CN110382524B - 用于在酵母中生产重组il-11的系统和方法 - Google Patents

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Abstract

重组IL‑11在酵母中表达，然后通过沉淀、在变性剂存在下溶解沉淀并使溶解的蛋白质复性，从需氧发酵培养基中分离。通过阳离子交换和疏水性相互作用色谱进一步纯化复性rhIL‑11，以提供具有高生物活性和低rhIL‑11二聚体和氧化rhIL‑11含量的高度纯化的rhIL‑11。

Description

用于在酵母中生产重组IL-11的系统和方法
本申请要求2017年1月16日提交的美国临时申请号62/446,762的权益。这些和所有其他引用的外在材料通过引用以其整体并入本文。如果通过引用并入的参考文献中术语的定义或使用与本文提供的该术语的定义不一致或相反，则以本文提供的该术语的定义为准。
发明领域
本发明的领域是重组IL-11的生产和随后的纯化，尤其是在酵母中。
背景技术
背景技术描述包括可用于理解本发明的信息。并不承认本文提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的发明相关，或者具体或隐含地引用的任何出版物是现有技术。
白细胞介素IL-11具有相当大的治疗潜力，但是已证明以足够的规模和纯度产生IL-11具有挑战性。由于缺乏糖基化，已尝试在细菌中表达重组IL-11。然而，所得蛋白质倾向于表达为不溶性包涵体，导致产率差。这可能是由于不适当的折叠。已经尝试在酵母中表达IL-11，但是迄今为止这样的方法提供了低产率并且需要使用有毒的有机溶剂。
解决该问题的一种方法是将重组IL-11表达为具有更期望的表达特征的融合蛋白。可商购的IL-11通常分离自大肠杆菌中表达的融合蛋白。不幸的是，使用肠激酶从融合蛋白产生IL-11片段导致产物异质性。类似地，美国专利申请公开号2009/0010872(属于Mackiewicz)描述了重组IL-11融合蛋白，其结合了IL-11和可溶性IL-11受体序列，以及这种融合蛋白在培养基中的昆虫或哺乳动物细胞中的表达。然而，从这种融合蛋白中回收IL-11需要切割融合蛋白的额外的处理步骤，并可导致产物IL-11片段的长度和/或序列的变化。此外，这种细胞具有复杂的培养要求，这可能使期望的产物的下游纯化变复杂。
例如，美国专利申请公开号2007/0275889描述了编码IL-11序列和陪伴蛋白的质粒的用途，以及这种质粒在培养的昆虫或哺乳动物细胞中的表达。陪伴蛋白用于提供适当的折叠并防止表达的IL-11聚集。本文中的所有出版物均以引用方式并入，其程度如同每个单独的出版物或专利申请被具体和单独地指出通过引用并入。如果并入的参考文献中的术语的定义或用法与本文提供的术语的定义不一致或相反，则本文提供的该术语的定义适用，并且该术语在该参考文献中的定义不适用。然而，如上所述，此类细胞的培养条件可以使随后的纯化步骤变复杂。此外，在培养的哺乳动物和昆虫细胞中的表达通常远低于细菌或酵母的表达。
因此，仍然需要一种简单、有效且可规模化的方法来提供基本上纯的和活性的IL-11。
在一些实施方式中，用于描述和要求保护本发明的某些实施方式的表示成分的量、性质(如浓度)、反应条件等的数字应理解为在某些情况下通过术语“约”修饰。相应地，在一些实施方式中，书面描述和所附权利要求书中陈述的数值参数是近似值，其可以根据特定实施方式试图获得的所需性质而变化。在一些实施方式中，数值参数应根据报道的有效数字的数量并通过应用普通的舍入技术来解释。尽管陈述本发明的一些实施方式的宽范围的数值范围和参数是近似值，但具体实施例中陈述的数值尽可能精确地报道。在本发明的一些实施方式中呈现的数值可能含有必然由其各自的测试测量值中发现的标准偏差引起的某些误差。
如本文的说明书中和贯穿所附的权利要求所使用的，除非上下文另有明确规定，否则“一种”、“一个”和“该”的含义包括复数指代。还有，如本文的说明书中所使用的，除非上下文另有明确规定，否则“在...中”的含义包括“在...中”和“在......上”。
除非上下文指示相反，否则本文所陈述的所有范围应解释为包括其端点，并且开放式范围应解释为仅包括商业实用值。类似地，除非上下文指示相反，否则值的所有列举应视为包括中间值。
本文中对数值范围的叙述仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的简写方法。除非本文另有说明，否则具有范围的每个单独的值被并入说明书中，如同其在本文中单独叙述一样。除非本文另有说明或上下文明显矛盾，否则本文所描述的所有方法均可以任何合适的顺序进行。关于本文某些实施方式提供的任何和所有实例或示例性语言(如“诸如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明，而不是对本发明的其他权利要求的范围进行限制。说明书中的任何语言都不应被解释为表示对于本发明的实践必不可少的任何未要求保护的要素。
本文公开的本发明的可选要素或实施方式的分组不应解释为限制。每个组成员可以单独地或与组中的其他成员或本文中找到的其他元素进行任何组合的参考和要求。出于方便和/或可专利性的原因，可以将一个或多个组成员包括在组中或从组中删除。当发生任何这样的包括或删除时，本说明书在此被认为含有经修改的组，从而满足所附权利要求中使用的所有马库什组的书面描述。
发明内容
本发明主题提供了这样的装置、系统和方法，其提供相对于现有技术方法具有降低的二聚体和氧化含量的高度纯化的重组IL-11。
本发明构思的一个实施方式是用于生产IL-11的方法，其包括将编码重组IL-11的表达载体引入酵母中，其中编码的重组IL-11不是融合蛋白的形式。在诱导IL-11表达的条件下，在培养基中培养酵母，随后将上清液与培养基的固体分离。然后用足以形成包括沉淀的悬浮液的量的聚乙二醇处理该上清液。例如，聚乙二醇可以以约4％(w/v)至约12％(w/v)和/或约6％(w/v)至约9％(w/v)的终浓度提供。这种聚乙二醇的分子量的范围可以为约2,000D至约20,000D，和/或约4,000D至约12,000D。
将该沉淀溶解在包含变性剂的溶液中，产生粗IL-11溶液。合适的变性剂包括脲、盐酸胍和/或洗涤剂(如十二烷基硫酸盐和/或N-十二烷基肌氨酸钠)。例如，在这样的溶解步骤中，盐酸胍的浓度可以是约4M至约10M或约5M至约9M的浓度。然后降低变性剂浓度(例如，盐酸胍浓度可以降低至0.7M或更低)以产生重折叠的IL-11溶液。在一些实施方式中，降低变性剂浓度的步骤包括在降低变性剂浓度后在18℃至25℃下温育约一小时。变性剂的浓度可通过任何合适的方法降低，包括稀释和/或缓冲液交换。IL-11的重折叠可以在约0.1mg/mL至约10mg/mL和/或小于约2mg/mL的蛋白浓度下进行，并且可以在没有共溶质的情况下进行。重折叠可以在约4至约12的pH下，或在约7至约11的pH下进行。然后使重折叠的IL-11溶液与离子交换介质接触，并随后将纯化的IL-11从离子交换介质(如，阳离子交换介质)洗脱。
在一些实施方式中，上述方法包括额外的处理步骤。在一些实施方式中，使纯化的IL-11与疏水性相互作用介质接触。合适的疏水性相互作用介质包括丁基、己基、辛基和/或苯基介质。随后将精炼(polished)的IL-11——其相对于纯化的IL-11具有降低的氧化IL-11含量——从疏水性相互作用介质中洗脱。所得纯化的IL-11可具有至少95％的纯度，例如包括约5％或更少的氧化IL-11和/或1％或更少的IL-11二聚体。当使用7TD1细胞系测试时，精炼的IL-11通常具有约4×106U/mg至约1.2×107U/mg(如，约6×106U/mg)的生物活性。
从以下优选实施方式的详细描述以及附图中，本发明主题的各种目的、特征、方面和优点将变得更加明显，附图中相同的数字表示相同的成分。
附图说明
图1A至1C：图1A至1C描绘了rhIL-11表达的高密度发酵的结果。图1A描绘了在不同时间点的生长曲线。收集不同诱导后时间点的培养基，并通过非还原性SDS-PAGE和免疫印迹进行分析。图1B显示了利用考马斯蓝染色的非还原性SDS-PAGE的典型结果。图1C显示了蛋白质免疫印迹的典型结果。M代表蛋白标记。
图2：图2显示了典型非还原性16％SDS-PAGE凝胶，其说明了在双水相萃取后rhIL-11的回收。
图3：图3提供了使用液体两相提取从表达培养基中分离的粗rhIL-11的远-UV CD光谱。
图4：图4显示了从发酵培养基(下图)和rhIL-11的参考标准(上图)沉淀的rhIL-11的尺寸排阻色谱的结果。
图5：图5显示了使用Capto-S柱(阳离子交换剂)通过液相色谱从含有0.1％Tween-80的发酵培养基中分离rhIL-11的结果。红色迹线描绘了在线电导率(in-lineconductivity)；蓝色迹线描绘了280nm处的UV吸光度。阴影区域表示判断为适合汇集(pooling)的级分。
图6A和6B：图6A和6B显示了在变性剂存在下重折叠后，在Capto-S阳离子交换剂上分离rhIL-11的结果。图6A显示了使用8M脲的结果。图6B显示了使用6M盐酸胍的结果。在两幅图中，红色迹线描绘了在线电导率，蓝色迹线描绘了280nm处的UV吸光度。箭头指示复性rhIL-11的洗脱位置。
图7：通过在7M GdHCl存在下溶解各种浓度的沉淀蛋白的重折叠产率。
图8：图8显示了在共溶质存在或不存在下分离重折叠的rhIL-11的结果。红色迹线描绘了在线电导率，和蓝色迹线描绘了280nm处的UV吸光度。
图9：图9显示了rhIL-11在不同pH下的重折叠产率。
图10：图10显示了使用Capto-S柱(阳离子交换剂)通过液相色谱分离复性的rhIL-11的结果。红色迹线描绘了在线电导率，绿色迹线描绘了pH，和蓝色迹线描绘了280nm处的UV吸光度。阴影区域表示判断为适合汇集的级分。
图11A和11B：图11A和11B显示了通过LC/MS的分子质量测定的结果。图11A显示了典型的离子色谱图。图11B显示了具有19,046.7Da的解卷积质量的主峰，其与预期的分子量19,047一致。在解卷积质量为19,062.5Da时观察到的次峰可能是氧化IL-11，因为额外的16Da可以通过单个氧来解释。
图12：图12显示了在Capto-S柱上离子交换的主峰的洗脱级分的尺寸排阻色谱的结果。
图13：图13显示了通过疏水性相互作用色谱法，使用丁基HP柱去除氧化rhIL-11的精炼rhIL-11的典型结果。红色迹线描绘了在线电导率，和蓝色迹线描绘了280nm处的UV吸光度。阴影区域表示判断为适合汇集的级分。
图14：图14显示了纯化的rhIL-11的纯度研究的典型结果，其使用以考马斯亮蓝染色的非还原性16％SDS-PAGE。蛋白样品的加样量为0.2至5.0μg。
图15：图15显示了通过RP-UPLC测定的rhIL-11和相关蛋白的纯度研究的典型结果。氧化rhIL-11以约2.5％存在，而未知杂质以约1.6％存在。
图16：图16显示了通过SEC-UPLC测定的单体rhIL-11的纯度研究的典型结果。单体rhIL-11的纯度为约99.0％。
图17：图17提供了纯化的IL-11产物的质谱m/z。获得了解卷积的质量19,045.7Da，其与预期的分子量19,047Da一致。
图18：图18显示了衍生自rhIL-11水解的胰蛋白酶消化肽的典型总离子色谱图。通过m/z和MS/MS片段化确认每种肽的鉴定。
图19：图19显示了使用纯化的rhIL-11进行的细胞增殖测定的典型结果。
具体实施方式
以下描述包括可用于理解本发明的信息。并不承认本文提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的发明相关，或者具体或隐含引用的任何出版物是现有技术。
本发明主题提供了装置、系统和方法，其中重组人IL-11可以在酵母中表达并作为活性的、基本上纯的单体蛋白从培养基中回收。将重组蛋白使用不包括反应物(诸如聚乙二醇)的溶剂沉淀，在离液剂或变性剂(如胍盐(guanidinium))存在下溶解，并复性以提供适当的蛋白折叠。色谱步骤诸如离子交换(如，阳离子交换)和/或疏水性相互作用色谱(如，使用丁基取代的色谱介质)可以结合到本发明构思的方法中。
从以下优选实施方式的详细描述以及附图中，本发明主题的各种目的、特征、方面和优点将变得更加明显，附图中相同的数字表示相同的成分。
在一些实施方式中，用于描述和要求保护本发明的某些实施方式的表示成分的量、性质(如浓度)、反应条件等的数字应理解为在某些情况下通过术语“约”修饰。相应地，在一些实施方式中，书面描述和所附权利要求书中陈述的数值参数是近似值，其可以根据特定实施方式试图获得的所需性质而变化。在一些实施方式中，数值参数应根据报道的有效数字的数量并通过应用普通的舍入技术来解释。尽管陈述本发明的一些实施方式的宽范围的数值范围和参数是近似值，但具体实施例中陈述的数值尽可能精确地报道。在本发明的一些实施方式中呈现的数值可能含有必然由其各自的测试测量值中发现的标准偏差引起的某些误差。
如本文的说明书中和贯穿所附的权利要求所使用的，除非上下文另有明确规定，否则“一种”、“一个”和“该”的含义包括复数指代。还有，如本文的说明书中所使用的，除非上下文另有明确规定，否则“在...中”的含义包括“在...中”和“在......上”。
本文中对数值范围的叙述仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的简写方法。除非本文另有说明，否则每个单独的值被并入说明书中，如同其在本文中单独叙述一样。除非本文另有说明或上下文明显矛盾，否则本文所描述的所有方法均可以任何合适的顺序进行。关于本文某些实施方式提供的任何和所有实例或示例性语言(如“诸如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明，而不是对本发明的其他权利要求的范围进行限制。说明书中的任何语言都不应被解释为表示对于本发明的实践必不可少的任何未要求保护的要素。
本文公开的本发明的可选要素或实施方式的分组不应解释为限制。每个组成员可以单独地或与组中的其他成员或本文中找到的其他元素进行任何组合的参考和要求。出于方便和/或可专利性的原因，可以将一个或多个组成员包括在组中或从组中删除。当发生任何这样的包括或删除时，本说明书在此被认为含有经修改的组，从而满足所附权利要求中使用的所有马库什组的书面描述。
在本发明构思的衍生方法和组合物中，来自Invitrogen的PichiaPinkTM表达系统用于建立分泌rhIL-11的稳定的rhIL-11高水平表达克隆。载体表达来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的α-交配因子前序列，其是将重组蛋白引导至细胞外培养基的短信号传导肽。PichiaPinkTM表达系统的特殊特征是使用ADE2基因启动子和基因产物来选择高拷贝数克隆。ADE2(负责嘌呤核苷酸的从头生物合成的基因)的突变导致嘌呤前体的积累，其提供具有红色/粉红色的转化菌落。表达菌株是ade2营养缺陷型，其不能在缺乏腺嘌呤的培养基上生长。用质粒转化表达宿主能够使菌株在缺乏腺嘌呤的培养基上生长，并且短ADE启动子序列有助于筛选整合的具有高拷贝数克隆。具有低拷贝数的菌落呈现粉红色；而白色菌落是高拷贝数克隆。
使用毕赤酵母(Pichia pastoris)在酵母中生产重组人IL-11的现有技术方法在酵母表达水平以及产物纯化水平下具有低产率。发明人发现，高细胞密度发酵的结果暗示了在阳离子交换纯化后，失活rhIL-11的表达和低回收产率(1～5％)。发现当与针对已知量的参照物的SDS-PAGE分析相比，在培养基中表达水平的ELISA定量低估了IL-11含量(减少约90％)。发明人得出结论，现有技术方法由于错误折叠和/或聚集而提供低产率，这先前已经使用反相色谱和随后去除有机溶剂在一定程度上得到解决。
之前没有报道过分泌性可溶的但错误折叠的rhIL-11的存在，因为通常认为错误折叠的蛋白质在细胞内聚集或者为了降解而被补救(9)。本发明构思的方法利用使用毕赤酵母表达系统的重组人IL-11的表达和纯化，以及在不使用反相色谱法的情况下与酵母发酵培养基的分离。
探索了复性rhIL-11的可选方法，包括使用离液剂/变性剂，诸如脲、SDS，硫酸铵和盐酸胍。发明人确定高浓度的盐酸胍能够破坏导致rhIL-11自聚集的相互作用，并且当变性剂的浓度降低时，允许单体rhIL-11适当地重折叠。
从培养基中生产rhIL-11的方法从两相提取开始，以从培养基中沉淀rhIL-11。沉淀可以通过提供rhIL-11从发酵培养基中选择性或部分选择性沉淀的任何合适的方法进行，合适的方法包括引入盐(如，硫酸铵、硫酸钠)、有机溶剂(如，甲醇、乙醇、丙酮等)、和/或亲水性聚合物(如，葡聚糖、糊精、环糊精、聚乙二醇/PEG等)。例如，可以使用终浓度为8％(w/v)的分子量为8,000Da的PEG(如PEG-8000)。将从发酵培养基中沉淀的蛋白质与发酵培养基分离以进行进一步处理。这种分离可以通过任何合适的方法完成，包括沉降、倾析、过滤和/或离心分离。在一些实施方式中，沉淀的蛋白质可以在进一步处理之前洗涤一次或多次(例如，使用含有沉淀剂的洗涤缓冲液)。
随后将沉淀的粗蛋白溶解在含有变性剂的缓冲液中，其可以帮助破坏蛋白质聚集体。合适的变性剂包括离液剂(如，脲、胍盐、异硫氰酸盐等)和洗涤剂(如，离子洗涤剂，诸如十二烷基硫酸盐；非离子洗涤剂，诸如Tween-20和/或Tween-80；和兼性离子洗涤剂)。例如，终浓度为7M的盐酸胍可用于破坏蛋白质聚集体并重新溶解沉淀的蛋白质。
然而，使用这样的变性剂必然导致期望的rhIL-11产物的变性。这样的变形可以通过去除变性剂或降低变性剂的浓度被逆转以提供复性的/重折叠的rhIL-11。这样的去除可以是快速的或渐进的。可通过任何合适的方法去除变性剂，包括稀释(例如，用含有减少量的变性剂或无变性剂的缓冲液)和缓冲液交换。缓冲液交换可以渐进地(例如，通过透析)或相对快速地(例如，通过渗滤、尺寸排阻色谱等)完成。应当理解，诸如透析和渗滤的方法在去除低-CMC洗涤剂方面可能相对无效。在一些实施方式中，使用不包括表面活性剂的缓冲液的直接稀释可以充分降低变性剂浓度，以允许rhIL-11的重折叠和复性。
令人惊讶的是，发明人发现了盐酸胍比其它离液剂更有效地提供沉淀的rhIL-11的溶解和随后在去除或减少离液剂时复性为活性/天然构象。虽然发现了盐酸胍对此目的非常有效，但申请人认为其他离液剂(诸如脲、异硫氰酸盐等)和/或洗涤剂在其使用优化的条件下可以同样有效。
应当理解，变性rhIL-11的正确重折叠或复性可以是除变性剂浓度以外的因素的函数。例如，复性期间的蛋白质浓度可以影响复性发生的程度和不期望的副产物(诸如二聚体和更高级聚集体)的形成。尽管从方法效率的观点来看，复性期间的高蛋白质浓度是理想的，但是这些考虑必须与最终产物的产率和纯度相平衡。在本发明方法的方法中复性或产生重折叠的rhIL-11期间的蛋白质浓度可以为约0.1mg/ml至约10mg/mL。令人惊讶的是，发明人已经发现重折叠的rhIL-11的复性或产生在蛋白质浓度小于2mg/mL时提供了最佳结果。这可以结合通过使用不含变性剂的缓冲液稀释来降低变性剂的浓度而方便地实现。
类似地，复性步骤期间的pH可以影响变性的rhIL-11的重折叠或复性。发明人已经发现复性可以在约4至约12的pH范围内进行。在优选的实施方式中，复原可以在约7至约11的pH范围内进行。如果需要，可以通过在复性之前或复原期间适当地加入酸(诸如HCl)或碱(诸如NaOH)来调节pH。可选地，可通过向复性溶液中添加缓冲化合物(诸如磷酸盐、碳酸氢盐、Tris，HEPES等)或通过将复性溶液的缓冲液交换至适当pH的缓冲的溶液来调节pH。
在复性/重折叠后，可以对rhIL-11进行两步色谱过程。第一步是使用阳离子交换剂的离子交换。合适的阳离子交换剂包括弱阳离子交换剂(例如，带有羧基的离子交换剂)和强阳离子交换剂(例如，含有磺酸基的离子交换剂)。这种阳离子交换可以使用离子交换膜，和离子交换树脂和/或相转移溶剂进行。在优选的实施方式中，使用填充在色谱柱中的阳离子交换树脂进行离子交换，这有利于特定级分的收集。rhIL-11制剂可以低离子强度施用，这允许rhIL-11与阳离子交换剂缔合或结合。在允许未结合的污染物通过后，通过增加所施加的缓冲液的离子强度(例如，通过增加NaCl或其他盐的浓度)或通过改变所施加的缓冲液的pH，可以从阳离子交换剂洗脱或释放rhIL-11。洗脱可以以逐步或梯度方式进行。应当理解，可以将高样品负载(超过5mg/mL)施用于一些阳离子交换柱，这可以减少由于非特异性结合引起的损失并提高方法效率。例如，使用Capto-S强阳离子交换柱允许以13mg/mL负载并且可以以40％至60％的步骤回收率提供活性rhIL-11。
在一些实施方式中，将利用疏水性相互作用色谱的第二色谱步骤施用于阳离子交换的产物，以去除其他污染物并提供更高度纯化的rhIL-11。可以使用含有合适疏水部分的膜或树脂进行疏水性相互作用色谱。合适的疏水部分包括丙基、丁基、己基、辛基和苯基。在一些实施方式中，可以在疏水相互作用色谱之前将盐(诸如硫酸盐或磷酸盐)加入到rhIL-11溶液中。这些盐也可用于在先前的离子交换步骤中从阳离子交换剂中洗脱rhIL-11。在优选的实施方式中，使用填充在色谱柱中的疏水性相互作用树脂进行疏水性相互作用色谱，其有助于在洗脱期间收集特定级分。通过降低所施加缓冲液的离子强度和/或增加所施加缓冲液的有机溶剂和/或表面活性剂浓度，可以从这种疏水性相互作用柱洗脱rhIL-11。缓冲液组成的这种变化可以是逐步变化，或者可以作为梯度施用。应当理解，rhIL-11可以在高蛋白质负载下施用于这种疏水性相互作用柱，这可以提高方法效率。例如，疏水性相互作用色谱柱可以在6-8mg/mL样品负载下使用，以提供大于约95％的rhIL-11产物纯度(通过去除氧化rhIL-11和其他杂质)以及约50％的步骤产率。然后将得到的纯化的rhIL-11浓缩到至少6mg/mL，并与pH7的10mM磷酸钠缓冲液进行缓冲液交换以进行冷藏。典型的总产率可以为约20％～25％。来自这样的方法的最终纯化的批量已经在同一性、纯度和效力方面进行了表征；这种表征显示了该方法能够以高纯度产出有效力的rhIL-11。
发明人注意到rhIL-11的氧化是产物污染的重要来源，采用色谱步骤来减少氧化rhIL-11的存在对产率的影响。重组蛋白的氧化主要发生在处理和储存期间，这是因为存在反应性氧种类，包括超氧化物(O2-)及其质子化形式(HOO·)、过氧化氢(H2O2)和其他羟基(OH·)(17)。含硫残基的蛋白质氧化在稳定性中显著地起关键作用。特别是蛋白质治疗剂的氧化应激可能导致各种医疗后果，包括效力下降或免疫原性升高(18)。氧化损伤通常与发酵期间的溶解氧有关，这对于需氧发酵来说是不可避免的。发明人考虑可以对发酵过程进行修改以最小化培养期间氧化蛋白的产生，以及优化下游精炼过程以选择性去除氧化蛋白。
应当理解，相对于现有技术方法产生的rhIL-11，由这种方法得到的rhIL-11制剂具有高生物活性和高纯度。当使用7TD1细胞系测试生物活性时，如上所述从疏水性相互作用柱洗脱的精炼rHIL-11可具有约4×106U/mg蛋白质至约1.2×107U/mg蛋白质和通常约为6×106U/mg蛋白质的生物活性。这种rhIL-11制剂的纯度可以大于85％、大于90％、大于95％、大于98％或大于99％。通常，如上所述产生的rhIL-11的纯度大于95％。如上所述，氧化rhIL-11通常发现于需氧发酵产品中。如上所述制备的rhIL-11制剂通常包含5％或更少的氧化rhIL-11。类似地，如上所述制备的rhIL-11制剂可包括小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1％或小于0.5％的二聚rhIL-11(即rhIL-11二聚体)含量。通常，这种制剂包含小于1％的二聚rhIL-11含量。
实施例
以下是本发明构思的说明性实施例，并且不被认为是限制。
材料
PichiaPinkTM表达系统(#A11152，A11154)购自Invitrogen Life Technologies。用于克隆构建的限制酶和聚合酶购自Thermo Fisher Scientific的FastDigest酶。消泡剂204(#A6426)、不含氨基酸的酵母氮基质(base)(#Y0626)购自Sigma-Aldrich。衍生自酵母的rhIL-11的参考标准由杭州九原基因工程公司提供(批号#20121005/1006/1007/1008和20150402)。用于免疫印迹的反应物和材料，包括8-16％梯度SDS PAGE(#25268)、StartingBlock阻断缓冲液(#37579)、BlockerTM酪蛋白(#37583)、不含甲醇的转移缓冲液(#35045)、TBS Tween 20缓冲液(#28360)和1步超TMB(#37574)、2-巯基乙醇(#21985-023)和Novex Tris-甘氨酸16％聚丙烯酰胺凝胶(XP00162BOX)购自Thermoscientific。从R&D系统获得人IL-11亲和纯化多克隆山羊IgG(#AF-218-NA)和驴抗山羊IgGHRP亲和纯化多克隆(#HAF109)。从DSMZ获得与C57Bl/6脾细胞融合的7TD1鼠骨髓瘤细胞(编号ACC 23)。从牛胰腺修饰的测序级胰蛋白酶(Cat.11418025001)购自Roche diagnostics。小鼠IL-11受体α(目录号MBS553276)从MyBioSource，Inc.获得。CellTiter/>水性非放射性细胞增殖试验(MTS)(目录号G5430)购自Promega。RPMI 1640(#SH30255.01)、HI FBS(H#SH30071.03HI)、Strep/Pen(HYCLONE，USA，SV30010)购自美国HYCLONE。纯化树脂-Capto S(产品代码17-5316-10)、Capto Q(产品代码17-5441-01)和丁基HP(产品代码17-5432-01)购自GE Healthcare Life Sciences。用于HPLC操作的三氟乙酸(目录号302031)和乙腈(目录号34967)购自Sigma-Aldrich。聚乙二醇8000(#408050010)、DL-甲硫氨酸(#125652500)和盐酸胍(#364790025)购自Acros Organic。硫酸铵(#11566)购自Alfa Aesar。非动物来源的植胨蛋白胨(#210931)来自Becton Dickinson。
表达rhIL-11的酵母克隆的克隆和细胞库
合成重组人IL-11基因并克隆到含有编码α-因子信号肽的基因的pPINKα-HC酵母表达载体中，其中缺失Glu-Ala重复序列。通过电穿孔将所得重组载体转化到蛋白酶缺陷菌株中以产生稳定的克隆。挑选来自每次转化的大约40个克隆，并通过在SDS-PAGE上目测检查表达强度筛选表达高IL-11的克隆，如使用考马斯蓝染色可视化(数据未显示)。使用rhIL-11特异性抗体的蛋白质免疫印迹证实了蛋白质同一性。将研究主细胞库(master)和工作细胞库相应地准备并在深度冻结中存储。
为了确保数量和质量的一致表达，通过4代选择的克隆pPINKS2-IL11-24的传代，在克隆纯化后，扩展细胞主库随后是工作细胞库。主细胞库和工作细胞库储存在-80℃下长期储存。
高密度发酵
使用1升发酵系统(B生物反应器，Sartorius)用于评估使用补料分批发酵的高细胞密度培养物中所选克隆的rhIL-11表达水平。通过来自工作细胞库的解冻小瓶接种15-mL MGM(最小甘油培养基；0.2μm过滤)培养基开始发酵，该培养基不含腺嘌呤。MGM的组成如下：
·1.34％不含氨基酸的酵母氮基质
·1％甘油
·4ppm生物素
在30℃下以250rpm振荡培养20小时后，使用所得培养基接种具有0.5％植胨蛋白胨(pH 5)的100-mL BSM(发酵基础盐培养基)另外48小时。如下制备BSM的组合物：
BSM的组成-
·甘油(50％)80mL
·磷酸(28％)26.7mL
·硫酸钙 0.9g
·硫酸镁 14.9g
·氢氧化钾 4.1g
·硫酸钾 18.2g
·植胨蛋白胨5.0g
·PTM1痕量盐 4.4mL
添加水以得到最终体积为1L。
调节液体培养基的pH到5.0，并缓慢添加过滤的PTM1痕量盐以避免沉淀。
制备PTM1痕量盐如下：
PTM1痕量盐的组成-
添加水以得到最终体积为1L。
接下来，将含有0.5％(w/v)大豆植胨蛋白胨的600mL发酵基础盐培养基(BSM)与500μL消泡剂在1L容器中混合，随后在相同培养条件下在甘油分批阶段期间接种新鲜培养的种子细胞。通过调节搅拌速度将溶解氧水平-pO2值保持在80％，并将空气入口流量设定为0.3L/min。在甘油补料分批阶段，将50％甘油以6mL/hr/L的限制速率补料至容器中以促进生长。通过在不同时间点测量OD 600nm直至OD达到约180-200来监测细胞密度。在该阶段期间，通过增加搅拌速率和空气入口流量将pO2值保持在不低于30％。通过在初始4-5小时以5.5mL/hr/L补料30％(v/v)甲醇，然后以5.5-9mL/hr/L补料50％(v/v)甲醇，在甲醇补料分批中诱导rhIL-11的表达。通过增加搅拌速率和空气入口流量将pO2值保持在不低于20％。诱导48-72小时后收获培养基。
rhIL-11表达克隆的表达水平
通过在相同的SDS-PAGE凝胶上目测检查参考标准品的强度来确定所需表达水平的培养基的蛋白质含量，因为发现由于错误折叠的IL-11(其被发现很大程度上不被抗体检测)的存在，通过ELISA始终低估该值。可选地，可以使用光密度测定软件(诸如BiochemLabSolutions提供的GelQuant.NET(版本1.8.2))来定量蛋白质含量。使用RP-HPLC也可以实现表达水平的精确定量。通过添加8％(w/v)PEG-8000沉淀培养基中的分泌性rhIL-11并在离心后收集。将沉淀(pellet)重悬于含有7M盐酸胍的pH8磷酸钠缓冲液中。通过离心去除不溶性颗粒后，通过使用以下用于RP-HPLC操作的色谱程序将积分面积与已知浓度的参考标准进行比较来计算表达生产率：
·柱：PLRP-S柱(Agilent)、8μm、2.1x 150mm、孔径、配备有防护柱体。
·流动相A：水中0.1％(v/v)TFA；流动相B：90％(v/v)乙腈中0.1％(v/v)TFA。·流速：0.2ml/min。
·检测：215nm。
·注射体积：5-10μl。
梯度：在表1中显示了典型溶剂梯度。
表1
时间(分钟) A％ B％
0 100 0
1 100 0
2 70 30
33 25 75
33.1 10 90
35 10 90
35.1 100 0
50 100 0
纯化的rhIL-11的蛋白质浓度
使用UV/Vis微板和比色皿分光光度计(如，来自Thermo Scientific的MultiskanGO)，通过280nm处的UV吸光度测定色谱步骤后rhIL-11的浓度。使用下式计算在水中测量的在280nm处以M-1cm-1为单位的消光系数(Ec)为17,990：
Ec＝数目(Tyr)x 1490+数目(Trp)x 5500+数目(Cys)x 125计算以摩尔为单位的蛋白质浓度，如下：
浓度＝(在280nm的吸光度)/Ec
可选地，蛋白质浓度可以使用对于0.1％(即1mg/ml)溶液为0.944的吸光率值通过紫外光谱在280nm直接测定。使用280nm处的吸光度的蛋白质定量测量芳族氨基酸(诸如色氨酸和酪氨酸)的吸光度，并且不检测PEG部分的存在。由此，本文叙述的按重量计的蛋白质浓度不包括PEG分子的存在。这两个值都可以通过ProtParam计算，ProtParam是一种计算给定蛋白质的物理和化学参数的工具(10)。
十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，染色和免疫印迹
通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Biorad的Mini-PROTEAN系统联用预制凝胶来评估蛋白质的表观分子量。在考马斯蓝或银染色后可视化所得的聚丙烯酰胺凝胶。
用从Bio-Rad获得的Mini Trans-Blot Cell进行蛋白质免疫印迹。在蛋白质电泳后，使用300mA电流将在SDS-PAGE上分辨的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上1小时。随后使用封闭缓冲液将硝酸纤维素膜封闭30分钟至过夜，然后用TBS-Tween 20缓冲液洗涤6次，每次5分钟。通过与针对人IL-11的酪蛋白封闭的稀释的(1：2,000)一抗(山羊IgG)在室温下温育1小时，在膜上检测到目标蛋白质。在用TBS-Tween 20缓冲液洗涤膜6次，每次4分钟后，用针对山羊IgG的酪蛋白封闭的稀释的(1：3,000)二抗在室温下温育膜1小时。将膜转移至浅盘中，并根据制造商的程序利用1步超TMB温育。仔细监测显色过程，并在达到所需强度的条带时在水中短暂洗涤。
rhIL-11的纯化
双水相萃取：通过双水相萃取从发酵培养基中沉淀可溶但错误折叠的rhIL-11。将固体PEG 8000直接加入发酵培养基的滤液中，使终浓度为6％至8％(w/v)。通过温和搅拌使固体聚合物完全溶解，然后以4,000rpm离心10分钟以回收沉淀的蛋白质。
再折叠rhIL-11：将沉淀的蛋白质溶于含有7M盐酸胍(GdHCl)的pH 8-9的缓冲溶液的20mM磷酸钠中至终浓度为2mg/mL，并在室温下温育1小时。加入11倍体积的4mM磷酸钠缓冲液(pH8)以稀释GdHCl，通过在室温下将溶液温育2小时使变性蛋白质经历适当的重折叠。在进行离子交换色谱之前，使用超滤或透析，用4mM磷酸盐缓冲液通过简单稀释或缓冲液交换稀释所得溶液，以获得小于6.5mS/cm的电导率。
阳离子交换色谱：使用商业色谱装置(如，来自GE Healthcare Life Sciences的 plus)进行离子交换色谱。在加样到色谱柱上之前，将得到的稀释溶液离心或通过0.45或0.2μm膜过滤以去除颗粒。将混合物加样到Capto S柱上，该柱用含有20mM磷酸钠(pH8)的缓冲液A平衡。用含有20mM磷酸钠(pH8)和1M NaCl的缓冲液B的梯度洗脱或逐步洗脱来洗脱蛋白质。
疏水性相互作用色谱：使用商业色谱装置(例如来自GE Healthcare LifeSciences的 plus)进行疏水性相互作用分析。汇集含有来自阳离子交换剂(Capto S)的rhIL-11的级分，并加入到含有5mM DL-甲硫氨酸的0.5M硫酸铵中。将得到的稀释溶液离心或通过0.45或0.2μm膜过滤以在样品加样之前去除颗粒。将混合物加样到丁基HP柱上，该柱用在10mM磷酸钠(pH7)缓冲溶液中含有0.5M硫酸铵和5mM DL-甲硫氨酸的缓冲液A平衡。用含有10mM磷酸钠(pH7)缓冲液的缓冲液B的逐步或梯度洗脱来洗脱蛋白质。使用另外的0.2M乙酸洗脱紧密结合的rhIL-11。
通过尺寸排阻色谱确定纯度：除了其他高分子量物种之外，共价和非共价聚集的rhIL-11的含量通过尺寸排阻色谱(SEC)分析，其采用有提供二极管阵列检测器的商业UPLC系统(如，来自Thermo Scientific的UltiMate 3000快速分离LC系统)。使用以下参数进行色谱过程：
·柱：Waters Acquity BEH200 SEC 1.7μm,4.6x 150mm,孔径(部件#186005225)，配备有防护柱体(部件#186005793)。
·流动相：含有0.5M NaCl的25mM磷酸钠(pH 7.0)。
·流速：0.3ml/min。
·检测：280nm。
·停止时间：10min。
·注射5μg的蛋白质。
通过LC/MS确定纯度和分子质量：使用(a)提供有二极管阵列检测器的UPLC(如，来自Thermo Scientific的UltiMate 3000快速分离LC系统，或Agilent1290infinity UPLC系统)联用Agilent 6540UHD精确质量Q-TOF LC/MS系统，通过反相(RP)色谱分析rhIL-11的纯度。使用如下参数进行色谱过程：
·柱：ACQUITY UPLC PST C18柱，孔径，1.7μm，2.1mm x 150mm(部件号186003687)，配备有Acquity BEH C18 VanGuard前柱，/>孔径，1.7μm，2.1x5mm(部件号186004629)。
·流动相和梯度：流动相A：在水中0.1％(v/v)三氟乙酸(TFA)；流动相B：在95％(v/v)乙腈中0.1％(v/v)TFA。
流速：0.4ml/min。
·柱温：环境温度。
·检测：214nm。
·注射：5μg。
梯度-在表2中显示了典型的溶剂梯度。
表2
质谱法的操作参数如下：
·m/z范围和极性：150-3000正
·源参数：气体温度300℃；气体流速8l/min
·雾化器35psig
·鞘气(Sheath gas)温度380℃；鞘气流速11l/min
·扫描源参数：
οVCap＝3500
ο喷嘴电压1,000V
ο碎裂器(Fragmentor)175
ο锥孔(Skimmer)165
ο八极RF峰750
基于细胞的生物测定
使用7TD1细胞系在细胞增殖测定中计算rhIL-11的生物活性。将IL-11参考标准品和未知样品无菌稀释，以提供20,000ng/ml至0.2pg/ml的10倍浓度范围(总共9次稀释)。将50μl rhIL-11标准品或样品加入到含有7TD1细胞的孔(如，96孔板的孔中)中，每孔4,000个细胞，一式两份。将细胞在37℃下在含有5％CO2的潮湿气氛中温育，以表征它们在2μg/mLIL-11受体存在下对不同IL-11浓度的反应，持续3天(12)。对于细胞增殖测定，使用多通道移液管将每孔20μl的MTS溶液分配到孔中，并根据信号显影在37℃培养箱中温育2.5-3小时。温育后，使用UV/Vis微板和比色皿分光光度计(如，来自Thermo Scientific的Multiskan GO)读取板在490nm处的吸光度。
通过用GraphPad软件Prism 6拟合S形剂量-反应曲线，通过绘制y轴上490nm的吸光度对x轴上的浓度的曲线来确定剂量响应曲线的EC50(半最大有效浓度)，针对四参数非线性逻辑方程：
y＝((a-d)/(1+(x/c)b))+d
其中：
·a是当浓度接近零时最小渐近线的y轴；b是指曲线的陡峭程度的斜率
·c是EC50
·d是当浓度接近无穷时最大渐近线的y轴
·x是浓度
·y是在490nm的吸光度。
由下面的方程式导出比生物活性：
比活性(U/mg)＝(参考的比活性)x(EC50参考/EC50样品)
通过圆二色性表征二级结构
在室温下使用Jasco J-815分光偏振计使用1.0cm路径长度的石英池记录远紫外圆二色性(CD)光谱。使用去离子水或5mM磷酸钠(pH7)将蛋白质样品稀释至约0.02mg/mL。使用包括扫描速率、带宽和响应设定分别为100nm/min、1nm和2sec的操作参数在远紫外区(190nm至250nm)中监测二级结构。根据3次扫描的平均获得光谱。
肽映射
通过加入1/100(w/w)测序级胰蛋白酶，在含有2mg/mL蛋白质的50mM磷酸钠(pH8)缓冲液中制备蛋白水解溶液。在室温下温育6小时后，引入TFA(或甲酸)以获得0.1％的终浓度以淬灭反应。在注射之前通过离心或通过0.2或0.4μm膜过滤去除沉淀。使用LC/MS系统-Agilent 1290infinity UPLC系统联用Agilent 6540UHD精确质量Q-TOF LC/MS系统进行肽鉴定。色谱程序如下进行：
·柱：Zorbax 300SB-C8，2.1x150 mm，5μm，孔径(Agilent部件号883750-906)。
·流动相和梯度：流动相A：水中0.1％(v/v)TFA；流动相B：95％(v/v)乙腈中0.1％(v/v)TFA
·流速：0.2ml/min。
·检测：214nm。
·注射：10μg。
梯度-表3中显示了典型的溶剂梯度。
表3
质谱法的操作参数如下：
·m/z范围和极性：400-1700正；
·源参数：
ο气体温度300℃
ο气体流速8l/min
ο雾化器35psig
ο鞘气温度350℃
ο鞘气流速11l/min。
·扫描员参数：
οVCap＝3500
ο喷嘴电压1,000V
ο碎裂器175
ο锥孔165
·碰撞能量：
电荷 斜率 位移
2 4 1
3 3.5 -2
>3 3.2 -4.8
1 0 20
由胰蛋白酶切割的蛋白水解肽的估计分子量列于表1中。每种蛋白水解肽的鉴定用MS Product工具手动进行，其产生可能的碎片离子，这些碎片粒子源于m/z光谱中肽的碎裂。在表4中显示了由重组IL-11得到的胰蛋白酶消化肽段。
表4
氨基酸组成
使用Hitachi High-Speed Amino acid Analyzer L-8900确定氨基酸组成，其通过离子交换机制提供水解氨基酸的分离，然后用茚三酮衍生化。在水解之前，蛋白质样品以1mg/mL一式三份制备，并在氮气下在6N HCl，110℃的条件下水解22小时。在80℃水浴中蒸发后，将水解的样品重悬于0.02N HCl中。在这种酸性水解条件下，天冬酰胺和谷氨酰胺脱酰胺形成它们各自的酸。色氨酸完全降解。半胱氨酸和甲硫氨酸被氧化并且不容易从酸水解产物中检测到。酪氨酸，丝氨酸和苏氨酸部分水解(13)。
高细胞密度发酵
甘油-补料分批发酵在1L发酵罐中进行，所述发酵罐接种了从研究工作细胞库的小瓶中解冻的蛋白酶缺陷菌株(pPINKS1-IL11-24)，用于下游纯化显影。典型的细胞生长曲线如图1A所示，显示细胞培养物在额外补料甘油后达到200OD。甲醇诱导后细胞密度继续增长至250OD，但在诱导后22小时后逐渐下降，可能是由于营养不足。在诱导时间点后22小时、46小时和70小时取出发酵液体培养基的样品，并通过非还原SDS-PAGE分析。图1B和图1C分别显示了SDS-PAGE和免疫印迹的典型结果。表达水平不是通过ELISA测定的，因为发现该方法始终低估了生产率。相反，通过视觉检查或光密度测定法，通过考马斯蓝染色的强度相对于参考标准的强度来估计rhIL-11的生产率，并且发现产率近似0.4-0.6g/L。在通过考马斯蓝染色显影的SDS-PAGE中，在约15KD的rhIL-11(近似20KD)位置下方存在一些明显的条带(图1B)，其是通过使用针对rhIL-11的抗体的免疫印迹验证的降解物种(图1C)。通过RP-HPLC测定的发酵培养基的表达生产率为约0.4mg/mL。
使用阳离子交换色谱捕获IL-11
鉴于IL-11的高等电点(pI＝11)，试图用阳离子交换色谱从pH8的发酵培养基中捕获rhIL-11。通过离心去除细胞浆后，通过超滤对几百毫升液体培养基进行缓冲液-交换或直接用至少10体积的水稀释几百毫升液体培养基，得到小于3mS/cm的电导率。为了回收rhIL-11，将少量相当于约2毫克rhIL-11的溶液加样到预先用20mM Tris pH8缓冲液平衡的1mL Capto-S柱(阳离子交换剂)上。用上至1M NaCl的NaCl梯度洗脱结合的蛋白质直。SDS-PAGE和免疫印迹的结果表明在流通级分中发现了rhIL-11，并且没有与柱结合(数据未显示)。为了确保使用阳离子交换剂的纯化系统的适用性，将0.5mg参考rhIL-11掺入1mL发酵液体培养基中作为阳性对照，然后进行上述纯化步骤。回收约30％表明阳离子交换剂对分离rhIL-11的适用性，因为它以相同的方式成功地通过NaCl梯度洗脱。通过回收流通材料，尝试用阴离子交换剂(Capto-Q)进行分离。将少量相当于约2毫克rhIL-11的溶液加样到1mLCapto-Q柱(阴离子交换剂)上以回收流通液中的rhIL-11。该柱预先用20mM Tris pH 8缓冲液平衡，然后用上至1M NaCl的NaCl梯度洗脱。令人惊讶的是，SDS-PAGE的结果表明在含NaCl的级分中成功回收了rhIL-11，但没有在流通液中回收(数据未显示)。重复该纯化过程，得到一致和可重复的结果，证实了表达的rhIL-11的预料不到的离子特性。
本发明人注意到当使用发酵培养基样品时，基于细胞的增殖测定中rhIL-11的弱生物活性和使用ELISA定量的低估的rhIL-11含量。有趣的是，当发酵液体培养基掺入参考rhIL-11时，生物活性恢复(数据未显示)。发明人得出结论，离子交换剂上预料不到的结合(或缺乏)和生物活性的丧失表明表达的蛋白质的物理性质改变。
液体两相萃取
在进一步研究之前，通过简单的双水相萃取从发酵培养基中回收表达的蛋白质。通过加入聚乙二醇8000，开发萃取以从液相中沉淀非天然rhIL-11。将固体PEG-8000加入1mL过滤的发酵液体培养基中，以分别得到2.9、3.8、5.0、6.2、7.3和8.2％(w/v)。在4℃下温育1小时后，仅在含有6.2、7.3和8.2％的PEG8000的样品中观察到浑浊。通过使用台式离心机以最高速度离心5分钟收集沉淀，并用1-mL的pH8下的磷酸钠缓冲液重构沉淀的蛋白质。如图2所示，通过加入少至6％(w/v)的PEG 8000，几乎所有的rhIL-11都可以从沉淀中回收。在随后的研究中，除非另有说明，否则通过用PEG沉淀从培养基中回收rhIL-11。
发酵培养基中分泌的rhIL-11的结构特性
使用圆二色性(CD)和尺寸排阻色谱研究结构特征。通过向发酵培养基中加入8％的PEG 8000从液体两相萃取中回收的沉淀的rhIL-11以约0.02mg/mL重悬浮于去离子水中。典型的CD光谱如图3所示，揭示出显著的螺旋结构(如～222nm和210nm处的负带和～195nm处的正带所示)。这表明粗rhIL-11维持螺旋骨架。
对于尺寸排阻研究，将PEG沉淀的蛋白质重悬于20mM磷酸钠(pH 7)缓冲液中至浓度为约1mg/mL。使用Acquity BEH200 SEC柱将分子大小与rhIL-11的参考标准进行比较，该柱能够分离范围从10K至450K Da的球状蛋白质。如图4所示的结果表明来自发酵培养基的粗rhIL-11具有预料不到的高分子质量。这表明分泌的rhIL-11作为可溶性聚集体存在于培养液体培养基中。结合CD数据，预期保持分泌的rhIL-11的螺旋结构，但单体分子倾向于彼此非共价缔和以形成分子间螺旋束。发明人认为，不受理论束缚，这是原始过程中产率低的原因，导致物理化学特性的变化和生物活性的丧失。
在发酵培养基中使用非离子表面活性剂防止自聚集
尽管毕赤酵母通过真核折叠途径表达蛋白质，但高密度酵母培养物中的自聚集和错误折叠的分泌性rhIL-11以前没有被记载。聚集形式产生显著的问题，诸如生物活性丧失和下游纯化步骤中的差产率。防止聚集的一种策略是在发酵培养基中引入添加剂或表面活性剂(14)。为了研究这一点，0.1％的Tween-80被引入1-L高密度补料分批发酵培养基中。收获后，向130mL发酵培养基中加入10X水以降低电导率。通过0.45或0.2μm膜的简单过滤去除颗粒物质后，将所得溶液加入阳离子交换剂(Capto-S)中以回收生物活性的rhIL-11。典型的纯化曲线如图5所示。加样到柱上后，用50mM NaCl缓冲液洗涤柱，然后用10倍柱体积的50-300mM NaCl梯度洗涤。通过对所选级分的SDS-PAGE分析测定，合并含有rhIL-11的级分，得到13.6％的步骤产率。该发现表明0.1％的Tween-80可以在一定程度上减少发酵过程中的自聚集，但生物活性rhIL-11的回收可能不尽如人意。
rhIL-11复性的重折叠优化
溶液中蛋白质的重折叠是许多生理化学因素的结果，包括离子强度、pH、温度、蛋白质浓度等。研究了脲、硫酸铵、SDS和盐酸胍(GdHCl)作为可用于rhIL-11的重折叠过程的变性剂。PEG沉淀后，从2mL发酵培养基沉淀的蛋白质以5mg/mL重构，其中含有各自变性剂的缓冲溶液：8M脲、1M硫酸铵、0.5％SDS或6M GdHCl。在用水稀释以实现小于5mS/cm的电导率后，仅将天然和生物活性的rhIL-11吸附到阳离子交换剂上并且预期通过NaCl盐梯度洗脱。结果表明，除了6M GdHCl之外，变性剂未能使rhIL-11复性，如图6所示(其显示来自含有6MGdHCl的重折叠溶液的rhIL-11使用NaCl梯度成功洗脱)。在其他研究中，PEG沉淀后从2mL发酵沉淀的蛋白质溶于2mL碱性溶液，所述碱性溶液由0.1N NaOH、0.1N NaOH和70％乙醇、或0.1N NaOH和1％Tween 20组成。用水稀释并调节pH为8后，阳离子交换剂从这些溶液中回收少量天然rhIL-11。结果表明，在本发明构思的优选实施方式中，盐酸胍可用于以高产率成功地使rhIL-11复性。
通过将PEG蛋白沉淀以各种蛋白质浓度溶解在7M GdHCl溶液中来优化重折叠过程中使用的蛋白质浓度。在PEG沉淀后收集来自2mL发酵培养基的蛋白质，并在7M GdHCl缓冲溶液中以各种蛋白质浓度重建。通过简单稀释重折叠后，用如上所述的阳离子交换剂分离每种制剂的重折叠的rhIL-11。通过将观察到的峰面积与rhIL-11的参考标准的峰面积进行比较来评估重折叠的产率，如图7所示。结果表明，在所有测试浓度下都发生了重折叠，在约2mg/mL蛋白质浓度下具有宽的产率最佳值。
可以引入许多作为折叠增强剂或聚集抑制剂的共溶质以帮助蛋白质重折叠。典型的共溶质包括PEG、环糊精、精氨酸、脯氨酸和蔗糖。这些共溶质的作用机制尚不清楚。发明人研究了两种共溶质——0.5M精氨酸和0.4M蔗糖——的作用，它们被添加到重折叠溶液中。通过稀释重折叠后，用如上所述的阳离子交换剂分离每种制剂的重折叠的rhIL-11。通过评估峰高评估再折叠的产率(典型结果显示在图8中)，并显示重折叠的rhIL-11的相似产率。发明人发现，精氨酸和蔗糖都没有促进rhIL-11的重折叠，并且可以从rhIL-11纯化过程中消除共溶质的使用。这有利地简化了下游纯化过程。
通过在各种pH下溶解由PEG处理产生的蛋白质沉淀来优化用于再折叠的pH。在PEG沉淀以2mg/mL在不同pH值的7M GdHCl缓冲液中重建后，收集来自2mL发酵培养基的蛋白质。在使用相应的pH溶液通过简单稀释重折叠后，使用上述程序用阳离子交换剂分离每种制剂的重折叠的rhIL-11。通过比较观察到的峰面积与rhIL-11的参考标准产生的峰面积来评估重折叠的产率，如图9所示。在所研究的所有pH值下发现重折叠，并且在约pH 8.5下显示出宽的最佳值。
使用阳离子交换色谱分离重折叠的rhIL-11
使用236mL含有约94.2mg分泌性rhIL-11的发酵培养基研究使用阳离子交换培养基的分离。用8％PEG 8000(w/v)沉淀蛋白质，并通过以4,000rpm离心15分钟回收。弃去上清液后，用含有7M GdHCl的20mM磷酸钠(pH8)缓冲液将固相重构成2mg/mL蛋白质浓度。将蛋白质溶液在室温下温育1小时，同时温和搅拌以使其完全溶解。通过将蛋白质溶液倒入10倍体积的不含胍的4mM磷酸钠(pH8)缓冲液中来启动复性/重折叠过程。将所得溶液在室温下再温育1小时，然后使用超滤或用另外的缓冲溶液直接稀释进行缓冲液交换，以获得小于6mS/cm的电导率。使用Capto-S柱(1cm×10cm)进行阳离子交换色谱，典型结果如图10所示。在以12mg/mL树脂的样品负载加样到柱上之后，使用50mM NaCl缓冲液洗涤柱，然后在10倍柱体积上施加50-300mM NaCl梯度。将含有rhIL-11的级分(如非还原性SDS-PAGE所示)在池中合并，提供约40％至约60％的步骤产率。还通过RP-UPLC与质谱联用分析产物以阐明纯化蛋白质的分子质量(参见图11)。在UPLC上观察到的主峰的解卷积质量为19046.7Da，与在19,047Da处的rhIL-11的理论平均质量一致。液相色谱图中rhIL-11前面的小峰(占8.6％)被认为代表氧化物质，因为其解卷积质量比rhIL-11的解卷积质量高15.8Da，相当于大约单个氧的质量(16Da)。因此，在重折叠过程后纯化的rhIL-11经历基于细胞的测定，表明通过复性过程完全恢复活性(数据未显示)。
进一步研究了在Capto-S柱的主峰之后洗脱的小肩峰。RP-UPLC分析联用MS表明具有与rhIL-11参考标准相同的保留时间的单峰，并且具有与其理论质量一致的分子量(数据未显示)。SDS-PAGE分析还揭示了具有rhIL-11参考标准的相同迁移位置(数据未显示)。在使用含有0.5M NaCl作为洗脱液的25mM磷酸钠(pH7.0)的尺寸排阻色谱中，该小肩峰作为双峰而不是单峰洗脱。双峰的一个峰以与天然rhIL-11相同的保留时间洗脱，其中剩余的峰较早洗脱并且被认为是二聚体形式(参见图12)。由于使用含有0.5M硫酸铵的疏水性相互作用色谱的后续纯化可能潜在地破坏这种聚集体，因此将这些级分与主要部分合并。
通过将非动物来源的蛋白胨添加到发酵培养基中来减少氧化的rhIL-11
蛋白质氧化是制造过程中产品相关杂质的一个非常常见的来源，这是由于在需氧发酵过程(使用基础培养基加0.9％硫酸铵作为氮源)中不断暴露于各种形式的活性氧种类(ROS)，诸如氧自由基。从Capto-S柱纯化后，通过RP-UPLC定量，纯化的rhIL-11的所得的氧化的rhIL-11含量为约12.6％。为了降低氧化产物的含量，用0.5％植胨蛋白胨代替硫酸铵。植胨蛋白胨衍生自大豆蛋白胨，其包括含硫氨基酸，不仅可以提供氮源，还可以消除或减少发酵过程中ROS的形成。发明人认为，用其他含硫肽、氨基酸(如，半胱氨酸、甲硫氨酸)和/或有机化合物补充发酵培养基可以提供类似的效果。在通过Capto-S柱纯化后，在改良的发酵培养基中得到的氧化rhIL-11的量减少至约6.6％，接近建议的5.0％的接受标准。通过第二色谱步骤进一步精炼产物，以使用疏水性相互作用色谱法去除氧化的rhIL-11。
用疏水性相互作用色谱去除氧化的rhIL-11
向从Capto-S柱洗脱的组合池中，引入固体DL-甲硫氨酸以达到约5mM的浓度，并加入固体硫酸铵以获得约0.5M的浓度。通过0.2或0.45μm膜过滤后，将所得蛋白质溶液以8mg/mL床体积的样品负载量加样到丁基HP柱(1cm×10cm)上，然后用含有0.5M硫酸铵的缓冲溶液洗涤。随后用超过15倍柱体积的含有0.475M硫酸铵的缓冲溶液洗涤柱。使用10mM磷酸钠(pH7)缓冲液洗脱精炼的rhIL-11产物(参见图13)。通过RP-UPLC定量每个级分的氧化的rhIL-11含量，并显示了氧化种类的含量降低。汇集含有少于5％氧化种类的级分，并提供约49％的步骤回收。
缓冲液变化和浓缩
从丁基HIC柱洗脱的所得产物含有大量硫酸铵，其随后通过针对10mM磷酸钠(pH7)缓冲液的大量透析和/或超滤除去。将浓度调节至大于6mg/mL以进行冷藏。
rhIL-11产物的表征
使最终纯化的大量rhIL-11经历各种分析，包括同一性、纯度和效力。使用16％凝胶通过非还原性SDS-PAGE分析纯度和相对分子量(如图14所示)，其显示高纯度的单一带。
通过RP-UPLC测定纯度(和相关杂质)。如图15所示，rhIL-11的纯度大于95％。rhIL-11制剂含有约2.5％氧化的rhIL-11，其与商业产品(Nemega)的2.4％含量相当。通过SEC-UPLC定量单体rhIL-11含量，如图16所示，指示纯度为99％。
通过LC-MS测定纯化的rhIL-11的分子质量，表现出19,045.7Da的解卷积质量(参见图17)。这与理论平均分子量为19,047Da(偏差-68.2ppm)非常一致。此外，纯化的rhIL-11的氨基酸序列通过肽映射联用LC-MS来表征。蛋白质被胰蛋白酶消化，胰蛋白酶选择性水解赖氨酸和精氨酸氨基酸残基的C-末端侧的肽键。通过m/z比和MS/MS碎裂确定每个峰的同一性。除T11、T16和T19外，所有蛋白水解肽均成功分配(如图18所示)，提供88.7％的序列覆盖率。
使用Applied Biosystems LC 494蛋白质测序系统测定N-末端氨基酸序列，确认起始的15个氨基酸为：Gly-Pro-Pro-Pro-Gly-Pro-Pro-Arg-Val-Ser-Pro-Asp-Pro-Arg-Ala。在氮气下在110℃下用6N HCl水解样品预处理22小时后测定水解的氨基酸组成。在这种酸性水解条件下，天冬酰胺和谷氨酰胺被脱酰胺以形成各自的酸。色氨酸完全降解。半胱氨酸和甲硫氨酸被氧化并且不容易从酸水解产物中检测到。酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸部分水解。氨基酸组成研究的结果显示在表5中。大多数氨基酸的摩尔比与预期值非常一致。发明人认为针对异亮氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的结果受到其相对较低丰度的影响。
表5
N/A：不适用。
BD：检测限以下。最佳浓度范围是0.4-10nmole/20μL。
使用7TD1细胞增殖测定法测定纯化的rhIL-11的生物活性；典型结果显示在图19中。对于参考rhIL-11和通过所述方法产生的rhIL-11，观察到的EC50分别为1.1和2.2ng/mL，表明了相当的效力。
如上所示，本发明构思提供了使用酵母生产和分离高度纯化的rhIL-11的新方法。毕赤酵母成功表达分泌性重组人白细胞介素-11，但由于rhIL-11的自聚集，表达产物在生物学上无活性。在高密度补料分批培养中添加非离子表面活性剂(诸如Tween-80)仅产生约为总rhIL-11的10％的生物活性产物。然而，添加Tween-80可由于发酵过程中的搅动而导致起泡。
对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本文的发明构思的情况下，除了已经描述的那些之外的更多修改是可能的。因此，除了所附权利要求的精神之外，本发明的主题不受限制。此外，在解释说明书和权利要求时，所有术语应以与上下文一致的尽可能广泛的方式解释。特别地，术语“包括”和“包含”应该被解释为以非排他的方式指代元素、组分或步骤，指示所引用的元素、组分或步骤可以存在，或者被利用或组合。与未明确引用的其他元素，组分或步骤。当说明书权利要求涉及选自A、B、C......和N中的至少一个时，文本应解释为只需要组中的一个元素，而不是A加N或B加N等。
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Claims (17)

1.产生IL-11的方法，其包括：
将编码重组IL-11的表达载体引入酵母中，其中所述重组IL-11不是融合蛋白的形式；
在诱导所述重组IL-11表达的条件下在培养基中培养所述酵母，其中所述重组IL-11是失活的重组IL-11；
将上清液与所述培养基的固体分离；
使所述上清液与足以以4％(w/v)和12％(w/v)之间的终浓度提供从而形成包括沉淀的悬浮液的量的聚乙二醇接触，所述聚乙二醇具有2,000D至20,000D的平均分子量，其中所述沉淀包括所述失活的重组IL-11；
在包括4M至10M的盐酸胍的溶液中溶解所述沉淀，以产生粗IL-11溶液；
在4至12的pH下将所述粗IL-11溶液的盐酸胍的浓度降低至0.7M或更少，并将所述粗IL-11溶液的蛋白质浓度降低至0.1mg/mL至10mg/mL，以产生包括活性重组IL-11的再折叠的IL-11溶液；
使所述再折叠的IL-11溶液与阳离子交换介质接触；和
从所述离子交换介质洗脱纯化的IL-11。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述聚乙二醇以6％(w/v)和9％(w/v)之间的终浓度提供。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述聚乙二醇具有4,000D至12,000D的平均分子量。
4.根据权利要求1所述的方法，其中在所述溶解步骤中，所述变性剂为盐酸胍，浓度为5M至9M。
5.根据权利要求1所述的方法，其中降低所述变性剂浓度的步骤包括在降低所述变性剂浓度后在18℃至25℃下温育一小时。
6.根据权利要求1所述的方法，其中降低盐酸胍浓度的步骤通过稀释所述粗IL-11溶液完成。
7.根据权利要求1所述的方法，其中降低盐酸胍浓度的步骤通过所述粗IL-11溶液的缓冲液交换完成。
8.根据权利要求1所述的方法，其中产生所述再折叠IL-11溶液的步骤以小于2mg/mL的蛋白质浓度进行。
9.根据权利要求1所述的方法，包括以下另外的步骤：
使所述纯化的IL-11与疏水性相互作用介质接触；和
从所述疏水性相互作用介质洗脱精炼的IL-11，
其中相对于所述纯化的IL-11，所述精炼的IL-11具有降低含量的氧化IL-11。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述疏水性相互作用介质选自丁基、己基、辛基和苯基。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述精炼的IL-11具有至少95％的纯度。
12.根据权利要求9所述的方法，其中所述精炼的IL-11包括5％或更少的氧化IL-11。
13.根据权利要求9所述的方法，其中所述精炼的IL-11包括1％或更少的IL-11的二聚体。
14.根据权利要求1所述的方法，其中产生所述再折叠IL-11溶液的步骤在不存在共溶质的情况下进行。
15.根据权利要求所述1的方法，其中产生所述再折叠IL-11溶液的步骤在7至11的pH下进行。
16.根据权利要求1所述的方法，其中当使用7TD1细胞系测试时，所述精炼的IL-11具有4x 106U/mg至1.2x 107U/mg的生物活性。
17.根据权利要求16所述的方法，其中当使用7TD1细胞系测试时，所述精炼的IL-11具有6x 106U/mg的生物活性。
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包涵体纯化技术;王海林等;《生物技术通报》;20070226(第01期);全文 *
巴斯德毕赤酵母表达的突变型人白细胞介素-2的发酵条件与纯化研究;刘堰等;《生物工程学报》;20050523(第03期);全文 *
巴斯德毕赤酵母表达系统的研究进展;张树军等;《农垦医学》;20070615(第03期);全文 *
蛋白质折叠理论与包涵体的处理;肖明;大庆高等专科学校学报(04);全文 *
重组毕赤酵母生产外源蛋白的过程控制与生理分析的研究进展;高敏杰等;《食品工业科技》;20141215(第24期);说明书第393页 *

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