CN106749608B - 干扰素α缀合物 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术及制药领域，涉及一种特异性修饰的IFNα缀合物、其制备方法、包含其的药物组合物及其在制备预防和/或治疗肝炎或肿瘤药物中的应用。本发明所提供的IFNα缀合物的制备方法为经由MTGase的催化作用，在特定位点的Gln侧链处经过酰胺键合酶促地缀合至亲水性非免疫原性聚合物，获得纯化的IFNα缀合物。生产过程中，操作简便、成本低廉，修饰位点远离活性区，体外生物学活性高于派罗欣2‑3倍，产品体内性质更加稳定。

Description

干扰素α缀合物

技术领域

本发明属于生物技术及制药领域，具体地，本发明涉及一种特异性修饰的干扰素α缀合物、其制备方法、包含其的药物组合物及其在制备预防和/或治疗肝炎或肿瘤药物中的应用。

背景技术

干扰素(interferon，IFN)是真核细胞针对病毒感染和其它抗原刺激而产生的一类具有广谱抗病毒、抗增殖和免疫调节作用的细胞因子。IFN已被广泛应用于多种疾病的治疗，如乙型肝炎、丙型肝炎等病毒性感染，多发性硬化、关节炎、等炎症反应异常性疾病，骨髓瘤、淋巴瘤、肝癌等肿瘤疾病。根据IFN的来源及其对酸的耐受程度，可将其分为I型、II型和III型。其中，I型IFN包括α、β、ω、κ、ε、δ6种类型，IFNα的临床应用最广，由白细胞分泌产生。IFNα存在许多结构相似的蛋白质亚型，由165-166氨基酸残基组成，如αl、α2、α3等，在同一亚型内又因氨基酸的差异而细分，如α1有2种：α-1a、α-1b；α2有3种：α-2a、α-2b、α-2c。目前，临床应用以IFNαlb、IFNα2a、IFNα-2b为主。其中，IFNα-1b由166个氨基酸残基组成，分子量约19.4kDa，IFNα-2a由165个氨基酸残基组成，分子量约19.2kDa。但IFN作为蛋白质药物，存在以下缺点：1)会被消化系统破坏，不能够口服；2)药物分子量较小，易被肾小球滤过和体内不稳定，易被蛋白质酶解，体内半衰期较短；3)需要长时间、频繁、连续注射给药，患者依从性差；4)药物免疫原性较高；5)有时溶解度低，易沉淀析出。

与生物相容的、高分子量的聚合物缀合是用于增加治疗肽或蛋白的半衰期和用于改进其持久性效果的最常用技术之一。迄今为止最成功的手段是通过共价偶联聚乙二醇(PEG)屏蔽蛋白质的表面，这种方法称为聚乙二醇化(pegylation)。蛋白质的PEG修饰技术，始于20世纪70年代。药物经PEG修饰后，往往会具有以下优点：1)更长的半衰期；2)较低的最大血药浓度；3)血药浓度波动较小；4)较少的酶降解作用；5)较少的免疫原性及抗原性；6)较小的毒性；7)更好的溶解性；8)用药频率减少；9)提高病人的依从性，提高生活质量，降低治疗费用。

用于蛋白缀合的另一选择(作为PEG的替代方案)是利用其它线性的或支链的生物相容性聚合物，例如聚氧丙烯、聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物、聚丙烯酰吗啉、聚乙烯吡咯烷酮、羟乙基淀粉、右旋糖酐、聚多糖等等。

PEG化修饰在IFN的长效剂型开发中得到了成功应用，如Roche的PEGASYS(派罗欣)和Schering的PEG-INTRON(佩乐能)。PEGASYS是被分子量为40kDa的分支型PEG随机修饰的IFNα-2a，其循环周期为96小时，能保持IFNα-2a抗病毒活性的7％；PEG-INTRON是被分子量为12kDa的线性PEG随机修饰的IFN-α2b，其循环周期为45小时，可保持IFNα-2b抗病毒活性的28％。

以上PEG化修饰的成功运用均是采用化学法PEG化IFNα。目前，化学法修饰技术中PEG分子主要结合到IFNα的以下功能集团：1)N-末端或丝氨酸或赖氨酸的NH₂基团；2)半胱氨酸的巯基；3)组氨酸的咪唑基团等。

中国专利CN1167777A要求保护PEG-IFNα结合物，IFNα通过酯键或酰胺键与PEG部分连结，因此，PEG部分可通过IFNα上的赖氨酸残基或N-末端的NH₂基团或丝氨酸残基的羟基与IFNα结合，PEG化修饰位点种类和数目很多，且可以附着一个或更多PEG部分，从而形成未PEG化、单PEG化和多PEG化的IFN的混合物，通过本领域熟知的方法能从混合物中分离出单PEG化IFNα。但是，由于IFNα-2a分子显示多个PEG化位点，因此它是位置异构体的混合物。因此该PEG化修饰为非特异性位点修饰，修饰位点种类和数量多且形成的修饰衍生物不稳定，造成修饰产物组成不均一、质量控制较难。

中国专利CN1711109A公开了PEG化的IFNα-2a的位置异构体：PEG-Lys(31)、PEG-Lys(49)、PEG-Lys(70)、PEG-Lys(83)、PEG-Lys(112)、PEG-Lys(121)、PEG-PEG-Lys(131)、PEG-Lys(134)和PEG-Lys(164)及其分离上述位置异构体的方法，要获得单位点PEG化修饰的IFNα-2a，需要首先化学法修饰IFN，得到一系列的未PEG化、单PEG化和多PEG化的IFN的混合物，再通过本领域熟知的方法能从混合物中分离出单PEG化IFNα，然后通过中国专利CN1711109A公开的分离方法进行分离，步骤繁琐，操作复杂。且在化学修饰过程中会用到氰基硼氢化钠等有毒化合物，给操作人员带来健康安全隐患。

除了化学PEG化之外，结合甲氧基-PEG(mPEG)链和蛋白的酶促程序已经被描述。例如，这些基于利用原核和真核起源的谷氨酰胺转移酶类(TGase)以催化将用伯氨基官能化的mPEG转移至感兴趣的多肽链中天然存在的或通过位点特异性诱变反应插入的谷氨酰胺(Gln)残基的酰基(H.Sato,Enzymatic Procedure for Site-Specific PEGylation ofProteins,Adv.Drug Deliv.Rev.,54,487-504,2002)。

中国专利申请CN1165539A公开了使用微生物谷氨酰胺转氨酶(MTGase)将聚合物链连接至在其氨基酸序列中具有至少一个Gln残基的肽和蛋白，尽管该专利申请给出了在一些模型蛋白上的单取代的实例，但不清楚的是取代是否也是位点特异性，这意指它们产生单分子形式或位置异构体的混合物，在位置异构体的混合物中，尽管被单取代，聚合物链与不同的Gln结合。

本发明按照CN1165539A公开的技术方案制备了PEG化的IFNα，并对该产物进行PEG修饰位点鉴定，结果显示，该产物为非单一位点修饰，而是一种位置异构体的混合物。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种特异性的单一氨基酸位点修饰的IFNα缀合物、其制备方法、包含其的药物组合物及其在制备预防和/或治疗肝炎或肿瘤的药物中的应用。

为此，本发明提供一种人IFNα缀合物，其特征在于，人IFNα经由MTGase的催化作用，在特定位点的Gln侧链处经过酰胺键合酶促地缀合至亲水性非免疫原性聚合物上，获得纯化的人IFNα缀合物。

具体地，本发明提供一种特异性的、单一氨基酸位点修饰的人IFNα缀合物，其特征在于，人IFNα1或IFNα2分别通过多肽链上的Gln102或Gln101共价结合到亲水性非免疫原性聚合物上，或天然的人IFNα1或IFNα2的类似物或衍生物通过多肽链上相应位置的Gln共价结合到亲水性非免疫原性聚合物上。

更优选地，上述的人IFNα1或IFNα2分别具有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的天然的IFNα-1b、IFNα-2a。

其中，所述的亲水性非免疫原性聚合物至少用一个氨基官能化，其选自由聚乙二醇、聚氧丙烯、聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物、聚丙烯酰吗啉、聚乙烯吡咯烷酮、羟乙基淀粉、右旋糖酐、聚多糖组成的组。

优选地，所述的亲水性非免疫原性聚合物为聚乙二醇，分子量范围为20-40kDa，优选40kDa。

更优选地，上述的聚乙二醇是伯氨基官能化的甲氧基-PEG。

所述的聚乙二醇可为直链或支链的聚乙二醇。

更进一步地，所述的聚乙二醇具有下式的结构式：

其中，m和n表征聚合度，为大于0的整数，m优选2-500，n优选2-400，上述的聚乙二醇的分子量为20-40kDa，优选40kDa。

另外，本发明还提供了包含上述的一个或多个特异性的单一氨基酸位点修饰的人IFNα缀合物的药物组合物。

鉴于现有技术中酶法PEG化修饰人IFNα后，获得的为非单一氨基酸位点修饰的IFN缀合物，因此，本发明人在现有技术的基础上，对MTGase催化人IFNα的PEG反应的条件，如反应温度、pH、反应时间以及PEG的分子量大小进行了一系列的摸索和实验。过酸、过碱或温度过高，会使酶的空间结构遭到破坏，使酶活性降低甚至失活，从而影响人IFNα的PEG化结果。较低温度下，酶的空间结构稳定，但酶的活性较低，同样会影响人IFNα的PEG化结果，因此，需要摸索确定合适的反应温度和反应的pH。即使在适宜的条件下酶的催化效率也不是一成不变，随着反应时间的延长酶会发生钝化现象，即催化能力下降。因此，需要进行一系列的实验摸索合适的温度、pH及反应时间。PEG分子量大小同样也会影响人IFNα的PEG化结果：分子量过大或过小都会导致非单一位点修饰产物的产生。因此，对于PEG的分子量大小需要进行一系列的实验以确定可产生单一氨基酸位点PEG修饰的人IFNα。本发明在进行了大量的实验的基础上发现，当反应条件为：4-37℃反应3-6小时，pH范围为6-10，PEG分子量范围为20kDa-40kDa时，均可得到单一谷氨酰胺位点修饰的IFNα缀合物。尤其是，当反应条件为：25℃反应5小时，pH 8.8，PEG为支链且分子量大小为40kDa时，单一谷氨酰胺位点修饰的IFNα缀合物的收率更高。

因此，本发明还提供了一种制备上述特异性的单一氨基酸位点修饰的人IFNα缀合物的方法：在MTGase的存在下，将IFNα与非免疫原性聚合物混匀，反应条件为：在4-37℃反应3-6小时，pH范围为6-10；优选的反应条件是在4-37℃反应3-6小时，pH范围为8.5-10；更优选的反应条件是25℃反应5小时，pH为8.8。

此外，本发明还提供了上述特异性的单一氨基酸位点修饰的人IFNα缀合物在预防和/或治疗肝炎或肿瘤的药物中的用途。

本发明的IFNα1、IFNα2可以为从天然来源提取的或通过重组生物技术获得的IFNα。重组人IFNα1、IFNα2可以是人工合成的，也可以是原核系统如大肠杆菌(E.coli)表达的，也可以是真核酵母系统如毕赤酵母(Pichia pastoris)表达的，也可以是其它昆虫细胞系统或哺乳细胞系统如CHO表达的。优选的，IFNα1、IFNα2为通过重组生物技术获得的分别具有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的人IFNα。

制备人IFNα的方法为本领域已知的现有技术，如Poonam Srivastava,PalashBhattacharaya,Gaurav Pandey,K.J.Mukherjee Overexpression and purification ofrecombinant human interferon alpha2b in Escherichia coli.Protein Expressionand Purification 41(2005)313–322，中国专利CN1814617A等。

本发明优选通过层析法对人IFNα缀合物进行纯化分离；优选的，采用离子交换、凝胶过滤层析；更优选的采用阳离子交换层析，包括SP Sepharose FF，SP Sepharose HP，SOURCE15S等介质。

收获得到的特异性单一氨基酸位点修饰的重组人IFNα缀合物可通过本领域公知的方法来进行性质分析，如采用质谱分析产物的分子量，聚丙烯酰胺凝胶电泳、高效液相色谱等分析产物的纯度，胞病变抑制法分析产物体外生物学活性，液相质谱联用的方法分析产物的修饰位点。

本发明的MTGase可以为天然来源提取的或通过重组生物技术获得的微生物谷氨酰胺转氨酶，可以是原核系统如大肠杆菌、链霉菌表达的，也可以是真核酵母系统如毕赤酵母表达的。

制备MTGase的方法及其活性检测方法为本领域已公开的技术，如M.-L.HO,S.-Z.LEU,J.-F.HSIEH,AND S.-T.JIANG.Technical Approach to Simplify thePurification Method and Characterization of Microbial TransglutaminaseProduced from Streptoverticillium ladakanum.JOURNAL OF FOOD SCIENCE.Vol.65,No.1,2000等。

天然的人IFNα1或IFNα2的类似物是指与天然的IFNα1或IFNα2具有至少90％的同源性，经过1-15个氨基酸的替代、缺失或增加等变异后仍具有与天然IFNα1或IFNα2相同的功能的蛋白质。

天然的人IFNα1或IFNα2的衍生物是指天然的IFNα1或IFNα2序列中至少一个氨基酸与其他分子连接，同时保持了与天然IFNα1或IFNα2相同的功能。

本发明所提供化合物为特异性单一氨基酸位点修饰的IFNα缀合物，克服了目前修饰产物多为混合物的缺点：如修饰没有选择性，为非特异性位点修饰，修饰位点种类和数量多且形成的修饰衍生物不稳定，造成修饰产物组成不均一、质量控制较难等。

本发明所提供的IFNα缀合物的制备方法为经由MTGase的催化作用，在特定位点的Gln侧链处经过酰胺键合酶促地缀合至亲水性非免疫原性聚合物上，获得纯化的IFNα缀合物。生产过程中，操作简便、成本低廉，而传统的化学法控制过程复杂，并且在修饰过程中会用到氰基硼氢化钠等有毒化合物，给操作人员带来健康安全隐患。

本发明所提供IFNα缀合物中修饰位点远离活性区，体外生物学活性高于派罗欣2-3倍；产品体内性质更加稳定。

附图说明

附图1：40kDa PEG-IFNα-2a SOURCE 15S纯化图谱。

附图2：IFNα-2a及PEG-IFNα-2a纯化样品SDS-PAGE电泳结果。

附图3：40kDa PEG-IFNα-1b SOURCE 15S纯化图谱。

附图4：PEG₃₃₅₀-IFNα-2a纯化图谱。

附图5：40kDa PEG-IFNα-2a纯化样MALDI-TOF MS法分子量测定结果。

附图6：40kDa PEG-IFNα-2a纯化样品RP-HPLC结果。

附图7：40kDa PEG-IFNα-2a修饰位点的质谱鉴定结果。

附图8：细胞病变抑制法分析产物体外生物学活性结果图。

附图9：细胞病变抑制法抑制50％细胞病变时各组分的体外生物学活性图。

附图10：PEG-IFNα-2a用于荷瘤裸鼠治疗的肾癌肿瘤生长曲线图。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于对本发明进行解释和说明，并不用于限定本发明。

实施例1 分子量为40kDa的支链PEG-IFNα-2a的制备

将IFNα-2a蛋白用25mM Tris-HCl pH8.8的缓冲液透析平衡，IFNα-2a浓度调整至2mg/ml，按IFNα-2a与PEG的分子摩尔比为l:5的比例，加入PEG粉末(40kDa支链mPEG-NH₂，由北京键凯科技有限公司提供)，轻轻搅拌使粉末溶解，加入0.6IU/ml MTGase，25℃反应5h获得偶联反应产物，加入终浓度为20mM的醋酸铵终止反应，对上述偶联反应产物进行阳离子交换层析：将上述偶联反应产物加入5倍体积的缓冲液A(25mM NaAC，pH5.0)稀释，之后上样于经缓冲液A平衡的阳离子交换层析柱(SOURCE 15S，GE HealthcarLife Sciences)上，洗脱采用从缓冲液A到缓冲液B(25mM NaAC，0.5M NaCl，pH5.0)的线性洗脱(3-18％)，收集唯一洗脱峰(如附图1所示)。

实施例2 分子量为20kDa直链PEG-IFNα-2a的制备

实施例1中的PEG粉末更换为分子量为20kDa的直链mPEG-NH₂，其他制备步骤同实施例1。

实施例3 分子量为40kDa支链PEG-IFNα-2a在pH 6.0缓冲液中的制备

实施例1中的25mM Tris-HCl缓冲液的pH由8.8变为6.0，其他制备步骤同实施例1。

实施例4 分子量为40kDa支链PEG-IFNα-2a在pH 8.5缓冲液中的制备

实施例1中的25mM Tris-HCl缓冲液的pH由8.8变为8.5，其他制备步骤同实施例1。

实施例5 分子量为40kDa支链PEG-IFNα-2a在pH 10.0缓冲液中的制备

实施例1中的25mM Tris-HCl缓冲液的pH由8.8变为10.0，其他制备步骤同实施例1。

实施例6 分子量为40kDa支链PEG–IFNα-2a在温度为4℃下的制备

实施例1中的偶联反应温度变为4℃，其他制备步骤同实施例1。

实施例7 分子量为40kDa支链PEG–IFNα-2a在温度为37℃下的制备

实施例1中的偶联反应温度变为37℃，其他制备步骤同实施例1。

实施例8 分子量为40kDa支链PEG-IFNα-1b的制备

实施例1中的IFNα-2a更换为IFNα-1b，其他制备步骤同实施例1(如附图3所示)。

实施例9 中国专利CN1165539A实施例10PEG-IFNα-2a的制备

将IFNα-2a蛋白用200mM Tris-HCl pH7.5的缓冲液透析平衡，IFNα-2a浓度调整至2mg/ml，按IFNα-2a与PEG的分子摩尔比为l:5的比例，加入PEG粉末(分子量3350，由Sigma公司提供)，轻轻搅拌使粉末溶解，加入220U/ml MTGase，37℃反应2h获得偶联反应产物，加入终浓度为20mM的醋酸铵终止反应，对上述偶联反应产物进行阳离子交换层析：将上述偶联反应产物加入5倍体积的缓冲液A(25mM NaAC，pH5.0)稀释，之后上样于经缓冲液A平衡的阳离子交换层析柱(SOURCE 15S，GE Healthcare Life Sciences)上，洗脱采用从缓冲液A到缓冲液B(25mM NaAC，0.5M NaCl，pH5.0)的线性洗脱(3-18％)，分别收集各洗脱峰峰尖(如附图4所示)，收获纯化的PEG₃₃₅₀-IFNα-2a。

实施例10 PEG-IFNα-2a的性质分析

对实施例1-9样品分别进行性质分析。

(1)MALDI-TOF MS法检测分子量

采用MALDI-TOF MS(5800MALDI-TOF/TOF，AB SCIEX)法测定上述实施例PEG化修饰产物的分子量。试剂盒使用ProteoMass Peptide&Protein MALDI-MS Calibration Kit(MSCAL 1，Sigma)，原始数据及图谱由4000 Series Explorer V3.5软件导出。

实施例1-8中，在不同条件下40kDa PEG修饰得到的PEG-IFNα-2a的MS分子量一致，大小约59.4kDa(如附图5所示)；20kDa PEG修饰的PEG-IFNα-2a的MS分子量大小约41.3kDa。

(2)蛋白质纯度检测

PEG-IFNα-2a的修饰位点异构体的纯度检测采用RP-HPLC法。HPLC分析柱采用C18(4.6mm×250mm，waters)，样品上样体积20μl(约10μg蛋白)，流动相：A液：0.2％三氟乙酸水溶液，B液：95％乙腈的A液，梯度：0％-100％B(80min)，流速：0.9mL/min，检测波长：210nm。

实施例1-8中，在不同条件下PEG修饰所得的PEG-IFNα-2a的纯度检测结果均为单一主峰，纯度大于99％(如附图6所示)。

(3)PEG化修饰位点的鉴定

将PEG-IFNα-2a、PEG-IFNα-1b和未修饰的IFNα-2a、IFNα-1b，经Trypsin与Glu C酶降解后，进行质谱分析，收集谱图，与数据库中由野生型IFNα-2a经胰蛋白酶降解产生的所有多肽片段的理论值比较。

将实施例1-7得到的PEG-IFNα-2a产物进行PEG化修饰位点鉴定，结果如图7所示。以上PEG-IFNα-2a的酶解产物在45.6min-47min均出现一色谱峰，该峰未在IFN酶解产物分离图中发现，故该峰为PEG化肽段。将PEG-IFNα-2a酶解产物在相同的条件下进行分离，收集45.6min-47min色谱峰，离心干燥后用于后续N端测序。N端序列分析结果为A_VI_GVGVTETPLMK。该肽段第二位氨基酸理论序列为半胱氨酸，在N端测序时不稳定，不能测定；而第5位氨基酸为Gln，在本次试验中不能测出。综合质谱分析结果，在未修饰的IFNα-2a样品中，含有Gln的多肽片段均被捕捉到，而在PEG-IFNα-2a样品中，只捕捉到了除Gln101外的其它含有Gln的多肽片段，表明由于Gln101位有PEG的修饰，分子量远远大于串联四级杆飞行时间质谱仪所能捕捉到的范围，因此可以证实PEG修饰位点应为该肽段第五位氨基酸Gln，即IFNα-2a的第101位氨基酸Gln。

将实施例8获得的PEG-IFNα-1b洗脱峰收集后与未经修饰的IFNα-1b经Trypsin与Glu C酶降解后，做质谱分析，进行PEG化修饰位点的鉴定。结果显示两个峰的N端序列分析结果分别为_DLP_THSLDNR和A_VM_EER；第二个肽段分析方法同实施例1-6分析，该肽段第二位氨基酸理论序列为半胱氨酸，在N端测序时不稳定，不能测定；而第5位氨基酸为Gln，在本次试验中不能测出。综合质谱分析结果，在未修饰的IFNα-1b样品中，含有Gln的多肽片段均被捕捉到，而在PEG-IFNα-1b样品中，只捕捉到了除Gln102外的其它含有Gln的多肽片段，表明由于Gln102位有PEG的修饰，分子量远远大于串联四级杆飞行时间质谱仪所能捕捉到的范围，因此可以证实PEG修饰位点应为该肽段第五位氨基酸Gln(即IFNα-1b的第102位氨基酸Gln)。

同理将实施例9获得的两个PEG-IFNα-2a洗脱峰分别收集后经Trypsin与Glu C酶降解后，做质谱分析，进行PEG化修饰位点的鉴定。结果显示两个峰的N端序列分析结果分别为_DLP_THSLGSR和A_VI_GVGVTETPLMK；第二个肽段分析同实施例1-7分析，即IFNα-2a的第101位氨基酸Gln被PEG化修饰；而对第一个肽段进行分析，结果显示IFNα-2a的第5位氨基酸Gln被PEG化。因此，使用专利CN1165539A实施例10所述方法获得的修饰产物为非单一Gln位点修饰的IFN。

(4)PEG-IFNα-2a的体外活性测定

采用细胞病变抑制法检测PEG-IFNα-2a的体外生物学活性。按照欧洲药典(EuropePharmacopoeia Volume III)中所述方法，测定IFN的体外抗病毒活性。这种试验是基于IFN与A-549细胞共孵育之后，使得A-549细胞建立了抗病毒状态，从而使脑心肌炎病毒(EMCV)攻击不再致A-549细胞病变，IFN的浓度通过半数细胞得到保护时的稀释倍数来定量，每个样品均同步检测3个平行样。

实施例1所得的PEG-IFNα-2a产物的体外生物学活性检测结果如附图8-9所示，结果显示，PEG-IFNα-2a能保持IFNα-2a抗病毒活性的20％左右，比PEGASY(批号：131326/SH0202，7％)高2-3倍。

(5)PEG-IFNα-2a大鼠药代动力学研究

实验采用SD大鼠，随机分组，每组6只，雌雄各半，分笼喂养，以700μg/kg体重的剂量分别给予单次皮下注射IFNα-2a、PEG-IFNα-2a和PEGASYS，给药后尾静脉取血，取血时间分别为：IFNα-2a—注射后0min、5min、10min、0.5h、1h、2h、3h、4h、12h、24h；PEG-IFNα-2a和PEGASYS—注射后0h、0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h；血样经5,000rpm，10min离心后取血浆部分，置-70℃保存备用。用实施例8(4)方法检测血清中干扰素活性。

将实施例1所得的PEG-IFNα-2a、IFNα-2a和PEGASYS分别按上述步骤进行大鼠药代动力学研究，结果如表1所示。

表1 IFNα-2a和PEG-IFNα-2a的药代动力学参数

可见，IFNα-2a经PEG化后，末端半衰期显著延长。与PEGASYS相比，实施例1的PEG-IFNα-2a产物的在大鼠体内的吸收速度和程度都有明显提高，半衰期更长，同时清除速率比PEGASYS低，因此，实施例1的PEG-IFNα-2a产物比PEGASYS有更好的药代动力学特性。

(6)PEG-IFNα-2a对人皮下肾癌异种移植肿瘤模型的药效学评价研究

收集A498细胞，每只NOD-SCID小鼠腋部皮下注入细胞悬液，2.7×10⁶个/只，建立荷瘤小鼠模型。待肿瘤长到200-300mm³时，将小鼠根据肿瘤体积及动物体重均衡分成5个组：空白对照组，PEG-IFNα-2a组(1.5、15μg/只，实施例1，1周给药1次)，PEGASYS组(1.5、15μg/只，1周给药1次)，IFNα-2a组(15μg/只，1周给药3次)，每组5只动物，均为皮下给药，每周量瘤3次，第26天剖瘤称重。

给药后动物正常饲养，使用测量瘤径的方法，动态观察受试药的抗肿瘤作用，试验结束后(第28天)将动物处死，剥瘤，计算抑瘤率。

肿瘤体积(tumor volume，TV)的计算公式为：TV＝1/2×a×b²。其中a和b分别表示肿瘤长和宽，根据测量结果计算出肿瘤体积。

根据公式计算相对肿瘤体积抑制率(％)。

相对肿瘤体积抑制率＝(1－TRTV/CRTV)×100％。其中，TRTV：治疗组RTV，CRTV：阴性对照组RTV，相对肿瘤体积(RTV)＝V_t/V₀。V₀为分笼给药时(即d₀)测量所得肿瘤体积，V_t为每一次测量时的肿瘤体积。

实验结果采用SPSS 11.5统计软件，Repeated Measure过程分析随时间变化多次测量间肿瘤体积变化，Multivariate过程比较各次测量时组间肿瘤体积差异，

动物肿瘤体积变化如附图10所示。结果显示：与空白组相比，各治疗组从第10天起均可显著抑制A498肿瘤生长，从第12天起各剂量组均可极显著抑制肿瘤细胞的生长。PEGASYS 15μg和PEG-IFNα-2a 15μg组均能引起所有小鼠肿瘤完全消退，PEGASYS 1.5μg、PEG-IFNα-2a 1.5μg和IFNα-2a 15μg能引起部分小鼠肿瘤缩小，部分肿瘤完全消退。可见，与未PEG化IFNα-2a作用相比，同剂量的PEG-IFNα-2a(15μg)抗肿瘤效果更为显著，能引起所有小鼠肿瘤完全消退；15μg的IFNα-2a的抗肿瘤效果与1.5μg的PEG-IFNα-2a和PEGASYS相当。

上文对本发明的实施方式作了详细的说明，但是本发明并不限于上述实施方式，尽管参照实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内作出的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种特异性的、单一氨基酸位点修饰的人IFNα缀合物，其特征在于，天然的人IFNα1或IFNα2分别通过多肽链上的Gln102或Gln101共价结合到亲水性非免疫原性聚合物上，所述亲水性非免疫原性聚合物为聚乙二醇，分子量范围为20-40kDa。

2.权利要求1所述的人IFNα缀合物，其特征在于，所述的人IFNα1、IFNα2分别为天然的IFNα-1b和IFNα-2a，分别具有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

3.权利要求1-2任一项所述的人IFNα缀合物，其特征在于，所述的聚乙二醇为伯氨基官能化的甲氧基-聚乙二醇。

4.一种药物组合物，包含一个或多个权利要求1-3任一项所述的人IFNα缀合物。

5.一种制备权利要求1-3所述的人IFNα缀合物的方法，其特征在于，在MTGase的存在下，将IFNα与亲水性非免疫原性聚合物混匀，反应条件为：在4-37℃反应3-6小时，pH范围为6-10。

6.权利要求5所述的方法，反应条件为：在4-37℃反应3-6小时，pH范围为8.5-10。

7.权利要求5所述的方法，反应条件为：在25℃反应5小时，pH为8.8。

8.权利要求1-3任一项所述的人IFNα缀合物在制备预防和/或治疗肝炎或肿瘤的药物中的用途。

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