DE60016402T2

DE60016402T2 - Therapeutische verwendung eines inhibitors des hedgehog signalübertragungsweges

Info

Publication number: DE60016402T2
Application number: DE60016402T
Authority: DE
Inventors: Jonathan Robert Lamb; Gerard Francis Hoyne; Margaret Jane Dallman
Original assignee: Lorantis Ltd
Current assignee: Celldex Therapeutics Ltd
Priority date: 1999-06-08
Filing date: 2000-06-05
Publication date: 2005-10-27
Anticipated expiration: 2020-06-06
Also published as: WO2000074706A1; EP1183040A1; GB0013674D0; AU5095500A; AU780358B2; CA2376210A1; EP1183040B1; ES2233383T3; JP2003501395A; ATE283700T1; DE60016402D1; US20020192216A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines Inhibitors für einen Hedgehog-Signalweg bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Epithelzellhyperplasie, Gewebefibrose, Entzündung oder einer Immunstörung.
Hintergrund
In vielen Geweben, wie etwa der Lunge und der Niere, kann eine chronische, nicht abheilende Entzündung zu einem Umbau führen, bei dem sowohl Epithelzellhyperplasie als auch Fibrose stattfinden. Zusätzlich kommt es zu einer begleitenden Infiltration einkerniger Zellen an lokalen Stellen der Entzündung und der Induktion von Immunreaktionen gegen Auto-Antigene. Eine ähnliche Pathologie wird auch bei der chronischen Abstoßung transplantierter Organe beobachtet. Allgemein sind diese Erkrankungen klinisch schwer zu behandeln, wie dies bei chronischer, obstruktiver Lungenerkrankung gut zu beobachten ist, bei der die momentane pharmakologische Behandlung von begrenzter Wirkung ist. Daher wird die Fähigkeit, diese Fehlregulation von epithelialen Reparaturprozessen zu kontrollieren, welche Anti-Selbst-Immunantworten und Gewebeumbau befördern, einen bedeutenden klinischen Einfluss haben.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Bildung von Epitheloberflächen und die Regulation des epithelialen Zellwachstums scheinen zwischen den Arten hochgradig konserviert zu sein. Kürzliche Studien der Entwicklungsbiologie haben die Bedeutung der epithelialen Zellwachstumsfaktorgene Shh und Wnt 1 und der TGF-β-Superfamilienmitglieder BMP4 und BMP7 gezeigt. Diese Genprodukte spielen nicht nur eine wichtige Rolle bei epithelialem Zellwachstum in der Entwicklung, sondern auch bei der Gewebe-Musterbildung. Die letztere erfordert die koordinierte und zeitliche Regulierung von Zelldifferenzierungsprogrammen. Während der Entwicklung reagieren Zellen auf Wachstumsfaktoren, die sich in ihrer Umgebung befinden, und es ist die Interpretation dieser verschiedenen Wachstumsfaktor-Signalwege, die bestimmen wird, welches Differenzierungsprogramm eingeleitet wird. Derzeit ist wenig über den Beitrag dieser Gene bei der Gewebeumordnung und Fibrose bekannt, die bei chronischer Entzündung beobachtet werden, obwohl man BMP eine Beteiligung bei der Fibrose bei Knochenerkrankung zugeschrieben hat. Wir haben beobachtet, dass es bei erkrankter Lunge zu einer gesteigerten Expression des Gens patched kommt, das am Hedgehog-Signal beteiligt ist. Wir haben ferner festgestellt, dass die intratracheale Zufuhr von Plasmid-DNA für das Hedgehog-Gen zur Entwicklung von Epithelzellhyperplasie, Gewebefibrose und der Infiltration durch einkernige Zellen führt. Die Pathologie ist derjenigen ähnlich, die bei interstitieller Lungenerkrankung beobachtet wird.
Wir schlagen vor, dass Antagonisten von Komponenten des Hedgehog-Signals und/oder Antagonisten von Komponenten des Hedgehog-Signalwegs Erkrankungen wie Epithelzellhyperplasie, Gewebefibrose und chronische Entzündung verhindern und/oder beheben könnten und ebenso die Transplantatabstoßung verhindern könnten.
Aspekte der Erfindung
Bei einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Antagonisten für eine Komponente des Signalwegs eines Hedgehog-Familienmitglieds bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Epithelzellhyperplasie, Gewebefibrose, Entzündung oder einer Immunstörung bereitgestellt.
Anders ausgedrückt, stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Antagonisten für eine Komponente des Signalswegs eines Hedgehog-Familienmitglieds bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Epithelzellhyperplasie, Gewebefibrose, Entzündung oder einer Immunerkrankung bereit.
Bei einer Ausführungsform ist das Hedgehog-Familienmitglied Sonic Hedgehog, Indian Hedgehog oder Desert Hedgehog.
Bei einer Ausführungsform ist der Signalweg, der ein Ziel des Hedgehog-Signals ist, ein BMP-Signalweg oder ein Wnt-Signalweg.
Bei einer Ausführungsform ist der Antagonist HIP, Cyclopamin, Fzb, Cerberus, WIF-1, Xnr-3, Noggin, Chordin, Gremlin oder Follistatin oder ein Derivat, ein Fragment, eine Variante, ein Nachahmer, ein Homologes oder ein Analoges davon.
Bei einer anderen Ausführungsform ist der Antagonist ein Antikörper gegen eine Komponente des Hedgehog-Signalwegs.
Bei einer weiteren Ausführungsform ist der Antagonist selbst ein Bestandteil des Hedgehog-Signalwegs.
Vorzugsweise betrifft die Verwendung der vorliegenden Erfindung die Behandlung der Lungenhyperplasie oder der Lungenfibrose.
Bevorzugter betrifft die Verwendung der vorliegenden Erfindung die Behandlung von Schocklunge; chronischen obstruktiven Atemwegserkrankungen, einschließlich Asthma, Emphysem und chronischer Bronchitis; Atelektase; berufsbedingten Lungenerkrankungen, einschließlich Silikose; Überempfindlichkeitserkrankungen der Lunge, einschließlich Überempfindlichkeitslungenentzündung; idiopathischen interstitiellen Lungenerkrankungen, einschließlich idiopathischer pulmonaler Fibrose, Lungenentzündung, einschließlich herkömmlicher interstitieller Lungenentzündung, desquamativer interstitieller Lungenentzündung und akuter interstitieller Lungenentzündung; und pleuraler Fibrose.
Bei einer Ausführungsform ist die Immunerkrankung eine Autoimmunerkrankung oder eine Transplantatabstoßung.
In spezifischerer Form kann die Autoimmunerkrankung Thyroiditis, Insulitis, Multiple Sklerose, Iridocyclitis, Uveitis, Orchitis, Hepatitis, Addison-Krankheit, Myasthenia gravis, rheumatoide Arthritis und Lupus erythematodes sein.
Bei einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung zur Verwendung bei der Behandlung von Epithelzellhyperplasie, Gewebefibrose, Entzündung, Krebs oder einer Immunerkrankung bereit, wobei diese Zusammensetzung eine therapeutisch wirksame Menge eines Antagonisten eines Hedgehog-Signalwegs oder eines Antagonisten eines Ziel-Signalwegs des Hedgehog-Signals und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, Hilfsstoff oder ein Verdünnungsmittel umfasst.
Verschiedene bevorzugte Merkmale und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden nun mittels nicht einschränkender Beispiele und unter Bezugnahme auf die begleitenden Zeichnungen beschrieben, von denen:
1 eine schematische Darstellung des HH-Signals zeigt;
2 eine schematische Darstellung eines Bestandteils des HH-Signals zeigt;
3 eine schematische Darstellung des Wnt-Signals zeigt;
4 das Plasmid SPC-SV40 zeigt;
5 das Plasmid SPC-Shh zeigt;
6 die Ergebnisse von Beispiel 2 zeigt;
7–9 die Ergebnisse von Beispiel 3 zeigen;
10 die Ergebnisse von Beispiel 4 zeigt;
11 die Ergebnisse von Beispiel 5 zeigt;
12 die Ergebnisse von Beispiel 6 zeigt;
13 die Ergebnisse von Beispiel 7 zeigt;
14 die Ergebnisse von Beispiel 8 zeigt;
15 die Ergebnisse von Beispiel 9 zeigt;
16 die Ergebnisse von Beispiel 12 zeigt;
17 die Ergebnisse von Beispiel 13 zeigt.
Zur Erleichterung der Bezugnahme wird unten eine Zusammenfassung der begleitenden Sequenzliste gegeben:

SEQ ID NO:1 zeigt die abgeleitete Aminosäuresequenz von Maus-SHH, und SEQ ID NO:2 zeigt die zugehörige Nukleinsäuresequenz;
SEQ ID NO:3 zeigt die abgeleitete Aminosäuresequenz von Maus-Dvl-1, und SEQ ID NO:4 zeigt die zugehörige Nukleinsäuresequenz;
SEQ ID NO:5 zeigt die abgeleitete Aminosäuresequenz von Maus-HIP, und SEQ ID NO:6 zeigt die zugehörige Nukleinsäuresequenz; und
SEQ ID NO:7 zeigt die abgeleitete Aminosäuresequenz von Maus-WIF-1, und SEQ ID NO:8 zeigt die zugehörige Nukleinsäuresequenz.

Proteine der Hedgehog-Familie
Alle mehrzelligen Organismen benötigen Zellkommunikation, um Wachstum und Differenzierung im Embryo zu regulieren. Eine Strategie hierfür besteht darin, abgegrenzte Organisatorzentren zu etablieren, die Signale aussenden, um die Zellproliferation und die Festlegung des Zellschicksals koordiniert zu kontrollieren. Das hedgehog (hh)-Gen wurde ursprünglich über den Segmentpolaritäts-Phänotyp identifiziert, der durch dessen Mutation bei Drosophila erzeugt wird. Gene der hh-Familie sind inzwischen aus verschiedenen Vertebraten-Spezies, einschließlich Maus, Huhn, Zebrafisch, Ratte, Xenopus und Mensch isoliert worden. Diese Gene scheinen nicht nur ein hohes Maß struktureller Homologie sowohl innerhalb einer Art als auch zwischen den Arten zu zeigen, sondern zeigen zusätzlich einige bemerkenswerte Ähnlichkeiten hinsichtlich der Funktionsweisen, die sie bei verschiedenen embryonalen Prozessen zeigen. Bei Vertebraten ist Sonic hedgehog (Shh) ein Schlüsselsignal in verschiedenen Signal-sendenden Zentren. Es gibt bei zwei weitere Säuger-HH-Mitglieder: Indian hedgehog (Ihh) und Desert hedgehog (Dhh).
Eine Zusammenfassung der verschiedenen hedgehog-Gene ist in der folgenden Tabelle 1 angegeben:
Tabelle 1
Die Klassifizierung von Genen verschiedener Arten basiert auf dem Vergleich des Expressionsmusters und der Aminosäuresequenz. Von allen Vertebraten-Proteinen ist DHH gegenüber Drosophila HH am ähnlichsten (51% Identität über die gesamte Länge des prozessierten Proteins). Die Aminosäureidentität bei SHH beträgt 93% zwischen Maus und Mensch, 84% zwischen Maus und Huhn, 78% zwischen Maus und Xenopus und 68% zwischen Maus und Zebrafisch. Der innerhalb der Art vorgenommene Vergleich bei der Maus ergibt 58-63% Identität bei paarweiser Kombination zwischen SHH, IHH und DHH. Der zwischen den Arten vorgenommene Vergleich zwischen Maus und Xenopus zeigt die höchsten Identitäten zwischen IHH und XBHH (70%) und DHH und XCHH (64%).
Die verschiedenen Hedgehog-Proteine bestehen aus einem Signalpeptid mit einer hochgradig konservierten N-terminalen Region und einer stärker abweichenden C-terminalen Domäne. Es versteht sich, dass die biologisch aktiven Hedgehog-Peptide aus einem größeren Vorläuferprotein gebildet werden. Zusätzlich zur Abspaltung der Signalsequenz bei dem sekretorischen Weg durchlaufen die Hedgehog-Vorläuferproteine eine interne autoproteolytische Spaltung. Diese Selbstspaltung erzeugt ein N-terminales Peptid (etwa 19 kDa) und ein C-terminates Peptid (etwa 26–28 kDa). Es ist dieses N-terminale Peptid, das für die über kurze und lange Distanz reichenden Hedgehog-Signalaktivitäten bei Drosophila und Vertebraten notwendig ist. Das N-terminale Peptid bleibt eng mit der Oberfläche der Zellen verbunden, in denen es synthetisiert wurde, während das C-terminale Peptid frei diffundieren kann.
Signalweg
1 zeigt eine Darstellung eines Hedgehog-Signalwegs mit besonderem Bezug auf die Signalweitergabe bei Vertebraten.
Epithelzellen können den Homöodomänen-Transkriptionsfaktor engrailed(en) exprimieren und das Hedgehog-Protein, das aus veranschaulichenden Gründen in der Figur als Shh dargestellt ist, sekretieren. Wir haben beobachtet, dass En eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung des Überlebens von Lymphozyten im peripheren Immunsystem spielt.
In den Zielzellen wird das HH-Signal durch zwei Transmembranproteine vermittelt: Patched (Ptc), das strukturelle Ähnlichkeiten mit Kanal- und Transporterproteinen besitzt, und Smoothened (Smo), ein Sieben-Transmembran-Protein ähnlich den G-Protein-gekoppelten Rezeptoren und dem Wingless-Rezeptor Frizzeled (unten beschrieben). Smo ist ein konstitutiver Aktivator der HH-Zielgene. Seine Aktivität wird normalerweise von Ptc unterdrückt, und diese Repression wird durch die Bindung von HH an Ptc aufgehoben. Dementsprechend erlaubt die Bindung von HH an Ptc eine Signaltransduktion, die zur Aktivierung des Transkriptionsfaktors Gli führt, der sich im Kern der Zielzellen befindet.
Das Signal erreicht Gli durch den zytoplasmatischen Komplex, der gebildet wird zwischen (1) der Serin/Threonin-Kinase Fused (Fu), (2) Suppressor of Fused (SU(Fu)); und (3) Costal2 (Cos2). Das durch diesen Komplex vermittelte Signal kann durch die cAMP-abhängige Proteinkinase A (PKA) inhibiert werden (siehe 2).
Gli wirkt ein auf die Zielgene Wingless (Wnt) und die BMP/Aktivin-Wachstumsfaktoren. Sowohl Wnt als auch BMP werden in die Extrazellulärflüssigkeit sekretiert, um an ihre Rezeptoren zu binden. Dieser Prozess ist in 1 schematisch dargestellt.
Eine Zusammenfassung und ein Vergleich der Komponenten des Hedgehog-Signalwegs sind in der folgenden Tabelle 2 angegeben:
Tabelle 2
Die Nomenklatur kann hier in austauschbarer Weise verwendet werden.
Weitere Informationen über das durch Hedgehog vermittelte Signal sind in den folgenden Artikeln zu finden: Ingham; Chuang und McMahon; Pepicelli et al; und Hammerschmidt et al.
BMP-Signalweg
„Bone morphogenetic Proteins" (BMPs, Proteine der Knochenmorphogenese) sind multifunktionale Zytokine, die Mitglieder der Superfamilie des Transformierenden Wachstumsfaktors-β (TGF-β) darstellen. Sie regulieren die Zellproliferation, Zelldifferenzierung und die Apoptose verschiedener Zelltypen. Die Aktivitäten der BMPs werden extrazellulär durch die BMP-bindenden Proteine Noggin, Chordin, Gremlin, Cerberus und Xnr-3 reguliert. Es ist herausgefunden worden, dass die BMPs die Neurogenese in einem Frühstadium der Entwicklung blockieren, was jedoch durch lösliche Faktoren, z.B. Noggin und Chordin, aufgehoben werden kann, die extrazellulär sekretiert werden und an die BMPs binden und diese neutralisieren und sie somit davon abhalten, ihre Rezeptoren zu aktivieren. Zusätzlich kann das Signal durch BMP-Rezeptoren die Expression des Notch-Liganden Delta inhibieren, wofür wir vor kurzem eine wichtige Rolle bei der Regulierung peripherer Immunantworten gezeigt haben. Der Notch-Signalweg wird in unserer internationalen Patentveröffentlichung WO 98/20142 diskutiert.
BMPs binden an zwei verschiedene Typen von Serin-Threonin-Kinase-Rezeptoren, Typ I und Typ II. Im Fall der Typ I-Rezeptoren binden die BMPs an BMP Typ IA-Rezeptor, BMP Typ I-B-Rezeptor und Aktivin Typ I-Rezeptor. Im Fall der Typ II-Rezeptoren binden die BMPs an BMP Typ II-Rezeptor, Aktivin Typ-II-Rezeptor und Aktivin Typ IIB-Rezeptor. In den Rezeptor- Liganden-Komplexen phosphorylieren Typ II-Rezeptoren Typ I-Rezeptoren in der GS-Domäne (reich an Glycin-, Serin- und Threonin-Resten), um letztere zu aktivieren. Die aktivierten Typ I-Rezeptoren phosphorylieren die Smad-Familie, die die Signale vom Zytoplasma in die Kerne weiterleitet. Smad1, Smad5 und möglicherweise MADH6 werden durch BMP-Rezeptoren aktiviert, bilden heteromere Komplexe mit Smad4 und bewegen sich in den Kern, wo sie die Transkription verschiedener Gene aktivieren können. Smad6 und Smad7 sind inhibitorische Smads und können als autokrine Abschaltsignale fungieren. Das durch BMP induzierte Smad-Signal reguliert die Genexpression von achaete/scute herab, die für die Expression des Notch-Liganden Delta benötigt wird. Wie in Tabelle 2 oben angezeigt, ist Decapentaplegic (Dpp) in Drosophila ein Homologes von Säuger-BMPs.
Wingless/Wnt-Signalweg
Wir haben die Rolle der Fehlregulation des Wnt-Signalwegs bei interstitieller Lungenerkrankung untersucht. Die Wnt-Gene sind Ziele des HH-Signalwegs, und die Wnt-Proteine sind sekretierte Wachstumsfaktoren, die an der Regulation der Epithelzellproliferation und -Differenzierung in der Lunge während der Embryonalentwicklung beteiligt sind. Wir schlagen vor, dass das Wnt-Signal auch während Prozessen der Epithelzellreparatur in der Lunge heraufreguliert werden könnte.
Dishevelled-1 (Dvl-1) ist das murine Homolog des Fliegengens Dsh und hat die Funktion, Signale von dem Wnt-Rezeptor, Frizzled, an das Zytoplasma weiterzuleiten, wo es die Kinaseaktivität einer wohlbekannten Serin/Threonin-Kinase, GSK-3b, reguliert. Die Überexpression von Dsh im Fliegenepithel führt zur onkogenen Aktivierung des Epithels durch das zunehmende Wnt-Signal.
Eine Darstellung dieses Signalwegs ist in 3 gezeigt. Wingless (Wg) in Drosophila und sein Vertebraten-Homologes, die Wnt-Signalwege, regulieren die Zellproliferation. Wg und Wnt sind sekretierte Wachstumsfaktoren, die an der Auslösung zellulärer Entscheidungen beteiligt sind. Der Wg/Wnt-Ligand bindet an Rezeptormoleküle der Frizzled (Fz)-Familie, um eine Signaltransduktionskaskade auszulösen, an der das zytoplasmatische Protein Dishevelled (Dvl) beteiligt ist (Sussman DJ et al). Die GenBank-Zugangsnummer für die Dvl-1-cDNA ist U10115. Der in 3 dargestellte Komplex liegt im Zytoplasma der Zielzellen vor. Allgemein blockiert APC das Signal; in Gegenwart eines Signals von Wnt jedoch wird β-Catenin freigesetzt und interagiert mit zwei Transkriptionsfaktoren, Lef-1/TCF-1, was in Zielgenexpression resultiert. Die Zielgene von Wnt beinhalten En und damit indirekt HH, c-myc und Cyclin D1. Es wird erkennbar sein, dass das Notch-Signal ebenfalls durch den Wnt-Signalweg reguliert wird, da festgestellt wurde, dass Dvl das Notch-Signal inhibiert.
Inhibitoren
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Verbindungen, die das Hedgehog-Signal inhibieren oder blockieren (antagonisieren). Solche Verbindungen können so betrachtet werden, als hätten sie den Effekt, die Expression von Hedgehog herunterzuregulieren. Praktischer Weise werden derartige Verbindungen hier als Inhibitoren oder Antagonisten bezeichnet.
Die Erfindung richtet sich auch auf Mutationen, die in einem Verlust der normalen Funktion der Regulatoren des Hedgehog-Signalwegs oder von Regulatoren eines Signalwegs, der Ziel des Hedgehog-Signalwegs ist, resultieren, etwa bei menschlichen Krankheitszuständen, bei denen eine Infiltration durch Lymphozyten erfolgt oder ein Versagen eines Kontrollpunkts des Zellzyklus beteiligt ist. Eine Gentherapie zur Wiederherstellung solcher regulatorischer Aktivität wäre daher bei der Behandlung dieser Krankheitszustände angezeigt. Alternativ wird in Erwägung gezogen, dass die Verhinderung der Expression oder die Inhibition der Aktivität von derartigen Signalwegen bei der Behandlung solcher Krankheitszustände nützlich sein kann. Es versteht sich, dass Antisense-Therapie oder Gentherapie angewendet werden können, um solche Signalwege negativ zu regulieren.
Es sind Antagonisten für jede Komponente des Signalwegs identifiziert worden. Diese können wie folgt in Tabelle 3 zusammengefasst werden:
Tabelle 3
HIP (für Hedgehog-interagierendes Protein) ist ein Membran-Glykoprotein, das wenigstens an alle drei Säuger-Hedgehog-Proteine bindet, und zwar mit einer Affinität, die derjenigen von Ptc vergleichbar ist. HIP scheint das Hedgehog-Signal als Ergebnis der Bindung an Hedgehog-Proteine abzuschwächen. Eine solche negativ regulierende Rückkopplungsschleife könnte auch dazu dienen, die Antwort auf ein beliebiges Hedgehog-Signal zu modulieren. Die Genbank-Zugangsnummer für HIP ist AF116865.
Veratrum-Alkaloide und distale Inhibitoren der Cholesterin-Biosynthese sind seit mehr als 30 Jahren als starke Teratogene untersucht worden, die dazu in der Lage sind, Zyklopie und andere Geburtsdefekte zu induzieren. Es ist auch gezeigt worden, dass diese Verbindungen in spezifischer Weise den Shh-Signalweg blockieren (Cooper et an. Ein Beispiel für ein solches Veratrum-Alkaloid ist Cyclopamin (11-Deoxojervin), ein aus der Wüstenpflanze Veratrum californicum isoliertes Steroid (Coventry et al).
Frezzled ist ein sekretierter Antagonist des Wnt-Signals. Frezzled enthält eine Domäne, die der putativen Wnt-Bindungsregion der Frizzled-Familie von Transmembran-Rezeptoren ähnlich ist, jedoch fehlen ihm sämtliche der Transmembran-Domänen, was in einem putativ sekretierten, Wnt-bindenden Protein resultiert. Die GenBank-Zugangsnummern für die Frezzled-cDNA-Sequenzen aus Xenopus, Maus und Mensch sind U68059, U68058, bzw. U68057.
Cerberus ist ein sekretiertes Protein, und es ist herausgefunden worden, dass es ein Antagonist der Wnt- und BMP-Signalwege ist. Die GenBank-Zugangsnummer für Xenopus Cerberus-cDNA ist U64831.
WIF-1 (Wnt-inhibitorischer Faktor 1) ist ein sekretiertes Protein, das an Wnt-Proteine bindet und deren Aktivitäten inhibiert. Die GenBank-Zugangsnummern für WIF-1 sind: Mensch, AF122922; Maus, AF122923; Xenopus, AF122924; und Zebrafisch, AF122925.
Noggin und Chordin binden an BMPs und verhindern dadurch die Aktivierung von deren Signalkaskade.
Gremlin ist ein sekretiertes Protein, und es ist herausgefunden worden, dass es ein Antagonist der Wnt- und BMP-Signalwege ist. Die Genbank-Zugangsnummern für die Gremlin-cDNA sind: Xenopus, AF045798; Huhn, AF045799; Mensch AF045800; und Maus, AF045801.
Für Xnr-3 ist herausgefunden worden, dass es ein Antagonist der BMP-Signalwege ist.
Für Follistatin ist herausgefunden worden, dass es andere Aspekte der BMP-Aktivität inhibiert und dass es ebenso als ein Activin-bindendes Protein fungiert.
Es wird ebenso erkennbar sein, dass der Antagonist selbst ein Bestandteil des Hedgehog-Signalwegs sein kann. Beispiele für solche Antagonisten beinhalten die negativen Regulatoren des HH-Signals: Ptc, Cos2 und PKA.
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird von PKA Gebrauch gemacht. PKA ist in die Mechanismen der HH-Signaltransduktion einbezogen worden, da es die Wirkung hat, HH-Zielgene in Imaginalscheiben-Zellen, die Ci exprimieren, zu reprimieren. Die Wirkung von Ci als Transkriptions-Repressor oder -Aktivator hängt ab von der durch Hedgehog regulierten, PKA-abhängigen proteolytischen Prozessierung.
Zyklisches AMP (cAMP) ist ein Nukleotid, das in Reaktion auf die hormonelle Stimulation von Zelloberflächen-Rezeptoren aus ATP gebildet wird. cAMP fungiert als Signalmolekül, indem es Kinase A aktiviert; es wird durch Phosphodiesterase (PDE) zu AMP hydrolysiert. Die cAMP-Spiegel beeinflussen die Spaltung von Cubitus und die Spiegel von TGF-β. In spezifischer Weise fallen die TGF-β-Spiegel beim Anstieg der cAMP-Spiegel ab, und dies wird beispielsweise Fibrose beeinflussen. Bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird von cAMP-Modifikatoren Gebrauch gemacht. Solche Modifikatoren beinhalten PDE-Inhibitoren und beta-Agonisten, wie etwa beta-adrenerge Agonisten. Es ist beispielsweise herausgefunden worden, dass die Transkription von ptc 1 durch Mittel induziert werden kann, die den cAMP-Signaltransduktionsweg aktivieren.
Antisense-Nukleinsäuren (bevorzugt 10 bis 20 Basenpaar-Oligonukleotide), die dazu in der Lage sind, spezifisch an Expressionskontroll-Sequenzen oder an RNA zu binden, werden in die Zellen eingeführt (z.B. durch einen viralen Vektor oder ein kolloidales Dispersionssystem wie etwa ein Liposom). Die Antisense-Nukleinsäure bindet an die Zielsequenz in der Zelle und verhindert die Transkription oder die Translation der Zielsequenz. Phosphothioat- und Methylphosphat-Antisense-Oligonukleotide werden besonders für die therapeutische Verwendung der Erfindung in Betracht gezogen. Die Antisense-Oligonukleotide können weiterhin durch poly-L-Lysin, Transferrin-Polylysin oder Cholesterin-Reste an ihren 5'-Enden modifiziert werden.
Ebenfalls einbezogen in die vorliegende Erfindung sind Antikörper-Produkte (z.B. monoklonale und polyklonale Antikörper, einzelkettige Antikörper, chimäre Antikörper, „CDR-graftet" Antikörper und Antigen-bindende Fragmente hiervon) und andere Bindeproteine (wie etwa solche, die in den obigen Tests identifiziert werden). Bindeproteine können unter Verwendung von isolierten natürlichen oder rekombinanten Enzymen entwickelt werden. Die Bindeproteine sind wiederum nützlich, um rekombinante und natürlich vorkommende Enzyme zu reinigen und um Zellen zu identifizieren, die diese Enzyme produzieren. Tests für die Detektion und Quantifizierung von Proteinen in Zellen und in Fluiden können eine einzelne Antikörpersubstanz oder multiple Antikörpersubstanzen in einem „Sandwich"-Testformat beinhalten, um eine zytologische Analyse der HH-Proteinspiegel durchzuführen. Die Bindeproteine sind weiterhin von deutlichem Nutzen zum Modulieren (d.h. zum Blockieren, Inhibieren oder Stimulieren) von Interaktionen.
Antikörper können durch die Verabreichung von Polypeptiden oder Epitop-enthaltenden Fragmenten an ein Tier, für gewöhnlich ein Kaninchen, unter Verwendung von Routine-Protokollen erzeugt werden. Beispiele für solche Techniken beinhalten diejenigen von Köhler und Milstein.
Allgemeiner ausgedrückt, kann der Antagonist ausgewählt werden aus Polypeptiden und Fragmenten hiervon, linearen Peptiden, zyklischen Peptiden, synthetischen und natürlichen Verbindungen einschließlich niedermolekularer organischer oder anorganischer Verbindungen. Die Antagonisten können aus einem biologischen Material, wie etwa aus einer Komponente der extrazellulären Matrix, abgeleitet sein.
Polypeptidsubstanzen, wie etwa Noggin oder Chordin, können aus Säugerzellen gereinigt, durch rekombinante Expression in geeigneten Wirtszellen oder kommerziell erhalten werden. Alternativ können Nukleinsäurekonstrukte, die diese Polypeptide codieren, durch Transfektion unter Verwendung von Standard-Techniken oder durch virale Infektion/Transduktion eingeführt werden.
Inhibitoren zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung können praktischerweise unter Verwendung eines geeigneten Screening-Verfahrens identifiziert werden.
Ein Test zur Identifizierung solcher Inhibitoren kann die Immobilisierung einer Komponente des relevanten Signalwegs, z.B. von HH, oder einem Testprotein beinhalten, was den nicht immobilisierten Bindungspartner detektierbar markiert, sowie weiterhin die gemeinsame Inkubation der Bindungspartner und die Bestimmung der Menge der gebundenen Markierung. Die gebundene Markierung zeigt an, dass das Testprotein mit der Komponente interagiert.
Ein weiterer Testtyp zur Identifizierung von Inhibitoren beinhaltet die Immobilisierung einer Komponente des Signalwegs, z.B. von HH oder einem Fragment hiervon, an einem festen Träger, der mit einem Fluoreszenzmittel beschichtet (oder imprägniert) ist, die Markierung eines Testproteins mit einer Verbindung, die dazu befähigt ist, das Fluoreszenzmittel anzuregen, das In-Kontakt-Bringen der immobilisierten Komponente mit dem markierten Testprotein, die Detektion von Lichtemission durch das Fluoreszenzmittel und die Identifizierung von interagierenden Proteinen als Testproteinen, was zur Lichtemission durch das Fluoreszenzmittel führt. Alternativ kann das putative interagierende Protein immobilisiert und die Komponente in dem Test markiert werden.
Darüber hinaus können solche Assays zur Identifizierung von Inhibitoren beinhalten: die Transformation oder Transfektion geeigneter Wirtszellen mit einem DNA-Konstrukt umfassend ein Reporter-Gen unter der Kontrolle eines Promotors, der durch einen Transkriptionsfaktor mit einer DNA-bindenden Domäne und einer Aktivierungsdomäne reguliert wird; in den Wirtszellen erfolgende Expression einer ersten Hybrid-DNA-Sequenz, codierend eine erste Fusion eines Teils einer Komponente oder einer vollständigen Komponente des Signalwegs, z.B. HH, Wnt oder BMP, mit der DNA-bindenden Domäne oder der aktivierenden Domäne des Transkriptionsfaktors; in den Wirtszellen erfolgende Expression einer zweiten Hybrid-DNA-Sequenz, codierend einen Teil eines Proteins oder das gesamte Protein, das mit dieser Komponente interagiert in Kombination mit der DNA-bindenden Domäne oder der aktivierenden Domäne des Transkriptionsfaktors, die jeweils nicht in der ersten Fusion enthalten ist; Bewertung der Wirkung einer Testverbindung auf die Interaktion zwischen der Komponente und dem damit interagierenden Protein durch Detektion der Bindung des interagierenden Proteins mit der Komponente in einer bestimmten Wirtszelle durch Messung der Produktion des Reporter-Genprodukts in der Wirtszelle in Anwesenheit oder Abwesenheit der Testverbindung; und Identifizierung der modulierenden Verbindungen als denjenigen Testverbindungen, die die Produktion des Reporter-Genprodukts im Vergleich zu dessen Produktion in Abwesenheit der modulierenden Verbindung verändern. Derzeit bevorzugt zur Verwendung in dem Test sind der LexA-Promotor zum Antreiben der Expression des Reporter-Gens, das LacZ-Reporter-Gen, ein Transkriptionsfaktor, der die lexA-DNA-Bindungsdomäne und die GAL4-transaktivierende Domäne umfasst, sowie Hefe als Wirtszellen.
Bei einer bestimmten Ausführungsform, die im Hinblick auf das Hedgehog-Signal beschrieben ist, wird die geeignete Wirtszelle mit einem DNA-Konstrukt transformiert oder transfiziert, das ein Reporter-Gen unter der Kontrolle des Ptc-Promotors umfasst; dann erfolgt in diesen Zellen die Expression einer DNA-Sequenz, die Hedgehog codiert; weiterhin wird die Wirkung einer Testverbindung auf die Interaktion zwischen HH und dem Ptc-Promotor in einer bestimmten Wirtszelle durch Messung der Produktion des Reporter-Genprodukts in der Wirtszelle in Abwesenheit und Anwesenheit der Testverbindung bewertet; hierbei werden Inhibitoren als diejenigen Testverbindungen identifiziert, die die Produktion des Reporter-Genprodukts im Vergleich zu dessen Produktion in Abwesenheit der Testverbindung vermindern.
Kombinatorische Bibliotheken, Peptide und Peptid-Nachahmer, definierte chemische Einheiten, Oligonukleotide und Naturprodukt-Bibliotheken können bei solchen Tests auf ihre Aktivität als Inhibitoren durchgetestet werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung von Derivaten, Varianten, Fragmenten, Analogen, Homologen und Nachahmern dieser oben genannten Inhibitoren, einschließlich solcher, die unter Verwendung der Testverfahren identifizierbar sind.
Der Begriff „Derivat", wie er hier im Bezug auf die Polypeptide der vorliegenden Erfindung verwendet wird, beinhaltet jede beliebige Substitution, Variation, Modifikation, Austausch, Deletion hierbei, oder die Addition eines (oder mehrerer) Aminosäurereste von oder an die Sequenz, vorausgesetzt, dass das resultierende Protein, etc. die Fähigkeit besitzt, antagonistisch auf den Ablauf des Signalwegs einzuwirken.
Der Begriff „Variante", wie er hier im Bezug auf die Polypeptide der vorliegenden Erfindung verwendet wird, beinhaltet jede beliebige Substitution, Variation, Modifikation, Austausch, Deletion hierbei, oder die Addition eines (oder mehrerer) Aminosäurereste von oder an die Sequenz, vorausgesetzt, dass das resultierende Protein, etc. die Fähigkeit besitzt, antagonistisch auf den Ablauf des Signalwegs einzuwirken.
Der Begriff „Fragment", wie er hier im Bezug auf die Polypeptide der vorliegenden Erfindung verwendet wird, beinhaltet ein abweichendes Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz besitzt, die als Teil, jedoch nicht im Bezug auf die Gesamtheit der Aminosäuresequenz dem vorstehend genannten Polypeptid vollständig entspricht und das die Fähigkeit besitzt, antagonistisch auf den Ablauf des Signalweges einzuwirken.
Der Begriff „Analoges", wie er hier im Bezug auf die Polypeptide der vorliegenden Erfindung verwendet wird, beinhaltet jedweden peptidischen Nachahmer, d.h. eine chemische Verbindung, die die Fähigkeit besitzt, dem Ablauf des Signalwegs in einer ähnlichen Weise wie das Stammpolypeptid entgegenzuwirken.
Der Begriff „Homologes", wie er hier im Bezug auf die Polypeptide der vorliegenden Erfindung verwendet wird, beinhaltet ein Polypeptid, das den gleichen evolutionären Ursprung besitzt wie das zugrunde liegende Polypeptid, vorausgesetzt, dass es die Fähigkeit besitzt, dem Ablauf des Signalwegs entgegenzuwirken.
Der Begriff „Nachahmer", wie er hier im Bezug auf die Inhibitoren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, beinhaltet eine Verbindung, die ebenfalls die Fähigkeit besitzt, dem Ablauf des Signalwegs in einer ähnlichen Weise wie die Stammverbindung entgegenzuwirken.
Spezifischer ausgedrückt, deckt der Begriff „Homologes" Identität im Bezug auf Struktur und/oder Funktion ab, unter der Voraussetzung, dass das Expressionsprodukt der resultierenden Nukleotidsequenz die inhibitorische Aktivität besitzt. Im Hinblick auf Sequenzidentität (d.h. Ähnlichkeit) liegt vorzugsweise eine Sequenzidentität von wenigstens 75%, bevorzugter von wenigstens 85%, noch bevorzugter von wenigstens 90% vor. Wiederum bevorzugter ist die Sequenzidentität wenigstens 95%, noch bevorzugter wenigstens 98%. Diese Begriffe umfassen auch allelische Variationen der Sequenzen.
Die Sequenzidentität im Hinblick auf die Sequenzen kann durch einen einfachen „Augapfel"-Vergleich (d.h. einen strengen Vergleich) von einer beliebigen oder von mehreren der Sequenzen mit einer anderen Sequenz bestimmt werden, um zu sehen, ob diese andere Sequenz eine z.B. wenigstens 75% Sequenzidentität mit der/den Sequenzen) aufweist.
Die relative Sequenzidentität kann auch über kommerziell erhältliche Computerprogramme bestimmt werden, die die prozentuale Identität zwischen zwei oder mehr Sequenzen unter Verwendung eines beliebigen geeigneten Algorithmus zur Identitätsbestimmung, z.B. unter Verwendung von voreingestellten Parametern (Default-Parametern), berechnen können. Ein typisches Beispiel für ein solches Computer-Programm ist CLUSTAL. Vorteilhafter Weise wird der BLAST-Algorithmus verwendet, wobei die Parameter auf Default-Werte gesetzt sind. Der BLAST-Algorithmus wird detailliert unter http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast_help.html beschrieben, was hier durch Referenz in Bezug genommen wird. Die wie folgt definierten Suchparameter können in vorteilhafter Weise auf die definierten Default-Parameter eingestellt werden.
Vorteilhafter Weise bezieht sich „weitgehende Identität" bei der Bestimmung über BLAST auf Sequenzen, die mit einem Erwartungswert (EXPECT value) von wenigstens etwa 7 übereinstimmen, bevorzugt von wenigstens etwa 9 und am bevorzugtesten von 10 oder mehr.
Der voreingestellte Schwellenwert für den EXPECT-Wert bei der BLAST-Suche ist üblicher Weise 10.
BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) ist der heuristische Such-Algorithmus, der von den Programmen blastp, blastn, blastx, tblastn und tblastx verwendet wird; diese Programme schreiben ihren Ergebnissen Signifikanz zu, wobei sie die statistischen Verfahren von Karlin und Altschul (siehe http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast_help.html) mit einigen wenigen Verbesserungen verwenden. Die BLAST-Programme wurden für die Suche nach Sequenzähnlichkeit entworfen, z.B. um Homologe zu einer Such-Sequenz zu identifizieren. Für eine Diskussion der Grundlagen der Ähnlichkeitssuche bei Sequenz-Datenbanken wird auf Altschul et al (1994) Nature Genetics 6:119–129 verwiesen.
Die fünf unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov verfügbaren BLAST-Programme führen die folgenden Aufgaben durch:

blastp – vergleicht eine Aminosäure-Suchsequenz mit einer Proteinsequenz-Datenbank.
blastn – vergleicht eine Nukleotid-Suchsequenz mit einer Nukleotidsequenz-Datenbank.
blastx – vergleicht die exakten Translationsprodukte einer Nukleotid-Suchsequenz (beide Stränge) in den sechs Leserastern mit einer Proteinsequenz-Datenbank.
tblastn – vergleicht eine Protein-Suchsequenz mit einer Nukleotidsequenz-Datenbank, die dynamisch in alle sechs Leseraster (beide Stränge) translatiert wird.
tblastx – vergleicht die in den sechs Leserastern durchgeführten Translationen einer Nukleotid-Suchsequenz mit den in den sechs Leserastern durchgeführten Translationen einer Nukleotidsequenz-Datenbank.

BLAST verwendet die folgenden Suchparameter:
HISTOGRAM – zeigt ein Histogramm der Treffer für jede Suche an; Voreinstellung ist „ja" (siehe Parameter H im BLAST Handbuch).
DESCRIPTIONS – Begrenzt die Anzahl der Kurzbeschreibungen angezeigter passender Sequenzen auf die eingestellte Zahl; voreingestellter Grenzwert ist 100 Beschreibungen (siehe Parameter V auf der Handbuchseite).
EXPECT – Schwellenwert der statistischen Signifikanz für die Anzeige von Treffern im Bezug auf Datenbanksequenzen; der voreingestellte Wert ist 10, d.h. man erwartet, dass sich gemäß dem stochastischen Modell von Karlin und Altschul (1990) 10 Treffer alleine durch Zufall ergeben. Wenn die statistische Signifikanz, die einem Treffer zugeschrieben wird, größer als der EXPECT-Schwellenwert ist, so wird der Treffer nicht angezeigt. Niedrigere EXPECT-Schwellenwerte sind stringenter, d.h. führen zu einer geringeren Aussicht auf angezeigte Treffer. Bruchwerte werden akzeptiert (siehe Parameter E im BLAST-Handbuch).
CUTOFF – Ausschlusswert für die Anzeige hohe Trefferzahlen aufweisender Segment-Paare („high-scoring segment pairs", HSPs). Der voreingestellte Wert wird ausgehend von dem EXPECT-Wert (siehe oben) berechnet. Für eine Datenbanksequenz werden HSPs nur dann angezeigt, wenn die ihnen zugeordnete statistische Signifikanz wenigstens ebenso groß ist, wie die Signifikanz, die einem einzelnen HSP zugeordnet würde, das eine Trefferrate gleichwertig dem CUTOFF-Wert besitzt. Höhere CUTOFF-Werte sind stringenter, d.h. führen zu einer geringeren Chance, dass Treffer angezeigt werden (siehe Parameter S im BLAST-Handbuch). Typischer Weise können Signifikanz-Ausschlusswerte im Bezug auf die Verwendung von EXPECT intuitiver gehandhabt werden.
ALIGNMENTS – Begrenzt die Datenbanksequenzen hinsichtlich der festgelegten Zahl, für die die hochgradig übereinstimmenden Segmentpaare (HSPs) angezeigt werden sollen; die voreingestellte Begrenzung ist 50. Wenn mehr Datenbanksequenzen dem statistischen Signifikanz-Schwellenwert zur Anzeige (siehe EXPECT und CUTOFF) entsprechen, werden nur die Treffer angezeigt, denen die größte statistische Signifikanz zugeschrieben wird (siehe Parameter B im BLAST-Handbuch).
MATRIX – Spezifiziert eine alternative Rechenmatrix für BLASTP, BLASTX, TBLASTN und TBLASTX. Die voreingestellte Matrix ist BLOSUM62 (Henikoff & Henikoff, 1992). Die gültigen alternativen Auswahlmöglichkeiten beinhalten: PAM40, PAM120, PAM250 und IDENTITY. Für BLASTN sind keine alternativen Rechenmatrizes verfügbar; eine Spezifizierung der MATRIX-Vorgabe in BLASTN-Abfragen ergibt eine Fehlermeldung.
STRAND – Beschränkt eine TBLASTN-Suche auf nur den oberen oder unteren Strang der Datenbanksequenzen; oder beschränkt eine BLASTN-, BLASTX- oder TBLASTX-Suche alleine auf Leseraster im oberen oder unteren Strang der Suchsequenz.
FILTER – Zeigt Segmente der Suchsequenz auf, die eine geringe Komplexität der Zusammensetzung besitzen, wie es durch das Programm SEG von Wootton & Federhen (1993) Computers and Chemistry 17: 149–163 festgelegt ist, oder Segmente, die aus in kurzer Periodizität folgenden internen Wiederholungssequenzen bestehen, wie dies durch das Programm XNU von Claverie & States (1993) Computers and Chemistry 17: 191–201 festgelegt ist, oder bei BLASTN, durch das Programm DUST von Tatusov und Lipman (siehe http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Das Filtern kann statistisch signifikante, aber biologisch uninteressante Angaben aus dem BLAST-Bericht entfernen (z.B. Treffer für häufig vorkommende saure, basische oder Prolin-reiche Regionen) und damit eine Beschränkung auf die biologisch interessanteren Regionen der Suchsequenz für die spezifische Paarung mit Datenbanksequenzen vornehmen.
Von einem Filterprogramm gefundene niedrigkomplexe Sequenzen werden in der Nukleotidsequenz unter Verwendung des Buchstaben „N" (z.B. „NNNNNNNNNNNNN") und in Proteinsequenzen unter Verwendung des Buchstaben „X" (z.B. „XXXXXXXXX") ersetzt.
Die Filterung wird nur auf die Suchsequenz (oder deren Translationsprodukte) angewendet, nicht jedoch auf Datenbank-Sequenzen. Die voreingestellte Filterung ist DUST bei BLASTN und SEG bei anderen Programmen.
Es ist keineswegs ungewöhnlich, dass eine Maskierung durch SEG, XNU oder beide erfolgt, wenn dies auf Sequenzen aus SWISS-PROT angewendet wird; es sollte daher nicht erwartet werden, dass das Filtern stets eine Wirkung zeigt. Weiterhin können in einigen Fällen Sequenzen in ihrer Gesamtheit maskiert werden, was anzeigt, dass die statistische Signifikanz jedes angezeigten Treffers gegen die nicht mit einem Filter belegte Suchsequenz mit Vorsicht zu genießen ist.
NCBI-gi – Bewirkt die Anzeige von NCBI gi-Identifikatoren in der Ausgabe, zusätzlich zu der Zugangsnummer und/oder dem Namen des Lokus.
Am bevorzugtesten werden Sequenzvergleiche unter Verwendung des einfachen BLAST-Suchalgorithmus durchgeführt, der unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST zur Verfügung steht.
Andere Computerprogramm-Verfahren zur Bestimmung der Identität und der Ähnlichkeit zwischen den beiden Sequenzen beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, das GCG-Programmpaket (Devereux et al 1984 Nucleic Acids Research 12: 387) sowie FASTA (Atschul et al 1990 J Molec Biol 403–410).
Bei einigen Aspekten der vorliegenden Erfindung werden keine Lückeneinschränkungen verwendet, wenn die Sequenzidentität bestimmt wird.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung von Nukleotidsequenzen, die komplementär zu den hier gezeigten Sequenzen sind, oder die Verwendung eines beliebigen Fragments oder Derivats davon. Wenn die Sequenz komplementär zu einem Fragment hiervon ist, dann kann diese Sequenz als Sonde verwendet werden, um entsprechende Promotorsequenzen in anderen Organismen zu identifizieren.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung von Nukleotidsequenzen, die dazu befähigt sind, mit den hier dargestellten Sequenzen zu hybridisieren oder die Verwendung eines beliebigen Fragments oder Derivats hiervon.
Hybridisierung bedeutet einen „Prozess, durch den ein Strang einer Nukleinsäure sich mittels Basenpaarung mit einem komplementären Strang verbindet" (Coombs J (1994) Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, New York NY) und bezieht sich ebenso auf den Prozess der Vervielfältigung, wie er in Techniken der Polymerasekettenreaktion gemäß Beschreibung in Dieffenbach CW und GS Dveksler (1995, PCR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY) durchgeführt wird.
Ebenfalls eingeschlossen in den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von Nukleotidsequenzen, die dazu in der Lage sind, mit den hier dargestellten Nukleotidsequenzen unter Bedingungen mittlerer bis maximaler Stringenz zu hybridisieren. Die Hybridisierungsbedingungen basieren auf der Schmelztemperatur (Tm) des Nukleinsäurebindungskomplexes, wie dies von Berger und Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Band 152, Academic Press, San Diego, CA) beschrieben ist und vermitteln eine definierte „Stringenz" gemäß folgender Beschreibung.
Die maximale Stringenz ergibt sich typischerweise bei etwa Tm-5°C (5°C unter der Tm der Sonde); hohe Stringenz bei etwa 5°C bis 10°C unterhalb von Tm; mittlere Stringenz bei etwa 10°C bis 20°C unterhalb von Tm; und niedrige Stringenz bei etwa 20° bis 25°C unterhalb von Tm. Wie Fachleuten ersichtlich sein wird, kann eine Hybridisierung bei maximaler Stringenz dazu verwendet werden, um identische Nukleotidsequenzen zu identifizieren oder zu detektieren, während eine Hybridisierung bei mittlerer (oder niedriger) Stringenz dazu verwendet werden kann, um ähnliche oder verwandte Nukleotidsequenzen zu identifizieren oder zu detektieren.
Bei einem bevorzugten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Nukleotidsequenzen, die mit den Nukleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung unter stringenten Bedingungen hybridisieren können (z.B. bei 65°C und 0,1 × SSC).
Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung von Nukleotidsequenzen, die dazu befähigt sind, mit Sequenzen zu hybridisieren, die komplementär zu den hier dargestellten Sequenzen sind, oder die Verwendung eines beliebigen Fragments oder Derivats hiervon. Entsprechend umfasst die vorliegende Erfindung die Verwendung von Nukleotidsequenzen, die komplementär zu Sequenzen sind, die dazu in der Lage sind, mit den Sequenzen der vorliegenden Erfindung zu hybridisieren. Diese Typen von Nukleotidsequenzen sind Beispiele für Nukleotidsequenz-Varianten.
In diesem Zusammenhang schließt der Begriff „Variante" Sequenzen ein, die komplementär zu Sequenzen sind, die dazu befähigt sind, mit den hier dargestellten Nukleotidsequenzen zu hybridisieren. Bevorzugt jedoch schließt der Begriff „Variante" Sequenzen ein, die komplementär zu Sequenzen sind, die dazu in der Lage sind, unter stringenten Bedingungen (z.B. 65°C und 0,1 × SSC (1 × SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Na₃-Citrat pH 7,0)) mit den hier dargestellten Nukleotidsequenzen zu hybridisieren.
Transgene Tiere
Transgene Tiere, die dazu in der Lage sind, wenigstens einen Antagonisten, der für die vorliegende Erfindung nutzbar ist, zu exprimieren oder überzuexprimieren, sind beschrieben. Vorzugsweise exprimiert oder überexprimiert das Tier HIP, Frezzled-1, Noggin (Ngg) und/oder WIF-1.
Die transgenen Tiere können dazu in der Lage sein, wenigstens ein Polypeptid zu exprimieren oder überzuexprimieren, das eine Komponente des Hedgehog-Signalwegs ist oder eine Komponente eines Signalwegs darstellt, der, wie etwa der Wnt- oder BMP-Signalweg, ein Ziel des Hedgehog-Signalwegs ist. Vorzugsweise exprimiert oder überexprimiert das Tier HH (bevorzugter Shh) und/oder Dvl-1.
Das transgene Tier ist typischerweise ein Vertebrat, bevorzugter ein Nagetier, wie etwa eine Ratte oder eine Maus, schließt jedoch auch andere Säuger, wie etwa Mensch, Ziege, Schwein, Rind, etc., ein.
Derartige transgene Tiere sind nützlich als Tiermodelle der Erkrankung und in Screening-Tests auf neue nützliche Verbindungen. Durch spezifische Expression eines oder mehrerer Polypeptide gemäß obiger Definition kann die Wirkung solcher Polypeptide auf die Krankheitsentwicklung untersucht werden. Weiterhin können Therapien, einschließlich Gentherapie und verschiedener Wirkstoffe, bei transgenen Tieren getestet werden. Verfahren für die Herstellung transgener Tiere sind in der Technik bekannt. So gibt es beispielsweise mehrere mögliche Wege für die Einführung von Genen in Embryonen. Diese beinhalten (i) die direkte Transfektion oder retrovirale Infektion embryonaler Stammzellen, gefolgt von der Einführung dieser Zellen in einen Embryo im Entwicklungsstadium der Blastozyste; (ii) die retrovirale Infektion früher Embryonen; und (iii) die direkte Mikroinjektion von DNA in Zygoten oder in frühe Embryonalzellen.
Stabile Zelllinien, die als Krankheitsmodelle für Testungen und Behandlung nützlich sind, werden ebenfalls beschrieben. Eine stabile Zelllinie wird ein rekombinantes Gen oder Gene, hier auch als Transgene bezeichnet, enthalten, die einen oder mehrere Inhibitoren oder Bestandteile eines Hedgehog-Signalwegs codieren.
Vorzugsweise ist das Transgen HH (bevorzugter Shh), HIP, WIF-1, Fzb-1, Ngg und/oder Dvl-1. Eine Zelllinie, die ein Transgen, wie hier beschrieben, enthält, wird durch Einführen des Transgens in eine ausgewählte Zelllinie gemäß einer oder mehrerer der Prozeduren, die in der Technik der Einführung von Fremdgenen in eine Zelle bekannt sind, hergestellt.
Wie ebenfalls im Folgenden beschrieben, sind die Sequenzen, die die Inhibitoren und Komponenten der Signalwege codieren, wie beschrieben, operativ mit Kontrollsequenzen, einschließlich Promotoren/Enhancern und anderen Expressionsregulationssignalen verbunden.
Der Promotor wird typischerweise ausgewählt aus Promotoren, die in Säugerzellen funktionell sind, obwohl auch prokaryotische Promotoren und Promotoren, die in anderen eukaryotischen Zellen funktionell sind, verwendet werden können. Der Promotor wird typischerweise von Promotorsequenzen viraler oder eukaryotischer Gene abgeleitet. Beispielsweise kann es ein Promotor sein, der aus dem Genom einer Zelle stammt, in der die Expression stattfinden soll. Im Hinblick auf eukaryotische Promotoren können dies Promotoren sein, die in ubiquitärer Weise funktionieren (wie etwa Promotoren von a-Actin, b-Actin, Tubulin) oder, alternativ, in gewebespezifischer Weise aktiv sind (wie etwa die Promotoren der Gene für Pyruvat-Kinase). Gewebespezifische Promotoren, die spezifisch für Lymphozyten, dendritische Zellen, Hautzellen, Gehirnzellen, Epithelzellen bzw. Zellen des Auges sind, sind besonders bevorzugt, z.B. die Promotoren von CD2, CD11c, Keratin 14, Wnt-1 und Rhodopsin.
Vorzugsweise wird der Epithelzell-Promotor SPC verwendet. Es können weiterhin Promotoren sein, die auf spezifische Stimuli reagieren, z.B. Promotoren, die Steroidhormon-Rezeptoren binden. Es können auch virale Promotoren verwendet werden, z.B. der Promotor aus der langen terminalen Sequenzwiederholung des murinen Moloney-Leukämievirus (Moloney murine leukaemia virus long terminal repeat (MMLV LTR)-Promotor), der Rous Sarkomavirus (RSV) LTR-Promotor oder der humane Cytomegalievirus (CMV) IE-Promotor.
Es kann auch vorteilhaft sein, wenn die Promotoren induzierbar sind, so dass die Expressionsstärken des heterologen Gens während der Lebensdauer der Zelle reguliert werden können. Induzierbar bedeutet, dass die Expressionsniveaus, die unter Verwendung des Promotors erhalten werden, reguliert werden können.
Zusätzlich können sämtliche dieser Promotoren durch die Hinzufügung weiterer regulatorischer Sequenzen, z.B. Enhancer-Sequenzen, modifiziert werden. Es können auch chimäre Promotoren verwendet werden, die Sequenzelemente von zwei oder mehr der oben beschriebenen, verschiedenen Promotoren enthalten können.
Therapeutische Anwendungen
Wie vorstehend angemerkt, kann eine Entzündung bei vielen Geweben, so etwa bei Lunge und Niere, zu chronischen Erkrankungen führen. Beispielsweise beinhaltet die chronische Lungenerkrankung die Gewebeumbildung in Gegenwart entzündlicher Zellen, wofür Emphysem und interstitielle Lungenerkrankung (ILD) Beispiele sind. Das erkrankte Gewebe geht mit einer Epithelzellhyperplasie einher, die zu Fibrose und Vernarbung führt. Es erfolgt eine begleitende Infiltration durch einkernige Zellen an lokalen Stellen der Entzündung und die Induktion von Immunantworten, die sich gegen Selbst-Antigene richten. Eine ähnliche Pathologie wird auch bei der chronischen Abstoßung von transplantiertem Gewebe, einschließlich transplantierter Organe, beobachtet.
Hedgehog ist wichtig bei der Regulierung von Wachstum und Differenzierung epithelialer Zellen. Es besitzt eine Rolle bei der Bildung des Notochords, der Gliedmaßen, des Darmes, der Lunge, Haut, usw. Die Abzweigung bei der Morphogenese erfolgt durch die Induktion von Wnt- und BMP-Wachstumsfaktoren. Hedgehog bindet an seinen Rezeptor Ptc und an Smo. Mutationen können beim Menschen zur autosomalen Erkrankung des Nevoid Basalzellenkarzinom-Syndroms (NBCCS) führen, das durch Abnormitäten der Entwicklung und eine starke Prädisposition für verschiedene Krebsarten, insbesondere den sehr häufigen Basalzellkarzinomen (BCC), gekennzeichnet ist.
BMPs sind Mitglieder der TGF-β-Superfamilie. Während TGF-β-1 eine wohletablierte Rolle bei der Vermittlung der Lungenfibrose hat, ist BMP-4 bislang nur eine Beteilung an fibrotischer Knochenerkrankung zugeschrieben worden.
Wir stellen nun ein Medikament zur Behandlung von Epithelzellhyperplasie und Fibrose, insbesondere in der Lunge und der Niere, bereit. Genauer dargestellt, beinhalten Erkrankungen, die behandelt werden können, Schocklunge; chronische obstruktive Atemwegsstörungen/chronische obstruktive Lungenerkrankungen, einschließlich Asthma, Emphysem und chronischer Bronchitis; Atelektase; berufsbedingte Lungenerkrankungen, einschließlich Silikose; Überempfindlichkeitserkrankungen der Lunge, einschließlich Überempfindlichkeitslungenentzündung; idiopathische interstitielle Lungenerkrankungen, einschließlich idiopathischer pulmonaler Fibrose, herkömmlicher interstitieller Lungenentzündung, desquamativer interstitieller Lungenentzündung und akuter interstitieller Lungenentzündung; und pleurale Fibrose. Weitere Details über diese und die unten genannten Krankheitszustände sind im Merck Manual (17. Auflage), herausgegeben von den Merck Research Laboratories, N.J., USA, zu finden.
Die vorliegende Erfindung ist auch nützlich zur Behandlung von Immunstörungen wie etwa Autoimmunerkrankungen oder Transplantatabstoßung, wie etwa Allotransplantatabstoßung.
Die Beispiele für Erkrankungen, die behandelt werden können, beinhalten eine Gruppe, die üblicherweise als Autoimmunerkrankungen bezeichnet werden. Das Spektrum der Autoimmunerkrankungen reicht von organspezifischen Erkrankungen (wie etwa Thyroiditis, Insulitis, Multipler Sklerose, Iridocyclitis, Uveitis, Orchitis, Hepatitis, Addison-Krankheit, Myasthenia gravis) bis zu systemischen Erkrankungen, wie etwa rheumatoider Arthritis oder Lupus erythematodes. Andere Erkrankungen beinhalten Immunhyperreaktivität, wie etwa allergische Reaktionen.
Detaillierter beinhalten organspezifische Autoimmunerkrankungen Multiple Sklerose, Insulin-abhängigen Diabetes mellitus, verschiedene Formen von Anämie (aplastisch, hämolytisch), Autoimmun-Hepatitis, Thyroiditis, Insulitis, Iridocyclitis, Skleritis, Uveitis, Orchitis, Myasthenia gravis, idiopathische, thrombozytopenische Purpura, entzündliche Darmerkrankungen (Crohn'sche Erkrankung, Colitis ulcerosa).
Systemische Autoimmunerkrankungen beinhalten: Rheumatoide Arthritis, juvenile Arthritis, Skleroderma und systemische Sklerose, Sjögren-Syndrom, undifferenzierte Bindegewebskrankheit, Antiphospholipid-Syndrom, verschiedene Formen der Vaskulitis (Polyarteritis nodosa, allergische Granulomatose und Gefäßentzündung, Wegner'sche Granulomatose, Kawasaki-Krankheit, Überempfindlichkeitsvaskulitis, Henoch-Schoenlein-Purpura, Behcet'sche Krankheit, Takayasu-Arteritis, Riesenzellenarteritis, Thrombangiitis obliterans), Lupus erythematodes, rheumatische Polymyalgie, essentielle (gemischte) Cryoglobulinämie, Psoriasis vulgaris und psoriatische Arthritis, diffuse Fasziitis mit oder ohne Eosinophilie, Polymyositis und andere idiopathische entzündliche Myopathien, wiederkehrende Panniculitis, wiederkehrende Polychondritis, lymphomatoide Granulomatose, Erythema nodosum, Spondylitis ankylopoetica, Reiter-Syndrom, verschiedene Formen entzündlicher Dermatitis.
Eine umfangreichere Liste der Erkrankungen beinhaltet: unerwünschte Immunreaktionen und Entzündung, einschließlich Arthritis und rheumatoider Arthritis, mit Überempfindlichkeit assoziierte Entzündung, allergische Reaktionen, Asthma, systemischer Lupus erythematodes, Kollagenerkrankungen und andere Autoimmunerkrankungen, mit Arteriosklerose assoziierte Entzündung, Arteriosklerose, arteriosklerotische Herzerkrankung, Reperfusionsverletzung, Herzstillstand, Myocardinfarkt, entzündliche Gefäßerkrankungen, Atemnotsyndrom oder andere cardiopulmonale Erkrankungen, mit peptischem Geschwür assoziierte Entzündung, Colitis ulcerosa und andere Erkrankungen des Gastrointestinaltrakts, Leberfibrose, Leberzirrhose und andere Lebererkrankungen, Thyroiditis oder andere Drüsenerkrankungen, Glomerulonephritis oder andere renale und urologische Erkrankungen, Otitis oder andere Halsnasenohren-Erkrankungen, Dermatitis oder andere dermale Erkrankungen, periodontale Erkrankungen oder andere Zahnerkrankungen, Orchitis oder Epididymoorchitis, Infertilität, Hodentrauma oder andere Hodenerkrankungen mit Immunaspekten, Plazentafehlfunktion, Plazentainsuffizienz, habituelle Fehlgeburt, Eklampsie, Prä-Eklampsie und andere Immun- und/oder Entzündungsbezogene gynäkologische Erkrankungen, posteriore Uveitis, intermediäre Uveitis, anteriore Uveitis, Konjunktivitis, Chorioretinitis, Uveoretinitis, optische Neuritis, intraokulare Entzündung, z.B. Retinitis oder zystoides Maculaödem, sympathische Ophthalmie, Skleritis, Retinitis pigmentosa, Immun- und Entzündungskomponenten der degenerativen Erkrankung des Augenhintergrunds, Entzündungskomponenten bei Augenverletzung, infektionsbedingte Augenentzündung, proliferative Vitreoretinopathien, akute ischämische optische Neuropathie, exzessive Vernarbung, z.B. nach operativer Glaukomfiltration, Immun- und/oder Entzündungsreaktionen gegen Augenimplantate und andere Immun- und/oder Entzündungsbezogene Augenerkrankungen, mit Autoimmunerkrankungen oder Autoimmunzuständen assoziierte Entzündung, Erkrankungen sowohl des Zentralnervensystems (ZNS) als auch beliebiger anderer Organe, bei denen eine Unterdrückung von Immun- und/oder Entzündungsprozessen sinnvoll wäre, Parkinson-Erkrankung, Komplikationen und/oder Nebenwirkungen bei der Behandlung der Parkinson-Erkrankung, mit AIDS in Zusammenhang stehender Demenz-Komplex, HIV-bedingte Enzephalopathie, Devic-Syndrom, Sydenham-Chorea, Alzheimer-Erkrankung und andere degenerative Erkrankungen, Zustände oder Erkrankungen des ZNS, Entzündungskomponenten bei Schlaganfall, Post-Polio-Syndrom, Immun- und Entzündungskomponenten psychiatrischer Erkrankungen, Myelitis, Enzephalitis, subakute sklerosierende Panenzephalitis, Enzephalomyelitis, akute Neuropathie, subakute Neuropathie, chronische Neuropathie, Guillaim-Barre-Syndrom, Sydenham-Chorea, Myasthenia gravis, Pseudotumor cerebri, Down-Syndrom, Huntington-Krankheit, amyotrophe Lateralsklerose, Entzündungskomponenten bei ZNS-Quetschung oder ZNS-Verletzung oder bei Infektionen des ZNS, Entzündungskomponenten bei Muskelatrophien und -Dystrophien, und Immun- und Entzündungs-bezogene Erkrankungen, Zustände oder Störungen des zentralen und peripheren Nervensystems, post-traumatische Entzündung, septischer Schock, infektiöse Erkrankungen, Entzündungskomplikationen oder Nebenwirkungen bei Chirurgie und Organbehandlungen, Entzündungs- und/oder Immunkomplikationen und Nebenwirkungen der Gentherapie, z.B. infolge der Infektion durch einen viralen Träger, oder mit AIDS assoziierte Entzündung. Weitere Zielsetzungen sind z.B. die Unterdrückung oder Inhibition einer humoralen und/oder zellulären Immunantwort, die Behandlung oder Milderung proliferativer Monozyten- oder Leukozyten-Erkrankungen, z.B. von Leukämie, durch die Verminderung der Menge an Monozyten oder Lymphozyten, die Verhinderung und/oder Behandlung der Transplantatabstoßung bei der Transplantation natürlicher oder künstlicher Zellen, Gewebe und Organe, wie etwa Hornhaut, Knochenmark, Organe, Linsen, Schrittmachern, natürlicher oder künstlicher Hautgewebe.
Wir haben nun herausgefunden, dass die Verwendung von Antagonisten des Hedgehog-Signals die oben genannten Erkrankungen verhindern und/oder deren Rückgang befördern kann.
Vektoren, Wirtszellen, Expression
Vektoren, die ein Polynukleotid beinhalten, das für die vorliegende Erfindung nützlich ist, werden ebenso beschrieben wie Wirtszellen, die genetisch mittels solcher Vektoren erzeugt werden, sowie die Produktion von für die vorliegende Erfindung nutzbaren Polypeptiden durch solche Techniken.
Für die rekombinante Produktion können Wirtszellen genetisch hergestellt werden, um Expressionssysteme oder Polynukleotide der Erfindung aufzunehmen. Die Einführung eines Polynukleotids in die Wirtszelle kann durch Verfahren durchgeführt werden, die in zahlreichen Labor-Standardhandbüchern, so etwa in Davis et al. und in Sambrook et al., beschrieben sind; derartige Verfahren sind z.B. die Calciumphosphat-Transfektion, die DEAE-Dextran vermittelte Transfektion, Transvektion, Mikroinjektion, durch kationische Lipide vermittelte Transfektion, Elektroporation, Transduktion, Transfektion durch mechanische Verletzung („scrape loading"), ballistische Einführung und Infektion.
Repräsentative Beispiele für geeignete Wirte beinhalten Bakterienzellen, wie etwa Streptokokken, Staphylokokken, E. coli, Streptomyces- und Bacillus subtilis -Zellen; Pilzzellen, wie etwa Hefezellen und Aspergillus-Zellen; Insektenzellen, wie etwa Drosophila S2- und Spodoptera Sf9-Zellen; tierische Zellen, wie etwa CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, 293 und Bowes-Melanomzellen; und Pflanzenzellen.
Es kann eine große Vielzahl von Expressionssystemen verwendet werden, um ein für die vorliegende Erfindung nutzbares Polypeptid zu produzieren. Derartige Vektoren beinhalten u.a. chromosomale, episomale und von Viren abgeleitete Vektoren, so z.B. Vektoren, die von bakteriellen Plasmiden, Bakteriophagen, Transposonen, Hefe-Episomen, Insertionselementen, chromosomalen Hefeelementen, Viren, wie etwa Baculoviren, Papovaviren, so etwa von SV40, Vacciniaviren, Adenoviren, Geflügelpockenviren, Pseudorabiesviren und Retroviren abgeleitet sind und Vektoren, die aus Kombinationen hiervon erhalten werden, wie etwa solchen, die aus genetischen Elementen von Plasmiden und Bakteriophagen erzeugt werden, wie etwa Cosmide und Phagemide. Die Expressionssystem-Konstrukte können Kontrollregionen beinhalten, die die Expression bewirken und ebenso regulieren. Allgemein kann jedes beliebige System oder jeder Vektor, der geeignet ist, Polynukleotide aufrechtzuerhalten, weiterzugeben oder zu exprimieren und/oder ein Polypeptid in einem Wirt zu exprimieren, für eine diesbezügliche Expression verwendet werden. Die jeweilige DNA-Sequenz kann mittels einer beliebigen Technik aus einer Vielzahl wohlbekannter und zur Routine gehörender Techniken in das Expressionssystem eingesetzt werden. Beispiele für solche Techniken sind z.B. die in Sambrook et al dargestellten Techniken.
Für die Sekretion des translatierten Proteins in das Lumen des endoplasmatischen Retikulums, in den periplasmatischen Raum oder in die extrazelluläre Umgebung können geeignete Sekretionssignale in das exprimierte Polypeptid eingebaut werden. Diese Signale können im Bezug auf das Polypeptid endogen sein, oder es können heterologe Signale sein.
Polypeptide der Erfindung können aus rekombinanten Zellkulturen mittels wohlbekannter Verfahren gewonnen und gereinigt werden; diese Verfahren beinhalten Ammoniumsulfat- oder Ethanol-Präzipitation, Säure-Extraktion, Anionen- oder Kationen-Austauschchromatographie, Phosphocellulose-Chromatographie, Chromatographie auf Basis hydrophober Wechselwirkung, Affinitätschromatographie, Hydroxylapatit-Chromatographie und Lektin-Chromatographie. Am bevorzugtesten wird Hochleistungsflüssigchromatographie zur Reinigung verwendet. Es können wohlbekannte Techniken zur Wiederherstellung der Faltung des Proteins verwendet werden, um die aktive Konformation wiederherzustellen, wenn das Polypeptid während der Isolierung und/oder Reinigung denaturiert wird.
Verfahren der Verabreichung
Bei der vorliegenden Erfindung kann das Polynukleotid durch ein beliebiges geeignetes Vehikel der Genübertragung entweder ex vivo oder in vivo an eine Zielzellpopulation verabreicht werden.
Dies beinhaltet, ohne hierauf beschränkt zu sein, DNA, die in Lipid- oder Proteinkomplexen formuliert ist, oder die als nackte DNA verabreicht wird, die Verabreichung über Injektion oder biolistischem Weg, über Viren, wie etwa Retroviren, Adenoviren, Herpesviren, Vacciniaviren und Adeno-assoziierte Viren. Das Genübertragungs-Vehikel kann von einem Durchschnittsfachmann der rekombinanten DNA-Technologie und Genexpression erstellt werden, um das Fusionsprotein auf geeignetem Niveau und mit der für eine bestimmte Anwendung erforderlichen Zellspezifität zu exprimieren.
Wie in der Technik wohlbekannt ist, ist ein Vektor ein Werkzeug, das den Transfer einer Einheit von einer Umgebung in eine andere erlaubt oder erleichtert. In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung und in beispielhafter Weise ermöglichen einige der bei den rekombinanten DNA-Techniken verwendeten Vektoren die Übertragung von Einheiten, wie etwa einem DNA-Segment (wie etwa einem heterologen DNA-Segment, so etwa einem heterologen cDNA-Segment), in eine Zielzelle. Optional kann der Vektor, sobald er sich in der Zielzelle befindet, dann dazu dienen, die heterologe DNA in der Zelle aufrechtzuerhalten, oder er kann als Element der DNA-Replikation dienen. Beispiele für in der rekombinanten DNA-Technik verwendete Vektoren beinhalten Plasmide, Chromosomen, künstliche Chromosomen oder Viren.
Der Vektor kann mittels viraler oder nicht-viraler Techniken übertragen werden.
Nicht-virale Zufuhrsysteme beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, Verfahren der DNA-Transfektion. Hier beinhaltet die Transfektion einen Prozess unter Verwendung eines nicht-viralen Vektors, um ein Gen auf eine Säuger-Zielzelle zu übertragen.
Typische Transfektionsmethoden beinhalten Elektroporation, DNA-Biolistik, Lipidvermittelte Transfektion, Transfektion unter Verwendung kompaktierter DNA, Liposomen, Immunliposomen, Lipofectin, Transfektions-Vermittlung durch kationische Mittel, kationische flächige Amphiphile (CFAs), (Nature Biotechnology 1996, 14:556), mehrwertige Kationen wie etwa Spermin, kationische Lipide oder Polylysin., 1,2-Bis(oleoyloxy)-3-(trimethylammonio)propan (DOTAP)-Cholesterinkomplexe (Wolff und Trubetskoy, 1998, Nature Biotechnology 16:421) und Kombinationen hiervon.
Virale Übertragungssysteme beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, Adenovirus-Vektoren, Adeno-assoziierte virale (AAV)-Vektoren, Herpesvirus-Vektoren, Retrovirus-Vektoren, Lentivirus-Vektoren oder Baculovirus-Vektoren.
Beispiele für Retroviren beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein: murinen Leukämie-Virus (MLV), humanen Immundefizienzvirus (HIV), den Virus der infektiösen Anämie des Pferdes (EIAV), den Maus-Brusttumorvirus (MMTV), Rous-Sarkoma-Virus (RSV), Fujinami-Sarkoma-Virus (FuSV), murinen Moloney-Leukämievirus (Mo-MLV), FBR murinen Osteosarkomavirus (FBR MSV), murinen Moloney-Sarkomavirus (Mo-MSV), murinen Abelson-Leukämievirus (A-MLV), Vogel-Myelozytomatose-Virus 29 (MC29) und Vogel-Erythroblastose-Virus (AEV).
Eine detaillierte Liste von Retroviren ist in Coffin of al („Retroviruses" 1997 Cold Spring Harbor Laboratory Press, Herausgeber: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus, S. 758–763) zu finden.
Adenoviren und Adeno-assoziierte Viren, die eine gute Spezifität für Epithelzellen aufweisen, sind besonders bevorzugt.
Andere Beispiele für Vektoren beinhalten Systeme zur Verabreichung ex vivo, die, ohne hierauf beschränkt zu sein, DNA-Transfektionsverfahren, wie etwa Elektroporation, DNA-Biolistik, Lipid-vermittelte Transfektion und über kompaktierte DNA vermittelte Transfektion beinhalten.
Folglich können Nukleinsäurevektoren gemäß obiger Beschreibung dazu befähigt sein, die Übertragung bevorzugt bei den Zielzellen vorzunehmen. Im beispielhaften Fall eines retroviralen Vektors kann das retrovirale Hüllprotein dazu befähigt sein, den Vektor zu einem bestimmten Zelltyp oder zu bestimmten Zelltypen zu leiten. Zu diesem Zweck kann das Hüllprotein ein modifiziertes Hüllprotein sein, das dahingehend angepasst ist, eine spezifische Zielfähigkeit aufzuweisen, oder es kann ein ausgewähltes Hüllprotein sein, das aus einer anderen viralen oder retroviralen Quelle stammt und die gewünschte Zielfähigkeit besitzt.
Vorzugsweise ist die Nukleinsäure in einem Vektor operativ mit einer Expressionskontrollsequenz verbunden, die dazu befähigt ist, eine bevorzugte Expression des Fusionsproteins in der Zielzelle zu bewirken. Die Expressionskontrollsequenz kann z.B. ein Promotor oder Enhancer sein, der bevorzugt in bestimmten Zelltypen, einschließlich der Zielzelle, aktiv ist, oder ein Promotor oder Enhancer, der bevorzugt unter bestimmten Bedingungen aktiv ist.
Der Begriff „Promotor" wird im gebräuchlichen Sinne der Technik verwendet und stellt z.B. eine RNA-Polymerase-Bindestelle gemäß der Jacob-Monod-Theorie der Genexpression dar.
Der Begriff „Enhancer" beinhaltet eine DNA-Sequenz, die andere Proteinkomponenten des Transkriptionsinitiationskomplexes bindet und somit die Initiation der Transkription, die von dem zugehörigen Promotor gesteuert wird, erleichtert.
Vorzugsweise sind die Promotoren der vorliegenden Erfindung gewebespezifisch. Dies bedeutet, dass sie dazu in der Lage sind, die Transkription einer Nukleinsäure in einem Gewebe anzutreiben, während sie in anderen Gewebetypen weitgehend „still" bleiben. Ein besonders bevorzugter Promotor ist der Epithelzellpromotor.
Der Begriff „gewebespezifisch" bezieht sich auf einen Promotor, der in seiner Aktivität nicht auf einen einzigen Gewebetyp beschränkt sein muss, der aber nichtsdestoweniger insofern Selektivität zeigt, als er in einer Gruppe von Geweben aktiv ist, während er in einer anderen Gruppe weniger aktiv oder inaktiv sein kann.
Verabreichung
Verbindungen, die dazu befähigt sind, den Signalweg einer Komponente der Hedgehog-Familie zu beeinflussen und für die therapeutische Anwendung vorgesehen sind, werden für die Verabreichung an Patienten typischerweise mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Verdünnungsmittel formuliert, um eine pharmazeutische Zusammensetzung herzustellen. Die Formulierung wird von der Natur der identifizierten Verbindung und dem Weg der Verabreichung abhängen, kann jedoch typischerweise für die topische, parenterale, intramuskuläre, intravenöse, intraperitoneale, auf intranasale Inhalation oder Lungeninhalation ausgerichtete, intradermale oder intraartikuläre Verabreichung formuliert werden. Die Verbindung kann in einer injizierbaren Form verwendet werden. Sie kann daher mit jedem beliebigen Vehikel gemischt werden, das für eine injizierbare Formulierung pharmazeutisch akzeptabel ist, bevorzugt für eine direkte Injektion an der zu behandelnden Stelle, obwohl sie auch systemisch verabreicht werden kann.
Der pharmazeutisch akzeptable Träger oder das Verdünnungsmittel können beispielsweise sterile isotonische Kochsalzlösungen oder andere isotonische Lösungen, wie etwa Phosphat-gepufferte Saline, sein. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können mit einem beliebigen bzw. mit beliebigen geeigneten Bindemittel(n), Gleitstoff(en), Suspendiermittel(n), Beschichtungsmittel(n), Lösungsvermittler(n) gemischt werden. Es ist außerdem bevorzugt, die Verbindung in einer oral aktiven Form zu formulieren.
Im Allgemeinen wird eine therapeutisch wirksame tägliche orale oder intravenöse Dosis der Verbindungen der Erfindung, einschließlich Verbindungen der Formel (1) und ihrer Salze, wahrscheinlich im Bereich von 0,01 bis 50 mg/kg Körpergewicht des zu behandelnden Subjekts liegen, bevorzugt bei 0,1 bis 20 mg/kg. Die Verbindungen der Formel (1) und ihre Salze können auch durch intravenöse Infusion verabreicht werden, wobei die Dosis hier wahrscheinlich im Bereich von 0,001–10 mg/kg/h liegen wird.
Tabletten oder Kapseln der Verbindung können, so wie es passend ist, zu einem Zeitpunkt einfach, zweifach oder in größerer Zahl verabreicht werden. Es ist auch möglich, die Verbindungen in Formulierungen mit lang anhaltender Freisetzung zu verabreichen.
Typischer Weise wird der Arzt die tatsächliche Dosis bestimmen, die für den jeweiligen Patienten am geeignetsten ist, wobei diese mit dem Alter, Gewicht und der Reaktion des jeweiligen Patienten variieren wird. Die obigen Dosierungen sind beispielhaft für den durchschnittlichen Fall. Es kann natürlich individuelle Umstände geben, unter denen höhere oder niedrigere Dosisbereiche bevorzugt sind, und auch diese liegen im Schutzbereich der Erfindung.
Alternativ können die Verbindungen der Erfindung durch Inhalation oder in Form eines Zäpfchens oder Pessars verabreicht werden, oder sie können topisch in Form einer Lotion, Lösung, Creme, Salbe oder als Stäubepuder appliziert werden. Eine alternative Form der transdermalen Applikation erfolgt über die Verwendung eines Hautpflasters. Beispielsweise können die Wirkstoffe in eine Creme gegeben werden, die aus einer wässrigen Emulsion von Polyethylenglykolen oder flüssigem Paraffin besteht. Sie können weiterhin, bei einer Konzentration zwischen 1 und 10 Gewichts-%, in eine Salbe gegeben werden, die aus einer Basis aus weißem Wachs oder weißem Weichparaffin, zusammen mit den entsprechend benötigten Stabilisatoren und Konservierungsstoffen, besteht.
Bei einigen Anwendungen sollten die Zusammensetzungen bevorzugt oral verabreicht werden, z.B. in Form von Tabletten, enthaltend Hilfsstoffe wie Stärke oder Laktose, oder als Kapseln oder kugelige Zubereitungen entweder alleine oder im Gemisch mit Hilfsstoffen, oder in Form von Elixieren, Lösungen oder Suspensionen, die Geschmacks- oder Farbstoffe enthalten.
Die Zusammensetzungen (ebenso wie die Verbindungen alleine) können auch parenteral injiziert werden, z.B. intrakavernös, intravenös, intramuskulär oder subkutan. In diesem Fall werden die Zusammensetzungen einen geeigneten Träger oder ein Verdünnungsmittel enthalten.
Für die parenterale Verabreichung werden die Zusammensetzungen am besten in Form einer sterilen wässrigen Lösung verwendet, die andere Substanzen enthalten kann, z.B. eine hinreichende Menge an Salzen oder Monosacchariden, um die Lösung im Bezug auf das Blut isotonisch zu machen.
Für die bukkale oder sublinguale Verabreichung können die Zusammensetzungen in Form von Tabletten oder Lutschtabletten bzw. Pastillen verabreicht werden, deren Formulierung in herkömmlicher Weise erfolgen kann.
Für die orale, parenterale, bukkale und sublinguale Verabreichung an Subjekte (wie etwa Patienten) kann der Tagesdosis-Spiegel der Verbindungen der vorliegenden Erfindung und ihrer pharmazeutisch akzeptablen Salze und Solvate typischerweise von 10 bis 500 mg (in einer Dosis oder in aufgeteilten Dosen) liegen. Somit können Tabletten oder Kapseln für ihre einfache oder zwei- oder mehrfache Verabreichung zu einem Zeitpunkt beispielhaft 5 bis 100 mg an Wirkstoff enthalten, so wie es günstig ist. Wie oben angezeigt, wird der Arzt die tatsächliche Dosis bestimmen, die für einen individuellen Patienten am geeignetsten ist, wobei diese mit dem Alter, Gewicht und der Reaktion des jeweiligen Patienten variieren wird. Es ist anzumerken, dass die oben genannten Dosierungen zwar beispielhaft für den Durchschnittsfall sind, es aber natürlich individuelle Umstände geben kann, bei denen höhere oder niedrigere Dosisbereiche bevorzugt sind, und dass solche Dosisbereiche im Schutzumfang dieser Erfindung liegen.
Die beschriebenen Verabreichungswege und Dosierungen sind nur als Richtlinie gedacht, da ein fachkundiger Anwender dazu in der Lage sein wird, problemlos den optimalen Verabreichungsweg und die optimale Dosierung für einen bestimmten Patienten, in Abhängigkeit beispielsweise vom Alter, Gewicht und dem Zustand des Patienten, zu bestimmen.
Der Begriff „Behandlung" oder „Therapie", wie er hier verwendet wird, ist so zu verstehen, dass er auch diagnostische und prophylaktische Anwendungen einschließt.
Die Verwendung der vorliegenden Erfindung erstreckt sich sowohl auch humanmedizinische als auch auf veterinärmedizinische Anwendungen.
Wie hier verwendet, kann man annehmen, dass die Begriffe „Protein", „Polypeptid" und „Peptid" synonyme Bedeutung haben, wobei „Protein" lediglich deshalb in einem allgemeinen Sinne verwendet wird, um eine relativ gesehen längere Aminosäuresequenz zu bezeichnen als diejenige, die in einem Polypeptid vorliegt, und „Polypeptid" kann allein deshalb in allgemeinem Sinne verwendet werden, um eine relativ längere Aminosäuresequenz zu bezeichnen, als sie in einem Peptid vorliegt. Allgemein werden wir uns, allein zur Erleichterung der Bezugnahme, auf den Begriff „Polypeptid" beziehen.
Die Erfindung wird nun in weiterem Detail und unter Bezugnahme auf die folgenden, nicht einschränkenden Beispiele beschrieben:
Beispiel 1: Konstruktion des SPC-Shh-Expressionsplasmids
Der in 5 gezeigte SPC-Maus-Shh-Vektor wurde aus einem Stamm-Expressionsvektor konstruiert, der wie folgt hergestellt wurde. Der in 4 gezeigte Stammvektor enthält ein pUC18-Rückgrat mit einem Ampicillin-Resistenzgen, eine 3,7 kb-Sequenz, die die humane SPC-Promotorregion, eine multiple Klonierungsstelle (MCS) und ein Intron aus dem kleinen T-Antigen von SV40 enthält, eine 0,4 kb-Sequenz, die eine poly(A)-Anheftungsstelle enthält, sowie Stopp-Codons in allen drei Leserastern (Korfhagen et al; Development 1997). Die cDNA-Sequenz, die die Maus-Shh codiert, wurde in die MCS einkloniert.
Zusätzliche Vektoren, die SPC-HIP, SPC-WIF-1 und SPC-Dvl-1 enthalten, wurden durch Klonierung muriner cDNAs für HIP, WIF-1, Dvl-1 in die MCS des SPC-Expressionsvektors hergestellt.
Beispiel 2: Gesteigerte Expression von Ptc in Lungenepithelzellen aus humanen Patienten mit idiopathischer fibrosierender Alveolitis (IFA, auch bekannt als CFA) und in einem Mausmodell der interstitiellen pulmonalen Fibrose (IPF)
6C BALB/c-Mäuse wurden intratracheal (i.t.) mit 50 μg FITC, gelöst in physiologischer, gepufferter Saline (PBS), behandelt. Drei Monate später wurden die Mäuse getötet und die Lungen entnommen und in 4% gepuffertem Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet. 5 μm-Schnitte des Lungengewebes wurden auf TESPA-beschichtete Objektträger gebracht und die Expression des Ptc-Gens wurde mittels Antisense-RNA in situ-Hybridisierung (ISH) untersucht.
Die Schnitte wurden bei 65°C mit Digoxigenin-Antisense-RNA-Sonden hybridisiert, die spezifisch für murines Ptc1 waren. Die gebundene Sonde wurde mittels Alkalischer Phosphatase, konjugiert mit Ziege-anti-Digoxigenin-Fab, detektiert, und die Schnitte wurden unter Verwendung von NBT und BCIP als Substrat entwickelt. Wir haben eine gesteigerte Expression von Ptc in Lungenepithelzellen im murinen Modell der IPF beobachtet. Die Expression von Ptc war alleine auf diejenigen Gebiete beschränkt, die Schädigung zeigten. Eine gesteigerte Expression von Ptc wurde innerhalb von 24 Stunden nach der intratrachealen Gabe von FITC festgestellt; diese hielt für mindestens 6 Monate an.
6A & B In Paraffin eingebettetes, archiviertes Lungengewebe von humanen Patienten, bei denen IFA diagnostiziert wurde, oder von Kontrollpatienten mit gesundem Lungengewebe, wurde auf 5 μm geschnitten und auf TESPA-beschichtete Objektträger gelegt. Die Schnitte wurden dann mittels Antisense-RNA in situ-Hybridisierung (siehe oben) auf Ptc-Genexpression hin analysiert. Wir beobachteten eine gesteigerte Expression von Ptc in Lungenepithelzellen.
Beispiel 3: Überexpression von Shh führt zu Epithelzellhyperplasie und Lungenfibrose. (Figuren 7–9)
BALB/c-Mäuse erhielten i.t. Injektionen von entweder (i) Saline alleine, oder (ii) 20 μg SPC-Plasmid, gelöst in Saline, oder (iii) 20 μg SPC-Shh-Plasmid-DNA, gelöst in Saline, an Tag 0 und Tag 5. Das SPC-Plasmid vermittelt die gewebespezifische Expression eines gewünschten Gens, da es die Promotorsequenz des Lungenepithelzell-spezifischen Oberflächenproteins C („surface protein C", SPC) enthält. Die Mäuse wurden an Tag 12 bzw. an Tag 35 getötet, wobei die Lungen entnommen und in 4% gepuffertes Formalin eingebracht wurden.
5 μm-Schnitte des Lungengewebes (7, 8) oder der Luftröhre (Trachea) (9) von jeder Gruppe und zu jedem der beiden Zeitpunkte wurden auf mit poly-L-Lysin beschichtete Objektträger gelegt und einer histochemischen Färbung unter Verwendung von Hämatoxylin und Eosin (H & E) unterzogen.
Die Gruppen beinhalteten:

Tag 12: PBS (2 Mäuse), SPC (2 Mäuse) und SPC-Shh (2 Mäuse)
Tag 35: PBS (3 Mäuse), SPC (3 Mäuse) und SPC-Shh (3 Mäuse)

Objektträger der Behandlungsgruppe nach 35 Tagen wurden unter Verwendung einer histochemischen Masons-Trichrom-Färbung außerdem auf Collagen-Produktion hin untersucht. Diese Art der Färbung wird routinemäßig verwendet, um Collagenfasern in Gewebeproben anzufärben, wobei diese grün werden. Es konnten im Vergleich zur Kontrolle gesteigerte Mengen an Collagenanfärbung in Lungengewebe aus den mit SPC-Shh behandelten Mäusen identifiziert werden.
Schnittscheiben der 35 Tage-Behandlungsgruppe wurden auch auf potentielle Becherzellhyperplasie hin untersucht, wobei die histochemische Periodic-Acid-Schift-(PAS)-Färbung verwendet wurde. Bei Verwendung dieser Färbung färben sich Zellen, die Muzine (Schleimstoffe) produzieren, intensiv pink, während sich Epithelien hellblau färben. Wir haben eine Zunahme der Anzahl der Becherzellen im Lungengewebe der SPC-Shh-Mäuse (d.h. pinkfarbene Zellen) und eine gesteigerte Schleimsekretion in den Atemwegen beobachtet. Die gesteigerte Anzahl an Becherzellen wurde nur bei denjenigen Atemwegen beobachtet, die Anzeichen einer Epithelhyperplasie zeigten. Normale Atemwege bei den SPC-Shh-Mäusen entsprachen denjenigen der Kontrollmäuse.
Schnittscheiben der Tag 12- und der Tag 35-Behandlungsgruppe wurden für einen Indexmarker der Proliferation, Ki-67, angefärbt, um Beweise dafür zu erhalten, dass die Lungenepithelien der SPC-Shh-Mäuse aktiv proliferierten. Schnitte der drei Behandlungsgruppen wurden mit einem Antikörper markiert, der spezifisch für das Ki-67-Antigen war, und der Zellen in der S-Phase des Zellzyklus markiert. Es gab im Lungenepithel der SPC-Shh-behandelten Mäuse im Vergleich zum Epithel der Kontrollmäuse einen Anstieg in der Anzahl der Ki-67 +ve-Zellen.
Beispiel 4: Epithelzellen exprimieren nach FITC-Schädigung hohe Mengen an Shh
Mäuse wurden intratracheal mit dem Hapten Fluoresceinisothiocyanat behandelt. Sieben Tage später wurden die Lungen entnommen und in Formalin fixiert. Es wurden Schnitte hergestellt und mittels Immunhistochemie für Shh gefärbt. Die 10A und 10B zeigen die Expression von Shh in der Lunge FITC-behandelter Mäuse, während 10C die Färbung zeigt, die in der Kontrolllunge für Shh beobachtet wird. Shh konnte bei epithelialen Zellen detektiert werden, wobei bei einer Basalzellenpopulation im Lungeninterstitium, die in der Morphologie mit Fibroblasten übereinstimmte, ein höheres Mengenniveau an Shh detektiert wurde.
Beispiel 5: Epithelzellen exprimieren nach FITC-Schädigung hohe Mengen an Shh
Mäuse wurden intratracheal mit dem Hapten Fluoresceinisothiocyanat behandelt. Einen Monat später wurden die Lungen entnommen und in Formalin fixiert. Es wurden Schnitte hergestellt und mittels Immunhistochemie für Shh gefärbt. Die 11A und 11B zeigen die Expression von Shh in zwei verschiedenen Lungenschnitten FITC-behandelter Mäuse, während die 11C und 11D die Färbung zeigen, die für Shh in der Kontrolllunge beobachtet wurde. Shh konnte bei Epithelzellen auf einem höherem Niveau detektiert werden als bei einer Basalzellenpopulation im Lungeninterstitium.
Beispiel 6: Epithelzellen exprimieren nach FITC-Schädigung hohe Mengen an Ptc
Mäuse wurden intratracheal mit dem Hapten Fluoresceinisothiocyanat behandelt. Sieben Tage später wurden die Lungen entnommen und in Formalin fixiert. Es wurden Schnitte hergestellt und mittels Immunhistochemie für Ptc gefärbt. 12A zeigt die Expression von Ptc in der Lunge FITC-behandelter Mäuse, während 12B die Färbung zeigt, die für Ptc in der Kontrolllunge beobachtet wird. Ptc konnte bei Epithelzellen detektiert werden, und es wurde ein höheres Niveau an Ptc bei infiltrierenden Leukozyten, die im Lungeninterstitium gefunden wurden, detektiert.
Beispiel 7: Shh- und Ptc-Färbung bei Biopsiematerial aus humaner CFA-Lunge
Archiviertes Material eines CFA-Patienten wurde geschnitten und mittels Immunhistochemie auf Gegenwart von Shh-N (dem bioaktiven Protein) und Ptc angefärbt. Die 13A–C zeigen die Färbung für Shh, und die 13D–F zeigen die Expression von Ptc. Jede Figur stellt einen Serienschnitt dar, der bei 10x vom jeweils selben Lungenstück aufgenommen wurde. Die Zellen im Interstitium der Atemwege und im Alveolarraum beinhalten Leukozyten, und diese werden stark für Ptc angefärbt.
Beispiel 8: Shh- und Ptc-Färbung bei Biopsiematerial aus humaner CFA-Lunge
Archiviertes Material eines CFA-Patienten wurde geschnitten und mittels Immunhistochemie auf Gegenwart von Shh-N (dem bioaktiven Protein) und Ptc angefärbt. Die 14A und B zeigen die Färbung für Shh, und die 14C und D zeigen die Expression von Ptc. Die 14A und C stellen einen Serienschnitt dar, der bei 10x vom selben Lungenstück aufgenommen wurde, während die 14B und D Ansichten bei 40x sind, die vom unteren Bereich des Schnitts aufgenommen wurden. Die Zellen im Interstitium der Atemwege und im Alveolarraum beinhalten Leukozyten, und diese werden stark für Ptc angefärbt.
Beispiel 9: Shh- und Ptc-Färbung bei Biopsiematerial aus humaner CFA-Lunge
Archiviertes Material eines CFA-Patienten wurde geschnitten und mittels Immunhistochemie auf Gegenwart von Shh-N (dem bioaktiven Protein) und Ptc angefärbt. Die 15A und B zeigen die Färbung für Shh, und die 15C und D zeigen die Expression von Ptc. Die 15A und C stellen Serienschnitte dar, die vom selben Lungenstück aufgenommen wurden, während die 15B und D Serienschnitte sind, die von einem anderen Schnitt aufgenommen wurden. Die Zellen im Atemwegslumen enthalten alveolare Makrophagen und diese werden stark für Ptc angefärbt.
Beispiel 10: Wirkung der Einführung von SPC-HIP
Unsere vorherigen Studien haben gezeigt, dass die Fehlregulation des Shh-Signalwegs während der Epithelzellreparatur in der Lunge zu einer Lymphozyteninfiltration bei gleichzeitiger Induktion von interstitieller Fibrose und Vernarbung führen kann. Wir haben vorstehend ein neuartiges Modell der pulmonalen Fibrose verwendet, bei dem die i.t. Behandlung naiver BALB/c-Mäuse mit 50 μg FITC, gelöst in Saline (PBS), zu einer anfänglich starken Entzündungsreaktion führt, die um Tag 7 herum abklingt, bei der jedoch eine Epithelzellhyperplasie zu dieser Zeit sichtbar ist und Lymphozyten beginnen, die Lunge an den Stellen der Epithelzellhyperplasie etwa an Tag 21 zu infiltrieren. Um Tag 28 gibt es Anzeichen für eine interstitielle Fibrose, die sich durch die Gegenwart von Lymphozyten in der Lunge zu verschlimmern scheint. Bei diesem Modell haben wir eine gesteigerte Expression von Ptc-1 an Stellen der Epithelzellhyperplasie, jedoch nicht in normalen Bereichen des Lungengewebes beobachtet. Dies zeigt an, dass es bei den FITC-behandelten Mäusen eine Fehlregulation des Shh-Signalwegs in dem Krankheitsprozess gibt.
Da HIP ein natürlicher Antagonist des Shh-Proteins ist, haben wir HIP in der Lunge überexprimiert, wobei der SPC-Expressionsvektor wie folgt verwendet wurde:
BALB/c-Mäuse wurden i.t. mit 50 μg FITC, gelöst in Saline (PBS), behandelt. Den Mäusen wurden 1–3 Monate später, d.h. zu Zeitpunkten, bei denen bekannt ist, dass die Mäuse normalerweise eine leichte bis schwere Fibrose haben würden, zwei i.t.-Injektionen, enthaltend entweder SPC-Plasmid alleine in Saline oder SPC-HIP in Saline, im Abstand von 7 Tagen verabreicht. Die Mäuse wurden an Tag 7, Tag 30, bzw. Tag 60 nach der Verabreichung von SPC-HIP getötet. Das Lungengewebe wurde entnommen und in 4% gepuffertem Formalin fixiert. Die Schnitte wurden mittels H & E, PAS, Masons-Trichrom, und Ki-67 zu den verschiedenen Zeitpunkten untersucht. Zusätzlich haben wir die Expression von Ptc und Shh durch ISH und Immunhistochemie überprüft. Eine Verminderung der Ptc-Expression und der Epithelzellhyperplasie und Lungenfibrose ist im Vergleich zu dem Epithel der Kontrollmäuse erkennbar.
Beispiel 11: Wirkung der Einführung von PKA
BALB/c-Mäuse wurden i.t. mit 50 μg FITC, gelöst in Saline (PBS), behandelt. Den Mäusen wurden 1–3 Monate später, d.h. zu Zeitpunkten, bei denen bekannt ist, dass die Mäuse normalerweise eine leichte bis schwere Fibrose haben würden, zwei i.t.-Injektionen von PKA in Saline im Abstand von 7 Tagen verabreicht. Die Mäuse wurden an Tag 7, Tag 30, bzw. Tag 60 nach der Verabreichung von SPC-PKA getötet. Das Lungengewebe wurde entnommen und in 4% gepuffertem Formalin fixiert. Die Schnitte wurden mittels H & E, PAS, Masons-Trichrom, und Ki-67 zu den verschiedenen Zeitpunkten untersucht. Zusätzlich haben wir die Expression von Ptc und Shh durch ISH und Immunhistochemie überprüft. Eine Verminderung der Ptc-Expression und der Epithelzellhyperplasie und Lungenfibrose ist im Vergleich zu dem Epithel der Kontrollmäuse erkennbar.
Beispiel 12: Epithelzellen exprimieren nach FITC-Schädigung hohe Mengen an Dvl-1
Mäuse wurden intratracheal mit dem Hapten Fluoresceinisothiocyanat behandelt. Sieben Tage später wurden die Lungen entnommen und in Formalin fixiert. Es wurden Schnitte hergestellt und mittels Immunhistochemie auf Dvl-1 hin angefärbt. 16A zeigt die Expression von Dvl-1 in der Lunge FITC-behandelter Mäuse, während 16B die in der Kontrolllunge beobachtete Färbung auf Dvl-1 zeigt. Es wurden eine starke Expression von Dvl-1 bei den Epithelzellen sowie infiltrierende Leukozyten beobachtet.
Beispiel 13: Dvl-1-Adenovirus induziert Epithelzellproliferation
Mäuse wurden intratracheal mit einem Kontroll-Adenovirus (17A und C) oder mit einem Adenovirus, der die murine Dvl-1 cDNA enthält (17B und D), behandelt. Vier Tage später wurden die Lungen entnommen und in Formalin fixiert. Es wurden Schnitte hergestellt und mittels Immunhistochemie auf den Proliferationsmarker Ki67 hin angefärbt. Die 17A und B zeigen eine Ansicht der Lunge bei 10x, und die 17C und D sind 40x-Ansichten der in dem gepunkteten Kästchen gezeigten Ausschnitte. Proliferierende Zellen exprimieren das Ki67-Antigen bei hohen Mengenniveaus.
Beispiel 14: Rolle der Fehlregulation des Wnt-Signals bei der Lungenfibrose
Das Dvl-1-Protein wird in den Lungenepithelien von Mäusen überexprimiert, um zu prüfen, welche Wirkung es bei der Entwicklung der Lungenfibrose haben könnte. BALB/c-Mäusen wurde mittels der i.t.-Route entweder (i) 20 μg an SPC-Plasmid, gelöst in Saline, oder (ii) 20 μg an SPC-Dvl-1-Plasmid-DNA, gelöst in Saline, an den Tagen 0 und 7 injiziert. Die Mäuse wurden an den Tagen 14 bzw. 35 getötet, wonach die Lungen entnommen und in 4% gepuffertes Formalin eingebracht wurden.
Das Lungengewebe wurde entnommen und in 4% gepuffertem Formalin fixiert. Die Schnitte wurden mittels H & E, PAS, Masons-Trichrom und Ki-67 zu den verschiedenen Zeitpunkten untersucht. Zusätzlich wurde die Expression von Dvl-1, Ptc und Shh mittels ISH und Immunhistochemie untersucht. Es wurde herausgefunden, dass die Überexpression zu Epithelzellhyperplasie und Lungenfibrose führt.
Beispiel 15: Prüfung der Wirkung der Einführung des Wnt-Antagonisten WIF-1
WIF-1 ist ein neuartiges Protein, das kürzlich als ein als Transmembranprotein exprimiertes Protein identifiziert wurde, das an Wnt-Proteine bindet, um diese zu neutralisieren. WIF-1 wird normal im Lungengewebe, sowie ebenso auch im Gehirn, exprimiert; wir haben daher eine ähnliche Versuchsreihe wie im Fall der SPC-HIP-Protokolle durchgeführt, wobei an dessen Stelle SPC-WIF-1 verwendet wurde. Wiederum ist im Vergleich zu dem Epithel der Kontrollmäuse eine Verminderung der Epithelzellhyperplasie und der Lungenfibrose zu beobachten.
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SEQ ID NO: 1 & 2
SEQ ID NO: 3 & 4
SEQ ID NO: 5 & 6
SEQ ID NO: 7 & 8

Claims

Verwendung eines Inhibitors für einen Hedgehog-Signalweg bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Epithelzellhyperplasie, Gewebefibrose, Entzündung oder einer Immunstörung.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Immunstörung eine Autoimmunerkrankung oder Transplantatabstoßung ist.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei die Autoimmunerkrankung Thyroiditis, Insulitis, Multiple Sklerose, Iridocyclitis, Uveitis, Orchitis, Hepatitis, Addison-Krankheit, Myasthenia gravis, rheumatoide Arthritis oder Lupus Erythematodes ist.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei der Hedgehog-Signalweg der Sonic-Hedgehog-, Indian-Hedgehog- oder Desert-Hedgehog-Signalweg ist.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei der Inhibitor HIP, Fzb, Cerberus, WIF-1, Xnr-3, Noggin, Chordin, Gremlin oder Follistatin oder ein Derivat, ein Fragment, eine Variante, ein Nachahmer, ein Homologes oder ein Analoges davon ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Inhibitor Ptc, Cos2 oder PKA ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Inhibitor ein Antikörper ist.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung der Lunge oder der Niere.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Atemnotsyndrom beim Erwachsenen, chronischer, obstruktiver Atemwegsstörungen, einschließlich Asthma, Emphysem und chronische Bronchitis, Atelektase, berufsbedingte Lungenerkrankung, einschließlich Silikose, Überempfindlichkeitserkrankungen der Lunge, einschließlich Überempfindlichkeitslungenentzündung; idiopathische interstitielle Lungenerkrankungen, einschließlich idiopathischer pulmonaler Fibrose, Lungenentzündung, einschließlich herkömmlicher interstitieller Lungenentzündung, desquamativer interstitieller Lungenentzündung und akuter interstitieller Lungenentzündung, und pleurale Fibrose.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei der Inhibitor ein Antagonist ist, ausgewählt unter Polypeptiden und Fragmenten davon, linearen Peptiden, zyklischen Peptiden, synthetischen und natürlichen Verbindungen, einschließlich niedermolekularen organischen oder anorganischen Verbindungen.