JP5336372B2 - Ｇ−ｃｓｆ部位特異的モノコンジュゲート - Google Patents

Description

前駆細胞の増殖および成熟好中球への分化を刺激する、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の新規な部位特異的モノコンジュゲート、ならびにその類縁体および誘導体を本明細書に記述する。これらのコンジュゲートは、トランスグルタミナーゼを用いて、天然のヒトＧ−ＣＳＦポリペプチド配列およびその類縁体の単一グルタミン残基に、親水性の非免疫原性ポリマーを共有結合で部位特異的に結合して得られている。これらの新規な部位特異的モノコンジュゲート誘導体は、溶液中で安定であり、顕著なｉｎ ｖｉｔｒｏ生物活性を示し、非コンジュゲートタンパク質と比較して血流半減期が長く、その結果長期の薬理活性を示すので、治療用途に推奨される。

ヒト顆粒球コロニー刺激因子（ｈ−Ｇ−ＣＳＦ）は、間質細胞、マクロファージ、線維芽細胞および単球により自然に産生される２０ｋＤａの糖タンパク質である。その産生は、内毒素に曝した際および感染中に増加する。Ｇ−ＣＳＦは、好中球前駆細胞上に発現するＧ−ＣＳＦ受容体（Ｇ−ＣＳＦＲ）に高い親和性で結合する骨髄において、該細胞の増殖および抗感染性成熟好中球への分化を誘発するが、他の血液細胞系にはさしたる造血作用を及ぼさずに作用する。

主たる天然Ｇ−ＣＳＦアイソフォームは、２個のジスルフィド結合に用いられた４個のシステイン残基、１７位の遊離システイン残基、および１３３位にあるスレオニン残基側鎖の酸素上のグリコシル化部位（Ｏ−連結グリコシル化）を有する、１７４個のアミノ酸ポリペプチドである。グリコシル化は、効率的な受容体との結合の確立またはＧ−ＣＳＦ生物活性にとって必要ではない（例えば、非特許文献１参照）が、単一Ｏ−糖鎖の存在によりＧ−ＣＳＦの物理的および酵素的安定性が改善されることが報告されている（例えば、非特許文献２、非特許文献３参照）。遺伝子工学技法によるヒトＧ−ＣＳＦ産生によって、原発性、続発性双方の数種の好中球減少症を処置する新しい治療法が開発されてきた。特に、組換えＧ−ＣＳＦ化合物は、以下の治療法：
骨髄毒性抗腫瘍薬または骨髄機能廃絶療法に続く骨髄移植で処置されている危険性の高い患者における、好中球減少症と、感染性および発熱性関連現象の期間短縮、
骨髄抑制または骨髄機能廃絶療法と、場合によりそれに続く骨髄移植を受けている患者における、自家細胞移植にて使用する末梢血前駆細胞の動員、
先天性または特発性好中球減少症に罹り、好中球原形質濃度の激減、ならびに感染症および発熱を示す患者の処置、
後期ＨＩＶ感染症患者に発現する、好中球減少症および細菌感染症の処置
のために病院環境で処方される。

各種の好中球減少症に罹った患者のＧ−ＣＳＦによる処置の際に示された特別の関心から、哺乳動物、細菌双方の細胞系で産生される組換え化合物の開発が盛んに行われてきた。

実際、組換えＧ−ＣＳＦの少なくとも３種の変異型：
哺乳動物細胞に発現し、天然タンパク質ポリペプチド鎖と同一のアミノ酸１７４個のポリペプチド鎖として作製され、１３３位のスレオニン残基上にＯ−連結オリゴ糖部分を含んだ、レノグラスチムと称するグリコシル化型、
Ｎ末端にある追加のメチオニル残基以外は、天然タンパク質と同一のアミノ酸１７５個のポリペプチド鎖（ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ）として細菌細胞中に発現する、フィルグラスチムと称する非グリコシル化型、
Ｎ末端にある追加のメチオニル残基、ならびにＴｈｒ２、Ｌｅｕ４、Ｇｌｙ５、Ｐｒｏ６およびＣｙｓ１８の残基のＡｌａ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、ＡｒｇおよびＳｅｒ各残基による置換が、天然タンパク質ポリペプチド鎖と異なるアミノ酸１７５個のポリペプチド鎖（ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ）として細菌細胞中に発現する、ナルトグラスチムと称する非グリコシル化型
が、治療用途のために数カ国で入手可能である。

様々な組換えＧ−ＣＳＦ誘導体の臨床応用で熟知されている制約は、非経口投与後の血流における薬物動態半減期（ｔ_1/2）が３〜４時間という短い循環永続性である。その結果、例えば、非骨髄性腫瘍を有し、骨髄抑制化学療法を受けている患者において感染症の発現を低減するための組換えＧ−ＣＳＦの処方投薬量は、化学療法サイクルの期間に対するＧ−ＣＳＦ５μｇ／ｋｇ／日の皮下注射を、サイクル当たり注射１０〜１４回に及んで毎日投与することからなる。

Ｇ−ＣＳＦの薬物動態プロファイルは、大多数のサイトカイン同様に、Ｇ−ＣＳＦ受容体を発現する細胞により媒介される、インターナリゼーションおよび部分的分解の特異的で可飽和性の機構以外に、非特異的で非可飽和性の腎クリアランス機構（およびそれ程ではないが、肝クリアランス）によって調節される。

腎クリアランスはタンパク質分子のサイズに関係するので、腎限外ろ過を減少させる方法の１つは、分子サイズおよび／または流体力学的体積を増加させることである。

これは、治療タンパク質の分野における非常に一般的な問題であり、幾つかの解決策として、治療タンパク質の担体タンパク質（例えば、免疫グロブリンまたはアルブミン）との融合、徐放性ポリマーのナノスフェアおよびミクロスフェア中への活性成分の組込み、ならびに生体適合性の高分子量ポリマーとのタンパク質の共有結合性コンジュゲーションが提案されてきた。

特にタンパク質−ポリマーの共有結合性コンジュゲーション領域では、いわゆるＰＥＧ化が広範に採用されてきており、この場合、選択されたタンパク質は、１０００〜２０００Ｄａから２００００〜４００００Ｄａまたはそれ以上に及ぶ分子量を有し、１本または複数の線状または分岐ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）に共有結合される。一般にＰＥＧ化タンパク質は、腎クリアランス速度の低下、ならびに安定性の向上および免疫原性の減少を示す。ＰＥＧがポリペプチドに適切に結合されると、その流体力学的体積および物理化学的性質が変化する一方、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性または受容体認識などの基本的な生物学的機能は、未変化のままか、僅かな減少を受けるか、場合によっては完全に抑制されることもある。ＰＥＧコンジュゲーションは、タンパク質表面をマスキングし、分子サイズを増加させ、したがって腎限外ろ過を減少させ、抗体または抗原提示細胞の結合を防止し、タンパク分解酵素による分解を低減する。最終的に、ＰＥＧコンジュゲーションは、ＰＥＧの物理化学的性質を付与し、そのためペプチド兼ノンペプチド薬物の生体分布および溶解性は、同様に変化する。タンパク質コンジュゲーション用のＰＥＧ代替物として、デキストラン、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（アクリロイルモルホリン）または多糖類などその他の生体適合性の線状または分岐ポリマーを使用してもよい。

一般に使用される化学的ＰＥＧ化法およびその結果を概観するには、非特許文献４および非特許文献５が参考となる。

生体適合性高分子量ポリマーとの共有結合性Ｇ−ＣＳＦコンジュゲーションは、例えば、幾つかの科学論文および特許に記載されており、その一部を以下に簡単に要約する。

特許文献１には、ポリ（エチレングリコール）またはポリ（プロピレングリコール）のポリマー鎖に化学的にコンジュゲートし、生物活性を維持し、血流半減期の増加を示すＧ−ＣＳＦ遺伝的変異型が記載されている。

特許文献２には、アミノ酸側鎖のアミノ基およびカルボキシル基の化学的結合によるＰＥＧ鎖でのＧ−ＣＳＦ修飾によって、半減期の長いＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦコンジュゲートを産生することが記載されている。

特許文献３には、ポリマーＰＥＧ鎖１〜１５本に化学結合し、ｉｎ ｖｉｖｏ投与後の安定性、溶解性および血流循環が改善されたＧ−ＣＳＦ誘導体が記載されている。

特許文献４には、異なった構造的、物理化学的および生物学的性質を示すＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ化学コンジュゲートが記載されている。

Ｇ−ＣＳＦのアミノ基またはカルボキシル基による非選択的コンジュゲーションで主に得られる以上のコンジュゲートは、通常、アイソフォームのコンジュゲート混合物であるが、下記に報告するような本質的に部位特異的なモノコンジュゲート誘導体を産生することを目的とした、Ｇ−ＣＳＦ化学コンジュゲートが開発されてきた。

特許文献５には、ポリマーと該タンパク質とのアミド結合、および好ましくは還元的アルキル化反応を介したポリマーと該タンパク質とのアミン結合の双方により得ることができる、ポリペプチド鎖のＮ末端アミノ酸残基のα−アミノ基に対するポリマー化合物のコンジュゲーションに対する方法が記載されている（例えば、非特許文献６を参照）。したがって、この技術の適用によって、Ｎ末端メチオニルのα−アミノ基上で２０ｋＤａの線状ＰＥＧにコンジュゲートしたｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦの開発が、プロピオンアルデヒドで官能化したモノメトキシＰＥＧ鎖を用いたｐＨ５での還元的アルキル化反応により可能となった。この生成物は、ＰＥＧ−フィルグラスチムの国際的一般名およびＮｅｕｌａｓｔａ（登録商標）の登録商品名で市販されてきた（例えば、非特許文献７を参照）。

部位特異的コンジュゲートを潜在的に生じることができる別のタンパク質残基は、チオールラジカルと共有結合を形成する残基で官能化されたＰＥＧ分子に対する高反応性部分である、システインチオール基である（例えば、非特許文献８を参照）。大部分のタンパク質は遊離システイン残基（即ち、ジスルフィド結合に関与していない）を有していないので、部位特異的な変異誘発を介して、ポリペプチド鎖の中にシステイン残基を挿入し、次いで、官能化されたポリマーを用いたその反応性システインチオール基との反応を可能にすることにより、ポリマーおよびタンパク質を部位特異的にコンジュゲートすることが可能であるが、それについては一連のＧ−ＣＳＦ変異体に対して記載されている（例えば、非特許文献９を参照）。部分的に代替的な手法に従って、特許文献６には、そのままでは疎水性ポケット中にマスクされてしまう遊離−ＳＨ部分を溶媒に曝すように部分的にタンパク質変性をした後、ジスルフィド結合（Ｃｙｓ¹⁷）に関与しないその天然システインチオール基上でｒ−ｈ−Ｇ−ＣＳＦをコンジュゲーションすることが記載されている。

以上の多様な化学的コンジュゲーション法だけでなく、酵素的手順も、ポリマーおよびタンパク質を結合するために記載されている。こうした手順は、原核性、真核性双方のトランスグルタミナーゼ酵素の使用によって、対象とするポリペプチド鎖中に自然に存在する、または部位特異的な変異誘発反応により挿入したグルタミン残基のアシル基に対する、一級アミノ基で官能化したポリマーの転移を触媒することに基づいている（例えば、非特許文献１０を参照）。

したがって、例えば、特許文献７および特許文献８の双方には、微生物トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）の使用によって、アミノ酸配列中に少なくとも１個のグルタミン残基を有するペプチドおよびタンパク質中に、ポリマー鎖を挿入することが記載されている。これらの特許では、幾つかのモデルタンパク質上での一置換に関する実施例を示しているが、複数置換も部位特異的であるのか明らかではなく、すなわち、複数置換が単一の分子形態を産生するのか、あるいは一置換ではあっても、ポリマー鎖が異なるグルタミンに結合している位置異性体混合物を産生することを意味しているのかが明らかではない。

国際公開第８９／０６５４６号パンフレット 国際公開第９０／０６９５２号パンフレット 国際公開第００／４４７８５号パンフレット 欧州特許第０３３５４２３号明細書 米国特許第５９８５２６５号明細書 国際公開第２００５／０９９７６９Ａ２号パンフレット 欧州特許第７８５２７６号明細書 米国特許第６０１０８７１号明細書

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本発明は、高いクリアランス速度およびその結果としての血中半減期の減少、タンパク質分解感受性、ならびに潜在的な免疫原性反応などの医薬活性タンパク質に関連する共通欠点を克服するように設計した、治療用途のためのヒトＧ−ＣＳＦの新規な部位特異的モノコンジュゲート誘導体およびその類縁体に関する。

本発明のＧ−ＣＳＦ部位特異的モノコンジュゲート誘導体は、均一な物理化学プロファイルならびに最適な薬物動態学的および薬力学的挙動を示すコンジュゲート誘導体を得るために、該タンパク質の構造的およびコンホメーション的変化を最小とするように設計されている。

前記性質を有する新規な部位特異的モノコンジュゲート誘導体は、通常利用している治療化合物の持続型に相当にするものとして、投与頻度を減らして（例えば、毎日の代わりに毎週）使用することができる。

微生物トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）存在下における、Ｇ−ＣＳＦとＰＥＧ２０ｋＤａとの反応混合物の０時間でのＳＥ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。 微生物トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）存在下における、Ｇ−ＣＳＦとＰＥＧ２０ｋＤａとの反応混合物の室温、１６時間後のＳＥ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。 Ｇｌｎ¹³⁴上にＰＥＧ化されたＧ−ＣＳＦの精製後のＳＥ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。 ＰＥＧ２０ｋＤａでＧｌｎ¹³⁴上にＰＥＧ化されたＧ−ＣＳＦのＶ８加水分解物のゲル電気泳動を示す図である。 微生物トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）存在下における、ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ変異体（Ｇｌｎ１３５→Ａｓｎ１３５）とＰＥＧ２０ｋＤａとの反応混合物の０時間でのＳＥ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。 微生物トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）存在下における、ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ変異体（Ｇｌｎ１３５→Ａｓｎ１３５）とＰＥＧ２０ｋＤａとの反応混合物の室温、１６時間後のＳＥ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。 非微生物トランスグルタミナーゼ（モルモットおよびヒトケラチノサイト）存在下における、Ｇ−ＣＳＦとＰＥＧ２０ｋＤａとの反応混合物の０時間でのＳＥ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。 非微生物トランスグルタミナーゼ（モルモットおよびヒトケラチノサイト）存在下における、Ｇ−ＣＳＦとＰＥＧ２０ｋＤａとの反応混合物の室温、１６時間後のＳＥ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。 ｉｎ ｖｉｔｒｏ生物活性：Ｍ−ＮＦＳ６０細胞の増殖曲線を示す図である。 ラットにおける薬物動態プロファイルを示す図である。 ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ、Ｇｌｎ１５９Ａｓｎ ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ、およびＧｌｎ１５９Ａｓｎ／Ｇｌｎ１３５Ａｓｎ ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦのＰＥＧ化速度を示す図である。 微生物トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）存在下における、ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ（フィルグラスチム）とＰＥＧ２０ｋＤａとの反応混合物の０時間でのＳＥ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。 微生物トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）存在下における、ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ（フィルグラスチム）とＰＥＧ２０ｋＤａとの反応混合物の１６時間後のＳＥ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。 ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ−Ｇｌｎ１３５−ＰＥＧ２０ｋＤａ（フィルグラスチム−Ｇｌｎ１３５−ＰＥＧ２０ｋＤａ）の精製後のＳＥ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。 微生物トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）存在下における、Ｇｌｎ１３５Ａｓｎ ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ変異体とＰＥＧ２０ｋＤａとの反応混合物の０時間でのＳＥ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。 微生物トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）存在下における、Ｇｌｎ１３５Ａｓｎ ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ変異体とＰＥＧ２０ｋＤａとの反応混合物の１６時間後のＳＥ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。 微生物トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）存在下における、Ｇｌｎ１３５Ａｓｎ−Ｔｈｒ１３４Ｇｌｎ ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ変異体とＰＥＧ２０ｋＤａとの反応混合物の０時間でのＳＥ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。 微生物トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）存在下における、Ｇｌｎ１３５Ａｓｎ−Ｔｈｒ１３４Ｇｌｎ ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ変異体とＰＥＧ２０ｋＤａとの反応混合物の１６時間後のＳＥ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。 微生物トランスグルタミナーゼ（２５０ｍＵ／ｍｇタンパク質）存在下における、ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ（フィルグラスチム）とＰＥＧ２０ｋＤａとの反応混合物の０時間でのＳＥ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。 微生物トランスグルタミナーゼ（２５０ｍＵ／ｍｇタンパク質）存在下における、ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ（フィルグラスチム）とＰＥＧ２０ｋＤａとの反応混合物の２時間後のＳＥ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。

この手法の結果、本発明の新規なＧ−ＣＳＦコンジュゲート誘導体に関する限定的な態様は、以下のもの：
ポリペプチド鎖置換変異を導入すること、および／またはポリペプチド鎖の部分変性もしくは完全変性を用いることが不要であることを理由とした、治療に既に利用されているＧ−ＣＳＦ誘導体の１種に対応するポリペプチド鎖を有するタンパク質のコンジュゲーション反応における使用、
分子量範囲が５ｋＤａから６０ｋＤａの生体適合性の線状または分岐の水溶性ポリマーとのコンジュゲーション、
ａ）受容体相互作用に関わる残基の１つではなく、またはその１つに近接しておらず、更にｂ）アミノ酸１７４個の天然ヒトＧ−ＣＳＦにおいて、オリゴ糖鎖にコンジュゲートしている１３３位のスレオニン残基、またはアミノ酸１７５個のメチオニルＧ−ＣＳＦ誘導体の対応するスレオニン１３４残基、またはＧ−ＣＳＦ類縁体上の対応するスレオニン残基に、隣接または近接した位置にポリペプチド鎖上で配置されている単一で特異的なアミノ酸残基上の単一ポリマー鎖に、Ｇ−ＣＳＦを結合するコンジュゲーション技法の使用
である。

Ｇ−ＣＳＦは、好中球前駆細胞、好中球および幾種かの白血病細胞系の膜上に主に発現する特異的受容体（Ｇ−ＣＳＦＲ）と相互作用をした後、その機能を明らかにする。Ｇ−ＣＳＦのその受容体との結合（化学量論的には、Ｇ−ＣＳＦＲ２分子毎にＧ−ＣＳＦ２分子として起こる）は、受容体の二量化を誘発し、細胞増殖および非増殖的分化を刺激する一連の細胞内反応を活性化する。Ｇ−ＣＳＦ分子上には、受容体の二量化に関与する主な連結部位が２箇所あり、受容体結合に関わる残基が以下のように特定されている。即ち、結合部位１に関連するアミノ酸残基としてＬｙｓ４０、Ｐｈｅ１４４、Ｖａｌ４８およびＬｅｕ４９であり、結合部位２に関連するアミノ酸残基としてＧｌｕ１９、Ｌｅｕ１５、Ａｓｐ１１２およびＬｅｕ１２４である（例えば、非特許文献１１および非特許文献１２を参照）。

タンパク質において、ポリマー鎖への化学的コンジュゲーションに最も利用される反応性基は、リシンのε−アミノ基、およびポリペプチド鎖のＮ末端アミノ酸のα−アミノ基である。実際こうした基は、高めまたは低めの比率（％）であらゆるタンパク質配列中に出現する。Ｇ−ＣＳＦに関する限り、アミノ基への化学的連結によるＰＥＧコンジュゲーション（ＮＨ₂末端およびリシン性アミン）について記載した論文および特許が幾つかある。例えば、特許文献３には、ＰＥＧ鎖がリシンまたはアミノＮ末端残基に結合したＧ−ＣＳＦ−ＰＥＧコンジュゲートが記載されている。Ｇ−ＣＳＦでは、４個のリシン（Ｌｙｓ１６、Ｌｙｓ２３、Ｌｙｓ３４、Ｌｙｓ４０）ならびにポリペプチド鎖のＮ末端の遊離α−アミノ基があり、その上、これらの荷電官能基が普通、水性溶媒に接触できるので、このコンジュゲーションが可能となる。

Ｇ−ＣＳＦの場合、化学的コンジュゲーションの生成物は、１〜４個のＰＥＧ鎖が異なった位置に連結している数種のコンジュゲートの混合物であり、治療に適性とするには、これを分離して、最良の活性、薬物動態プロファイルおよび毒性プロファイルを示す１種または複数の異性体を単離しなければならない。

既述のように、いわゆる部位特異的コンジュゲーションにより単一コンジュゲートの形成をもたらす周知の化学的コンジュゲーション技法があるが、その形成は、Ｎ末端アミノ酸のα−アミノ基上、天然Ｇ−ＣＳＦ分子の遊離システイン残基上、または部位特異的変異誘発によりポリペプチド鎖中に挿入されたシステイン残基上でしか可能でない。第１の場合（特許文献５に記載されるような場合で、前記のＰＥＧ−フィルグラスチム化合物）には、Ｎ末端アミノ基の反応選択性は、約５のｐＨ値で化学反応を実施することにより改善され、こうした条件では、リシンのε−アミノ基は軽度な求核性（約９．５のｐＫａ）に過ぎないが、α−Ｎ末端基は依然として反応性であり、それより低いｐＫａ値を有する。

前記のシステインコンジュゲーションでは、部位特異的変異誘発を用いたシステイン残基の挿入によりＧ−ＣＳＦ一次配列を改変すること（例えば、Ｍ．Ｓ．Ｒｏｓｅｎｄａｈｌ等、２００５年の場合）、または天然Ｇ−ＣＳＦ Ｃｙｓ１７を露出させ、反応させるためにＧ−ＣＳＦの変性を用いること（例えば、特許文献６で言及している）が必要である。

したがって、従来の化学的コンジュゲーション手順は、本発明に記載の特性を示す部位特異的モノコンジュゲート誘導体の調製には適切でないと想定することができる。

トランスグルタミナーゼが触媒する酵素的コンジュゲーション反応でＧ−ＣＳＦの部位特異的モノコンジュゲート誘導体を調製するためには、予備分析により、潜在的に有用な酵素種およびそれらの性質、特に基質特異性に関する性質が確認されるであろう。

哺乳動物では、トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）は、その産物が、各種組織中（特に表皮組織、血液および前立腺中）に発現する、構造的、機能的に相関した９種のアイソザイム（ＴＧ−１からＴＧ−７、因子ＸＩＩＩＡ、バンド４．２）として区分される、一群の遺伝子によりコードされる。それらは、Ｃａ²⁺イオンの存在下、生理的タンパク質および異常タンパク質の翻訳後修飾反応を触媒する（例えば、非特許文献１３を参照）。

最近、様々な微生物から単離された、特に、Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ属細菌種およびＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌種に関連する微生物ＴＧａｓｅ（これらの酵素は、それぞれ細胞外レベルで、胞子内に局在している）についての記載がなされている。微生物ＴＧａｓｅは、対応する真核生物酵素と反対にＣａ²⁺イオンによる活性化を必要としない。その上、Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ属細菌種に由来し、ＭＴＧ（微生物トランスグルタミナーゼ）と通称される微生物ＴＧａｓｅは、肉、チーズおよびそれらの誘導品の質感を改善するために、食品産業においても用途が見出されている（例えば、非特許文献１４を参照）。

哺乳類および微生物双方のＴＧａｓｅは、ポリペプチド鎖のグルタミン残基のアシルアクセプターであるγ−カルボキサミド基に特異的に作用する。現在までのところ、特定のコンセンサス部位は同定されていないが、微生物または哺乳類ＴＧａｓｅは、ポリペプチド鎖の柔軟で溶媒接触可能な部位に位置するグルタミン残基だけを認識すると、一般に考えられている。しかし、グルタミン残基の前方または後方に、正荷電または立体障害性の側鎖を有するアミノ酸残基が存在すると、該酵素による認識が正の影響を受けることができるという兆候がある（例えば、非特許文献１５および非特許文献１６を参照）。アシルドナー部分に関しては、微生物および哺乳類双方のＴＧａｓｅは非選択的である。実際に該ＴＧａｓｅは、タンパク質鎖上のリシン残基のε−アミノ基と反応するだけでなく、アミン一般または一級脂肪族アルキルアミンとも反応することができ、線状鎖上にある少なくとも炭素原子４個の一級脂肪族アミンに対して特異的選択性を有している（例えば、非特許文献１７を参照）。

微生物トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）の原型と見なすことができる、Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍｏｂａｒａｅｎｓｅのトランスグルタミナーゼは、哺乳類ＴＧａｓｅより小さい。前者トランスグルタミナーゼの一次配列および三次構造（例えば、非特許文献１８を参照）を決定した結果、活性部位周辺のアミノ酸構造の違いが目立ったが、このことから、微生物ＴＧａｓｅは哺乳類ＴＧａｓｅほど特異的ではないと推測される。これらの構造研究に基づいて、微生物トランスグルタミナーゼの特異性は、グルタミン基質残基に関して、活性部位の間隙を形成するタンパク質構造の柔軟性がより大きいために、哺乳類トランスグルタミナーゼの特異性ほど厳密ではないと想定されている。その上、より小さいために、標的タンパク質のグルタミン基質残基との微生物トランスグルタミナーゼの相互作用が恐らく促進されている。

結論として、前記の従来法によれば、タンパク質ポリペプチド鎖上のグルタミン残基が微生物または哺乳類トランスグルタミナーゼの潜在的基質になる主要件は、柔軟で溶媒接触可能なタンパク質ドメイン中、または露出したポリペプチド鎖上に配置されていることである。Ｇ−ＣＳＦポリペプチド鎖中のアミノ酸１０個中約１個は、グルタミンであり、合計では１７残基になる。こうした残基は全て、推定上のトランスグルタミナーゼ基質と見なすことができるが、タンパク質の三次元構造が、グルタミン残基のほんの２〜３個しか該酵素に接触できなくする上で基本的な役割を演じている。

Ｘ線結晶解析で決定した（例えば、非特許文献１９を参照）場合のＧ−ＣＳＦ三次元構造に基づいて、Ｇ−ＣＳＦグルタミン残基１７個それぞれの側鎖表面の溶媒接触性が、分子ドッキング法を用いて計算されている。

表１（表中、Ｇｌｎ残基の記数は、アミノ酸１７４個の天然Ｇ−ＣＳＦを指示している）に示すように、グルタミン残基６個、特に７０位、１７３位、１３１位、１１９位、９０位および１１位のＧｌｎ残基は、側鎖表面の少なくとも４０％が溶媒に接触でき、したがって最も有力なトランスグルタミナーゼ基質と見なすことができる。

グルタミン基質周辺のアミノ酸残基（特に、正荷電および極性の残基）は、誘導体化部位の決定において寄与因子と見なされている（例えば、非特許文献１０を参照）。例えば、ＩＬ−２の酵素的ＰＥＧ化は、７４位（−ＶＬＮＬＡＱ⁷⁴ＳＫ−）で選択的に起こる。Ｇ−ＣＳＦでは、相対的に小さいが、なお相当な溶媒接触性表面を有するＧｌｎ１４５残基（−ＳＡＦＱ¹⁴⁵ＲＲＡＧ）が、上記規準に含まれ、別の潜在的ＴＧａｓｅ基質と見なすことができる。

一般に、推定上の微生物ＴＧａｓｅ基質として潜在的に挙動し、Ｇ−ＣＳＦ構造にある相対的に多数のグルタミンは、一級アミノ基官能化ポリマーでモノコンジュゲートした部位特異的誘導体をもたらすＴＧａｓｅ触媒反応を複雑化させると思われる。

メチオニル−Ｇ−ＣＳＦが、微生物トランスグルタミナーゼで触媒された２０ｋＤａモノメトキシ−ＰＥＧ−アミンとのコンジュゲーション反応を受けると、グルタミン１３５残基上で部位特異的にモノコンジュゲートした、高収率のメチオニル−Ｇ−ＣＳＦ−ＰＥＧ２０ｋＤａが得られることが、意外にも発見されたのであり、それは本発明の特定の主題である。

新規で生物活性なモノコンジュゲートＧ−ＣＳＦ誘導体は、本明細書に記載され、本発明の主題の１つであり、一級アミノ基で官能化された非免疫原性親水性ポリマー（例えば、モノメトキシ−ＰＥＧ−アルキルアミンもしくはモノメトキシ−ＰＥＧ−アミンの誘導体、またはその類縁体）の線状鎖または分岐鎖が、トランスグルタミナーゼ酵素触媒反応により共有結合アミド結合を介して、天然Ｇ−ＣＳＦにおけるオリゴ糖鎖にコンジュゲートしているスレオニン残基に隣接した、単一のグルタミン残基のアシル部分に部位特異的に連結されている。

特に、本発明に従って調製されるモノコンジュゲート誘導体は、アミノ酸１７４個の天然ヒトＧ−ＣＳＦポリペプチド鎖の１３２から１３７、好ましくは１３２から１３４の範囲の位置にあり、非免疫原性親水性ポリマーに共有結合で連結されたグルタミン残基を有することを特徴とする。より好ましくは、該グルタミン残基は、アミノ酸１７４個の天然ヒトＧ−ＣＳＦではＧｌｎ¹³⁴残基で表わされ、アミノ酸１７５個のメチオニル−Ｇ−ＣＳＦではＧｌｎ¹³⁵残基で表わされ、生物活性Ｇ−ＣＳＦ変異体の場合には、ポリペプチド鎖上の対応位置にあるグルタミン残基で表わされる。

本発明の一実施形態によれば、該水溶性ポリマーは、線状または分岐状のポリ（エチレングリコール）、ポリ（オキシプロピレン）、ポリ（オキシエチレン）−ポリ（オキシプロピレン）ブロックコポリマー、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（アクリロイルモルホリン）、多糖類、またはアミノカルバミルポリ（エチレングリコール）から選択される。

本発明の別の実施形態によれば、該親水性ポリマーは、分子量範囲が５ｋＤａから４０ｋＤａ、好ましくは１５ｋＤａから２５ｋＤａの線状または分岐状のモノメトキシ−ポリエチレングリコールアミンであり、一層より好ましくは分子量が約２０ｋＤａの線状のモノメトキシ−ポリエチレングリコールアミンである。例えば、それは次式：
ＮＨ₂−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｏ−（ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｏ）_n−ＣＨ₃
［式中ｎの範囲が約１１２から９０７、好ましくは約３３９から５６６、より好ましくは約４５３である］
の線状モノメトキシ−ポリエチレングリコールアミンであってもよい。

別の実施形態によれば、該親水性ポリマーは、分子量範囲が５ｋＤａから４０ｋＤａ、好ましくは１５ｋＤａから２５ｋＤａ、より好ましくは２０ｋＤａのアミノカルバミルポリエチレングリコールである。例えば、それは次式：

［式中ｎの範囲が約１０９から９０４、好ましくは約３３６から５６３、より好ましくは約４５０である］
のＯ−［メチル−ポリ（エチレングリコール）］−Ｎ−［２−（３−アミノプロポキシ）エトキシ］エチルカルバメートであってもよい。

本発明の別の主題は、前駆細胞の増殖および成熟好中球へのその分化に対して刺激活性を有し、前パラグラフに記載され、本発明のために利用できる部位特異的なモノコンジュゲート酵素反応により誘導体化されたＧ−ＣＳＦ分子であり、その分子には、アミノ酸１７４個の天然ヒトＧ−ＣＳＦ分子、Ｎ末端にメチオニル残基が追加されているアミノ酸１７５個のｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ（フィルグラスチム）、または天然Ｇ−ＣＳＦ配列と比較して、１個から１５個のアミノ酸残基が置換、除去もしくは付加されている他の類似のヒトＧ−ＣＳＦ変異型が含まれる。

本発明に従って部位特異的モノコンジュゲートを調製するために使用できるＧ−ＣＳＦアミノ酸配列を、以下に２例示す。

表中、ｎ＝０または１は、それぞれ、１７４個のアミノ酸の天然Ｇ−ＣＳＦおよび１７５個のアミノ酸のｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦに言及し、該ポリマーに共有結合しているグルタミン残基は、太字で下線が付されている。

特に、ｎ＝０のときはその配列が配列番号１、即ち、アミノ酸１７４個の天然ヒトＧ−ＣＳＦ配列であり、ｎ＝１のときはその配列が配列番号２、即ち、フィルグラスチムに相当する、Ｎ末端にメチオニル残基が追加されているアミノ酸１７５個のｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦである。

微生物トランスグルタミナーゼ（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍｏｂａｒａｅｎｓｅのＭＴＧ酵素）を利用する酵素的コンジュゲーション手順には、本明細書に説明用の例として記載する以下のステップ：
Ａ）ｐＨの範囲６から８の緩衝溶液中へのＧ−ＣＳＦ、またはその類縁体もしくは誘導体の溶解、
Ｂ）少なくとも１個の一級アミノ官能基を示す親水性ポリマー（例えば、メトキシ−ＰＥＧ−アミン）の添加、
Ｃ）ＭＴＧの添加、および１５から３５℃の範囲の温度、好ましくは２５℃での１〜２４時間の反応、
Ｄ）部位特異的モノコンジュゲートＧ−ＣＳＦの、好ましくはカラムクロマトグラフィーによる任意選択の精製
が含まれる。

一実施形態によれば、該酵素は、１〜３００ｍＵ／ｍｇの間で変化するＧ−ＣＳＦ量、好ましくは約２５０ｍＵ／ｍｇ Ｇ−ＣＳＦ量で使用され、その反応は１〜６時間実施される。

別の実施形態によれば、該酵素は、１〜２０ｍＵ／ｍｇの間で変化するＧ−ＣＳＦ量、好ましくは約１０ｍＵ／ｍｇ Ｇ−ＣＳＦ量で使用され、その反応は１２〜２４時間実施される。

タンパク質の溶解は、リン酸緩衝液その他のｐＨ６〜８の緩衝液中で、好ましくはｐＨ７．４で実施することができる。該反応は、ＮａＣｌその他の無機もしくは有機塩（１〜２００ｍＭの濃度）、あるいは濃度が０．００１〜２％の界面活性剤などの添加剤の存在下で実施することができる。

アミノ酸１７４個のＧ−ＣＳＦおよびＰＥＧ−アミン−２０ｋＤａを用いて反応を実施したとき（下記の実施例１に報告するとおり）、Ｇ−ＣＳＦ−ＰＥＧ２０ｋＤａモノＰＥＧ化誘導体の収率は８０％を超えていた。

コンジュゲート誘導体の特性決定は、ペプチドマッピング分析に従って実施した。生成ペプチドの配列により、アミノ基で官能化したＰＥＧとの天然Ｇ−ＣＳＦのコンジュゲーションが、Ｇｌｎ１３４残基上で選択的に起こり、部位特異的モノコンジュゲートが産生することが確認された。グルタミン１３４上で選択的にモノコンジュゲートされたＧ−ＣＳＦ誘導体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで相当な生物活性を有し、天然Ｇ−ＣＳＦと比較して、ｉｎ ｖｉｖｏ投与後の薬理活性の延長を示した。その上、グルタミン１３５上で選択的にモノコンジュゲートされたｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ（ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ−Ｇｌｎ¹³⁵−ＰＥＧ２０ｋＤａ）は、基準の市販製品Ｎｅｕｌａｓｔａ（登録商標）（メチオニルアミノ末端上での化学的ＰＥＧ化で得られるモノＰＥＧ化ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦで製造される）と比較して、高いｉｎ ｖｉｔｒｏ生物活性および同等の薬物動態プロファイルを示した。

微生物トランスグルタミナーゼで触媒される、アミノ酸１７４個の天然Ｇ−ＣＳＦのＧｌｎ１３４残基、またはアミノ酸１７５個のメチオニル−Ｇ−ＣＳＦのＧｌｎ１３５残基、またはＧ−ＣＳＦ類縁体の対応Ｇｌｎ残基に対するモノＰＥＧ化反応の特異性および選択性は、１個または複数のグルタミン残基が、部位特異的変異誘発によりアスパラギン残基で置換されたｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ変異体に関して実施したＰＥＧ化試験によって確認された。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中に発現し、少なくとも９５％まで精製した変異体は、非変異基準タンパク質と比較したｉｎ ｖｉｔｒｏ生物活性試験により示されたように、適正な構造的コンホメーションを維持していた。

ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦおよびその変異体２種（Ｇｌｎ１５９ＡｓｎおよびＧｌｎ１３５Ａｓｎ／Ｇｌｎ１５９Ａｓｎ）に対して同一反応条件で行い、そのプロファイルを図１１に示すＰＥＧコンジュゲーションにより、アスパラギン残基で置換するとｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦのＰＥＧ化反応が本質的に阻害されるので、グルタミン１３５だけがトランスグルタミナーゼ基質として挙動することが確認された。

その上、Ｇ−ＣＳＦ、および化学的コンジュゲーション（例えばＰＥＧ化）で得られるその誘導体は共に、水溶液中に保存すると容易に可溶性または不溶性凝集体を発生し、コンジュゲート誘導体の場合、不安定性は、位置およびコンジュゲーション法、タンパク質濃度および保存条件の関数として増加する（例えば、非特許文献２０および非特許文献２１を参照）。本発明に記載の新規なコンジュゲート誘導体（例えば、アミノ酸１７４個の天然Ｇ−ＣＳＦのＧｌｎ１３４上でＰＥＧ化した誘導体）は、界面活性剤の存在下および非存在下で、濃度５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌのいずれでも凝集に対して安定であった。

本発明の別の主題は、単一の特異的なグルタミン残基上で非免疫原性親水性ポリマーにモノコンジュゲートされた、Ｇ−ＣＳＦ誘導体およびその類縁体の医薬製剤であって、調製済み滅菌溶液、または使用のために適当な溶媒で液戻しする滅菌凍結乾燥粉末を含み得る医薬製剤を包含する。

第１の例（調製済み滅菌溶液）では、濃度範囲１から１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは５から１０ｍｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦコンジュゲート誘導体（例えば、天然Ｇ−ＣＳＦのＧｌｎ¹³⁴にコンジュゲートしたモノＰＥＧ化誘導体）だけでなく、例えばスクロース、ラクトース、マンニトールまたはソルビトールの中から選択される等張化剤、および溶液ｐＨを４または５（好ましくは５）に調節する適切な緩衝剤も含んでもよい。場合により、この製剤の別の成分は、Ｔｗｅｅｎ２０またはＴｗｅｅｎ８０などの非イオン界面活性剤であり得る。

使用のために液戻しすることになる滅菌した凍結乾燥粉末製剤の場合、その成分の１種は、マンニトール、トレハロース、ソルビトールまたはグリシンなどの膨張剤、および必要であればトレハロースまたはマンニトールなどの凍結保護剤でもよい。液戻し用の溶媒は、注射用の化合物に対して、ｐＨを４から５に調節するための緩衝剤塩を含んだ、または含まない水であり得る。

本発明の目的において、
用語「Ｇ−ＣＳＦ相同体」とは、アミノ酸１７４個の天然ヒトＧ−ＣＳＦのアミノ酸配列との相同性が、少なくとも９０％のアミノ酸配列を有する任意のタンパク質を指す。Ｇ−ＣＳＦ相同体のアミノ酸配列の変化は、アミノ酸１７４個の該天然ヒト配列のアミノ酸１個または複数の付加、サブトラクション、置換または化学修飾に起因し得、
用語「ヒトＧ−ＣＳＦ類縁体」とは、前駆細胞の増殖および成熟好中球への分化を刺激する天然ヒトＧ−ＣＳＦの活性を有し、そのアミノ酸配列は、配列番号１に従うが、アミノ酸１から１５個が除去され、または他のアミノ酸で置換されているポリペプチドを指し、
用語「ヒトＧ−ＣＳＦ誘導体」とは、前駆細胞の増殖および成熟好中球への分化を刺激する天然ヒトＧ−ＣＳＦの活性を有し、そのアミノ酸配列は、配列番号１に報告されているが、該配列のアミノ酸１個または複数が他の分子に連結されているポリペプチドを指し、Ｇ−ＣＳＦ誘導体の代表例は、グリコシル化Ｇ−ＣＳＦのフィルグラスチム、具体的には、Ｎ末端にメチオニル残基を有する配列番号２のポリペプチドであるが、前記用語同士は、アミノ酸１個または複数が他の分子に結合しているＧ−ＣＳＦ類縁体も本発明のために使用できるので、相互に排他的ではなく、
用語「非免疫原性」とは、酵素的コンジュゲーション反応に使用されるポリマーを指し、その同じポリマーを全身経路を介して投与したとき、免疫系の活性化を誘発することもなく、特異的な抗ポリマー抗体をさほど生じることもないことを意味する。

本発明の好ましい実施形態を、それだけに限らないが以下の実施例により例示する。
（実施例１）
部位特異的なモノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ−Ｇｌｎ ¹³⁴ −ＰＥＧ２０ｋＤａ誘導体の調製
大腸菌中に発現した非グリコシル化ｒｅｃ−Ｇ−ＣＳＦをｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸二水素カリウム緩衝液中に溶解し、その濃度を約５３μＭに相当するタンパク質１ｍｇ／ｍｌとした。次いで、２０ｋＤａのモノメトキシ−ポリ（エチレングリコール）アミン（メトキシポリ（エチレングリコール）アミン２００００、Ｆｌｕｋａ）を、そのタンパク質溶液にＰＥＧ：Ｇ−ＣＳＦのモル比１０：１になるまで添加した。微生物トランスグルタミナーゼ（Ａｃｔｉｖａ ＷＭ、味の素）を０．０２４Ｕ／ｍｌ反応溶液の濃度で添加した後、タンパク質溶液を軽く撹拌しながら室温で１６時間インキュベートした。反応の完了後、その溶液をｐＨ４．０の２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液を用いて希釈し、線形勾配（１５カラム容積中、０から５００ｍＭ ＮａＣｌ）で溶出するカラムクロマトグラフィー（ＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）で精製した。モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦを含有する画分のプールを濃縮し、ｐＨ４．０の２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液を用いて溶出する、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム上でのゲルろ過で処理した。

この工程の最後に、Ｇｌｎ１３４残基（ｒｅｃ−ｈ−Ｇ−ＣＳＦ−Ｃｌｎ¹³⁴−ＰＥＧ２０ｋＤａ）上で選択的にモノＰＥＧ化された誘導体を、ｐＨ４の２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液中、約１ｍｇ／ｍｌの濃度で得た。

調製および精製の各段階で、試料をＳＥ−ＨＰＬＣカラム上で分析し、反応収率、精製度およびタンパク質濃度を決定した。開始時および室温での１６時間のインキュベーション後の反応混合物、ならびに１３４位でモノＰＥＧ化された精製誘導体のクロマトグラムを、それぞれ図１、２および３に示す。

（実施例２）
ｒｅｃ−ｈ−Ｇ−ＣＳＦ−Ｇｌｎ ¹³⁴ −ＰＥＧ２０ｋＤａのコンジュゲーション部位の決定
精製したｒｅｃ−ｈ−Ｇ−ＣＳＦ−Ｇｌｎ¹³⁴−ＰＥＧ２０ｋＤａ化合物を、エンドプロテイナーゼＧｌｕｃＣを用いて酵素的に加水分解した。それを１２０ｍＭのＮＨ₄ＨＣＯ₃緩衝液中、ｐＨ８．８、温度３７℃で１８時間インキュベートした。

分解後、ペプチド混合物をポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析したところ、３つの電気泳動バンドが以下のように分離した（図４を参照）：（Ｉ）分子量４０００Ｄａ未満のタンパク質に相当する移動帯、（ＩＩ）分子量約４００００Ｄａのタンパク質に相当する移動帯、（ＩＩＩ）分子量約６００００Ｄａのタンパク質に相当する移動帯。最後のものは、分子量計算値３８７９８Ｄａ（２００００＋１８７９８）を有する非加水分解ＰＥＧ化タンパク質の残留物である。その高分子量化は、ＰＥＧ２０ｋＤａに繋がったものに属するとみなさなければならず、サイズ２倍の球状タンパク質（４０ｋＤａ）に相当する。バンドＩＩは、ヨウ化バリウムで処理した後、強い陽性反応を示し、したがってＰＥＧ化ペプチドの存在を示している。バンドＩＩは、ＰＶＤＦ膜上にウェスタンブロットし、自動エドマン分解を用いて分析することにより、アミノ酸配列を決定した（表２を参照）。

上記に示した結果から、ＰＥＧ化は、エンドプロテイナーゼＧｌｕｃＣによる加水分解から生じるＬｅｕ¹²⁴〜Ａｌａ¹⁴¹ペプチド上、より具体的には、Ｌｅｕ¹²⁴〜Ａｌａ¹⁴¹ペプチドＮ末端配列の１１番アミノ酸に相当するＧｌｎ¹³⁴残基上で特異的に起こることが明確に推定することができる。

（実施例３）
Ｇｌｎ１５９ＡｓｎおよびＧｌｎ１５９Ａｓｎ／Ｇｌｎ１３５Ａｓｎ ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ変異体の微生物ＴＧａｓｅによるＰＥＧ２０ｋＤａ−ＮＨ ₂ へのＰＥＧ化
大腸菌中に発現した非グリコシル化変異体各々をｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸二水素カリウム溶液中に溶解し、その濃度を約５３μＭに相当するタンパク質１ｍｇ／ｍｌとした。次いで、２０ｋＤａのモノメトキシ−ポリ（エチレングリコール）アミン（メトキシポリ（エチレングリコール）アミン２００００、Ｆｌｕｋａ）を、そのタンパク質溶液にＰＥＧ：Ｇ−ＣＳＦのモル比１０：１になるまで添加した。微生物トランスグルタミナーゼ（Ａｃｔｉｖａ ＷＭ、味の素）を０．０２４Ｕ／ｍｌ反応溶液の濃度で添加した後、タンパク質溶液を軽く撹拌しながら室温で１６時間インキュベートした。反応の開始および終了時に、反応混合物のアリコートをＳＥ−ＨＰＬＣカラム上で分析し、収率およびタンパク質濃度を決定した。

単一変異体Ｇｌｎ１５９Ａｓｎとは対照的に、二重変異体Ｇｌｎ１５９Ａｓｎ／Ｇｌｎ１３５ＡｓｎがＰＥＧ化生成物を全く産生しなかったという事実から、コンジュゲーションは、１３５位のグルタミン上で特異的に行なわれ、上記に示したアミノ酸配列データが確認されることが分かる。室温でのインキュベーションの開始時、および１６時間後の反応混合物のクロマトグラムを、それぞれ図５および６に示す。

（実施例４）
モルモットＴＧａｓｅによるｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦのＰＥＧ２０ｋＤａ−ＮＨ ₂ へのＰＥＧ化
大腸菌中に発現した非グリコシル化ｒｅｃ−Ｇ−ＣＳＦをｐＨ７．５の１００ｍＭ トリス緩衝液中に溶解し、その濃度を約５３μＭに相当するタンパク質１ｍｇ／ｍｌとした。次いで、２０ｋＤａのモノメトキシ−ポリ（エチレングリコール）アミン（メトキシポリ（エチレングリコール）アミン２００００、Ｆｌｕｋａ）を、そのタンパク質溶液にＰＥＧ：Ｇ−ＣＳＦのモル比１０：１になるまで添加した。モルモットトランスグルタミナーゼ（Ｓｉｇｍａ）を０．３Ｕ／ｍｌ反応溶液の濃度まで、および１０ｍＭ ＣａＣｌ₂を添加した後、タンパク質溶液を軽く撹拌しながら室温で１６時間インキュベートした。反応の開始および終了時に、反応混合物の試料をＳＥ−ＨＰＬＣカラム上で分析し、収率およびタンパク質濃度を決定した。

予想通り、この酵素はＰＥＧコンジュゲートを全く産生しなかった。

室温でのインキュベーションの開始時、および１６時間後の反応混合物のクロマトグラムを、それぞれ図７および８に示す。

（実施例５）
ヒトケラチノサイトＴＧａｓｅによるｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦのＰＥＧ２０ｋＤａ−ＮＨ ₂ へのＰＥＧ化
大腸菌中に発現した非グリコシル化ｒｅｃ−Ｇ−ＣＳＦをｐＨ７．５の１００ｍＭ トリス緩衝液中に溶解し、その濃度を約２６．５μＭに相当するタンパク質０．５ｍｇ／ｍｌとした。次いで、２０ｋＤａのモノメトキシ−ポリ（エチレングリコール）アミン（メトキシポリ（エチレングリコール）アミン２００００、Ｆｌｕｋａ）を、そのタンパク質溶液にＰＥＧ：Ｇ−ＣＳＦのモル比１０：１にまで添加した。ヒトケラチノサイトトランスグルタミナーゼ（組換えヒトケラチノサイトトランスグルタミナーゼ、Ｎ−Ｚｙｍｅ）を０．５Ｕ／ｍｌ反応溶液の濃度まで、および１０ｍＭ ＣａＣｌ₂を添加した後、タンパク質溶液を軽く撹拌しながら室温で１６時間インキュベートした。反応の開始および終了時に、反応混合物のアリコートをＳＥ−ＨＰＬＣカラム上で分析し、収率およびタンパク質濃度を決定した。

予想通り、この酵素はＰＥＧコンジュゲートを全く産生しなかった。

（実施例６）
ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ−Ｇｌｎ ¹³⁵ −ＰＥＧ２０ｋＤａのｉｎ ｖｉｔｒｏ生物活性の決定
Ｇ−ＣＳＦの存在下で増殖活性を増加させるマウス骨髄芽細胞系Ｍ−ＮＦＳ６０を用いる増殖アッセイで、ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ−Ｇｌｎ¹³⁵−ＰＥＧ２０ｋＤａの生物活性をｉｎ ｖｉｔｒｏで試験した（非特許文献２２を参照）。

Ｍ−ＮＦＳ６０細胞を、ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ−Ｇｌｎ¹³⁵−ＰＥＧ２０ｋＤａ（１〜３０ｎｇ／ｍｌ）、標準Ｇ−ＣＳＦ（０．００１〜５ｎｇ／ｍｌ）およびＮ末端ＰＥＧ化ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ（１〜３０ｎｇ／ｍｌ）の増加していく濃度を含有する培地（ＲＰＭＩ １６４０、１０％ＦＢＳ）２００μｌ中、細胞１０⁴個／ウェルの濃度で９６−ウェルプレート中に分配した。

各プレートを５％ＣＯ₂雰囲気中、３７℃でインキュベートした。４８時間後、ＷＳＴ１試薬２０μｌを添加し、同じ条件で更に４時間インキュベーションを継続した。

各試料の吸光度を、ＥＬＩＳＡマイクロプレートリーダーを用いて（白い）バックグランドに対して波長範囲４２０〜４８０ｎｍで測定した。標準増殖曲線を用いて、試験した試料の生物活性を計算し、ＥＣ₅₀値（最大増殖の５０％を誘導する濃度）として表わした。

アッセイの結果を、表３および図９に示す。

その結果、グルタミン１３５にモノコンジュゲートしたｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ−Ｇｌｎ¹³⁵−ＰＥＧ２０ｋＤａ誘導体は、天然タンパク質の約２０％のｉｎ ｖｉｔｒｏ残存活性を有し、これは、Ｎ末端ＰＥＧ化ｈ−Ｇ−ＣＳＦ（ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ−ＮＨ−ＰＥＧ２０ｋＤａ）の残存活性よりやや高いことが示された。

（実施例７）
ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ−Ｇｌｎ ¹³⁵ −ＰＥＧ２０ｋＤａの薬物動態プロファイルの決定
この実験では、グルタミン１３５上で選択的にモノＰＥＧ化されたｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ−Ｇｌｎ¹³⁵−ＰＥＧ２０ｋＤａをラットの皮下に投与し、血清タンパク質濃度の経時評価によってその持続作用を調べた。

体重３００〜３５０ｇのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ雄性ラット４匹からなる３群について、天然Ｇ−ＣＳＦ、Ｎ末端ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ（ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ−ＮＨ−ＰＥＧ２０ｋＤａ）およびｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ−Ｇｌｎ¹³⁵−ＰＥＧ２０ｋＤａを、ラットの背部の皮下に注射した。

第１群の各４匹は、１０ｍＭ酢酸緩衝液を含むｐＨ５の緩衝塩水溶液に溶解したＧ−ＣＳＦ０．１ｍｇ／ｋｇ用量の接種を受けた。

第２群の各４匹には、ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ−ＮＨ−ＰＥＧ２０ｋＤａ（１０ｍＭ酢酸緩衝液を含むｐＨ５の緩衝塩水溶液に溶解した）をＧ−ＣＳＦ相当量として計算した用量０．１ｍｇ／ｋｇで投与した。

第３群の各４匹には、ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ−Ｇｌｎ¹³⁵−ＰＥＧ２０ｋＤａ（１０ｍＭ酢酸緩衝液を含むｐＨ５の緩衝塩水溶液に溶解した）をＧ−ＣＳＦ相当量として計算した用量０．１ｍｇ／ｋｇで投与した。

投与直後ならびに１、２、４、８、２４、３２、４８および７２時間後に、血液試料０．５ｍｌを採取した。血液試料を処理して血清を取得し、これを、ＥＬＩＳＡタンパク質免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡキット：ヒトＧ−ＣＳＦアッセイキット；ｃｏｄ．ＪＰ２７１３１；ＩＢＬ Ｃｏ．Ｌｔｄ．）で、ｈ−Ｇ−ＣＳＦを投与したラットから得た血清の標準としてｈ−Ｇ−ＣＳＦを、第２群のラットから得た血清の標準としてｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ−ＮＨ−ＰＥＧ２０ｋＤａを、ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ−Ｇｌｎ¹³⁵−ＰＥＧ２０ｋＤａで処置したラットに対するラット血清投薬量の標準としてｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ−Ｇｌｎ¹³⁵−ＰＥＧ２０ｋＤａを用いて試験した。

血清濃度の値を用いて、図１０に報告したように薬物動態プロファイルを計算し、ＡＵＣ（曲線下面積）、Ｔ_maxおよびＣ_max（ピークの時間および濃度）およびＴ_1/2（半減期）を決定した。その結果を表４に示す。

（実施例８）
部位特異的モノＰＥＧ化ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ−Ｇｌｎ ¹³⁵ −ＰＥＧ２０ｋＤａ（フィルグラスチム−Ｇｌｎ１３５−ＰＥＧ２０ｋＤａ）誘導体の調製
大腸菌中に発現した非グリコシル化ｒｅｃ−ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ（フィルグラスチム）をｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸二水素カリウム中に溶解し、その濃度を約５３μＭに相当するタンパク質１ｍｇ／ｍｌとした。次いで、２０ｋＤａのモノメトキシ−ポリ（エチレングリコール）アミン（メトキシポリ（エチレングリコール）アミン２００００、Ｆｌｕｋａ）を、そのタンパク質溶液にＰＥＧ：Ｇ−ＣＳＦのモル比１０：１になるまで添加した。微生物トランスグルタミナーゼ（Ａｃｔｉｖａ ＷＭ、味の素）を０．０２４Ｕ／ｍｌ反応溶液の濃度まで添加した後、タンパク質溶液を軽く撹拌しながら室温で１６時間インキュベートした。反応の終了時、その溶液をｐＨ４．０の２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液で希釈し、線形勾配（１５カラム容積中、０から５００ｍＭ ＮａＣｌ）で溶出するカラムクロマトグラフィー（ＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）で精製した。モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦを含有する画分のプールを濃縮し、ｐＨ４．０の２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液で溶出する、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム上でのゲルろ過で処理した。

この工程の終了時、誘導体は、ｐＨ４の２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液中、約１ｍｇ／ｍｌの濃度で、Ｇｌｎ１３５残基上に選択的にモノＰＥＧ化されていた（ｒｅｃ−ｈ−ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ−Ｇｌｎ¹³⁵−ＰＥＧ２０ｋＤａ）。

調製および精製の各段階の試料をＳＥ−ＨＰＬＣカラム上で分析し、反応収率、精製率および濃度を決定した。開始時および室温での１６時間のインキュベーション後の反応混合物、ならびに１３５位（Ｇｌｎ１３５）でモノＰＥＧ化された精製誘導体のクロマトグラムを、それぞれ図１２、１３および１４に示す。

（実施例９）
Ｇｌｎ１３５Ａｓｎ ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ変異体の微生物ＴＧａｓｅによるＰＥＧ２０ｋＤａ−ＮＨ ₂ へのＰＥＧ化
大腸菌中に発現した非グリコシル化Ｇｌｎ１３５Ａｓｎ ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦをｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸二水素カリウム緩衝液中に溶解し、その濃度を約５３μＭに相当するタンパク質１ｍｇ／ｍｌとした。次いで、２０ｋＤａのモノメトキシ−ポリ（エチレングリコール）アミン（メトキシポリ（エチレングリコール）アミン２００００、Ｆｌｕｋａ）を、そのタンパク質溶液にＰＥＧ：Ｇ−ＣＳＦのモル比１０：１になるまで添加した。微生物トランスグルタミナーゼ（Ａｃｔｉｖａ ＷＭ、味の素）を０．０２４Ｕ／ｍｌ反応溶液の濃度まで添加した後、タンパク質溶液を軽く撹拌しながら室温で１６時間インキュベートした。反応の開始および終了時、反応混合物の試料をＳＥ−ＨＰＬＣカラム上で分析し、収率およびタンパク質濃度を決定した。

反応の開始前に記録したクロマトグラム（図１５）および１６時間後に記録したクロマトグラム（図１６）は、非コンジュゲートタンパク質に相当する保持時間に１本のピークを有することを特徴としており、したがってこのＧｌｎ１３５Ａｓｎ変異体はＰＥＧ化されなかった。

（実施例１０）
Ｇｌｎ１３５Ａｓｎ−Ｔｈｒ１３４Ｇｌｎ ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ変異体の微生物ＴＧａｓｅによるＰＥＧ２０ｋＤａ−ＮＨ ₂ へのＰＥＧ化
大腸菌中に発現した非グリコシル化Ｇｌｎ１３５Ａｓｎ−Ｔｈｒ１３４Ｇｌｎ変異体をｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸二水素カリウム緩衝液中に溶解し、その濃度を約５３μＭに相当するタンパク質１ｍｇ／ｍｌとした。次いで、２０ｋＤａのモノメトキシ−ポリ（エチレングリコール）アミン（メトキシポリ（エチレングリコール）アミン２００００、Ｆｌｕｋａ）を、そのタンパク質溶液にＰＥＧ：Ｇ−ＣＳＦのモル比１０：１になるまで添加した。微生物トランスグルタミナーゼ（Ａｃｔｉｖａ ＷＭ、味の素）を０．０２４Ｕ／ｍｌ反応溶液の濃度まで添加した後、タンパク質溶液を軽く撹拌しながら室温で１６時間インキュベートした。反応の開始および終了時、反応混合物の試料をＳＥ−ＨＰＬＣカラム上で分析し、収率およびタンパク質濃度を決定した。ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ−Ｇｌｎ１３４−ＰＥＧ２０ｋＤａ変異体のＰＥＧ化収率計算値は６０％である。

反応の開始前に採取した試料のクロマトグラム（図１７）は、タンパク質に相当する単一ピークを示した。２５℃で１６時間インキュベーションした後、保持時間が短縮された（したがってＭＷが増加した）新しいピークが認められ、これは、反応の終了時に採取した試料のクロマトグラムにも示された（図１８）。

（実施例１１）
微生物ＴＧａｓｅ（２５０ｍＵ／ｍｇタンパク質）の使用によるＭｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ（フィルグラスチム）のＰＥＧ２０ｋＤａ−ＮＨ ₂ へのＰＥＧ化
この実施例は、２５０ｍＵ ＭＴｇａｓｅ／ｍｇフィルグラスチムの比率でＭＴＧａｓｅを用いると、僅か２時間の反応時間後にフィルグラスチムのＰＥＧ化を定量的に得ることが可能であることを示している。

大腸菌中に発現した非グリコシル化ｒｅｃ−ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ（フィルグラスチム）をｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸二水素カリウム緩衝液中に溶解し、その濃度を約５３μＭに相当するタンパク質１ｍｇ／ｍｌとした。次いで、２０ｋＤａのモノメトキシ−ポリ（エチレングリコール）アミン（メトキシポリ（エチレングリコール）アミン２００００、Ｆｌｕｋａ）を、そのタンパク質溶液にＰＥＧ：Ｇ−ＣＳＦのモル比１０：１になるまで添加した。次いで、微生物トランスグルタミナーゼ（Ａｃｔｉｖａ ＷＭ、味の素）を０．２５Ｕ／ｍｌ反応溶液の濃度まで反応混合物に添加した。その反応を、軽く撹拌しながら室温で２時間実施した。試料を採取し、ＳＥ−ＨＰＬＣカラム上で分析することにより、反応収率を決定した。開始時、および室温で２時間後の反応混合物のクロマトグラムを、それぞれ図１９および２０に示す。

Claims (26)

1. ヒトＧ−ＣＳＦポリペプチド鎖配列のグルタミン残基が非免疫原性親水性ポリマーに共有結合で連結している、ヒトＧ−ＣＳＦの部位特異的モノコンジュゲートであって、前記グルタミン残基が、アミノ酸１７４個の天然ヒトＧ−ＣＳＦポリペプチド鎖の１３３番から１３４番の範囲の位置、またはアミノ酸１７５個のＭｅｔ−Ｇ−ＣＳＦポリペプチド鎖の１３４番から１３５番の範囲の位置にあることを特徴とする、ヒトＧ−ＣＳＦの部位特異的モノコンジュゲート。
2. 前記グルタミン残基は、アミノ酸１７４個の天然ヒトＧ−ＣＳＦポリペプチド鎖の１３４番、またはアミノ酸１７５個のＭｅｔ−Ｇ−ＣＳＦポリペプチド鎖の１３５番の位置にあることを特徴とする、請求項１に記載のヒトＧ−ＣＳＦの部位特異的モノコンジュゲート。
3. 前記コンジュゲート化親水性ポリマーは、少なくとも１個のアミノ基で官能化されていることを特徴とする、請求項１に記載のＧ−ＣＳＦの部位特異的モノコンジュゲート。
4. 前記親水性ポリマーは、線状または分岐状のポリエチレングリコール、ポリオキシプロピレン、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー、ポリビニルピロリドン、ポリアクリロイルモルホリン、多糖類、アミノカルバミルポリエチレングリコールの中から選択されることを特徴とする、請求項１に記載のＧ−ＣＳＦの部位特異的モノコンジュゲート。
5. 前記親水性ポリマーは、分子量が５ｋＤａから４０ｋＤａの範囲にある線状または分岐状のモノメトキシ−ポリエチレングリコールアミンであることを特徴とする、請求項１に記載のＧ−ＣＳＦの部位特異的モノコンジュゲート。
6. 前記親水性ポリマーは、分子量が１５ｋＤａから２５ｋＤａの範囲にある線状または分岐状のモノメトキシ−ポリエチレングリコールアミンであることを特徴とする、請求項１に記載のＧ−ＣＳＦの部位特異的モノコンジュゲート。
7. 前記親水性ポリマーは、分子量２０ｋＤａの線状モノメトキシ−ポリエチレングリコールアミンであることを特徴とする、請求項１に記載のＧ−ＣＳＦの部位特異的モノコンジュゲート。
8. 前記親水性ポリマーは、分子量が５ｋＤａから４０ｋＤａの範囲にあるアミノカルバミルポリエチレングリコールであることを特徴とする、請求項１に記載のＧ−ＣＳＦの部位特異的モノコンジュゲート。
9. 配列番号１に対応するアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１に記載のヒトＧ−ＣＳＦの部位特異的モノコンジュゲート。
10. 配列番号２に対応するアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１に記載のＧ−ＣＳＦの部位特異的モノコンジュゲート。
11. 医薬として許容可能な賦形剤および／または補助剤と共に、請求項１から１０のいずれかに記載のヒトＧ−ＣＳＦの部位特異的モノコンジュゲートを少なくとも１種含有することを特徴とする製剤。
12. 溶液または凍結乾燥粉末であることを特徴とする、請求項１１に記載の製剤。
13. 非経口的に投与できることを特徴とする、請求項１１に記載の製剤。
14. 好中球減少症を治療および／または予防するための、および／または哺乳類末梢血の造血前駆細胞を動員するための医薬製剤の調製における、請求項１から１０のいずれかに記載の少なくとも１種の部位特異的モノコンジュゲートの使用。
15. トランスグルタミナーゼ活性酵素の存在下、グルタミン残基と非免疫原性親水性ポリマーとのアミド結合反応の達成を含むことを特徴とする、請求項１から１０のいずれかに記載の部位特異的モノコンジュゲートを調製する方法。
16. 前記酵素は細菌起源であることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
17. 前記酵素は、Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍｏｂａｒａｅｎｓｅのトランスグルタミナーゼであることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
18. 前記反応は、ｐＨが６から８の範囲の緩衝塩水溶液中で実施されることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
19. 前記反応は１〜２４時間実施されることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
20. 前記酵素は、１〜３００ｍＵ／ｍｇ Ｇ−ＣＳＦ、またはその類縁体および／または誘導体量で使用され、前記反応は、１〜６時間実施されることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
21. 前記酵素は、１〜２０ｍＵ／ｍｇ Ｇ−ＣＳＦ、またはその類縁体および／または誘導体量で使用され、前記反応は、１２〜２４時間実施されることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
22. 前記反応は、１５から３５℃の温度範囲で実施されることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
23. 前記反応は、無機塩もしくは有機塩の存在下、および／または界面活性剤の存在下で実施されることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
24. 前記無機塩および／または有機塩は、０から２００ｍＭの間で変化する濃度で存在し、前記界面活性剤は、０から２％の間で変化する濃度で存在することを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
25. 前記無機塩はＮａＣｌであることを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
26. 前記酵素、および／または前記のＧ−ＣＳＦまたはその類縁体および／または誘導体は、組換え体起源であることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。

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