MX2011002055A - Conjugados de biopolimeros que contienen un analogo de interleucina-11. - Google Patents

Conjugados de biopolimeros que contienen un analogo de interleucina-11.

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Myoung-Suk Kim
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Abstract

La presente invención proporciona conjugados biopoliméricos de un análogo de IL-11 (mIL-11y un polímero biocompatible. La mIL-11e la invención presenta una resistencia mejorada a la acidólisis y muestra estabilidad aumentada en comparación con rhIL-11. Los conjugados de la presente invención se caracterizan por una vida media en suero más prolongada y presentan prácticamente ninguna pérdida de actividad en comparación con la mIL-11 no conjugada correspondiente.

Description

CONJUGADOS DE BIOPOLIMEROS QUE CONTIENEN UN ANÁLOGO DE INTERLEUCINA-11 ANTECEDENTE DE LA INVENCIÓN Campo de la invención Esta invención es en el campo de los terapéuticos biológicos. En especial, la invención se refiere a los conjugados de biopolímeros que contienen un análogo o mutante de interleucina-11 (mIL-11) humana, donde la mlL-11 presenta mejor estabilidad en comparación con una IL-11 humana recombinante madura (rhIL-11), y donde el conjugado de biopolxmeros conserva prácticamente el mismo nivel de actividad que la mIL-11.
Técnica anterior La toxicidad hematológica , tal y como se manifiesta por neutropenia y trombocitopenia, es un efecto colateral no deseado asociado con quimioterapia contra cáncer, muchas veces limitando la dosis de los fármacos anti-tumorales que se administran a un paciente. La administración in vivo de interleucina 11 (IL-11), una citocina derivada de células estromales que interactúa con una variedad de tipos de células hematopoyéticas y no hematopoyéticas , ha demostrado aumentar el recuento de plaquetas y tiene un efecto trombopoyético benéfico. La IL-11 desempeña una función importante en la diferenciación de las células madre en los megacariocitos , la proliferación y maduración de los megacariocitos y la producción de plaquetas.
La IL-11 humana, recombinante (rhIL-11) tiene utilidad potencial en el tratamiento de efectos colaterales asociados con quimioterapia de cáncer. Cuando se administra en animales, rhIL-11 favorece la megacariocitopoyesis y aumenta el recuento de plaquetas en animales normales e inmunosuprimidos . Un producto de rhIL-11 se comercializa por Wyet-Ayerst como NEUMEGA® (nombre genérico oprelvekin) y está aprobado para la prevención de trombocitopenia grave y la disminución de la necesidad de transfusiones de plaquetas después de quimioterapia mielosupresiva en pacientes adultos con malignidades no mieloides que estén en alto riesgo de presentar trombocitopenia grave. El producto NEUMEGA® es suministrado en un vial para un solo uso que contiene 5 mg de IL-11 como un polvo liofilizado. El polvo es reconstituido con 1 mL de agua inyectable estéril, USP, para producir una solución que contiene 5 mg/mL de IL-11 la cual se administra en una dosis de 50 pg/kg/dia. Los efectos adversos más frecuentes asociados con NEUMEGA® pueden ser arritmias atriales, síncope, disnea, insuficiencia cardiaca congestiva y edema pulmonar.
Aunque la administración de rhIL-11 in vivo ha demostrado que tiene un efecto farmacológico demostrable para la prevención de la disminución del recuento de plaquetas en pacientes que sufren quimioterapia contra cáncer, la frecuencia necesaria de la administración (muchas veces una vez al día durante dos semanas o más) es superior a la deseada. Además, aunque las citocinas como IL-11 son compuestos terapéuticos atractivos, su uso muchas veces es limitado por la rápida depuración a través de la excreción urinaria, captación hepática y/o degradación enzimática. Parece ser que el riñon e hígado son contribuidores importantes para la rápida depuración de rhIL-11 de la circulación de un animal. Esta depuración rápida probablemente se debe al peso molecular bajo de rhIL-11 (aproximadamente 19 kDa ) y su carácter altamente catiónico. Puesto que la permselectividad de la pared capilar glomerular para las macromoléculas se basa principalmente en el tamaño molecular, modificaciones químicas de rhIL-11 con polímeros solubles en agua podría restringir la filtración glomerular de la proteína.
Se ha estudiado la modificación de las proteínas recombinantes con biopolímeros como las moléculas de polietilen glicol (PEG) como medio para superar el tiempo de circulación corto. La conjugación del polímero PEG a las proteínas (PEGilación) ha demostrado mejorar la biodisponibilidad aumentando el radio hidrodinámico de las proteínas protegiendo así contra la depuración renal rápida y aumenta la solubilidad. Además, debido al volumen de los polímeros PEG, las proteínas conjugadas con PEG muestran proteólisis reducida y reconocimiento inmune reducido, lo cual confiere ventajas considerables de las proteínas PEGiladas (Veronese FM y Pasut G., Drug Discovery Today 70:1451-8 (2005)). Por otra parte, la capacidad para que una proteína conjugada con PEG prevenga su susceptibilidad a las enzimas proteolíticas o a los anticuerpos también puede deteriorar la capacidad de la proteína para unirse a su receptor. Como resultado la afinidad de unión de una Proteína conjugada a PEG con un receptor se reduciría, especialmente si el sitio de conjugación está implicado en o está en proximidad cercana al sitio de unión al receptor.
Para solucionar la necesidad de retener la rhIL-11 en circulación, los investigadores han investigado la posibilidad de modificar químicamente la molécula de rhIL-11 con el polímero polietilen glicol (PEG) soluble en agua. Véase Takagi et al, Journal of Controlled Reléase 119: 271-278 (2007 ). No obstante, como ya se describió, la modificación química de rhIL-11 con PEG presenta numerosas desventajas. Debido al volumen y el impedimento estérico del PEG unido, el conjugado PEG-rhIL-11 fracasaría o se uniría mínimamente al receptor de IL-11. Además, la actividad biológica de la molécula de rhIL-11 se reduciría. De hecho, Takagi et al., demostraron que aunque los conjugados de PEG-rhlL- 11 se mantuvieron en el plasma durante un tiempo más prolongado que una rhIL-11 no conjugada y de este modo se obtuvo un efecto medible en el aumento del recuento de plaquetas, la actividad biológica restante de la rhIL-11 PEGilada disminuyó por la conjugación a PEG. Takagi et al, Journal of Controlled Reléase 119: 271-278 (2007). Por tanto, para obtener la eficacia deseada fue necesario administrar una cantidad aumentada del conjugado PEG-rhIL-11.
La presente invención se dirige a la necesidad de una molécula IL-11 que, cuando se administra a los pacientes, no solo es retenida en el plasma durante más tiempo, sino también conserva la actividad biológica, aumentando con ello su eficacia para el tratamiento y prevención de trombocitopenia Y otras toxicidades hematológicas que se asocian con la quimioterapia contra cáncer .
BREVE COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención aporta conjugados de un análogo de IL-11 y un polímero biocompatible . El análogo de IL-11 (mIL-11) de la invención muestra una resistencia mejorada a la acidólisis y presenta estabilidad aumentada en comparación con rhIL-11. Además, los conjugados de la invención se caracterizan por una vida media en suero más prolongada y se distinguen por el hecho de que tales conjugados no presentan pérdida de actividad en comparación con mIL-11 no conjugada, correspondiente.
En una modalidad, la invención se dirige a un conjugado que contiene mIL-11 y un polímero biocompatible, en donde la secuencia de aminoácidos de la mIL-11 comprende la ID SEC NO: 2, con excepción de cinco o menos sustituciones de aminoácidos, a condición de que, sin embargo, el residuo de aminoácidos correspondiente a la posición 1 de la ID SEC NO: 2 sea alanina y el residuo de aminoácido correspondiente a la posición 125 de la ID SEC NO: 2 sea asparagina; en donde el nivel de actividad de la proliferación celular in vitro del conjugado se disminuya por no menos de 5% en comparación con el nivel de la actividad de proliferación celular de una mIL-11 de referencia, no conjugada, donde las secuencias de aminoácido de la mIL-11 en la mIL-11 conjugada y en la mIL-11 de referencia no conjugada sean idénticas; y en donde la actividad de la proliferación celular se determine poniendo en contacto la mIL-11 conjugada o la mIL-11 de referencia no conjugada con células gue respondan a IL-11 en virtud de la expresión de una cadena a y glucoproteina 130 (gpl30) del receptor de IL-11, el cultivo de las células in vitro, y la medición de la proliferación de las células resultantes.
En otra modalidad, la invención se dirige a un conjugado gue contiene una IL-11 humana, mutante (mIL-11) y un polímero biocompatible ; en donde la secuencia de aminoácido de la mIL-11 comprende una secuencia de aminoácido al menos 95% idéntica a la secuencia de aminoácido de la ID SEC NO: 2, sin embargo, a condición de que el residuo aminoácido correspondiente a la posición 1 de la ID SEC NO: 2 sea alanina y el residuo aminoácido correspondiente a la posición 125 de la ID SEC NO: 2 sea asparagina; y en donde el nivel de actividad de proliferación celular in vitro del conjugado en un ensayo de proliferación celular disminuye por no menos de 5% en comparación con el nivel de actividad proliferación celular de una mIL-11 de referencia, no conjugada, en donde las secuencias de aminoácidos de la mIL-11 en la mIL-11 conjugada y la mIL-11 de referencia, no conjugada sean idénticas; y en donde la actividad de la proliferación celular se determine poniendo en contacto la mIL-11 conjugada o la mIL-11 de referencia no conjugada con células que respondan a IL-11 en virtud de la expresión de una cadena a y glucoproteina 130 (gpl30) del receptor de IL-11, el cultivo de las células in vitro y la medición de la proliferación de las células resultantes .
En otras modalidades, el polímero biocompatible se selecciona del grupo que consiste en polietilen glicol (PEG), polipropilen ¦ glicol, polioxietileno , politrimetilen glicol, poliácido láctico, poliácido acrilico, poliácido amino, polialcohol vinilico, poliuretano, polifosfaceno, poli ( L-lisina ) , polióxido de alquileno, polisacárido, dextrano, polivinil pirrolidona, polialcohol vinilico y poliacril amida. En modalidades particulares, el polímero biocompatible es PEG. En algunas otras modalidades, el PEG es lineal o ramificado. En modalidades adicionales, el PEG tiene un peso molecular de aproximadamente 2 kDa a aproximadamente 100 kDa, aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 60 kDa, aproximadamente 2 kDa a aproximadamente 50 kDa, o aproximadamente 5 kDa a aproximadamente 20 kDa.
En modalidades particulares, la mIL-11 del conjugado del biopolimero contiene la secuencia de aminoácidos de la ID SEC NO: 2. En otras modalidades, la mIL-11 del conjugado del biopolimero contiene la secuencia de aminoácidos de la ID SEC NO: 1, con la excepción de que la valina en la posición 31 es reemplazada con alanina, y aspartato de la posición 155 es sustituido con asparagina .
La invención también se dirige a una composición farmacéutica que contiene el conjugado biopolimero de la invención y un portador aceptado para uso farmacéutico.
La invención además se dirige a los métodos para el tratamiento, mejoría o prevención de una enfermedad o trastorno que responde a IL-11 en un mamífero, como puede ser trombocitopenia , que consiste en administrar al animal un conjugado de biopolimero o una composición de la invención. La invención también se dirige a un método para aumentar el recuento de plaquetas en un mamífero, que consiste en administrar un conjugado de biopolimero o una composición de la invención. En las modalidades particulares, el mamífero es un humano.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS/FIGURAS Los objetivos y características anteriores y otros de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción de la invención, cuando se tomen junto con los dibujos acompañantes los respectivamente muestran : La Figura 1 es una representación de un gel SDS-PAGE con la muteína IL-11 mono-PEGilada , purificada por el método de PEGilacíón específico de la amina (PEG-mIL-11-SC, franja 1) y la muteína IL-11 purificada (franja 2).
La Figura 2 son gráficas que presentan los resultados de un ensayo estructural (A) y funcional (B) de mIL-11 en comparación con IL-11 humana, recombinante (rhIL-11 ) .
La Figura 3 es una representación de los cromatogramas HPLC de fase inversa de rhIL-11 estresada y mIL-11 en solución pH 3.5 durante 0, 1, 2, 3 y 4 días a 50°C.
La Figura 4 es una gráfica que representa los sitios de hidrólisis ácida de rhIL-11 y mIL-11, los cuales están representados como diagonales.
La Figura 5 es un diagrama que representa los posibles grupos amino para los sitios de PEGilación en la muteina IL-11. La amina primaria N-terminal está representada en gris oscuro, mientras que las e-aminas de las lisinas (posiciones 63, 120, 196) tienen color gris claro. La numeración se basa en la IL-11 humana tipo nativa (NCBI AAA59132.1).
La Figura 6 es una representación de un cromatograma HPLC por exclusión de tamaño de la PEG-mIL- 11-SC purificada como se muestra en el Ejemplo 3.
La Figura 7 es una representación de un gel SDS-PAGE y el cromatograma HPLC por exclusión de tamaño de PEG-mlL-ll-AD purificada como se muestra en el Ejemplo 4.
La Figura 8 es una gráfica que muestra los resultados de la actividad de proliferación in vitro de la mIL-11 PEGilada ( PEG-mIL- 11-AD o PEG-mIL- 11-SC ) respecto a la mIL-11 no conjugada (N = 3). Las barras de error indican la desviación estándar de los datos.
La Figura 9 son gráficas que muestran los niveles de recuentos de plaquetas en ratas (N=5) después de una sola administración subcutánea de PEG-mIL-11-SC (400 µg/kg) (A) y PEG-mIL-11-AD (400 pg/kg) (B) en comparación con el grupo tratado con mIL-11 no conjugada (dosis sencilla de 400 µg/kg) . Las barras de error indican desviación estándar de los datos .
La Figura 10 son gráficas que muestran el nivel de recuentos de plaquetas en ratas (N=5) después de la administración subcutánea sencilla de PEG-mIL- 11-SC (400 g/kg) (A) y PEG-miL-11-AD (400 yg/kg) (B) en comparación con la administración subcutánea diaria de mIL-11 no conjugada (400 yg/kg/dia) durante siete días. Las barras de error indican la desviación estándar de los datos.
La Figura 11 son gráficas que muestran el nivel de la concentración de IL-11 in vivo después de una sola inyección subcutánea de PEG-mIL- 11-SC (400 g/kg) (A), o PEG-mIL-11-AD (400 g/kg) en comparación con una dosis sencilla de mIL-11 no conjugada (400 µq/kq) en ratas (N=4-6 ) .
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a los conjugados de un análogo de IL-11 y un polímero biocompatible y el uso de éstos, para el tratamiento, mejoría o prevención de enfermedades o trastornos que responden a IL-11, incluida la trombocitopenia o neutropenia asociadas con quimioterapia de cáncer. El conjugado análogo de IL-11 (mIL-11) polipéptido de la presente invención se conserva en el plasma durante un tiempo más prolongado que la IL-11 humana o la IL-11 human recombinante (rhIL-11), y conserva prácticamente la misma actividad biológica de la mIL-11 no conjugada.
Las secuencias de aminoácidos de la IL-11 humana y la IL-11 humana recombinante se muestran a continuación. La secuencia de aminoácidos de IL-11 humana es la siguiente: Met-Asn-Cys-Val-Cys-Arg-Leu-Va1-Leu-Val-Val-Leu-Ser-Leu-Trp-Pro-Asp-Thr-Ala- al-Ala-Pro-Gly-Pro-Pro-Pro-Gly-Pro-Pro-Arg-Val-Ser-Pro-Asp-Pro-Arg-Ala-Glu-Leu-Asp-Ser-Thr-Val-Leu-Leu-Thr-Arg-Ser-Leu-Leu-Ala-Asp-Thr-Arg-Gln-Leu-Ala-Ala-Gln-Leu-Arg-Asp-Lys-Phe-Pro-Ala-As -Gly-Asp-His-Asn-Leu-Asp-Ser-Leu-Pro-Thr-Leu-Ala-Met-Ser-Ala-Gly-Ala-Leu-Gly-Ala-Leu-Gln-Leu-Pro-Gly-Val-Leu-Thr-Arg-Leu-Arg-Ala-Asp-Leu-Leu-Ser-Tyr-Leu-Arg-His-Val-Gln-Trp-Leu- Arg-Arg-Ala-Gly-Gly-Ser- Ser-Leu-Lys-Thr-Leu-Glu-Pro-Glu-Leu-Gly-Thr-Leu-Gln-Ala-Arg-Leu-Asp-Arg-Leu-Leu-Arg-Arg-Leu-Gln-Leu-Leu-Met-Ser-Arg-Leu-Ala-Leu-Pro-Gln-Pro-Pro-Pro-Asp-Pro-Pro-Ala-Pro-Pro-Leu-Ala-Pro-Pro-Ser-Ser-Ala-Trp-Gly-Gly-Ile-Arg-Ala-Ala-His-Ala-Ile-Leu-Gly-Gly-Leu-His-Leu-Thr-Leu-Asp-Trp-Ala-Val-Arg-Gly-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys-Thr-Arg-Leu ( ID SEC NO : 1).
La secuencia de aminoácidos de la IL-11 humana, recombinante se muestra como sigue: Gly-Pro-Pro-Pro-Gly-Pro-Pro-Arg-Val-Ser-Pro-Asp-Pro-Arg-Ala-Glu-Leu-Asp-Ser-Thr-Val-Leu-Leu-Thr-Arg-Ser-Leu-Leu-Ala-Asp-Thr-Arg-Gln-Leu-Ala-Ala-Gln-Leu-Arg-Asp-Lys-Phe-Pro-Ala-Asp-Gly-Asp-His-Asn-Leu-Asp-Ser-Leu-Pro-Thr-Leu-Ala-Met-Ser-Ala-Gly-Ala-Leu-Gly-Ala-Leu-Gln-Leu-Pro-Gly-Val-Leu-Thr-Arg-Leu-Arg-Ala-Asp-Leu-Leu-Ser-Tyr-Leu-Arg-His-Val-Gln-Trp-Leu-Arg-Arg-Ala-Gly-Gly-Ser-Ser-Leu-Lys-Thr-Leu-Glu-Pro-Glu-Leu-Gly-Thr-Leu-Gln-Ala-Arg-Leu-Asp-Arg-Leu-Leu-Arg-Arg-Leu-Gln-Leu-Leu-Met-Ser-Arg-Leu-Ala-Leu-Pro-Gln-Pro-Pro-Pro-Asp-Pro-Pro-Ala-Pro-Pro-Leu- la-Pro-Pro-Ser-Ser-Ala- rp-Gly-Gly-Ile-Arg-Ala-Ala-His-Ala-Ile-Leu-Gly-Gly-Leu-His-Leu-Thr-Leu-Asp-Trp-Ala-Val-Arg-Gly-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys-Thr-Arg-Leu (ID SEC NO: 3) Polipéptidos de mIL-11 El polipéptido de mIL-11 (ID SEC NO: 2) es un análogo de IL-11 humana (ID SEC NO: 1), obtenida por deleción de los primeros treinta aminoácidos N-terminales del polipéptido IL-11 de la ID SEC NO: 1, seguido por la sustitución de valina (Val) en la posición 1 resultante con alanina (Ala), y la sustitución de aspartato (Asp) en la posición 125 resultante con asparagina (Asn).
La secuencia de aminoácidos de mIL-11 se enlista como sigue Ala--Ser--Pro--Asp--Pro--Arg--Ala--Glu--Leu-Asp- Ser^ -Thr -Val-¦Leu--Leu -Thr -Arg -Ser -Leu -Leu -Ala -Asp -Thr- Arg--Gln -Leu-¦Ala--Ala -Gln -Leu -Arg -Asp -Lys -Phe -Pro -Ala- Asp--Gly -Asp-¦His--Asn--Leu--Asp -Ser -Leu -Pro -Thr -Leu--Ala-Met--Ser -Ala-¦Gly--Ala -Leu--Gly--Ala--Leu -Gln -Leu -Pro--Gly- Val--Leu -Thr-¦Arg--Leu--Arg--Ala--Asp--Leu -Leu -Ser -Tyr--Leu- Arg--His -Val-¦Gln--?f-: Leu-Arg-Arg-Ala-< Gly Gly--Ser-: Ser-Leu- Lys--Thr -Leu-¦Glu--Pro -Glu--Leu--Gly--Thr -Leu -Gln -Ala--Arg- Leu--Asp--Arg-¦Leu--Leu--Arg--Arg--Leu--Gln -Leu -Leu -Met--Ser-Arg--Leu--Ala-Leu--Pro--Gln--Pro--Pro--Pro--Asn -Pro -Pro--Ala- Pro--Pro--Leu-¦Ala--Pro--Pro--Ser--Ser--Ala--Trp--Gly--Gly--Ile- Arg--Ala--Ala-¦His--Ala--He--Leu--Gly--Gly--Leu -His--Leu--Thr- Leu--Asp--Trp-Ala--Val--Arg--Gly--Leu--Leu -Leu--Leu--Lys--Thr- Arg--Leu (ID SEC NO: 2) · El polipéptido de mIL-11 ha sido anteriormente descrito en la Patente China No. 11677, el contenido de la cual se incorpora en la presente para referencia.
El término "mIL-11" se utiliza de manera indistinta con "análogo de IL-11", "polipéptido de mIL-11" o "muteina IL-11", y cuando se utiliza en la presente, se refiere a un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos de la ID SEC NO: 2.
La presente invención comprende los polipéptidos los cuales contienen, o de otro modo consisten en, una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a, por ejemplo, la secuencia de polipéptidos que se muestra en la ID SEC NO: 2, y/o los fragmentos de polipéptidos de la ID SEC NO: 2, a condición de que cualquier polipéptido y/o fragmento de la ID SEC NO: 2 contenga una secuencia de aminoácidos que conserve una alanina en un aminoácido que corresponda a la posición 1 de la ID SEC NO: 2 y retenga una asparagina en un aminoácido que corresponda a la posición 125 de la ID SEC NO: 2.
Por un polímero que tenga una secuencia de aminoácidos al menos, por ejemplo, 95% "idéntica" a una secuencia de aminoácidos de consulta de la presente invención, se pretende que la secuencia de aminoácidos del polipéptido objeto sea idéntica a la secuencia problema o consulta con excepción de que el polipéptido objeto conserve una alanina en un aminoácido que corresponda a la posición 1 de la ID SEC NO: 2 y conserve una asparagina en un aminoácido que corresponda a la posición 125 de la ID SEC NO: 2, y con excepción de que la secuencia polipeptidica objeto pueda incluir hasta cinco alteraciones de aminoácidos por cada 100 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de consulta. En otras palabras, para obtener un polipéptido que tenga una secuencia de aminoácidos al menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de consulta, hasta 5% de los residuos aminoácidos en la secuencia objeto, con la excepción de los aminoácidos correspondientes a los de las posiciones 1 y 125 de la ID SEC NO: 2, puede ser insertado, delecionado o sustituido con otro aminoácido. Estas alteraciones de la secuencia de referencia pueden ocurrir en las posiciones amino o carboxilo terminales de la secuencia de aminoácidos de referencia o en cualquier otra parte entre estas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre residuos de la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.
Como un aspecto práctico, si algún polipéptido específico es al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntico a la secuencia de aminoácidos de la ID SEC NO: 2 puede determinarse de manera tradicional utilizando los programas de cómputo conocidos como BLAST 2.0 con los algoritmos BLASTP (Altschul et al, J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990; Altschul et al, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Altschul, J. Mol. Biol. 219:555-565, 1991). Como se sabe en la técnica, la "similitud" entre dos polipéptidos se determina comparando la secuencia de aminoácidos y los sustitutos aminoácidos conservados de éstos del polipéptido con la secuencia de un segundo polipéptido. La identidad u homología con respecto a tales secuencias se define en la presente como el porcentaje de residuos de aminoácidos en la secuencia candidata que sean idénticos con los péptidos conocidos, después de alinear las secuencias e introducir los huecos ( gaps ) , si es necesario, para obtener el porcentaje máximo de homología, y sin considerar alguna sustitución conservativa como parte de la identidad de la secuencia. Las extensiones, deleciones o inserciones N-terminales , C-terminales o internas en la secuencia peptídico no debe ser considerada como afectación de la homología .
La presente invención además comprende polipéptidos que contienen, o alternativamente consisten en, una secuencia de aminoácidos establecida en la ID SEC NO: 2 o una secuencia de aminoácidos que tenga 5 o menos (incluidos 5, 4, 3, 2, 1 o 0) sustituciones, adiciones y/o deleciones de aminoácidos, a condición de que el polipéptido conserve una alanina en un aminoácido que corresponda a la posición 1 de la ID SEC NO: 2 y conserve una asparagina en un aminoácido que corresponda a la posición 125 de la ID SEC NO: 2.
El término "derivado de éste" o "variante de éste", cuando se aplica al polipéptido de mIL-11, se refiere a un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos que sea al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la ID SEC NO: 2 o que tenga 5 o menos (incluidas 5, 4, 3, 2, 1 o 0) substituciones, adiciones y/o deleciones de aminoácidos en comparación con la ID SEC NO: 2, a condición de que el polipéptido conserve una alanina en un aminoácido que corresponda a la posición 1 de la ID SEC NO: 2 y conserve una asparagina en un aminoácido que corresponda a la posición 125 de la ID SEC NO: 2, en donde el polipéptido conserva prácticamente toda la actividad biológica de mIL-11. Las adiciones o sustituciones incluyen el uso de aminoácidos que no se encuentran en estado natural y pueden encontrarse en cualquier número interno, o en el N-terminal y/o C-terminal, a condición de que el polipéptido conserve prácticamente toda la actividad biológica de mIL-11.
La variante o derivado de mIL-11 puede ser (i) aquella en la cual uno o más de los residuos de aminoácidos estén sustituidos con un residuo de aminoácido conservado o no conservado (preferentemente un residuo de aminoácido conservado) y tal residuo de aminoácido sustituido puede o no ser uno codificado por el código genético, o (ii) aquel en el cual uno o más de los residuos de aminoácidos incluya un grupo sustituyente , o (iii) aquel en el que el polipéptido maduro esté fundido con otro compuesto, como puede ser un compuesto para aumentar la vida media del polipéptido (por ejemplo, polietilen glicol), o (iv) aquel en el que aminoácidos adicionales estén fundidos al polipéptido maduro para la purificación del polipéptido o (v) aquel en el que un fragmento del polipéptido sea soluble, es decir, no unido a la membrana, pero todavía una los ligandos al receptor unido a la membrana. Tales variantes o derivados son considerados dentro del alcance de los expertos en la técnica a partir de las enseñanzas de la presente.
Una "variante" del polipéptido puede ser una variante conservativa, o una variante alélica. Cuando se utiliza en la presente, una variante conservativa se refiere a una secuencia de aminoácidos que tenga alteraciones dentro de la secuencia que no afecten de manera adversa las funciones biológicas de la proteína. Se dice que una sustitución, inserción o deleción afecta de manera adversa a la proteína cuando la secuencia alterada impide o rompe una función biológica asociada con la proteína. Por ejemplo, la carga total, estructura o propiedades hidrófobas-hidrófilas de la proteína pueden alterarse sin afectar de manera adversa una actividad biológica. Por consiguiente, la secuencia de aminoácidos puede ser alterada, por ejemplo, para hacer el péptido más hidrófobo o hidrófilo, sin afectar de manera adversa las actividades biológicas de la proteína.
Una "sustitución de aminoácido conservativa" es aquella en la que un residuo de aminoácido es reemplazado con un residuo de aminoácido que tenga una cadena lateral con una carga semejante. Las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con cargas semejantes han sido definidas en la técnica. Estas familias contienen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (p. ej . , ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (p. ej., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisterna), cadenas laterales no polares (p. ej . , alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina , metionina, triptofano), cadenas laterales con ramificaciones beta (p. e j . , treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (p. e . , tirosina, fenilalanina , triptofano, histidina). De otro modo, las mutaciones pueden ser introducidas al azar a lo largo de toda o parte de la secuencia codificante, como puede ser por mutagénesis por saturación, y los mutantes resultantes pueden ser cribados para la actividad biológica para identificar mutantes que conserven la actividad {p. ej . , la actividad de IL-11).
Una "variante alélica" es propuesta para referirse a las formas alternas de un gen que ocupe un locus determinado en un cromosoma de un organismo. Genes II, Lewin, B., ed. , John Wiley & Sons, New York ( 1985 ). Las variantes que no se encuentran en estado natural pueden ser producidas utilizando técnicas de mutagénesis conocidas en la materia. Las variantes alélicas, aunque poseedoras de una secuencia de aminoácidos ligeramente diferente que las antes mencionadas, todavía presentarán las mismas funciones biológicas o similares asociadas con la proteina mIL-11.
Las técnicas normalizadas conocidas por los expertos en la materia pueden utilizarse para introducir mutaciones en la secuencia de nucleótidos que codifique una molécula de la invención, como puede ser, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis en las que interviene la PCR las cuales producen sustituciones de aminoácidos como se describe en diversas referencias de la literatura como Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y, 1989.; DNA Cloning: A Practical Approach, Volúmenes I y II (D. N. Glover ed. 1985), Ausubel, et al (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John iley & Sons, Inc., 1994, Sidhu et al, Methods Enzymol 328:333-363, 2000) y Kunkel et al, Methods Enzymol 204: 1991. Asi pues, las proteínas y péptidos de la presente invención incluyen moléculas que contienen la secuencia de aminoácidos de la ID SEC NO: 2 o una variante o derivado de ésta. Las variantes consideradas además incluyen aquellas que contienen derivados, en donde la proteína ha sido modificada en forma covalente por sustitución, medios químicos, enzimáticos u otros apropiados con una porción diferente de un aminoácido que se encuentre en estado natural (por ejemplo, una porción detectable como una enzima o radioisótopo).
Utilizando los métodos conocidos de la ingeniería de proteínas y la tecnología del DNA recombinante , las variantes pueden ser producidas para mejorar o alterar las características de los polipéptidos de la mIL-11. Por ejemplo, uno o más aminoácidos puede ser delecionado del polipéptido de mIL-11 para facilitar la unión covalente de un biopolímero en una posición específica, por ejemplo, en un residuo Lys ubicado cerca del N-terminal del polipéptido, sin pérdida considerable de la función biológica .
Así pues, la invención además incluye las variantes del polipéptido mIL-11 que muestran considerable actividad biológica. Tales variantes incluyen deleciones, inserciones, inversiones, repeticiones y sustituciones seleccionadas de acuerdo con las reglas generales conocidas en la técnica para tener poco efecto sobre la actividad .
El experto estará consciente de las sustituciones aminoácidos que con menor probabilidad o probablemente no afecten de manera significativa la función de la proteína (p. ej . , la sustitución de un aminoácido alifático con un segundo aminoácido alifático), como se describe más adelante .
Un "derivado" de la invención puede ser modificado en forma covalente por sustitución, medios químicos, enzimáticos u otros apropiados con una porción diferente del aminoácido que se encuentra en estado natural (por ejemplo, una porción detectable como una enzima o radioisótopo). Los ejemplos de los derivados incluyen las proteínas de fusión.
El polipéptido de la presente invención puede ser un polipéptido recombinante , un polipéptido natural o un polipéptido sintético, preferentemente un polipéptido recombinante .
La estructura y función de la IL-11 humana ha sido estudiada extensamente y un experto en la técnica sabe de los aminoácidos de la secuencia de IL-11 que son importantes para retener considerablemente toda la actividad biológica de la proteína y que preferentemente no se cambian o solo se cambian de manera conservativa en alguna variante o derivado de mIL-11. Otros aminoácidos que no son cruciales para la actividad biológica pueden ser delecionados y lo sustituidos más libremente. Los ejemplos de los aminoácidos conocidos por ser importantes para la actividad biológica pueden ser, más no se limitan Lys41, Met58, Lys98, Lys174, Thr175, Arg176 y Leu177 (Czupryn et al., J. Biol. Chem. 270 :91% (1995)); Pro13, Glu16, Leu17, Leu22, Arg25, Leu28, Thr31, Arg32, Leu34, Arg39, Arg150, Ala152, His153, lie155, Gly158, Leu159, Thr162, Leu163, Asp164, Trp165, Arg168 y Leu170 (Czupryn et al, Ann . NY Acad. Sci. 762:152 (1995 )); Leu63, lie149, Arg168 y Leu172 (Tacken et al., Eur . J. Biochem. 265:645 (1999 )), donde el número del aminoácido corresponde al del polipéptido rhIL-11. Un experto en la técnica puede preparar derivados de la mlL-11 utilizando técnicas de mutagénesis rutinarias, como pueden ser las descritas en las referencias que se mencionan en lo anterior, e identificar los derivados que conservan considerablemente toda la actividad biológica del polipéptido mIL-11.
El término "considerablemente la misma actividad biológica" o "actividad biológica considerable" o "actividad biológica semejante" o "que presenta prácticamente ninguna pérdida de actividad", con respecto a mIL-11, una mIL-11 no conjugada o una mIL-11 no manipulada, cuando se utilizan en la presente, se refiere a al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de cualquiera o más de las actividades biológicas de mIL-11 (p. ej . , la capacidad para estimular trombopoyesis u otras actividades biológicas reconocidas de mIL-11, como puede ser su resistencia a la hidrólisis ácida) . Una actividad biológica de mIL-11 también incluye su capacidad para inducir proliferación celular cuando se mide en un ensayo de proliferación celular in vitro utilizando células Ba/F3 que expresen gpl30 y la cadena a del receptor de IL-11, semejante al método que se describe por Lebeau B et al. (Lebeau B et al., FEBS Letters 407: 141-147 (1997)). Al utilizar un ensayo de proliferación celular como éste, el término "considerablemente todo" o "semejante" o "el mismo" cuando se utiliza para modificar el término "la actividad biológica del polipéptido mlL-11" corresponde a un nivel de actividad tal y como se mide por el ensayo descrito, donde el nivel decrece por no menos de 5%, en comparación con el nivel de la actividad de proliferación celular del polipéptido mlL-11.
El nivel de actividad biológica de un conjugado que contiene mIL-11 puede determinarse midiendo el nivel de una o más actividades biológicas tal y como se describe en lo anterior. Esta determinación puede hacerse comparando el conjugado de la invención con una mIL-11 de referencia, no conjugada. Cuando se utiliza en la presente, el término "referencia" está destinado a significar un objeto o articulo al que se hace referencia como un punto de comparación, y puede servir como un testigo. Con respecto a la presente invención, una mIL-11 "de referencia" seria una mIL-11 no conjugada que tenga la secuencia idéntica a la mIL-11 dentro de un conjugado que esté siendo analizada para determinar el efecto que el biopolimero del conjugado tiene sobre la actividad biológica de mIL-11 al cual está unido. Asi pues, la actividad biológica del conjugado que contiene mIL-11, o una variante o derivado de éste, puede compararse con una mIL-11 "referencia" no conjugada correspondiente para determinar si la mIL-11 en una forma conjugada, tal y como se compara con una mIL-11, en forma no conjugada, tiene considerablemente la misma actividad biológica.
Por ejemplo, un biopolimero conjugado que tenga prácticamente toda la actividad biológica del polipéptido mIL-11 tendría un nivel de actividad, cuando se mide por el ensaye de proliferación celular in vitro descrito, de no menos de 5%, 4%, 3%, 2% o 1%, tal y como se compara con el nivel de la actividad de proliferación celular del polipéptido mIL-11 no conjugado. Cuando se compara la actividad biológica, por ejemplo, de un conjugado biopolimero especifico que contenga una mIL-11, variante, fragmento o derivado de ésta, la mIL-11 del conjugado y la mIL-11 no conjugada a la cual se está comparando tienen secuencias idénticas. La actividad de mIL-11 puede también determinarse por ensayos in vitro e in vivo rutinarios, adicionales bien conocidos en la técnica (p. ej. , el ensayo de proliferación de megacariocitos , la estimulación de los niveles sanguíneos de plaquetas).
En algunas modalidades de la presente invención, una mIL-11 aislada o purificada, o variante, fragmento o derivado de ésta, se utiliza en los métodos de la invención. Una proteína "aislada" o "purificada" de ésta es considerablemente libre de material celular u otras proteínas contaminantes de la fuente de células o tejido del cual la proteína de mIL-11, o variante, fragmento o derivado de ésta, se obtiene, o prácticamente libre de precursores químicos u otras sustancias químicas cuando se sintetiza por métodos químicos. El término "prácticamente libre de material celular" incluye preparaciones de la proteína mIL-11, o variantes, fragmentos o derivados de ésta, en las cuales la proteína se separa de los componentes celulares de las células de las cuales se produjo recombinantemente . En una modalidad, el término "prácticamente libre de material celular" incluye preparaciones de la proteina mIL-11, o variantes, fragmentos o derivados de ésta, que tengan menos de aproximadamente 30% (en peso seco) de proteina no mIL-11 (también mencionada en la presente como "proteina contaminante"), p. ej . , menos de aproximadamente 20%, menos de aproximadamente 10%, o menos de aproximadamente 5% de proteina no mIL-11. Cuando la proteina mIL-11 o variante, fragmento o derivado de ésta, se produce de manera recombinante , también de preferencia está considerablemente libre de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente 20%, p. ej . , menos de aproximadamente 10% o menos de aproximadamente 5% del volumen de la preparación de la proteina.
El término "considerablemente libre de precursores químicos u otras sustancias químicas" incluye preparaciones de la proteína mIL-11, o variantes, fragmentos o derivados de ésta en la cual se separa la proteína de precursores químicos u otras sustancias químicas que estén implicadas en la síntesis de la proteína. En una modalidad, el término "considerablemente libre de precursores químicos u otras sustancias químicas" incluye preparaciones de la proteína mIL-11, o variante, fragmento o derivado de ésta, que tenga menos de aproximadamente 30% (en peso seco) de precursores químicos o sustancias químicas que no sean mIL-11, p. ej . , menos de aproximadamente 20%, menos de aproximadamente 10%, o menos de aproximadamente 5% de precursores químicos o sustancias químicas que no sean mIL-11.
El polipéptido mIL-11, o variante, fragmento o derivado de éste, puede producirse por cualquier método conocido en la técnica, p. ej . , expresión recombinante o síntesis química. Preferentemente, el polipéptido mIL-11, o variante, fragmento o derivado de éste, se expresa de manera recombinante, p. ej . , en bacterias, levaduras o cultivos celulares de ¦ mamífero. La expresión recombinante implica la preparación de un vector que contenga un polinucleótido que codifique el polipéptido mIL-11, o variante, fragmento o derivado de éste, entregando el vector en una célula hospedera, el cultivo de la célula hospedera en condiciones en las cuales el polipéptido mIL-11, o variante, fragmento o derivado de éste, se exprese, y la separación del polipéptido mIL-11, o variante, fragmente o derivado de éste. Los métodos y materiales para preparar vectores recombinantes y transformar células hospederas utilizando el mismo, la replicación de los vectores en las células hospederas y la expresión de polipéptidos y proteínas extraños biológicamente activos están descritos en Sambrook et al., Molecular Cloning, 3a edición, Cold Spring Harbor Laboratory, 2001 and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York 3a edición, (2000 ), cada una incorporada en la presente para referencia.
La información de la secuencia de los aminoácidos del polipéptido mIL-11, o variante, fragmento o derivado de éste puede utilizarse para crear una secuencia de polinucleótidos que codifique el polipéptido mIL-11, o variante, fragmento o derivado de éste. La secuencia de polinucleótidos puede ser sintetizada por métodos químicos u obtenida a partir de un gen o cDNA que codifique IL-11 de tipo nativa o recombinante . La disponibilidad de la secuencia del polinucleótido que codifique la mIL-11 hace posible la expresión en escala grande del polipéptido codificado por técnicas bien conocidas y practicadas de manera rutinaria en la técnica .
Polímeros biocompatibles y conjugados poliméricos biocompatibles Los polímero o biopolímeros biocompatibles de la invención pueden ser, más no se limitan a, uno o más polialquilen glicoles (que incluye, más no se limita a, uno o más poli(etilen glicoles), uno o más monometoxipoli ( etilen glicoles) y uno o más monohidroxipoli ( etilen glicoles)), uno o más polióxidos de alquileno, uno o más polioxiranos , uno o más polialcoholes olefínicos, p. ej., polialcohol vinílico, uno o más policarboxilatos , uno o más poli ( vinilpirrolidonas ) , uno o más poli ( oxietilenoximetilenos ) , uno o más poli ( aminoácidos ) , uno o más poliacriloilmorfolinas , uno o más copolímeros de una o más amidas y uno o más óxidos de alquileno, uno o más dextranos y uno o más ácidos hialurónicos . En particular, los biopolímeros de la presente invención son polietilen glicol (PEG), polipropilen glicol, polioxietileno , politrimetilen glicol, poliácido láctico, poliácido acrílico, poliaminoácido, polialcohol vinílico, poliuretano, polifosfazenos , poli ( L-lisina ) , polióxido de alquileno, polisacárido , dextrano, polivinil pirrolidona, polialcohol vinílico y poliacril amida.
Los biopolímeros de la presente invención pueden incluir cualquier forma monofuncional activada lineal o ramificada de polímeros que sean conocidos en la técnica. Por ejemplo, se incluyen aquellos con pesos moleculares (excluida la masa del grupo activador) en el intervalo de aproximadamente 1 kDa a aproximadamente 100 kDa. Los intervalos adecuados de los pesos moleculares pueden ser más no se limitan a aproximadamente 2 kDa a aproximadamente 100 kDa aproximadamente 2 kDa a aproximadamente 20 kDa aproximadamente 5 kDa a aproximadamente 20 kDa aproximadamente 5 kDa a aproximadamente 30 kDa aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 20 kDa aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 60 kDa aproximadamente 18 kDa a aproximadamente 60 kDa aproximadamente 12 kDa a aproximadamente 30 kDa aproximadamente 5 kDa, aproximadamente 10 kDa aproximadamente 20 kDa o aproximadamente 30 kDa. En el caso de PEG lineales, los pesos moleculares de aproximadamente 10 kDa, aproximadamente 20 kDa o aproximadamente 30 kDa corresponden a los grados de polimerización (n) de aproximadamente 230, aproximadamente 450 o aproximadamente 680 unidades monoméricas de óxido de etileno, respectivamente.
Cuando se utiliza en la presente, "PEG" incluye todos los polímeros de óxido de etileno, sean lineales o ramificados o de múltiples brazos o sean con extremos protegidos o con terminaciones hidroxilo. "PEG" incluye aquellos polímeros que son conocidos en la técnica como poli(etilen glicol), metoxipoli ( etilen glicol) o mPEG o poli(etilen glicol ) -monometil éter, alcoxipoli ( etilen glicol), poli(óxido de etileno) o PEO, oí-metil-Q-hidroxi-poli ( oxi- 1 , 2-etandiilo ) y polioxirano, entre otros nombres que se utilizan en la técnica para los polímeros de óxido de etileno.
Cuando se utiliza en la presente, el término "PEGilación" se refiere a cualquier proceso para el acoplamiento covalente de PEG a una molécula diana bioactiva, especialmente una proteína que se une al receptor. El conjugado que se produce con esto es conocido como conjugado "PEGilado." La PEGilación puede obtenerse utilizando uno o más enfoques de modificación química, que incluye la PEGilación específica de la amina, PEGilación dirigida al N-terminal y/o modificación específica del sitio.
Cuando se utiliza en la presente, el término "conjugado" se refiere al producto de una unión covalente de un biopolímero, p. e . , PEG, a una molécula diana, p. ej . , rhIL-11 o mIL-11. El término "conjugación" se refiere a la formación de un conjugado como se describe antes. En la presente invención es posible utilizar cualquier método normalmente utilizado por los expertos en la técnica para la conjugación de un biopolímero a una molécula diana.
La molécula rhIL-11 contiene un total de cuatro sitios posibles para la unión covalente de un biopolímero como PEG cuando se aplica un método específico de la amina para la conjugación. Los cuatro sitios posibles incluyen tres residuos de lisina (Lys41, Lys98 y Lys174) y el N-terminal. Con respecto a la predicción de la estructura tridimensional de rhIL-11, estos grupos amino primario existen en la superficie externa de rhIL-11. La Lys41, Lys98 y Lys174 de la rhIL-11 corresponde a Lys33, Lys90 y Lys166 de la mIL-11 (ID SEC NO: 2), respectivamente .
En las preparaciones comunes de los conjugados de biopolímeros , como el conjugado de PEG, la molécula que interesa que sea conjugada a PEG (p. e j . , rhIL-11 o mlL-11) se incuba en una solución amortiguadora junto con un exceso molar de PEG. La reacción se lleva a cabo utilizando el tiempo de reacción deseado, la temperatura y relación molar del modificador de PEG/molécula IL-11. La información respecto a las condiciones de reacción que se utilizan para la PEGilación se conocen en la técnica y pueden encontrarse, por ejemplo en Zalipsky et al., Biotechnol. Appl . Biochem. 15:100-114 (1992) y Kinstler et. al, Pharm. Res. 75:996-1002 (1996). Para llevar a cabo tales reacciones de conjugación, Takagi et al., encontraron que fue difícil mantener la actividad biológica de la molécula rhIL-11. Véase Takagi et al., Journal of Controlled Reléase 119: 271-278 (2007).
Vectores y células hospederas Los vectores se utilizan en la presente para amplificar el DNA o RNA que codifican mIL-11, o variante o derivado de ésta y/o para expresar el DNA que codifica la mIL-11, o variante o derivado de ésta. Cuando se utiliza en la presente, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual ha sido ligada. Un tipo de vector es un "plásmido" , lo cual se refiere a un bucle de DNA bicatenario circular en el cual pueden ligarse segmentos de DNA adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde los segmentos adicionales de DNA pueden estar ligados en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula hospedera en la cual se introducen (p. ej., vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores de mamífero episomales). Otros vectores (p. ej . , vectores de mamífero no episomales) están integrados en el genoma de una célula hospedera tras la introducción en la célula hospedera, y con ello se replican junto con el genoma del hospedero. Además, ciertos vectores pueden dirigir la expresión de los genes a los cuales están unidos de manera operante. Tales vectores se conocen en la presente como "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de DNA recombinante muchas veces están en forma de plásmidos . En la especificación presente, "plásmido" y "vector" pueden utilizarse de manera indistinta en vista de que el plásmido es la forma más comúnmente utilizada del vector. No obstante, la invención está destinada para incluir estas otras formas de vectores de expresión, como los vectores virales (p. ej . , retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados con replicación defectuosa), que tienen funciones equivalentes.
La expresión de las proteínas en procariotas se lleva a cabo muy comúnmente en E. coli con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de las proteínas de fusión o que no son de fusión. Los vectores de fusión adicionan una cantidad de aminoácidos a una proteína codificada en éstos, normalmente al amino terminal de la proteína recombinante . Estos vectores de fusión por lo regular tienen tres propósitos: (1) aumentar la expresión de la proteína recombinante; (2) aumentar la solubilidad de la proteína recombinante; y (3) ayudar en la purificación de la proteína recombinante actuando como un ligando en la purificación por afinidad. Con frecuencia, en los vectores de expresión por fusión, un sitio de desdoblamiento proteolítico se introduce en la unión de la porción de fusión y la proteína recombinante para permitir la separación de la proteína recombinante a partir de la porción de fusión después de la purificación de la proteína de fusión. Tales enzimas, y sus secuencias de reconocimiento cognadas, incluyen el Factor Xa, trombina y enterocinas. Los vectores de expresión por fusión comunes incluyen pGEX (Amersham; Smith et al., Gene 67:31-40 (1988)), pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, N.J.) que funden o fusionan glutation-S-transferasa (GST), la proteína de unión a maltosa E, o proteína A, respectivamente, a la proteína recombinante diana.
Los ejemplos de los vectores de expresión de E. coli que no son de fusión, inducibles, adecuados incluyen pTrc (Amrann et al, Gene 69:301-315 (1988)) y pET 1 Id (Studier et al, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 60-89). Una estrategia para llevar al máximo la expresión de las proteínas recombinantes en E. coli es expresar la proteina en bacterias hospederas con una capacidad deteriorada para el clivaje proteolítico de la proteína recombinante. Véase, Gottesman, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 119-128. Otra estrategia es alterar la secuencia del ácido nucleico que va a ser insertado en un vector de expresión de modo que cada uno de los codones de cada aminoácido sean los preferentemente utilizados en E. coli (Wada et al, Nuc . Acids Res. 20:2111-2118 (1992)). Tal alteración de las secuencias del ácido nucleico de la invención puede llevarse a cabo por técnicas de síntesis de DNA normalizadas.
En otra modalidad, el vector de expresión es un vector de expresión de levadura. Los ejemplos de los vectores de expresión en la levadura S. cerevisae incluyen pYepSecl (Baldari et al, EMBO J. 6:229-234 (1987)), pMFa (Kurján et al, Cell 50:933-943 (1982)), pJRY88 (Schultz et al, Gene 54:113-123 (1987)), pYES2 ( Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.)/ Y picZ ( Invitrogen Corporation).
En otra versión, la mIL-11, o variante o derivado de ésta puede expresarse en células de insecto utilizando vectores de expresión baculovirus. Los vectores baculovirus disponibles para la expresión de las proteínas en células de insecto cultivadas (p. ej., células SF9) incluyen la serie pAc ( Smith et al, Mol. Cell. Biol. 3:2156-2165 (1983)) y la serie pVL (Lucklow et al, Virology 170:31-39 (1989)).
En todavía otra modalidad, un ácido nucleico de la invención se expresa en células de mamífero utilizando un vector de expresión de mamífero. Los ejemplos de los vectores de expresión de mamífero pueden ser pCDM8 (Seed, Nature 329:840 (1987)) y pMT2PC (Kaufman et al, EMBO J. 6: 187-195 (1987)). Cuando se utiliza en células de mamífero, las funciones de control de los vectores de expresión muchas veces son proporcionadas por elementos regulativos virales. Por ejemplo, los promotores comúnmente utilizados se obtienen de polioma, adenovirus 2, citomegalovirus y Virus de simio 40. Para otros sistemas de expresión adecuados para células procariotas y eucariotas, véase, p. ej . , los capítulos 16 y 17 de Sambrook et al, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989.
Los vectores de expresión preferidos son constructos de DNA que pueden replicarse en los cuales una secuencia de DNA que codifica la mIL-11, o variante o derivado de ésta, está ligado de manera operante o conectado a las secuencias testigo adecuadas capaces de efectuar la expresión de la mIL-11, o variante o derivado de ésta en un hospedero adecuado. Las regiones del DNA están ligadas de manera operante, o conectadas cuando estas están relacionadas funcionalmente entre sí. Por ejemplo, un promotor está ligado de manera operante o conectado a una secuencia codificadora si regula la transcripción de la secuencia. Los expertos en la técnica se darán cuenta que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedera que va a ser transformada, el nivel de expresión de la proteína deseada, etc. Los vectores de expresión de la invención pueden ser introducidos en células hospederas para producir con ello proteínas o péptidos, incluidas las proteínas o péptidos de fusión, codificados por ácidos nucleicos como se describe en la presente. Los vectores preferidos preferentemente contienen un promotor que es reconocido por el organismo hospedero. Las secuencias promotoras de la presente invención pueden ser procariotas, eucariota o virales. Los ejemplos de las secuencias procariotas adecuadas incluyen los promotores trp, tac, trc, recA, choque térmico y lacZ de E. coli. Otros promotores pueden ser, más no se limitan a, el promotor T7 del bacteriófago, el promotor PR y PL de bacteriófago lambda, el promotor 'temprano inmediato del citomegalovirus y el promotor del virus de sarcoma de Rous .
Más aún, los vectores de expresión adecuados pueden tener un marcador apropiado que permita el cribado de las células hospederas transformadas. La transformación del hospedero seleccionado se lleva a cabo utilizando cualquiera de las diversas técnicas bien conocidas para el experto en la técnica y descritas en Sambrook et al, supra.
Un origen de replicación también puede proporcionarse mediante la construcción del vector para que incluya un origen exógeno o pueda ser provisto por el mecanismo de replicación cromosómica de la célula hospedera. Si el vector está integrado en el cromosoma de la célula hospedera, este último puede ser suficiente.
Las secuencias de nucleótidos que codifican la mlL-11, o variante o derivado de ésta pueden ser recombinadas con DNA vector de acuerdo con las técnicas tradicionales, que incluye terminaciones con extremos romos o con extremos escalonados para la ligación, la digestión con enzima de restricción para proporcionar terminaciones apropiadas, el relleno de extremos cohesivos según sea apropiado, el tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar la unión no deseada y ligación con ligasas apropiadas. Las técnicas para estas manipulaciones están descritas en Sambrook et al., supra y son bien conocidas en la técnica. Los métodos para la construcción de vectores de expresión de mamífero están descritos en, por ejemplo, Okayama et al., Mol. Cell. Biol. 3:280 (1983), Cosman et al, Mol. Immunol. 23:935 (1986), Cosman et al., Nature 572:768 (1984), EP-A-0367566 , y WO 91/18982, cada una de las cuales se incorpora en la presente para referencia en su totalidad.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporcionan células hospederas, incluidas células procariotas y eucariotas, que contienen un polinucleótido que codifica la mIL-11, o variante o derivado de ésta, en una forma que permite la expresión del polipéptido mIL-11 codificado, o variante o derivado de éste. Los polinucleótidos de la invención pueden ser introducidos en la célula hospedera como parte de un plásmido circular, o como DNA lineal que contenga una región que codifique la proteina aislada o un vector viral. Los métodos para introducir DNA en la célula hospedera que son bien conocidos y se practican de manera rutinaria en la técnica incluyen la transformación, transíección , electroporación , inyección nuclear, o fusión con portadores como liposomas, micelas, células fantasma y protoplastos . Los sistemas de expresión de la invención incluyen sistemas de células bacterianas, de levadura, fúngales, de plantas, insectos, de invertebrados, vertebrados y mamíferos.
Las células hospederas de la invención son útiles en los métodos para la producción en gran escala de los polipéptidos de mIL-11, o variante o derivado de ésta, en donde las células crecen en un medio de cultivo adecuado y el producto polipéptido deseado se aisla de las células, o a partir del medio en el cual se hicieron crecer las células, por métodos de purificación conocidos en la técnica, p. ej . , los métodos cromatográficos tradicionales como la cromatografía por inmunoafinidad, cromatografía de afinidad por un receptor, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de afinidad por lecitina, filtración por exclusión de tamaño, cromatografía de intercambio catiónico o aniónico, cromatografía líquida de alta presión ( HPLC ) , HPLC de fase inversa y similares. Todavía otros métodos de purificación pueden ser aquellos métodos en donde la proteína deseada se expresa y purifica como una proteína de fusión que tiene un marbete, etiqueta o porción quelante especifica que es reconocida por una contraparte o compuesto de unión específico. La proteína purificada puede ser desdoblada para producir la proteína deseada, o puede dejarse como una proteína de fusión intacta. El desdoblamiento del componente de fusión puede producir una forma de la proteína deseada que tenga residuos de aminoácidos adicionales como resultado del proceso del desdoblamiento .
Las células hospederas adecuadas para la expresión de los polipéptidos de la invención pueden ser, más no se limitan a, células procariotas, eucariotas y levadura. Si se emplea un vector de expresión procariótico , entonces la célula hospedera apropiada sería cualquier célula procariota con capacidad de expresar las secuencias clonadas. Las células procariotas adecuadas pueden ser, más no se limitan a, bacterias de los géneros Escheríchia , Bacillus, Salmonella, Pseudomonas , Streptomyces y Staphylococcus .
Si se emplea un vector de expresión eucariota, entonces la célula hospedera apropiada seria cualquier célula eucariota con capacidad de expresar la secuencia clonada. Preferentemente, las células eucariotas son células de eucariotas superiores. Las células eucariotas adecuadas pueden ser, más no se limitan a, células de cultivo tisular de mamífero no humano y células de cultivo tisular humano. Las células hospederas preferidas pueden ser, más no se limitan a, células de insecto, células HeLa, células de ovario de hámster Chino (células CHO), células de riñon de mono verde africano (células COS ) , células 293 humanas y fibroblastos murinos 3T3. La propagación de tales células en el cultivo celular se ha vuelto un procedimiento habitual (véase, Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Patterson, Eds . (1973), el cual se incorpora en la presente para referencia en su totalidad ) .
Además, como célula hospedera es posible emplear una célula de levadura. Las células de levadura preferidas pueden ser, más no se limitan a, los géneros Saccharomyces, Pichia y Kluveromyces . Los hospederos de levadura preferidos son S. cerevisiae y P. pastoris . Los vectores de levadura preferidos que pueden contener una secuencia origen de replicación a partir de un plásmido de levadura 2T, una secuencia de replicación autónoma (ARS), una región promotora, secuencias para la poliadenilación , secuencias para la terminación de la transcripción y un gen marcador seleccionable . Los vectores de lanzadera para la replicación en levadura y E. coli también se incluyen en la presente.
En otra versión es posible utilizar células de insecto como células hospederas. En una modalidad preferida, los polipéptidos de la invención se expresan utilizando un sistema de expresión baculovirus (véase, Luckow et al, Bio/Technology, 6:47 ( 1988 j , BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS: A LABORATORY MANUAL, O'Rielly et al. (Eds.), W.H. Freeman and Company, New York, 1992, y la Patente U.S. No. 4 , 879 , 236, cada una de las cuales se incorpora en la presente para referencia en su totalidad). Además, el sistema de expresión baculovirus completo MAXBACTM ( Invitrogen ) , por ejemplo, puede utilizarse para la producción en células de insecto. Las células hospederas adecuadas se discuten más en Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). De otro modo, el vector de expresión recombinante puede ser transcrito y traducido in vitro, por ejemplo utilizando las secuencias reguladoras del promotor T7 y T7 polimerasa.
Una células hospedera de la invención, como puede ser una célula hospedera procariota o eucariota en cultivo puede utilizarse para producir (es decir, para expresar) el polipéptido mIL-11, o variante o derivado de ésta. En una modalidad, el método consiste en cultivar la célula hospedera de la invención (en la cual haya sido introducido un vector de expresión recombinante que codifique la mIL-11, o variante o derivado de ésta) en un medio apropiado para que se produzca la mIL-11, o variante o derivado de ésta. En otra modalidad, el método además comprende en aislar la mIL-11, o variante o derivado de ésta, del medio o la célula hospedera.
En los casos donde el polipéptido mIL-11, o variante o derivado de éste, se encontrará principalmente de manera intracelular , el material intracelular (incluidos los cuerpos de inclusión para bacterias Gram-negativas ) puede ser extraído de la célula hospedera utilizando cualquier técnica normalizada conocida para un experto en la materia. Estos métodos comprenderán, como un ejemplo y no como limitación, el lisado de las células hospederas para liberar el contenido del periplasma/citoplasma mediante la prensa French, homogeneización , y/o sonicación seguido por centrifugación.
Si el polipéptido mIL-11, o variante o derivado de éste, ha formado cuerpos de inclusión en el citosol, tales cuerpos de inclusión pueden unirse frecuentemente a las membranas celulares internas y/o externas. Luego de la centrifugación, los cuerpos de inclusión se encontrarán principalmente en el material sedimentado. El material sedimentado puede ser luego tratado con extremos de pH o con uno o más agentes caotrópicos como detergente, guanidina, derivados de guanidina, urea o derivados de urea en presencia de un agente reductor como ditiotreitol a pH alcalino o tris-carboxietil fosfina a pH ácido para liberar, romper y solubilizar los cuerpos de inclusión. Una vez solubilizado , el polipéptido mlL-11, o variante o derivado de éste, puede ser analizado utilizando electroforesis en gel, inmunoprecipitación o similares. Los diversos métodos para aislar el polipéptido mIL-11, o variante o derivado de éste, serán evidentes para un experto en la técnica, por ejemplo, el aislamiento o purificación puede lograrse utilizando los métodos normalizados como los que se establecen más adelante y en Marston et al, Meth. Enzymol. 182:264-275 (1990) (incorporada para referencia en la presente en su totalidad ) .
Si el polipéptido mIL-11 aislado, o variante o derivado de éste no presenta actividad biológica después del procedimiento de aislamiento empleado, diversos métodos para "volver a plegar" o convertir el polipéptido en su estructura terciaria y generar enlaces disulfuro, pueden utilizarse para restablecer la actividad biológica. Los métodos conocidos para un experto en la técnica incluyen el ajuste del pH del polipéptido solubilizado a un pH normalmente por encima de 7 y en presencia de una concentración especifica de un caótropo. La selección del caótropo es muy semejante a las elecciones que se utilizan para la solubilización de los cuerpos de inclusión pero normalmente a una concentración menor y no necesariamente es el mismo caótropo que se utiliza para la solubilización. Puede ser necesario emplear un agente reductor o el agente reductor más su forma oxidada en una proporción especifica, para producir un potencial redox especifico que permita que ocurra una combinación de enlaces disulfuro para la formación del (los) puente(s) cisterna de la proteina. Algunas de las parejas redox comúnmente utilizadas pueden ser cisteína/cistamina, glutation ( GSH ) /ditiobis GSH, cloruro cúprico,, ditiotreitol ( DT ) /ditiano DTT, 2-mercaptoetanol ( bME ) /ditio-b ( ME ) . Para aumentar la eficacia del replegado, puede ser necesario emplear un co-disolvente , como glicerol, polietilen glicol de diversos pesos moleculares, y arginina.
Métodos de tratamiento La presente invención comprende los métodos de tratamiento, mejoría o prevención de enfermedades o trastornos que responden a IL-11. Los ejemplos de las enfermedades o trastornos que pueden responder a la administración de IL-11 pueden ser, más no se limitan a, trombocitopenia (p. e j . , inducida por quimioterapia mielosupresiva ) , trastornos en los que interviene el sistema inmunitario (p. ej., citotoxicidad en las que intervienen las células T citotóxicas y en las que interviene el complemento, enfermedad de injerto contra hospedero), mucositis (p. e j . , mucositis oral, mucositis gastrointestinal, mucositis nasal, proctitis), enfermedades de intestino inflamado (p. ej., la enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, colitis indeterminada, colitis infecciosa), trastornos inflamatorios de la piel (p. ej., soriasis, dermatitis atópica, hipersensibilidad por contacto), sepsis, gingivitis, periodontitis , enfermedades oculares inflamatorias (p. ej . , conjuntivitis, retinitis, uveitis), trastornos de la motilidad gastrointestinal (p. ej . , la enfermedad del reflujo gastroesofágico , intolerancia a la alimentación, ileo adinámico postoperatorio), pancreatitis, enterocolitis necrotizante , úlcera aftosa, faringitis, esofagitis, úlceras pépticas, AIDS (SIDA), artritis reumatoide, osteoartritis , espondiloartropatias , enfermedades diarreicas provocadas por antibióticos, esclerosis múltiple, diabetes, osteoporosis , lesiones por reperfusión, asma, rinitis, pre-eclampsia, enfermedad de Von Willebrand, hemofilia A, linfoma de No-Hodgkin y deficiencias de células progenitoras o madre hematopoyéticas .
El término "cantidad terapéutica eficaz", cuando se utiliza en la presente, se refiere a aquella cantidad del compuesto terapéutico suficiente para permitir la mejoría de uno o más síntomas de un trastorno, o prevenir el avance de un trastorno, o provocar la regresión del trastorno. Por ejemplo, con respecto al tratamiento de trombocitopenia , una cantidad terapéutica eficaz preferentemente se refiere a la cantidad de un compuesto terapéutico que aumenta el nivel en sangre de las plaquetas por al menos 5%, preferentemente al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 100%.
Los términos "prevenir", "prevención", cuando se utiliza en la presente, se refiere a una disminución en la presencia de células patológicas o una ausencia de disminución de células deseables (p. ej., plaquetas) en un animal. La prevención puede ser completa, p. e j . , la ausencia total de una disminución en células deseables en un individuo. La prevención también puede ser parcial, de modo que la disminución de las células deseables en un individuo sea menor que la que ocurriría sin la presente invención .
El conjugado polimérico biocompatible que contiene mIL-11, o variante, fragmento o derivados de ésta, puede ser administrado después del inicio de los síntomas de una enfermedad o trastorno. En otras modalidades, el conjugado polimérico biocompatible que contiene mIL-11, o variante, fragmento o derivado de ésta, puede ser administrado antes del comienzo de una enfermedad o trastorno en casos en los cuales la enfermedad o trastorno probablemente ocurra, para prevenir o reducir la gravedad de la enfermedad o trastorno. Por ejemplo, la forma conjugada de mIL-11, o variante, fragmento o derivado de ésta, con PEG puede ser administrada a un paciente que sufra un tratamiento de quimioterapia que, según se sabe ocasiona trombocitopenia.
El conjugado polimérico biocompatible que contiene mIL-11, o variante, fragmento o derivado de ésta, puede ser administrado en combinación con uno o más compuestos terapéuticos diferentes o tratamientos conocidos como eficaces para el tratamiento, mejoría o prevención de una enfermedad o trastorno. Los ejemplos de otros compuestos terapéuticos o tratamientos pueden ser, sin limitación, otros factores de crecimiento (p. ej . , interleucinas , interferones , factores estimuladores de colonias, factores de necrosis tumoral, eritropoyetina ) , agentes inmunosupresores , agentes anti-inflamatorios , agentes anti-cancerosos , anticuerpos y radiación. El conjugado polimérico biocompatible que contiene mIL-11, o variante, fragmento o derivado de ésta, y uno o más compuestos terapéuticos diferentes puede ser administrado como una sola composición o como composiciones diferentes. En algunas modalidades, el conjugado polimérico biocompatible que contiene mIL-11, o variante, fragmento o derivado de ésta, y uno o más compuestos terapéuticos se administra a un animal bajo una o más de las siguientes condiciones: con diferente periodicidades, a diferentes duraciones, a diferentes concentraciones, por diferentes vías de administración, etc. En algunas modalidades, el conjugado polimérico biocompatible que contiene mIL-11, o variante, fragmento o derivado de ésta, se administra antes del compuesto terapéutico, p. ej., 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 12 o 18 horas, 1, 2, 3, 4, 5 o 6 días, o 1, 2, 3 o 4 semanas antes de la administración del compuesto terapéutico. En algunas modalidades, el conjugado polimérico biocompatible que contiene mIL-11 o variante, fragmento o derivado de ésta, se administra después del compuesto terapéutico, p. ej . , 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 12 o 18 horas, 1, 2, 3, 4, 5 o 6 días, o 1, 2, 3 o 4 semanas después de la administración del compuesto terapéutico. En algunas modalidades, el conjugado polimérico biocompatible que contiene mIL-11, o variante, fragmento o derivado de ésta y el compuesto terapéutico se administran en forma . concurrente pero con diferentes calendarios, p. ej . , el conjugado polimérico biocompatible que contiene mIL-11 o variante, fragmento o derivado de ésta, se administra diario, dos veces a la semana o una vez a la semana, mientras que el compuesto terapéutico o anticáncer se administra una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas o una vez cada cuatro semanas.
Composiciones Las composiciones dentro del alcance de esta invención incluyen todas las composiciones en donde el conjugado polimérico biocompatible que contiene mIL-11, o variante, fragmento o derivado de ésta, de la presente invención está contenido en una cantidad que sea eficaz para obtener su uso propuesto. Si bien las necesidades individuales varían, la determinación de los intervalos óptimos de las cantidades eficaces de cada componente está dentro de la habilidad de la técnica. Por lo regular, el conjugado polimérico biocompatible que contiene mlL-11, o variante, fragmento o derivado de ésta,' puede administrarse a animales, por ejemplo, humanos, en una dosis de aproximadamente 1 a aproximadamente 5000 g/kg de peso corporal. En otras modalidades, la dosis es ax 2 a aproximadamente 1000 yg/kg, aproximadamente 5 a aproximadamente 500 µ?/kg, o aproximadamente 5 a aproximadamente 250 yiq/kq (calculando la masa de la proteína sola, sin modificación química).
En algunas modalidades, la composición que contiene el conjugado polimérico biocompatible que contiene mlL-11, o variante, fragmento o derivado de ésta, está en forma farmacéutica unitaria, p. ej . , en un envase para un solo uso, en solución lista para inyección, pildora, cápsula o composición tópica. En una modalidad, la forma farmacéutica unitaria contiene menos que aproximadamente 500 mg del conjugado polimérico biocompatible que contiene mIL-11 o variante, fragmento o derivado de ésta p. ej., desde aproximadamente 0.1 mg a aproximadamente 500 mg, desde aproximadamente 0.2 mg hasta aproximadamente 100 mg, o desde aproximadamente 0.5 mg hasta aproximadamente 50 mg.
Además de la administración del conjugado polimérico biocompatible que contiene mIL-11 o variante, fragmento o ' derivado de ésta como un polipéptido aislado, los polipéptidos de la invención pueden ser administrados como parte de una preparación farmacéutica que contenga los portadores aceptados para uso farmacéutico apropiados que comprendan excipientes y auxiliares que faciliten el procesamiento de los polipéptidos en los preparados para uso farmacéutico. Preferentemente, los preparados contienen desde aproximadamente 0.01 hasta 99%, preferentemente desde aproximadamente 0 . 2 5 hasta 7 5 % del polipéptido activo, junto con el excipiente.
En una modalidad, las composiciones farmacéuticas que contienen excipientes que estabilizan el conjugado polimérico biocompatible que contiene el polipéptido mlL-11 o variante, fragmento o derivado de ésta, evitando con ello la degradación tras el almacenamiento. En una modalidad, la composición farmacéutica está en forma seca, p. ej . , liofilizada, para preservar la estabilidad del polipéptido conjugado con el polímero biocompatible. La composición seca se disuelve en un líquido apropiado, p. ej . , agua o salina, inmediatamente antes de la administración a un animal. En otra modalidad, las composiciones farmacéuticas están en forma líquida. Los ejemplos de las composiciones farmacéuticas apropiadas para el conjugado polimérico biocompatible que contiene mIL-11, o variante, fragmento o derivado de ésta incluye composiciones que contienen el conjugado polimérico biocompatible que contiene mIL-11 o variante, fragmento o derivado de ésta, glicina y un crioprotector , y opcionalmente un polisorbato, metionina y un agente amortiguador (véase las Patentes U. S. Nos. 6 , 2 70 , 757 ; 7 , 03 3 , 992 ) .
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden ser administradas a cualquier animal que pueda experimentar los efectos benéficos de los compuestos de la invención. Entre estos animales están los mamíferos, p. ej., humanos, aunque la invención no se propone para estar así limitada. Otros animales pueden ser animales veterinarios (vacas, ovejas, cerdos, caballos, perros, gatos y similares). En una modalidad, el animal es un humano o mono.
Las composiciones f rmacéuticas pueden ser administradas por cualquier medio que logre su objetivo propuesto. Por ejemplo, la administración puede ser por las vías parenteral, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal , transdérmica , bucal, intratecal, intracraneal, intranasal o tópica. De otro modo o en forma concurrente, la administración puede ser por la vía oral. La vía de administración preferida depende de la enfermedad o trastorno que va a ser tratado, mejorado o prevenido. Por ejemplo, para la estimulación- de la trombopoyesis , la vía de administración preferida es la subcutánea. Para el tratamiento, mejoría o prevención de enfermedades inflamatorias gastrointestinales, la vía de administración preferida es la tópica. La dosificación administrada dependerá de la edad, salud y peso del recipiendario, la clase de tratamiento concurrente, si lo hay, la frecuencia del tratamiento y el tipo de efecto deseado .
Las preparaciones farmacéuticas de la presente invención se fabrican en una forma que es bien conocida, por ejemplo, por medio del mezclado tradicional, granulación, la preparación de grageas, disolución o procesos de liofilización . Asi pues, las preparaciones farmacéuticas para uso oral pueden obtenerse combinando los compuestos activos con excipientes sólidos, opcionalmente triturando la mezcla resultante y procesando la mezcla de los gránulos, después de la adición de auxiliares convenientes, si se desea, o es necesario, para obtener tabletas o núcleos de grageas.
Los excipientes adecuados son, en particular, cargas como sacáridos, por ejemplo lactosa o sacarosa, manitol o sorbitol, preparaciones de celulosa y/o fosfatos de calcio, por ejemplo fosfato tricálcico o fosfato hidrógeno de calcio, asi como aglutinantes como pasta de almidón, utilizando, por ej,emplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de papa, gelatina, tragacanto, metil celulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio y/o polivinil pirrolidona. Si se desea, es posible adicionar agentes desintegradores como los almidones antes mencionados, y también carboximetil-almidón , polivinil pirrolidona reticulada, agar o ácido alginico o una sal de éste, como puede ser alginato de sodio. Los auxiliares son, sobre todo, agentes que regulan el flujo y lubricantes, por ejemplo, sílice, talco, ácido esteárico o sales de éste, como puede ser el estearato de magnesio o estearato de calcio, y/o polietilen glicol. Los núcleos de grageas se proporcionan con recubrimientos apropiados los cuales, si se desea, serán resistentes a los jugos gástricos. Para este propósito, es posible utilizar soluciones concentradas del sacárido, las cuales pueden opcionalmente contener goma arábiga, talco, polivinil pirrolidona, polietilen glicol y/o dióxido de titanio, soluciones de laca y los disolventes o mezclas de disolventes orgánicos apropiadas. Para producir recubrimientos resistentes a los jugos gástricos, las soluciones de preparaciones de celulosa apropiadas como ftalato de acetilcelulosa o ftalato de hidroxipropilmetil-celulosa son los utilizados. Los materiales colorantes o pigmentos pueden ser adicionados a las tabletas o recubrimientos de la gragea, por ejemplo, para la identificación o para determinar las combinaciones de las dosis de los compuestos activos.
Otros preparados farmacéuticos que pueden utilizarse por vía oral pueden ser cápsulas de ajuste a presión fabricadas de gelatina, asi como las cápsulas selladas, suaves elaboradas de gelatina y un plastificador como glicerol o sorbitol. Las cápsulas de ajuste a presión pueden contener los compuestos activos en forma de gránulos los cuales pueden mezclarse con cargas como lactosa, aglutinantes como almidones y/o lubricantes como talco o estearato de magnesio y, como una opción, estabilizadores. En las cápsulas blandas, los compuestos activos preferentemente están disueltos o se suspenden en líquidos apropiados como aceites grasos o parafina líquida. Además, es posible adicionar estabilizadores.
La presente invención también se dirige a los kits, incluidos los kits farmacéuticos. Los kits pueden contener un conjugado biopolimérico que contenga un mlL-11, o variante, fragmento o derivado de ésta, así como los controles apropiados, como pueden ser controles positivo y/o negativo. En algunas modalidades, los kits pueden contener una composición farmacéutica que contenga el conjugado biopolimérico que contenga la mIL-11, o variante, fragmento o derivado de ésta. El kit preferentemente contiene otros componentes, como por ejemplo, las instrucciones, un soporte sólido, reactivos útiles para la cuantificación y similares. El compuesto o agente puede estar empacado en un envase adecuado.
Ejemplos Ejemplo 1: Muteina interleucina-11 A. Preparación de la muteina IL-11 humana La muteina interleucina-11 humana (mIL-11) es una interleucina-11 humana (IL-11) rediseñada para tolerar estrés químico y proteolítico . La región N-terminal (los residuos 1-30) de IL-11 humana (NCBI AAA59132.1 ID SEC NO. 1) fue delecionada, y el nuevo N-terminal (correspondiente a valina en la posición 31 de la IL-11 humana) y aspartato en la posición 125 resultante (correspondiente a la posición 155 de la IL-11 humana) fueron mutados en alanina y asparagina, respectivamente. La secuencia ,de aminoácidos de mIL-11 se muestra en lo anterior como ID SEC NO: 2. La mIL-11 fue expresada como una proteína de fusión glutation-S-transferasa (GST-mlL-11) utilizando el vector de expresión pGEX4T. Los procedimientos de preparación detallados son semejantes a los descritos en WO 2006/126102 A2. En resumen, el cDNA que codifica mlL-11 fue generado por mutagénesis dirigida al sitio e introducido en el vector de expresión pGEX4T-kan, en el cual el gen resistente a ampicilina de pGEX4T fue reemplazado con el gen resistente a kanamicina, produciendo GST-mIL- 11. El vector de expresión resultante pGEX4T-GST-mIL-ll fue transformado en RX de E. coli (Promega, Madison, WI , EUA) . Un solo transformante fue inoculado en caldo LB suplementado con kanamicina (10 g/mL) e incubado hasta que el crecimiento alcanzó un nivel adecuado (OD6oo=0.5) a 30 °C. Después, se adicionó isopropil- -D-tiogalactopiranósido (IPTG) (0.4 mM) para inducir la expresión de proteínas y las células se hicieron crecer durante otras 3-4 horas a 30 °C. La expresión de GST-mIL- 11 fue confirmada por SDS-PAGE (dodecil sulfato de sodio - electroforesis en gel de poliacrilamida ) . Las células fueron cosechadas por centrifugación y resuspendidas en fosfato de sodio 50 mM, pH 7.5 con un contenido de EDTA 2 mM y lisado por sonicación o el homogeneizador a presión alta a 4°C. Se hicieron los siguientes pasos a 4°C, a menos que se indique de otro modo. Los desechos de las células lisadas fueron separados por centrifugación y los sobrenadantes fueron aplicados a cromatografía por afinidad GST (GE Healthcare, Pittsburgh, PA, EUA). La columna fue lavada con fosfato de sodio 50 mM, pH 7.5, seguido por elución con fosfato de sodio 50 mM, pH 7.5, con un contenido de glutation reducido 10 mM. La fracción de GST-mIL-11 eluida fue recolectada e incubada a 20°C para la proteólisis de trombina. Por cada miligramo de GST-mlL-11, se adicionaron 0.75 U de trombina, seguido por incubación a 20°C durante 1.5 h con agitación suave. La concentración de la proteina fue analizada por espectroscopia UV con coeficiente de absorbancia. La proteólisis fue terminada por enfriamiento inmediato a 1-4°C. La solución de la reacción fue luego aplicada a una cromatografía de intercambio catiónico (resina SP sepharose fast flow, GE Healthcare, Pittsburgh, PA, EUA) . La columna fue lavada extensamente con fosfato de sodio 50 mM, pH 7.5. En estas condiciones, la glutation-S-transferasa y glutation fueron eluidos en la fase móvil y la mIL-11 desdoblada permaneció como unida. La fracción de mIL-11 fue recolectada por un gradiente lineal de NaCl de 0 a 40 mM en fosfato de sodio 50 mM, pH 7.5, y luego se aplicó a una columna de benzamidina (GE Healthcare, Pittsburgh, PA, EUA) para remover cualquier trombina residual. La fracción de flujo a través fue recolectada y aplicada a una columna de Sephadex 75 (GE Healthcare, Pittsburgh, PA, EUA) para un intercambio de solución amortiguadora a acetato de sodio 50 mM, pH 5.0, con un contenido de 0.1% de polisorbato 20 y 5% de sorbitol. La fracción de mIL-11 fue recolectada y almacenada a -80°C hasta que estuvo lista para su uso (Figura 1, franja 2).
B. Caracterización de la muteina IL-11 humana Para investigar el efecto de la mutación en IL-11, un ensayo de la estructura secundaria y un ensayo de la actividad biológica se hicieron por espectroscopia de dicroísmo circular (CD) y un ensayo de proliferación celular, respectivamente. Se piensa que la interleucina-11 humana adopta un pliegue de has de cuatro hélices (Czupryn et al, JBC 270:978-985 (1995)). El espectro CD en el UV lejano de la mIL-11 fue registrado utilizando un aparato JASCO modelo J-810 (Tokio, Japón) semejante al informado por Czupryn et al., con modificación leve. El registro del espectro CD fue a 25 ± 1°C en Tris-HCl 10 mM, pH 8.0 con longitud de trayectoria de 0.1 cm. La concentración de la muestra fue de 0.5 mg/mL. Para el testigo también se analizó IL-11 humana, recombinante (rhIL-11, yeth, NJ, EUA, ID SEC NO. 3). El espectro CD de la mIL-11 presentó una señal alfa-helicoidal típica y fue semejante al de la rhIL-11 (Figura 2A) . Además, cuando se analizó la mlL-11 en cuanto a su actividad de proliferación celular utilizando células Ba/F3 que expresan receptores de IL-11 (véase el Ejemplo 5 para los detalles del procedimiento), la curva de actividad biológica de mIL-11 fue semejante a la de rhIL-11 (Figura 2B). Estos resultados demuestran que las mutaciones introducidas en IL-11 no afectan su capacidad para unirse a su receptor y no afectan la estructura general de la molécula. La información detallada de la linea celular y el protocolo del ensayo se presentan en el Ejemplo 5.
Ejemplo 2: Ensayo de estabilidad de mIL-11 en condiciones ácidas Como está descrito en el Ejemplo 1, la mIL-11 fue diseñada para ser más estable que IL-11 en estrés químico. Para comparar la estabilidad de mIL-11 con IL-11, se hicieron experimentos de degradación forzada. En breve, la mIL-11 preparada en el Ejemplo 1 y rhIL-11 adquirida de Wyeth (NJ, EUA) fueron incubadas en ácido cítrico 2 m , pH 3.5 solución amortiguadora durante 0-4 días a 50°C. Las muestras tratadas en ciertos puntos temporales (0, 1, 2, 3 y 4 días) fueron recolectadas e inmediatamente congeladas para detener la reacción hasta el análisis. Los productos degradados fueron analizados por SDS-PAGE y HPLC en fase inversa (RP-HPLC, Cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa, C4, 5 X 4.6 mm, Vydac , Deerfield, IL, EUA). Cada pico del RP-HPLC (Figura 3) fue recolectado e identificado por secuenciación de Edman y espectroscopia de masa.
En el transcurso de 24 horas del tratamiento, aproximadamente 60% de rhIL-11 estaba degradada, produciendo tres fragmentos con base en SDS-PAGE (no se muestran los datos) y RP-HPLC (Figura 3). Estos resultados son semejantes a los anteriormente reportados en Kenley y arne, Phárma. Res. 11:72-76 (1994)). Después de 4 días en condiciones ácidas, solo 3% de rhIL-11 intacta se observó en el RP-HPLC. Este resultado también es idéntico al anteriormente descrito (Kenley y Warne). Los sitios comunes de la hidrólisis ácida son los enlaces peptidicos entre prolina (P) aspartato (D), los cuales aparecen dos veces en rhIL-11 y una vez en mIL-11 (con diagonales, Figura 4). Sin embargo, en el caso de mIL-11, la mayor parte del mlL-11 (-85%) permaneció intacta a lo largo del tratamiento (Figura 3). El sitio de degradación observado de mIL-11 fue entre prolina 3 y aspartato 4. A diferencia de rhIL-11, el enlace peptidico entre las posiciones 154-155 (Figura 4) fue protegido de la proteólisis, tal vez debido a la mutación de aspartato a asparagina en la posición 124-125 de la ID SEC NO: 2 (correspondiente a P154-D155 de la ID SEC NO: 1). Estos resultados indican que mIL-11 es notablemente más estable en condición ácida en comparación con rhIL-11. Esta peculiaridad de mIL-11 es ventajosa para la PEGilación, porque en algunos casos, las condiciones de PEGilacion son muy duras.
Ejemplo 3: Preparación de la muteina IL-11 mono-PEGilada : uso de PEGilacion especifica de la amina A. Preparación de la muteina mIL-11 mono-PEGilada; PEG-mIL-11-SC Hay 4 aminas expuestas en la superficie sobre la muteina IL-11 (una amina primaria de N-terminal y tres aminas épsilon de los residuos de lisina, Figura 5). Como se describe más adelante, se hizo un método de PEGilacion especifico de la amina.
Primero, la mIL-11 purificada que se muestra en el Ejemplo 1 fue dializada contra salina amortiguada con fosfato (PBS), pH 7.4, para remover cualquier grupo amina no deseado. La solución de mIL-11 dializada luego fue concentrada a 1 mg/mL, utilizando una membrana de ultrafiltración (Vivaspin2, 10K MWCO, Vivascience, Alemania). La concentración de mIL-11 fue¦ determinada por absorbancia a 280 nm (Pace et al., Prot. Sci . 4: 2411 ( 1995 )) o el método de Lowry (Lowry et al, J. Biol. Chem. 193: 265 ( 1951 )). La solución de mIL-11 dializada reaccionó con un exceso 5 molar de carbonato de metoxi polietilen glicol succinimidilo (mPEG-SC, IDB, Corea) durante 1~2 h a temperatura ambiente (20-25°C) con agitación leve. Las longitudes de los polímeros PEG analizados fueron 5 kDa, 20 kDa o 30 kDa. Independientemente de la longitud del polímero PEG unido, se aplicó la misma reacción y esquema de purificación. La solución de la reacción fue luego diafiltrada contra acetato de sodio 50 m , pH 5.0, utilizando membrana 10K (Vivaspin2, 30K MWCO, Vivascience, Alemania) para remover los polímeros PEG sin reaccionar.
Los retenidos fueron luego cargados sobre una columna de cromatografía de intercambio catiónico ( SP-sepharose, GE Healthcare, Pittsburgh, PA, EUA) y equilibrados con acetato de sodio 50 mM, pH 5.0. La columna fue eluida con un gradiente salino lineal desde 0 hasta 400 mM en la misma solución amortiguadora para separar la mIL-11 di-PEGilada, mono-PEGi lada (PEG-mlL-11-SC) y no PEGilada. La fracción de mIL-11 mono-PEGilada obtenida fue luego desalada utilizando la columna Sephadex 25 en un búfer de formulación (acetato de sodio 50 mM, pH 5.0 con un contenido de 0.1% de Tween 20, 5% de sorbitol). La concentración de PEG-mlL-11-SC fue determinada por absorbancia a 280 nm y el método de Lowry. La concentración final se ajustó a 1 mg/mL y se almacenó a -80°C hasta su uso.
B. Caracterización La mlL-llmono-PEGilada, purificada, a la que se hace referencia como PEG-mIL- 11-SC , fue analizada por SDS-PAGE (4-12% NuPAGE Novex gel bis-tris acrilamida, Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) y HPLC de exclusión de tamaño (Bio-Sil SEC 250, Bio-Rad, Richmond, CA, EUA). Una banda distinta de 50 kDa para mIL-11 PEGilada con mPEG-SC de 20 kDa se observó en el gel de SDS-PAGE (Figura 1, franja 1), indicando que la mayor parte de mIL-11 que había sido obtenida después de la purificación era mono-PEGilada . Menos de 5% de la banda de 75 kDa (representando la mlL-11 di-PEGilada) y menos de 1% de mIL-11 sin reaccionar (18 kDa) también se detectaron. Con el análisis por cromatografía líquida de alta presión (HPLC) por exclusión de tamaño, un contenido ligeramente mayor de mIL-11 di-PEGilada (8%, tiempo de retención -14 min) fue detectado, mientras que la mIL-11 sin reaccionar (1%) permaneció igual (Figura 6). La pureza total de la mIL-11 mono-PEGilada ( PEG-mIL- 11-SC ) fue mayor de 90%, independientemente de los lotes de purificación que se analizaron.
Ejemplo 4: Preparación de la muteina mIL-11 mono- PEGilada: uso de PEGilacion especifica del N-terminal A. Preparación de la muteina mIL-11 mono-PEGilada utilizando el método de PEGilacion específico del N-terminal ( PEG-mIL-11-AD) Para introducir de manera selectiva el biopolímero PEG al N-terminal de una proteína, un exceso cuatro molar de metoxi PEG propionaldehído 20 kDa (Nektar Therapeutics , San Carlos, CA, EUA) se mezcló con la muteina mIL-11 purificada en acetato de sodio 50 mM, pH 5.0. Luego se adicionó cianoborohidruro de sodio (concentración final 5 mM) como agente reductor. La mezcla de reacción fue incubada a temperatura ambiente (20-25°C) durante 24 h con agitación suave. La reacción se interrumpió por un paso de purificación inmediato o almacenamiento a -20°C. El método de purificación del polímero PEG sencillo unido al N-terminal de mIL-11 (PEG-mIL-11-AD) fue idéntico al método descrito en el Ejemplo 3.
B. Caracterización Los métodos de análisis fueron los mismos que los del Ejemplo 3. Como en el caso del Ejemplo 3, también se detectaron tres bandas migrando alrededor de 75, 50 y 18 kDa, lo que representa mIL-11 di-PEGilada, mono-PEGilada y no tratada (no conjugada). Solo se detectó menos de 1% de mIL-11 di-PEGilada (75 kDa) y menos de 1% de mIL-11 sin reaccionar (18 kDa) (Figura 7A) . Con el análisis HPLC por exclusión de tamaño, la pureza total de la mIL-11 mono-PEGilada (tiempo de retención ~15 min) fue aproximadamente 92%, con 8% de mIL-11 di-PEGilada (tiempo de retención -14 min) y menos de 1% de mIL-11 sin reaccionar o no conjugada (Figura 7B) .
Ejemplo 5: Actividad biológica in vi ro de mIL-11 PEGilada A. Construcción de células Ba/F3 que expresan los receptores de IL-11 humana (BallG) La actividad biológica de mIL-11 PEGilada se determinó por un ensayo de proliferación celular in vitro utilizando células Ba/F3 que expresan gpl30 y la cadena a del receptor de IL-11, semejante al método descrito por Lebeau et al. (Lebeau et al., FEBS Letters 407: 141-147 ( 1997 ) ) .
En resumen, la linea celular Ba/F3 (DSMZ, Alemania) que expresa de manera estable los receptores de IL-11, gpl30 y la cadena del receptor de IL-11 (IL-11R), fue preparada por transducción de las células Ba/F3 con dos vectores retrovirales , MIN-IL-llR y MIH-gpl30, que expresan la cadena a del receptor de IL-11 (NCBI NM 004512.3) y gpl30 (NCBI NM 602184), respectivamente. Se preparó el plásmido retroviral pMIN-IL-HR por la inserción del gen de IL-11R en el vector pMIN ( Yu et al, Gene Therapy 10: 706-711 (2003)). El pMIH-gpl30 fue preparado por la sustitución del gen de resistencia a neomicina del pMIN con un gen de resistencia a higromicina, seguido por la inserción del gen gpl30. Para producir el vector retroviral MIN-IL-llR, pMIN-IL-HR fue transfectado en células HEK293T con pVM-GP y pVM-AE , expresando gag-pol y la envoltura anfotrópica, respectivamente, como lo mostró Yu et al., Gene Therapy 10: 706-711 (2003). El vector retroviral MIH-gpl30 fue generado mediante el mismo procedimiento que MIN-IL-llR, con excepción de que se transfecto pMIH-gpl30 en lugar de pMIN-IL-llR. Las células trans fectadas fueron crecidas durante 2 dias en medio DMEM con un contenido de 10% de suero fetal bovino. Después del cultivo, el virus libre de células fue preparado filtrando el sobrenadante del cultivo a través de un filtro de 0.45 ym. Para producir las células Ba/F3 que expresan la cadena a del receptor de IL-11, las células Ba/F3 fueron transducidas con el vector retroviral MIN-IL-llR y seleccionadas en presencia de 2 mg/mL de G418. La expresión de la cadena a del receptor de IL-11 se confirmó por citometria de flujo utilizando FITC-anti-IL-1 IR (Thermo Scientific, Rockford, IL, EUA) . Después las células que expresan de manera estable IL-11R fueron luego transducidas con el vector retroviral MIH-gpl30 y seleccionadas en presencia de 2 mg/mL de G418 y 0.5 mg/mL de higromicina. La expresión de IL-11R y gpl30 fue confirmada por citometria de flujo utilizando FITC-anti-IL- 1 IR y PE-anti-hgpl30 (BD Biosciences, San José, CA, EUA), respectivamente. Los clones individuales que expresan IL-11R y gpl30 fueron obtenidos por dilución limitada en presencia de 2 mg/mL de G418 y 0.5 mg/mL de higromicina. La producción del mRNA de la cadena del receptor de IL-11 y gpl30 a partir de las células fue confirmada por RT-PCR utilizando los siguientes de cebadores.
Para la cadena a del receptor de IL-11: ID SEC NO: 4: 5 ' -CGACGCGTATGAGCAGCAGCTGCTCAGGG- 3 ' (de avance ) ID SEC NO: 5: 5 ' -GAAGATCTCTACAGGTTTGGAGCTCCTGG-3 ' ( inverso ) Para gpl30: ID SEC NO: 6: 5 ' -ACGCGTATGTTGACGTTGCAGACT-3 ' (de avance) ID SEC NO: 7: 5 ' -GGATCCTCACTGAGGCATGTAGCC- 3 ' (inverso) B. Ensayo de la actividad biológica in vitro de las mlL-11 mono-PEGiladas La mIL-11 mono-PEGilada ( PEG-mIL-11-SC o PEG-mIL-11-AD) preparada utilizando el método especifico de la amina o el método especifico del N-terminal como se describe en los Ejemplos 3 y 4 anteriores, y la mIL-11 no conjugada preparada en el Ejemplo 1 fueron diluidas a partir de 1 pg/mL hasta 1 g/mL por diluciones sucesivas 10 veces y colocadas en placas de 96 pozos. 100 microlitors de células BallG (3 X 104 células/mL) fueron adicionadas a las muestras diluidas y crecidas durante 72 h a 37°C, 5% de C02 en placas de 96 pozos. Al final del cultivo, las células fueron tratadas con agente XTT (kit para la proliferación celular II, Roche, Indianapolis , IN, EUA) durante 4 h a 37 °C, 5% de C02. Las densidades ópticas de las muestras a 492 nm fueron medidas con un lector de microplacas (VERSA max, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EUA) . La densidad óptica a 690 nm fue restada de cada muestra para remover la señal de- dispersión de las células. Todos los ensayos se hicieron en triplicado.
Las preparaciones de las mIL-11 mono-PEGiladas, mIL-11 PEGiladas especificas de la amina (PEG-mIL-11-SC) y mIL-11 PEGiladas, especificas del N-terminal (PEG-mIL-11-AD) , mostraron actividad de proliferación celular como la mIL-11 no conjugada, indicando que la adición de PEG no interfirió con la interacción entre IL-11 y los receptores de IL-11 (Figura 8). Las curvas de dosis-respuesta de la mIL-11 PEGilada fueron graficadas por la absorbancia en el eje y contra la concentración de la muestra en el eje x. La curva sigmoidal dependiente de la dosis fue ajustada contra la ecuación logística.
Ejemplo 6: Actividad biológica in vivo de la muteina mlL- 11 PEGilada en ratas Las pruebas in vivo de la mIL-11 PEGilada se llevaron a cabo administrando 400 µ?/kq de PEG-mlL-11-AD, PEG-mIL- 11-SC o mIL-11 no conjugada en ratas Sprague-Dawley hembra de 10 semanas (SLC, Japón) utilizando inyección subcutánea sencilla. Se utilizo salina como el testigo vehículo. Se asignó a cinco animales por cada grupo. Las muestras de sangre fueron recolectadas de la vena de la cola en diferentes puntos temporales (0, 3, 6, 8, 10 y 12 días) después de la dosificación. Se midieron los recuentos de plaquetas utilizando el analizador de hematología automático (Abbott Lab, Abbott Park, IL, EUA) , de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Como se muestra en la Figura 9, los recuentos de plaquetas de los animales tratados con PEG-mIL-11-SC (A) o PEG-mIL-11-AD (B) aumentaron desde el día 3 y llegaron a un máximo en el dia 6. Los recuentos de plaquetas de las proteínas mIL-11 PEGiladas fueron significativamente mayores que las de mIL-11 sin tratar (*; P<0.001) durante el día 6, y significativamente superiores a las del testigo vehículo (**; P<0.05) en los días 6 y 8. No hubo diferencia con significado estadístico en el recuento de plaquetas entre mIL-11 no conjugada y el testigo vehículo en todos los puntos temporales. Estos resultados demostraron que las actividades biológicas de las proteínas mIL-11 PEGiladas fueron mayores que las de mlL-11 no conjugadas en ratas.
La habilidad para reducir la frecuencia de la dosis se analizó comparando la administración sencilla de PEG-mIL-11-SC o PEG-mIL-11-AD con la administración múltiple de mIL-11 no conjugada en rata. Ratas Sprague-Dawley hembra de diez semanas (5 ratas por grupo) con un peso de -250 g fueron inyectadas por vía subcutánea una vez con 400 ug/kg de mIL-11 PEGilada ( PEG-mIL-11-SC o PEG-mIL-11-AD) . Para el testigo se administraron 400 µg/kg de mIL-11 no conjugada como una inyección diaria durante siete días. Las muestras de sangre fueron recolectadas de la vena de la cola en diferentes puntos temporales (0, 3, 6, 8, 10 y 12 días) después de la dosificación. Los recuentos de plaquetas fueron medidos utilizando un analizador de hematología automático.
Como se muestra en la Figura 10, los recuentos de plaquetas de los animales tratados con PEG-mIL-11-SC (A) o PEG-mIL- 11-AD (B) aumentaron a partir del día 3 y llegaron a un máximo en el día 6, mientras que los recuentos de plaquetas de los animales tratados con mlL-11 no conjugada alcanzaron un máximo en el día 8. El nivel máximo de los recuentos de plaquetas de los grupos tratados con mIL-11 PEGilada fue semejante a las siete inyecciones consecutivas de mIL-11 no conjugada. Estos resultados demostraron que una sola dosis administrada de mIL-11 PEGilada sustituye eficazmente las siete dosis diarias administradas de mIL-11 no conjugada y da como resultado eficacia idéntica o aumentada en ratas.
Ejemplo 7: Farmacocinética de muteína mIL-11 PEGilada en rata Para determinar la farmacocinética de PEG-mIL-11-SC y PEG-mIL-11-AD en rata, ratas Sprague-Dawley hembra de 10 semanas (SLC, Japón) fueron administradas con 400 yg/kg de PEG-mIL-11-SC o PEG-mIL-11-AD utilizando una sola inyección subcutánea. Como testigos se utilizaron salina o 400 g/kg de mIL-11 no conjugada. A cada grupo se asignó cuatro a seis ratas. En resumen, las muestras de sangre fueron recolectadas de la vena de la cola en diversos puntos temporales (0.08, 0.5, 1, 2, 3, 6, 12, 24 , 48, 72 y 96 h) después de la dosificación. Después las muestras de plasma fueron separadas por centrifugación (2,500 g, 10 min), y se midió la concentración de PEG-mIL-11-SC , PEG-mlL- 11-AD o mIL-11 sin tratamiento utilizando el kit ELISA de IL-11 humana disponible en el comercio (R&D system, Minneapolis, MN, EUA) , de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Como proteínas patrón se utilizó PEG-mlL- 11-SC , PEG-mlL-11-AD o mIL-11 no conjugada. Se analizaron los parámetros farmacocinéticos con el programa informático inNonlin versión 5.2 (Pharsight Corp., Cary, NC , EUA) utilizando enfoques no compartimentales .
Como se muestra en la Figura 11, las concentraciones en plasma de PEG-mlL- 11-SC (A) o PEG-mlL- 11-AD (B) llegaron a un máximo a las 8 h y se mantuvieron hasta 72 h después de la administración. La concentración en plasma de mIL-11 no conjugada llegó a un máximo a la hora y se mantuvo hasta 12 h después de la administración. Los parámetros farmacocinéticos de PEG-mlL- 11-SC , PEG-mIL-11- AD o mIL-11 no conjugada se resumen en la Tabla 1 siguiente. La vida media de PEG-mIL-11-SC o -AD fue aproximadamente 5 veces más prolongada en comparación con la de mIL-11 no conjugada. El área bajo la curva fue de aproximadamente 8 veces o 5 veces mayor para PEG-mILll-AD o -SC en comparación con mIL-11 no conjugada utilizando la misma dosis. Este resultado demuestra que las proteínas mIL-11 PEGiladas se caracterizan por persistencia prolongada en comparación con mIL-11 no conjugada en ratas.
La Tabla 1 siguiente muestra los detalles farmacocinéticos de PEG-mIL-11 y mIL-11 en ratas después de una sola administración subcutánea.
TABLA 1 Estos ejemplos muestran las modalidades posibles de la presente invención. Aunque la invención ha sido mostrada y descrita específicamente con referencia a algunas modalidades de ésta, los expertos en la técnica entenderán que estas han sido presentadas como ejemplo solamente, y no como limitación, y diversos cambios en la forma y detalles pueden hacerse en ésta sin apartarse del espíritu y alcance de la invención. Así pues, la amplitud y alcance de la presente invención no deben ser limitados por ninguna de las modalidades ejemplares antes descritas, sino debe ser definida solo de acuerdo con las siguientes reivindicaciones y sus equivalentes.
Todos los documentos mencionados en la presente, incluidos los artículos de revistas y resúmenes, solicitudes de patente publicadas o U. S correspondientes o extranjeras, patentes publicadas o. extranjeras o cualquier otro documento, se incorpora cada uno completamente para referencia en la presente, incluidos todos los datos, tablas, figuras y texto presentado en los documentos mencionados.

Claims (29)

REIVINDICACIONES
1. Un conjugado que contiene una IL-11 humana mutante (mIL-11) y un polímero biocompatible en donde la secuencia de aminoácidos de la mIL-11 comprende la ID SEC NO: 2, con excepción de 5 o menos sustituciones de aminoácidos a condición de que, no obstante, el residuo de aminoácido correspondiente a la posición 1 de la ID SEC NO: 2 sea alanina y el residuo de aminoácido correspondiente a la posición 125 de la ID SEC NO: 2 sea asparagina, en donde el nivel de la actividad de proliferación celular in vitro del conjugado decrece en no menos de 5% en comparación con el nivel de actividad -de proliferación celular de una mIL-11 de referencia no conjugada, en donde las secuencias de aminoácidos de la mIL-11 en la mIL-11 conjugada y en la mIL-11 de referencia no conjugada son idénticas; y en donde la actividad de proliferación celular se determina poniendo en contacto la mIL-11 conjugada o la mIL-11 de referencia no conjugada a las células sensibles a IL-11 en virtud de la expresión de una cadena a del receptor de IL-11 o glucoproteína 130 (gpl30), el cultivo de las células in vitro y la medición de la proliferación celular resultante.
2. El conjugado de la reivindicación 1, caracterizado porque el polímero biocompatible se selecciona del grupo que consiste en polietilen glicol (PEG), polipropilen glicol, polioxietileno , politrimetilen glicol, poliácido láctico, poliácido acrílico, poliaminoácido, polialcohol vinílico, poliuretano, polifos faceno , poli ( L-lisina ) , polióxido de alquileno, polisacárido , dextrano, polivinil pirrolidona, polialcohol vinílico y poliacril amida.
3. El conjugado de la reivindicación 1, caracterizado porque el polímero biocompatible es polietilen glicol (PEG) .
4. El conjugado de la reivindicación 3, caracterizado porque el PEG es lineal o ramificado.
5. El conjugado de la reivindicación 1, caracterizado porque la mIL-11 es mono-PEGilada .
6. El conjugado de la reivindicación 3, caracterizado porque la PEG tiene un peso molecular de aproximadamente 2 kDa a aproximadamente 100 kDa.
7. El conjugado de la reivindicación 6, caracterizado porque el PEG tiene un peso molecular de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 60 kDa.
8. El conjugado de la reivindicación 6, caracterizado porque el PEG tiene un peso molecular de aproximadamente 2 kDa a aproximadamente 50 kDa.
9. El conjugado de la reivindicación 8, caracterizado porque el PEG tiene un peso molecular de aproximadamente 5 kDa a aproximadamente 20 kDa.
10. El conjugado de la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos de la mIL-11 comprende la ID SEC NO: 2.
11. El conjugado de la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos de la mIL-11 comprende la ID SEC NO: 1, con la excepción de que valina en la posición 31 es reemplazada con alanina, y aspartato en la posición 155 es reemplazada con asparagina.
12. El conjugado de la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos de la mIL-11 comprende la ID SEC NO: 3, con la excepción de que valina en la 87 posición 9 es reemplazada con alanina, y aspartato en la posición 133 es reemplazada con asparagina.
13. Un conjugado que contiene una IL-11 humana mutante 5 (mIL-11) y un polímero biocompatible en donde la secuencia de aminoácidos de la mIL-11 comprende una secuencia de aminoácidos al menos 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la ID SEC NO: 2, a condición de que, no obstante, el residuo aminoácido 10 correspondiente a la posición 1 de la ID SEC NO: 2 sea alanina y el residuo aminoácido correspondiente a la posición 125 de la ID SEC NO: 2 sea asparagina; y en donde el nivel de actividad de proliferación celular in vitro del conjugado en un ensayo de 15 proliferación celular disminuye por no menos de 5% en comparación con el nivel de la actividad de proliferación celular de una mIL-11 de referencia no conjugada, en donde las secuencias de aminoácidos de la mIL-11 en la mIL-11 conjugada y en la mIL-11 de referencia no 20 conjugada son idénticas; y en donde la actividad de proliferación celular se determina poniendo en contacto la mIL-11 conjugada o la mIL-11 de referencia no conjugada a las células sensibles a IL-11 en virtud de la expresión de una cadena a del 25 receptor de IL-11 y glucoproteína 130 (gpl30), el cultivo de las células in vitro y la medición de la proliferación celular resultante.
14. El conjugado de la reivindicación 13, caracterizado porque el polímero biocompatible se selecciona del grupo que consiste en polietilen glicol ( PEG ) , polipropilen glicol, polioxietileno, politrimetilen glicol, poliácido láctico, poliácido acrílico, poliaminoácido, polialcohol vinílico, poliuretano, polifosfaceno , poli ( L-lisina ) , polióxido de alquileno, polisacárido , dextrano, polivinil pirrolidona, polialcohol vinílico y poliacril amida.
15. El conjugado de la reivindicación 13, caracterizado porque el polímero biocompatible es polietilen glicol (PEG) .
16. El conjugado de la reivindicación 15, caracterizado porque el PEG es lineal o ramificado.
17. El conjugado de la reivindicación 13, caracterizado porque la mIL-11 es mono-PEGilada .
18. El conjugado de la reivindicación 153, caracterizado porque la PEG tiene un peso molecular de aproximadamente 2 kDa a aproximadamente 100 kDa.
19. El conjugado de la reivindicación 18, caracterizado porque el PEG tiene un peso molecular de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 60 kDa.
20. El conjugado de la reivindicación 18, caracterizado porque el PEG tiene un peso molecular de aproximadamente 2 kDa a aproximadamente 50 kDa.
21. El conjugado de la reivindicación 20, caracterizado porque el PEG tiene un peso molecular de aproximadamente 5 kDa a aproximadamente 20 kDa.
22. El conjugado de la reivindicación 13, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos de la mIL-11 comprende la ID SEC NO: 2.
23. El conjugado de la reivindicación 13, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos de la mIL-11 comprende la ID SEC NO: 1, con la excepción de que valina en la posición 31 es reemplazada con alanina, y aspartato en la posición 155 es reemplazada con asparagina.
24. El conjugado de la reivindicación 13, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos de la mIL-11 comprende la ID SEC NO: 3, con la excepción de que valina en la posición 9 es reemplazada con alanina, y aspartato en la posición 133 es reemplazada con asparagina.
25. Una composición farmacéutica que contiene el conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 y un portador aceptado para uso farmacéutico.
26. Un uso del conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 o la composición de la reivindicación 25 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de trobmocitopenia en un paciente que necesite de éste.
27. El uso de la reivindicación 26, caracterizado porque el paciente es un mamífero.
El uso de la reivindicación 27, caracterizado porqu mamífero es un humano.
29. Un uso del conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, o la composición de la reivindicación 25 para la fabricación de un medicamento para aumentar el recuento de plaquetas en un paciente que necesite de éste. El uso de la reivindicación 29, caracterizado porque paciente es un mamífero. El uso de la reivindicación 30, caracterizado porque mamífero es un humano. RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona conjugados biopoliméricos de un análogo de IL-11 (mIL-11) y un polímero biocompatible . La mIL-11 de la invención presenta una resistencia mejorada a la acidólisis y muestra estabilidad aumentada en comparación con rhIL-11. Los conjugados de la presente invención se caracterizan por una vida media en suero más prolongada y presentan prácticamente ninguna pérdida de actividad en comparación con la mIL-11 no conjugada correspondiente.
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