JPH06256394A - 修飾インターロイキン６ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 インターロイキン６ (以下ＩL-６という) 活
性を有する糖タンパク質またはポリペプチドにポリエチ
レングリコール (ＰＥＧ) を結合してなる、均一度の高
い修飾ＩL-６、その製造方法およびこの修飾ＩL-６の血
小板形成促進剤。 【効果】 本発明の修飾ＩL-６は、既知のＩL-６活性を
有する糖タンパク質またはポリペプチドより優れた機能
を有しており、かつ均一度が高いので医薬品として有用
である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、インターロイキン６
(以下ＩL-６という) 活性を有する糖タンパク質または
ポリペプチドにポリエチレングリコール (ＰＥＧ) を結
合してなる、均一度の高い修飾ＩL-６、その製造方法お
よびこの修飾ＩL-６の血小板形成促進剤としての用途に
関する。

【０００２】ここで、ＩL-６活性とは、Ｂリンパ球の最
後の分化に関わる活性であり、同時にＴリンパ球（Garm
an, R.D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:76
29,1987）、形質細胞・多発性骨髄腫細胞（Van Snick e
t al., J. Exp. Med., 165:641, 1987.）、肝細胞（Gau
ldie, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:72
51, 1987.）、神経細胞（Seed, B. and Aruffo, A., Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:3365, 1987. ）、造血
幹細胞（Ikebuti, K., 実験医学、第７巻、 No.1:31, 1
989. ）の細胞系列に対する刺激作用あるいは急性期反
応の制御（Andus, T. et al., 実験医学、第７巻、 No.
1:37, 1989. ）などを総合したものである。

【０００３】また造血細胞系への作用に関しては、最近
報告された血小板形成促進作用も、本発明のＩL-６活性
として挙げることができる (Ishibashi, T. et al., BL
OOD,74, No.４, 1989) 。抗ガン剤を高投与された担ガ
ン患者においては血中の血小板数が極度に低下すること
があり、このような場合血小板数低下に起因する種々の
障害、例えば異常出血 (出血過多等) がおこり易くな
る。ＩL-６の血小板形成能は、これらの抗ガン剤の投与
に伴う副作用を軽減させることが期待される (McNiece,
I.K. et al., Exp. Hematol., 16:807, 1988)。本発明
のＰＥＧ修飾ＩL-６は、既知のＩL-６活性を有する糖タ
ンパク質またはポリペプチドより優れた機能を有してお
り、かつ均一度が高いので医薬品として利用できる。

【０００４】

【従来の技術】ＩL-６活性を有する糖タンパク質または
ポリペプチドの一例として、ヒトＩL-６ (以下 hＩL-６
という) の製造技術については、既に多くの報告があ
る。例えば、遺伝子組換え技術によらない方法として
は、ヒトＴ細胞とヒト癌細胞とのヒトＴ融合細胞による
生産方法 (Okada, M. et al., J. Exp. Med., 157:583,
1983)、あるいはヒトＴ細胞白血球ウイルスにより形質
転換されたヒトＴ細胞による生産方法 (特開昭61-11502
4号) が挙げられる。また遺伝子組換え技術による方法
としては、 hＩL-６をコードするＤＮＡにより形質転換
された哺乳動物細胞あるいは細菌による生産方法も確立
されている (特開昭63-42688号、特開昭63-157996号、
特表平1-503354号) 。これらの方法で生産される hＩL-
６は、生産細胞が哺乳動物細胞である場合には糖タンパ
ク質として、細菌細胞である場合にはポリペプチドとし
て、それぞれ生産されるが、いずれのものもＩL-６活性
を有している (特開昭63-42688号、特開昭63-157996
号、特表平1-503354号) 。

【０００５】hＩL-６のｃＤＮＡ塩基配列より決定した
成熟ポリペプチド部分は本来184個のアミノ酸残基から
なっているが、そのＮ末端において１以上のアミノ酸残
基の付加あるいは27アミノ酸残基の欠失があるもの、ま
たはそのＣ末端において約50アミノ酸残基の欠失 (ある
いは有害とならない置換) があるものも、依然として活
性を有していることが知られている (特開昭63-157996
号、特表平1-503354号、欧州特許公報0363083号、Brake
nhoff, J.P.J., J. Immunol., 143:1175, 1989) 。

【０００６】一般に高分子のポリペプチドを医薬として
用いる場合にその血中滞留時間を増加させるための方法
としては、ポリエチレングリコール化、デキストラン修
飾、グルタミン酸とリジンのポリマー（Liu, F.T. et a
l., Biochemistry, 18:690,1979. ）、プルラン化、ガ
ンマグロブリン化、ポリアスパラギン酸誘導体修飾（Ok
ada, M. et al., Int. Archs. Allergy Appl. Immun.,
66:189, 1981. ）、スマンクス化（前田浩ら、癌と化学
療法、11:814, 1984. ）、脂肪酸修飾（Sagawa, A. et
al., Int. Archs. Allergy Appl. Immun., 76:79, 198
5. ）などが知られている。またアスパラギナーゼ、ス
ーパーオキサイドディスムターゼ、ウリカーゼなどのヒ
ト以外の由来の酵素類について、ポリエチレングリコー
ルで化学修飾を行うことにより血中クリアランス値の延
長が認められている。

【０００７】ＩL-６を生体に投与した場合、血中半減期
が非常に短いことが明らかとなっている (Castell, J.
V. et al., Eur. J. Biochem., 177:357, 1988) 。した
がって、ＩL-６の血中での半減期を延長させ、その薬効
の持続をはかることが望ましい。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】ＩL-６活性を有する糖
タンパク質またはポリペプチドをＰＥＧ修飾して得られ
るＰＥＧ修飾ＩL-６には、顕著な薬効の増強がみられ、
それについて、本発明者らは先に特許出願（特願平2-25
0460号）している。一般に医薬品は物質としてより均一
度の高いものが望まれる。しかし、ポリエチレングリコ
ール修飾ポリペプチドあるいはＰＥＧ修飾タンパク質
は、修飾剤であるＰＥＧに分子量分布があること、そし
てＰＥＧ修飾率に分布があることから、品質が不均一と
なるため、これらを医薬品として用いるためには、何ら
かの製造方法を講じ、均一度を高める必要がある。特に
工業的生産規模に耐えうる製造方法により、より均一度
の高いＰＥＧ修飾ポリペプチドあるいはＰＥＧ修飾タン
パク質を製造し、医薬品として提供する必要がある。

【０００９】ＰＥＧを結合させて得られたＰＥＧ修飾Ｉ
L-６について、イオン交換、疎水性相互作用、逆相、ゲ
ル濾過等の各種モードのクロマトグラフィーによる分離
を試みたが、より均一度の高いＰＥＧ修飾ＩL-６を得る
のに十分な分離はできなかった。逆相及びゲル濾過モー
ドのクロマトグラフィーでは、ある程度の分離は可能で
あったが、逆相クロマトグラフィーの場合、有機溶媒を
使用するためタンパク質の変性が生じる恐れがあり、ま
た工業的規模の生産には適していない。また、ゲル濾過
の場合には、通常使用されている長さ (〜1.５ｍ) のカ
ラムでは十分な分離はできなかった。さらにカラム長を
長くすることは取り扱いが不便であり、また、ゲルの圧
縮や圧損失の増加などがあり、適当でないと共に工業的
生産には適さない。以上のように従来よく行なわれる方
法では均一度の高いＰＥＧ修飾ＩL-６の製造方法として
は問題があった。

【００１０】そこで本発明者らは、ゲル濾過カラムとし
て合成ポリマー系充填剤を使用し、さらに、分離能を上
げるためにリサイクルクロマトグラフィー法 (recyclin
gchromatography, 循環クロマトグラフィー法) を用い
て分離を行なうことにより、より均一度の高いＰＥＧ修
飾ＩL-６を得ることが可能であることを見出し、本発明
を完成するに至った。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明は、インターロイ
キン６活性を有する糖蛋白質またはポリペプチドにポリ
エチレングリコールを結合してなる修飾インターロイキ
ン６であって、ShodexOHpak KB804（昭和電工（株）
製：ポリヒドロキシメタクリレート）カラム（径８mm×
長さ30cm）を用い、150mMNaClを含む10mMリン酸緩衝液
（pH7.0）を移動相として、タンパク質として10-50μg
のサンプルを毎分0.5mlの流速で高速液体クロマトグラ
フィを行って分析したときのピーク巾（Ｖw）が約1.2ml
より小さいものであることを特徴とする、修飾インター
ロイキン６にある。なお、ここでピーク巾とはピークの
両側に接線を引き、基線（試料濃度が０のときに検出器
の信号によって描かれる線）との交点を求め、得られた
二つの交点の距離を測って求められる数値である。

【００１２】ＩL-６活性を有する糖蛋白質またはポリペ
プチドにＰＥＧを結合させる態様としては、ポリペプチ
ドのアミノ酸のアミノ基を介する態様と、アミノ酸のカ
ルボキシル基を介する態様があり、いずれでもよいが、
特に前者が好ましい。このアミノ酸を介する態様におい
ては、ＩL-６活性を有する分子中の少なくとも１個のア
ミノ基の水素原子を、以下に示す式［Ｉ］または式［I
I］で表される基で置換する。

【００１３】

【化３】

【００１４】(式中、ｎは７ないし６00の正の整数を、
Ｒ₁ は炭素数１ないし３のアルキル基を示す。)

【００１５】

【化４】

【００１６】(式中、ｎ、ｍは同一または異なる７ない
し６00の正の整数を、Ｒ_1,Ｒ₂ は同一または異なる炭素
数１ないし３のアルキル基を示す。) 本発明におけるＩL-６活性を有する糖タンパク質あるい
はポリペプチドとして好ましいのは、実質的に配列番号
１のアミノ酸配列を有するヒトＩL-６であり、その生産
にあたっては、遺伝子組換えによる方法あるいはそれに
よらない方法のいずれをも用いることができる。

【００１７】ここで「実質的」とは、アミノ酸配列が同
一である場合のほかに、天然 hＩL-６タンパクとの間に
有害な機能的非類似性を生じさせないような１以上のア
ミノ酸変化 (すなわち欠失、付加、挿入、置換) を含み
うることを意味する。このようなアミノ酸変化の例とし
ては、前述の従来技術に挙げた hＩL-６ (特開昭63-157
996号、特表平1-503354号および欧州特許公開0363083号
参照) がある。

【００１８】それらの中でも、遺伝子組換え大腸菌によ
り産生された hＩL-６が、純度よく均質大量に入手でき
るので好ましい。特に、前記アミノ酸配列あるいはその
Ｎ末端にメチオニン残基の付加されたアミノ酸配列ある
いはメチオニン−リジンジペプチドが付加されたアミノ
酸配列（配列番号２）を有するポリペプチドがさらに好
ましい。

【００１９】上記の hＩL-６は、例えば特表平1-503354
(ジェネティックス・インスティテュート・インコーポ
レイテッド) に開示の方法に従い得ることができ、また
hＩL-６遺伝子の塩基配列 (例えば Haegeman, G. et a
l., Eur. J. Biochem., 159:625, 1986)を参考に、Souz
a らの方法 (特表昭63-500636)に準じて、 hＩL-６のア
ミノ酸配列をコードするＤＮＡを化学合成し、大腸菌に
組み込み発現させて得ることができる。

【００２０】本発明に用いられる化学修飾基に関し、上
式中、ｍ、ｎはそれぞれの平均値を示す。ｍおよびｎは
同一でも異なっていてもよいが、ｍとｎが同一であって
約７ないし６00、好ましくは約７ないし250、さらに好
ましくは約30ないし150であるのがよい。本発明で用い
られるＰＥＧとしては、平均分子量３00ないし３0000の
ものが好ましい。中でも平均分子量1000ないし２0000の
ものがさらに好ましい。上式中、Ｒ_1,Ｒ_2,で示される水
酸基の保護基としては、例えば炭素数１ないし３のアル
キル基 (例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル
基、イソプロピル基など) が挙げられ、とりわけメチル
基が好ましい。

【００２１】ＩL-６活性を有するポリペプチド (以下Ｉ
L-６ポリペプチドという) のアミノ基をＰＥＧで修飾す
るには、ＰＥＧをスクシンイミドを介して結合させる方
法 (式［Ｉ］) とトリアジンを介して結合させる方法
(式［II］) との２種類の方法が考えられるが、前者が
より好ましい。スクシンイミドを介する修飾方法として
は、一般式 HO-(CH₂CH₂O)_n-R₁ ［III］ (式中、ｎおよびＲ₁ は前記と同じ意味である) で表さ
れるＰＥＧと、式

【００２２】

【化５】

【００２３】で表される化合物を反応させ、

【００２４】

【化６】

【００２５】(式中、ｎおよびＲ₁ は前記と同じ意味で
ある) で表される化合物を得、ついでこれにＩL-６ポリ
ペプチドを反応させることにより行なわれる。化合物
［III］と［IV］を反応させ［Ｖ］を得る操作は、ほぼ
１00％反応の終了した形態で化学試薬活性型ＰＥＧ (日
本油脂) として販売されているため、これを使用するこ
とができる。

【００２６】活性型ＰＥＧすなわち化合物［Ｖ］とＩL-
６ポリペプチドを反応させ、修飾ＩL-６を得るために
は、例えば0.25M ホウ酸ナトリウム緩衝液 (pH 8.0-8.5
)中で化合物［Ｖ］と４℃で１時間〜２時間反応させ
る。この場合、活性型ＰＥＧの分解を避けるために、活
性型ＰＥＧを数度に分けて添加してもよい。反応終了
後、修飾ＩL-６を得るため、例えばゲル濾過およびイオ
ン交換クロマトグラフィーを用いて未反応の化合物
［Ｖ］および未反応のＩL-６ポリペプチドを分離除去す
る。次にトリアジンを介して修飾する方法としては、一
般式 HO-(CH₂CH₂O)_n-R₁ ［III］ (式中、ｎおよびＲ₁ は前記と同じ意味である) で表さ
れるＰＥＧと、式

【００２７】

【化７】

【００２８】で表される化合物を反応させ、一般式

【００２９】

【化８】

【００３０】(式中、ｎ、ｍは同一または異なる７ない
し６00の正の整数を、Ｒ_1,Ｒ₂ は同一または異なる炭素
数１ないし３のアルキル基を示す。)で表される化合物
を得、ついでこれにＩL-６ポリペプチドを反応させるこ
とにより行われる。

【００３１】活性型ＰＥＧすなわち化合物［VII］とＩL
-６ポリペプチドを反応させ、修飾ＩL-６を得るために
は、例えば0.25M ホウ酸ナトリウム緩衝液 (pH10.0) 中
で化合物［III］と４℃〜室温で２〜20時間反応させ
る。この場合、活性型ＰＥＧの分解を避けるために、数
度に分けて活性型ＰＥＧを添加してもよい。反応終了
後、修飾ＩL-６を得るため、例えばゲル濾過およびイオ
ン交換クロマトグラフィーを用いて未反応の化合物［VI
I］および未反応のＩL-６ポリペプチドを分離除去す
る。

【００３２】ＩL-６ポリペプチドのカルボキシル基をＰ
ＥＧで修飾するには、例えば、一般式 H₂NCH₂CH₂CH₂O-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂CH₂NH₂ ［VIII］ (式中、ｎは前記と同じ意味である)で表される活性ＰＥ
Ｇを反応させればよい。

【００３３】本発明のＰＥＧ修飾ＩL-６は、マウスに投
与した時、もとの未修飾のＩL-６ポリペプチドあるいは
糖鎖の付加したＩL-６よりもはるかに優れた血小板増加
活性を有し、しかも毒性は低いので血小板形成促進剤と
して有効に用いることができる。本発明の均一度の高い
ＰＥＧ修飾ＩL-６は、リサイクルクロマトグラフィ法を
用いたゲル濾過ＨＰＬＣ法により精製して製造すること
ができ、このような方法で製造されたＰＥＧ修飾ＩL-６
も本発明に包含される。リサイクルクロマトグラフィ法
はPorath and Bennich (Arch.Biochem.Biophys. suppl.
1:159, 1962)により考案された方法で、比較的長さの短
いカラムを用いて高分解能を得ようとするものである。
すなわち、最初のカラム溶出操作により分離した画分を
バルブ等を使用して元のカラムに戻し、再び溶出操作を
行う。これを繰り返すことにより、高い分解能を得るこ
とができる（図１）。リサイクル法には１本（あるいは
直列に連結した複数）のカラムを用いる通常の方法（図
１Ａ）の他に、複数のカラムを切換えバルブを介して接
続し、バルブを切換えることによりサンプルを各カラム
に交互に導入するオルタネイティブ・リサイクル(alter
native recycle)法（図１Ｂ）があるが、本発明の目的
にはどちらの方法を用いてもよく、いずれでも優れた分
離を得ることが期待できる。

【００３４】この精製方法に用いるカラムとしては、ポ
リビニル系あるいはポリメタクリレート系などの合成ポ
リマー系の材質の充填剤のものが適している。シリカ系
の充填剤を用いる場合には移動相中に有機溶媒の添加、
あるいはＰＥＧの添加を行なう必要がある。この精製法
は、工業的規模の生産に適しており、本精製法により製
造された均一度の高いＰＥＧ修飾ＩL-６は、医薬品、特
に血小板形成促進剤として用いることができる。

【００３５】本発明のＰＥＧ修飾ＩL-６を血小板形成促
進剤として用いるには、例えば哺乳動物の各種急性もし
くは亜急性の血球低下の治療を目的として経口的もしく
は非経口的に投与する。投与するにあたっては、ＰＥＧ
修飾ＩL-６を薬理学的に許容しうる賦形剤、希釈剤など
と混合し、それ自体公知の方法で、すなわち経口剤とし
て例えば錠剤、カプセル剤として、あるいは注射剤とし
て上記哺乳動物に投与する。

【００３６】ＰＥＧ修飾ＩL-６の１日投与量は、修飾Ｉ
L-６中のタンパク質量として約５μｇないし５00mg／ヒ
ト、さらに好ましくは約２00μg ないし50mg／ヒトとな
る修飾ＩL-６の量である。

【００３７】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳細に説
明するがこれらの実施例は本発明の技術的範囲を何ら限
定するものではない。 〔参考例〕hＩL-６遺伝子の塩基配列 (例えば Haegema
n, G. et al., Eur. J. Biochem.,159:625, 1986)を参
考に、Souza らの方法 (特表昭63-500636号) に準じ
て、配列番号２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを化
学合成し、大腸菌に組み込み発現させた。

【００３８】上記 hＩL-６を菌体内に蓄積した大腸菌の
細胞を、3500×ｇで10分間遠心分離して300ｇ回収し、
特開昭63-157996の方法に従って hＩL-６の抽出、可溶
化、リフォールディングを行ない、Ｑ−セファロース及
びＣＭ−セファロースカラムクロマトグラフィーを行
い、 hＩL-６約2.９ｇを得た。得られた hＩL-６をＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥで調べたところ、単一バンドであり、かつ
アミノ酸組成から計算された分子量21K とほぼ一致して
いた。

【００３９】また、アミノ酸配列分析より、予想された
Ｎ末端アミノ酸配列 (すなわちMetLys Ala Pro・・・) を
確認した。

【００４０】

【実施例１】ＰＥＧ化試薬として、平均分子量が約12,0
00のＰＥＧのコハク酸エステルをＮ−ヒドロキシスクシ
ンイミドにより活性化したＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ドポリエチレングリコール (日本油脂に合成を委託)
(以下活性型ＰＥＧ12Ｍという) を使用して、参考例で
示した遺伝子組換えにより大腸菌中で生産されたhIL-６
をＰＥＧ修飾し、そのＰＥＧ修飾体をリサイクル法を用
いたゲル濾過分離法により分画した。

【００４１】0.１M ホウ酸ナトリウム緩衝液 (pH8.５)
15mlに溶解したhIL-６ (16mg) 溶液に、氷浴中で攪拌し
ながら 920mgの活性型ＰＥＧ12Ｍを10回に分けて20分毎
に添加し、反応させた。反応終了後、YM30限外濾過膜
(Amicon) を用い反応液を4.5ml に濃縮後、30mlのＰＢ
Ｓ（10mMリン酸緩衝液 pH7.0、150mM NaCl) を用いて緩
衝液交換を行なった。これを、TSKgel G4000PW (東ソ
ー、φ7.８mm×60cm) カラム２本を図１のようにオルタ
ネイティブ・リサイクルクロマトグラフィーを行なうた
めにセットし、予めＰＢＳで平衡化しておいたシステム
に添加し、同緩衝液で流速１ml／min 、８回リサイクル
を行なって溶離し、ＰＥＧ修飾ＩL-６の分画を行なっ
た。得られたＰＥＧ修飾ＩL-６の収量は３mg（タンパク
質として、以下の実施例は全て同じ) であった。

【００４２】

【実施例２】0.１M ホウ酸ナトリウム緩衝液 (pH8.５)
８mlに溶解した参考例の hＩL-６ (8.５mg) 溶液に、氷
浴中にて攪拌しながら 388mgの活性型ＰＥＧ12Ｍを８回
に分けて20分毎に添加し、反応させた。反応終了後、YM
30限外濾過膜 (Amicon) を用い反応液を４mlに濃縮後、
30mlのＰＢＳを用いて緩衝液交換を行なった。これを予
めＰＢＳで平衡化したTSKgel G4000PW (東ソー、φ7.８
mm×60cm) にのせ、実施例１と同様にオルタネイティブ
・リサイクル法を用いて溶離し、ＰＥＧ修飾ＩL-６の分
画を行なった。得られたＰＥＧ修飾ＩL-６の収量は2.７
mgであった。

【００４３】

【実施例３】0.１M ホウ酸ナトリウム緩衝液 (pH8.５)
８mlに溶解した参考例の hＩL-６ (8.５mg) 溶液に、氷
浴中にて攪拌しながら 194mgの活性型ＰＥＧ12Ｍを８回
に分けて20分毎に添加し、反応させた。反応終了後、YM
30限外濾過膜 (Amicon) を用い反応液を４mlに濃縮後、
30mlのＰＢＳを用いて緩衝液交換を行なった。これを予
めＰＢＳで平衡化したTSKgel G4000PW (東ソー、φ7.８
mm×60cm) にのせ、実施例１と同様にオルタネイティブ
・リサイクル法を用い、溶離を行ない、ＰＥＧ修飾ＩL-
６の分画を行なった。得られたＰＥＧ修飾ＩL-６の収量
は2.４mgであった。

【００４４】

【実施例４】0.１M ホウ酸ナトリウム緩衝液 (pH8.５)
30mlに溶解した参考例の hＩL-６ (40mg) 溶液に、氷浴
中で攪拌しながら 900mgの活性型ＰＥＧ12Ｍを５回に分
けて20分毎に添加し、反応させた。反応終了後、YM30限
外濾過膜 (Amicon) を用い反応液を４mlに濃縮後、15ml
のＰＢＳを用いて緩衝液交換を行なった。これを予めＰ
ＢＳで平衡化したスーパーデックスG200カラム (Pharma
cia, φ1.６cm×60cm)にのせ、同緩衝液を用いて0.5ml/
min の流速で溶離を行ない、ピークの頂点を中心として
溶離液15mlを集めＰＥＧ修飾ＩL-６の分画を行なった。
得られたＰＥＧ修飾ＩL-６の収量は13.2mgであった。

【００４５】

【実施例５】実施例１〜４で調製したＰＥＧ修飾ＩL-６
について、各々、ＰＥＧ修飾率の測定を行なった。ＰＥ
Ｇ修飾率の測定は、Stocksらの方法 (Anal. Biochem.,
154:232, 1986)に従って、0.１M リン酸ナトリウム緩衝
液 (pH8.０) 中で7.５％ Fluorescamine(4-phemylspiro
［furan-2(3H), 1'-phthalan］-3,3'-dione)と反応さ
せ、蛍光強度 (λex=390nm, λex=475nm) を測定するこ
とによって未修飾アミノ基率を出すことにより行なっ
た。結果を表１に示す。 表 １ ───────────────────── ＰＥＧ修飾ＩL-６ ＰＥＧ修飾率 (％)^* ───────────────────── 実施例１ ５２ 実施例２ ４８ 実施例３ ３４ 実施例４ ３６ ───────────────────── * 分子当りの平均ＰＥＧ修飾率

【００４６】

【実施例６】実施例１〜４で調製したＰＥＧ修飾ＩL-６
について、下記の条件下でゲル濾過ＨＰＬＣを用いて均
一度を分析した。結果を図２に示す。図２の各ピークの
両側に接線を引き、基線（試料濃度が０のときに検出器
の信号によって描かれる線）との交点を求め、得られた
二つの交点の距離を測ってピーク巾Ｖwを求めた（表
２）。実施例１〜３で調製したＰＥＧ修飾ＩL-６は、実
施例４（従来法）で調製されたＰＥＧ修飾ＩL-６に比
べ、ピーク巾が狭い左右対称なピークとして溶離されて
きた。この結果はリサイクルクロマトグラフィを用いて
調製したＰＥＧ修飾ＩL-６では、従来法で調製されたＰ
ＥＧ修飾ＩL-６に比べて、均一度が高くなっていること
を示す。 ・ゲル濾過ＨＰＬＣ条件 カラム： Shodex OHpak KB804（昭和電工（株）
製：ポリヒドロキシメタクリレート）、径８mm×長さ30
cm 移動相： 10mMリン酸緩衝液(pH7.0)、150mM NaCl 流速： 0.5 ml/min 検出： 280nm吸光度 温度： 室温 サンプル濃度：0.2-0.5 mg/ml （タンパク質として） サンプル液量：50-100μl 機器： ポンプ・島津製作所LC-7A、検出器・Wat
ers社model481 表 ２ ───────────────────────── ＰＥＧ修飾ＩL-６ ピーク巾Ｖw(ml) Ｖw₄ ^* との比 ────────────────────────── 実施例１ 1.05 0.64 実施例２ 0.9 0.55 実施例３ 0.9 0.55 実施例４ 1.65 − ────────────────────────── ^* 実施例4のPEG 修飾1L-6のピーク巾

【００４７】

【実施例７】実施例１〜４で調製したＰＥＧ修飾ＩL-６
について、下記の条件下で逆相ＨＰＬＣを用いて均一度
を分析した。結果を図３に示す。図３の各ピークより実
施例６と同様にしてピーク巾を求めて比較した結果、実
施例１、２、３で調製したＰＥＧ修飾ＩL-６のピーク巾
の実施例４で調製したＰＥＧ修飾ＩL-６のピーク巾に対
する比は、それぞれ0.55、0.45、0.55であった。この結
果はリサイクルクロマトグラフィを用いて調製したＰＥ
Ｇ修飾ＩL-６では、従来法で調製されたＰＥＧ修飾ＩL-
６に比べて、均一度が高くなっていることを示す。 ・逆相ＨＰＬＣ条件 カラム： Shodex RSpak D4-613（昭和電工（株）
製：ブチル基結合ポリメタクリレート）、径６mm×長さ
15cm 溶離： 0.1%トリフルオロ酢酸中アセトニトリル
25%-45%の直線濃度勾配溶離法（20分間） 流速： 0.5 ml/min 検出： 280nm吸光度 温度： 室温 サンプル濃度：0.2-0.5 mg/ml （タンパク質として） サンプル液量：50-100μl 機器： 日立製作所ポンプ・L-6200とL-6000、検出器・
L-4000

【００４８】

【実施例８】ＰＥＧ化試薬として、平均分子量が約4500
のＰＥＧのコハク酸エステルをＮ−ヒドロキシスクシン
イミドにより活性化したＮ−ヒドロキシスクシンイミド
ポリエチレングリコール (以下、活性型ＰＥＧ１とい
う) を使用して、遺伝子組換えにより大腸菌中で生産さ
れた参考例の hＩL-６をＰＥＧ修飾し、そのＰＥＧ修飾
体を、リサイクル法を用いたゲル濾過分離法により分画
した。

【００４９】0.１M ホウ酸ナトリウム緩衝液 (pH8.５)
８mlに溶解した hＩL-６ (8.５mg)溶液に、氷浴中で攪
拌しながら 146mgの活性型ＰＥＧ１を８回に分けて20分
毎に添加し、反応させた。反応終了後、YM10限外濾過膜
を用い反応液を４mlに濃縮後、30mlのＰＢＳを用いて緩
衝液交換を行なった。これを予めＰＢＳで平衡化したTS
Kgel G4000PWにのせ、実施例１と同様にオルタネイティ
ブ・リサイクル法を用いて溶離し、ＰＥＧ修飾ＩL-６の
分画を行なった。得られたＰＥＧ修飾ＩL-６の収量は2.
６mgであった。

【００５０】

【実施例９】0.１M ホウ酸ナトリウム緩衝液 (pH8.５)
８mlに溶解した参考例の hＩL-６ (8.５mg) 溶液に、氷
浴中で攪拌しながら73mgの活性型ＰＥＧ１を４回に分け
て20分毎に添加し、反応させた。反応終了後、YM10限外
濾過膜を用い反応液を４mlに濃縮後30mlのＰＢＳを用い
て緩衝液交換を行なった。これを予めＰＢＳで平衡化し
たTSKgel G4000PWにのせ、実施例１と同様にオルタネイ
ティブ・リサイクル法を用いて溶離し、ＰＥＧ修飾ＩL-
６の分画を行った。得られたＰＥＧ修飾ＩL-６の収量は
2.４mgであった。

【００５１】

【実施例10】0.１M ホウ酸ナトリウム緩衝液 (pH8.５)
１00mlに溶解した参考例の hＩL-６(50mg) 溶液に、氷
浴中で攪拌しながら 560mgの活性型ＰＥＧ１を６回に分
けて20分毎に添加し、反応させた。反応終了後、YM10限
外濾過膜を用い反応液を10mlに濃縮後50mlのＰＢＳを用
いて緩衝液交換を行なった。これを予めＰＢＳで平衡化
したスーパーデックスG200 (Pharmacia, φ1.６cm×60c
m) にのせ、同緩衝液を用いて0.5 ml／min の流速で溶
離を行ない、ピークの頂点を中心として溶離液15mlを集
めＰＥＧ修飾ＩL-６の分画を行なった。得られたＰＥＧ
修飾ＩL-６の収量は2.４mgであった。

【００５２】

【実施例11】実施例８〜10で調製したＰＥＧ修飾ＩL-６
について、各々、実施例５と同様の方法でＰＥＧ修飾率
の測定を行なった。結果を表３に示す。 表 ３ ───────────────────── ＰＥＧ修飾ＩL-６ ＰＥＧ修飾率（％）^* ───────────────────── 実施例８ ４７ 実施例９ ４０ 実施例10 ３０ ───────────────────── ^* 分子当りの平均ＰＥＧ修飾率

【００５３】

【実施例12】実施例８〜10で調製したＰＥＧ修飾ＩL-６
について、実施例６と同じゲル濾過ＨＰＬＣによって均
一度を分析した。結果を図４に示す。図４の各ピークよ
り実施例６と同様にしてピーク巾Ｖwを求めて比較した
（表４）。実施例８、９で調製したＰＥＧ修飾ＩL-６
は、実施例10（従来法）で調製されたＰＥＧ修飾ＩL-６
に比べ、ピーク巾が狭い左右対称なピークとして溶離さ
れてきた。この結果はリサイクルクロマトグラフィを用
いて調製したＰＥＧ修飾ＩL-６では、従来法で調製され
たＰＥＧ修飾ＩL-６に比べて、均一度が高くなっている
ことを示す。

【００５４】 表 ４ ────────────────────────── ＰＥＧ修飾ＩL-６ ピーク巾Ｖw(ml) Ｖw₁₀ ^*との比 ────────────────────────── 実施例８ 0.75 0.5 実施例９ 0.75 0.5 実施例10 1.5 − ────────────────────────── ^* 実施例10のPEG修飾1L-6のピーク巾

【００５５】

【実施例13】実施例３、４、９、10で調製したＰＥＧ修
飾ＩL-６および参考例で調製した未修飾のヒトＩL-６
を、Balb/cマウス（８週令、雌；ｎ＝５）の皮下に１日
１回タンパク質として１μｇ（未修飾ＩL-６は10μｇ）
ずつ５日間投与し、最終投与翌日に採血して末梢血中の
血小板数を計数した。その結果を表５に示す。 表 ５ ─────────────────────────── ＰＥＧ修飾ＩL-６ 血小板数 (% of normal control) ─────────────────────────── 実施例３ 266.4 実施例４ 233.0 実施例９ 243.0 実施例10 198.4 未修飾ＩL-６ 145.1 ───────────────────────────

【００５６】

【発明の効果】本発明のＰＥＧ修飾ＩL-６は、既知のＩ
L-６活性を有する糖タンパク質またはポリペプチドより
優れた機能を有しており、かつ均一度が高いので医薬品
として有用である。

【００５７】

【配列表】 配列番号：１ (1) 配列の長さ：１８５ (2) 配列の型：アミノ酸 (3) 配列の種類：ポリペプチド (4) 起源 生物名：ヒト (5) 配列 ALA PRO VAL PRO PRO GLY GLU ASP SER LYS ASP VAL ALA ALA PRO 15 HIS ARG GLN PRO LEU THR SER SER GLU ARG ILE ASP LYS GLN ILE 30 ARG TYR ILE LEU ASP GLY ILE SER ALA LEU ARG LYS GLU THR CYS 45 ASN LYS SER ASN MET CYS GLU SER SER LYS GLU ALA LEU ALA GLU 60 ASN ASN LEU ASN LEU PRO LYS MET ALA GLU LYS ASP GLY CYS PHE 75 GLN SER GLY PHE ASN GLU GLU THR CYS LEU VAL LYS ILE ILE THR 90 GLY LEU LEU GLU PHE GLU VAL TYR LEU GLU TYR LEU GLN ASN ARG 105 PHE GLU SER SER GLU GLU GLN ALA ARG ALA VAL GLN MET SER THR 120 LYS VAL LEU ILE GLN PHE LEU GLN LYS LYS ALA LYS ASN LEU ASP 135 ALA ILE THR THR PRO ASP PRO THR THR ASN ALA SER LEU LEU THR 150 LYS LEU GLN ALA GLN ASN GLN TRP LEU GLN ASP MET THR THR HIS 165 LEU ILE LEU ARG SER PHE LYS GLU PHE LEU GLN SER SER LEU ARG 180 ALA LEU ARG GLN MET 配列番号：２ (1) 配列の長さ：１８７ (2) 配列の型：アミノ酸 (3) 配列の種類：ポリペプチド (4) 起源 生物名： （ヒトをmodifyしたもの） (5) 配列 MET LYS ALA PRO VAL PRO PRO GLY GLU ASP SER LYS ASP VAL ALA 15 ALA PRO HIS ARG GLN PRO LEU THR SER SER GLU ARG ILE ASP LYS 30 GLN ILE ARG TYR ILE LEU ASP GLY ILE SER ALA LEU ARG LYS GLU 45 THR CYS ASN LYS SER ASN MET CYS GLU SER SER LYS GLU ALA LEU 60 ALA GLU ASN ASN LEU ASN LEU PRO LYS MET ALA GLU LYS ASP GLY 75 CYS PHE GLN SER GLY PHE ASN GLU GLU THR CYS LEU VAL LYS ILE 90 ILE THR GLY LEU LEU GLU PHE GLU VAL TYR LEU GLU TYR LEU GLN 105 ASN ARG PHE GLU SER SER GLU GLU GLN ALA ARG ALA VAL GLN MET 120 SER THR LYS VAL LEU ILE GLN PHE LEU GLN LYS LYS ALA LYS ASN 135 LEU ASP ALA ILE THR THR PRO ASP PRO THR THR ASN ALA SER LEU 150 LEU THR LYS LEU GLN ALA GLN ASN GLN TRP LEU GLN ASP MET THR 165 THR HIS LEU ILE LEU ARG SER PHE LYS GLU PHE LEU GLN SER SER 180 LEU ARG ALA LEU ARG GLN MET

【図面の簡単な説明】

【図１】 リサイクルクロマトグラフィの概要を示した
ものである。Ａは通常のリサイクル法、Ｂはオルタネイ
ティブ・リサイクル法を示す。

【図２】 実施例１〜４で調製したＰＥＧ修飾ＩL-６の
ゲル濾過ＨＰＬＣによるクロマトグラムを示す。

【図３】 実施例１〜４で調製したＰＥＧ修飾ＩL-６の
逆相ＨＰＬＣによるクロマトグラムを示す。

【図４】 実施例８〜10で調製したＰＥＧ修飾ＩL-６の
ゲル濾過ＨＰＬＣによるクロマトグラムを示す。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成６年１月２６日

【手続補正３】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】全図

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１Ａ】

【図１Ｂ】

【図２】

【図３】

【図４】

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 インターロイキン６活性を有する糖蛋白
   質またはポリペプチドにポリエチレングリコールを結合
   してなる修飾インターロイキン６であって、Shodex OHp
   ak KB804カラム（径８mm×長さ30cm）を用い、150mMNaC
   lを含む10mMリン酸緩衝液（pH7.0）を移動相として、タ
   ンパク質として10-50μgのサンプルを毎分0.5mlの流速
   で高速液体クロマトグラフィを行って分析したときのピ
   ーク巾（Ｖw）が約1.2mlより小さいものであることを特
   徴とする、修飾インターロイキン６。
2. 【請求項２】 ポリエチレングリコールが糖蛋白質また
   はポリペプチドのアミノ酸残基の遊離アミノ基を介して
   結合している請求項１記載の修飾インターロイキン６。
3. 【請求項３】 糖蛋白質またはポリペプチドの少なくと
   も１個の遊離アミノ基の水素原子が式［Ｉ］、 【化１】 （式中、nは７ないし600の正の整数を、R₁は炭素数１な
   いし３のアルキル基を示す。）または式［II］、 【化２】 （式中、n,mは同一または異なる７ないし600の正の整数
   を、R₁、R₂は同一または異なる炭素数１ないし３のアル
   キル基を示す。）を有する基で置換された請求項２記載
   の修飾インターロイキン６。
4. 【請求項４】 ポリエチレングリコールが糖蛋白質また
   はポリペプチドのアミノ酸残基の遊離カルボキシル基を
   介して結合している請求項１記載の修飾インターロイキ
   ン６。
5. 【請求項５】 糖蛋白質またはポリペプチドが実質的に
   配列番号１のアミノ酸配列を有するヒトインターロイキ
   ン６である請求項１記載の修飾インターロイキン６。
6. 【請求項６】 糖蛋白質またはポリペプチドが配列番号
   ２のアミノ酸配列を有するヒトインターロイキン６であ
   る請求項１記載の修飾インターロイキン６。
7. 【請求項７】 ポリペプチドが大腸菌によって生産され
   たヒトインターロイキン６ポリペプチドである請求項５
   記載の修飾インターロイキン６。
8. 【請求項８】 請求項１〜７のいずれか１項の修飾イン
   ターロイキン６を有効成分として含有する血小板形成促
   進剤。
9. 【請求項９】 インターロイキン６活性を有する糖蛋白
   質またはポリペプチドにポリエチレングリコールを結合
   させ、ついでリサイクルクロマトグラフィ法を用いたゲ
   ル濾過により精製することを特徴とする、請求項１記載
   の修飾インターロイキン６の製造方法。
10. 【請求項10】 インターロイキン６活性を有する糖蛋白
    質またはポリペプチドにポリエチレングリコールを結合
    させ、ついでリサイクルクロマトグラフィ法を用いたゲ
    ル濾過により精製することにより製造される、修飾イン
    ターロイキン６。