DE10011926A1

DE10011926A1 - Genetisch veränderte Fibroblastenzellen

Info

Publication number: DE10011926A1
Application number: DE10011926A
Authority: DE
Inventors: Peter Angel; Norbert Fusenig; Andrea Kolbus; Marina Schorpp-Kistner; Axel Szabowski; Nicole Maas-Szabowski; Sven Andrecht
Original assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Current assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Priority date: 2000-01-14
Filing date: 2000-01-14
Publication date: 2001-08-02
Also published as: US6846674B2; CA2396996A1; WO2001051619A3; JP2003519487A; US20030109474A1; AU2001237215A1; WO2001051619A2; EP1248835A2

Abstract

Beschrieben werden genetisch veränderte Fibroblastenzellen mit den folgenden Eigenschaften: (a) ein eine Untereinheit des Transkriptionsfaktors AP-1 codierendes Gen ihres Genoms ist inaktiviert und (b) sie enthält in einem Expressionsvektor mit einem Promotor funktionell verknüpft das Gen von (a) in einer solchen Form, daß erst nach Induktion des Promotors die aktive Untereinheit exprimiert wird oder die von dem Gen codierte Untereinheit in inaktiver und aktivierbarer Form vorliegt. Ferner wird ein Verfahren unter Verwendung der erfindungsgemäßen Fibroblastenzelle zur Identifizierung einer Verbindung beschrieben, die die AP-1 abhängige Differenzierung und/oder Proliferation von Keratinozyten fördern, hemmen oder modifizieren kann oder eines Gens, das an der AP-1 abhängigen Differenzierung und/oder Proliferation von Keratinozyten beteiligt ist, sowie die Verwendung der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten Testverbindung bzw. des Gens zur Behandlung oder Diagnose von Erkrankungen, die mit einer gestörten Proliferation und/oder Differenzierung von Keratinozyten assoziiert sind.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft genetisch veränderte Fibroblastenzellen, bei denen ein eine Untereinheit des Transkriptionsfaktors AP-1 codierendes Gen ihres Genoms inaktiviert ist und die in einem Expressionsvektor mit einem Promotor funktionell verknüpft das vorerwähnte Gen in einer solchen Form enthalten, daß erst nach Induktion des Promotors die aktive Untereinheit exprimiert wird oder in einer solchen Form enthält, daß die von dem Gen codierte Untereinheit in inaktiver, aber aktivierbarer, Form vorliegt. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die die AP-1 abhängige Differenzierung und/oder Proliferation von Keratinozyten fördern, hemmen oder modifizieren können und die Identifizierung von Genen ermöglichen, die an der AP-1 abhängigen Differenzierung und/oder Proliferation von Keratinozyten beteiligt sind.

Die Proliferation und Differenzierung von Keratinozyten und damit die Struktur und Funktion der Epidermis sind von der Interaktion mit Fibroblasten abhängig, wobei diese Prozesse zumindest zum Teil von der gesteuerten Expression von Genen abhängen, die von dem Transkriptionsfaktor AP-1 (z. B. c-Jun, JunB) abhängig sind. Es kann davon ausgegangen werden, daß eine abnormale oder fehlende Regulation dieser Gene zu einer gestörten Proliferation und/oder Differenzierung der Keratinozyten führt, was wiederum zu einer Reihe von Erkrankungen führen kann, beispielsweise einem gestörten Hautmetabolismus (gestörte Wundheilung, Psoriasis, chronische Entzündungsreaktionen etc.) oder der Bildung von Hauttumoren. Bisher sind die daran beteiligten Gene bzw. Faktoren kaum bekannt und die bisherige Suche nach solchen Faktoren, die im wesentlichen auf pharmakologischen Studien an Zellkulturen oder Tieren, z. T. auch auf klinischen Studien basiert, hat den Nachteil, daß die durchzuführenden Analysen sehr komplex und zeitaufwendig und vor allem auch kaum selektiv sind.

Somit liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, Mittel zur Identifizierung von Verbindungen bereitzustellen, die direkt oder indirekt mit einer Expression des Transkriptionsfaktors AP-1 in Zusammenhang stehen bzw. direkt oder indirekt durch diesen Transkriptionsfaktor reguliert werden und die an der Proliferation und/oder Differenzierung von Hautkeratinozyten beteiligt sind. Dies sind einerseits Verbindungen, die über den Transkriptionsfaktor AP-1 direkt Gene steuern, die für die Regulation von Wachstum und Differenzierung der Epidermis verantwortlich und in krankhaften Zuständen defekt sind oder fehlerhaft reguliert werden. Zu diesen Verbindungen gehören eine große Zahl bekannter und noch nicht hinreichend bekannter Signalsubstanzen, wie Interleukine und andere Zytokine und Wachstumsfaktoren sowie synthetische Agonisten bzw. Antagonisten für ihre Rezeptoren. Die von ihnen über AP-1 gesteuerten Gene bzw. deren Produkte umfassen eine ähnlich große Zahl bekannter und noch nicht hinreichend bekannter Wachstums- und Differenzierungsfaktoren, Enzyme, deren Inhibitoren, sowie strukturelle Proteine der epidermalen Zellen. Neben diesen direkt AP-1 steuernden bzw. abhängigen Komponenten soll das Testsystem regulierende Faktoren bzw. Proteine erfassen, die mittelbar durch krankhafte bzw. therapeutische Einflüsse in Keratinozyten freigesetzt werden und dann sekundär AP-1 gesteuerte Reaktionsmechanismen in den genetisch modifizierten Fibroblasten induzieren.

Die Lösung dieser Aufgabe wird durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen erzielt.

Es wurde überraschenderweise in der vorliegenden Erfindung festgestellt, daß mittels genetisch veränderten Fibroblastenzellen ein System zur Identifizierung der vorstehenden Substanzen etabliert werden kann. Diese Fibroblastenzellen weisen die folgenden Eigenschaften auf: (a) ein eine Untereinheit des Transkriptionsfaktors AP-1 codierendes Gen ihres Genoms ist inaktiviert und (b) sie enthalten in einem Expressionsvektor mit einem Promotor funktionell verknüpft das Gen von (a) in einer solchen Form, daß erst nach Induktion des Promotors die aktive Untereinheit exprimiert wird oder in einer solchen Form, daß die von dem Gen codierte Untereinheit in inaktiver, aber aktivierbarer, Form vorliegt. Mittels dieser genetisch veränderten Fibroblastenzellinie wird eine spezifischere und einfachere Suche nach neuen Wirkstoffen, beispielsweise neuen agonistisch oder antagonistischen Pharmaka, bzw. von entsprechenden Genen ermöglicht, die bei der Behandlung von mit der Proliferation und/oder Differenzierung von Keratinozyten assoziierten Erkrankungen von Nutzen sein können. Daneben können auch Substanzen, die bereits in anderen Systemen identifiziert wurden, in einem auf den erfindungsgemäßen Fibroblasten basierenden Testsystemen näher analysiert werden.

Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft somit eine genetisch veränderte Fibroblastenzelle mit den folgenden Eigenschaften: (a) ein eine Untereinheit des Transkriptionsfaktors AP-1 codierendes Gen ihres Genoms ist inaktiviert; und (b) sie enthält in einem Expressionsvektor mit einem Promotor funktionell verknüpft das Gen von (a) in einer solchen Form, daß erst nach Induktion des Promotors die aktive Untereinheit exprimiert wird oder in einer solchen Form, daß die von dem Gen codierte Untereinheit in inaktiver, aber aktivierbarer, Form vorliegt.

Beispiele für Gene, die Untereinheiten des Transkriptions faktors AP-1 codieren, sind jun-c, JunB, JunD, c-Fos, FosB, Fra-1 und Mitglieder der ATF-Proteinfamilie (Angel und Karin, 1991)

Die Inaktivierung des eine Untereinheit des Transkriptions faktors AP-1 codierenden Gens kann nach üblichen, dem Fachmann bekannten Verfahren erfolgen. Hier ist beispielsweise die Verwendung der Antisense-Technik (Riabowol et al., 1992, PNAS 89, S. 157-161) oder die Injektion von neutralisierenden Antikörpern (Kovary et al., 1991, Mol. Cell. Biol. 11, S. 4466-4472) zu nennen. Der bevorzugeste Ansatz zur Inaktivierung eines Gens stellt jedoch die Herstellung von "Knockout"-(Säuge)Tieren und die Isolierung davon abgeleiteter Zellen dar. Dies beinhaltet die Herstellung eines geeigneten "Gene targeting" Vektors, die Isolierung korrekt genetisch modifizierter embryonaler Stammzellen, die Injektion dieser Zellen in (Säuge)Tier-Blastozysten (bevorzugt: Maus- Blastozysten), die Etablierung von Chimären und die Verpaarung dieser (Säuge)Tiere zur Generierung von (Säuge)Tieren (bevorzugt: Mäusen) mit dem gewünschten Genotyp (A. L. Joyner: Gene targeting: A practical approach, Oxford University Press, Oxford, 1993, S. 1-234) Anschließend werden Säugetiere mit dem geeigneten Genotyp verpaart, die Embryonen während der Schwangerschaft isoliert (s. Beispiel 1), nach Standardprotokollen daraus primäre embryonale Fibroblasten isoliert und davon spontan immortale Linien etabliert (Todaro und Green, 1995; Schreiber et al., 1995). Somit betrifft eine bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Fibroblastenzelle eine Fibroblastenzelle, bei der das Gen codierend für eine Untereinheit des Transkriptionsfaktors AP-1 durch "knockout" inaktiviert wurde. Die Inaktivierung des eine Untereinheit des Transkriptionsfaktors AP-1 codierenden Gens kann auch durch Eingriff (z. B. Inhibierung) in AP-1 übergeordnete Regulatorproteinen erfolgen.

Bevorzugt ist, die zu exprimierenden Gene in einen geeigneten Expressionsvektor unter die Kontrolle eines konstitutiven Promotors zu stellen. Geeignet sind dafür Regulationseinheiten von Viren (SV40, RSV, CMV) oder von zellulären Genen, die konstitutiv exprimiert werden (z. B. das Ubiquitin C Protein). Es ist bevorzugt, den Expressionsvektors in der Weise auszugestalten, daß eine Untereinheit des Transkriptionsfaktors AP-1 kontitutiv in inaktiver, aber aktivierbarer, Form exprimiert wird. Dabei wird ein inaktives Fusionsprotein hergestellt, das erst durch Zugabe eines Induktors seine Konfirmation so ändert, daß das Protein aktiv wird.

Zur Herstellung des Expressionsvektors von Schritt (b) kann der Fachmann nach üblichen in vitro-Rekombinationsverfahren, wie sie beispielsweise in Sambrook et al., 1989 beschrieben sind, vorgehen.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße, genetisch veränderte Fibroblastenzelle dadurch gekennzeichnet, daß das eine Untereinheit des Transkriptionsfaktors AP-1 codierende Gen c-jun (Angel et al., 1988; Hilberg et al., 1993) oder junB (Schorpp-Kistner et al., 1999) ist, d. h. die Fibroblastenzellen sind c-jun- bzw. JunB-defizient.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße genetisch veränderte Fibroblastenzelle eine humane Fibroblastenzelle oder Maus-Fibroblastenzelle und am meisten bevorzugt ist eine genetisch veränderte Fibroblastenzelle, bei der c-JunER^TM oder JunB-ER^TM enthalten ist. c-JunER^TM enthält die N-terminale Hälfte von c-Jun und die Tamoxifen-Bindungsstelle (ER) (Bossy-Wetzel et al., 1997). Zur Optimierung der Expression werden die c-Jun-ER^TM Sequenzen unter die Kontrolle der menschlichen Ubiquitin-C- Promotor/Enhancer Sequenz gebracht, welche eine effiziente Regulationseinheit darstellt (Schorpp et al., 1996). Analog wird basierend auf JunB ein JunB-ER^TM-Konstrukt hergestellt (s. Bsp. 9).

Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die die AP-1 abhängige Differenzierung und/oder Proliferation von Keratinozyten fördern, hemmen oder modifizieren kann, wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt: A) Inkontaktbringen der Testverbindung mit der erfindungsgemäßen, genetisch veränderten Fibroblastenzelle in Cokultur mit primären Keratinozyten in einem Testsystem I und/oder Testsystem II, wobei Testsystem I dadurch gekennzeichnet ist, daß das von dem Gen von (b) codierte Protein nicht oder in inaktiver Form vorliegt, und Testsystem II dadurch, daß das von dem Gen von (b) codierte Protein in aktiver Form vorliegt, und B) Bestimmung der Expression von für den Differenzierungsstatus bzw. Proliferationsstatus von Keratinozyten assoziierten Markergenen und/oder der Epithelstrukturen, wobei eine Veränderung der Expression der Markergene und/oder der Epithelstruktur in Testsystem II, aber nur unvollständig in Testsystem I anzeigt, daß die Testverbindung die AP-1 abhängige Differenzierung und/oder Proliferation von Keratinozyten fördern, hemmen oder modifizieren kann. In Testsystem I kann zwar die Proliferation, nicht aber die Differenzierung der Keratinozyten gemessen werden. Testsystem I zeichnet sich dadurch aus, daß die Kokultur von Keratinozyten und Fibroblasten in einem zwei-dimensionalen System auf (Plastik)kulturträgern erfolgt, während in Testsystem II beide Zellarten zusammen mit einer Matrix eine dreidimensionale Gewebestruktur, ähnlich der Haut, bilden.

Testsytem I stellt eine zweidimensionale Feeder-Layer-Cokultur dar, bei der Keratinozyten zusammen mit bestrahlten Fibroblasten (Feeder-Zellen) submers kultiviert werden (Rheinland und Green, 1975). Primäre humane Keratinozyten werden aus Hautbiopsien der plastischen Chirurgie isoliert, in Feeder-Layer-Cokultur expandiert (Passage 1) und in Passage 2 in die Versuche eingebracht. Als Feeder-Layer können sowohl betrahlte, postmitotische Maus-3T3-Fibroblasten als auch menschliche Fibroblasten oder Fibroblasten-Linien verwendet werden und der Differenzierungsprozeß der Epithelzellen bleibt unverändert, d. h. die spezifischen Marker werden adäquat exprimiert. Die Proliferation der Keratinozyten wird signifikant von den mesenchymalen Zellen induziert, mit denen sie zusammen kultiviert werden. Hierbei kommt es auf eine äußerste Nähe epithelialer und mesenchymaler Zellen an, jedoch nicht auf den direkten Zellkontakt. Dies weist auf einen parakrinen Effekt der von den mesenchymalen Zellen produzierten Mediatoren hin (Smola et al., 1993). So können von Keratinozyten produzierte Mediatoren, wie IL-1 die Feeder- Zellen zur Synthese von Keratinozyten-spezifischen Wachstumsfaktoren, wie KGF, anregen (Maas-Szabowski et al., 1999), was auf einen Regelkreis zwischen Fibroblasten und Keratinozyten hinweist. Die Cokultivierung der beiden Zelltypen kann nach bekannten Verfahren erfolgen, beispielsweise mittels den in den nachstehenden Beispielen beschriebenen Verfahren, vorzugsweise mittels der in den nachstehenden Beispielen 3 und 11 bis 13 beschriebenen organotypischen Kultur. Werden Keratinozyten dagegen unter konventionellen Bedingungen im Feeder-Layer-System untergetaucht in Medium kultiviert, proliferieren sie und sobald sie Konfluenz erreicht haben, beginnen sie mehrschichtig zu wachsen. Sie bilden je nach Kultivierungsbedingungen eine bis mehrere Zellagen aus, die Plattenepithelien gleichen, sich jedoch in Struktur und Funktion stark von der Epidermis in vivo unterscheiden.

In Testsytem II, der weit komplexeren, dreidimensionalen organotypischen Kultur werden die Keratinozyten luftexponiert auf einem mit Fibroblasten versetzen Collagengel (Collagen Typ I, aus Ratte oder Rind) kultiviert, wodurch eine verbesserte epitheliale Gewebearchitektur erreicht wird, die mit der Struktur der Haut eher vergleichbar ist (Fusenig et al., 1994). Mediumkomponenten, die durch das ins Medium eingetauchte Collagengel diffundieren, ernähren die Fibroblasten und Keratinozyten. In organotypischen Kulturen bilden die Keratinozyten schon nach 7 Tagen ein vielschichtiges, geordnetes Epithel aus, bestehend aus Stratum basale, spinosum, granulosum und corneum. Morphologisch entspricht das Epithel der Epidermis, denn es weist die spezifischen epidermalen Differenzierungsmarker auf, wie Keratin 1/10, Transglutaminase, Filaggrin, Loricrin (Stark et al., 1999).

Bei den Testverbindungen kann es sich um sehr unterschiedliche Verbindungen handeln, sowohl um natürlich vorkommende als auch synthetische, organische und anorganische Verbindungen, sowie Polymere (z. B. Oligopeptide, Polypeptide, Oligonucleotide und Polynucleotide) sowie kleine Moleküle, Antikörper, Zucker, Fettsäuren, Nucleotide und Nucleotid-Analoge, Analoge von natürlich vorkommenden Strukturen (z. B. Peptid-"Imitatoren", Nucleinsäureanaloge etc.) und zahlreiche weitere Verbindungen sowie Gemische verschiedener Verbindungen. Besonders von Interesse sind einerseits Zytokine und Wachstumsfaktoren, andererseits niedermolekulare lipophile Substanzen, die Zytokin- oder Wachstumsfaktorem imitieren (Agonisten) oder Zytokin- oder Wachstumsfaktoren-induzierte Signalwege hemmen (Antagonisten). Desweiteren ist die Testung von Proteinen von Interesse, deren Expression durch c-Jun bzw. JunB reguliert werden, z. B. die Matrix Metalloproteinasen MMP-9 und MMP-13 (Schorpp-Kistner, 1999). Die Aufnahme in die Zellen erfolgt bei den Testverbindungen innerhalb kurzer Distanzen im Kultursystem. Bei lipophilen Substanzen erfolgt der direkte Durchtritt durch die Zellmembran. Bei Zytokinen und Wachstumsfaktoren erfolgt die Bindung an entsprechende Oberflächenrezeptoren und Auslösung von intrazellulären Signalwegen zum Zellkern. Darüberhinaus kann eine große Anzahl von möglicherweise nützlichen Verbindungen in Extrakten von natürlichen Produkten als Ausgangsmaterial gescreent werden. Solche Extrakte können aus einer großen Anzahl von Quellen stammen, beispielsweise den Spezies Pilze, Actinomyceten, Algen, Insekten, Protozoen, Pflanzen und Bakterien. Die Extrakte, die Aktivität zeigen, können dann zur Isolierung des aktiven Moleküls analysiert werden; siehe dazu beispielsweise Turner, 1996, und Suh, 1995.

Als Markergene kommen grundsätzlich Haut-spezifische Gene, die einen bestimmten Differenzierungtyp anzeigen, in Frage. Die in den Abb. 4-6 verwendeten Gene repräsentieren brauchbare Marker. Die Bestimmung der Expression erfolgt durch in-situ Hybridisierung oder bevorzugt Immunhistochemie (IHC) oder Immunfluoreszenz. Die Kriterien für Proliferation und Differenzierung sind zum einen histologisch (z. B. Dicke des Epithels) sowie Expressionsstärke und Lokalisierung der Markergene ki-67 (Proliferation) und der in den Abb. 4-6 verwendeten Gene (Differenzierung).

Änderungen im Expressionsspiegel des Markergens können unter Verwendung von dem Fachmann gut bekannten Verfahren untersucht werden. Dazu zählt die Überwachung der mRNA-Konzentration (z. B. unter Verwendung geeigneter Sonden oder Primer), Immunassays hinsichtlich der Proteinkonzentration (z. B. mittels entsprechender Antikörper), RNAse-Schutzassays, Amplifikationsassays oder jedes andere für einen Nachweis geeignete Mittel, das auf dem Fachgebiet bekannt ist.

Das Suchen nach neuen Verbindungen, deren Expression direkt oder indirekt durch AP-1 reguliert wird bzw. die die Proliferation und/oder Differenzierung von Hautkeratinozyten regulieren und somit von therapeutischen Wert sind, kann auch in großem Maßstab erfolgen, beispielsweise dadurch, daß eine sehr hohe Anzahl von Kandidaten-Verbindungen in Substanzbibliotheken gescreent wird, wobei die Substanzbibliotheken synthetische oder natürliche Moleküle enthalten können.

Das vorstehende erfindungsgemäße Verfahren kann anhand von Protokollen modifiziert werden, die in der wissenschaftlichen Literatur und der Patentliteratur beschrieben und auf dem Fachgebiet bekannt sind. Beispielsweise kann eine große Anzahl von möglicherweise nützlichen Molekülen in einem einzigen Test gescreent werden. Beispielsweise können dann, wenn ein Feld von 1000 Verbindungen gescreent werden soll, im Prinzip alle 1000 Verbindungen in eine Mikrotiterplattenvertiefung gegeben und gleichzeitig getestet werden. Wenn die Gegenwart einer Verbindung mit einer gewünschten Aktivität entdeckt wird, kann dann der Pool von 1000 in 10 Pools von 100 aufgeteilt werden und der Prozeß solange wiederholt werden, bis eine individuelle Verbindung identifiziert ist. Jedenfalls können die Herstellung und das simultane Screenen von großen Banken aus synthetischen Molekülen beispielsweise mittels gut bekannter Verfahren der kombinatorischen Chemie ausgeführt werden, siehe beispielsweise von Breemen, 1997, und Lam, 1997.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch als Screening mit hohem Durchsatz ("high throughput screening") stark beschleunigt werden. Die hier beschriebenen Assays können zur Verwendung in einem solchen Verfahren entsprechend modifiziert werden. Es ist für den Fachmann offensichtlich, daß für diesen Zweck zahlreiche Verfahren zur Verfügung stehen.

Mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens können auch die molekularen Wirkungsweisen beispielsweise von Zytokinen auf Wachstum und Differenzierungsprozesse der Haut untersucht werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Identifizierung eines Gens, das an der AP-1 abhängigen Differenzierung und/oder Proliferation von Keratinozyten beteiligt ist. Dabei wird das Expressionsmuster von Genen in Normalfibroblasten und genetisch veränderten Fibroblasten, wie z. B. c-Jun-/- bzw. JunB-/-Zellen, verglichen. Unterschiedlich regulierte Gene sind potentielle Kandidaten für Gene, die die Regulation von Proliferation und Differenzierung in Keratinozyten regulieren. Vorzugsweise wird die c-Jun-/- Zellinie, die den Ubi-cJun-ER^TM Expressionsvektor und/oder die JunB-/-Zellinie, die den Ubi-JunB-ER^TM Expressionsvektor trägt, zur vergleichenden Genexpressionsanalyse herangezogen. Dabei soll die Expression in unbehandelten und Tamoxifen- behandelten Zellen verglichen werden. In allen Fällen wird RNA aus den entsprechenden Zellen präpariert und in cDNA umgeschrieben. Die cDNA kann dabei entweder radioaktiv oder durch einen Fluoreszenzfarbstoff markiert sein. Die cDNAs dienen als Sonden für die Hybridisierung von Filtern oder Glasträgern, auf denen eine Vielzahl von indikativen Sequenzen individueller Gene immobilisiert sind. Gene, deren Expression sich unter den oben beschriebenen Bedingungen verändert, können anhand der Unterschiede in der Hybridisierungsstärke identifiziert werden. Diese vergleichende Genexpressions analyse mittels "high density filter screening" und "DNA chip technology" sind in Iyer et al. (1999) und Fambrough et al. (1999) beschrieben. Bei bekannten Genen kann die entsprechende Substanz als rekombinantes Protein entweder direkt zum Kulturmedium zugegeben werden (z. B. im Falle eines Zytokins oder Wachstumsfaktors) oder mittels Gentransfer in die veränderten Fibroblasten eingebracht und exprimiert werden. Entsprechendes gilt für bisher unbekannte DNA-Sequenzen.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Markergen ein K1/K10, Transglutaminase, Filaggrin oder Loricrin codierendes Gen (Stark et al., 1999). Die Expression dieser Gene kann entsprechend den vorstehenden Angaben bestimmt werden, beispielsweise auch entsprechend den in den nachstehenden Beispielen 11 bis 13 beschriebenen Verfahren unter Verwendung geeigneter Antikörper.

Eine mit dem erfindungsgemäßen Verfahren identifizierte Verbindung bzw. ein identifiziertes Gen können dann zur Behandlung von Erkrankungen verwendet werden, wobei - entsprechend der Art der Erkrankung - die Expression des Zielgens verringert oder eliminiert wird (beispielsweise durch "knocking out" des Gens in der Zielzelle oder durch Blockierung der Translation über Antisense-RNAs oder Ribozyme bzw. über Vektoren, die als Insertion Polynucleotide enthalten, die Antisense-RNAs oder Ribozyme codieren) oder erhöht wird, beispielsweise durch Verabreichung eines Vektors, der das Zielgen unter Kontrolle eines geeigneten Promotors, beispielsweise eines induzierbaren Promotors oder eines zu einer starken Expression führenden Promotors enthält. Dieser Vektor kann von einem Virus stammen, beispielsweise von einem adenoassoziierten Virus (beispielsweise AAV Typ 2), Vaccinia- Virus oder Adenovirus, der bei einer Gentherapie von Nutzen ist. Besonders bevorzugt sind Retroviren. Beispiele für geeignete Retroviren sind MoMuLV, HaMuSV, MuMTV, RSV oder GaLV. Verfahren zur Herstellung geeigneter, auf den vorstehenden Viren basierenden Vektoren sind dem Fachmann bekannt. Für Zwecke der Gentherapie können die Gene bzw. die diese enthaltenden Vektoren auch in Form von kolloidalen Dispersionen zu den Zielzellen transportiert werden. Dazu zählen beispielsweise Liposomen oder Lipoplexe. Für eine Therapie geeignet sind auch Antikörper, die gegen von den vorstehenden Genen codierte Proteine gerichtet sind und vorzugsweise eine neutralisierende Wirkung aufweisen. Diese Antikörper können monoclonale, polyclonale oder synthetische Antikörper sein oder Fragmente davon. In diesem Zusammenhang bedeutet der Begriff "Fragment" alle Teile des monoclonalen Antikörpers (z. B. Fab-, Fv- oder "single chain Fv"-Fragmente), welche die gleiche Epitopspezifität wie der vollständige Antikörper aufweisen. Die Herstellung solcher Fragmente ist dem Fachmann bekannt. Vorzugsweise handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Antikörpern um monoclonale Antikörper. Die erfindungsgemäßen Antikörper können gemäß Standardverfahren hergestellt werden, wobei vorzugsweise das von den zu untersuchenden Genen codierte Protein oder ein synthetisches Fragment davon als Immunogen dienen. Verfahren zur Gewinnung monoclonaler Antikörper sind dem Fachmann ebenfalls bekannt. Bei Verabreichung der nach den erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten Substanzen, Gene oder Antikörper liegen diese vorzugsweise in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger vor. Zu geeigneten Trägern zählen beispielsweise Phosphat-gepufferte Kochsalzlösungen, Wasser, Emulsionen, beispielsweise Öl/Wasser-Emulsionen, Netzmittel, sterile Lösungen etc..

Die Verabreichung der diese Substanzen enthaltenden Arzneimittel kann oral oder, vorzugsweise, parenteral erfolgen. Zu den Verfahren für die parenterale Verabreichung gehören die topische, intra-arterielle, intramuskuläre, subkutane, intramedulläre, intrathekale, intraventrikuläre, intravenöse, intraperitoneale oder intranasale Verabreichung. Die geeignete Dosierung wird von dem behandelnden Arzt bestimmt und hängt von verschiedenen Faktoren ab, beispielsweise von dem Alter, dem Geschlecht, dem Gewicht des Patienten, dem Stadium der Erkrankung, beispielsweise des Hauttumors, der Art der Verabreichung etc..

Die vorliegende Erfindung betrifft somit ferner die Verwendung der nach den erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten Verbindung, des Gens oder des gegen ein von diesem Gen codierte Protein gerichteten Antikörpers zur Behandlung von Erkrankungen, die mit einer gestörten Proliferation und/oder Differenzierung von Keratinozyten assoziiert sind, vorzugsweise Hauterkrankungen, wie Psoriasis, chronische Hautentzündungen, verzögerte Wundheilung oder Hauttumore. Desweiteren sind Akne, Neurodermitis, Ekzeme und Narbenbehandlung zu nennen. Durch die vorliegende Erfindung können in gleicher Weise Verbindungen identifiziert werden, die Proliferation und Differenzierung verschiedener Epithelien betreffen bzw. Störungen, die mit entsprechenden Krankheiten einhergehen und die in gleicher Weise über Wechselwirkungen mit den assoziierten Bindegewebszellen gesteuert werden. Die identifizierten Verbindungen können dann in entsprechenden Kokulturmodellen auf ihre Relevanz getestet werden. Es gibt entsprechende Modelle bzw. sind in Entwicklung für die Mundschleimhaut, Leber, Brustdrüse, Prostata/Harnblase, Darm.

Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung des nach dem erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten Gens oder eines Fragments davon oder eines Antikörpers gegen das von diesem Gen codierte Protein zur Diagnose von Erkrankungen, die mit einer gestörten Proliferation und/oder Differenzierung von Keratinozyten assoziiert sind. Dabei wird eine geeignete Gewebeprobe nach dem Fachmann bekannten Verfahren entnommen und entsprechend der verwendeten Sonde der diagnostische Nachweis durchgeführt, beispielsweise als Southern-Blot, Northern-Blot, PCR, Sequenzierung oder als immunhistochemischer oder immunologischer Nachweis, z. B. als RIA oder ELISA. Bezüglich des Ausdrucks "Antikörper" wird auf die vorstehende Definition verwiesen.

Die oben beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäße Systems haben Vorteil, daß zum einen damit die tatsächlichen direkten Zielgene, z. B. von c-Jun bzw. Jun- B, erfaßt werden können, da man einen definierten Startpunkt der Aktivität hat (z. B. Zugabe von Hormon). Zum anderen hat man sofort eine große Menge an aktivem Protein vorliegen, was einen Vorteil gegenüber Vektorsystemen darstellt, die auf einem induzierbaren Promotor basieren (hier kann erst über mehrere Stunden die Proteinmenge durch Neusynthese angehoben werden). Im erfindungsgemäßen System kann man auch klonale Unterschiede zwischen Zellinien ausschließen.

Die Figuren zeigen:

Fig. 1: Schematische Darstellung des Cokultur- und des organotypischen Kultur-Systems
(A) Schematische Darstellung der Monolayer-Kultur auf Plastikoberflächen. Die primären Keratinozyten können in großer Verdünnung nur in Gegenwart eines Feeder-Layers aus Fibroblasten kultiviert werden. (B) Aufbau einer organotypischen Kultur. Das Prinzip der Cokultivierung von Fibroblasten und Keratinozyten ist um zwei Punkte erweitert: i) die Fibroblasten wachsen vergleichbar der natürlichen Haut in einer Collagenmatrix und ii) die Keratinozyten wachsen hier luftexponiert auf dieser Matrix.

Fig. 2: Schematische Darstellung der Eigenschaften der c-jun -/-c-JunER^TM Fibroblasten
Das endogene AP-1 Mitglied c-Jun wird nicht mehr funktionell in den Fibroblasten exprimiert (c-Jun-/-). Das in die Zellen eingebrachte Fusionsprotein c-JunER^TM kann die Funktion des fehlenden c-Jun Proteins übernehmen, wenn es durch exogene Zugabe des Liganden 4-OH-Tamoxifen aktiviert wird. Diese Funktionsweise des Fusionsprotein c-JunER^TM basiert darauf, daß der c-Jun Teil des Proteins inaktiviert ist, solange kein Ligand an der modifizierten Östrogenrezeptor-Bindungsdomäne (ER^TM) gebunden ist. Erst nach der Bindung des Liganden kann der c-Jun Teil des Fusionsproteins durch die Liganden- induzierte Konformationsänderung mit anderen AP-1 Mitgliedern dimerisieren und seine transaktivierende Funktion erfüllen. Der CAT-Assay zeigt, daß das c-JunER^TM Fusionsprotein durch Zugabe von 100 nM 4-OH-Tamoxifen die Expression des transient transfizierten Reportergens Chloramphenicol-Acetyl-Transferase (CAT), welches unter der Kontrolle des klassischen TRE ("TPA response element") aus dem Collagenase Gen steht, induzieren kann. Der Western-Blot bestätigt, daß die stabil transfizierten c-jun-/-Fibroblasten das Fusionsprotein c- JunER^TM exprimieren.

Fig. 3: Wildtyp, c-jun-/- und c-jun-/-c-JunER^TM Fibroblasten in Cokultur mit primären humanen Keratinozyten
Die Proliferation und Differenzierung in Fibroblasten wird u. a. durch c-Jun Aktivität bewirkt

Fig. 4: Charakteristika der in vitro organotypischen Kulturen
Das organotypische Cokultur-System als Modell für die Proliferation und Differenzierung in Haut

Fig. 5: Vergleich organotypischer Kulturen mit Maus-Wildtvp- 3T3-Fibroblasten und c-jun bzw. JunB defizienten Fibroblasten

Fig. 6: Der in organotypischen Kulturen mit c-jun-/- erhaltene Phänotyp kann durch Zugabe von KGF (A) oder GM-CSF (B) partiell revertiert werden

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Isolierung primärer Fibroblasten aus Wildtyp und junB-/-Embryonen; Etablierung immortaler Zellinien

Primäre Maus-embryonale-Fibroblasten (MEF) wurden nach dem Verfahren von Todaro und Green (1963), isoliert und immortalisiert. Für die Präparation von primären Fibroblasten wurden Mausembryonen an den Tagen 9,5 und 10,0 der Embryonalentwicklung aus heterozygot verpaarten junB+/- Weibchen (Schorpp-Kistner et al., 1999) nach deren Tötung durch zervikale Dislokation aus dem Uterus gewonnen. Die Embryonen wurden in PBS aus der mütterlichen Decidua isoliert. Nach Entfernen der extraembryonalen Gewebe und des Amnions, das zur Genotypisierung verwendet wurde, wurde der Corpus in DMEM-Medium (mit 10% FCS, Penicillin/Streptomycin 1%, 1 mM L- Glutamin) durch Aufsaugen in sterile 2,5 ml Einwegspritzen mit 25 G-Kanülen in kleine Gewebefragmente und Zellgruppen zerkleinert. Diese Gewebefragmente und Zellhaufen wurden in einer Zellkulturplatte mit sechs Vertiefungen ausgesät und in DMEM-Medium mit vorstehender Zusammensetzung im Brutschrank kultiviert. Am folgenden Tag wurden nicht-angehaftete grobe Gewebefragmente durch Waschen mit PBS entfernt und die angewachsenen primären Fibroblasten nach Gabe von neuem DMEM- Medium weiterkultiviert. Nach 5 bzw. 7 Tagen (Embryonen von Tag 10,0 bzw. 9,5) wurden die Zellen durch Trypsinierung passagiert und in einer Dichte von ca. 3 × 10⁵ auf je drei T25 Zellkulturflaschen (Fa. Greiner, Frickenhausen, Deutschland) ausplattiert. Diese MEF wurden weiterhin alle drei Tage passagiert und in einer Zelldichte von 1-3 × 10⁴ Zellen pro cm² ausgesät. Ab der 7. bis zur 16. Passage wurde das exponentielle Wachstum durch eine sog. Krise beendet. Während dieser Krise wurden die Zellen für 7 bis max. 17 Tage auf der Zellkulturschale ohne Trypsinieren belassen. Die Zellen wurden beobachtet und das Medium wurde alle 3 Tage gewechselt. Als wieder eine Zunahme an Zellen beobachtet wurde, wurden die Zellen wieder alle drei Tage trypsiniert und mit einer Zellzahl von 3 × 10⁴ pro cm² ausgesät. Durch stetes Weiterpassagieren entstanden so nach 16 bis 18 Passagen immortalisierte Zellinien, die kryokonserviert oder für nachfolgende Experimente weiterverwendet wurden. Die immortalisierten Zellen wurden nochmals auf ihren Genotyp hin untersucht. Diese Genotypisierung erfolgte wie bei Schorpp- Kistner et al., 1999 beschrieben.

Beispiel 2 Isolierung und Kultivierung von primären humanen Keratinozyten und Fibroblasten

Epidermale Keratinozyten und dermale Fibroblasten wurden aus Biopsien von menschlicher Körperhaut isoliert (Boukamp et al., 1990). Keratinozyten wurden als Feeder-Layer-Cokulturen in FAD-Medium (DMEM: Hams F12/3 : 1 (Fa. Sigma, Deisenhofen, Deutschland) mit 0,1% Glucose, 1 mM L-Glutamin; pH-Wert 7,3; mit 100 E/ml Penicillin, 10 µg/ml Streptomycin, 5 µg/ml Insulin, 1 ng/ml hEGF, 10^-10 M Choleratoxin, 24 ng/ml Adenin (alle Zusätze von Sigma, Deisenhofen, Deutschland; mit 5% FCS) kultiviert (1 × 10⁴/cm² Feeder-Zellen und 1,1 × 10⁴/cm² Keratinozyten). Menschliche Fibroblasten wurden in DMEM mit 10% FCS vermehrt. Zur Herstellung von Feeder-Fibroblasten wurden humane Fibroblasten mit 70 Gray und Maus-Fibroblasten mit 20 Gy bestrahlt. Die Aktivierung des c-Jun-ER Fusionproteins in der stabilen c-jun-/-Zellinie, die einen induzierbaren c-Jun-ER^TM Expressionsvektor enthält, erfolgte durch Zugabe von 4-OH-Tamoxifen (Sigma) in das Kulturmedium (Endkonzentration 100 nM). Entsprechend wurde zur Aktivierung des JunB-ER_TM Fusionsproteins vorgegangen.

Beispiel 3 Organotypische Kulturen

Kollagen Typ 1 wurde aus Rattenschwanzsehnen präpariert und in einer Konzentration von 4 mg/ml in 0,1% Essigsäure als Gebrauchslösung bereitgestellt (Smola et al., 1993). Die verwendeten Kollagengele bestanden aus 80 Vol% 4 mg/ml Kollagen in 0,1% Essigsäure, 10 Vol% Hanks-Salzlösung (10 × konzentriert) und 10 Vol% FCS mit oder ohne Zellen (2 × 10⁵ Zellen/ml). Das flüssige Kollagen wurde auf Eis mit Hanks- Lösung versetzt und unter Rühren mit 5 M NaOH neutralisiert. (Abtrypsinierte und in FCS aufgenommene Zellen können dann in die Kollagenlösung eingerührt werden.) Die Gellösung wurde in Zellkulturschalen oder je 2,5 ml in Filterinserts (3 µm Porengröße, Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland) ausgegossen und 1 Stunde im Inkubator zur Ausbildung eines Gels belassen. Sterile Glasringe mit einem Innendurchmesser von 18 mm (1,5 mm Wandstärke, 12 mm Höhe) wurden auf die Gele gesetzt und leicht angepreßt. Nach 1 h im Inkubator wurden die Kollagengele in DMEM mit 10% FCS äquilibriert. Nach 24 h wurde das Medium aus den Glasringen abgezogen und jeweils 1 ml Keratinozytensuspension (9 × 10⁵ Zellen/ml FAD) wurde in das Innere der Glasringe ausgesät. Nach 24 h Innkubation wurde das Medium von den Keratinozyten entfernt, wodurch die Zellen luftexponiert werden. Dieser Zeitpunkt wurde als Tag 0 der organotypischen Kulturen definiert. DMEM mit 10% FCS wurde alle 2 Tage gewechselt, der Mediumspiegel grenzt dabei an den oberen Gelrand. Zur histologischen oder immunhistochemischen Aufarbeitung wurden die Kulturen fixiert oder eingefroren. Zum Nachweis von proliferierenden Zellen in einer Kultur durch immunhistochemische Methoden wurde 12 h vor Fixierung der Kulturen BrdU (Sigma) in einer Konzentration von 65 µM ins Medium gegeben.

Beispiel 4 Applikation von Cytokinen

2D-Cokulturen auf Plastikschalen bzw. Glasobjektträgern oder in 3D-Form als organotypische Kulturen wurden 24 h im entsprechenden Standardmedium inkubiert. Anschließend wurde mit Cytokinen angereichertes Medium zugesetzt und die Kulturen damit je nach Versuch mehrere Stunden oder Tage inkubiert, wobei der Mediumwechsel mit Faktorzugabe alle 2 Tage erfolgte. Bezugsquelle der Wachstumsfaktoren und Antikörper:
KGF (BTS, St. Leon, Deutschland); anti-GM-CSF, polyklonal, neutralisierend (R, Wiesbaden, Deutschland); GM-CSF (Boehringer Mannheim, Deutschland) und anti-KGF, monoklonal, neutralisierend (R).

Beispiel 5 Fixierung von Kulturen

Bei Monolayerkulturen adhärenter Zellen wurde das Medium von den Zellen abgezogen und die Zellen wurden auf den Glasobjektträgern in 80% Methanol 5 min und 100% Aceton 3 min fixiert. Die Objektträger wurden anschließend getrocknet und bei -40°C aufbewahrt. Zur Herstellung von Paraffinpräparaten wurden organotypische Cokulturen oder Hautbiopsien mind. 24 h in 3,5% Formaldehyd (in PBS+) fixiert, zunächst in Agar, dann in Paraffin (Medim, Fa. Vogel, Gießen, Deutschland) eingebettet. Von den Präparaten wurden 2 µm Schnitte angefertigt, die histologisch mit Hämatoxylin (15 min) und Eosin (5 min) angefärbt wurden. Nach Entparaffinierung konnten die Paraffinschnitte auch für immunhistochemische Analysen verwendet werden. Zur Herstellung von Gefrierpräparaten wurden Hautproben oder organotypische Cokulturen auf Korkplättchen in Einbettgel ("Tissue Teck", O. C. T., Frankfurt, Deutschland) über flüssigem Stickstoff eingefroren. Die Präparate wurden bei -80°C aufbewahrt. Am Gefriermikrotom wurden 5 µm Schnitte hergestellt, diese auf silanisierte Objektträger aufgebracht und für immunhistochemische Analysen verwendet.

Beispiel 6 Immunhistochemische Analysen

Paraffinschnitte wurden in einer absteigenden Alkoholreihe entparaffiniert und in PBS gespült. Anschließend wurden durch 5 min Kochen der Schnitte in "Tuf"-Lösung (Advanced Biotechnologies, Hamburg, Deutschland) und 30 min 0,1% Trypsin bei 37°C oder Mikrowellenbehandlung in 0,1 M Citratpuffer die Epitope auf den Gewebeschnitten zugänglich gemacht. Gefrierschnitte wurden 5 min in 80%igen Methanol, dann 2 min in Aceton fixiert. Zum Nachweis der Inkorporation von BrdU (Proliferationsassay) wurden zur Denaturierung der DNA-Stränge die Schnitte 10 min in 1,5 M HCl inkubiert. Der erste Antikörper, verdünnt in 1%iger BSA-Lösung, wurd 1 h bei 37°C oder 12 h bei 4°C inkubiert. Nach dreimaligem Waschen in PBS+ wurde der zweite Fluorochrom-gekoppelte Antikörper für 45 min bei Raumtemperatur appliziert. Die Zweitantikörper gegen IgG- Maus oder IgG-Kaninchen waren nach Wahl mit FITC (grün) oder "Texas red" (rot) gekoppelt (Dianova, Hamburg, Deutschland). Zur Kernfärbung wurde der DNA-Farbstoff Bisbenzimid (Dianova, Hamburg, Deutschland) in einer Endkonzentration von 5 ng/ml zum zweiten Antikörper zugesetzt. Überschüssige Antikörper wurden durch Waschen entfernt (3 × 10 min, PBS+) und die Schnitte mit "Mowiol" (O. C. T., Frankfurt, Deutschland) und mit einem Deckglas abgedeckt. Folgende Antikörper wurden verwendet:

1. Antikörper gegen BrdU (Spezifität: Maus) von Dianova, Hamburg, Deutschland; 1. Antikörper gegen Filaggrin (Spezifität: Maus) von Cell Systems, St. Katharina, Deutschland; Antikörper gegen K10 (Klon 8.60) (Spezifität: Maus) von Sigma, Deisenhofen, Deutschland; Antikörper gegen Loricrin (Spezifität: Kaninchen) von D. Hohl, Lausanne, Schweiz; Antikörper gegen Ki-67 (Mib-1) (Spezifität: Maus) von Calbiochem, Bad Soden, Deutschland; Antikörper gegen Transglutaminase (Spezifität: Maus) von Cell Systems, St. Katharina, Deutschland

Beispiel 7 Reverse Transkriptions-Polymarase Kettenreaktion (RT-PCR)

Gesamt-RNA wurde nach dem Protokoll von Chomczynski und Sacchi, 1987 (siehe Schorpp-Kistner et al., 1999) präpariert und in folgendem Ansatz zu cDNA umgeschrieben: 10 µg RNA, 10 µl 10 × PCR-Puffer, 20 µl 25 mM MgCl₂, 6 µl von jedem dNTP (je 10 mM), 2,5 µl RNase Inhibitor (20 E/µl), 5 µl 50 E/µl MLV Reverse Transkriptase, 2 µl 50 µM Oligo-dT₁₆, 2 µl 50 µM "Random Hexamer"-Primer und H₂O_depc, zu einem Gesamtvolumen von 100 µl. Die Reaktionsansätze inkubierten 10 min bei Raumtemperatur, dann 80 min bei 42°C und wurden durch 5 min Erhitzen auf 95°C gestoppt. 5 µg Gesamt-RNA wurden entsprechend in einem 50 µl-Ansatz zu cDNA umgeschrieben und die erhaltenen Produkte bei -20°C gelagert.

Alle folgenden PCR-Schritte waren auf die Verwendung der Produkte des "PCR Core"-Kits von Boehringer Mannheim und des "TrioThermoblocks" von Fa. Biometra, Göttingen, Deutschland abgestimmt. Eingesetzt wurden jeweils 4 µl des Reversen- Transkriptions-Ansatzes. Zu einem Gesamtvolumen von 50 µl wurden hinzugefügt: 1 × PCR-Puffer, je 200 µM der Desoxynukleotide, 0,2 µM jedes Primers, je nach Amplifikationsbedingungen 1,5 mM bis 2,5 mM MgCl₂ und 1,5 E Taq- Polymerase. Zu jedem Ansatz wurden 50 µl Mineralöl (Sigma) zugetropft, um eine Verdunstung des Reaktionsgemisches während der PCR-Reaktion zu vermeiden. Der erste Zyklus der PCR umfaßte eine 5minütige Denaturierung der Matrize bei 94°C. Daran schlossen sich entsprechend des linearen Amplifikationsbereiches für das ausgewählte Fragment 20 bis 30 Zyklen (1 min Denaturieren bei 94°C, 1 min Hybridisieren bei Primer-spezifischer Temperatur, 1 min Synthese durch die Taq- Polymerase bei 72°C) an. Die PCR endete mit 5minütiger Synthese bei 72°C zur Komplettierung unvollständig synthetisierter Fragmente. Die Ansätze wurden bis zur weiteren Verwendung bei -20°C aufbewahrt.

Beispiel 8 Herstellung und Analyse der c-jun-/-Zellinien, die stabil einen c-Jun-ER^TM Expressionsvektor enthalten

Zur Subklonierung des c-JunER^TM DNA-Fragments wurde die Accl/Sall Restriktionsschnittstelle aus der Mehrfachklonierungsstelle eines "pBluescript SK"-Vektors (Fa. Stratagene, La Jolla, USA) entfernt. Dazu wurde der Vektor mit HincII linearisiert, EcoRI-Linker wurden an den Vektor ligiert und nach Restriktion wurde mit EcoRI religiert. Das c-JunER^TM DNA-Fragment wurde mittels EcoRI-Verdau aus PMV7 c-JunER^TM (Bossy-Wetzel et al., 1997) isoliert und in die EcoRI- Schnittstelle des modifizierten "pBluescriptSK"-Vektors subkloniert. Zum Austausch eines Teils der murinen c-Jun- Sequenz wurde der Vektor mit Accl/Hpal verdaut und durch das äquivalente Accl/Hpal-Fragment der menschlichen c-Jun-Sequenz (Angel et al., 1988) ersetzt. Das so entstandene c-JunER^TM- Hybrid aus murinen und humanen Sequenzen wurde mittels EcoRI- Verdau in einen unmodifizierten "pBluescript"-Vektor subkloniert. Zur Optimierung der Expression des Fusionsproteins wurden die c-Jun-ER Sequenzen unter die Kontrolle des menschlichen Ubiquitin-C Promotor/Enhancer- Sequenz gebracht, die bereits in transgenen Mäusen als sehr effiziente Regulationseinheit identifiziert wurde (Schorpp et al., 1996). Dazu wurde ein Teil des c-JunER^TM als SalI/Ncol- Fragment aus dem Vektor isoliert und in einen Sall/Ncol geschnittenen "Ubi JunB ER^TM"-Vektor (Schorpp et al., 1996) eingesetzt. Die c-jun-/-Fibroblasten wurden mittels Lipofektion (Lipofectamin, Gibco BRL, Karlsruhe, Deutschland) entsprechend dem Protokoll des Herstellers mit 1.6 µg "Ubi c-JunER^TM und 0.4 µg "pSV Hygro" (Expressionsvektor für das Hygromycin-Resistenzgen; Expression wird über die Promotor/Enhancerregion des SV40 reguliert) co-transfiziert. Nach 3 Wochen Wachstum auf Selektionsmedium (DMEM mit 10% FCS und 50 µg/ml Hygromycin B) wurden klonale Kolonien isoliert und expandiert. Die genomische DNA der Fibroblasten wurde mittels Standardprotokoll isoliert. Die Genotypisierung wurde mittels PCR durchgeführt. PCR-Maschine: PTC-2000 von Fa. Biozyme Diagnostic GmbH, Hess. Oldendorf, Deutschland; Reaktionsbedingungen: 50 ng genomische DNA 5 mM MgCl₂, 10% DMSO, 1 × GB-Puffer (16,6 mM (NH₄)₂SO₄; 6,7 mM MgCl₂; 5 mM β- Mercaptoethanol; 6,7 mM EDTA), 0,5 mM dNTPs, 35 ng PCR-Primer (5'-Primer: 5'atgaggaaccgcattgcg; 3'-Primer: 5'- tggagattcaagtccccaaagcc) und 1 Einheit Taq-Polymerase (Sigma). PCR-Programm: 5' 94°C; 35 × (94°C 45"; 55°C 1'; 72°C 1'); 7' 72°C. Genotypisch positive Klone wurden mittels Western-Blot (α-c-Jun/AP-1 monoklonale Maus-Antikörper von Signal Transduction Laboratories, Dianova, Hamburg, Deutschland) auf die Expression des Fusionsproteins c-JunER^TM überprüft. Der Nachweis der Genexpression (Northern Blot, RT-PCR) und der Proteinmengen (Western Blot, ELISA) erfolgte nach gängigen Standardprotokollen.

Beispiel 9 Herstellung und Analyse der JunB-/-Zellinien, die stabil einen Ubi-JunB-ER^TM Expressionsvektor enthalten

Zur Herstellung eines junB-ER^TM Expressionsvektors wurde zunächst das Stopcodon in junB mit Hilfe eines DNA Fragments bestehend aus 2 Oligonkleotiden (Sequenz Oligo1: 5'- acggctgccagttcggctaggggtcaagggacacgccttc-3'; Oligo2: 5'- gtotggactcgaggatccccgaaggcgtgtcccttgaccc-3') in einem 3' Subklon von junB (323 Basenpaar BssHii-Xhol Fragment zwischen den Schnittstellen AlwNl und Xhol) ersetzt. Das komplette junB cDNA-Fragment wurde aus Ubi junB (Schorpp et al., 1996) mit SmaI ausgeschnitten, mit EcoRI Linker versehen und in die EcoRI Schnittstelle von pBluescript SK (Stratagene, La Jolla, USA) kloniert. Das endgültige junB-ER^TM Konstrukt wurde durch Ligation aus folgenden 4 Fragmenten hergestellt: 5' Bereich: EcoRI/BspHI Fragment aus der kompletten junB cDNA in pBluescript SK; 3' Bereich mit dem ersetzten Stopcodon: BspHI/BamHI Fragment; BamHI/EcoRI ER^TM Fragment aus PMV7 c-jun- ER^TM (Bossy-Wetzel et al., 1997); EcoRI geschnittener pBluescript SK. Das so erhaltene junB-ER^TM Fragment wurde als Xbal/Sall Fragment isoliert und in einen Xbal/Xhol geschnittenen Ubi junB Expressionsvektor (Schorpp et al., 1996) eingesetzt. Die junB-/-Fibroblasten wurden mittels Lipofektion (Lipofectamin; Gibco BRL, Karlsruhe) entsprechend dem Protokoll des Herstellers mit 2,8 µg Ubi junB-ER^TM und 0,4 µg pSV Hygro cotransfiziert. Nach 3 Wochen auf Selektionsmedium (DMEM) mit 10% FCS und 50 µg/ml Hygromycin B) wurden klonale Kolonien isoliert und expandiert. Die genomische DNA der Fibroblasten wurde mittels Standardprotokoll isoliert. Die Genotypisierung erfolgte mittels PCR. Die PCR wurde in einem Thermocycler PTC 200 von Biozym (Hess. Oldendorf) mit folgenden Reaktionsbedingungen durchgeführt: 50 ng genomische DNA, 2,5 mM MgCl₂, 10% DMSO, 1 × GB Puffer (16,6 mM (NH₄)₂SO₄, 6,7 mM MgCl₂, 5 mM beta- Mercaptolethanol, 6,7 µM EDTA), 0,5 mM dNTPs, 20 ng PCR Primer (5'Primer: 5'-cagaccgtaccggaggcacgcagc-3', 3'Primer: 5'- tggagattcaagtccccaaagcc-3') und 1 Unit Taq Polymerase (Sigma, Deisenhofen); Programm: 2' 94°C; 30 × (30" 94°C, 90" 55°C, 2' 72°C); 10' 72°C. Genotypisch positive Klone wurden mittels Western Blot Analyse mit einem polyklonalen Antikörper aus Kaninchen gegen junB (N17, Santa Cruz, Heidelberg) auf die Expression des Fusionsporteins junB-ER_TM überprüft. Der Nachweis der Genexpression (Northern Blot, RT-PCR) und der Proteinmengen (Western Blot, ELISA) erfolgte nach gängigen Standardprotokollen.

Beispiel 10 Wildtyp, c-jun-/- und c-jun-/-c-JunER^TM Fibroblasten in der 2D-Cokultur mit primären humanen Keratinozyten

Eine Cokultur von Fibroblasten und Keratinozyten wurde nach drei Tagen lichtmikroskopisch und mit Hilfe von Immunfluoreszenz (IF) auf Proliferation und Differenzierung der Keratinozyten analysiert (Fig. 3). Zu den Kulturen wurde alle 12 Stunden 100 nM 4-OH-Tamoxifen zugesetzt und alle 24 Stunden das Medium gewechselt. Die entsprechenden Kontrollen blieben unbehandelt. In der IF wurden die Kerne der Zellen durch den Hoechst-Farbstoff Bisbenzimid sichtbar gemacht (blaue Färbung). Die Keratinozyten-Inselgröße ist (erkennbar im Phasenkontrast und an der Involucrin-Färbung) durch das Fehlen einer c-Jun-Aktivität deutlich verringert. Auch sind weniger proliferierende Keratinozyten (Färbung für Ki67) nachzuweisen. Die Expression des Differenzierungsmarkers K1/K10 (grüne Färbung) ist verstärkt. Dieser kann in den c-jun -/-c-JunER^TM Fibroblasten durch die Tamoxifen induzierte c-Jun Aktivität wieder aufgehoben werden.

Beispiel 11 Charakteristika der in vitro 3D-organotypischen Kulturen

Vergleich von humaner Haut mit sieben Tage alten organotypischen Kulturen, bei denen primäre humane Fibroblasten und Maus-3T3-Fibroblasten verwendet wurden (Fig. 4). Er demonstriert, daß mit den organotypischen Kulturen ein in-vitro System zur Verfügung steht, welches sowohl histologisch als auch im Bezug auf die Expression von Markergenen der normalen humanen Haut äquivalent ist. Die Expression der Gene K1/K10, Transglutaminase, Filaggrin und Loricrin sind allgemein als Markergene für den Differenzierungsstatus der Keratinozyten anerkannt. Sowohl mit humanen als auch mit murinen Fibroblasten bilden sich normale Epithelien aus. Hiermit ist offensichtlich, daß die molekularen Mechanismen welche die Ephithelbildung kontrollieren, speziesübergreifend zwischen Mensch und Maus konserviert sind.

Beispiel 12 Vergleich organotypischer Kulturen mit Maus- Wildtyp-3T3-Fibroblastan und c-jun bzw. JunB defizienten Fibroblasten

Im Gegensatz zu Wildtyp-Maus-3T3-Fibroblasten induzieren c-jun bzw. junB defiziente Fibroblasten in organotypischen Kulturen eine veränderte Epithelstruktur (Fig. 5). Diese abnormalen Epithelien sind durch Hemmung bzw. Stimulierung der Proliferation mit der Konsequenz einer Ab- bzw. Zunahme der Epitheldicke und durch eine veränderte Differenzierung charakterisiert. Die mit c-jun-/-Fibroblasten erhaltenen organotypischen Kulturen zeigen eine deutlich verminderte Proliferation und Epithelbildung und auch die Expression der späten Differenzierungsmarker Filaggrin und Loricrin ist drastisch vermindert. Das Epithel der organotypischen Kultur mit junB-/-Fibroblasten ist verdickt und zeigt stark erhöhte Proliferation und sowohl histologisch als auch mittels IF eine veränderte Differenzierung. Die Expression des Markers K1/K10 setzt verspätet ein und ist erst in höheren Zellagen nachzuweisen. Die Differenzierungsmarker Transglutaminase, Filaggrin und Loricrin werden verstärkt und im Falle von Loricrin auch verfrüht exprimiert.

Beispiel 13 Der in organotypischen Kulturen mit c-jun-/- erhaltene Phänotyp kann durch Zugabe von KGF oder GM-CSF partiell revertiert werden

Die Applikation der Zytokine KGF bzw. GM-CSF zu den organotypischen Kulturen mit c-jun-/-Fibroblasten hebt die verminderte Epithelausbildung auf. Allerdings wird durch KGF- Gabe (Fig. 6A) nicht der volle Differenzierungsstatus wiederhergestellt. Dies ist histologisch erkennbar am Fehlen des Stratum granulosum und der Expression der Differenzierungsmarker Filaggrin und Loricrin. Die Zugabe des Zytokins GM-CSF (Fig. 6B) bewirkt zwar eine verstärkte Epithelbildung, aber auch in diesem Fall entspricht der Differenzierungsstatus des Epithels nicht dem Normalzustand. K1/K10 wird verspätet, Transglutaminase, Filaggrin und Loricrin verstärkt und Loricrin verfrüht exprimiert.

Bei der DMSZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, Braunschweig) wurden gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags hinterlegt:
am 11. November 1999:
Zellkultur 10JunB-/- DSM ACC2419
am 21. Dezember 1999:
Zellkultur 55/2c-Jun-ER^TM wt#180 DSM ACC2438
Zellkultur 10JunB-ER^TM #7 DSM ACC2439

Literaturangaben

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Bossy-Wetzel, E., Bakiri, L. und Yaniv. M. (1997). Induction of apoptosis by the transcription factor c-Jun. EMBO J. 16: 1695-1709.
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Claims

1. Genetisch veränderte Fibroblastenzelle mit den folgenden Eigenschaften:

a) ein eine Untereinheit des Transkriptionsfaktors AP-1 codierendes Gen ihres Genoms ist inaktiviert; und
b) sie enthält in einem Expressionsvektor mit einem Promotor funktionell verknüpft das Gen von (a) in einer solchen Form, daß erst nach Induktion des Promotors die aktive Untereinheit exprimiert wird oder in einer solchen Form, daß die von dem Gen codierte Untereinheit in inaktiver, aber aktivierbarer, Form vorliegt.

2. Genetisch veränderte Fibroblastenzelle nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Gen von (a) durch "knockout" inaktiviert wurde.

3. Genetisch veränderte Fibroblastenzelle nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das eine Untereinheit des Transkriptionsfaktors AP-1 codierende Gen c-jun oder junB ist.

4. Genetisch veränderte Fibroblastenzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 3, die eine humane Fibroblastenzelle oder Maus-Fibroblastenzelle ist.

5. Genetisch veränderte Fibroblastenzelle nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß in dem Expressionsvektor eine für ein Fusionsprotein aus c-Jun und eine Tamoxifen-Bindungsstelle (ER) codierende Sequenzen enthalten sind.

6. Genetisch veränderte Fibroblastenzelle nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß in dem Expressionsvektor eine für ein Fusionsprotein aus JunB und eine Tamoxifen-Bindungsstelle (ER) codierende Sequenzen enthalten sind.

7. Genetisch veränderte Fibroblastenzelle nach einem der Ansprüche 1-6, die mit der Bezeichung "Zellkultur 55/2c-Jun- ER^TM wt#80" unter DSM ACC2438 bei der DSMZ am 21. Dezember 1999 hinterlegt worden ist.

8. Genetisch veränderte Fibroblastenzelle nach einem der Ansprüche 1-6, die mit der Bezeichung "Zellkultur 10JunB-ER^TM #7" unter DSM ACC2439 bei der DSMZ am 21. Dezember 1999 hinterlegt worden ist.

9. Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die die AP- 1 abhängige Differenzierung und/oder Proliferation von Keratinozyten fördern, hemmen oder modifizieren kann, wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt:

A) Inkontaktbringen der zu testenden Verbindung mit der genetisch veränderten Fibroblastenzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 8 in Cokultur mit primären Keratinozyten in einem Testsystem I und Testsystem II, wobei Testsystem I dadurch gekennzeichnet ist, daß das von dem Gen von (b) codierte Protein nicht oder in inaktiver Form vorliegt, und Testsystem II dadurch, daß das von dem Gen von (b) codierte Protein in aktiver Form vorliegt, und
B) Bestimmung der Expression von für den Differenzierungsstatus und/oder den Proliferationsstatus von Keratinozyten assoziierten Markergenen und/oder der Epithelstrukturen,

wobei eine Veränderung der Expression der Markergene und/oder der Epithelstruktur in Testsystem II, nicht jedoch in Testsystem I anzeigt, daß die Testverbindung die AP-1 abhängige Differenzierung und/oder Proliferation von Keratinozyten fördern, hemmen oder modifizieren kann.

10. Verfahren zur Identifizierung eines Gens, das an der AP-1 abhängige Differenzierung und/oder Proliferation von Keratinozyten beteiligt ist, wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt:

a) Gewinnen von RNA aus Normalfibroblasten und genetisch veränderten Fibroblastenzellen nach einem der Ansprüche 1-8 sowie Umschreiben in cDNA
b) Markierung der cDNA
c) Hybridisieren der markierten cDNAs als Sonden mit Filtern oder Glasträgern, auf denen eine Vielzahl von indikativen Sequenzen individueller Gene immobilisiert sind
d) Bestimmen von Unterschieden in der Hybridisierungsstärke zwischen Sonden aus Normalfibroblasten und genetisch veränderten Fibroblasten.

11. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Markergen ein K1/K10, Transglutaminase, Filaggrin oder Loricrin codierendes Gen ist.

12. Verwendung der nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11 identifizierten Verbindung, des Gens oder des gegen ein von diesem Gen codierte Protein gerichteten Antikörpers zur Behandlung von Erkrankungen, die mit einer gestörten Proliferation und/oder Differenzierung von Keratinozyten assoziiert sind.

13. Verwendung des nach dem Verfahren nach Anspruch 10 identifizierten Gens oder eines Fragments oder eines Antikörpers gegen das von diesem Gen codierte Protein zur Diagnose von Erkrankungen, die mit einer gestörten Proliferation und/oder Differenzierung von Keratinozyten assoziiert sind.

14. Verwendung nach Anspruch 12 oder 13, wobei die Erkrankung Psoriasis, chronische Hautentzündung, verzögerte Wundheilung, Narbenbehandlung, Akne, Ekzeme, Neurodermitis oder ein Hauttumor ist.

15. Fibroblastenzelle, bei der das JunB-Gen inaktiviert ist.

16. Fibroblastenzelle nach Anspruch 15, wobei diese mit der der Bezeichnung "Zellkultur 10JunB-/-" unter DSM ACC2419 bei der DSMZ am 11. November 1999 hinterlegt worden ist.