体の発生である。このような抗体には、公
知方法で製造したモノクローナルおよびポリクローナル
抗体、並びにキメラ抗体または「組換え体」抗体が含まれ
る。またこの発明により、選択した哺乳類に抗原として
ＩＬ−１１またはそのフラグメントを与え、その後その
動物細胞を公知技術によりある種のがん細胞と融合させ
て不死化細胞を作ることにより生ずるセルラインが提供
される。このようなセルラインの生成およびこの発明の
哺乳類のＩＬ−１１ポリペプチドの全部または一部に対
する抗体の生成に用いる方法もまたこの発明に包含され
る。

【００４７】この発明の抗体は、例えば抗体を検出可能
な標識または標識系と結合させることにより、インビボ
およびインビトロ診断法に用いることができる。別法と
して、これらの抗体は、例えば当業者に公知のある種の
毒性または治療用化合物またはその一部分と結合させる
ことにより、インビボおよびインビトロの治療目的に用
いることができる。

【００４８】以下に示す実施例は、この発明のクローニ
ング、哺乳類ＩＬ−１１の発現および製造、並びに他の
方法および製品を例示的に記述するものである。これら
の実施例は説明を目的とするもので、この発明の範囲を
限定するものではない。

【００４９】実施例１−mＲＮＡの単離およびcＤＮＡラ
イブラリーの構築 霊長類セルライン、pＵ３４を成長させると、実施例７
のＴ１１６５検定においてＩＬ−６に対する中和抗体の
存在下、有意な活性を生じるのが見出された。ＰＵ−３
４間質セルラインは、両方向性欠損形質転換レトロウィ
ルスベクター（a defective amphotropic transforming
retroviral vector）で不死化することにより、長期間
の霊長類骨髄培養より得られた。Ｕ１９レトロウィルス
プラスミドは以前に報告されたように構築し[Ｐ.Ｓ.ジ
ャットら、ジャーナル・オブ・ビロロジー５９巻７４６
−７５０頁(1986年)]、ＳＶ４０ラージＴ抗原配列およ
びＧ４１８−耐性をコードしモロネイ・ネズミ白血病ウ
ィルス末端反復配列から離れて発現するネオーホスホト
ランスフェラーゼ配列を含有する。両方向性産生クロー
ンは、パッケージング・セルラインψＡＭ[Ｒ.コーン
ら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンス・オブ・ジ・ユナイテッド・ステー
ツ・オブ・アメリカ８１巻6349−6353頁(1984年)]をψ
２Ｕ１９−５[Ｐ.Ｓ.ジャット、上記で引用]からのエコ
トロピック・ウィルスの収穫物で感染させ、続いて０.
７５mg／mlのＧ４１８中で選別することにより産生し
た。

【００５０】１個のクローンψＡＭＵ１９−ＢＬは、Ｎ
ＩＨ／３Ｔ３細胞で検定した場合、５×１０³ Ｇ４１
８−耐性ＣＦＵ／mlの力価の組換えＳＶ４０ウィルスを
産生する。長期骨髄培養物（ＬＴＭＣ）は常法で完成さ
れ、１０％ウシ胎仔血清、１０％ウマ血清、１００単位
／mlペニシリンおよび１００μg／mlストレプトマイシ
ン（シグマ・ケミカル・カンパニー、セント・ルイス・
ミズーリー州）完全長期培養培地を補充したイスコフ改
変ダルベッコ培地(ＩＭＯＭ)中で維持した。

【００５１】ＬＴＭＣ付着層は、完成後７および１０日
にψＡＭＵ１９−ＢＬウィルス貯蔵物２mlで、８μg／m
lポリブレーン（アルドリッヒ・ケミカル・カンパニー
・インコーポレーティッド、ミルウォーキー、ウィスコ
ンシン州)の存在下３３℃で２.５時間感染させた。感染
後最初の３日間は、培養物を０.５mg／mlＧ４１８中で
選別した。感染後１４日にＧ４１８耐性コロニーをと
り、マルチウェルプレート（コーニング・グラスウェ
ア、コーニング、ニューヨーク）に広げた。

【００５２】ＰＵ−３４と称する１個のセルラインのな
らし培地を長期培養物中の始原細胞を保持する能力に基
づいて広範に分析した。このセルラインは多分化能ヒト
および霊長類始原細胞を、培養中３週間まで維持する能
力があることを示した。ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＧＭ−Ｃ
ＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦおよびＬＩＦ／ＨＩＬＤ
Ａを含む既知の成長因子活性に加え、ＩＬ−１−の刺激
したＰＵ−３４ならし培地は、Ｔ１１６５ネズミ・プラ
スマ細胞腫セルラインの増殖を刺激する能力があること
が判明したが、これは通常ＩＬ−６に反応する[Ｒ.Ｐ.
ノールダンら、上記で引用］のだが、ヒトＩＬ−６に対
する中和抗血清の存在下でさえも反応する。この生物検
定は、ＰＵ−３４から得られたcＤＮＡライブラリーの
発現クローニングの間に用いられた。生物検定について
の詳細は以下の実施例７で記載する。

【００５３】ＰＵ−３４細胞のcＤＮＡライブラリーは
以下のように調製した。ＰＵ−３４細胞をＩＬ１−α
で、２単位／mlの濃度で２４時間刺激した。ポリアデニ
ル化ＲＮＡ(ポリＡ＋ＲＮＡ)を常法によりこれらの細胞
から調製した。全ＲＮＡをチルグウィンら、バイオケミ
ストリー１８巻5294−5299頁(1979年)の方法に準じて、
刺激したpＵ３４細胞から抽出した。mＲＮＡは、オリゴ
(dＴ)−セルロース・クロマトグラフィーにより調製し
た[Ｈ.アビブら、プロシーディング・オブ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ジ・ユナイテ
ッド・ステーツ・オブ・アメリカ６９巻1408−1412頁(1
972年)]。

【００５４】mＲＮＡを５μg用いて、ウォングら、(上
記で引用)により報告されたように、ＤＮＡポリメラー
ゼＩで、および２本目の鎖の反応においてはＲＮＡアー
ゼＨで[Ｔ.マニアティスら、上記で引用]、二本鎖cＤＮ
Ａを合成した。Ｃos−１細胞発現ベクターpＸＭ[Ｙ.Ｃ.
ヤングら、セル４７巻３−１０頁(1986年)]を独特なＸh
o I部位で直線化し、同等モル量のセミ−Ｘho I適合c
ＤＮＡに連結した。連結反応を用いてエシエリキア・コ
リ形質転換能細胞(ＨＢ１０１株)に形質転換し[Ｙ.Ｃ.
ヤングら、上記で引用]、約５０００００個のアンピシ
リン耐性コロニーのライブラリーを得た。

【００５５】実施例２−ＤＮＡの調製およびＣos−１細
胞のトランスフェクション Ｇ.Ｇ.ウォングら（上記で引用）により以前に報告され
た発現クローニング系を用いて、以下のようなＩＬ−１
１活性をコード化するcＤＮＡを単離した。細菌性コロ
ニーをニトロセルロース膜上に写した。各膜からコロニ
ーをＬ−ブロース中にかきとり、プラスミドＤＮＡを前
述の方法[Ｊ.Ａ.メイヤーズら、ジャーナル・オブ・バ
クテリオルジー１２７巻1529−1536頁(1976年)]により
単離した。各々の最初のＤＮＡ試料を２００−５００コ
ロニーのプールから調製した。

【００５６】各プラスミドＤＮＡの５μgを用いて、０.
１mＭクロロキンを添加したジエチルアミノエチル−デ
キストラン（ＤＥＡＥ）試験計画によりＣos−１細胞を
トランスフェクトした[Ｌ.Ｍ.ソンパイラックら、プロ
シーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンス・オブ・ジ・ユナイテッド・ステーツ・オブ
・アメリカ７８巻7575−7578頁(1981年)およびＨ.ルー
スマンら、タクル．アシッズ・レス・１１巻1295−1308
頁(1983年)；Ｙ.Ｃ．ヤングら、上記で引用]。トランス
フェクトしたＣos−１細胞の培養上清を、トランスフェ
クション後７２時間に収穫し、Ｔ１１６５刺激剤活性を
検定した（実施例７参照）。

【００５７】ふるい分けした３１７回のプールのうち、
検出可能な量のＩＬ−６（抗ＩＬ−６抗体で中和するこ
とにより測定）を含有し、Ｔ１１６５検定において抗Ｉ
Ｌ−６抗体の存在下に活性が残存する２個の陽性プール
からのプラスミドＤＮＡを、Ｃos−１細胞中に再びトラ
ンスフェクトし、トランスフェクトした上清をＴ１１６
５検定において活性を再びふるい分けした。このような
活性を有する１個のプールを選別し、含有するクローン
の数がより少なくなるようにさらに分割した。この群か
ら、検定においてプールを全て集めたものよりも高い活
性を示すプールを選別した。このプールから個々のクロ
ーンを取り出した。これらのＤＮＡを調製し、トランス
フェクトし、トランスフェクトした上清をＴ１１６５検
定において活性を試験した。２個の陽性のクローンを固
定した。１個はＩＬ−６活性を発現し、もう１個は抗Ｉ
Ｌ−６抗体により中和されない活性を発現した。この後
者のプールをさらに分割し、択一的にpＣ１Ｒ６かまた
はpＰＵ３４−ＴＲＡと称する、新規なＴ１１６５増殖
活性をコードする単一の陽性プラスミドが得られるまで
トランスフェクションを繰り返した。このクローンを実
施例７の検定において再び試験した。

【００５８】pＣ１Ｒ６−トランスフェクトしたＣos−
１細胞のならし培地の活性をもまた、その他のサイトカ
イン、例えばネズミおよびヒトＩＬ−６、並びにネズミ
ＧＭ−ＣＳＦと比較した。ならし培地はＴ１１６５細胞
による測定可能な３Ｈ−チミジンの取り込みを、最終的
に１：１０００まで希釈した時でさえ刺激した。至適濃
度では、新規なサイトカインは基底値の１００倍以上の
取り込みを助けた。

【００５９】このcＤＮＡの挿入物を、ジデオキシ鎖終
結法により、超螺旋鋳型上で合成オリゴヌクレオチドプ
ライマーを用いて配列決定した。[Ｆ.サンガーら、プロ
シーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンス・オブ・ジ・ユナイテッド・ステーツ・オブ
・アメリカ７４巻5463−5467頁(1977年)]。表１に示すp
Ｃ１Ｒ６のcＤＮＡのヌクレオチド配列は予想される１
９９アミノ酸ポリペプチドをコードする５９７ヌクレオ
チドの単一の長い転写解読枠を含有する。１７−２０個
の疎水性アミノ酸の広がりが推定上の開始コドンに直ぐ
近接して存在し、これは通常のタンパク分泌性先導配列
に類似している。

【００６０】初期cＤＮＡクローンであるpＣ１Ｒ６は不
完全であることが判明したが、さらにcＤＮＡを分析
し、この転写物がサイトカイン遺伝子発現の重要な制御
要素であると考えられるＲＮＡ不安定配列、ＡＴＴＴＡ
の多重コピーを有する約４２０塩基対の３'非コード化
配列を含有することが明らかになった[Ｇ.シャウら、セ
ル４６巻６５９−６６７頁(1986年)]。

【００６１】実施例３−タンパク分析 pＰＵ３４−ＴＲＡのcＤＮＡによりコードされるポリペ
プチドをパルス標識化実験を用いて同定した。クロロキ
ンで誘導後４８時間に、ＩＬ−１１クローンの組み換え
ＤＮＡでトランスフェクトしたＣos−１細胞の培養上清
を除去し、細胞を１.０mlのＤＭＥＭ中の０.５mＣi[³⁵
Ｓ]メチオニンで、３７℃で４時間パルス標識化した。
放射線標識した上清の試料１０μlを回収し、ラエムリ
緩衝液系で１２％ゲルの１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ[Ｕ.
Ｋ.ラエムリ、ネイチャー２２７巻６８０−６８５頁(19
70年)]に供した。電気泳動後、ゲルを蛍光光度法増強溶
液（エンハンス；ニュー・インブランド・ニュークレ
ア、ボストン、マサチューセッツ州）中に浸し、乾燥
し、Ｘ線フィルムに爆露した。

【００６２】³⁵Ｓ−メチオニン標識化pＣ１Ｒ１６−ト
ランスフェクトしたＣos−１細胞のならし培地のＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(ＳＤＳ−ＰＡＧＥ)
分析により、約１８０個のアミノ酸分泌タンパクに予想
される分子量に合致する偽トランスフェクトした対照に
は存在しない、主に２０キロダルトンの種が存在するこ
とが示された。

【００６３】この大きさの予測および発現タンパクの異
質性の欠如は、アスパラギン結合炭水化物の添加するた
めのコンセンサス配列(Ａsn−Ｘ−Ｔhr／Ｓer)Ｒ.Ｊ.ウ
ィンツラー、「ホルモナル・プロテインズ・アンド・ペ
プタイスセ」リー,Ｃ.Ｈ.編(アカデミック・プレス・ニ
ューヨーク)１頁〜(1973年)]が存在しないことに一致す
る。成熟タンパクの予期されるアミノ酸配列にはシステ
イン残基は含まれず、これはその他の任意のサイトカイ
ン遺伝子では見られない様相である。

【００６４】実施例４−ＩＬ−１１を発現するヒト・セ
ルライン ２個のヒト・セルラインを、少なくとも１種のＩＬ−１
１の源泉として同定した。具体的には、ヒト肺線維芽細
胞セルライン、ＭＲＣ−５[アメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクションより受け入れ番号ＡＴＣＣ ＣＣ
Ｌ １７１で入手可能]を、１単位／mlの組み換えヒト
ＩＬ−１−アルファ（ジェネティックス・インスティテ
ュート、インコーポレーテッド）および１０^-7Ｍフォル
ボール１２−１３ジブチレート（シグマ）で誘導して、
Ｔ１１６５検定で試験した。誘導したならし培地が、Ｉ
Ｌ−６の飽和量より大きなカウント／分を呈する、すな
わちＰＵ３４の誘導ならし培地により呈するのと類似の
活性が観察された。ＩＬ−１１が存在すれば低ＩＬ−６
信号を増強するであろうということは注目されている。
さらに、以下に詳細に記載するように、このセルライン
のノーザン・ブロットにより、ＩＬ−１１のメッセージ
が存在することが示される。

【００６５】さらに、ヒト栄養芽層セルライン、ＴＰＡ
３０−１（ＡＴＣＣより、受け入れ番号ＣＲＬ１５８３
で入手可能）もまた、ノーザン・ブロットにおいてＩＬ
−１１メッセージの存在を誘導しないことが示される。
その他のＩＬ−１１のヒト源泉もまた、本発明の教示に
より入手でき、容易に同定できる。

【００６６】実施例５−ＲＮＡ分析 Ａ．ＰＵ３４ 細菌性ＩＬ−１アルファ誘導ＰＵ３４細胞の全細胞性Ｒ
ＮＡ５μgを、２.２Ｍホルムアルデヒド含有１.２％ア
ガロースゲルを通して電気泳動した[Ｈ.レーラッハら、
バイオケミストリー１６巻4743頁(1977年)]。ホルムア
ルデヒド−変性ＲＮＡを報告されたとおりナイロン膜
（ゼータバインド;クノー、メリーデン、コネチカット
州）に移し[Ｅ.Ｍ.サザーン、ジャーナル・オブ・モレ
キュラー・バイオロジー９８巻５０３−５１４頁(1975
年)]、³²Ｐ標識化cＤＮＡプローブでプローブした。

【００６７】cＤＮＡプローブはベクターからcＤＮＡ挿
入物をＸhoIで制限酵素で開裂することにより作り、プ
ライマーとして無作為なオリゴヌクレオチドを用いて、
ＤＮＡポリメラーゼIの大きな断片の存在下³²Ｐ−dＣＴ
Ｐで挿入物を標識化した[Ａ.Ｐ.フェイルベルグら、ア
ナリティカル・バイオケミストリー１３２巻６−１３頁
(1983年)]。ナイロン膜を６５℃で４時間予めハイブリ
ダイズし、４×ＳＳＣ、０.５％ＳＤＳ ５×デンハー
ト溶液および１００μg／ml変性サケ精子ＤＮＡからな
るハイブリダイゼーション溶液中６５℃で１６時間、³²
Ｐ−dＣＴＰ標識化cＤＮＡプローブでハイブリダイズし
た。その他の用いたプローブには、ヒト(rh)ＩＬ−１
α、rhＩＬ−２、rhＩＬ−３、rhＩＬ−４、rhＩＬ−
５、rhＩＬ−６、rhＩＬ−７、rhＩＬ−９、rhＧＭ−Ｃ
ＳＦ、rhＭ−ＣＳＦ、ＬＩＦ／ＨＩＬＤＡおよび霊長類
ＩＬ−１１がある。

【００６８】ハイブリダイゼーションの後、膜を２×Ｓ
ＳＣ／０.１％ＳＤＳで６５℃で３０分間、次に０.２×
ＳＳＣ／０.１％ＳＤＳで６５℃で３０分間の２回洗浄
した。ついで膜を乾燥し、−７０℃でカルシウム・タン
グステート・インテンシファイング・スクリーンの存在
下Ｘ線フィルムに適用した。

【００６９】このノーザン・ブロット分析により、ＰＵ
３４ mＲＮＡが約２.５キロベースおよび約１.５キロ
ベースの大きさのメッセージを有し、pＣ１Ｒ６プロー
ブでハイブリダイズされる２重のＩＬ−１１転写物を含
有することが示された。上記表IのcＤＮＡ配列の大きさ
は、より小さなメッセージとよく相関する。この違い
は、さらにcＤＮＡクローンを単離および分析すること
により示されるように、別々にスプライシングして大き
な転写物中さらに３'非コード化配列を生じる結果であ
る。ＰＵ３４細胞による２個の転写物の存在は、ＩＬ−
１α誘導がない場合は明白な転写物がないので、ＩＬ−
１α制御されるようである。

【００７０】レクチン刺激ヒト末梢血リンパ球からまた
はヒト胎盤からのヒトＴセルラインＣ１０−ＭＪ２[レ
アリーら、ブラッド６９巻９５３頁(1987年)]、Ｃ５−
ＭＪ２[アリアら、サイエンス２２３巻1086頁(1984年)]
およびＭo[ゴルデら、プロシーディング・オブ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ジ・ユナ
イテッド・ステーツ・オブ・アメリカ７７巻５９３頁(1
980年)]からのmＲＮＡ調製物中、ＲＮＡブロット分析に
より同定される転写物はない。従って、唯一同定される
ＩＬ−１１の源泉は、間充組織由来の付着細胞である。

【００７１】Ｂ．ＭＲＣ−５ ヒト胎児肺線維芽細胞セルライン（ＭＲＣ−５）は、ヤ
コブスら、ネイチャー２２７巻４３頁(1970年)に報告さ
れるように、５０ng／mlの酢酸フォルバール・ミリステ
ート（ＰＭＡ）および１単位／mlのＩＬ−１αで刺激
後、両方の転写物を発現することが見出された。上記で
ＰＵ３４ＲＮＡに関して記載されるように、２種の転写
物は、このセルラインにおいて、約２.５キロベースお
よび約１.５キロベースの同一の大きさのメッセージで
同定された。ＭＲＣ−５セルラインから単離されるヒト
cＤＮＡ配列の分析により、霊長類およびヒトのコード
化部域は、ヌクレオチドレベルで約９５％の同一性を共
有することが示された。

【００７２】Ｃ．ＴＰＡ３０−１ ヒトＳＶ４０−形質転換栄養芽層セルライン、ＴＰＡ３
０−１に関して、同じプローブを用い、同じ方法を実施
した場合、大きな約２.３キロベースのＩＬ−１１メッ
セージのみが同定された。

【００７３】実施例６−ＤＮＡ配列分析 pＰＵ３４−ＴＲＡのcＤＮＡクローンのヌクレオチド配
列を、報告されるように[Ｇ.Ｇ.ウォングら、およびＹ.
Ｃ.ヤングら、上記で引用]、Ｂal３１ヌクレアーゼ消化
による重複断片の順序をもった組の生成およびＭ１３ベ
クターへのサブクローニングにより決定した[Ｍ.ポンク
ツら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンス・オブ・ジ・ユナイテッド・ステ
ーツ・オブ・アメリカ７９巻4298−4302頁(1982年)；お
よびＪ.メッシングら、ジーン、１９巻２６９−２７６
頁(1982年)]。１本鎖ＤＮＡを調製し、ヌクレオチド配
列をジデオキシヌクレオチド鎖終結法により決定した
[Ｆ.サンガーら、プロシーディング・オブ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ジ・ユナイテ
ッド・ステーツ・オブ・アメリカ、７４巻5463−5467頁
(1977年)]。このヌクレオチド配列は上記表１に示す。

【００７４】実施例７−検定における生物学的活性 Ａ．Ｔ１１６５増殖検定 Ｔ１１６５ ＩＬ−６依存性ネズミプラスマ細胞腫細胞
[Ｒ.Ｐ.ノルダンら、サイエンス２３３巻５６６頁(1986
年);ドクター・ノルダン、ナショナル・インスティテュ
ーツ・オブ・ヘルスより入手]は１０％加熱不活化ウシ
胎仔血清、２mＭグルタミン、１００単位／mlペニシリ
ン、１００μg／mlストレプトマイシン（全てギブコ、
グランド・アイランド、ニューユーク）５×１０^-5Ｍベ
ーター・メルカプトエタノール（シグマ・ケミカル・カ
ンパニー、セント・ルイス、ミズーリー州）を補充し、
およびＣＨＯ細胞で産生させた１０−２０単位／mlの組
み換えヒトＩＬ−６（ジェネティックス・インスティテ
ュート・インコーポレーテッド）を補充したＲＰＭＩ中
で通常どおり成長させる。２−４日経過後、細胞を培養
から取り出し、洗浄して残留ＩＬ−６を除去し、７.５
×１０⁴−１×１０⁵セル／mlの濃度で再懸濁する。

【００７５】検定試料（ＰＵ３４ならし培地かまたはp
Ｃ１Ｒ６−トランスフェクトしたＣos細胞ならし培地）
を９６ウェルマイクロタイタープレート上、ＩＬ−６不
含培養培地１００μlで２検体ずつ連続希釈する。次に
上記細胞懸濁液を各ウェルに加え、プレートを３７℃で
２−３日間恒温培養する；³Ｈ−チミジンの０.５μＣi
[デュポント、ウィルミントン、デルウェア州]を検定の
最後の６時間、各ウェルに加える。細胞をＧＦＣ型Ｃ濾
紙（ＬＫＢ）上に収穫し、水およびエタノールで洗浄
し、乾燥する。濾紙を次にシンチレーション用液中に浸
し、ＬＫＢ平面シンチレーションカウンターで計数す
る。³Ｈ−チミジンの取り込みにより増殖を測定する。

【００７６】ＰＵ３４細胞から誘導したならし培地は、
ＩＬ−６の飽和量よりも多いＴ１１６５細胞の増殖を引
き起こし、これは別の因子の存在を示唆している。ヒト
ＩＬ−６に対する抗体の存在下で検定した場合、低いが
有意な活性がならし培地に残存する。非常に低量のＩＬ
−６を含有するＩＬ−１誘導ＰＵ３４のならし培地の分
画化試料をもまたヒトＩＬ−６に対する抗体の存在下お
よび不在下で検定し、その結果は、程度は低いが単独で
増殖でき、低量のＩＬ−６とで相乗する能力がある因子
の存在が示唆された。

【００７７】ＰＵ３４ライブラリーのトランスフェクシ
ョンからのＣos細胞上清もまた、単独およびヒトＩＬ−
６に対する抗体＋至適量内のネズミＩＬ−６のカクテル
の存在下、活性を検定した。抗体はＰＵ３４細胞により
産生される霊長類ＩＬ−６を中和できるが、ネズミＩＬ
−６を中和することができない。従って相乗因子はライ
ブラリーに存在するＰＵ３４ ＩＬ−６からの干渉をう
けることなくふるい分けできる。表１の成熟ＩＬ−１１
タンパクは、この検定において、１００希釈単位／mlの
最大活性の半分であるという特徴がある。

【００７８】Ｂ．Ｂセルプラーク形成検定 Ｂセルプラーク形成検定を、Ｒ.Ｍ.オハラら、ジャーナ
ル・オブ・イムノロジー１４１巻2935−2842頁(1988年)
に報告されている方法に準じてＩＬ−１０発現Ｃos細胞
に関して実施した。ネズミプラーク形成検定は、本来の
Ｃ５７Ｂ１／６マウスからの７.５×１０⁶脾臓細胞を３
×１０⁶ ４−ヒドロキシ−３−ニトロフェニル−アセ
チル改変ウマ赤血球（ＮＰ−ＨＲＢＣ）と共に０.７５m
lの５％ウシ胎仔血清を補充したミッシェル−ダットン
培地[Ｒ.Ｉ.ミッシェルら、ジャーナル・オブ・エクス
ペリメンタル・メディシン１２６巻４２３−４４２頁(1
967年)]中、試験試料（ＩＬ−１１含有Ｃos細胞ならし
培地）と共に、または伴なわずに５日間恒温培養するこ
とにより実施した。ＮＰ−共役ウマ赤血球（Ｈ−ＲＢ
Ｃ）またはヒツジ赤血球（Ｓ−ＲＢＣ）を、以前に報告
されたように[Ｐ.Ｂ.ハウスマンら、ジャーナル・オブ
・イムノロジー１３４巻1388−1396頁(1985年)]、１ml
のパックしたＨ−ＲＢＣまたはＳ−ＲＢＣ（コロラド・
セリューム・カンパニー、デンバー、コロラド州)と共
に、ジメチルホルムアミド（シグマ・ケミカル・カンパ
ニー、セントルイス、ミズーリー州）中、１０mgのＮＰ
−サクシンイミド(ケンブリッジ・バイオケミカル、イ
ンコーポレーティッド、ケンブリッジ、英国)を反応さ
せることにより調製した。

【００７９】これらの培養物に、５％ウシ胎仔血清を含
有するが試験試料（ならし培地）を含まない補充用培地
を、毎日さらに０.１ml供給した。ＮＰ−反応性Ｂセル
は、ドレッサーら、「ハンドブック・イン・エクスペリ
メンタル・イムノロジー」(Ｄ.Ｗ.ワイヤー、ブラックウ
ェル、オックスフォード)、２７１頁(1973年)に報告さ
れるようにＮＰ−共役−ヒツジＲＢＣプラーク検定を用
いて培養期間の最後に同定し、ＩＬ−１１含有ならし培
地で支持される培養物から得られるプラークの数を培地
のみを補充した培養物から得られるプラークの数と比較
することにより、反応率を算出した。典型的な実験で
は、外来性因子の欠如した基底反応では、プレートした
７.５×１０⁶セルあたり、６０００ＮＰ−特異性プラー
ク形成細胞を産生した。

【００８０】このような検定の結果を図１に示す。対照
反応のパーセントは、ＮＰ−ＨＲＢＣで刺激し、pＣ１
Ｒ６−トランスフェクトしたＣos−１細胞ならし培地の
規定の希釈により支持される本来の脾細胞の５日間の培
養中のＮＰ−反応性Ｂセルの成長の増強を、培地のみを
補充した対照培養物と比較する。Ｃos産生哺乳動物ＩＬ
−１１は、この検定においてプラーク形成単位／培養物
が２ １／２−３倍に増強され、このことは、ＩＬ−１
１がＢセル刺激および分化に直接的に働くか、またはＴ
セル刺激に間接的に働き、Ｂセルの反応に影響を及ぼす
その他のサイトカインを分泌する。

【００８１】Ｃ．ネズミ・フィブリン・クロット検定 Ｃos細胞産生哺乳動物ＩＬ−１１もまた、巨核球コロニ
ー形成検定においてＳ.クリアら、エクスプ．ヘマトー
ル．１５巻８９６−９０１頁(1987年)に報告されるよう
に実質的に行い、および２％仔ウシ血清を添加して改変
した方法で、活性を試験した。簡単に記載すると、ネズ
ミコロニー形成単位巨核球（ＣＦＵ−Ｍeg）検定は、
２.５×１０⁵ネズミ骨髄細胞を２０％ウシ胎仔血清を補
充したＩＭＤＭの０.４ml中、６ウェル皿にプレートし
て実施した。クロット形成は０.２５mgフィブリノーゲ
ンおよび０.２５単位のスロンビン（シグマ・ケミカル
・カンパニー、セントルイス、モンタナ州）を３７℃で
添加することにより開始した。種々に希釈した試験試料
をフィブリンクロットに加え、続いて培養物を３７℃で
６日間、恒温培養した。クロットをＳ.クリヤら、上記
で引用、およびＡ.ナケフら、プロシーディング・オブ
・ザ・ソサイエティー、フォー・エクスペリメンタル・
バイオロジー・アンド・メディスン１５１巻５８７−５
９０頁(1976年)に報告されるように、２.５％グルター
ルアルデヒドで固定し、０.５mg／mlのアチセルチオコ
リン・ヨーダイドで染色した。陽性のコロニー（巨核球
のみを含有）は直接検鏡して数えた。コロニーの数は２
検体ずつ評価した。

【００８２】図２に結果を示す。コロニー数は、(１)イ
ヌ無形成貧血血清の１：１０希釈；(２)１５０単位／ml
のネズミＩＬ−３；(３)刺激剤なし；および(４)１：１
０もしくは(５)１：５０希釈のpＣ１Ｒ６−トランスフ
ェクトしたＣos−１細胞ならし培地のみ、または(６)
１：１０もしくは(７)１:５０希釈の１５０単位／mlの
ネズミＩＬ−３を補充したpＣ１Ｒ６−トランスフェク
トしたＣos−１細胞ならし培地により支持されるマウス
骨髄細胞の６日間培養物中の巨核球コロニー(アセチル
コリンエステラーゼが陽性細胞)の全数を表す。

【００８３】ＩＬ−１１をこの検定で単独で試験した場
合、反応はほとんど検出されなかった。しかしながら、
この検定ではＩＬ−１１を組み換えネズミＩＬ−３の存
在下試験した場合、検定結果は、ＩＬ−１１およびＩＬ
−３の組み合わせによりこの検定において巨核球細胞の
産生および成熟を有意に刺激することを示した。この検
定は、哺乳動物ＩＬ−１１が巨核球の成長の刺激におい
て、ＩＬ−３と相乗効果を有することが示された。

【００８４】実施例８−ヒトＩＬ−１１の獲得 ヒトＩＬ−１１のクローン化配列を得るために、上記実
施例５においてヒトＩＬ−１１ mＲＮＡとハイブリダ
イズしたＰＵ３４ ＩＬ−１１ cＤＮＡを用いて、前
述のヒト肺線維芽細胞セルライン、ＭＲＣ−５から調製
したcＤＮＡライブラリーをふるい分けした。このライ
ブラリーからの組み換え体をプレートし、２連のニトロ
セルロース・レプリカーゼをプレートから作る。これら
のレプリカーゼは機会的プライミング標識化法[Ａ.Ｐ.
フェインベルグ、上記で引用]を用いて³²Ｐ−dＣＴＰで
標識化した哺乳動物のＩＬ−１１ cＤＮＡと共に、標
準的なハイブリダイゼーション溶液（４×ＳＳＣ）中６
５℃で一晩ハイブリダイズした。次に膜を０.２×ＳＳ
Ｃで、同温で、放射活性の基底値が特異的なハイブリダ
イジング配列の検出を可能にする値まで低下するまで洗
浄した。重複膜上で哺乳動物のＩＬ−１１プローブにハ
イブリダイズするのが見出されたコロニーを取り、プラ
スミドＤＮＡの調製に用いた。

【００８５】ヒトＩＬ−１１の全配列は、ＰＵ３４セル
ラインから哺乳動物ＩＬ−１１を単離するための前述の
方法と同様の方法に準じて決定した。ヒト配列もまた表
１に示す。ヒト配列ヌクレオチドが霊長類の配列と異な
る場合は、表１でヒトヌクレオチドを霊長類のヌクレオ
チド配列の上に記す。

【００８６】別法として、オリゴヌクレオチドを、サブ
クローニングの目的で適当な制限部位を有する表１の配
列、およびＩＬ−１１のヒトＤＮＡ配列を得るために用
いられるポリメラーゼ連鎖反応から構築してもよい。例
えば以下のオリゴヌクレオチドが合成される:

【表６】 ５'オリゴヌクレオチド：５'ＡＴＧＧＡＴＣＣＡＣＡＴＧＡＡＣＴ ＧＴＧＴＴＴＧＣＣＧ３' ３'オリゴヌクレオチド：５'ＴＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＣＡＧＣＣＧ ＡＧＴＣＴＴＣＡＧＣ３'

【００８７】次にこれらのオリゴヌクレオチドをＭＲＣ
−５またはＴＰＡ３０−１のcＤＮＡライブラリーにお
けるポリメラーゼ連鎖反応に用い、そこからヒトＩＬ−
１１のＤＮＡ配列を得る。ＰＣＲ法は、現在当業界で標
準的な方法に準じて実施する。得られたＰＣＲ産生物を
次に適当に消化したpＸＭ、またはその他の発現ベクタ
ーにサブクローン化する。上記のオリゴヌクレオチドに
関しては、pＸＭベクターサブクローニングするために
ＢamＨIおよびＨindIIIで消化する。

【００８８】ヒトＩＬ−１１の配列を得るための第３の
方法としては、プローブとして表１の配列を用いてヒト
ゲノムライブラリーをふるい分けする方法がある。

【００８９】実施例９−組みかえＩＬ−１１の発現 ヒト因子を含む組み換え哺乳動物ＩＬ−１１を産生する
ために、それをコード化するcＤＮＡを適当な発現ベク
ターに移す。この発現ベクターは標準的な分子生物学的
技術による哺乳動物、昆虫、酵母、菌類および細菌類の
発現用に非常に多くの型が当業界で公知である。例えば
Ｙ.Ｃ.ヤングら、セル４７巻３−１０頁(1986年)を参照
されたい。

【００９０】哺乳動物のＩＬ−１１に関して以前に報告
されているように、ヒトＩＬ−１１のcＤＮＡは標準的
な技法を用いて合成され、発現ベクター、pＸＭでクロ
ーン化される(ヤングら、上記で引用)。このベクターは
哺乳動物細胞、例えばＣos−１細胞でcＤＮＡ挿入物の
発現を可能にする。pＸＭはＳＶ４０エンハンサー、主
要アデノウィルス後期プロモーター、３部分先導配列、
および小さなハイブリッド介在配列、ＤＨＦＲコード化
配列、ＳＶ４０後期メッセージポリＡ添加部位並びにア
デノウィルスＶaI遺伝子を含有する。このベクターをエ
ンドヌクレアーゼ酵素ＸhoIで直線化し、相補的な付着
末端を生じる合成オリゴヌクレオチドを添加して予め改
変したＩＬ−１１ cＤＮＡの同等モル量に連結するこ
とができる。このようなオリゴヌクレオチドは市販によ
り入手できる[コラボラティブ・リサーチ・レキシント
ン、マサチューセッツ州]。

【００９１】ＣＨＯ細胞中でサイトカインをよく発現す
ることが認められているもう１つのベクターは、pＥＭ
Ｃ２Ｂ１である。このベクターはアメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ)、ロックビル、
メリーランド州（米国）に受け入れ番号ＡＴＣＣ４０３
４８で寄託されているpＭＴ２pcから誘導できる。ＤＮ
Ａは、プラスミドをＰstIで消化することにより直線化
する。次にＤＮＡをＴ₄ＤＮＡポリメラーゼを用いてブ
ラントする。オリゴヌクレオチド５'ＴＧＣＡＧＧＣＧ
ＡＧＣＣＴＧＡＡＴＴＣＣＴＣＧＡ３'を次にＤＮＡに
連結し、５'末端にＰstI部位を再生し、ＤＨＦＲ cＤ
ＮＡのＡＴＧの前にＥcoＲI部位およびＸhoI部位をつけ
加える。このプラスミドをpＭＴ２１と称する。pＭＴ２
１を、プラスミドを２個の隣接するクローニング部位で
開裂するＥcoＲIおよびＸhoIで切断する。５０８塩基対
のＥＭＣＶ断片を制限酵素ＥcoＲIおよびＴaqαIでpＭ
Ｔ₂ＥＣＡＴ₁[Ｓ.Ｋ.ジョングら、ジャーナル・オブ・
ビロロジー６３巻1651−1660頁(1989年)]から切断し
た。６８ヌクレオチドの長さの１対のオリゴヌクレオチ
ドを合成し、ＡＴＧまでＥＭＣＶ配列を重複させた。Ａ
ＴＧをＡＴＴに変え、Ｃを１個加え、３'末端でＸhoI部
位を作る。ＴaqαI部位は５'末端に位置する。オリゴヌ
クレオチドの配列は：５' ＣＧＡＧＧＴＴＡＡＡＡＡＡ
ＣＧＴＣＴＡＧＧＣＣＣＣＣＣＧＡＡＣＣＡＣＧＧＧＧ
ＡＣＧＴＧＧＴＴＴＴＣＣＴＴＴＧＡＡＡＡＡＣＡＣＧ
ＡＴＴＧＣ ３'およびこれらの相補的鎖であった。

【００９２】pＭＴ２１ ＥcoＲIからＸhoIまでの断片
をＥＭＣＶ ＥcoＲIからＴaqαIまでの断片およびＴaq
αI／ＸhoIオリゴヌクレオチドに連結し、ベクターpＥ
ＭＣ２Ｂ１を産生した。このベクターはＳＶ４０の複製
開始点およびエンハンサー、アデノウィルス主要後期プ
ロモーター、アデノウィルス３部分先導配列の大部分の
cＤＮＡコピー、小さなハイブリッド介在配列、ＳＶ４
０ポリアデニル化信号およびアデノウィルスＶＡ I遺
伝子、ＤＨＦＲおよびβ−ラクタマーゼマーカー、並び
にＥＭＣ配列を、哺乳動物細胞中望ましいcＤＮＡを高
量発現させるのに適当な関係で含有する。ＥＭＣ２Ｂ１
ベクターはエンドヌクレアーゼ酵素ＥcoＲIで直線化
し、続いて発現を構築するＥcoＲI相補的末端を生じる
合成オリゴヌクレオチドを加えることにより予め改変し
たＩＬ−１１をコードするcＤＮＡに同等モル量で別々
に連結する。

【００９３】ＩＬ−１１を含有する望ましいベクターを
次に、通常の遺伝子工学の技術により適当な宿主細胞に
導入する。標準的な技法を用いて形質転換した細胞を培
養し、発現したＩＬ−１１を回収し、培養培地から精製
する。

【００９４】Ａ．哺乳動物細胞の発現 哺乳動物の宿主細胞中にＩＬ−１１ポリペプチドの発現
を得るために、ＩＬ−１１ ＤＮＡ配列を含有するpＸ
Ｍベクターを実施例２に記載のとおりＣos細胞にトラン
スフェクトする。トランスフェクトしたＣos細胞のなら
し培地は、Ｔ１１６５検定で測定されるＩＬ−１１生物
学的活性を含有する。同様にＩＬ−１１のcＤＮＡを含
有するpＥＭＣ−２Ｂ１の構築物をＣＨＯ細胞にトラン
スフェクトする。

【００９５】当業者はまた、例えば各々のプラスミドか
らのＩＬ−１１のＤＮＡ配列をＸhoIで挿入し、周知の
組み換え遺伝子工業の技術並びにpＪＬ３およびpＪＬ４
[ゴーフら、エンボ.ジェイ.４巻６４５−６５３頁(1985
年)]およびpＭＴ２（pＭＴ２−ＶＷＦ、ＡＴＣＣ＃６７
１２２で出発；ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ８７／０００３
３参照）のようなその他の既知ベクターを用いて、pＸ
Ｍ／ＩＬ−１１ベクターに匹敵するその他の哺乳動物発
現ベクターを構築することもできる。

【００９６】これらのベクターを適当な宿主細胞に形質
転換することにより、結果的にＩＬ−１１ポリペプチド
を発現させることができる。Ｃos細胞以外の哺乳動物宿
主細胞も、ＩＬ−１１の発現に用いることができる。例
えば、共に通常の方法によりベクターＤＮＡを安定して
完成させ、完成したベクターＤＮＡを続いて増幅させる
のが好ましく、そのために選り抜きの哺乳動物宿主細胞
としてＣＨＯ細胞を用いることができる。

【００９７】一度ベクターおよび宿主細胞を選択し形質
転換すると、標準的な免疫学的なまたは酵素検定によ
り、安定した形質転換体を、ＩＬ−１１の発現に関して
ふるい分ける。ＩＬ−１１ポリペプチドをコードするＤ
ＮＡまたはmＲＮＡの存在は、標準的な方法、例えばサ
ザーンまたはノーザンブロッティングにより検出でき
る。発現ベクターＤＮＡを適当な宿主細胞に導入後数日
間、ポリペプチドをコードするＤＮＡの一過性の発現
は、培養培地のタンパクの活性または免疫学的検定、例
えばＴ１１６５検定により、選別せずに測定される。

【００９８】Ｂ．細菌性発現系 同様に、当業者はコード化配列をフランキングするあら
ゆる哺乳動物の制御配列を排除し、細菌の配列を挿入し
て細菌性ベクターを作ることによりＩＬ−１１の配列を
操作し、細菌細胞により本発明のＩＬ−１１ポリペプチ
ドを細胞内または細胞外に発現させることができる。

【００９９】因子をコード化するＤＮＡはさらに、細菌
性の発現のための種々コドンを含有するように改変で
き、これは当業界で公知である。成熟ＩＬ−１１配列
（表１で２１−１９９アミノ酸をコードするヌクレオチ
ド）は、分泌性リーダーポリペプチドをコードするヌク
レオチド配列に効果的に枠内で結合し、成熟した種々タ
ンパクの細菌性発現、分泌および加工を可能にするのが
好ましく、これも当業界で公知である。次に細菌宿主細
胞で発現される化合物を全て既知の方法により回収し、
精製し、並びに／または物理化学的、生化学的および／
もしくは臨床パラメーターに関して特性化できる。

【０１００】別法として、ＩＬ−１１はエシエリキア・
コリ中に細胞質タンパクとして発現させてもよい。この
場合、分子は塩酸グアニジンで完全に変性した後、必ず
再び折りたたまなければならないようであるが、この方
法も当業界で公知である。現在のところエシエリキア・
コリにおいて、ＩＬ−１１を発現させる好ましい方法で
は、ヒトＩＬ−１１配列の最初の３１コドンを除去す
る。次に以下の配列:

【表７】 を成熟ヒトＩＬ−１１のコドン３２に付ける。

【０１０１】Ｃ．昆虫または酵母細胞の発現 昆虫細胞で発現させるために昆虫ベクターを構築する
[例えば発行欧州特許出願第１５５４７６号に記載され
た方法を参照されたい]ために同様の操作を行うことが
できる。酵母細胞により本発明のタンパクを細胞内また
は細胞外に発現させるために、酵母制御配列を用いて酵
母ベクターをも構築できる。[例えば、発行ＰＣＴ出願
ＷＯ第８６／００６３９号および欧州特許出願ＥＰ第１
２３２８９号に記載されている方法を参照されたい。]

【０１０２】実施例１０−ＩＬ−１１を高量発現するＣ
ＨＯセルラインの構築 哺乳動物から本発明のＩＬ−１１ポリペプチドの高量を
産生する１つの方法には、異種のＩＬ−１１遺伝子の多
重コピーを含有する細胞の構築が含まれる。カウフマン
・アンド・シャープ、ジャーナル・オブ・モレキュラー
・バイオロジー、上記(1982年)の方法に準じて異種遺伝
子を増幅可能なマーカー例えば、増加した遺伝子コピー
を含有する細胞をメソトレキセート（ＭＴＸ）の濃度上
昇中に伸長用に選別できるためのジヒドロホレート・リ
ダクターゼ（ＤＨＦＲ）に結合できる。この方法は多種
細胞型で用いることができる。別法として、ＩＬ−１１
cＤＮＡおよび薬剤耐性選別遺伝子（例えばＤＨＦＲ）
を同じベクターに導入することができる。この方法で好
ましいベクターはpＥＭＣ２Ｂ１である。

【０１０３】例えば、その他のプラスミド配列と有効に
関連し、それのおよびＤＨＦＲ発現プラスミドpＡdＡ２
bＳＶ(Ａ)３[カウフマン・アンド・シャープ・モル・セ
ル・ビオール.３巻９号1598−1608頁(1983年)]の発現を
可能にするＩＬ−１１遺伝子含有pＸＭベクターは、リ
ン酸カルシウム共沈およびトランスフェクションにより
ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞、ＤＵＫＸ−ＢＩＩに同時導入
できる。

【０１０４】別法として、その他のプラスミド配列と有
効に関連し、それの発現を可能にするＩＬ−１１遺伝子
含有pＥＭＣ−２Ｂ１ベクターを、原形質体融合および
トランスフェクションによりＤＨＦＲ−欠損ＣＨＯ細胞
に導入する。ＩＬ−１１遺伝子およびＤＨＦＲマーカー
遺伝子は共に、ＩＬ−９をpＥＭＣ２Ｂ１に導入した場
合に効果的に発現する。ＩＬ−１１遺伝子を前述のとお
りpＭＴ２に導入でき、その結果できたベクターはpＸＭ
／ＩＬ−１１およびpＡdＡ２６ＳＶ(Ａ)３の代わりに用
いることができる。

【０１０５】ＤＨＦＲ発現形質転換体は、透析ウシ胎仔
血清を有するアルファー培地中の成長から選択する。形
質転換体を生物検定、免疫検定またはＲＮＡブロッティ
ングによりＩＬ−９の発現に関して検査し、続いて陽性
プールを選択して、カウフマンら、モル.セル.ビオール
５巻1750頁(1983年)に報告されるように、ＭＴＸの濃度
上昇中（逐次的に０.０２、０.２、１.０および５μＭ
ＭＴＸ）に成長を増幅させる。増幅した系列をクロー
ニングし、生物学的に活性なＩＬ−１１ポリペプチド発
現をＴ１１６５検定により監視する。ＩＬ−１１ポリペ
プチド発現はＭＴＸ耐性の水準の増強と共に増加するこ
とが予想される。

【０１０６】前述の任意の発現系において、結果的に得
られたセルラインは適当な薬剤を選別することによりさ
らに増幅でき、結果的に得られたセルラインを再びクロ
ーニングし、発現量を本明細書で記載したＴ１１６５検
定を用いて評価できる。ＩＬ−１１発現ＣＨＯセルライ
ンは血清不含培地中成長するように適合させることがで
きる。レクチン親和クロマトグラフィー、逆相ＨＰＬＣ
ＦＰＬＣ等のような技術を含む当業界でよく用いられ
る方法を用いて、セルラインのならし培地から、同一の
ＩＬ−１１が単離できる。

【０１０７】実施例１１−初期ネズミ始原細胞培養中の
増殖に対するＩＬ−１１の作用 メチルセルローズ細胞培養物を３５mmラックス懸濁培養
皿（＃５２２１Ｒ、ヌンク、インコーポレイテッド、ネ
イパービル、ＩＬ）中で確立した。５−フルオロウラシ
ル(５−ＦＵ)(アドリア・ラボラトリーズ、コロンビ
ア、ＯＨ)を、１０〜１５週令雌ＢＤＦ₁マウス（ＡＲＳ
スプラーク・ドーリー、インディアナポリス、ＩＮ）に
尾静脈から１５０mg／kg体重を静脈注射により投与した
(ツダら、ジャーナル・オブ・セルラー・フィジオロジ
ー、１１７：３０８〜３１８(1983)およびＧ.Ｓ.ホジソ
ンら、ネイチャー、２８１：３８１〜３８２(1979)）。
三匹のマウスから集めた大腿または脾臓から単一の細胞
懸濁液を調製した。低密度(＜１０７７)単核細胞を４０
０gにて遠心分離後、フィゴル−パクの界面から集め
た。これらの細胞をプラスチック製皿に一夜付着させた
後、非付着単核(骨髄および脾臓)細胞を５−ＦＵ注射
後、各２日および５日に採取した。

【０１０８】培養物１mlは、正常マウスの骨髄細胞２×
１０⁴個、５−ＦＵ−処理マウスの骨髄細胞５×１０⁴個
または脾臓細胞１×１０⁶個、α−培地（フロー・ラボ
ラトリーズ、インコポレイテッド、マックリーン、Ｖ
Ａ)、１.２％１５００cpsメチルセルローズ（フィッシ
ャーサイエンチフィク・コーポレーション、ノルクロ
ス、ＧＡ)、３０％胎子牛血清(ＦＣＳ)(ハイクロン・ラ
ボラトリーズ、インコーポレイテッド、ロガン、Ｕ
Ｔ)、１％脱イオン化フラクション・Ｖ・ウシ血清アル
ブミン(ＢＳＡ)(シグマ・ケミカル・コーポレーショ
ン、セントルイス、ＭＯ)、１×１０^-4Ｍ２−メルカプ
トエタノール(イーストマン・オーガニック・ケミカル
ズ、ロチェスター、ＮＹ)および造血因子を含有した。
皿を３７℃にて５％ＣＯ₂を通気した加湿雰囲気中でイ
ンキュベートした。血小板生成細胞を除いて、細胞５０
個以上からなるコロニーをインキュベーション後の所定
の日に倒立顕微鏡で計数した。４個以上の血小板生成細
胞が含まれるときは血小板生成細胞を計数した。コロニ
ーの型の省略記号を下記に記載する：ＧＭ、顆粒球／マ
クロファージ；Ｍast、乳房細胞コロニー；Ｅ、赤血球
バースト；Ｍ、血小板生成細胞コロニー；ＧＥＭＭ、顆
粒球／マクロファージ／血小板生成細胞コロニー[Ｔ.ナ
カタら、ジャーナル・オブ・セルラー・フィジオロジ
ー、１１１:２３９−２４６(1982)]；ＧＭＭ、顆粒球／
赤血球／マクロファージ／血小板生成細胞コロニー[Ｔ.
ナカタら、上掲;およびＡ.Ａ.フォーザーら、ブラッ
ド、５２：1243−1248(1978)]；およびＢｌ、芽球細胞
コロニー［Ｔ.ナカタら、プロシーディング・オブ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンス、７９:3843
−3847(1982);およびＴ.スダら、上掲]。

【０１０９】芽球細胞（blast cell）の造血能力を未
分化細胞コロニー再平板培養により測定した。インキュ
ベーション５〜１５日間に、５０〜１５０個の細胞を含
む個々の芽球細胞コロニーをエッペンドルフピペットで
取り上げ、ヒト尿エリスロポイエチン(Ｅp)[１mg当り３
７０Ｕの活性、カワキタ・マコト博士より入手、熊本医
科大学、熊本、日本]２Ｕ／ml、ＷＥＨＩ−３細胞の１
％濃縮（×２０）培養物上清を含む二次メチルセルロー
ズ培養物中に再平板培養した。

【０１１０】芽球細胞はまた、観察されたＩＬ−１１の
効果が直接的であるのか、または他の因子によるものか
を調査するための造血細胞の純粋標的集団として用い
た。組換えネズミＩＬ−３の１００Ｕ／mlの存在下、５
−ＦＵ後４日の脾臓細胞１００万個を培養した。遺伝子
工学的に高い力価(約３００００Ｕ／ml)まで、ネズミＩ
Ｌ−３を産生するように計画されたチャイニーズ・ハム
スター卵巣（ＣＨＯ）細胞によって調製された。培養８
日目に、各芽球細胞コロニー（５０〜１５０個の細胞）
を培養物から取り上げ、集め、培地で２度洗浄し、種々
の因子の組合わせを含む各二次培養物中に再平板培養し
た。

【０１１１】４×１０⁶Ｕ／mg蛋白の比活性を有する組
換えヒトＩＬ−６をエシェリキァ・コリ中に発現させ
た。ネズミ形質細胞腫−刺激活性をコード化したcＤＮ
Ａで形質導入されたＣＯＳ−１細胞により訓化された培
地（ＣＭ）あった。[Ｓ.Ｒ.ポールら、プロシーディン
グ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
ス、ＵＳＡ印刷中(1990)]

【０１１２】Ａ．正常マウスの骨髄細胞からのコロニー
形成 正常骨髄細胞からのコロニー形成をＩＬ−１１により維
持した。Ｅp２Ｕ／mlの存在下または不存在下で、ＩＬ
−１１は投与量−依存的にコロニーを生じさせた。１：
１００稀釈のＩＬ−１１は最大のコロニー形成を維持し
た。しかしながら、ＩＬ−１１とのインキュベーション
８日目または１６日目に検出されたコロニーの総数は、
ＩＬ−３との培養物中よりも顕著に低かった。ＩＬ−１
１−含有培養物中に見られたコロニーはＧＭ型が優勢で
あったが、数種の多系統(ＧＭＭおよびＧＥＭＭ)コロニ
ーも観察された。１：１００稀釈のＩＬ−１１は、イン
キュベーション１６日目に３個の芽球細胞コロニーの形
成を維持した。

【０１１３】Ｂ．５−ＦＵ−処理マウスの骨髄細胞から
のコロニー形成 ＩＬ−１１、ＩＬ−６、ＩＬ−３、単独および各種組合
わせの存在下で確立された培養物中１５０mg／kgの５−
ＦＵ [Ｔ.スダら、上掲およびＧ.Ｓ.ホジソンら、上掲]
の注射後２日目に採取された骨髄細胞からのコロニー形
成を検討し、ＩＬ−１１が初期の始原細胞の増殖の維持
においてＩＬ−３と相乗的に働くかどうかを調べた。

【０１１４】最終稀釈１：１００および１：１０００の
ＩＬ−１１の、ＩＬ−３の最適濃度への添加はコロニー
形成を顕著に増強した。特に、ＩＬ−１１の１：１００
稀釈およびＩＬ−３の存在下で、コロニー形成の動態は
各種因子により維持される動態に比較すると促進され
た。コロニー形成の時間的経過および維持されたコロニ
ーの総数はＩＬ−６およびＩＬ−３の組合わせで観察さ
れたのと類似している。１：１００稀釈中のＩＬ−１１
単独は長期のインキュベーション後わずかなコロニー形
成を維持した。これらの結果はＩＬ−１１が初期の始原
細胞のＩＬ−３依存性増殖を促進することを示してい
る。各相乗的因子の作用に関連する５−ＦＵ後２日の骨
髄細胞からのコロニー形成の動力学に対するＩＬ−１１
およびＩＬ−６の組合わせの効果を別に検討した。ＩＬ
−６およびＩＬ−１１はＩＬ−３依存性コロニー形成を
顕著に促進した。しかしながら、ＩＬ−６およびＩＬ−
１１の組合わせの効果は個別の効果と異ならなかった。

【０１１５】Ｃ．５−ＦＵ投与後４日の脾臓細胞からの
芽球細胞のコロニー発達の連続的観察 各種芽球細胞コロニーの成長率を培養図研究法により連
続的にプロットした。結果は、ＩＬ−１１の相乗的効果
は幹細胞が休眠状態にある時期中に減少し、成長率がこ
れらの培養系で統計学的に異ならないから、ＩＬ−６ま
たはＧ−ＣＳＦで観察された効果と非常に類似した作用
をもたらすことを示した。

【０１１６】Ｄ．芽球細胞コロニーの再平板培養能力の
比較 ＩＬ−１１およびＩＬ−６に対応する芽球細胞コロニー
の増殖能力を再平板培養実験により検討した。すでに報
告されたように[Ｋ．イケブチら、ブラッド、７２:2007
−2014(1988)]、各芽球細胞コロニーのうちに、二次再
平板培養効率中に顕著な変化が見られた。しかし、３種
の異なる一次培養条件で生長させた芽球細胞コロニーの
再平板培養効率には顕著な差はなかった。

【０１１７】先の報告[Ｋ．イケブチら、上掲]と同様
に、二次コロニー中の二次ＧＥＭＭコロニーの百分率お
よび未分化細胞胚芽細胞コロニー当りの二次ＧＥＭＭコ
ロニーの発生率は、ＩＬ−３単独を含む培養物中に見ら
れる一次未分化細胞コロニーよりも、ＩＬ−１１または
ＩＬ−６を含む培養物中に確認された一次未分化細胞コ
ロニーからの方が著しく高かった。これらのパラメータ
ーは、ＩＬ−１１＋ＩＬ−３を含む培養物およびＩＬ−
６＋ＩＬ−３を含む培養物間に顕著な差はなかった。

【０１１８】これらの結果はＩＬ−１１およびＩＬ−６
の相乗的活性が類似しており、二次ＧＥＭＭコロニーの
発生率の増加が、芽球細胞コロニー形成中の幹細胞の
Ｇ．期間の短縮によるかもしれないことを示す[Ｋ．イ
ケブチら、上掲]。

【０１１９】Ｅ．集めた芽球細胞の再平板培養の検討 ＩＬ−３により維持された初期段階の培養物からの芽球
細胞を集めて得られた標的細胞をＧＭコロニー形成に対
するＩＬ−１１およびＩＬ−６の直接的効果を比較する
ために用いた。集めた芽球細胞は間質細胞を欠き、非常
に高い平板培養効率を示した。

【０１２０】ＩＬ−３を含む培地で確認された細胞５０
〜１５０個を含む芽球細胞を取り、集め、Ｅｐ２Ｕ／ml
の存在中、ＩＬ−１１、ＩＬ−６、またはＩＬ−３を含
む二次培地に再平板培養する。これらのデータは芽球細
胞の少なくとも７０％が造血始原細胞であることを示
す。

【０１２１】ＩＬ−３とＥｐの組合せが種々の単一系統
および多系統のコロニー形成を維持したが、ＩＬ−１１
およびＥｐはマクロファージコロニーのみの産生を維持
した。ＩＬ−６およびＥｐの組合せほぼ同数数の純粋マ
クロファージコロニーだけでなく、好中球／マクロファ
ージのコロニーの形成も維持した。ＩＬ−１１により維
持されたマクロファージコロニーはＩＬ−６により維持
されたマクロファージコロニーより小さかった。

【０１２２】これらの結果は、ＩＬ−１１とＩＬ−６が
異なる始原細胞サブセットを除いて重複して相互に作用
すること、および優先的にマクロファージ始原細胞群を
維持することを示した。

【０１２３】Ｆ．IＬ−１１の相乗作用効果に対する抗I
Ｌ−６抗体中和効果 ＩＬ−１１とＩＬ−６間の直接コロニー維持活性がＣos
細胞ＣＭのそのものの性質の結果でなかったことを確認
するために、Ｃos−由来ＩＬ−６を阻害することで知ら
れる抗ＩＬ−６抗体の中和を、休止始原細胞からのＩＬ
３−依存増殖に対するＩＬ−１１およびＩＬ−６の相乗
効果の検討に用いた。

【０１２４】ＩＬ−６またはＩＬ−１１の存在中および
抗体の不在中で、５ＦＵ投与後５日の脾臓細胞からのコ
ロニーの発達は８日目のコロニー数により示されるよう
に顕著に促進された。抗ＩＬ−６抗体が存在したとき、
ＩＬ−６の相乗効果を完全に消失したが、ＩＬ−１１の
効果は消失しなかった。抗体の効果は１６日まで持続し
た。これらの結果は、Ｃos細胞ＣＭ中の明白な相乗効果
がＩＬ−６により仲介されるという可能性を全く退け
た。

【０１２５】ＩＬ−１１ｃＤＮＡを形質導入されたＣos
細胞の馴化培地（ＣＭ）は、培養中の多効能性始原細胞
のＩＬ−３−依存増殖を促進することが判明し、活性は
独自にＩＬ−６に関連した。促進の機構は休止幹細胞の
Ｇ．期間の短縮と思われる。

【０１２６】前述の記載はこの発明の現在の好ましい実
施態様を詳述したものである。この発明の実施において
多数の修飾および変更が当技術の熟練者に考えられるこ
とと思われる。そのような修飾および変更もまたこの発
明の範囲に含まれる。

【０１２７】この発明によって下記の各事項が可能とな
る。 (１) 実質的に他の蛋白質様物質の随伴を欠くほ乳類Ｉ
Ｌ−１１蛋白質。 (２) 表１のアミノ酸＃２２−アミノ酸＃１９９のアミ
ノ酸配列またはその生物活性フラグメントを含む、１記
載の蛋白質。 (３) ヒトＩＬ−１１アミノ酸配列を含む、２記載の蛋
白質。 (４) 表１に示されたＤＮＡ配列と同じかまたは実質的
に同じＤＮＡ配列、そのフラグメントまたはそこにハイ
ブリダイズし得るＤＮＡ配列の全部または一部によりコ
ードされる、１記載の蛋白質。 (５) 下記特性： 1) ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける還元条件下での見かけ上
の分子量が約２０kd、 2) 計算された分子量が約２０kd、 3) Ｔ１１６５検定における生物活性、 4) ＩＬ−３の存在下での血小板生成細胞コロニー形成
検定における生物活性、 5) Ｂ細胞プラーク形成検定における生物活性 のうちの一つまたはそれ以上を有する、１記載の蛋白
質。

【０１２８】(６) ＩＬ−１１の複製および発現を指図
し得る発現制御配列を機能し得る形で随伴した１０記載
のＤＮＡ配列により形質転換された細胞を培養し、ＩＬ
−１１蛋白質をその条件培地から回収することにより製
造されるＩＬ−１１蛋白質。 (７) 実質的に他の蛋白質様物質の随伴を欠くヒトＩＬ
−１１蛋白質。 (８) ヒトＩＬ−１１蛋白質の複製および発現を指図し
得る発現制御配列を機能し得る形で随伴した、ヒトＩＬ
−１１蛋白質またはそのフラグメントの発現をコードす
るcＤＮＡ配列により形質転換されたセルラインを培養
することを含む、ヒトＩＬ−１１蛋白質またはそのフラ
グメントの製造方法。 (９) ＩＬ−１１をコードし、第１表に示されたヌクレ
オチド塩基配列と同じかまたは実質的に同じ配列、その
フラグメントまたはそこにハイブリダイズし得るＤＮＡ
配列の全部または一部を含むＤＮＡ配列。 (10) 発現制御配列を機能し得る形で随伴した９または
１９記載のＤＮＡ配列により形質転換された細胞。

【０１２９】(11) ほ乳類または細菌細胞を含む、１０
記載の細胞。 (12) ９または１９記載のＤＮＡ配列を含むプラスミド
・ベクター。 (13) さらに追加的なサイトカイン、ヘマトポイエチ
ン、生長因子または抗体の治療有効量を含む、１２記載
の医薬。 (14) さらに追加的なサイトカイン、ヘマトポイエチ
ン、生長因子または抗体の治療有効量を含む、１３記載
の組成物。 (15) サイトカインが、ＩＬ−１ないしＩＬ−９、ＧＭ
−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、インターフェロン
類、Ｍeg−ＣＳＦ、ＭＩＦ、ＬＩＦ、ＴＮＦおよびエリ
スロポイエチンから成る群から選択される、１４記載の
組成物。

【０１３０】(16) サイトカインがＩＬ−３またはＩＬ
−６である、１５記載の組成物。 (17) 免疫系または造血系の刺激またはそれに関連した
疾患の処置に適した医薬組成物の製造における２または
３記載のＩＬ−１１蛋白質の用途。 (18) ＩＬ−６の非存在下でのＴ１１６５検定において
生物活性を有する均一ほ乳類ＩＬ−１１。 (19) 発熱物質不含有の非経口投与に関して許容し得る
水性賦形剤中に２または３記載のＩＬ−１１蛋白質の有
効量を含む、免疫系または造血系の刺激またはその疾患
の処置を目的とする注射可能製剤。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、ネズミ・プラーク-形成検定におけ
る、pＣ１Ｒ６-トランスフェクションcos−１細胞条件
培地によるネズミＮＰ−反応性Ｂ細胞の発達の向上性を
描いた図である。

【図２】 図２は、ネズミ・フィブリン・クロット検定
における、pＣ１Ｒ６-トランスフェクションcos−１細
胞条件培地によるＩＬ−３依存性ネズミ血小板生成細胞
コロニーの発達の向上性を描いた図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 14/54 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＹ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 フランシス・ケー・ベネット アメリカ合衆国02176マサチューセッツ、 メルローズ、ファースト・ストリート 262番 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 15/09 ZNA ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記ＤＮＡのいずれかにより形質転換さ
   れた宿主細胞を培養し、この培養物からＴ１１６５検定
   において活性を示す蛋白質を回収することを特徴とす
   る、蛋白質の製造法： （ａ）次のいずれかのヌクレオチド配列を有するＤＮ
   Ａ： 【表１】 又は 【表２】 （ｂ）（ａ）のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハ
   イブリダイズし得るＤＮＡ及び（ｃ）（ａ）又は（ｂ）
   のＤＮＡと縮重の関係にあるＤＮＡ。
2. 【請求項２】 蛋白質が哺乳類ＩＬ−１１蛋白質であ
   る、請求項１記載の製造法。
3. 【請求項３】 蛋白質がひとＩＬ−１１蛋白質である、
   請求項２記載の製造法。
4. 【請求項４】 蛋白質がさるＩＬ−１１蛋白質である、
   請求項２記載の製造法。