JP7227159B2 - 酵母における組換えil-11の生産のためのシステムおよび方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2017年1月16日に出願された米国仮特許出願第62/446,762号の利益を主張する。これらおよび他のすべての参照された外部材料は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。参照により本明細書に組み入れられる用語の定義または使用が矛盾する、または本明細書に提供されるその用語の定義に反する場合、本明細書に提供されるその用語の定義が支配的であるとみなされる。
本発明の分野は、特に酵母における、組換えIL-11の製造およびその後の精製である。
本発明の主題は、先行技術の方法と比較して二量体および酸化物含量が低減された高純度の組換えIL-11を提供する装置、システムおよび方法を提供する。
PichiaPink(商標)発現システム(#A11152、Al 1154)はインビトロジェンライフテクノロジーズ(Invitrogen Life Technologies)から入手した。クローン構築のための制限酵素およびポリメラーゼは、Thermo Fisher ScientificのFastDigest酵素から購入した。消泡剤204(#A6426)、アミノ酸を含まない酵母窒素ベース(#Y0626)は、Sigma-Aldrichから入手した。酵母由来のrhIL-11の参照標準は、Hangzhou Jiuyuan Gene Engineering Companyによって提供された(Lot#20121005/1006/1007/1008&20150402)。8-16%グラジエントSDS PAGE(#25268)、StartingBlock Blocking Buffers(#37579)、Blocker(商標)Casein(#37583)、トランスファーバッファーメタノールフリー(#35045)、TBS Tween20バッファー(#28360)および1ステップウルトラTMB(#37574)、Gibco(登録商標)2-メルカプトエタノール(#21985-023)およびNovex Tris-Glycine16%ポリアクリルアミドゲル(XP00162BOX)を含むイムノブロッティング用の試薬および材料はThermo scientificから購入した。ヒトIL-11 Affinity Purified Polyclonal Goat IgG(#AF-218-NA)およびDonkey抗ヤギIgG HRPアフィニティー精製ポリクローナル(#HAF109)は、R&D systemsから入手した。C57B1/6脾臓細胞と融合した7TD1マウス骨髄腫細胞は、DSMZから入手した(No.ACC23)。ウシ膵臓から修飾された配列決定グレードのトリプシン(カタログ番号11418025001)はRocheダイアグノスティックスから購入した。マウスIL-11受容体アルファ(カタログ番号MBS553276)はMyBioSource,Inc.から入手した。CellTiter96(登録商標)Aqueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay(MTS)(カタログ番号G5430)はPromega社から購入した。RPMI 1640(#SH30255.01)、HI FBS(H#SH30071.03HI)およびStrep/Pen(HYCLONE、USA、SV30010)は、HYCLONE、USAから購入した。精製樹脂Capto S(製品コード17-5316-10)、Capto Q(製品コード17-5441-01)およびButyl HP(製品コード17-5432-01)は、GE Healthcare Life Sciencesから入手した。HPLC操作のためのトリフルオロ酢酸(カタログ番号302031)およびアセトニトリル(カタログ番号34967)はSigma-Aldrichから購入した。ポリエチレングリコール8000(#408050010)、DL-メチオニン(#125652500)およびグアニジン塩酸塩(#364790025)はAcros Organicから入手した。硫酸アンモニウム(#11566)はAlfa Aesarから入手した。動物由来ではないフィトンペプトン(#210931)はBecton Dickinsonから入手した。
組換えヒトIL-11遺伝子を合成し、α因子シグナルペプチドをコードする遺伝子を含むpPINKα-HC酵母発現ベクターにクローン化し、ここではGlu-Ala反復は欠失していた。得られた組換えベクターをエレクトロポレーションによりプロテアーゼ欠損株に形質転換し、安定なクローンを作製した。各形質転換からの約40クローンを選択し、クーマシーブルー染色を用いて視覚化して、SDS-PAGEでの発現強度の目視検査によって高IL-11発現クローンについてスクリーニングした(データは示さず)。rhIL-11特異的抗体を用いたウエスタンイムノブロットによりタンパク質の同一性を確認した。リサーチマスターとワーキングセルバンクはそれに応じて準備し、凍結保存した。
流加発酵を用いた高細胞密度培養における選択されたクローンのrhIL-11発現レベルを評価するために、1リットルの発酵システム(BIOSTAT(登録商標)B Bioreactor、Sartorius)を用いた。発酵は、ワーキングセルバンクからの解凍したバイアルを用いてアデニンを欠く15mLのMGM(最小グリセロール培地;0.2μm濾過)培地を接種することから始まった。MGMの組成は以下の通りである。
1% グリセロール
4ppm ビオチン
グリセロール(50%) 80mL
リン酸(28%) 26.7mL
硫酸カルシウム 0.9g
硫酸マグネシウム 14.9g
水酸化カリウム 4.1g
硫酸カリウム 18.2g
フィトンペプトン 5.0g
PTM1微量塩 4.4mL
水を加えて最終容量を1Lとした。
硫酸第二銅-5H2O 6.0g
ヨウ化ナトリウム 0.08g
硫酸マンガン-H2O 3.0g
モリブデン酸ナトリウム-2H2O 0.2g
ホウ酸 0.02g
塩化コバルト 0.5g
塩化亜鉛 20.0g
硫酸第一鉄-7H2O 65.0g
ビオチン 0.2g
硫酸 5.0mL
水を加えて最終容量を1Lとした。
所望の発現レベルでの培地のタンパク質含量は、ミスフォールディングされたIL-11の存在のためにELISAによって値が一貫して過小評価されることがわかったので(抗体によってほとんど検出されないことが分かった)、同じSDS-PAGEゲル上の参照標準の強度に対して目視検査によって決定した。あるいは、タンパク質含有量は、濃度測定ソフトウェア(BiochemLab Solutionsによって提供されるGelQuant.NET(バージョン1.8.2)など)を用いて定量化することができる。RP-HPLCを用いて発現レベルの正確な定量化も達成された。培地中の分泌型rhIL-11を、8%(w/v)PEG-8000を添加することにより沈殿させ、遠心分離後に回収した。ペレットを、7Mグアニジン塩酸塩を含有するpH8のリン酸ナトリウムバッファーに再懸濁した。遠心分離によって不溶性微粒子を除去した後、RP-HPLC操作のための以下のクロマトグラフィー手順を使用して積分面積を既知濃度の参照標準と比較することによって発現生産性を計算した。
移動相A:水中0.1%(v/v)のTFA;移動相B:90%(v/v)アセトニトリル中0.1%(v/v)のTFA
流速:0.2ml/分
検出:215nm
注入体積:5~10μL
クロマトグラフィー工程後のrhIL-11の濃度は、UV/Visマイクロプレートおよびキュベット分光光度計(例えば、ThermoScientificからのMultiskanGO)を使用して、280nmでのUV吸光度によって決定した。水中で測定される280nmでのM-1cm-1の単位の消衰係数(Ec)を、以下の式を用いて17,990と計算した。
Ec=数(Tyr)×1490+数(Trp)×5500+数(Cys)×125
濃度=(280nmにおける吸光度)/Ec
タンパク質の見かけの分子量は、プレキャストゲルと組み合わせたBioradのMini-PROTEANシステムを用いたドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)によって評価した。得られたポリアクリルアミドゲルを、クーマシーブルーまたは銀染色に従って可視化した。
水性二相抽出
可溶性であるがミスフォールディングされたrhIL-11は、水性二相抽出によって発酵培地から沈殿した。固形PEG8000を発酵培地の濾液に直接添加して、6%~8%(w/v)の最終濃度を得た。固体ポリマーを穏やかに攪拌することによって完全に溶解させ、続いて10分間4,000rpmで遠心分離して沈殿タンパク質を回収した。
沈殿したタンパク質を、7Mグアニジン塩酸塩(GdHCl)pH8~9バッファーを含有する20mMリン酸ナトリウムに最終濃度2mg/mLになるように溶解し、室温で1時間インキュベートした。11倍容量の4mMリン酸ナトリウムバッファー(pH8)を添加してGdHClを希釈し、溶液を室温で2時間インキュベートすることによって変性タンパク質を適切にリフォールディングさせた。イオン交換クロマトグラフィーに供する前に、得られた溶液を、4mMリン酸バッファーを用いて、限外濾過または透析を用いた単純希釈またはバッファー交換によって希釈して、6.5mS/cm未満の導電率を得た。
イオン交換クロマトグラフィーは、市販のクロマトグラフィー装置(例えば、GE Healthcare Life SciencesからのAKTAprime plus)を使用して実施した。クロマトグラフィーカラムに負荷する前に、得られた希釈液を、0.45または0.2μm膜を通して遠心分離または濾過して、微粒子を除去した。混合物を、20mMリン酸ナトリウムpH8を含むバッファーAで平衡させたCapto Sカラムに負荷した。20mMリン酸ナトリウムpH8および1M NaClを含有するバッファーBのグラジエント溶出またはステップ溶出で溶出させた。
市販のクロマトグラフィー装置(例えば、GE Healthcare Life SciencesからのAKTAprime plus)を使用して、疎水性相互作用クロマトグラフィーを実施した。カチオン交換体(CaptoS)からのrhIL-11を含有する画分をプールし、5mMのDL-メチオニンを含む0.5Mの硫酸アンモニウムに添加した。得られた希釈液を、サンプル負荷の前に、0.45または0.2μmの膜を通して遠心分離または濾過して微粒子を除去した。混合物を、10mMリン酸ナトリウムpH7バッファー中に0.5M硫酸アンモニウムおよび5mM DL-メチオニンを含有するバッファーAで平衡化したButyl HPカラムに負荷した。タンパク質を、10mMリン酸ナトリウムpH7バッファーを含有するバッファーBのステップ溶出またはグラジエント溶出で溶出した。強く結合したrhIL-11を溶出するために、さらに0.2M酢酸を用いた。
他の高分子量種に加えて、共有結合的および非共有結合的に凝集したrhIL-11の含有量を、ダイオードアレイ検出器を備えた市販のUPLCシステム(例えば、Thermo ScientificからのUltiMate3000 Rapid Separation LCシステム)を用いたサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)により分析した。クロマトグラフィー手順は以下を用いて実施した。
移動相:0.5M NaClを含有する25mMリン酸ナトリウムpH7.0
流速:0.3ml/分
検出:280nm
停止時間:10分
タンパク質5μgの注入
rhIL-11の純度は、Agilent 6540 UHD Accurate Mass Q-TOFLC/MSシステムに接続されたダイオードアレイ検出器を備えた(a)UPLC(例えば、Thermo ScientificからのUltiMate3000 Rapid Separation LCシステム、またはAgilent 1290 infinity UPLCシステム)を使用する逆相(RP)クロマトグラフィーによって分析した。クロマトグラフィー手順は以下の手順を用いて実施した。
移動相とグラジエント:移動相A:水中0.1%(v/v)トリフルオロ酢酸(TFA);移動相B:95%(v/v)アセトニトリル中0.1%(v/v)TFA
流速:0.4ml/分
カラム温度:周囲温度
検出:214nm
注入量:5μg
m/z範囲と極性:150-3000陽性
供給元パラメータ:ガス温度300℃;ガス流量8L/分
ネブライザー 35psig
シースガス温度380℃;シースガス流量 11L/分
スキャンソースパラメータ:
VCap=3500
ノズル電圧 1,000V
フラグメンター 175
スキマー(Skimmerl) 65
OctopoleRFPeak 750
rhIL-11の生物学的活性は、7TD1細胞ラインを用いて細胞増殖アッセイにおいて計算された。IL-11参照標準および未知のサンプルを無菌的に希釈し、濃度範囲を10倍の20,000ng/ml~0.2pg/mlにした(合計9希釈)。50μLのrhIL-11標準またはサンプルを、ウェルあたり4,000細胞で7TD1細胞を含有するウェル(例えば、96ウェルプレートのウェル)に2度添加した。細胞を5%CO2を含有する加湿雰囲気中で37℃でインキュベートして、2μg/mLのIL-11受容体の存在下で3日間、異なるIL-11濃度に対するそれらの応答を特徴付けた(12)。細胞増殖アッセイのために、マルチチャンネルピペットを用いてウェル当たり20μLのMTS溶液をウェルに分配し、信号発信に応じて、37℃のインキュベーターにおいて2.5~3時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを、UV/Visマイクロプレートおよびキュベット分光光度計(例えば、Thermo ScientificからのMultiskan GO)を用いて490nmでの吸光度について読み取った。
y=((a-d)/(l+(x/c)b))+d
ここで、
aは、濃度がゼロに近づくにつれての最小漸近線のy軸である;bはその曲線のグラジエントを表すグラジエントである
cはEC50である
dは、濃度が無限大に近づくにつれての最大漸近線のy軸である
xは濃度である
yは490nmにおける吸光度である
比生物活性は以下の式から導かれる。
比活性(U/mg)=(基準比活性)×(EC50基準/EC50サンプル)
遠紫外円偏光二色性(CD)スペクトルを、室温で光路長1.0cmの石英セルを用いてJascoJ-815分光偏光計を用いて記録した。タンパク質サンプルを、脱イオン水または5mMリン酸ナトリウム(pH7)を用いて約0.02mg/mLに希釈した。二次構造を、それぞれ100nm/分、1nmおよび2秒に設定された走査速度、帯域幅および反応を含む操作パラメータを用いて遠UV領域(190nm~250nm)でモニターした。スペクトルは3回の走査の平均から得た。
タンパク質分解溶液を、配列決定グレードの1/100(w/w)トリプシンを添加することによって、2mg/mLのタンパク質を含有する50mMリン酸ナトリウムpH8バッファー中で調製した。室温で6時間インキュベートした後、TFA(またはギ酸)を導入して最終濃度0.1%にして反応を停止させた。沈殿物を、注入の前に、0.2または0.4μmの膜を介して遠心分離または濾過によって除去した。Agilent 6540 UHD Accurate Mass Q-TOF LC/MSシステムと組み合わせたLC/MSシステム-Agilent 1290 無限UPLCシステムを用いてペプチド同定を行った。クロマトグラフィー手順は以下のように実施した。
移動相とグラジエント:移動相A:水中0.1%(v/v)のTFA;移動相B:95%(v/v)アセトニトリル中0.1%(v/v)のTFA
流速:0.2ml/分
検出:214nm
注入量:10μg
m/z範囲と極性:400-1700陽性
ソースパラメータ:
ガス温度 300℃
ガス流量 8L/分
ネブライザー 35psig
シースガス温度 350℃
シースガス流量 11L/分
スキャンソースパラメータ:
VCap=3500
ノズル電圧 1,000V
フラグメンター 175
スキマー 165
アミノ酸組成は、Hitachi High-Speed Amino acid Analyzer L-8900を用いて決定した。これはイオン交換機構とそれに続くニンヒドリンでの誘導体化による加水分解アミノ酸の分離を提供する。加水分解の前に、タンパク質サンプルを1mg/mLで3回調製し、窒素雰囲気下、6NのHCl、110℃の条件下で22時間加水分解した。80℃の水浴中で蒸発させた後、加水分解したサンプルを0.02NのHClに再懸濁した。そのような酸性加水分解条件下で、アスパラギンおよびグルタミンは脱アミド化され、それらのそれぞれの酸を形成する。トリプトファンは完全に分解されている。システインおよびメチオニンは酸化されており、酸加水分解物から容易には検出されない。チロシン、セリンおよびスレオニンは部分的に加水分解されている(13)。
下流精製実行のために研究作業用セルバンクのバイアルから解凍されたプロテアーゼ欠損株(pPINKS1-IL11-24)を接種した1-L発酵槽中でグリセロール供給バッチ発酵を行った。典型的な細胞増殖曲線を図1Aに示す。図1Aは、グリセロールの追加供給後に200ODを達成した細胞培養物を示す。細胞密度は、メタノール誘導後も250ODまで成長し続けたが、おそらく栄養素が不十分なため、誘導後22時間後には徐々に低下した。発酵ブロスのサンプルを、誘導時点の22時間後、46時間後、および70時間後に採取し、非還元SDS-PAGEによって分析した。図1B図および図1Cは、SDS-PAGEおよびイムノブロッティングの典型的な結果をそれぞれ示す。この方法は一貫して生産性を過小評価することが見出されたので、発現レベルはELISAによって決定されなかった。代わりに、rhIL-11の生産性は、目視検査またはデンシトメトリーのいずれかによって、参照標準のものと比較したクーマシーブルー染色の強度によって推定され、約0.4~0.6g/Lを生じることが見出された。クーマシーブルー染色によって行われるSDS-PAGEでは、約15KDのrhIL-11(約20KD)の位置より下にいくつかの明らかなバンドがあり(図1B)、rhIL-に対する抗体を用いたイムノブロッティングによって検証されるように分解種であった(図1C)。RP-HPLCにより決定された発酵培地の発現生産性は、約0.4mg/mLであった。
IL-11の高い等電点(pI=11)を考慮して、pH8で発酵培地からrhIL-11を捕捉するためにカチオン交換クロマトグラフィーを試みた。遠心分離によって細胞ペーストを除去した後、数百ミリリットルのブロスを限外濾過によるバッファー交換に供するか、または少なくとも10容量の水で直接希釈して3mS/cm未満の導電率を得た。rhIL-11を回収するために、約2ミリグラムのrhIL-11に相当する少量の溶液を、20mM Tris pH8バッファーで予め平衡化した1mLのCapto-Sカラム(カチオン交換体)に負荷した。結合タンパク質を、1M NaClまでのNaClグラジエントで溶出した。SDS-PAGEおよびイムノブロッティングの結果は、rhIL-11がフロースルー画分中に見出されカラムに結合しなかったことを示した(データは示さず)。カチオン交換体を用いる精製システムの適合性を確実にするために、陽性対照として0.5mgの参照rhIL-11を1mL発酵ブロス中にスパイクし、続いて前述の精製手順を行った。約30%の回収率は、同じ方法でNaClグラジエントによってうまく溶出されたので、rhIL-11を単離するためのカチオン交換体の適合性を示唆した。フロースルー物質の回収による陰イオン交換体(Capto-Q)を用いた単離を試みた。約2ミリグラムのrhIL-11に相当する少量の溶液を1mLのCapto-Qカラム(陰イオン交換体)に負荷して、フロースルーでrhIL-11を回収した。カラムは予め20mM Tris pH8バッファーで平衡化した後、1M NaClまでのNaClグラジエントで溶出した。驚くべきことに、SDS-PAGEの結果は、NaCl含有画分中のrhIL-11の成功した回収を示したが、フロースルー中ではそうではなかった(データ示さず)。この精製プロセスを繰り返して、一貫した再現性のある結果を導き、発現されたrhIL-11の予想外のイオン特性を確認した。
さらなる調査の前に、発現されたタンパク質は単純な水性二相抽出によって発酵培地から回収された。ポリエチレングリコール8000を添加することにより、抽出を展開して液相から非天然rhIL-11を沈殿させた。固体PEG-8000を1mLの濾過発酵ブロスに添加して、それぞれ、2.9、3.8、5.0、6.2、7.3および8.2%(w/v)を得た。4℃で1時間インキュベートした後、6.2、7.3および8.2%のPEG8000を含有するサンプルにおいてのみ濁りが可視化された。卓上型遠心分離機を用いて最高速度で5分間遠心分離することによって沈殿物を収集し、沈殿したタンパク質を1mLのpH8のリン酸ナトリウムバッファーで再構成した。図2に示すように、わずか6%(w/v)のPEG8000を添加することによって、ほとんど全てのrhIL-11を沈殿物から回収することができた。その後の研究において、特に明記しない限り、rhIL-11は、PEGを用いた沈殿によって培地から回収された。
円偏光二色性(CD)とサイズ排除クロマトグラフィーを用いて構造特性を研究した。発酵培地に8%のPEG8000を添加することによって液体二相抽出から回収された沈殿rhIL-11を約0.02mg/mLで脱イオン水に再懸濁した。典型的なCDスペクトルを図3に示す。これは、有意ならせん構造(約222nmおよび210nmでの負のバンド、および約195nmでの正のバンドによって示されるように)を明らかにしている。これは、粗rhIL-11がらせん状の骨格を維持していたことを示唆している。
ピキア・パストリスは真核生物のフォールディング経路を介してタンパク質を発現するが、高密度酵母培養物における自己凝集およびミスフォールディングされた分泌型rhIL-11はこれまでに報告されていない。凝集形態は、生物活性の喪失および下流の精製工程における低収率などの重大な問題を引き起こす。凝集を防ぐ一つの戦略は、発酵培地に添加物や界面活性剤を導入することである(14)。これを調べるために、0.1%のTween-80を1Lの高密度流加発酵培地に導入した。回収後、130mLの発酵培地に10倍の水を加えて導電率を下げた。0.45または0.2μmの膜を介して単純濾過により粒子状物質を除去した後、得られた溶液を、カチオン交換体(Capto-S)に負荷して生物活性rhIL-11を回収した。典型的な精製プロファイルを図5に示す。カラムに負荷した後、カラムを50mM NaClバッファーで洗浄し、続いてカラム容量の10倍以上の50~300mM NaClグラジエントで洗浄した。rhIL-11を含む画分を、選択された画分のSDS-PAGE分析によって決定されるように合わせたところ、13.6%の工程収率が得られた。その知見は、0.1%Tween-80が発酵中の自己凝集をある程度減少できることを示唆したが、生物活性rhIL-11の回収は満足できないかもしれない。
溶液中のタンパク質のリフォールディングは、イオン強度、pH、温度、タンパク質濃度などを含む多くの物理化学的要因の結果である。尿素、硫酸アンモニウム、SDSおよびグアニジン塩酸塩(GdHCl)は、rhIL-11のリフォールディングプロセスに有用であり得る変性剤として研究された。PEG沈殿後に2mLの発酵培地からタンパク質を沈殿させ、それぞれの変性剤含有バッファー:8M尿素、1M硫酸アンモニウム、0.5% SDSまたは6M GdHClで5mg/mLに再構成した。5mS/cm未満の導電率を達成するために水で希釈した後、天然および生物学的に活性なrhIL-11のみがカチオン交換体に吸着され、NaCl塩グラジエントによって溶出されると予想される。結果は、図6に示されるように、6MのGdHClを除いて、変性剤がrhIL-11を再生することに失敗したことを示した(これは、6M GdHClを含むリフォールディング溶液からのrhIL-11がNaClグラジエントを用いて首尾よく溶出されたことを示す)。他の研究では、PEG沈殿後に2mLの発酵培地から沈殿したタンパク質が、0.1N NaOH、70%のエタノールを含む0.1N NaOH、または1%のTween20を含む0.1N NaOHからなるアルカリ溶液2mLに溶解した。水で希釈し、pHをpH8に調整した後、カチオン交換体は、そのような溶液から天然rhIL-11をほとんど回収しなかった。結果は、本発明の概念の好ましい実施形態において、グアニジン塩酸塩を用いてrhIL-11を高収率で首尾よく再生することができることを示唆している。
カチオン交換培地を用いる単離は、約94.2mgの分泌型rhIL-11を含有する236mLの発酵培地を用いて調べた。タンパク質を8%PEG8000(w/v)で沈殿させ、4,000rpmで15分間の遠心分離により回収した。上澄みを捨てた後、固相を、7M GdHClを含有する20mMリン酸ナトリウムpH8バッファーで2mg/mLタンパク質濃度に再構成した。タンパク質溶液を室温で1時間穏やかに撹拌しながらインキュベートして完全に可溶化させた。再生/リフォールディングプロセスは、タンパク質溶液を10倍容量のグアニジンを含まない4mMリン酸ナトリウムpH8バッファーに注ぐことによって開始した。得られた溶液をさらに室温でさらに1時間インキュベートし、続いて限外濾過を用いてバッファーを交換するか、または追加のバッファーで直接希釈して、6mS/cm未満の導電率を達成した。Capto-Sカラム(1cm×10cm)を用いてカチオン交換クロマトグラフィーを実施し、典型的な結果を図10に示す。12mg/mL樹脂のサンプル負荷でカラムに負荷した後、カラムを50mM NaClバッファーを用いて洗浄し、続いて10倍のカラム容量にわたって50~300mM NaClグラジエントを適用した。rhIL-11を含有する画分(非還元SDS-PAGEによって示されるように)をプール中で混合し、約40%~約60%の工程収率を得た。生成物を質量分析と組み合わせたRP-UPLCによっても分析して、精製タンパク質の分子量を解明した(図11参照)。UPLCで観察された主ピークのデコンボリューション質量は19046.7Daであり、19,047DaのrhIL-11の理論平均質量と一致していた。液体クロマトグラムにおいてrhIL-11より先の小さなピーク(8.6%を占める)は、そのデコンボリューション質量がおよそ単一の酸素の質量に相当するrhIL-11のものより15.8Da大きいため、酸化種を表すと考えられる(16Da)。リフォールディングプロセス後の精製rhIL-11は結果的に細胞ベースのアッセイに供され、再生プロセスによる活性の完全な回復を示唆している(データは示さず)。
タンパク質酸化は、好気性発酵中に酸素ラジカルなどの様々な形態の活性酸素種(ROS)に絶えずさらされることから生じる、製造プロセス中の製品関連不純物の非常に一般的な原因である(基礎培地と窒素源としての0.9%硫酸アンモニウムを用いて行った)。Capto-Sカラムから精製した後、得られた精製rhIL-11の酸化されたrhIL-11含有量はRP-UPLCにより定量すると約12.6%であった。酸化生成物の含有量を減らすために、硫酸アンモニウムを0.5%フィトンペプトンで置き換えた。フィトンペプトンは、窒素源を提供するだけでなく、発酵中のROSの形成を排除または減少させることができる硫黄含有アミノ酸を含む大豆ペプトンに由来する。本発明者らは、発酵培地に他の硫黄含有ペプチド、アミノ酸(例えばシステイン、メチオニン)、および/または有機化合物を補給することで同様の効果が得られると考えている。Capto-Sカラムによる精製の後、改変発酵培地中で得られた酸化されたrhIL-11の量は、提案された許容基準5.0%に近い約6.6%に減少した。生成物を、疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いて酸化されたrhIL-11を除去するための第二のクロマトグラフィー工程によりさらにポリッシュした。
Capto-Sカラムから溶出した画分の合わせたプールに、約5mMの濃度を達成するために固体DL-メチオニンを導入し、約0.5Mの濃度を得るために固体硫酸アンモニウムを添加した。0.2または0.45μm膜を通して濾過した後、得られたタンパク質溶液を、Butyl HPカラム(1cm×10cm)に8mg/mL総容積のサンプル負荷で負荷し、続いて、0.5M硫酸アンモニウムを含む緩衝溶液で洗った。続いてカラムを、カラム体積の15倍を超える0.475M硫酸アンモニウム含有バッファーで洗浄した。ポリッシュされたrhIL-11生成物を10mMリン酸ナトリウムpH7バッファーを用いて溶出した(図13参照)。各画分の酸化されたrhIL-11含有量はRP-UPLCによって定量化され、酸化種の含有量の減少を示した。5%未満の酸化種を含む画分をプールし、約49%の工程回収率を得た。
Butyl HICカラムから溶出して得られた生成物は大量の硫酸アンモニウムを含有しており、続いてそれを10mMリン酸ナトリウムpH7バッファーに対する入念な透析および/または限外濾過により除去した。冷蔵保管用に濃度を6mg/mL以上に調整した。
最終精製バルクrhIL-11を、同一性、純度および効力を含む様々な分析にかけた。純度および相対分子量を、(図14に示すように)16%ゲルを用いた非還元SDS-PAGEによって分析したところ、これは高純度で単一のバンドを示した。
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Claims (19)
- 組換えIL-11をコードする発現ベクターを酵母に導入する工程であって、ここで前記組換えIL-11は融合タンパク質の形態ではない、
IL-11の発現を誘導する条件下で培地中で前記酵母を培養する工程、
前記培地の固形物から上澄みを分離する工程、
前記上澄み中の可溶性であるがミスフォールディングされた組換えIL-11を同定する工程、
沈殿物を含む懸濁液を形成するのに十分な量で、前記上澄みをポリエチレングリコールと接触させる工程、
変性剤を含む溶液中で前記沈殿物を可溶化して、粗IL-11溶液を生成する工程、
前記変性剤の濃度を0.7M以下に下げてリフォールディングされたIL-11溶液を製造する工程、
前記リフォールディングされたIL-11溶液をイオン交換媒体と接触させる工程、および、
前記イオン交換媒体から精製されたIL-11を溶出する工程、を含む、IL-11を製造する方法。 - 前記ポリエチレングリコールが4%(w/v)~12%(w/v)の最終濃度で提供される、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリエチレングリコールが2,000D~20,000Dの平均分子量を有する、請求項1または2に記載の方法。
- 前記変性剤が、尿素、グアニジン塩酸塩および界面活性剤からなる群から選択される、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記界面活性剤が、ドデシル硫酸塩およびN-サルコシルからなる群から選択される、請求項4に記載の方法。
- 前記可溶化する工程において、前記変性剤が4M~10Mの濃度のグアニジン塩酸塩である、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記変性剤の濃度を低下させる工程が、前記変性剤の濃度を低下させた後、18℃~25℃で1時間インキュベートすることを含む、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記イオン交換媒体がカチオン交換媒体を含む、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記変性剤の濃度を低下させる工程が、前記粗IL-11溶液の希釈によって達成される、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記変性剤の濃度を低下させる工程が、前記粗IL-11溶液のバッファー交換によって達成される、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記リフォールディングされたIL-11溶液を製造する工程が、0.1mg/mL~10mg/mLのタンパク質濃度で行われる、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1~11のいずれか一項に記載の方法であって、
以下のさらなる工程、
前記精製されたIL-11を疎水性相互作用媒体と接触させる工程、および、
前記疎水性相互作用媒体からポリッシュされたIL-11を溶出する工程、
ここで、前記ポリッシュされたIL-11は、前記精製されたIL-11と比べて低下した含有量の酸化されたIL-11を有する、を含む方法。 - 前記ポリッシュされたIL-11が少なくとも95%の純度を有する、請求項12に記載の方法。
- 前記ポリッシュされたIL-11が5%以下の酸化されたIL-11を含む、請求項12記載の方法。
- 前記ポリッシュされたIL-11が、1%以下のIL-11の二量体を含む請求項12に記載の方法。
- 前記リフォールディングされたIL-11溶液を製造する工程が、共溶質の非存在下で行われる、請求項1~15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記リフォールディングされたIL-11溶液を製造する工程が、4~12のpHで行われる、請求項1~16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記リフォールディングされたIL-11溶液を製造する工程が、7~11のpHで行われる、請求項1~17のいずれか一項に記載の方法。
- 7TD1細胞ラインを用いて試験した場合、ポリッシュされたIL-11が4×106U/mg~1.2×107U/mgの生物学的活性を有する、請求項1~18のいずれか一項に記載の方法。
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