EP1248835A2 - Genetisch veränderte fibroblastenzellen - Google Patents

Genetisch veränderte fibroblastenzellen

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Publication number
EP1248835A2
EP1248835A2 EP01909465A EP01909465A EP1248835A2 EP 1248835 A2 EP1248835 A2 EP 1248835A2 EP 01909465 A EP01909465 A EP 01909465A EP 01909465 A EP01909465 A EP 01909465A EP 1248835 A2 EP1248835 A2 EP 1248835A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
gene
keratinocytes
fibroblast cell
genetically modified
differentiation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP01909465A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Peter Angel
Norbert Fusenig
Andrea Kolbus
Marina Schorpp-Kistner
Axel Szabowski
Nicole Maas-Szabowski
Sven Andrecht
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Original Assignee
Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ filed Critical Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Publication of EP1248835A2 publication Critical patent/EP1248835A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0656—Adult fibroblasts
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    • C12N2510/00—Genetically modified cells
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Definitions

  • the present invention relates to genetically modified fibroblast cells in which a gene encoding a subunit of the transcription factor AP-1 of their genome is inactivated and / or a component of the signal transduction pathway acting on the transcription factor AP-1 is modified with the consequence of a changed AP-1 activity and the functionally linked in an expression vector with a promoter contain the aforementioned gene in such a form that the active subunit is expressed only after induction of the promoter or in such a form that the subunit encoded by the gene in an inactive but activatable form is present.
  • the present invention also relates to a method for identifying compounds which can promote, inhibit or modify the AP-1-dependent differentiation and / or proliferation of keratinocytes and enable the identification of genes which are dependent on the AP-1-dependent differentiation and / or proliferation of keratinocytes are involved.
  • the proliferation and differentiation of keratinocytes and thus the structure and function of the epidermis depend on the interaction with fibroblasts, whereby these processes depend at least in part on the controlled expression of genes which are dependent on the transcription factor AP-1 (e.g. c-Jun, JunB) are dependent. It can be assumed that an abnormal or missing regulation of these genes leads to an impaired proliferation and / or differentiation of the keratinocytes, which in turn can lead to a number of diseases, for example an impaired skin metabolism (impaired wound healing, psoriasis, chronic inflammatory reactions etc.) or the formation of skin tumors.
  • an impaired skin metabolism impaired wound healing, psoriasis, chronic inflammatory reactions etc.
  • the present invention is therefore based on the object of providing means for identifying compounds which are directly or indirectly related to expression of the transcription factor AP-1 or are regulated directly or indirectly by this transcription factor and which are related to proliferation and / or differentiation of skin keratinocytes are involved.
  • these are compounds which directly control genes via the transcription factor AP-1, which are responsible for regulating the growth and differentiation of the epidermis and which are defective in pathological conditions or are incorrectly regulated.
  • These compounds include a large number of known and not yet well-known signal substances, such as interleukins and other cytokines and growth factors, and synthetic agonists or antagonists for their receptors.
  • the genes or their products controlled by them via AP-1 comprise a similarly large number of known and as yet insufficiently known growth and differentiation factors, enzymes, their inhibitors, and structural proteins of the epidermal cells.
  • the test system is intended to record regulating factors or proteins that are released indirectly by pathological or therapeutic influences in keratinocytes and then induce secondary AP-1-controlled reaction mechanisms in the genetically modified fibroblasts.
  • Fibroblast cells have the following properties: (a) a gene encoding a subunit of the transcription factor AP-1 is inactivated and / or a component of the signal transduction pathway acting on the transcription factor AP-1 is modified with the consequence of a changed AP-1 activity and (b) they contain the gene of (a) functionally linked in an expression vector with a promoter in such a form that the active subunit is only expressed after induction of the promoter or in such a form that the subunit encoded by the gene is inactive , but can be activated, is present.
  • This genetically modified fibroblast cell line enables a more specific and easier search for new active substances, for example new agonistic or antagonistic pharmaceuticals, or for corresponding genes which can be useful in the treatment of diseases associated with the proliferation and / or differentiation of keratinocytes.
  • new active substances for example new agonistic or antagonistic pharmaceuticals, or for corresponding genes which can be useful in the treatment of diseases associated with the proliferation and / or differentiation of keratinocytes.
  • substances that have already been identified in other systems can also be analyzed in more detail in a test system based on the fibroblasts according to the invention.
  • One embodiment of the present invention thus relates to a genetically modified fibroblast cell with the following properties: (a) a gene of a subunit of the transcription factor AP-1 of its genome is inactivated and / or a component of the signal transduction pathway acting on the transcription factor AP-1 is modified with following a change in AP-1 activity; and (b) it contains the gene of (a) functionally linked in an expression vector with a promoter in such a form that the active subunit is only expressed after induction of the promoter or in such a form that the subunit encoded by the gene is expressed in inactive but activatable form is present.
  • genes which encode subunits of the transcription factor AP-1 are jun-c, JunB, JunD, c-Fos, FosB, Fra-1 and members of the ATF protein family (Angel and Karin, 1991)
  • the gene encoding a subunit of the transcription factor AP-1 can be inactivated by conventional methods known to those skilled in the art.
  • the use of the antisense technique (Riabowol et al., 1992, PNAS 89, pp. 157-161) or the injection of neutralizing antibodies (Kovary et al., 1991, Mol. Cell. Biol. 11, p. 4466-4472).
  • the most preferred approach to inactivating a gene is to produce "knockout" (mammal) animals and isolate cells derived therefrom. This involves the preparation of an appropriate one
  • mouse blastocysts the establishment of chimeras and the mating of these (suckling) animals to generate
  • a preferred embodiment of the fibroblast cell according to the invention thus relates to a fibroblast cell in which the gene coding for a subunit of the transcription factor AP-1 has been inactivated by "knockout".
  • the gene encoding a subunit of the transcription factor AP-1 can also be inactivated by intervention (eg inhibition) in AP-1 superordinate regulatory proteins.
  • the activity of AP-1 can also be changed in such a way that a component of the signal transduction path acting on AP-1 is modified.
  • This modification can change the acting component at the gene or protein level, for example an up or down regulated expression or a conformational or structural change. The component therefore no longer assumes its role in the S igna 1 transduction path in the usual way and causes a change in the activity of AP-1.
  • genes to be expressed are placed in a suitable expression vector under the control of a constitutive promoter. Regulatory units from viruses (SV40, RSV, CMV) or from cellular genes that are constitutively expressed (e.g. the ubiquitin C protein) are suitable for this. It is preferred to design the expression vector in such a way that a subunit of the transcription factor AP-1 is expressed in an inactive but activatable form. An inactive fusion protein is produced which only changes its confirmation by adding an inductor so that the protein becomes active.
  • a constitutive promoter Regulatory units from viruses (SV40, RSV, CMV) or from cellular genes that are constitutively expressed (e.g. the ubiquitin C protein) are suitable for this. It is preferred to design the expression vector in such a way that a subunit of the transcription factor AP-1 is expressed in an inactive but activatable form. An inactive fusion protein is produced which only changes its confirmation by adding an inductor so that the protein becomes active.
  • step (b) To produce the expression vector from step (b), the person skilled in the art can use conventional in vitro recombination methods, as described, for example, in Sambrook et al. , 1989 are described.
  • the genetically modified fibroblast cell according to the invention is characterized in that the gene c-jun coding for a subunit of the transcription factor AP-1 (Angel et al., 1988; Hilberg et al., 1993) or junB (Schorpp-Kistner et al., 1999), that is the fibroblast cells are c-jun or JunB deficient.
  • the genetically modified fibroblast cell according to the invention is a human fibroblast cell or mouse fibroblast cell and most preferred is a genetically modified fibroblast cell which contains c-JunER TM or JunB-ER TM.
  • c-JunER TM contains the N-terminal half of c-Jun and the Tamoxifen binding site (ER) (Bossy-Wetzel et al., 1997).
  • ER Tamoxifen binding site
  • the c-Jun-ER TM sequences are brought under the control of the human ubiquitin C promoter / enhancer sequence, which represents an efficient regulatory unit (Schorpp et al., 1996).
  • a JunB-ER TM construct is produced based on JunB (see Example 9).
  • a further embodiment of the present invention relates to a method for identifying a compound which can promote, inhibit or modify the AP-1-dependent differentiation and / or proliferation of keratinocytes, the method comprising the following steps: A) contacting the test compound with the genetically modified fibroblast cell according to the invention in coculture with primary keratinocytes in a test system I and / or test system II, test system I being characterized in that the protein encoded by the gene of (b) is not present or is in inactive form, and test system II thereby that the protein encoded by the gene of (b) is in active form, and B) determining the expression of marker genes associated with the differentiation status or proliferation status of keratinocytes and / or the epithelial structures, a change in the expression of the marker genes and / or the epithelium structure in test system II, but only u n completely in test system I indicates that the test compound can promote, inhibit or modify the AP-1 dependent differentiation and / or proliferation of keratinocytes.
  • test system I the proliferation but not the differentiation of the keratinocytes can be measured.
  • Test system I is characterized in that the co-culture of keratinocytes and fibroblasts takes place in a two-dimensional system on (plastic) culture carriers, while in test system II both cell types together with a matrix form a three-dimensional tissue structure, similar to the skin.
  • Test system I represents a two-dimensional feeder layer coculture represents in which keratinocytes are submerged together with irradiated fibroblasts (feeder cells) (Rheinland and Green, 1975).
  • Primary human keratinocytes are isolated from skin biopsies in plastic surgery, expanded in feeder-layer coculture (passage 1) and introduced into the experiments in passage 2.
  • Both irradiated, postmitotic mouse 3T3 fibroblasts and human fibroblasts or fibroblast lines can be used as feeder layers and the differentiation process of the epithelial cells remains unchanged, ie the specific markers are adequately expressed.
  • the proliferation of keratinocytes is significantly induced by the mesenchymal cells with which they are cultured.
  • keratinocytes are cultivated under conventional conditions in the feeder layer system submerged in medium, they proliferate and as soon as they have reached confluence, they begin to grow in multiple layers. Depending on the cultivation conditions, they form one or more cell layers that resemble squamous epithelium, but differ greatly in structure and function from the epidermis in vivo.
  • the keratinocytes are exposed to air on a collagen gel (collagen type I, from rat or cattle), whereby an improved epithelial tissue architecture is achieved, which is more comparable to the structure of the skin (Fusenig et al., 1994).
  • a collagen gel collagen type I, from rat or cattle
  • an improved epithelial tissue architecture is achieved, which is more comparable to the structure of the skin (Fusenig et al., 1994).
  • Medium components that diff through the collagen gel immersed in the medium feed the fibroblasts and keratinocytes.
  • the keratinocytes form a multilayered, ordered epithelium after only 7 days, consisting of stratum basale, spinosum, granulosum and corneum.
  • the epithelium corresponds morphologically to the epidermis because it has the specific epidermal differentiation markers, such as keratin 1/10, transglutaminase, filaggrin, loricrin (Stark et al., 1999).
  • test compounds can be very different compounds, both naturally occurring and synthetic, organic and inorganic compounds, as well as polymers (e.g. oligopeptides, polypeptides, oligonucleotides and polynucleotides) as well as small molecules, antibodies, sugars, fatty acids, nucleotides and nucleotides - Analogs, analogs of naturally occurring structures (eg peptide "imitators", nucleic acid analogs etc.) and numerous other compounds and mixtures of different compounds.
  • polymers e.g. oligopeptides, polypeptides, oligonucleotides and polynucleotides
  • small molecules antibodies, sugars, fatty acids, nucleotides and nucleotides - Analogs, analogs of naturally occurring structures (eg peptide "imitators", nucleic acid analogs etc.) and numerous other compounds and mixtures of different compounds.
  • cytokines and growth factors on the one hand
  • test compounds absorb the cells within short distances in the culture system. In the case of lipophilic substances, they pass directly through the cell membrane. In the case of cytokines and growth factors, they bind to appropriate surface receptors and trigger intracellular signaling pathways to the cell nucleus.
  • cytokines and growth factors bind to appropriate surface receptors and trigger intracellular signaling pathways to the cell nucleus.
  • a large number of potentially useful compounds in extracts of natural products are screened as starting material.
  • Such extracts can come from a large number of sources, for example the species fungi, actinomycetes, algae, insects, protozoa, plants and bacteria. The extracts showing activity can then be analyzed to isolate the active molecule; see, for example, Turner, 1996 and Suh, 1995.
  • Skin-specific genes that indicate a certain type of differentiation can be used as marker genes.
  • the genes used in Fig. 4-6 represent useful markers. Expression is determined by in-situ hybridization or preferably immunohistochemistry (IHC) or immunofluorescence. The criteria for proliferation and differentiation are, on the one hand, histological (e.g. thickness of the epithelium) and the level of expression and localization of the marker genes ki-67 (proliferation) and the genes used in Fig. 4-6 (differentiation).
  • IHC immunohistochemistry
  • the criteria for proliferation and differentiation are, on the one hand, histological (e.g. thickness of the epithelium) and the level of expression and localization of the marker genes ki-67 (proliferation) and the genes used in Fig. 4-6 (differentiation).
  • Changes in the level of expression of the marker gene can be examined using methods well known to those skilled in the art. This includes monitoring the mRNA concentration (e.g. using suitable probes or primers), immunoassays for protein concentration (e.g. using appropriate antibodies), RNAse protection assays, amplification assays or any other means suitable for detection that is known in the art.
  • the search for new compounds whose expression is directly or indirectly regulated by AP-1 or which regulate the proliferation and / or differentiation of skin keratinocytes and are therefore of therapeutic value can also be carried out on a large scale, for example by the fact that a very high Number of candidate compounds in substance libraries is screened, the substance libraries may contain synthetic or natural molecules.
  • the above method according to the invention can be modified on the basis of protocols which are described in the scientific literature and the patent literature and are known in the art. For example, a large number of potentially useful molecules can be screened in a single test. For example, if a field of 1000 compounds is to be screened, in principle all 1000 compounds can be placed in a microtiter plate well and tested simultaneously.
  • the pool of 1000 can then be divided into 10 pools of 100 and the process repeated until an individual compound is identified.
  • the production and simultaneous screening of large banks of synthetic molecules can be carried out, for example, using well known combinatorial chemistry techniques, see for example van Breemen, 1997 and Lam, 1997.
  • the method according to the invention can also be greatly accelerated as high throughput screening.
  • the assays described here can be modified accordingly for use in such a method. It will be apparent to those skilled in the art that numerous methods are available for this purpose.
  • the method according to the invention can also be used to investigate the molecular effects, for example of cytokines, on growth and differentiation processes in the skin.
  • the present invention also relates to a method for identifying a gene which is involved in the AP-1-dependent differentiation and / or proliferation of keratinocytes.
  • the expression pattern of genes in normal fibroblasts and genetically modified fibroblasts, such as c-Jun - / - or JunB - / - cells, is compared. Different regulated genes are potential candidates for genes that regulate proliferation and differentiation in Regulate keratinocytes.
  • the c-Jun - / - cell line which carries the Ubi-cJun-ER TM expression vector and / or the JunB - / - cell line which carries the Ubi-JunB-ER TM expression vector is preferably used for the comparative gene expression analysis.
  • RNA is prepared from the corresponding cells and rewritten into cDNA.
  • the cDNA can either be radioactive or labeled with a fluorescent dye.
  • the cDNAs serve as probes for the hybridization of filters or glass supports on which a large number of indicative sequences of individual genes are immobilized. Genes whose expression changes under the conditions described above can be identified on the basis of the differences in the hybridization strength. This comparative gene expression analysis using "high density filter screening" and "DNA chip technology" are in Iyer et al. (1999) and Fambrough et al. (1999).
  • the corresponding substance can either be added directly to the culture medium as a recombinant protein (for example in the case of a cytokine or growth factor) or introduced and expressed in the modified fibroblasts by means of gene transfer.
  • a recombinant protein for example in the case of a cytokine or growth factor
  • introduced and expressed in the modified fibroblasts by means of gene transfer The same applies to previously unknown DNA sequences.
  • the marker gene is a gene coding for K1 / K10, transglutaminase, filaggrin or loricrin (Stark et al., 1999).
  • the expression of these genes can be determined in accordance with the above information, for example also in accordance with the methods described in Examples 11 to 13 below using suitable antibodies.
  • a compound identified with the method according to the invention or an identified gene can then be used for the treatment of diseases, the expression of the target gene being reduced or eliminated according to the type of disease (for example by "knocking out” of the gene in the target cell or by blocking translation via antisense RNAs or ribozymes or via vectors which contain polynucleotides as an insert which encode antisense RNAs or ribozymes) or is increased, for example by administration of a vector which contains the target gene under the control of a suitable promoter, for example an inducible promoter or a promoter leading to strong expression.
  • a suitable promoter for example an inducible promoter or a promoter leading to strong expression.
  • This vector can originate from a virus, for example from an adeno-associated virus (for example AAV type 2), vaccinia virus or adenovirus, which is useful in gene therapy.
  • Retroviruses are particularly preferred. Examples of suitable retroviruses are MoMuLV, HaMuSV, MuMTV, RSV or GaLV. Methods for producing suitable vectors based on the above viruses are known to the person skilled in the art.
  • the genes or the vectors containing them can also be transported to the target cells in the form of colloidal dispersions. These include, for example, liposomes or lipoplexes.
  • Antibodies which are directed against proteins encoded by the above genes and which preferably have a neutralizing effect are also suitable for therapy.
  • antibodies can be monoclonal, polyclonal or synthetic antibodies or fragments thereof.
  • fragment means all parts of the monoclonal antibody (for example Fab, Fv or “single chain Fv” fragments) which have the same epitope specificity as the complete antibody. The production of such fragments is known to the person skilled in the art.
  • the antibodies according to the invention are preferably monoclonal antibodies.
  • the antibodies according to the invention can be produced according to standard methods, the protein encoded by the genes to be examined or a synthetic fragment thereof preferably serving as the immunogen. Methods for obtaining monoclonal antibodies are also known to the person skilled in the art.
  • Suitable carriers include, for example, phosphate-buffered saline solutions, water, emulsions, for example oil / water emulsions, wetting agents, sterile solutions, etc.
  • the medicaments containing these substances can be administered orally or, preferably, parenterally.
  • Methods for parenteral administration include topical, intra-arterial, intramuscular, subcutaneous, intramedullary, intrathecal, intraventricular, intravenous, intraperitoneal, or intranasal administration.
  • the appropriate dosage is determined by the attending physician and depends on various factors, for example the age, gender, weight of the patient, the stage of the disease, for example the skin tumor, the type of administration, etc.
  • the present invention thus further relates to the use of the compound identified by the method according to the invention, the gene or the antibody directed against a protein encoded by this gene for the treatment of diseases which are associated with impaired proliferation and / or differentiation of keratinocytes, preferably skin diseases such as psoriasis, chronic skin inflammation, delayed wound healing or skin tumors. Furthermore, acne, neurodermatitis, eczema and scar treatment can be mentioned.
  • Two examples of antibodies, the desired properties of which can be detected in test systems I and II (FIG. 7), are those which are directed against interleukin 1 and GM-CSF and neutralize the activity of these cytokines.
  • the present invention can be used in the same way to identify compounds which relate to proliferation and differentiation of different epithelia or disorders which are associated with corresponding diseases and which are controlled in the same way via interactions with the associated connective tissue cells.
  • the identified compounds can then be tested for their relevance in corresponding coculture models become. There are corresponding models or are in development for the oral mucosa, liver, mammary gland, prostate / bladder, intestine.
  • the present invention relates to the use of the gene identified by the method according to the invention or a fragment thereof or an antibody against the protein encoded by this gene for the diagnosis of diseases which are associated with impaired proliferation and / or differentiation of keratinocytes.
  • a suitable tissue sample is taken according to methods known to the person skilled in the art and the diagnostic detection is carried out according to the probe used, for example as a Southern blot, Northern blot, PCR, sequencing or as immunohistochemical or immunological detection, e.g. as RIA or ELISA.
  • antibody reference is made to the above definition.
  • the preferred embodiments of the system according to the invention described above have the advantage that, on the one hand, the actual direct target genes, e.g. of c-Jun or Jun-B, because you have a defined starting point of the activity (e.g. addition of hormone). On the other hand, you immediately have a large amount of active protein, which is an advantage over vector systems that are based on an inducible promoter (here, the amount of protein can only be increased by new synthesis over several hours). In the system according to the invention, clonal differences between cell lines can also be excluded.
  • FIG. 1 Schematic representation of the co-culture and organotypic culture system
  • FIG. 1 Schematic representation of the monolayer culture on plastic surfaces.
  • the primary keratinocytes can only be cultured in high dilution in the presence of a feeder layer made of fibroblasts.
  • B Building one organotypical culture. The principle of the cocultivation of fibroblasts and keratinocytes has been expanded by two points: i) the fibroblasts grow comparable to natural skin in a collagen matrix and ii) the keratinocytes grow here exposed to air on this matrix.
  • Figure 2 Schematic representation of the properties of the c-jun - / - c-JunER TM fibroblasts
  • the endogenous AP-1 member c-Jun is no longer functionally expressed in the fibroblasts (c-Jun - / -).
  • the c-JunER TM fusion protein introduced into the cells can take over the function of the missing c-Jun protein if it is activated by the exogenous addition of the ligand 4-OH-tamoxifen.
  • This mode of operation of the fusion protein c-JunER TM is based on the fact that the c-Jun part of the protein is inactivated as long as no ligand is bound to the modified estrogen receptor binding domain (ER TM).
  • the CAT assay shows that the c-JunER TM fusion protein by adding 100 nM 4-OH-tamoxifen the expression of the transiently transfected reporter gene chloramphenicol acetyl transferase (CAT), which is under the control of the classic TRE ("TPA response element ") from the collagenase gene, can induce.
  • CAT chloramphenicol acetyl transferase
  • the Western blot confirms that the stably transfected c-jun - / - fibroblasts express the fusion protein c-JunER TM.
  • Figure 3 Wild type, c-jun - / - and c-jun - / - c-JunER TM fibroblasts in coculture with primary human keratinocytes. The proliferation and differentiation in fibroblasts is inter alia caused by c-Jun activity
  • Figure 4 Characteristics of the in vitro organotypic cultures.
  • the organotypic coculture system as a model for the proliferation and differentiation in skin
  • Figure 5 Comparison of oranotypic cultures with mouse wild-type 3T3 fibroblasts and c-jun or JunB deficient fibroblasts
  • Figure 6 The phenotype obtained in organotypic cultures with c-jun - / - can be partially reverted by adding KGF (A) or GM-CSF (B)
  • Figure 7 The formation of epithelium in organotypic cultures with wt and junB - / - MEF can be changed by adding neutralizing antibodies
  • the "atypical" epithelial formation obtained in organotypic cultures with junB - / - MEF can be partially normalized by adding GM-CSF and IL-1 neutralizing antibodies. It can be seen that the application of the neutralizing antibodies (IL-1 or GM-CSF) reduces the hyperproliferation and normalizes the differentiation status of the epithelium in organotypic cultures with junB - / - MEF. These changes can be recognized histologically by the normalization of the stratum granulosum and the expression of the differentiation marker loricrin.
  • Example 1 Isolation of primary fibroblasts from wild type and junB - / - embryos; Establishment of mortal cell lines
  • MEF Primary mouse embryonic fibroblasts
  • Todaro and Green (1963) method For the preparation of primary fibroblasts, mouse embryos were used on days 9.5 and 10.0 of the Embryonic development from heterozygous mated junB +/- females (Schorpp-Kistner et al., 1999) obtained from the uterus after their killing by cervical dislocation. The embryos were isolated from the maternal Decidua in PBS.
  • the corpus was soaked in DMEM medium (with 10% FCS, penicillin / streptomycin 1%, 1 M L-glutamine) by suction in sterile 2.5 ml disposable syringes 25 G cannulas shredded into small tissue fragments and cell groups. These tissue fragments and cell clusters were sown in a cell culture plate with six wells and cultivated in DMEM medium with the above composition in the incubator. On the following day, non-adherent coarse tissue fragments were removed by washing with PBS and the grown primary fibroblasts were further cultivated after administration of new DMEM medium.
  • DMEM medium with 10% FCS, penicillin / streptomycin 1%, 1 M L-glutamine
  • the cells were passaged by trypsinization and plated at a density of approx. 3 ⁇ 10 5 on three T25 cell culture bottles (Greiner, Frickenhausen, Germany). These MEFs were further passaged every three days and sown at a cell density of 1-3 x 10 4 cells per cm 2 . From the 7th to the 16th passage, the exponential growth was ended by a so-called crisis. During this crisis, the cells were kept for 7 to max. Leave on the cell culture dish for 17 days without trypsinizing. The cells were observed and the medium was changed every 3 days.
  • Epidermal keratinocytes and dermal fibroblasts were isolated from biopsies of human body skin (Boukamp et al., 1990). Keratinocytes were used as feeder layer cocultures in FAD medium (DMEM: Hams F12 / 3: 1 (Sigma, Deisenhofen, Germany) with 0.1% glucose, 1 M L-glutamine; pH 7.3; with 100 U / ml penicillin, 10 ⁇ g / ml streptomycin, 5 ⁇ g / ml insulin, 1 ng / ml hEGF, 10 -10 M cholera toxin, 24 ng / ml adenine (all additives from Sigma, Deisenhofen, Germany; with 5% FCS ) (lxl0 4 / cm 2 feeder cells 1 and l, lxl0 / cm 2 keratinocytes).
  • FAD medium DMEM: Hams F12 / 3: 1 (Sigma, Deisenhofen,
  • Human fibroblasts were multiplied in DMEM with 10% FCS. Human fibroblasts with 70 gray and mouse fibroblasts were used to produce feeder fibroblasts irradiated with 20 Gy.
  • the c-Jun-ER fusion protein was activated in the stable c-jun - / - cell line, which contains an inducible c-Jun-ER TM expression vector, by adding 4-OH-tamoxifen (Sigma) in the culture medium (final concentration 100 nM) The activation of the JunB-ER TM fusion protein was carried out accordingly.
  • Type 1 collagen was prepared from rat tail tendons and provided in a concentration of 4 mg / ml in 0.1% acetic acid as a working solution (Smola et al., 1993).
  • the collagen gels used consisted of 80 vol% 4 mg / ml collagen in 0.1% acetic acid, 10 vol% Hanks salt solution (10x concentrated) and 10 vol% FCS with or without cells (2 ⁇ 10 5 cells / ml).
  • the liquid collagen was mixed with Hanks solution on ice and neutralized with 5 M NaOH while stirring.
  • the medium was drawn off from the glass rings and 1 ml of keratinocyte suspension (9 ⁇ 10 5 cells / ml FAD) was sown into the interior of the glass rings. After 24 hours of incubation, the medium was removed from the keratinocytes, causing the cells to be exposed to air. This point in time was defined as day 0 of the organotypic cultures. DMEM with 10% FCS was changed every 2 days, the medium level adjoins the upper edge of the gel. The cultures were fixed or frozen for histological or immunohistochemical processing. To detect proliferating cells in a culture by immunohistochemical methods, BrdU (Sigma) was added to the medium at a concentration of 65 ⁇ M 12 h before the cultures were fixed.
  • BrdU Sigma
  • Paraffin sections were dewaxed in a descending alcohol series and rinsed in PBS. The epitopes on the tissue sections were then made accessible by boiling the sections in "Tuf” solution (Advanced Biotechnologies, Hamburg, Germany) for 5 minutes and 0.1% trypsin at 37 ° C. or microwave treatment in 0.1 M citrate buffer for 30 minutes. Frozen sections were fixed in 80% methanol for 5 min, then in acetone for 2 min. To prove the incorporation of BrdU
  • Total RNA was prepared according to the protocol of Chomczynski and Sacchi, 1987 (see Schorpp-Kistner et al., 1999) and rewritten to cDNA in the following approach: 10 ⁇ g RNA, 10 ⁇ l 10 ⁇ PCR buffer, 20 ⁇ l 25 mM MgCl 2 6 ⁇ l of each dNTP (10mM each), 2.5 ⁇ l RNase inhibitor (20E / ⁇ l), 5 ⁇ l 50E / ⁇ l MLV reverse transcriptase, 2 ⁇ l 50 ⁇ M 01igo-dT 16 , 2 ⁇ l 50 ⁇ M "random hexamer" primer and H 2 O depc , to a total volume of 100 ul.
  • reaction batches incubated for 10 minutes at room temperature, then for 80 minutes at 42 ° C. and were stopped by heating at 95 ° C. for 5 minutes. 5 ⁇ g of total RNA were correspondingly rewritten to cDNA in a 50 ⁇ l batch and the products obtained were stored at ⁇ 20 ° C.
  • PCR steps were tailored to the use of the products of the "PCR Core” kit from Boehringer Mannheim and the "TrioThermoblock” from Biometra, Göttingen, Germany. 4 ⁇ l of the reverse transcription approach were used in each case. The following were added to a total volume of 50 ⁇ l: 1 ⁇ PCR buffer, 200 ⁇ M each of the deoxynucleotide ide, 0.2 ⁇ M of each primer, depending on the amplification conditions, 1.5 mM to 2.5 mM MgCl 2 and 1.5E Taq polymerase. 50 ⁇ l of mineral oil (Sigma) were added dropwise to each batch in order to avoid evaporation of the reaction mixture during the PCR reaction.
  • mineral oil Sigma
  • the first cycle of PCR involved denaturing the template for 5 minutes at 94 ° C. This was followed by the linear amplification range for the selected fragment 20 to 30 Cycles (1 min denaturation at 94 ° C, 1 min hybridization at primer-specific temperature, 1 min synthesis by the Taq polymerase at 72 ° C). The PCR ended with a 5 minute synthesis at 72 ° C to complete incompletely synthesized fragments. The batches were kept at -20 ° C. until further use.
  • Example 8 Preparation and analysis of the c-jun - / - cell lines which stably contain a c-Jun-ER TM expression vector
  • the Accl / Sall restriction site was removed from the multiple cloning site of a "pBluescript SK" vector (Stratagene, La Jolla, USA).
  • pBluescript SK "Stratagene, La Jolla, USA.
  • the vector was linearized with Hindi, EcoRI linkers were ligated to the vector and, after restriction, religion was carried out with EcoRI.
  • the c-JunER TM DNA fragment was isolated from PMV7 c-JunER TM (Bossy-Wetzel et al., 1997) using EcoRI digestion and subcloned into the EcoRI interface of the modified "pBluescriptSK" vector.
  • the vector was digested with Accl / Hpal and replaced by the equivalent Accl / Hpal fragment of the human c-Jun sequence (Angel et al., 1988).
  • the resulting c-JunER TM hybrid of murine and human sequences was subcloned into an unmodified "pBluescript" vector using EcoRI digestion.
  • the c-Jun-ER sequences were brought under the control of the human ubiquitin-C promoter / enhancer sequence, which was already identified as a very efficient regulatory unit in transgenic mice (Schorpp et al., 1996).
  • part of the c-JunER TM was isolated from the vector as a Sall / Ncol fragment and inserted into a Sall / Ncol cut "Ubi JunB ER TM" vector (Schorpp et al., 1996).
  • the c-jun - / - fibroblasts were lipofected (Lipofectamin, Gibco BRL, Düsseldorf, Germany) according to the manufacturer's protocol with 1.6 ⁇ g "Ubi c-JunER TM and 0.4 ⁇ g" pSV Hygro "(expression vector for the Hygromyc in-Res gene expression is regulated via the proinotor / enhancer region of the SV40) co-transfected.
  • clonal colonies were isolated and expanded.
  • the genomic DNA of the fibroblasts was isolated using the standard protocol. Genotyping was carried out using PCR. PCR machine: PTC-2000 from Biozyme Diagnostic GmbH, Hess.
  • Genotypically positive clones were identified by Western blot ( ⁇ -c-Jun / AP-1 mouse monoclonal antibodies from Signal Transduction Laboratories, Dianova, Hamburg, Germany) was checked for the expression of the fusion protein c-JunER TM The detection of the gene expression (Northern blot, RT-PCR) and the protein amounts (Western blot, ELISA) was carried out according to standard protocols.
  • junB-ER TM expression vector To produce a junB-ER TM expression vector, the stop codon in junB was first created using a DNA fragment consisting of 2 oligonucleotides (sequence oligol: 5 1 - acggctgccagttcggctaggggtcaagggacacgccttc-3 '; Oligo2: 5'- gtotggactcgaggatgtcccc''ingggtcccga replaced by junB (323 base pair BssHii-Xhol fragment between the interfaces AlwNl and Xhol).
  • sequence oligol 5 1 - acggctgccagttcggctaggggtcaagggacacgccttc-3 '
  • Oligo2 5'- gtotggactcgaggatgtcccc''ingggtcccga replaced by junB (323 base pair Bs
  • the complete unB cDNA fragment was excised from Ubi junB (Schorpp et al., 1996) with Smal, provided with EcoRI linker and cloned into the EcoRI site of pBluescript SK (Stratagene, La Jolla, USA).
  • the final j'unß-ER TM construct was prepared by ligation from the following 4 fragments: 5 'region: EcoRI / BspHI fragment from the complete junB cDNA in pBluescript SK; 3 'region with the replaced stop codon: BspHI / BamHI fragment; BamHI / EcoRI ER TM fragment from PMV7 c-jun-ER TM (Bossy-Wetzel et al., 1997); EcoRI cut pBluescript SK.
  • the ⁇ B-ER TM fragment thus obtained was isolated as an Xbal / SalI fragment and inserted into an Xbal / Xhol cut Ubi junB expression vector (Schorpp et al., 1996).
  • junB - / - fibroblasts were lipofected (Lipofectamin; Gibco BRL, Düsseldorf) according to the manufacturer's protocol with 2.8 ⁇ g Ubi junB-ER TM and 0.4 ⁇ g pSV Hygro co transfected. After 3 weeks on selection medium (DMEM) with 10% FCS and 50 ⁇ g / ml hygromycin B), clonal colonies were isolated and expanded. The genomic DNA of the fibroblasts was isolated using the standard protocol. Genotyping was done using PCR. The PCR was carried out in a Thermocycler PTC 200 from Biozym (Hess.
  • Oldendorf with the following reaction conditions: 50 ng genomic DNA, 2.5 mM MgCl 2 , 10% DMSO, 1 x GB buffer (16.6 mM (NH 4 ) 2 SO) 4 , 6,7 mM MgCl 2 , 5mM beta-mercaptolethanol, 6, 7 ⁇ M EDTA), 0, 5 mM dNTPs, 20 ng PCR primer (5 'primer: 5' -cagaccgtaccggaggcacgcagc-3 ', 3' primer: 5 ' - tggagattcaagtccccaaagcc-3 ') and 1 unit Taq polymerase (Sigma, Deisenhofen); Program: 2 "94 ° C; 30 x (30" 94 ° C, 90 "55 ° C, 2'72 ° C); 10 '72 ° C.
  • Genotypically positive clones were determined by Western blot analysis with a polyclonal antibody from rabbits against unB (N17, Santa Cruz, Heidelberg) checked for the expression of the junB-ER m fusion protein The detection of the gene expression (Northern blot, RT-PCR) and the protein amounts (Western blot, ELISA) was carried out according to standard protocols.
  • Example 10 Wild-type, c-jun - / - and c-jun - / - c-JunER TM fibroblasts in 2D co-culture with primary human keratinocytes
  • a coculture of fibroblasts and keratinocytes was analyzed after three days by light microscopy and with the aid of immunofluorescence (IF) for the proliferation and differentiation of the keratinocytes (FIG. 3).
  • IF immunofluorescence
  • 100 nM 4-OH-tamoxifen was added to the cultures every 12 hours and the medium was changed every 24 hours. The corresponding controls remained untreated.
  • the nuclei of the cells were made visible using the Hoechst dye bisbenzimide (blue color).
  • the keratinocyte islet size (recognizable in the phase contrast and the involucrin staining) is significantly reduced by the lack of c-Jun activity. Less proliferating keratinocytes (staining for Ki67) can also be detected.
  • the expression of the differentiation marker K1 / K10 (green coloration) is increased. This can be reversed in the c-jun - / - c-JunER TM fibroblasts by the tamoxifen-induced c-Jun activity.
  • Example 12 Comparison of organotypic cultures with wild-type 3T3 fibroblasts and c-jun or JunB deficient fibroblasts
  • c-jun and junB deficient fibroblasts induce an altered epithelial structure in organotypic cultures (FIG. 5). These abnormal epithelia are characterized by inhibition or stimulation of the proliferation with the consequence of a decrease or increase in the epithelial thickness and an altered differentiation.
  • the organotypic cultures obtained with c-jun - / - fibroblasts show a significantly reduced Proliferation and epithelial formation and also the expression of the late differentiation markers filaggrin and loricrin are drastically reduced.
  • the epithelium of the organotypic culture with junB - / - fibroblasts is thickened and shows greatly increased proliferation and an altered differentiation both histologically and by means of IF.
  • the expression of the marker Kl / Kl0 starts late and can only be detected in higher cell layers.
  • the differentiation markers transglutaminase, filaggrin and loricrin are enhanced and, in the case of loricrin, also expressed prematurely.
  • Example 13 The phenotype obtained in organotypic cultures with c-jun - / - can be partially reverted by adding KGF or GM-CSF
  • Oncogene Jun encodes a sequence specific trans-activator similar to API. Nature 332: 166-171.
  • Feeder layer system Serial eultivation of strains of human epidermal keratinocytes. Cell 6: 331-344.
  • Fos is an essential component of the mammalian UV response, EMBO J. 14, pp. 5338-5349

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Abstract

Beschrieben werden genetisch veränderte Fibroblastenzellen mit den folgenden Eigenschaften: (a) ein eine Untereinheit des Transkriptionsfaktors AP-1 codierendes Gen ihres Genoms ist inaktiviert und/oder eine auf den Transkriptionsfaktor AP-1 einwirkende Komponente des Signaltransduktionsweges ist modifiziert mit der Folge einer veränderten AP-1 Aktivität (b) sie enthält in einem Expressionsvektor mit einem Promotor funktionell verknüpft das Gen von (a) in einer solchen Form, dass erst nach Induktion des Promotors die aktive Untereinheit exprimiert wird oder die von dem Gen codierte Untereinheit in inaktiver und aktivierbarer Form vorliegt. Ferner wird ein Verfahren unter Verwendung der erfindungsgemässen Fibroblastenzelle zur Identifizierung einer Verbindung beschrieben, die die AP-1 abhängige Differenzierung und/oder Proliferation von Keratinozyten fördern, hemmen oder modifizieren kann oder eines Gens, das an der AP-1, abhängigen Differenzierung und/oder Proliferation von Keratinozyten beteiligt ist, sowie die Verwendung der nach dem erfindungsgemässen Verfahren identifizierten Testverbindung bzw. des Gens zur Behandlung oder Diagnose von Erkankungen, die mit einer gestörten Proliferation und/oder Differenzierung von Keratinozyten assoziiert sind.

Description

Genetisch veränderte Fibroblastenzellen
Die vorliegende Erfindung betrifft genetisch veränderte Fibroblastenzellen, bei denen ein eine Untereinheit des Transkriptionsfaktors AP-1 codierendes Gen ihres Genoms inaktiviert ist und/oder eine auf den Transkriptionsfaktor AP- 1 einwirkende Komponente des Signaltransduktionsweges mit der Folge einer veränderten AP-1 Aktivität modifiziert ist und die in einem Expressionsvektor mit einem Promotor funktioneil verknüpft das vorerwähnte Gen in einer solchen Form enthalten, daß erst nach Induktion des Promotors die aktive Untereinheit exprimiert wird oder in einer solchen Form enthält, daß die von dem Gen codierte Untereinheit in inaktiver, aber aktivierbarer, Form vorliegt. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die die AP-1 abhängige Differenzierung und/oder Proliferation von Keratinozyten fördern, hemmen oder modifizieren können und die Identifizierung von Genen ermöglichen, die an der AP-1 abhängigen Differenzierung und/oder Proliferation von Keratinozyten beteiligt sind.
Die Proliferation und Differenzierung von Keratinozyten und damit die Struktur und Funktion der Epider is sind von der Interaktion mit Fibroblasten abhängig, wobei diese Prozesse zumindest zum Teil von der gesteuerten Expression von Genen abhängen, die von dem Transkriptionsfaktor AP-1 (z.B. c-Jun, JunB) abhängig sind. Es kann davon ausgegangen werden, daß eine abnormale oder fehlende Regulation dieser Gene zu einer gestörten Proliferation und/oder Differenzierung der Keratinozyten führt, was wiederum zu einer Reihe von Erkrankungen führen kann, beispielsweise einem gestörten Hautmetabolismus (gestörte Wundh'eilung, Psoriasis, chronische Entzündungsreaktionen etc.) oder der Bildung von Hauttumoren. Bisher sind die daran beteiligten Gene bzw. Faktoren kaum bekannt und die bisherige Suche nach solchen Faktoren, die im wesentlichen auf pharmakologischen Studien an Zellkulturen oder Tieren, z.T. auch auf klinischen Studien basiert, hat den Nachteil, daß die durchzuführenden Analysen sehr komplex und zeitaufwendig und vor allem auch kaum selektiv sind.
Somit liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, Mittel zur Identifizierung von Verbindungen bereitzustellen, die direkt oder indirekt mit einer Expression des Transkriptionsfaktors AP-1 in Zusammenhang stehen bzw. direkt oder indirekt durch diesen Transkriptionsfaktor reguliert werden und die an der Proliferation und/oder Differenzierung von Hautkeratinozyten beteiligt sind. Dies sind einerseits Verbindungen, die über den Transkriptionsfaktor AP-1 direkt Gene steuern, die für die Regulation von Wachstum und Differenzierung der Epidermis verantwortlich und in krankhaften Zuständen defekt sind oder fehlerhaft reguliert werden. Zu diesen Verbindungen gehören eine große Zahl bekannter und noch nicht hinreichend bekannter Signalsubstanzen, wie Interleukine und andere Zytokine und Wachstumsfaktoren sowie synthetische Agonisten bzw. Antagonisten für ihre Rezeptoren. Die von ihnen über AP-1 gesteuerten Gene bzw. deren Produkte umfassen eine ähnlich große Zahl bekannter und noch nicht hinreichend bekannter Wachstums- und Differenzierungsfaktoren, Enzyme, deren Inhibitoren, sowie strukturelle Proteine der epidermalen Zellen. Neben diesen direkt AP-1 steuernden bzw. abhängigen Komponenten soll das Testsystem regulierende Faktoren bzw. Proteine erfassen, die mittelbar durch krankhafte bzw. therapeutische Einflüsse in Keratinozyten freigesetzt werden und dann sekundär AP-1 gesteuerte Reaktionsmechanismen in den genetisch modifizierten Fibroblasten induzieren.
Die Lösung dieser Aufgabe wird durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen erzielt .
Es wurde überraschenderweise in der vorliegenden Erfindung festgestellt, daß mittels genetisch veränderten Fibroblastenzellen ein System zur Identifizierung der vorstehenden Substanzen etabliert werden kann. Diese Fibroblastenzellen weisen die folgenden Eigenschaften auf: (a) ein eine Untereinheit des Transkriptionsfaktors AP-1 codierendes Gen ihres Genoms ist inaktiviert und/oder eine auf den Transkriptionsfaktor AP-1 einwirkende Komponente des Signaltransduktionsweges ist modifiziert mit der Folge einer veränderten AP-1 Aktivität und (b) sie enthalten in einem Expressionsvektor mit einem Promotor funktioneil verknüpft das Gen von (a) in einer solchen Form, daß erst nach Induktion des Promotors die aktive Untereinheit exprimiert wird oder in einer solchen Form, daß die von dem Gen codierte Untereinheit in inaktiver, aber aktivierbarer, Form vorliegt. Mittels dieser genetisch veränderten Fibroblastenzellinie wird eine spezifischere und einfachere Suche nach neuen Wirkstoffen, beispielsweise neuen agonistisch oder antagonistischen Pharmaka, bzw. von entsprechenden Genen ermöglicht, die bei der Behandlung von mit der Proliferation und/oder Differenzierung von Keratinozyten assoziierten Erkrankungen von Nutzen sein können. Daneben können auch Substanzen, die bereits in anderen Systemen identifiziert wurden, in einem auf den erfindungsgemäßen Fibroblasten basierenden Testsystemen näher analysiert werden.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft somit eine genetisch veränderte Fibroblastenzelle mit den folgenden Eigenschaften: (a) ein eine Untereinheit des Transkriptionsfaktors AP-1 codierendes Gen ihres Genoms ist inaktiviert und/oder eine auf den Transkriptionsfaktor AP-1 einwirkende Komponente des Signaltransduktionsweges ist modifiziert mit der Folge einer veränderten AP-1 Aktivität; und (b) sie enthält in einem Expressionsvektor mit einem Promotor funktioneil verknüpft das Gen von (a) in einer solchen Form, daß erst nach Induktion des Promotors die aktive Untereinheit exprimiert wird oder in einer solchen Form, daß die von dem Gen codierte Untereinheit in inaktiver, aber aktivierbarer, Form vorliegt.
Beispiele für Gene, die Untereinheiten des Transkriptions- faktors AP-1 codieren, sind jun-c, JunB, JunD, c-Fos, FosB, Fra-1 und Mitglieder der ATF-Proteinfamilie (Angel und Karin, 1991)
Die Inaktivierung des eine Untereinheit des Transkriptionsfaktors AP-1 codierenden Gens kann nach üblichen, dem Fachmann bekannten Verfahren erfolgen. Hier ist beispielsweise die Verwendung der Antisense-Technik (Riabowol et al . , 1992, PNAS 89, S. 157-161) oder die Injektion von neutralisierenden Antikörpern (Kovary et al . , 1991, Mol. Cell. Biol . 11, S. 4466-4472) zu nennen. Der bevorzugeste Ansatz zur Inaktivierung eines Gens stellt jedoch die Herstellung von "Knockout"- (Säuge) Tieren und die Isolierung davon abgeleiteter Zellen dar. Dies beinhaltet die Herstellung eines geeigneten
"Gene targeting" Vektors, die Isolierung korrekt genetisch modifizierter embryonaler nicht-menschlicher Stammzellen, die Injektion dieser Zellen in ( Säuge ) Tier-Blas tozysten
(bevorzugt: Maus-Blastozysten) , die Etablierung von Chimären und die Verpaarung dieser (Säuge) iere zur Generierung von
(Säuge) ieren (bevorzugt: Mäusen) mit dem gewünschten Genotyp
(A.L. Joyner: Gene targeting: A practical approach, Oxford University Press, Oxford, 1993, S. 1-234) Anschließend werden Säugetiere mit dem geeigneten Genotyp verpaart, die Embryonen während der Schwangerschaft isoliert (s. Beispiel 1), nach Standardprotokollen daraus primäre embryonale Fibroblasten isoliert und davon spontan immortale Linien etabliert (Todaro und Green, 1995; Schreiber et al . , 1995). Somit betrifft eine bevorzugte Aus führungs form der erfindungsgemäßen Fibroblastenzelle eine Fibroblastenzelle, bei der das Gen codierend für eine Untereinheit des Transkriptionsfaktors AP-1 durch "knockout" inaktiviert wurde. Die Inaktivierung des eine Untereinheit des Transkriptionsfaktors AP-1 codierenden Gens kann auch durch Eingriff (z.B. Inhibierung) in AP-1 übergeordnete Regulatorproteinen erfolgen. Statt oder zusätzlich zur Inaktivierung des eine Untereinheit des Transkriptionsfaktors AP-1 codierenden Gens kann auch die Aktivität von AP-1 dergestalt verändert werden, daß eine auf AP-1 einwirkende Komponente des Signaltranskuktionsweges modifiziert ist. Diese Modifikation kann eine Veränderung der einwirkenden Komponente auf Gen- oder Proteinebene sein, z.B. eine hoch- oder heruntergeregelte Expression oder eine konformationelle bzw. strukturelle Veränderung. Die Komponente nimmt somit nicht mehr in gewohnter Form ihre Rolle im S i g n a 1 t r a n s du k t i o n s w e g ein und bewirkt eine Aktivitätsveränderung von AP-1.
Bevorzugt ist, die zu exprimierenden Gene in einen geeigneten Expressionsvektor unter die Kontrolle eines konstitutiven Promotors zu stellen. Geeignet sind dafür Regulationseinheiten von Viren (SV40, RSV, CMV) oder von zellulären Genen, die konstitutiv exprimiert werden (z.B. das Ubiquitin C Protein). Es ist bevorzugt, den Expressionsvektors in der Weise auszugestalten, daß eine Untereinheit des Transkriptionsfaktors AP-1 kontitutiv in inaktiver, aber aktivierbarer, Form exprimiert wird. Dabei wird ein inaktives Fusionsprotein hergestellt, das erst durch Zugabe eines Induktors seine Konfirmation so ändert, daß das Protein aktiv wird.
Zur Herstellung des Expressionsvektors von Schritt (b) kann der Fachmann nach üblichen in vitro-Rekombinationsverfahren, wie sie beispielsweise in Sambrook et al . , 1989 beschrieben sind, vorgehen.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße, genetisch veränderte Fibroblastenzelle dadurch gekennzeichnet, daß das eine Untereinheit des Transkriptionsfaktors AP-1 codierende Gen c-jun (Angel et al . , 1988; Hilberg et al . , 1993) oder junB (Schorpp-Kistner et al . , 1999) ist, d.h. die Fibroblastenzellen sind c-jun- bzw. JunB-defizient .
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße genetisch veränderte Fibroblastenzelle eine humane Fibroblastenzelle oder Maus-Fibroblastenzelle und am meisten bevorzugt ist eine genetisch veränderte Fibroblastenzelle, bei der c-JunER™ oder JunB-ER™ enthalten ist. c-JunER™ enthält die N-terminale Hälfte von c-Jun und die Tamoxifen-Bindungsstelle (ER) (Bossy-Wetzel et al . , 1997) . Zur Optimierung der Expression werden die c-Jun-ER™ Sequenzen unter die Kontrolle der menschlichen Ubiquitin-C- Promotor/Enhancer Sequenz gebracht, welche eine effiziente Regulationseinheit darstellt (Schorpp et al . , 1996) . Analog wird basierend auf JunB ein JunB-ER™-Konstrukt hergestellt (s. Bsp. 9) .
Eine weitere Aus führungs form der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die die AP-1 abhängige Differenzierung und/oder Proliferation von Keratinozyten fördern, hemmen oder modifizieren kann, wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt: A) Inkontaktbringen der Test Verbindung mit der erfindungsgemäßen, genetisch veränderten Fibroblastenzelle in Cokultur mit primären Keratinozyten in einem Testsystem I und/oder Testsystem II, wobei Testsystem I dadurch gekennzeichnet ist, daß das von dem Gen von (b) codierte Protein nicht oder in inaktiver Form vorliegt, und Testsystem II dadurch, daß das von dem Gen von (b) codierte Protein in aktiver Form vorliegt, und B) Bestimmung der Expression von für den Differenzierungsstatus bzw. Prolif erationss tatus von Keratinozyten assoziierten Markergenen und/oder der Epithelstrukturen, wobei eine Veränderung der Expression der Markergene und/oder der Epithel Struktur in Testsystem II, aber nur unvollständig in Testsystem I anzeigt, daß die Testverbindung die AP-1 abhängige Differenzierung und/oder Proliferation von Keratinozyten fördern, hemmen oder modifizieren kann. In Testsystem I kann zwar die Proliferation, nicht aber die Differenzierung der Keratinozyten gemessen werden. Testsystem I zeichnet sich dadurch aus, daß die Kokultur von Keratinozyten und Fibroblasten in einem zwei-dimensionalen System auf (Plastik) kulturträgern erfolgt, während in Testsystem II beide Zellarten zusammen mit einer Matrix eine dreidimensionale Gewebestruktur, ähnlich der Haut, bilden.
Testsytem I stellt eine zweidimensionale Feeder-Layer-Cokultur dar, bei der Keratinozyten zusammen mit bestrahlten Fibroblasten (Feeder-Zellen) submers kultiviert werden (Rheinland und Green, 1975) . Primäre humane Keratinozyten werden aus Hautbiopsien der plastischen Chirurgie isoliert, in Feeder-Layer-Cokultur expandiert (Passage 1) und in Passage 2 in die Versuche eingebracht. Als Feeder-Layer können sowohl betrahlte, postmitotische Maus-3T3-Fibroblasten als auch menschliche Fibroblasten oder Fibroblasten-Linien verwendet werden und der Differenzierungsprozeß der Epithelzellen bleibt unverändert, d.h. die spezifischen Marker werden adäquat exprimiert. Die Proliferation der Keratinozyten wird signifikant von den mesenchymalen Zellen induziert, mit denen sie zusammen kultiviert werden. Hierbei kommt es auf eine äußerste Nähe epithelialer und mesenchymaler Zellen an, jedoch nicht auf den direkten Zellkontakt. Dies weist auf einen parakrinen Effekt der von den mesenchymalen Zellen produzierten Mediatoren hin (Smola et al . , 1993). So können von Keratinozyten produzierte Mediatoren, wie IL-1 die Feeder- Zellen zur Synthese von Keratinozyten- spez i f ischen Wachstumsfaktoren, wie KGF, anregen (Maas-Szabowski et al . , 1999) , was auf einen Regelkreis zwischen Fibroblasten und Keratinozyten hinweist. Die Cokultivierung der beiden Zelltypen kann nach bekannten Verfahren erfolgen, beispielsweise mittels den in den nachstehenden Beispielen beschriebenen Verfahren, vorzugsweise mittels der in den nachstehenden Beispielen 3 und 11 bis 13 beschriebenen organotypischen Kultur. Werden Keratinozyten dagegen unter konventionellen Bedingungen im Feeder-Layer-Sys tem untergetaucht in Medium kultiviert, proliferieren sie und sobald sie Konfluenz erreicht haben, beginnen sie mehrschichtig zu wachsen. Sie bilden je nach Kultivierungsbedingungen eine bis mehrere Zellagen aus, die Plattenepithelien gleichen, sich jedoch in Struktur und Funktion stark von der Epidermis in vivo unterscheiden.
In Testsytem II, der weit komplexeren, dreidimensionalen organotypischen Kultur werden die Keratinozyten luftexponiert auf einem mit Fibroblasten versetzen Collagengel (Collagen Typ I, aus Ratte oder Rind) kultiviert, wodurch eine verbesserte epitheliale Gewebearchitektur erreicht wird, die mit der Struktur der Haut eher vergleichbar ist (Fusenig et al . , 1994) . Mediumkomponenten, die durch das ins Medium eingetauchte Collagengel diff ndieren, ernähren die Fibroblasten und Keratinozyten. In organotypischen Kulturen bilden die Keratinozyten schon nach 7 Tagen ein vielschichtiges, geordnetes Epithel aus, bestehend aus Stratum basale, spinosum, granulosum und corneum. Morphologisch entspricht das Epithel der Epidermis, denn es weist die spezifischen epidermalen Differenzierungsmarker auf, wie Keratin 1/10, Transglutaminase, Filaggrin, Loricrin (Stark et al. , 1999) .
Bei den Testverbindungen kann es sich um sehr unterschiedliche Verbindungen handeln, sowohl um natürlich vorkommende als auch synthetische, organische und anorganische Verbindungen, sowie Polymere (z.B. Oligopeptide, Polypeptide, Oligonucleotide und Polynucleotide) sowie kleine Moleküle, Antikörper, Zucker, Fettsäuren, Nucleotide und Nucleotid-Analoge, Analoge von natürlich vorkommenden Strukturen (z.B. Peptid- " Imitatoren" , Nucleinsäureanaloge etc.) und zahlreiche weitere Verbindungen sowie Gemische verschiedener Verbindungen. Besonders von Interesse sind einerseits Zytokine und Wachstumsfaktoren, andererseits niedermolekulare lipophile Substanzen, die Zytokin- oder Wachstumsfaktorem imitieren (Agonisten) oder Zytokin- oder Wachstumsfaktoren-induzierte Signalwege hemmen
(Antagonisten) . Desweiteren ist die Testung von Proteinen von Interesse, deren Expression durch c-Jun bzw. JunB reguliert werden, z.B. die Matrix Metalloproteinasen MMP-9 und MMP-13
(Schorpp-Kistner, 1999) . Die Aufnahme in die Zellen erfolgt bei den Testverbindungen innerhalb kurzer Distanzen im Kultursystem. Bei lipophilen Substanzen erfolgt der direkte Durchtritt durch die Zellmembran. Bei Zytokinen und Wachstumsfaktoren erfolgt die Bindung an entsprechende Oberflächenrezeptoren und Auslösung von intrazellulären Signalwegen zum Zellkern. Darüberhinaus kann eine große Anzahl von möglicherweise nützlichen Verbindungen in Extrakten von natürlichen Produkten als Ausgangsmaterial gescreent werden. Solche Extrakte können aus einer großen Anzahl von Quellen stammen, beispielsweise den Spezies Pilze, Actinomyceten, Algen, Insekten, Protozoen, Pflanzen und Bakterien. Die Extrakte, die Aktivität zeigen, können dann zur Isolierung des aktiven Moleküls analysiert werden; siehe dazu beispielsweise Turner, 1996, und Suh, 1995.
Als Markergene kommen grundsätzlich Haut-spezifische Gene, die einen bestimmten Differenzierungtyp anzeigen, in Frage. Die in den Abb. 4-6 verwendeten Gene repräsentieren brauchbare Marker. Die Bestimmung der Expression erfolgt durch in-situ Hybridisierung oder bevorzugt Immunhistochemie (IHC) oder Immunfluoreszenz. Die Kriterien für Proliferation und Differenzierung sind zum einen histologisch (z.B. Dicke des Epithels) sowie Expressionsstärke und Lokalisierung der Markergene ki-67 (Proliferation) und der in den Abb. 4-6 verwendeten Gene (Differenzierung) .
Änderungen im Expressionsspiegel des Markergens können unter Verwendung von dem Fachmann gut bekannten Verfahren untersucht werden. Dazu zählt die Überwachung der mRNA-Konzentration (z.B. unter Verwendung geeigneter Sonden oder Primer), Immunassays hinsichtlich der Proteinkonzentration (z.B. mittels entsprechender Antikörper), RNAse-Schutzassays , Amplifikationsassays oder jedes andere für einen Nachweis geeignete Mittel, das auf dem Fachgebiet bekannt ist.
Das Suchen nach neuen Verbindungen, deren Expression direkt oder indirekt durch AP-1 reguliert wird bzw. die die Proliferation und/oder Differenzierung von Hautkeratinozyten regulieren und somit von therapeutischen Wert sind, kann auch in großem Maßstab erfolgen, beispielsweise dadurch, daß eine sehr hohe Anzahl von Kandi da ten-Verbindungen in Substanzbibliotheken gescreent wird, wobei die Substanzbibliotheken synthetische oder natürliche Moleküle enthalten können. Das vorstehende erfindungsgemäße Verfahren kann anhand von Protokollen modifiziert werden, die in der wissenschaftlichen Literatur und der Patentliteratur beschrieben und auf dem Fachgebiet bekannt sind. Beispielsweise kann eine große Anzahl von möglicherweise nützlichen Molekülen in einem einzigen Test gescreent werden. Beispielsweise können dann, wenn ein Feld von 1000 Verbindungen gescreent werden soll, im Prinzip alle 1000 Verbindungen in eine Mikrotiterplattenvertiefung gegeben und gleichzeitig getestet werden. Wenn die Gegenwart einer Verbindung mit einer gewünschten Aktivität entdeckt wird, kann dann der Pool von 1000 in 10 Pools von 100 aufgeteilt werden und der Prozeß solange wiederholt werden, bis eine individuelle Verbindung identifiziert ist. Jedenfalls können die Herstellung und das simultane Screenen von großen Banken aus synthetischen Molekülen beispielsweise mittels gut bekannter Verfahren der kombinatorischen Chemie ausgeführt werden, siehe beispielsweise van Breemen, 1997, und Lam, 1997.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch als Screening mit hohem Durchsatz ("high throughput screening") stark beschleunigt werden. Die hier beschriebenen Assays können zur Verwendung in einem solchen Verfahren entsprechend modifiziert werden. Es ist für den Fachmann offensichtlich, daß für diesen Zweck zahlreiche Verfahren zur Verfügung stehen.
Mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens können auch die molekularen Wirkungsweisen beispielsweise von Zytokinen auf Wachstum und Differenzierungsprozesse der Haut untersucht werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Identifizierung eines Gens, das an der AP-1 abhängigen Differenzierung und/oder Proliferation von Keratinozyten beteiligt ist. Dabei wird das Expressionsmuster von Genen in Normalfibroblasten und genetisch veränderten Fibroblasten, wie z.B. c-Jun-/- bzw. JunB-/- Zellen, verglichen. Unterschiedlich regulierte Gene sind potentielle Kandidaten für Gene, die die Regulation von Proliferation und Differenzierung in Keratinozyten regulieren. Vorzugsweise wird die c-Jun-/- Zellinie, die den Ubi-cJun-ER™ Expressionsvektor und/oder die JunB-/- Zellinie, die den Ubi-JunB-ER™ Expressionsvektor trägt, zur vergleichenden Genexpressionsanalyse herangezogen. Dabei soll die Expression in unbehandelten und Tamoxifen- behandelten Zellen verglichen werden. In allen Fällen wird RNA aus den entsprechenden Zellen präpariert und in cDNA umgeschrieben. Die cDNA kann dabei entweder radioaktiv oder durch einen Fluoreszenzfarbstoff markiert sein. Die cDNAs dienen als Sonden für die Hybridisierung von Filtern oder Glasträgern, auf denen eine Vielzahl von indikativen Sequenzen individueller Gene immobilisiert sind. Gene, deren Expression sich unter den oben beschriebenen Bedingungen verändert, können anhand der Unterschiede in der Hybridisierungsstärke identifiziert werden. Diese vergleichende Genexpressionsanalyse mittels "high density filter screening" und "DNA chip technology" sind in Iyer et al . (1999) und Fambrough et al . (1999) beschrieben. Bei bekannten Genen kann die entsprechende Substanz als rekombinantes Protein entweder direkt zum Kulturmedium zugegeben werden (z.B. im Falle eines Zytokins oder Wachstumsfaktors) oder mittels Gentransfer in die veränderten Fibroblasten eingebracht und exprimiert werden. Entsprechendes gilt für bisher unbekannte DNA-Sequenzen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Markergen ein K1/K10, Transglutaminase, Filaggrin oder Loricrin codierendes Gen (Stark et al . , 1999). Die Expression dieser Gene kann entsprechend den vorstehenden Angaben bestimmt werden, beispielsweise auch entsprechend den in den nachstehenden Beispielen 11 bis 13 beschriebenen Verfahren unter Verwendung geeigneter Antikörper.
Eine mit dem erfindungsgemäßen Verfahren identifizierte Verbindung bzw. ein identifiziertes Gen können dann zur Behandlung von Erkrankungen verwendet werden, wobei entsprechend der Art der Erkrankung - die Expression des Zielgens verringert oder eliminiert wird (beispielsweise durch "knocking out" des Gens in der Zielzelle oder durch Blockierung der Translation über Antisense-RNAs oder Ribozyme bzw. über Vektoren, die als Insertion Polynucleotide enthalten, die Antisense-RNAs oder Ribozyme codieren) oder erhöht wird, beispielsweise durch Verabreichung eines Vektors, der das Zielgen unter Kontrolle eines geeigneten Promotors, beispielsweise eines induzierbaren Promotors oder eines zu einer starken Expression führenden Promotors enthält. Dieser Vektor kann von einem Virus stammen, beispielsweise von einem adenoassoziierten Virus (beispielsweise AAV Typ 2), Vaccinia- Virus oder Adenovirus, der bei einer Gentherapie von Nutzen ist. Besonders bevorzugt sind Retroviren. Beispiele für geeignete Retroviren sind MoMuLV, HaMuSV, MuMTV, RSV oder GaLV. Verfahren zur Herstellung geeigneter, auf den vorstehenden Viren basierenden Vektoren sind dem Fachmann bekannt. Für Zwecke der Gentherapie können die Gene bzw. die diese enthaltenden Vektoren auch in Form von kolloidalen Dispersionen zu den Zielzellen transportiert werden. Dazu zählen beispielsweise Liposomen oder Lipoplexe. Für eine Therapie geeignet sind auch Antikörper, die gegen von den vorstehenden Genen codierte Proteine gerichtet sind und vorzugsweise eine neutralisierende Wirkung aufweisen. Diese Antikörper können monoclonale, polyclonale oder synthetische Antikörper sein oder Fragmente davon. In diesem Zusammenhang bedeutet der Begriff "Fragment" alle Teile des monoclonalen Antikörpers (z.B. Fab- , Fv- oder "single chain Fv"-Fragmente) , welche die gleiche Epitopspezifität wie der vollständige Antikörper aufweisen. Die Herstellung solcher Fragmente ist dem Fachmann bekannt. Vorzugsweise handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Antikörpern um monoclonale Antikörper. Die erfindungsgemäßen Antikörper können gemäß Standardverfahren hergestellt werden, wobei vorzugsweise das von den zu untersuchenden Genen codierte Protein oder ein synthetisches Fragment davon als Immunogen dienen. Verfahren zur Gewinnung monoclonaler Antikörper sind dem Fachmann ebenfalls bekannt. Bei Verabreichung der nach den erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten Substanzen, Gene oder Antikörper liegen diese vorzugsweise in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger vor. Zu geeigneten Trägern zählen beispielsweise Phosphat-gepufferte Kochsalzlösungen, Wasser, Emulsionen, beispielsweise Öl/Wasser-Emulsionen, Netzmittel, sterile Lösungen etc..
Die Verabreichung der diese Substanzen enthaltenden Arzneimittel kann oral oder, vorzugsweise, parenteral erfolgen. Zu den Verfahren für die parenterale Verabreichung gehören die topische, intra-arterielle, intramuskuläre, subkutane, intramedulläre, intrathekale, intraventrikuläre, intravenöse, intraperitoneale oder intranasale Verabreichung. Die geeignete Dosierung wird von dem behandelnden Arzt bestimmt und hängt von verschiedenen Faktoren ab, beispielsweise von dem Alter, dem Geschlecht, dem Gewicht des Patienten, dem Stadium der Erkrankung, beispielsweise des Hauttumors, der Art der Verabreichung etc..
Die vorliegende Erfindung betrifft somit ferner die Verwendung der nach den erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten Verbindung, des Gens oder des gegen ein von diesem Gen codierte Protein gerichteten Antikörpers zur Behandlung von Erkrankungen, die mit einer gestörten Proliferation und/oder Differenzierung von Keratinozyten assoziiert sind, vorzugsweise Hauterkrankungen, wie Psoriasis, chronische Hautentzündungen, verzögerte Wundheilung oder Hauttumore. Desweiteren sind Akne , Neurodermi t i s , Ekzeme und Narbenbehandlung zu nennen. Zwei Beispiele für Antikörper, deren gewünschte Eigenschaften in den Testsystemen I und II nachgewiesen werden kann (Fig. 7), sind solche, die gegen Interleukin 1 und GM-CSF gerichtet sind und die Aktivität dieser Zytokine neutralisieren. Durch die vorliegende Erfindung können in gleicher Weise Verbindungen identifiziert werden, die Proliferation und Differenzierung verschiedener Epithelien betreffen bzw. Störungen, die mit entsprechenden Krankheiten einhergehen und die in gleicher Weise über Wechselwirkungen mit den assoziierten Bindegewebszellen gesteuert werden. Die identifizierten Verbindungen können dann in entsprechenden Kokulturmodellen auf ihre Relevanz getestet werden. Es gibt entsprechende Modelle bzw. sind in Entwicklung für die Mundschleimhaut, Leber, Brustdrüse, Prostata/Harnblase, Darm.
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung des nach dem erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten Gens oder eines Fragments davon oder eines Antikörpers gegen das von diesem Gen codierte Protein zur Diagnose von Erkrankungen, die mit einer gestörten Proliferation und/oder Differenzierung von Keratinozyten assoziiert sind. Dabei wird eine geeignete Gewebeprobe nach dem Fachmann bekannten Verfahren entnommen und entsprechend der verwendeten Sonde der diagnostische Nachweis durchgeführt, beispielsweise als Southern-Blot, Northern-Blot , PCR, Sequenzierung oder als immunhisto- chemischer oder immunologischer Nachweis, z.B. als RIA oder ELISA. Bezüglich des Ausdrucks "Antikörper" wird auf die vorstehende Definition verwiesen.
Die oben beschriebenen bevorzugten Ausführungs ormen des erfindungsgemäße Systems haben Vorteil, daß zum einen damit die tatsächlichen direkten Zielgene, z.B. von c-Jun bzw. Jun- B, erfaßt werden können, da man einen definierten Startpunkt der Aktivität hat (z.B. Zugabe von Hormon) . Zum anderen hat man sofort eine große Menge an aktivem Protein vorliegen, was einen Vorteil gegenüber VektorSystemen darstellt, die auf einem induzierbaren Promotor basieren (hier kann erst über mehrere Stunden die Proteinmenge durch Neusynthese angehoben werden) . Im erfindungsgemäßen System kann man auch klonale Unterschiede zwischen Zellinien ausschließen.
Die Figuren zeigen:
Figur 1: Schematische Darstellung des Cokultur- und des organotypischen Kultur-Systems
(A) Schematische Darstellung der Monolayer-Kultur auf Plastikoberflächen. Die primären Keratinozyten können in großer Verdünnung nur in Gegenwart eines Feeder-Layers aus Fibroblasten kultiviert werden. (B) Aufbau einer organotypischen Kultur. Das Prinzip der Cokultivierung von Fibroblasten und Keratinozyten ist um zwei Punkte erweitert: i) die Fibroblasten wachsen vergleichbar der natürlichen Haut in einer Collagenmatrix und ii) die Keratinozyten wachsen hier luftexponiert auf dieser Matrix.
Figur 2: Schematische Darstellung der Eigenschaften der c-jun -/- c-JunER™ Fibroblasten
Das endogene AP-1 Mitglied c-Jun wird nicht mehr funktioneil in den Fibroblasten exprimiert (c-Jun -/-) . Das in die Zellen eingebrachte Fusionsprotein c-JunER™ kann die Funktion des fehlenden c-Jun Proteins übernehmen, wenn es durch exogene Zugabe des Liganden 4-OH-Tamoxifen aktiviert wird. Diese Funktionsweise des Fusionsprotein c-JunER™ basiert darauf, daß der c-Jun Teil des Proteins inaktiviert ist, solange kein Ligand an der modifizierten Östrogenrezeptor-Bindungsdomäne (ER™) gebunden ist. Erst nach der Bindung des Liganden kann der c-Jun Teil des Fusionsproteins durch die Liganden- induzierte Konformationsänderung mit anderen AP-1 Mitgliedern dimerisieren und seine transaktivierende Funktion erfüllen. Der CAT-Assay zeigt, daß das c-JunER™ Fusionsprotein durch Zugabe von 100 nM 4-OH-Tamoxifen die Expression des transient transfizierten Reportergens Chloramphenicol-Acetyl-Transferase (CAT) , welches unter der Kontrolle des klassischen TRE ( "TPA response element") aus dem Collagenase Gen steht, induzieren kann. Der Western-Blot bestätigt, daß die stabil transfizierten c-jun -/- Fibroblasten das Fusionsprotein c- JunER™ exprimieren.
Figur 3: Wildtyp, c-jun -/- und c-jun -/- c-JunER™ Fibroblasten in Cokultur mit primären humanen Keratinozyten Die Proliferation und Differenzierung in Fibroblasten wird u.a. durch c-Jun Aktivität bewirkt
Figur 4: Charakteristika der in vitro organotypischen Kulturen Das organotypische Cokultur-System als Modell für die Proliferation und Differenzierung in Haut Figur 5: Vergleich orqanotypischer Kulturen mit Maus-Wildtyp- 3T3-Fibroblasten und c-jun bzw. JunB defizienten Fibroblasten
Figur 6: Der in organotypischen Kulturen mit c-jun -/- erhaltene Phänotyp kann durch Zugabe von KGF (A) oder GM-CSF (B) partiell revertiert werden
Figur 7: Die Epithelausbildung in organotypischen Kulturen mit wt und junB -/- MEF kann durch Zugabe von neutralisierenden Antikörpern verändert werden
Die in organotypischen Kulturen mit junB -/- MEF (Maus embryonale Fibroblasten) erhaltene "atypische" Epithelbildung kann durch Zugabe von GM-CSF und IL-1 neutralisierenden Antikörpern partiell normalisiert werden. Man sieht, daß die Applikation der neutralisierenden Antikörper ( IL-1 bzw. GM-CSF) die Hyperprol i ferat ion vermindert und den Differenzierungsstatus des Epithels in organotypischen Kulturen mit junB -/- MEF normalisiert. Diese Veränderungen sind histologisch erkennbar an der Normalisierung des Stratum granulosum und der Expression des Differenzierungsmarkers Loricrin. In organotypischen Kulturen mit wt MEF kann durch Zugabe von GM-CSF und IL-1 neutralisierenden Antikörpern die Epithelausbildung stark reduziert werden. Diese Veränderungen sind histologisch erkannbar an der Verringerung der Epitheldicke und der verminderten Expression des Differenzierungsmarkers Loricrin.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1: Isolierung primärer Fibroblasten aus Wildtyp und junB-/- Embryonen; Etablierung i mortaler Zellinien
Primäre Maus-embryonale-Fibroblasten (MEF) wurden nach dem Verfahren von Todaro und Green (1963), isoliert und immortalisiert . Für die Präparation von primären Fibroblasten wurden Mausembryonen an den Tagen 9,5 und 10,0 der Embryonalentwicklung aus heterozygot verpaarten junB +/- Weibchen (Schorpp-Kistner et al . , 1999) nach deren Tötung durch zervikale Dislokation aus dem Uterus gewonnen. Die Embryonen wurden in PBS aus der mütterlichen Decidua isoliert. Nach Entfernen der extraembryonalen Gewebe und des Amnions, das zur Genotypisierung verwendet wurde, wurde der Corpus in DMEM-Medium (mit 10% FCS, Penicillin/Streptomycin 1%, 1 M L- Glutamin) durch Aufsaugen in sterile 2 , 5 ml Einwegspritzen mit 25 G-Kanülen in kleine Gewebefragmente und Zellgruppen zerkleinert. Diese Gewebefragmente und Zellhaufen wurden in einer Zellkulturplatte mit sechs Vertiefungen ausgesät und in DMEM-Medium mit vorstehender Zusammensetzung im Brutschrank kultiviert. Am folgenden Tag wurden nicht-angehaftete grobe Gewebefragmente durch Waschen mit PBS entfernt und die angewachsenen primären Fibroblasten nach Gabe von neuem DMEM- Medium weiterkultiviert. Nach 5 bzw. 7 Tagen (Embryonen von Tag 10,0 bzw. 9,5) wurden die Zellen durch Trypsinierung passagiert und in einer Dichte von ca. 3xl05 auf je drei T25 Zellkulturflaschen (Fa. Greiner, Frickenhausen, Deutschland) ausplattiert. Diese MEF wurden weiterhin alle drei Tage passagiert und in einer Zelldichte von l-3xl04 Zellen pro cm2 ausgesät. Ab der 7. bis zur 16. Passage wurde das exponentielle Wachstum durch eine sog. Krise beendet. Während dieser Krise wurden die Zellen für 7 bis max. 17 Tage auf der Zellkulturschale ohne Trypsinieren belassen. Die Zellen wurden beobachtet und das Medium wurde alle 3 Tage gewechselt. Als wieder eine Zunahme an Zellen beobachtet wurde, wurden die Zellen wieder alle drei Tage trypsiniert und mit einer Zellzahl von 3xl04 pro cm2 ausgesät. Durch stetes Weiterpassagieren entstanden so nach 16 bis 18 Passagen immortalisierte Zellinien, die kryokonserviert oder für nachfolgende Experimente weiterverwendet wurden. Die immortalisierten Zellen wurden nochmals auf ihren Genotyp hin untersucht. Diese Genotypisierung erfolgte wie bei Schorpp- Kistner et al . , 1999 beschrieben. Beispiel 2 : Isolierung und Kultivierung von primären humanen Keratinozyten und Fibroblasten
Epidermale Keratinozyten und dermale Fibroblasten wurden aus Biopsien von menschlicher Körperhaut isoliert (Boukamp et al . , 1990) . Keratinozyten wurden als Feeder-Layer-Cokulturen in FAD-Medium (DMEM:Hams F12/3:l (Fa. Sigma, Deisenhofen, Deutschland) mit 0,1 % Glucose, 1 M L-Glutamin; pH-Wert 7,3; mit 100 E/ml Penicillin, 10 μg/ml Streptomycin, 5 μg/ml Insulin, 1 ng/ml hEGF, 10-10 M Choleratoxin, 24 ng/ml Adenin (alle Zusätze von Sigma, Deisenhofen, Deutschland; mit 5% FCS) kultiviert (lxl04/cm2 Feeder- Zel 1 en und l,lxl0 /cm2 Keratinozyten) . Menschliche Fibroblasten wurden in DMEM mit 10% FCS vermehrt. Zur Herstellung von Feeder-Fibroblasten wurden humane Fibroblasten mit 70 Gray und Maus-Fibroblasten mit 20 Gy bestrahlt. Die Aktivierung des c-Jun-ER Fusionproteins in der stabilen c-jun-/-Zellinie, die einen induzierbaren c-Jun-ER™ Expressionsvektor enthält, erfolgte durch Zugabe von 4-OH-Tamoxifen (Sigma) in das Kulturmedium (Endkonzentration 100 nM) . Entsprechend wurde zur Aktivierung des JunB-ERTM Fusionsproteins vorgegangen.
Beispiel 3 : Organotypische Kulturen
Kollagen Typ 1 wurde aus Ratttenschwanzsehnen präpariert und in einer Konzentration von 4 mg/ml in 0,1% Essigsäure als Gebrauchslösung bereitgestellt (Smola et al . , 1993). Die verwendeten Kollagengele bestanden aus 80 Vol% 4 mg/ml Kollagen in 0,1% Essigsäure, 10 Vol% Hanks-Salzlösung (lOx konzentriert) und 10 Vol% FCS mit oder ohne Zellen (2xl05 Zellen/ml) . Das flüssige Kollagen wurde auf Eis mit Hanks- Lösung versetzt und unter Rühren mit 5 M NaOH neutralisiert. (Abtrypsinierte und in FCS aufgenommene Zellen können dann in die Kollagenlösung eingerührt werden.) Die Gellösung wurde in Zellkulturschalen oder je 2,5 ml in Filterinserts (3 μm Porengröße, Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland) ausgegossen und 1 Stunde im Inkubator zur Ausbildung eines Gels belassen. Sterile Glasringe mit einem Innendurchmesser von 18 mm (1,5 mm Wandstärke, 12 mm Höhe) wurden auf die Gele gesetzt und leicht angepreßt. Nach 1 h im Inkubator wurden die Kollagengele in DMEM mit 10% FCS äquilibriert . Nach 24 h wurde das Medium aus den Glasringen abgezogen und jeweils 1 ml Keratinozytensuspension (9xl05 Zellen/ml FAD) wurde in das Innere der Glasringe ausgesät. Nach 24 h Innkubation wurde das Medium von den Keratinozyten entfernt, wodurch die Zellen luftexponiert werden. Dieser Zeitpunkt wurde als Tag 0 der organotypischen Kulturen definiert. DMEM mit 10% FCS wurde alle 2 Tage gewechselt, der Mediumspiegel grenzt dabei an den oberen Gelrand. Zur histologischen oder immunhistochemisehen Aufarbeitung wurden die Kulturen fixiert oder eingefroren. Zum Nachweis von proliferierenden Zellen in einer Kultur durch immunhistochemisehe Methoden wurde 12 h vor Fixierung der Kulturen BrdU (Sigma) in einer Konzentration von 65 μM ins Medium gegeben.
Beispiel : Applikation von Cytokinen
2D-Cokulturen auf Plastikschalen bzw. Glasobjektträgern oder in 3D-Form als organotypische Kulturen wurden 24 h im entsprechenden Standardmedium inkubiert. Anschließend wurde mit Cytokinen angereichertes Medium zugesetzt und die Kulturen damit je nach Versuch mehrere Stunden oder Tage inkubiert, wobei der Mediumwechsel mit Faktorzugabe alle 2 Tage erfolgte. Bezugsquelle der Wachstumsfaktoren und Antikörper: KGF (BTS, St. Leon, Deutschland); anti-GM-CSF, polyklonal, neutralisierend (R&D-Systems, Wiesbaden, Deutschland) ; GM-CSF (Boehringer Mannheim, Deutschland) und anti-KGF, monoklonal, neutralisierend (R&D-Systems) .
Beispiel 5 : Fixierung von Kulturen
Bei Monolayerkulturen adhärenter Zellen wurde das Medium von den Zellen abgezogen und die Zellen wurden auf den Glasobjektträgern in 80% Methanol 5 min und 100% Aceton 3 min fixiert. Die Objektträger wurden anschließend getrocknet und bei -40°C aufbewahrt. Zur Herstellung von Paraffinpräparaten wurden organotypische Cokulturen oder Hautbiopsien mind. 24 h in 3,5% Formaldehyd (in PBS+) fixiert, zunächst in Agar, dann in Paraffin (Medi , Fa. Vogel, Gießen, Deutschland) eingebettet. Von den Präparaten wurden 2 μ Schnitte angefertigt, die histologisch mit Hämatoxylin (15 min) und Eosin (5 min) angefärbt wurden. Nach Entparaffinierung konnten die Paraf inschnitte auch für immunhistochemisehe Analysen verwendet werden. Zur Herstellung von Gefrierpräparaten wurden Hautproben oder organotypische Cokulturen auf Korkplättchen in Einbettgel ("Tissue Teck" , O.C.T., Frankfurt, Deutschland) über flüssigem Stickstoff eingefroren. Die Präparate wurden bei -80°C aufbewahrt. Am Gefriermikrotom wurden 5 μm Schnitte hergestellt, diese auf silanisierte Objektträger aufgebracht und für immunhistochemische Analysen verwendet.
Beispiel 6 : Immunhistochemische Analysen
Paraffinschnitte wurden in einer absteigenden Alkoholreihe entparaffiniert und in PBS gespült. Anschließend wurden durch 5 min Kochen der Schnitte in "Tuf" -Lösung (Advanced Biotechnologies, Hamburg, Deutschland) und 30 min 0,1% Trypsin bei 37°C oder Mikrowellenbehandlung in 0,1 M Citratpuffer die Epitope auf den Gewebeschnitten zugänglich gemacht. Gefrierschnitte wurden 5 min in 80%igen Methanol, dann 2 min in Aceton fixiert. Zum Nachweis der Inkorporation von BrdU
(Proliferationsassay) wurden zur Denaturierung der DNA-Stränge die Schnitte 10 min in 1,5 M HCI inkubiert. Der erste Antikörper, verdünnt in l%iger BSA-Lösung, wurd 1 h bei 37°C oder 12 h bei 4°C inkubiert. Nach dreimaligem Waschen in PBS+ wurde der zweite Fluorochrom-gekoppelte Antikörper für 45 min bei Raumtemperatur appliziert. Die Zweitantikörper gegen IgG- Maus oder IgG-Kaninchen waren nach Wahl mit FITC (grün) oder "Texas red" (rot) gekoppelt (Dianova, Hamburg, Deutschland) . Zur Kernfärbung wurde der DNA-Farbstoff Bisbenzimid (Dianova, Hamburg, Deutschland) in einer Endkonzentration von 5 ng/ml zum zweiten Antikörper zugesetzt. Überschüssige Antikörper wurden durch Waschen entfernt (3x 10 min, PBS+) und die Schnitte mit "Mowiol" (O.C.T., Frankfurt, Deutschland) und mit einem Deckglas abgedeckt. Folgende Antikörper wurden verwendet :
1. Antikörper gegen BrdU (Spezifität: Maus) von Dianova, Hamburg, Deutschland; 1. Antikörper gegen Filaggrin
(Spezifität: Maus) von Cell Systems, St. Katharina, Deutschland; Antikörper gegen K10 (Klon 8.60) (Spezifität: Maus) von Sigma, Deisenhofen, Deutschland; Antikörper gegen Loricrin (Spezifität: Kaninchen) von D. Hohl, Lausanne, Schweiz; Antikörper gegen Ki-67 (Mib-1) (Spezifität: Maus) von Calbiochem, Bad Soden, Deutschland; Antikörper gegen Transglutaminase (Spezifität: Maus) von Cell Systems, St. Katharina, Deutschland
Beispiel 7 : Reverse Transkriptions-Poly erase Kettenreaktion (RT-PCR)
Gesamt-RNA wurde nach dem Protokoll von Chomczynski und Sacchi, 1987 (siehe Schorpp-Kistner et al . , 1999) präpariert und in folgendem Ansatz zu cDNA umgeschrieben: 10 μg RNA, 10 μl lOx PCR-Puffer, 20 μl 25mM MgCl2 6 μl von jedem dNTP (je lOmM) , 2,5 μl RNase Inhibitor (20E/μl) , 5 μl 50E/μl MLV Reverse Transkriptase, 2 μl 50 μM 01igo-dT16, 2 μl 50 μM "Random Hexamer"-Primer und H2Odepc, zu einem Gesamtvolumen von 100 μl . Die Reaktionsansätze inkubierten 10 min bei Raumtemperatur, dann 80 min bei 42°C und wurden durch 5 min Erhitzen auf 95°C gestoppt. 5 μg Gesamt-RNA wurden entsprechend in einem 50 μl-Ansatz zu cDNA umgeschrieben und die erhaltenen Produkte bei -20°C gelagert.
Alle folgenden PCR-Schritte waren auf die Verwendung der Produkte des "PCR Core"-Kits von Boehringer Mannheim und des "TrioThermoblocks" von Fa. Biometra, Göttingen, Deutschland abgestimmt. Eingesetzt wurden jeweils 4 μl des Reversen- Transkriptions-Ansatzes. Zu einem Gesamtvolumen von 50 μl wurden hinzugefügt: lx PCR-Puffer, je 200 μM der Desoxynukleot ide , 0,2 μM jedes Primers, je nach Amplifikationsbedingungen 1,5 mM bis 2,5 mM MgCl2 und 1,5E Taq- Polymerase. Zu jedem Ansatz wurden 50 μl Mineralöl (Sigma) zugetropft, um eine Verdunstung des Reaktionsgemisches während der PCR-Reaktion zu vermeiden. Der erste Zyklus der PCR umfaßte eine 5minütige Denaturierung der Matrize bei 94°C. Daran schlössen sich entsprechend des linearen Amplifikationsbereiches für das ausgewählte Fragment 20 bis 30 Zyklen (1 min Denaturieren bei 94°C, 1 min Hybridisieren bei Primer-spezifischer Temperatur, 1 min Synthese durch die Taq- Polymerase bei 72°C) an. Die PCR endete mit 5minütiger Synthese bei 72°C zur Komplettierung unvollständig synthetisierter Fragmente. Die Ansätze wurden bis zur weiteren Verwendung bei -20°C aufbewahrt.
Beispiel 8: Herstellung und Analyse der c-jun -/- Zellinien, die stabil einen c-Jun-ER™ Expressionsvektor enthalten
Zur Subklonierung des c-JunER™ DNA-Fragments wurde die Accl/Sall Restriktionsschnittstelle aus der Me rfachklonierungsstelle eines "pBluescript SK" -Vektors (Fa. Stratagene, La Jolla, USA) entfernt. Dazu wurde der Vektor mit Hindi linearisiert, EcoRI-Linker wurden an den Vektor ligiert und nach Restriktion wurde mit EcoRI religiert. Das c-JunER™ DNA-Fragment wurde mittels EcoRI-Verdau aus PMV7 c-JunER™ (Bossy-Wetzel et al . , 1997) isoliert und in die EcoRI- Sc nittstelle des modifizierten "pBluescriptSK"-Vektors subkloniert. Zum Austausch eines Teils der murinen c-Jun- Sequenz wurde der Vektor mit Accl/Hpal verdaut und durch das äquivalente Accl/Hpal-Fragment der menschlichen c-Jun-Sequenz (Angel et al . , 1988) ersetzt. Das so entstandene c-JunER™- Hybrid aus murinen und humanen Sequenzen wurde mittels EcoRI- Verdau in einen unmodifizierten "pBluescript " -Vektor subkloniert. Zur Optimierung der Expression des Fusionsproteins wurden die c-Jun-ER Sequenzen unter die Kontrolle des menschlichen Ubiquitin-C Promotor/Enhancer- Sequenz gebracht, die bereits in transgenen Mäusen als sehr effiziente Regulationseinheit identifiziert wurde (Schorpp et al., 1996). Dazu wurde ein Teil des c-JunER™ als Sall/Ncol- Fragment aus dem Vektor isoliert und in einen Sall/Ncol geschnittenen "Ubi JunB ER™"-Vektor (Schorpp et al . , 1996) eingesetzt. Die c-jun -/- Fibroblasten wurden mittels Lipofektion (Lipofectamin, Gibco BRL, Karlsruhe, Deutschland) entsprechend dem Protokoll des Herstellers mit 1.6 μg "Ubi c-JunER™ und 0.4 μg "pSV Hygro" (Expressionsvektor für das Hygromyc in-Res i s tenzgen ; Expression wird über die Proinotor/Enhancerregion des SV40 reguliert) co-transfiziert . Nach 3 Wochen Wachstum auf Selektionsmedium (DMEM mit 10% FCS und 50 μg/ml Hygromycin B) wurden klonale Kolonien isoliert und expandiert. Die genomische DNA der Fibroblasten wurde mittels Standardprotokoll isoliert. Die Genotypisierung wurde mittels PCR durchgeführt. PCR-Maschine: PTC-2000 von Fa. Biozyme Diagnostic GmbH, Hess. Oldendorf, Deutschland; Reaktionsbedingungen: 50 ng genomische DNA 5 mM MgCl2, 10% DMSO, 1 x GB-Puffer (16,6 mM (NH4)2S04; 6,7 M MgCl2; 5 M ß- Mercaptoethanol ; 6 , 7 mM EDTA), 0 , 5 mM dNTPs, 35 ng PCR-Primer (5 ' -Primer: 5'atgaggaaccgcattgcg; 3 ' -Primer: 5 ' - tggagattcaagtccccaaagcc) und 1 Einheit Taq-Polymerase (Sigma) . PCR-Programm: 5' 94°C; 35x (94°C 45"; 55°C 1 ' ; 72°C 1 • ) ; 71 72°C. Genotypisch positive Klone wurden mittels Western-Blot (α-c-Jun/AP-1 monoklonale Maus-Antikörper von Signal Transduction Laboratories, Dianova, Hamburg, Deutschland) auf die Expression des Fusionsproteins c-JunER™ überprüft. Der Nachweis der Genexpression (Northern Blot, RT-PCR) und der Proteinmengen (Western Blot, ELISA) erfolgte nach gängigen Standardprotokollen.
Beispiel 9s Herstellung und Analyse der JunB -/- Zellinien, die stabil einen Ubi-JunB-ER™ Expressionsvektor enthalten
Zur Herstellung eines junB-ER™ Expressionsvektors wurde zunächst das Stopcodon in junB mit Hilfe eines DNA Fragments bestehend aus 2 Oligonkleotiden (Sequenz Oligol: 51- acggctgccagttcggctaggggtcaagggacacgccttc-3 ' ; Oligo2: 5'- gtotggactcgaggatccccgaaggcgtgtcccttgaccc-3 ' ) in einem 3 ' Subklon von junB (323 Basenpaar BssHii-Xhol Fragment zwischen den Schnittstellen AlwNl und Xhol) ersetzt. Das komplette unB cDNA-Fragment wurde aus Ubi junB (Schorpp et al . , 1996) mit Smal ausgeschnitten, mit EcoRI Linker versehen und in die EcoRI Schnittstelle von pBluescript SK (Stratagene, La Jolla, USA) kloniert. Das endgültige j'unß-ER™ Konstrukt wurde durch Ligation aus folgenden 4 Fragmenten hergestellt: 5' Bereich: EcoRI/BspHI Fragment aus der kompletten junB cDNA in pBluescript SK; 3' Bereich mit dem ersetzten Stopcodon: BspHI/BamHI Fragment; BamHI/EcoRI ER™ Fragment aus PMV7 c-jun- ER™ (Bossy-Wetzel et al . , 1997); EcoRI geschnittener pBluescript SK. Das so erhaltene ι B-ER™ Fragment wurde als Xbal/Sall Fragment isoliert und in einen Xbal/Xhol geschnittenen Ubi junB Expressionsvektor (Schorpp et al . , 1996) eingesetzt. Die junB - /- Fibroblasten wurden mittels Lipofektion (Lipofectamin; Gibco BRL, Karlsruhe) entsprechend dem Protokoll des Herstellers mit 2 , 8 μg Ubi junB-ER™ und 0,4 μg pSV Hygro co trans f i z i er t . Nach 3 Wochen auf Selektionsmedium (DMEM) mit 10 % FCS und 50 μg/ml Hygromycin B) wurden klonale Kolonien isoliert und expandiert. Die genomische DNA der Fibroblasten wurde mittels Standardprotokoll isoliert. Die Genotypisierung erfolgte mittels PCR. Die PCR wurde in einem Thermocycler PTC 200 von Biozym (Hess. Oldendorf) mit folgenden Reaktionsbedingungen durchgeführt: 50 ng genomische DNA, 2 , 5 mM MgCl2, 10 % DMSO, 1 x GB Puffer (16,6mM (NH4)2S04, 6,7 mM MgCl2, 5mM beta- Mercaptolethanol, 6 , 7 μM EDTA), 0 , 5 mM dNTPs, 20 ng PCR Primer (5 'Primer: 5 ' -cagaccgtaccggaggcacgcagc-3 ' , 3 'Primer: 5'- tggagattcaagtccccaaagcc-3 ' ) und 1 Unit Taq Polymerase (Sigma, Deisenhofen); Programm: 2" 94°C; 30 x (30" 94°C, 90" 55°C, 2'72°C); 10' 72°C. Genotypisch positive Klone wurden mittels Western Blot Analyse mit einem polyklonalen Antikörper aus Kaninchen gegen unB (N17, Santa Cruz, Heidelberg) auf die Expression des Fusionsporteins junB-ERm überprüft. Der Nachweis der Genexpression (Northern Blot, RT-PCR) und der Proteinmengen (Western Blot, ELISA) erfolgte nach gängigen Standardprotokollen.
Beispiel 10: Wildtyp, c-jun -/- und c-jun -/- c-JunER™ Fibroblasten in der 2D-Cokultur mit primären humanen Keratinozyten
Eine Cokultur von Fibroblasten und Keratinozyten wurde nach drei Tagen lichtmikroskopisch und mit Hilfe von Immunfluoreszenz (IF) auf Proliferation und Differenzierung der Keratinozyten analysiert (Figur 3) . Zu den Kulturen wurde alle 12 Stunden 100 nM 4-OH-Tamoxifen zugesetzt und alle 24 Stunden das Medium gewechselt. Die entsprechenden Kontrollen blieben unbehandelt. In der IF wurden die Kerne der Zellen durch den Hoechst-Farbstoff Bisbenzimid sichtbar gemacht (blaue Färbung) . Die Keratinozyten-Inselgröße ist (erkennbar im Phasenkontrast und an der Involucrin-Färbung) durch das Fehlen einer c-Jun-Aktivität deutlich verringert. Auch sind weniger proliferierende Keratinozyten (Färbung für Ki67) nachzuweisen. Die Expression des Differenzierungsmarkers K1/K10 (grüne Färbung) ist verstärkt. Dieser kann in den c-jun -/- c-JunER™ Fibroblasten durch die Tamoxifen induzierte c-Jun Aktivität wieder aufgehoben werden.
Beispiel 11: Charakteristika der in vitro 3D-organotypischen Kulturen
Vergleich von humaner Haut mit sieben Tage alten organotypischen Kulturen, bei denen primäre humane Fibroblasten und Maus-3T3-Fibroblasten verwendet wurden (Figur 4) . Er demonstriert, daß mit den organotypischen Kulturen ein in-vitro System zur Verfügung steht, welches sowohl histologisch als auch im Bezug auf die Expression von Markergenen der normalen humanen Haut äquivalent ist. Die Expression der Gene K1/K10, Transglutaminase, Filaggrin und Loricrin sind allgemein als Markergene für den Differenzierungsstatus der Keratinozyten anerkannt. Sowohl mit humanen als auch mit murinen Fibroblasten bilden sich normale Epithelien aus. Hiermit ist offensichtlich, daß die molekularen Mechanismen welche die Ephi thelbildung kontrollieren, speziesübergreifend zwischen Mensch und Maus konserviert sind.
Beispiel 12 : Vergleich organotypischer Kulturen mit aus- Wildtyp-3T3-Fibroblasten und c-jun bzw. JunB defizienten Fibroblasten
Im Gegensatz zu Wildtyp-Maus-3T3-Fibroblasten induzieren c-jun bzw. junB defiziente Fibroblasten in organotypischen Kulturen eine veränderte Epithelstruktur (Figur 5) . Diese abnormalen Epithelien sind durch Hemmung bzw. Stimulierung der Proliferation mit der Konsequenz einer Ab- bzw. Zunahme der Epitheldicke und durch eine veränderte Differenzierung charakterisiert. Die mit c-jun -/- Fibroblasten erhaltenen organotypischen Kulturen zeigen eine deutlich verminderte Proliferation und Epithelbildung und auch die Expression der späten Differenzierungsmarker Filaggrin und Loricrin ist drastisch vermindert. Das Epithel der organotypischen Kultur mit junB -/- Fibroblasten ist verdickt und zeigt stark erhöhte Proliferation und sowohl histologisch als auch mittels IF eine veränderte Differenzierung. Die Expression des Markers Kl/Kl0 setzt verspätet ein und ist erst in höheren Zellagen nachzuweisen. Die Differenzierungsmarker Transglutaminase, Filaggrin und Loricrin werden verstärkt und im Falle von Loricrin auch verfrüht exprimiert.
Beispiel 13: Der in organotypischen Kulturen mit c-jun -/- erhaltene Phänotyp kann durch Zugabe von KGF oder GM-CSF partiell revertiert werden
Die Applikation der Zytokine KGF bzw. GM-CSF zu den organotypischen Kulturen mit c-jun -/- Fibroblasten hebt die verminderte Epithelausbildung auf. Allerdings wird durch KGF- Gabe (Figur 6A) nicht der volle Differenzierungsstatus wiederhergestellt. Dies ist histologisch erkennbar am Fehlen des Stratum granulosum und der Expression der Differenzierungsmarker Filaggrin und Loricrin. Die Zugabe des Zytokins GM-CSF (Figur 6B) bewirkt zwar eine verstärkte Epithelbildung, aber auch in diesem Fall entspricht der Differenzierungsstatus des Epithels nicht dem Normalzustand. K1/K10 wird verspätet, Transglutaminase, Filaggrin und Loricrin verstärkt und Loricrin verfrüht exprimiert.
Bei der DMSZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, Braunschweig) wurden gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags hinterlegt:
am 11. November 1999:
Zellkultur 10JunB-/- DSM ACC2419 am 21. Dezember 1999:
Zellkultur 55/2c-Jun-ER™ wt#180 DSM ACC2438
Zellkultur lOJunB-ER™ #7 DSM ACC2439
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Claims

Patentansprüche
1. Genetisch veränderte Fibroblastenzelle mit den folgenden Eigenschaften :
(a) ein eine Untereinheit des Transkriptionsfaktors AP-1 codierendes Gen ihres Genoms ist inaktiviert und/oder eine auf den Transkriptionsfaktor AP-1 einwirkende Komponente des Signaltransduktionsweges ist modifiziert mit der Folge einer veränderten AP-1 Aktivität; und
(b) sie enthält in einem Expressionsvektor mit einem Promotor funktioneil verknüpft das Gen von (a) in einer solchen Form, daß erst nach Induktion des Promotors die aktive Untereinheit exprimiert wird oder in einer solchen Form, daß die von dem Gen codierte Untereinheit in inaktiver, aber aktivierbarer, Form vorliegt .
2. Genetisch veränderte Fibroblastenzelle nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Gen von (a) durch "knockout" inaktiviert wurde.
3. Genetisch veränderte Fibroblastenzelle nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das eine Untereinheit des Transkriptionsfaktors AP-1 codierende Gen c-jun oder junB ist.
4. Genetisch veränderte Fibroblastenzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 3, die eine humane Fibroblastenzelle oder Maus-Fibroblastenzelle ist.
5. Genetisch veränderte Fibroblastenzelle nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß in dem Expressionsvektor eine für ein Fusionsprotein aus c-Jun und eine Tamoxifen-Bindungsstelle (ER) codierende Sequenzen enthalten sind.
6. Genetisch veränderte Fibroblastenzelle nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß in dem Expressionsvektor eine für ein Fusionsprotein aus JunB und eine Tamoxifen-Bindungsstelle (ER) codierende Sequenzen enthalten sind.
7. Genetisch veränderte Fibroblastenzelle nach einem der Ansprüche 1-6, die mit der Bezeichung "Zellkultur 55/2c-Jun- ER™ wt#80" unter DSM ACC2438 bei der DSMZ am 21. Dezember 1999 hinterlegt worden ist.
8. Genetisch veränderte Fibroblastenzelle nach einem der Ansprüche 1-6, die mit der Bezeichung "Zellkultur lOJunB-ΞR™ #7" unter DSM ACC2439 bei der DSMZ am 21. Dezember 1999 hinterlegt worden ist.
9. Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die die AP- 1 abhängige Differenzierung und/oder Proliferation von Keratinozyten fördern, hemmen oder modifizieren kann, wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt:
A) Inkontaktbringen der zu testenden Verbindung mit der genetisch veränderten Fibroblastenzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 8 in Cokultur mit primären Keratinozyten in einem Testsystem I und Testsystem II, wobei Testsystem I dadurch gekennzeichnet ist, daß das von dem Gen von (b) codierte Protein nicht oder in inaktiver Form vorliegt, und Testsystem II dadurch, daß das von dem Gen von (b) codierte Protein in aktiver Form vorliegt, und
B) Bestimmung der Expression von für den Differenzierungsstatus und/oder den Proliferationsstatus von Keratinozyten assoziierten Markergenen und/oder der Epithelstrukturen, wobei eine Veränderung der Expression der Markergene und/oder der Epithelstruktur in Testsystem II, nicht jedoch in Testsystem I anzeigt, daß die Testverbindung die AP-1 abhängige Differenzierung und/oder Proliferation von Keratinozyten fördern, hemmen oder modifizieren kann.
10. Verfahren zur Identifizierung eines Gens, das an der AP-1 abhängige Differenzierung und/oder Proliferation von Keratinozyten beteiligt ist, wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt:
(a) Gewinnen von RNA aus Normalfibroblasten und genetisch veränderten Fibroblastenzellen nach einem der Ansprüche 1-8 sowie Umschreiben in cDNA
(b) Markierung der cDNA
(c) Hybridisieren der markierten cDNAs als Sonden mit Filtern oder Glasträgern, auf denen eine Vielzahl von indikativen Sequenzen individueller Gene immobilisiert sind.
(d) Bestimmen von Unterschieden in der Hybridisierungsstärke zwischen Sonden aus Normalfibroblasten und genetisch veränderten Fibroblasten.
11. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Markergen ein K1/K10, Transglutaminase, Filaggrin oder Loricrin codierendes Gen ist.
12. Verwendung der nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11 identifizierten Verbindung, des Gens oder des gegen ein von diesem Gen codierte Protein gerichteten Antikörpers zur Behandlung von Erkrankungen, die mit einer gestörten Proliferation und/oder Differenzierung von Keratinozyten assoziiert sind.
13. Verwendung des nach dem Verfahren nach Anspüren 10 identifizierten Gens oder eines Fragments oder eines Antikörpers gegen das von diesem Gen codierte Protein zur Diagnose von Erkrankungen, die mit einer gestörten Proliferation und/oder Differenzierung von Keratinozyten assoziiert sind.
14. Verwendung nach Anspruch 12 oder 13 , wobei die Erkrankung Psoriasis, chronische Hautentzündung, verzögerte Wundheilung, Narbenbehandlung, Akne, Ekzeme, Neurodermitis oder ein Hauttumor ist.
15. Fibroblastenzelle, bei der das JunB-Gen inaktiviert ist.
16. Fibroblastenzelle nach Anspruch 15, wobei diese mit der der Bezeichnung "Zellkultur 10JunB-/-" unter DSM ACC2419 bei der DSMZ am 11. November 1999 hinterlegt worden ist.
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