DE69839347T2 - Aus dem menschlichen gehirn stammender kcnq2 kaliumkanal - Google Patents

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Description

  • Technisches Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen eines neuen, aus dem menschlichen Gehirn stammenden Kaliumkanal-Polypeptids sowie die Verwendung dieser Sequenzen zur Identifizierung von Verbindungen, die die biologische und/oder pharmakologische Aktivität des nativen Biomoleküls modulieren. Ebenso betrifft die Erfindung die Diagnose, Untersuchung, Vorbeugung und Behandlung pathophysiologischer Störungen, die mit dem biologischen Molekül im Zusammenhang stehen oder von diesem vermittelt werden.
  • Stand der Technik
  • Bei den Kaliumkanälen handelt es sich um integrale Membranproteine von großer molekularer und funktioneller Vielfalt, die in praktisch allen Säugerzellen vorkommen. Neuronale Kaliumkanäle im Gehirn sind vorwiegend für die Aufrechterhaltung eines negativen Membranruhepotentials ebenso wie für die Steuerung der Membranrepolarisierung nach einem Aktionspotential verantwortlich. Je nach der Unterfamilie, zu der ein gegebener Kaliumkanal gehört, kann dieser über eine Änderung des Membranpotentials, eine Erhöhung der intrazellulären Ca2+-Konzentration oder die Bindung von Liganden an ihre Rezeptoren, einschließlich Acetycholin, Adrenalin, Dopamin, Galanin, Calcitonin-genverwandtes Peptid, Somatostatin und ATP, aktiviert werden. Die pharmakologische Identität verschiedener spannungsgesteuerter Kaliumkanäle wird über ihre Empfindlichkeit gegenüber Standardverbindungen, die zur Blockierung einer oder mehrerer Arten von Kaliumkanälen in der Lage sind, ermittelt. Zu diesen Verbindungen, die als Kaliumkanal- Blocker bekannt sind, gehören Tetraethylammoniumchlorid (TEA), 4-Aminopyridin (4-AP, ebenso wie 2-AP und 3-AP), 3,4- und 2,3-Diaminopyridin, BaCl2, CsCl, Strychnin, Phencyclidin, Pyridostigmin, 9-Aminoacridin, DuP-996 (3,3-bis-(4-Pyridinylmethyl)-1-phenylindolin-2-on; Linopiridin), Clofilium, Chinidin, Aminochinoline und Chinine. Die große molekulare und funktionelle Vielfalt macht die Kaliumkanäle zu einem potentiellen Ziel für die Entdeckung von Wirkstoffen für verschiedene pathophysiologische Indikationen, einschließlich Gedächtnisabbau, Schlaganfall, Epilepsie, Multipler Sklerose, Chorea Huntington, Angstzuständen, Depression, Psychose, Harninkontinenz, Diabetes, Asthma, Frühgeburt, Bluthochdruck, Herzischämie, Migränekopfschmerzen, Autoimmunkrankheiten, Krebs, Transplantatabstoßungen und Arrythmien. Toral, J., et al., Use of Cultured Human Neuroblastoma Cells in Rapid Discovery of the Voltage-gated Potassium-channel Blockers, J. Pharm. Pharmacol., 46: 731 (1994).
  • Die durch den Kaliumkanal aus Säugergehirn vermittelte neuronale Depolarisierung verlängert die neuronale Überlebensdauer in vitro und wurde zu einem Hauptmodell für die Untersuchung der neuronalen Apoptose. Siehe z. B. Shan Ping Yu, et al., Mediation of Neuronal Apoptosis by Enhancement of Outward Potassium Current, Science, 278: 114 (1997). Bei dem apoptotischen Neuronentod handelt es sich um einen Schlüsselmechanismus, durch den die Eliminierung neuronaler Vorläuferzellen während der Entwicklung des Säugergehirns reguliert wird und der für die normale Neurophysiologie wesentlich ist. Es konnte gezeigt werden, daß durch die durch Kaliumentzug induzierte Apoptose eine letale Kaskade von Ereignissen ausgelöst wird, zu der die spezifische RNA- und Proteinsynthese, die Induktion von Proteaseaktivität, die der des Interleukin-1-Umwandlungsenzyms ähnlich ist, sowie die Erzeugung von Radikalen zählen. Die neuronale Apoptose vermittelt ebenso bestimmte pathophysiologische Krankheitszustände. Gegenwärtige Untersuchungen richten sich auf die Signifikanz des vorzeitigen Tods adulter Neuronen bei neurodegenerativen Krankheiten des Menschen. Weller, M., et al., Developmental and Genetic Regulation of Programmed Neuronal Death, J. Neural Transm. Suppl., 50: 115 (1997).
  • Die Wichtigkeit der bioaktiven Integrität normaler Neurophysiologie wird in der heutigen klinischen Medizin leicht als Ergebnis der bemerkenswerten Demonstration der Folgen neuronaler Fehlfunktionen gesehen. Neuronenentwicklungs- und neurophysiologische Störungen, wie beispielsweise Schizophrenie, Angstzustände und Depression, sind signifikante physiologische Ereignisse, an denen eine neuronale Fehlfunktion beteiligt ist. Kürzlich wurde vorgeschlagen, daß Schizophrenie ebenso wie neurodegenerative Leiden, einschließlich Morbus Huntington, Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson und Lou-Gehrig-Krankheit, das Ergebnis einer fehlgeleiteten neuronalen Apoptose sind. Anormale Neuronenentwicklungsvorgänge wurden sowohl auf einen vorzeitigen Neuronentod als auch auf das Versagen der Eliminierung überschüssiger Neuronen zurückgeführt. Weiterhin wird vorgeschlagen, daß es sich bei dem katastrophischen Neuronenabbau bei neurophysiologischen Krankheiten, wie beispielsweise Schlaganfall und Epilepsie, um eine molekulare Kollaboration zwischen Nektrose und Apoptose. Stahl, S. M., J. Clin. Psychiatry, Apoptosis: Neuronal Death by Design, (5): 183 (1997).
  • Durch Fortschritte bei der Klonierung von KQT-Kaliumkanälen wurde das Verständnis der Struktur dieser Makromoleküle stark erweitert. Wang, Q., et al., Nature Genet., 12: 17 (1996); Wei, A., et al., Neuropharmacology, Band 35(7): 805 (1996); Curran, M. E., et al., Cell, 80: 795 (1995); Barhanin, J., et al., Nature, 384, 78–80 (1996); Sanguinetti, M. C., et al., Nature, 384: 80 (1996); Attali, B., Nature, 384: 25 (1996).
  • Vor kurzem wurde ein 1,5 Kb großes Vollängen-mRNA-Transkript beschrieben, das angeblich für ein 393 Aminosäuren großes Polypeptid eines Kaliumkanals aus einer menschlichen Neuroblastomlinie codiert. Yokoyama, M., et al., Identification and Cloning of Neuroblastoma-Specific and Nerve Tissue-Specific Genes through Compiled Express Profiles, DNA Research, 3: 311 (1996).
  • Die zentrale Rolle von Kaliumkanälen bei der Regulierung zahlreicher neurophysiologischer Funktionen macht sie zu besonders wichtigen Zielen bei der Therapieentwicklung. Unglücklicherweise wurde bislang noch keine Verbindung gefunden, die Kaliumkanäle ausschließlich in menschlichen Neuronen blockiert. Dementsprechend besteht nach wie vor ein Bedarf zur Identifizierung eines aus differenzierten Neuronen stammenden Kaliumkanals als pharmakologisches Ziel für das Screening von Kandidatenverbindungen für die Modulation neurophysiologischer Aktivität. Solche Modulatoren eignen sich potentiell für die Behandlung von Störungen, die durch Neuronen mit Fehlfunktion manifestiert werden. Darüber hinaus werden selektive Kanalblocker benötigt, die sich auf die Neuropharmakologie von Kaliumkanälen im Hinblick auf Neuronenentwicklungs- und neurophysiologische Störungen ebenso wie auf die Apoptose von Hirnneuronen richten.
  • Die Identifizierung und Charakterisierung von für die Aktivierung und Manifestierung der neuronalen Apoptose verantwortlichen Biomolekülen ist von größter Wichtigkeit in Richtung auf die Entwicklung therapeutischer Verbindungen zur Kontrolle und/oder Unterbrechung neurophysiologischer Störungen. Stahl, S. M., J. Clin. Psychiatry, Apoptosis: Neuronal Death by Design, (5): 183 (1997). Die Verfügbarkeit eines Funktionstests mit beträchtlichem Durchsatz stellt einen unverzichtbaren Teil eines jeden Wirkstoffentdeckungsprogramms dar, das sich auf Kaliumkanalmodulatoren konzentriert. Mit einem solchen Test sollte ein routinemäßiges Screening hunderter Verbindungen möglich sein. Toral, J., et al., Use of Cultured Human Neuroblastoma Cells in Rapid Discovery of the Voltage-gated Potassium-channel Blockers, J. Pharm. Pharmacol., 46: 731 (1994).
  • Kurze Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung richtet sich auf ein gereinigtes Polynukleotid, umfassend eine für das Polypeptid der SEQ ID NO: 3 codierende Nukleinsäuresequenz, wobei das Polypeptid die Fähigkeit besitzt, den Transmembranfluß und/oder -transport von Kaliumionen zu gestatten. In einigen Ausführungsformen umfaßt das Polynukleotid die Sequenz der SEQ ID NO: 2. Ebenso richtet sich die vorliegende Erfindung auf Expressionsvektoren, umfassend die erfindungsgemäßen Polynukleotide, ebenso wie auf Wirtszellen, die mit den Expressionsvektoren transformiert sind.
  • Ebenso richtet sich die vorliegende Erfindung auf ein gereinigtes Polypeptid der SEQ ID NO: 3, wobei das Polypeptid die Fähigkeit besitzt, den Transmembranfluß und/oder -transport von Kaliumionen zu gestatten.
  • Die vorliegende Erfindung richtet sich ferner auf ein Verfahren zur Herstellung von Zellen, die ein Polypeptid der SEQ ID NO: 3 exprimieren, wobei das Polypeptid die Fähigkeit besitzt, den Transmembranfluß und/oder -transport von Kaliumionen zu gestatten, wobei man in dem Verfahren
    • a) geeignete Wirtszellen mit einem eine für ein Polypeptid der SEQ ID NO: 3 codierende Nukleinsäure umfassenden Polynukleotid transformiert, wobei das Polypeptid die Fähigkeit besitzt, den Transmembranfluß und/oder -transport von Kaliumionen zu gestatten, und
    • b) das von der eingeführten Nukleinsäure codierte Polypeptid exprimierende Zellen selektioniert.
  • Die vorliegende Erfindung richtet sich ferner auf ein Verfahren zur Produktion eines Polypeptids der SEQ ID NO: 3, wobei das Polypeptid die Fähigkeit besitzt, den Transmembranfluß und/oder -transport von Kaliumionen zu gestatten, wobei man in dem Verfahren
    • a) eine mit einem Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung transformierte Wirtszelle unter für die Expression des Polypeptids geeigneten Bedingungen kultiviert und
    • b) das Polypeptid aus der Wirtszellkultur gewinnt.
  • Die vorliegende Erfindung richtet sich ferner auf ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die die biologische Aktivität eines Kaliumkanals modulieren, wobei man
    • a) einen Kandidatenverbindungsmodulator von biologischer Aktivität mit einem Polypeptid der SEQ ID NO: 3 kombiniert, wobei das Polypeptid die Fähigkeit besitzt, den Transmembranfluß und/oder -transport von Kaliumionen zu gestatten, und
    • b) eine Wirkung des Kandidatenverbindungsmodulators auf die Fähigkeit des Polypeptids zum Transmembranfluß und/oder -transport von Kaliumionen mißt.
  • Die vorliegende Erfindung richtet sich ferner auf ein
    • a) einen Kandidatenverbindungsmodulator von biologischer Aktivität mit einem Polypeptid der SEQ ID NO: 3 kombiniert, wobei das Polypeptid die Fähigkeit besitzt, den Transmembranfluß und/oder -transport von Kaliumionen zu gestatten, und
    • b) eine Wirkung des Kandidatenverbindungsmodulators auf die Fähigkeit des Polypeptids zum Transmembranfluß und/oder -transport von Kaliumionen mißt.
  • Die vorliegende Erfindung richtet sich ferner auf die Verwendung eines gereinigten Polypeptids nach SEQ ID NO: 3 oder auf das Polypeptid exprimierende Wirtszellen oder auf eine aus den Zellen hergestellte Präparation bei der Suche nach Verbindungen, die die Fähigkeit des Polypeptids zum Transmembranfluß und/oder -transport von Kaliumionen modulieren.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • In 1 ist die SEQ ID NO: 1 dargestellt, bei der es sich um eine 3029 Basen große cDNA-Nukleinsäuresequenz handelt, die für das neue aus dem menschlichen Gehirn stammende Kaliumkanalpolypeptid codiert, das für differenzierte Neuronen, wie hier beschrieben, gewebespezifisch ist. In 2 ist die SEQ ID NO: 2 dargestellt, bei der es sich um den 2565 Basen großen translatierten Strukturbereich von ATG bis TGA der cDNA-Nukleinsäuresequenz handelt, die für das für differenzierte Neuronen, wie hier beschrieben, gewebespezifische, aus dem menschlichen Gehirn stammende Kaliumkanalpolypeptid codiert.
  • In 3 ist die SEQ ID NO: 3 dargestellt, bei der es sich um die 854 Aminosäurereste umfassende Sequenz des für differenzierte Neuronen, wie hier beschrieben, gewebespezifischen, aus dem menschlichen Gehirn stammenden Kaliumkanalpolypeptids handelt.
  • In 4 ist die SEQ ID NO: 4 dargestellt, bei der es sich um die 1425 Basen große cDNA-Sequenz handelt, die zum HNSPC-Kaliumkanal, Genbank-Zugangsnr. D82346, gehört.
  • In 5 ist die SEQ ID NO: 5 gezeigt, bei der es sich um die 393 Aminosäurereste umfassende Sequenz des kürzlich beschriebenen HNSPC-Kaliumkanals, Gen-Zugangsnr. D82346, handelt; Yokoyama, M., et al., Identification and Cloning of Neuroblastoma-Specific and Nerve Tissue-Specific Genes through Compiled Express Profiles, DNA Research, 3: 311 (1996).
  • In 6 ist die SEQ ID NO: 6 gezeigt, bei der es sich um die 581 Aminosäurereste umfassende Sequenz des kürzlich beschriebenen menschlichen KvLQT1-Kaliumkanals, Genbank-Zugangsnr. U40990, U71077; handelt; Barhanin, J., et al., Nature, 384, 78–80 (1996); Sanguinetti, M. C., et al., Nature, 384: 80 (1996).
  • In 7 ist ein gegenüberstellender Vergleich zwischen der Aminosäurerestsequenz des vorliegend beschriebenen neuen, aus dem menschlichen Gehirn stammenden Kaliumkanalpolypeptids (SEQ ID NO: 3) und den Aminosäurerestsequenzen der Kaliumkanalpolypeptide HNSPC (SEQ ID NO: 5) und hKvLQT1 (SEQ ID NO: 6) dargestellt. Dabei sind konservierte Aminosäurereste eingerahmt. Zur Optimierung der Gegenüberstellung eingeführte Lücken sind durch waagerechte Striche repräsentiert. Die in dieser Figur gezeigten Sequenzen wurden unter Verwendung des Programms zur Gegenüberstellung mehrerer Sequenzen der Software DNASTAR (DNASTAR Inc, Madison WI) produziert.
  • In 8 ist ein Hydropathie-Graph der Aminosäurerestsequenz des vorliegend beschriebenen neuen, aus menschlichem Gehirn stammenden Kaliumkanalpolypeptids (SEQ ID NO: 3) und der Aminosäurerestsequenzen der Kaliumkanalpolypeptide HNSPC (SEQ ID NO: 5) und hKvLQT1 (SEQ ID NO: 6), die vorhergesagte Transmembransegmente zeigen, dargestellt.
  • Kyte, J., Doolittle, R. F.,. Mol. Biol., 157: 105 (1982); DNASTAR Inc, Madison WI.
  • In 9 sind Northern-Blot-Analysen mehrerer Gewebe dargestellt, wobei (Tafel A) die Nukleinsäuresonde Nr. 1, die für den vorliegend beschriebenen codierenden Bereich des aus menschlichem Gehirn stammenden Kaliumkanalpolypeptids (SEQ ID NO: 2) ist, und (Tafel B bzw. Tafel C) die Nukleinsäuresonde Nr. 2, die sowohl bei HNSPC-cDNA (SEQ ID NO: 4) als auch dem vorliegend beschriebenen codierenden Bereich des aus menschlichem Gehirn stammenden Kaliumkanalpolypeptids (SEQ ID No: 2) vorkommt, verwendet werden.
  • In 10 sind Northern-Blot-Analysen bestimmter Bereiche des menschlichen Gehirns dargestellt, wobei (Tafel A) die Nukleinsäuresonde Nr. 1, die für den vorliegend beschriebenen codierenden Bereich des aus menschlichem Gehirn stammenden Kaliumkanalpolypeptids (SEQ ID NO: 2) spezifisch ist, und (Tafel B) die Nukleinsäuresonde Nr. 2, die sowohl bei HNSPC-cDNA (SEQ ID NO: 4) als auch dem vorliegend beschriebenen codierenden Bereich des aus menschlichem Gehirn stammenden Kaliumkanalpolypeptids (SEQ ID NO: 2) spezifisch vorkommt, verwendet werden.
  • In 11 sind Northern-Blot-Analysen des adulten und des fötalen menschlichen Gehirns, der nichtinduzierten und neuronal induzierten Neuroblastomzellinie imr-32 und von Astrozyten dargestellt, wobei (Tafel A) die Nukleinsäuresonde Nr. 1, die für den vorliegend beschriebenen codierenden Bereich des aus menschlichem Gehirn stammenden Kaliumkanalpolypeptids (SEQ ID NO: 2) spezifisch ist, und (Tafel B) die Nukleinsäuresonde Nr. 2, die sowohl bei HNSPC-cDNA (SEQ ID NO: 4) als auch dem vorliegend beschriebenen codierenden Bereich des aus menschlichem Gehirn stammenden Kaliumkanalpolypeptids (SEQ ID NO: 2) vorkommt, verwendet werden.
  • In 12 ist die Expression und Aktivität funktionaler K+-Ströme der SEQ ID NO: 3 in den Säugerzellinien COS-7 und HEK 293 veranschaulicht:
    • A. Langsam aktivierender, nichtaktivierender Strom der aus menschlichen Gehirn stammenden Kaliumkanaluntereinheit in einer transfizierten COS-7-Zelle versus Fehlen des Stroms in der Elternzelle. Bei der durchgezogenen Linie über dem Strom handelt es sich um eine monoexponentielle Anpassung (τ = 216 ms).
    • B. Normalisierte mittlere (±SEM; n = 3 – 12) Steady-State-Aktivierungsspannungsabhängigkeit des SEQ ID NO: 3-Untereinheitsstroms, exprimiert in COS-7- und HEK 293-Zellen. Bei den durchgezogenen Linien handelt es sich um Boltzman-Anpassungen an die Daten (COS-7: V½: –6 mV, Steigungsfaktor: 13; KEK293: V½: 12 mV, Steigungsfaktor: 18.
    • C. Abhängigkeit des Umkehrpotentials der SEQ ID NO: 3-Untereinheit (HEK 293-Zellen) von [K+]0. Das Umkehrpotential wurde von „Peak-Tail"-Strömen gemessen, wobei die Liquid-Junction-Potentiale korrigiert wurden. Die lineare Regression (durchgezogene Linie) mit den Meßpunktmittelwerten (±SEM; n = 3 – 6) zeigt eine Steigung von 59 mV pro zehnfachem [K+]0-Anstieg, was auf einen stark K+-selektiven Strom hindeutet, wie durch die Nernst-Gleichung vorhergesagt.
    • D. Konzentrationsabhängige Hemmung der SEQ ID NO: 3-Untereinheit durch Tetraethylammonium (TEA). Bei der roten Linie handelt es sich um eine Hill-Anpassung an die Meßpunktmittelwerte (±SEM, n in Klammern) (IC50:0,13 mM, Steigungsfaktor: 0,59).
  • In 13 sind die Auswirkungen auf den K+-Strom während der Cotransfektion von COS-7- und HEK293-Zellen mit SEQ ID NO: 2 (lang) und SEQ ID NO: 4 (kurz) veranschaulicht.
    • A. Typische überlagerte Familie von durch eine ansteigende Spannungsschrittereihe in einer mit der SEQ ID NO: 2 transfizierten COS-7-Zelle hervorgerufenen Strömen.
    • B. Überlagerte Familie von mit der gleichen Vorgehensweise wie in (A) aus einer mit SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 2 und im Verhältnis 5:1 cotransfizierten Zelle erhaltenen Strömen.
    • C. Zusammengefaßte Daten (Mittelwert ± SEM, n-Werte in Klammern unterhalb der x-Achse) der Stromdichten aus allen mit Kombinationen aus SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 2 in den angegebenen Verhältnissen cotransfizierten COS-7- und HEK293-Zellen (* bezeichnet den Unterschied zur Elternzellenstromdichte mit p < 0,05, ** bezeichnet p < 0,001-Niveaus mittels Einweg-ANOVA).
  • In 14 ist ein Vergleich der Aktivierungsspannungsabhängigkeiten und Kinetiken für Ströme in mit hKvQT2L (SEQ ID NO: 2) (+ Leervektor) transfizierten COS-7-Zellen gegenüber mit hKvQT2S (SEQ ID NO: 4) + hKvQT2L (SEQ ID NO: 2) im Verhältnis 5:1 cotransfizierten Zellen veranschaulicht. Weder die Aktivierungsspannungsabhängigkeiten (A) noch die Aktivierungskinetiken (B) unterschieden sich signifikant für Ströme in mit KvQT2L tranfizierten Zellen gegenüber mit KvQT2L + KvQT2S cotransfizierten Zellen (Einweg-ANOVAs; p > 0,05).
    • A. Normalisierte mittlere (±SEM; n = 5,6) Steady-State-Aktivierungsspannungsabhängigkeit von Strömen. Bei den durchgezogenen Linien handelt es sich um Boltzman-Anpassungen an die Meßwerte (Vektor + KvQT2L: V½: –6 mV, Steigungsfaktor: 13; KvQT2S + KvQT2L 5:1: V½: –2 mV, Steigungsfaktor: 12).
    • B. Mittlere (±SEM; n = 5,6) τ-Werte, erhalten aus monoexponentiellen Anpassungen an die Aktivierung von durch einen ansteigenden Spannungsschrittbereich hervorgerufenen Strömen.
  • In 15 ist die Northern-Blot-Analyse eines Tumors des menschlichen Gehirns dargestellt. Eine ungefähr 2 Kb große Bande, die der kurzen Spleiß-Variante von hKvQT2 (SEQ ID NO: 4) entspricht, wurde in den Hirntumorspuren, jedoch nicht in den benachbarten Nichttumorzellen aus dem gleichen Gehirn oder aus nicht aus dem Gehirn stammenden Tumoren, die Metastasen im Gehirn gebildet hatten, nachgewiesen.
  • In 16 ist eine Northern-Blot-Analyse undifferenzierter, differenzierter und mit Beta-Amyloid behandelter SN56- und SN48-Septumzellinien dargestellt. SEQ ID NO: 1/SEQ ID NO: 2-spezifische Banden wurden in den cholinergen SN56-Zellen, jedoch nicht in SN48-Zellen (denen der Kaliumstrom fehlt) nachgewiesen.
  • In 17 ist die SEQ ID NO: 7 bzw. SEQ ID NO: 8 dargestellt, bei der es sich um die Aminosäurerestsequenz von KvQT3 der Ratte bzw. des Menschen handelt.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Falls nicht anders angegeben, besitzen alle hier verwendeten technischen und wissenschaftlichen Ausdrücke die gleiche Bedeutung, wie sie allgemein vom Fachmann auf dem Gebiet, zu dem diese Erfindung gehört, verstanden wird.
  • Biologische Aktivität, wie hier verwendet, bezieht sich auf die Fähigkeit, den Kaliumionen-Transmembranfluß und/oder -transport zu gestatten oder den Kaliumionen-Transmembranfluß und/oder -transport zu regulieren, oder auf die Fähigkeit einer Untereinheit, eine weitere Untereinheit, einen Liganden oder Cofaktor zu binden und/oder sonstwie die pharmakologische Aktivität eines Kaliumkanals zu modulieren.
  • Nukleinsäuresequenz, wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Oligonukleotid-, Nukleotid- oder Polynukleotidsequenz sowie auf Fragmente oder Teile davon und auf DNA oder RNA genomischen oder synthetischen Ursprungs, die doppelsträngig oder einzelsträngig vorliegen kann, gleichgültig, ob sie den Sense- oder Antisense-Strang repräsentiert. Analog bezieht sich Aminosäure- und/oder Aminosäurerestsequenz, wie hier verwendet, auf Peptid- oder Proteinsequenzen oder Teile davon.
  • Gereinigt, wie hier verwendet, bezieht sich auf Moleküle, und zwar entweder Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen, die aus ihrer natürlichen Umgebung entfernt und von wenigstens einer weiteren Komponente, mit der sie natürlicherweise assoziiert sind, isoliert oder getrennt werden.
  • Wie hier verwendet, handelt es sich bei einem funktionellen Derivat einer hier offenbarten Kaliumkanal-Molekülstruktur bzw. eines hier offenbarten Kaliumkanalpolypeptids um eine Verbindung oder Einheit, die eine (entweder funktionelle oder strukturelle) biologische Aktivität besitzt, die im wesentlichen ähnlich zu SEQ ID NO: 3 ist. Dabei soll der Ausdruck „funktionelle Derivate" die „Fragmente", „Varianten", „degenerierten Varianten „Analoge" und „Homologe" sowie „chemische Derivate" mit einbeziehen. Dabei soll sich der Ausdruck „Variante" auf ein Molekül beziehen, das eine weitgehend ähnliche Struktur und Funktion wie entweder ein ganzes Kaliumkanalmolekül oder ein Fragment davon aufweist. Dabei ist ein Molekül „weitgehend ähnlich" zu einem Kaliumkanalpolypeptid, wenn beide Moleküle weitgehend ähnliche Strukturen aufweisen oder wenn beide Moleküle eine ähnliche biologische Aktivität besitzen. Der Ausdruck „analog" bezieht sich auf ein Molekül, das eine weitgehend ähnliche Funktion wie entweder ein ganzes natives Polypeptid oder ein C-terminales Fragment davon aufweist.
  • Der Ausdruck „Modulation" wird hier so verwendet, daß er sich auf die Fähigkeit bezieht, eine funktionelle Eigenschaft eines Kaliumkanals entweder zu verstärken oder zu hemmen. Der Ausdruck „Modulation" wird hier ebenso so verwendet, daß er sich auf die Fähigkeit bezieht, die biophysikalische Aktivität eines Neurons zu beeinflussen.
  • Modulation oder Regulation von biologischer Aktivität, wie hier verwendet, bezieht sich auf die Bindung, Blockierung, Antagonisierung, Repression, Neutralisierung oder Sequestrierung einer biomolekularen Kaliumkanalstruktur, einschließlich, jedoch ohne darauf beschränkt zu sein, des hier beschriebenen neuen Kaliumkanalpolypeptids, ebenso wie auf die Heraufregulierung oder Agonisierung oder Aktivierung eines Kaliumkanals durch eine mit hier beschriebenen Mitteln identifizierte Verbindung.
  • Neurophysiologie modulieren, wie hier verwendet, bezieht sich auf die biophysiologische Regulation von Neuronen sowie die Behandlung von mit Neuronen in Zusammenhang stehenden oder von diesen vermittelten pathophysiologischen Störungen. „Weitgehend wie dargestellt", wie hier verwendet, bezieht sich auf funktionelle Derivate von Proteinen, Peptiden und DNA-Sequenzen, die zwar Änderungen aufweisen können, jedoch weitgehend die gleiche biologische Funktion auf weitgehend die gleiche Weise ausführen.
  • Biologisch aktives Fragment, wie hier verwendet, umfaßt Peptide, die bezüglich der N- oder/und C-Termini oder bezüglich des entsprechenden 5'- oder/und 3'-Endes des entsprechenden codierenden Polynukleotidbereichs verkürzt sind, wobei die Fragmente weitgehend die gleiche biologische Funktion ausführen oder Peptide codieren, die weitgehend die gleiche Funktion auf weitgehend die gleiche Weise ausführen. Der Ausdruck „biologisch aktiv" bezieht sich auch auf die Aktivität einer homologen oder analogen Einheit mit strukturellen, regulatorischen oder biochemischen Funktionen, die weitgehend die gleichen wie bei der natürlich vorkommenden Einheit sind.
  • Expressionsvektor, wie hier verwendet, bezieht sich auf Nukleinsäurevektorkonstruktionen, die Komponenten zur Steuerung der Expression heterologer proteincodierender Bereiche, einschließlich codierender Bereiche gemäß der vorliegenden Erfindung, durch genaue Transkription und Translation in Wirtszellen aufweisen. Expressionsvektoren enthalten üblicherweise einen Promoter zur Steuerung von Polymerasen zur Transkription des heterologen codierenden Bereichs, eine Klonierungsstelle, bei der der heterologe codierende Bereich einzuführen ist, und normalerweise Polyadenylierungssignale. Zu den Expressionsvektoren zählen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Plasmide, retrovirale Vektoren, virale und synthetische Vektoren.
  • Transformierte Wirtszellen, wie hier verwendet, beziehen sich auf Zellen, die codierende Bereiche gemäß der vorliegenden Erfindung stabil integriert in ihr Genom oder episomal vorliegend als replizierende oder nichtreplizierende Einheiten in Form einer linearen Nukleinsäure bzw. eines linearen Transkripts oder zirkulären Plasmids oder Vektors aufweisen.
  • Direkte Verabreichung, wie hier verwendet, bezieht sich auf die direkte Verabreichung von Nukleinsäurekonstrukten, die für Ausführungsformen (z. B. SEQ ID NO: 3, Modulatorverbindungsmolekül, Antisense-Molekül, Antikörpermolekül) gemäß der vorliegenden Erfindung oder Fragmente davon codieren, sowie auf die direkte Verabreichung von Ausführungsformen gemäß der vorliegenden Erfindung oder Fragmenten davon und der In-Vivo-Einführung von Molekülen der vorliegenden Erfindung, vorzugsweise über einen wirksamen eukaryontischen Expressionsvektor in einem geeigneten pharmazeutischen Träger. Polynukleotide und therapeutische Moleküle der vorliegenden Erfindung können ebenso in Form von Nukleinsäuretranskripten zugeführt werden.
  • Kaliumkanäle
  • Bei den Kaliumkanälen handelt es sich um die evolutionsmäßig älteste, verbreitetste und verschiedenartigste Form von Ionenkanälen. Kaliumkanäle kommen in allen Eukaryonten vor und bestimmen das Membranruhepotential und steuern die elektrische Anregbarkeit in verschiedenartigen Zelltypen. Bei den von Kaliumkanälen in Zellen ausgeführten Funktionen handelt es sich um so spezifische Funktionen wie das Festlegen der Zeiträume zwischen den Amplituden endogen schlagender Zellen. Im Nervensystem stellen Kaliumkanäle Schlüsselregulatoren der Signalgebung aufgrund ihrer Rolle bei der Kontrolle der Form und des Musters von Aktionspotentialen dar, die letztendlich kritisch für Wahrnehmung, Lernen und Verhalten sind. Wei, A., et al., Neuropharmacology, Band 35(7): 805 (1996). Die Wichtigkeit der bioaktiven Integrität normaler Neurophysiologie wird in der heutigen klinischen Medizin leicht als Ergebnis der bemerkenswerten Demonstration der Folgen neuronaler Fehlfunktionen gesehen.
  • Die Apoptose neokortikaler Neuronen in der Maus, die beispielsweise durch Serummangel oder durch Staurosporin induziert wird, wurde mit einer frühen Verstärkung des verzögerten Gleichrichterstroms (IK) und dem Verlust des gesamten intrazellulären K+ in Verbindung gebracht. Durch die Abschwächung des K+-Auswärtsstroms mit Tetraethylammonium (TEA) oder erhöhtem extrazellulären K+, jedoch nicht mit Blockern von CA2+-, Cl– oder anderen K+-Kanälen, konnte die Apoptose reduziert werden, selbst wenn damit verbundene Erhöhungen der intrazellulären CA2+-Konzentration verhindert wurden. Weiterhin wurde Apoptose durch Inkontaktbringen mit dem K+-Ionophor Valinomycin oder dem K+-Kanalöffner Cromakalim induziert. Ein verstärkter K+-Ausfluß kann bestimmte Formen neuronaler Apoptose vermitteln. Shan Ping Yu, et al., Mediation of Neuronal Apoptosis by Enhancement of Outward Potassium Current, Science, 278: 114 (1997).
  • Die Hypothese, daß ein erhöhter K+-Ausfluß einen ersten zu Apoptose führenden Schritt darstellen könnte, wird dadurch gestützt, daß die Applikation des selektiven K+-Ionophors Valinomycin Apoptose beispielsweise in Thymozyten, Lymphozyten und Tumorzellen auslöst. In corticalen Kulturen, die 24 bis 48 Stunden 20 nM Valinomycin ausgesetzt wurden, wurde die typische neuronale Apoptose induziert, die durch Chromatinkondensation, Zellkörperschrumpfung, internukleosomale DNA-Fragmentierung und Empfindlichkeit gegenüber Cyclohemimid gekennzeichnet ist. Typische neuronale Apoptose wurde weiterhin durch 24- bis 48-ständiges Inkontaktbringen mit dem K+-Kanalöffner Cromakalin, der KATP-Kanäle ebenso wie IK-ähnliche Ströme in zentralen Säugerneuronen aktiviert, ebenso induziert. Es gibt Hinweise darauf, daß eine langanhaltende Verstärkung des K+-Auswärtsstroms eine Schlüsselstellung bei der Vermittlung der Formen von corticaler neuronaler Apoptose einnimmt. Von Shan Ping Yu, et al. wird vorgeschlagen, daß Eingriffe, die sich auf die Blockierung des übermäßigen K+-Ausflusses, insbesondere durch den inaktivierenden verzögerten K+-Gleichrichterkanal, richten, als Strategie für die Abschwächung der neuronalen Apoptose bei Krankheitszuständen erforscht werden. Shan Ping Yu, et al., Mediation of Neuronal Apoptosis by Enhancement of Outward Potassium Current, Science, 278: 114 (1997).
  • In kürzlich durchgeführten Experimenten zur molekularen Klonierung und funktionalen Expression konnte gezeigt werden, daß Gene, die einer ähnlichen funktionalen Vielfalt wie im vorliegenden Fall unterliegen, sich in mehrere konservierte Klassen von Multigenfamilien gruppieren lassen. Insbesondere weisen KQT-Kanäle Kernbereiche auf, durch die sie sich von spannungsgesteuerten Kanälen unterscheiden. Wei, A., et al., Neuropharmacology, Band 35(7): 805 (1996).
  • Die KQT-Klasse spannungsgesteuerter Kaliumkanäle unterscheidet sich evolutionsmäßig von den anderen spannungsgesteuerten Kaliumkanälen (Kv-Kanälen). Barhanin, J., et al., Nature, 384, 78–80 (1996). Ein sehr bemerkenswerter Unterschied ist dabei das Fehlen einer Tetramerisierungsdomäne im N-Terminus, die die unterfamilienspezifische Assoziation vermittelt. Wei, A., et al., Neuropharmacology, Band 35(7): 805 (1996). Im Poren- und sechsten Transmembranbereich unterscheidet ein einzigartiges Muster konservierter Reste die KQT-Kanäle von anderen Kv-Kanälen, wie beispielsweise das vor der Pore liegende ADAL-Motiv, das KxPQTW-MOtiv in der Pore und das SFFALPAGILGSG-Motiv in S6.
  • Das erste Mitglied der KQT-Genfamilie ist KvLQT1. Mutationen dieses Gens wurden mit einer Form des langen QT-Syndroms, einer Erbkrankheit, die bei Trägern zu einer Veranlagung für Herzrhythmusstörungen führt, in Verbindung gebracht. Wang, Q., et al., Nature Genet., 12: 17 (1996). Kürzlich konnte von zwei unabhängigen Gruppen gezeigt werden, daß KvLQT1 und ein weiteres Einzeltransmembranprotein mit der Bezeichnung ISK sich im Herz unter Bildung des langsam aktivierenden Kaliumkanals IKS, der für die Repolarisierung von Aktionspotential verantwortlich ist, zusammenlagern. Barhanin, J., et al., Nature, 384, 78–80 (1996); Sanguinetti, M. C., et al., Nature, 384-80 (1996). Von Barhanin et al. und Sanguinetti et al. wurden vor kurzem die molekularen Komponenten der langsamen verzögerten K+-Gleichrichterkanäle identifiziert, ein entscheidender Schritt bei der Suche nach neuen Arzneistoffen gegen Rhythmusstörungen. Nature, 384, 78–80 (1996); Nature, 384-80 (1996); Attali, B., Nature, 384-25 (1996). In COS-Zellen induzierte die Expression von KVLQT1 einen spannungsabhängigen, schnell aktivierenden und langsam deaktivierenden K+-Auswärtsstrom. K LQT1-Messenger-RNA ist im Herz, in der Niere und den Speicheldrüsen der Maus stark vorhanden, im Gehirn, dem Skelettmuskel und der Leber jedoch fast nicht nachweisbar. Die molekulare Identifizierung des IKS-Kanals sollte bei der Konstruktion neuer Arzneistoffe gegen Rhythmusstörungen helfen. Barhanin, J., et al., Nature, 384-25 (1996). Eine Northern-Blot-Analyse von KvLQT1 zeigt Expression im Herz, der Plazenta, der Lunge, der Niere und der Bauchspeicheldrüse des Menschen; im Gehirn wird kein Signal nachgewiesen. Saguinetti, M. C., et al., Nature, 384-80 (1996).
  • Vor kurzem wurde von Yokoyoma, M., et al. über ein Transkript berichtet, das für ein aus 393 Aminosäuren bestehendes Polypeptid mit der Bezeichnung HNSPC (Human Neurons Specific Potassium Channel [menschlicher neuronespezifischer Kaliumkanal]) aus einer Neuroblastomzellinie (CHP 134) codiert. DNA Research, 3: 311 (1996). Beim menschlichen Neuroblastom handelt es sich um ein bösartiges Neoplasma, das aus Neuroblasten oder aus im Nebennierenmark oder sympathischen Ganglion entsteht. Die Autoren lehren die Identifizierung eines Gens, das angeblich spezifisch im Nervensystem exprimiert wird. Eine Vollängen-cDNA-Sequenz mit 1425 Basen, die dem Yokoyama-Transkript entspricht, ist vorliegend aufgeführt (SEQ ID NO: 4), wobei gezeigt wird, daß sie ein offenes Leseraster von 393 Aminosäuren, die von Position 178–1356 der SEQ ID NO: 4 reichen, enthält. Es wurde beschrieben, daß HNSPC alle strukturellen Charakteristika eines spezifisch im Nervensystem exprimierten spannungsgesteuerten Kaliumkanals aufweist. In der Northern-Blot-Analyse konnte unter Verwendung einer Vollängensonde gezeigt werden, daß es drei Transkripte gibt. Ein 1,5 Kb großes Transkript ist in Neuroblastomzellinien stark vertreten. In menschlichem Hirngewebe erschien ein 9,5 Kb großes Transkript als Hauptkomponente und Transkripte mit einer Länge von 1,5 Kb bzw. 3,8 Kb als Nebenkomponenten. Im fötalen Gehirn sind sowohl das 1,5 Kb große als auch das 9,5 Kb große Transkript, jedoch nicht ein 3,8 Kb großes Transkript stark vertreten. Yokoyama, M., et al., Identification and Cloning of Neuroblastoma-Specific and Nerve Tissue-Specific Genes through Compiled Express Profiles, DNA Research, 3: 311 (1996).
  • Das neue, aus dem menschlichen Gehirn stammende Kaliumkanalbiomolekül ist entwicklungsmäßig reguliert und gewebespezifisch für ausdifferenzierte Neuronen
  • Vorliegend wird die SEQ ID NO: 1 offenbart, bei der es sich um eine aus 3029 Basen bestehende cDNA-Nukleinsäuresequenz handelt, die für ein neues, aus dem menschlichen Gehirn stammendes Kaliumkanalpolypeptid codiert, das für ausdifferenzierte Neuronen gewebespezifisch ist, wie weiter beschrieben wird, siehe unten. Bei der SEQ ID NO: 2 handelt es sich um den 2565 Basen großen translatierten Strukturbereich, ATG bis TGA, der cDNA-Nukleinsäuresequenz, die für das neue, aus dem menschlichen Gehirn stammende gewebespezifische Kaliumkanalpolypeptid codiert. SEQ ID NO: 3, bei der es sich um die aus 854 Aminosäureresten bestehende Sequenz des aus dem menschlichen Gehirn stammenden Kaliumkanalpolypeptids handelt, das für ausdifferenzierte Neuronen gewebespezifisch ist, wie hier beschrieben.
  • Zu Referenz- und Vergleichszwecken: Bei der SEQ ID NO: 4 handelt es sich um die 1425 Basen große cDNA-Sequenz in Verbindung mit dem HNSPC-Kaliumkanal. Genbank-Zugangsnr. D82346. Bei der SEQ ID NO: 5 handelt es sich um die aus 393 Aminosäureresten bestehende Sequenz des kürzlich beschriebenen HNSPC-Kaliumkanals. Genbank-Zugangsnr. D82346; Yokoyama, M., et al., Identification and Cloning of Neuroblastoma-Specific and Nerve Tissue-Specific Genes through Compiled Express Profiles, DNA Research, 3: 311 (1996). Bei der SEQ ID NO: 6 handelt es sich um die aus 581 Aminosäureresten bestehende Sequenz des kürzlich beschriebenen menschlichen KvLQT1-Kaliumkanals. Genbank-Zugangsnr. U40990, U71077; Barhanin, J., et al., Nature, 384, 78–80 (1996); Sanguinetti, M. C., et al., Nature, 384: 80 (1996).
  • Das hier beschriebene, aus 854 Resten bestehende, entwicklungsmäßig regulierte und gewebespezifische, aus dem menschlichen Gehirn stammende Kaliumkanalpolypeptid (SEQ ID NO: 3) teilt auf der Aminosäureebene eine Gesamthomologie von 37% mit dem 581 AS großen KvLQT1 (SEQ ID NO: 6) sowie 44% mit dem 393 AS großen HNSPC (SEQ ID NO: 5) (95% Homologie in seiner gegenüberstellend vergleichbaren Sequenz) (Vergleich in 7 gezeigt). Das neue, aus dem Gehirn stammende Kaliumkanalpolypeptid (SEQ ID NO: 3) weist weitere 461 Aminosäuren in seinem C-terminalen Teil auf im Vergleich mit HNSPC (SEQ ID NO: 5).
  • Aufgrund der Erkennung eines überwiegenden 1,5 Kb großen Transkripts in mehreren undifferenzierten Neuroblastomzellinien ebenso wie einer 9,6–10 Kb großen Bande im Hirngewebe in Northern-Blots wurde HNSBC bereits als „menschlicher neuronenspezifischer Kaliumkanal" bezeichnet. Allerdings wurden diese Banden von Yokoyama et al. unter Verwendung einer Sonde des HNSPC-codierenden Bereichs nachgewiesen, die mit der neuen hier beschriebenen cDNA (SEQ ID NO: 1) 95% Bereichsähnlichkeit teilt. In der Tat entspricht die von Yokoyama et al. im menschlichen Gehirn beobachtete 9,5–10 Kb große Bande der hier beschriebenen neuen cDNA (SEQ ID NO: 1) und nicht HNSPC, wie weiter unten beschrieben.
  • Der neue, aus dem Gehirn stammende Kaliumkanal wird bei der Neuronendifferenzierung auf hohem Niveau exprimiert.
  • Die Differenzierung von Nervenzellen stellt einen entscheidenden Vorgang bei der normalen Entwicklung von Nervengewebe ebenso wie für die Regulation der Zellplastizität während des Wachstums und der Regenerierung bei Krankheitszuständen dar. Die Neuroblastomlinie IMR-32 wird dabei ausgiebig als Modellsystem für die Untersuchung neuronaler Differenzierung eingesetzt. Sher, et a., Neurochemistry, 50: 1708 (1988).
  • Eine den Positionen 1257 bis 1461 der SEQ ID NO: 2 entsprechende Nukleinsäuresonde (hier als Sonde Nr. 1 bezeichnet, weiter unten beschrieben) umfaßt den C-terminalen Schwanz des Strukturbereichs der neuen, aus dem Gehirn stammenden Kaliumkanal-cDNA. Die hier als Sonde Nr. 2 bezeichnete Nukleinsäuresonde entspricht den Basenpositionen 989 bis 1109 der SEQ ID NO: 2 und umfaßt den entsprechenden codierenden Bereich für einen 40 Aminosäuren langen Bereich, der sowohl in einem zentralen Bereich des hier beschriebenen, aus dem Gehirn stammenden Kaliumkanals als auch in einem Bereich des HNSPC, der zum C-Terminus des Peptids gehört, vorkommt.
  • Vorliegend wird gezeigt, daß mit der Nukleinsäuresonde 1 eine sehr schwache, 9,5–10 Kb große Bande in nichtinduzierten IMR-32-Zellen identifiziert wird, während die Expression in ausdifferenzierten IMR-32- Zellen dramatisch heraufreguliert ist (~20+fach) (11). Somit gibt es einen starken Zusammenhang zwischen der Expression des neuen, aus dem Gehirn stammenden Kaliumkanals und der Induktion neuronaler Differenzierung, wodurch die Wichtigkeit des neuen Biomoleküls bei der neurologischen Funktion betont wird.
  • In mehreren Gewebe-Blots mit der Nukleinsäuresonde 1 wird ein vorherrschendes 9,5–10 Kb großes Transkript ausschließlich im menschlichen Gehirn beobachtet (9). Dabei ist das Transkript sowohl im adulten als auch im fötalen Gehirn sichtbar (11) und liegt mit ähnlicher Intensität im Kleinhirn, in der Großhirnrinde, dem Markhirn, dem Okzipitallappen, dem Frontallappen, dem Temporallappen und dem Putamen vor (10). 9 zeigt Northern-Blot-Analysen mehrerer Gewebe, wobei (Tafel A) die Nukleinsäuresonde Nr. 1, die für den hier beschriebenen, für das aus dem menschlichen Gehirn stammende Kaliumkanalpolypeptid codierenden Bereich (SEQ ID NO: 2) spezifisch ist, sowie (Tafel B bzw. Tafel C) die Nukleinsäuresonde Nr. 2, die sowohl in der HNSPC-cDNA (SEQ ID NO: 4) als auch dem hier beschriebenen, für das aus dem menschlichen Gehirn stammende Kaliumkanalpolypeptid codierenden Bereich vorliegt (SEQ ID NO: 2), verwendet werden. 10 zeigt Northern-Blot-Analysen bestimmter Bereiche des menschlichen Gehirns, wobei (Tafel A) die Nukleinsäuresonde Nr. 1, die für den hier beschriebenen, für das aus dem menschlichen Gehirn stammende Kaliumkanalpolypeptid codierenden Bereich (SEQ ID NO: 2) spezifisch ist, sowie (Tafel B) die Nukleinsäuresonde Nr. 2, die sowohl in der HNSPC-cDNA (SEQ ID NO: 4) als auch dem hier beschriebenen, für das aus dem menschlichen Gehirn stammende Kaliumkanalpolypeptid codierenden Bereich vorliegt (SEQ ID NO: 2), verwendet werden. 11 zeigt Northern-Blot-Analysen von menschlichem adultem Gehirn und menschlichem fötalem Gehirn, IMR-32 und Astrozyten, wobei (Tafel A) die Nukleinsäuresonde Nr. 1, die für den hier beschriebenen, für das aus dem menschlichen Gehirn stammende Kaliumkanalpolypeptid codierenden Bereich (SEQ ID NO: 2) spezifisch ist, sowie (Tafel B) die Nukleinsäuresonde Nr. 2, die sowohl in der HNSPC-cDNA (SEQ ID NO: 4) als auch dem hier beschriebenen, für das aus dem menschlichen Gehirn stammende Kaliumkanalpolypeptid codierenden Bereich vorliegt (SEQ ID NO: 2), verwendet werden.
  • Das hier beschriebene, aus dem Gehirn stammende Kaliumkanalpeptid (SEQ ID NO: 3) wird entwicklungsmäßig reguliert und gewebespezifisch im menschlichen Gehirn und Neuroblastomzellinien die zu neuronaler Differenzierung induziert werden, exprimiert. Hierbei handelt es sich um eine signifikante Tatsache, die das neue Biomolekül funktionell von HNSPC unterscheidet und zu diesem in Gegensatz stellt, wobei HNSPC auf sehr niedrigem Niveau im adulten Gehirn exprimiert und bei der neuronalen Differenzierung von Neuroblastomzellinien nicht reguliert wird.
  • Der aus dem Gehirn stammende Kaliumkanal wird in neuronalen Zellen und nicht in Gliazellen des menschlichen Gehirns exprimiert. Das menschliche Gehirn besteht aus anregbaren Neuronen und nichtanregbaren Gliazellen. Dabei kommen die Gliazellen zehnmal häufiger vor als die neuronalen Zellen. Um zu beurteilen, ob das neue Kaliumkanaltranskript (SEQ ID NO: 1) im menschlichen Gehirn in neuronalen oder nichtneuronalen Zellen exprimiert wird, wurde eine Northern-Blot-Analyse der von primärem menschlichem fötalem Gehirn kultivierten nichtneuronalen Gliazellen durchgeführt. Das zu dem hier beschriebenen, aus dem Gehirn stammenden Kaliumkanal gehörende Transkript wurde in der mRNA aus Gliazellen nicht nachgewiesen, womit seine spezifische Expression in neuronalen Zellen des Gehirns bestätigt wurde (11). Das Transkript (SEQ ID NO: 1) ist sowohl in adultem als auch fötalem Gehirn vorhanden (11).
  • HNSPC wird vorwiegend in Neuroblastomzellinien und nicht im menschlichen Gehirn exprimiert. Dagegen wird hier gezeigt, daß mit der Sonde 2 eine vorherrschende 1,5 Kb große Bande sowohl in nativen und ausdifferenzierten IMR-32-Zellen (repräsentiert HNSPC) sowie eine zusätzliche 9,5–10 Kb große Bande in ausdifferenzierten IMR-32-Zellen (repräsentiert das zu dem hier beschriebenen neuen, aus dem Gehirn stammenden Kaliumkanal gehörende Transkript; 11) nachgewiesen werden. Somit wird HNSPC vorwiegend in Neuroblastomzellinien exprimiert, stellt jedoch nicht das vorherrschende Transkript im menschlichen Gehirn dar.
  • Mit der Sonde 2 wird eine vorherrschende 9,5–10 Kb große Bande in mehreren Bereichen des Gehirns festgestellt (9 und 10). Diese Ergebnisse sind den mit der Sonde 1 erhaltenen Ergebnissen (siehe oben) sehr ähnlich, was auf eine sehr hohe Expression des hier beschriebenen Kaliumkanalpolypeptids (SEQ ID NO: 3) im menschlichen Gehirn schließen läßt. Unter Verwendung der Sonde 2 wird ein 1,5 Kb großes Transkript in Tests beobachtet (9), das HNSPC repräsentiert, wie von Yokoyama et al. beschrieben.
  • Vorliegend wird erkannt, daß das zuvor von Yokoyama et al. beschriebene HNSPC-Polypeptid (SEQ ID NO: 5) unter die KQT-Familie fällt. Die hier beschriebene cDNA repräsentiert ein neues Kaliumkanalmitglied der KQT-Familie. In Hirntumoren ist die Genregulation verändert. Dabei wird die Hypothese vertreten, daß Hirntumoren mehr HNSPC (SEQ ID NO: 5) als das hier beschriebene längere, gewebespezifische Kaliumkanalpolypeptid (SEQ ID NO: 3) exprimieren, was zu einer erhöhten zellulären Proliferation führt. HNSPC (SEQ ID NO: 5) ist stark in neuronalen Zellinien und in fötalem Gehirn vertreten, doch weist das adulte Gehirn kein oder nur sehr wenig HNSPC auf, während das hier beschriebene längere, gewebespezifische Kaliumkanalpolypeptid dort stark vertreten ist (SEQ ID NO: 3). Dementsprechend würde man vorhersagen, daß die zu dem neuen Kaliumkanal gehörende neue SEQ ID NO: 1-cDNA in Hirntumoren bei gleichzeitiger Erhöhung der SEQ ID NO: 4-HNSPC-cDNA herunterreguliert ist.
  • Die funktionelle Expression der hier beschriebenen, aus dem Gehirn stammenden Kaliumkanaluntereinheit ergibt Ströme, die durch HNSPC supprimiert werden
  • Bei der Transfektion in Säugerzellen führt der für aus menschlichem Gehirn stammenden Kaliumkanal codierende cDNA-Bereich (SEQ ID NO: 2) zu robusten spannungsgesteuerten Auswärtsströmen (12A, B), die kaliumselektiv sind (12C) und sich wirksam durch von außen appliziertes TEA (Tetraethylammonium) blockieren lassen (12D). Die Transfektion von Säugerzellen mit HNSPC-cDNA, SEQ ID NO: 4 (eine kurze Spleißvariante der SEQ ID NO: 1), die die Kaliumkanaluntereinheit der SEQ ID NO: 5 ergibt, produziert keine funktionellen Ströme. Vorliegend wird ein EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein[verbessertes grün fluoreszierendes Protein])-Fusionskonstrukt der SEQ ID NO: 2 beschrieben, mit dem grüne Zellen als Marker für die Expression der Kanaluntereinheit nachgewiesen werden. Dieses Konstrukt produzierte funktionsfähige Kanäle mit biophysikalischen und pharmakologischen Eigenschaften, die der „unfusionierten" Kanaluntereinheit (SEQ ID NO: 3) sehr ähnlich sind (siehe 13A). Weiterhin führte die Coexpression der SEQ ID NO: 3 zusammen mit EGFP-HNSPC zur Suppression von durch die erhaltene lange Spleißvariantenuntereinheit produzierten Kaliumströmen (siehe 13A–D); allerdings wird keine signifikante Änderung der Kinetik der Kanalsteuerung demonstriert (14). Siehe Beispiel XIV.
  • Im Zusammenhang mit neuronaler Entwicklung wird gezeigt, daß unreifes, sich entwickelndes Hirngewebe sowohl die kurze als auch die lange Spleißvariante der SEQ ID NO: 1, z. B. SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 5, exprimiert, während das reife adulte Gehirn vorwiegend die lange Spleißvariante SEQ ID NO: 3 exprimiert (siehe 11). Die Tatsache, daß die kurze Versionsuntereinheit, HNSPC (SEQ ID NO: 5), die Funktion der langen Variante SEQ ID NO: 3 supprimiert, impliziert, daß geänderte Aktionspotentialabgabehäufigkeiten für das entwickelnde Gehirn kritisch sind.
  • Expression der SEQ ID NO: 4 in menschlichen Hirntumoren: Verwendung bei der Diagnose
  • Mit einer Northern-Blot-Analyse menschlicher Hirntumor-mRNA konnte gezeigt werden, daß das kurze Transkript HNSPC (SEQ ID NO: 4), das in normalem adultem Gehirn sehr schwach exprimiert wird, in adulten Hirntumoren heraufreguliert ist (15). Dieses Ergebnis läßt angesichts der beobachteten Assoziation der kurzen Spleißvariante (SEQ ID NO: 4) der aus dem Gehirn stammenden Kaliumkanaluntereinheit mit proliferierenden Hirnzellen, wie beispielsweise fötalem Gehirn und undifferenzierten Neuroblastomzellinien (11), erwarten, daß nachweisbare Niveaus des Transkripts auf Hirntumorgewebe hinweisen. Zwei Formen adulter Hirntumor-RNA, ein Astrazytom und ein Gliom, sind für das kurze Transkript, SEQ ID NO: 4, positiv. Kontroll-RNA aus benachbarten nichttumorgenen Zellen aus dem gleichen Gehirn waren für SEQ ID NO: 4-Transkripte negativ. Nicht aus dem Gehirn stammende Tumoren, die Metastasen im Gehirn gebildet hatten, waren ebenso für SEQ ID NO: 4-Transkripte negativ. Dementsprechend kann der Nachweis des kurzen Transkripts der SEQ ID NO: 4 mittels PCR oder Antikörpern im Liquor von Patienten mit Hirntumoren als diagnostisches Werkzeug zur Überwachung des Fortschreitens der Krankheit während der Behandlung oder anderweitig für diagnostische Zwecke verwendet werden. Beispielsweise läßt sich eine nachweisbare 107 bp-PCR-Bande, die für das kurze Transkript spezifisch ist, unter Verwendung des Vorwärtsprimers: 5' AAC CTC TCG CGC ACA GAC CTG CA 3' (SEQ ID NO: 9) entsprechend Positionen 1225–1247 der SEQ ID NO: 4, ebenso wie eines Rückwärtsprimers: 5' AAC AGT TGC TTG GTG GCA GGA GCC 3' (SEQ ID NO: 10), entsprechend Positionen 1308–1331 der SEQ ID NO: 4, erzeugen. Siehe Beispiel XV.
  • Rolle der SEQ ID NO: 3-Kaliumkanaluntereinheiten beim durch β-Amyloid induzierten Neuronentod (molekulare Identifizierung von für den K+-Kanal codierenden Genen in SN56-Zellen)
  • Cholinerge basale Vorderhirnneuronen (Colom et al., J Neurochem., 70: 1925 (1998)) und ebenso Kortexneuronen (Yu, S. et al., Neurobiol Dis., 5(2): 81 (1998)), die im Frühstadium von Morbus Alzheimer (AD) stark abgereichert sind, exprimieren ein bestimmtes Profil von K+-Strömen, die spannungsgesteuert und gegenüber TEA empfindlich sind. Die K+-Ströme regulieren lebenswichtige Zellfunktionen; infolgedessen erwartet man, daß ihre Änderung zur Schädigung und anschließend zum Tod der Zellen führt. Es konnte gezeigt werden, daß das Peptid Beta-Amyolid (Aβ) eine Hauptrolle bei der neuronalen Toxizität in Patienten mit AD spielt. Eine cholinerge Septumzellinie, SN56, exprimiert einen TEA-sensiblen Kaliumstrom. Es wurde demonstriert, daß Aβ die Kaliumströme in diesen Zellen verstärkt. Es wird gezeigt, daß die Abschwächung dieses Stroms über TEA Neuronen mit Aβ-vermittelter Toxizität blockiert. Colom et al., J Neurochem. 70: 1925 (1998). Eine nichtcholinerge Septumlinie (SN48) scheint keine signifikanten Kaliumströme aufzuweisen und ist gegenüber dem Aβ-induzierten Zelltod resistent. Die physiologischen Eigenschaften und pharmakologischen Profile der K+-Ströme in SN56 erinnern an die Eigenschaften von zwei Unterfamilien klonierter und charakterisierter Genprodukte: der shaw-Unterfamilie, Kv3.1 und Kv3.2 (Chandy und Gutman, Handbook of Receptors and Channels, (1995)) spannungsgesteuerter Kanäle und der vor kürzerer Zeit beschriebenen KvQT-Unterfamilie, KvQT2 und KvQT3 (Singh, et al., Nature Genetics (1998); Charlier, et al., Nature Genetics (1998)).
  • Um zu bestimmen, ob einer oder alle dieser Kanäle für den K+-Kanal in SN56-Zellen codierten, wurden Northern-Blot-Analysen durchgeführt. Dabei wurde Gesamt-RNA aus undifferenzierten und ausdifferenzierten SN48- und SN56-Zellen nach Standardvorschriften isoliert. Von jeder RNA-Probe wurden zwanzig Mikrogramm zusammen mit 20 μg RNA aus Ratten- und Mausgehirn (als Positivkontrollen) auf einem 1,0%igen Agarosegel laufengelassen, auf Nitrozellulose übertragen und unter hochstringenten Bedingungen an eine durch Zufallspriming mit 32P markierte Sonde, die so konstruiert ist, daß mit ihr die shaw-Unterfamilie von Genen (Kv3.1–Kv3.4) oder die SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 (die lange bzw. kurze alternative Spleißvariante des KvQT2-Gens) aufgespürt werden kann, hybridisiert. Das Autoradiogramm wurde hinreichend lange exponiert, so daß selbst weniger häufige Transkripte 1, falls vorhanden, deutlich sichtbar wären. Es werden starke 3,8 Kb- und 1,5 Kb-Banden nachgewiesen, die der langen bzw. kurzen Spleißvariante (SEQ ID NO: 2 bzw. SEQ ID NO: 4) entsprechen, sowohl in undifferenzierten als auch ausdifferenzierten SN56-Zellen nachgewiesen. Dieses Signal ist sehr schwach (oder fehlt) in SN48-Zellen. Siehe 16.
  • Mutationen in der KvQT-Genfamilie verursachen benigne Familiäre neonatale Epilepsie
  • Epileptische Störungen betreffen weltweit etwa 20–40 Millionen Menschen, wobei es sich bei 40% dieser Störungen um idiopathische generalisierte Epilepsien unbekannter Ätiologie handelt (In Idiopathic Generalized Epilepsies. Eds Malafosase A. et al., John Libbey, London, 1994). Die meisten der idiopathischen Epilepsien werden auf autosomale dominante Weise vererbt. Zwei Loci auf Chromosom 20q13.3 bzw. 8q24 wurden durch Kartierung mittels Verknüpfungsanalyse benignen, familiären, neonatalen Konvulsionen zugeordnet. Durch Positionsklonierung dieser Loci wurden von zwei Gruppen für hKvQT2 (SEQ ID NO: 3, vorliegend beschrieben) und KvQT3 (z. B. SEQ ID NO: 7 (17)) codierende Bereiche identifiziert, die bei Epilepsiepatienten mutiert sind. Singh N. A. et al., Nature Genetics, 18, 25 (1998); Biervert C., et al., Science, 279: 403 (1998); Charlier C., et al., Nature Genetics, 18: 53 (1998). Mehrere Punktmutationen bzw. Missense/Frameshift-Mutationen im Porenbereich in Post-S6- und C-Termini finden sich bei Epilepsiefamilien. Diese Mutationen führen zum Funktionsverlust des entsprechenden K+-Kanals. Es konnte gezeigt werden, daß eine solche Verkürzung im C-Schwanz, die die biologische und/oder pharmakologische Aktivität von HNSPC emittiert (SEQ ID NO: 5), nicht funktionsfähig ist und zur Suppression von Wildtyp-hKvQT2 (SEQ ID NO:)-Strömen bei Coexpression in Xenopus-Oozyten führt. Biervert C., et al., Science, 279: 403(1998). Es wurden wenigstens elf Maus-Spleißvarianten von mKQT2 (Maushomolog der SEQ ID NO: 3) beschrieben, die alle im C-Schwanz liegen. Keine dieser C-terminalen Spleißvarianten produzierte funktionsfähige Kanäle in Xenopus-Oozyten. Nakamura, M., et al., Receptors and Channels 5: 255 (1998).
  • Da Kaliumkanäle funktionale Tetramere sind, reicht eine Mutation in einem Allel aus, um zu einem dominanten negativen Phänotyp in einer Untereinheit zu führen, der für die Funktion des Kanaltetramers fatal sein könnte. Somit wird vermutet, daß der krankheitsbedingte Funktionsverlust des Kanals eine sich aus beeinträchtigter Repolarisierung ergebende neuronale Übererregbarkeit beim Epilepsiesyndrom verursacht. Es wird erwartet, daß sich menschliche KvQT2-Agonisten, beispielsweise Agonisten der biologischen und/oder pharmakologischen Aktivität der SEQ ID NO: 3, die als Kanalöffner fungieren, als bei der Behandlung von Anfällen und Epilepsien geeignet erweisen. Zudem wird erwartet, daß die Zuführung einer normalen Untereinheit über Gentherapie an ein Individuum, das eine normale Untereinheit benötigt, beispielsweise an ein Individuum, dem eine anomale Version vererbt wurde, von signifikantem therapeutischem Wert bei der Behandlung von durch abnorme Niveaus oder Versionen der SEQ ID NO: 3 vermittelten Störungen ist.
  • Molekulares Korrelat von M-Strömen im Gehirn
  • Bei dem M-Strom handelt es sich um einen nichtinaktivierenden spannungsgesteuerten Kaliumstrom, der sich in vielen neuronalen Zelltypen findet. Übersichtsartikel von Marrion N. V., Control of M-Current, Ann. Rev. Physiol., 59: 483 (1997). In jeder Hirnzelle ist der M-Strom bei der Kontrolle der Membranerregbarkeit dadurch dominant, daß er der einzige anhaltende Strom im Bereich der Aktionspotentialinitiation ist. Der M-Strom läßt sich über ein großes Array von Rezeptortypen modulieren, was entweder zur Verstärkung oder zur Unterdrückung des Stroms führt. Tatsächlich entstand historisch gesehen der Ausdruck M-Strom auf der Grundlage der beobachteten Unterdrückung eines zeit- und spannungsabhängigen Kaliumstroms durch Muscarinrezeptorstimulierung. Brown D. A. und Adams, P. R., Nature, 283: 673 (1980). Die Unterdrückung des M-Stroms führt zur Membrandepolarisierung, wodurch die Neuronen eher zur Abgabe von Aktionspotentialen neigen. Der Strom wird auch synaptisch reguliert, wobei die synaptische Unterdrückung des M-Stroms des langsamen postsynaptischen Anregungspotentials (EPSP [Excitatory Postsynaptic Potential]) in sympathischen und Hippocampus-CA3-Neuronen zugrunde liegt. Daher ist es offensichtlich, daß das Vorliegen des M-Stroms eine starke Wirkung bei der Regulierung neuronaler Erregbarkeit ausübt. Es konnte gezeigt werden, daß Modulatoren von M-Strömen die Freisetzung von Neurotransmittern verstärken und daher eine Attraktivität als Kognitionsverbesserer besitzen.
  • Die biophysikalischen und pharmakologischen Eigenschaften des in Säugerzellen exprimierten hKvQT2(SEQ ID NO: 3)-Kanals stimmen eng mit den Eigenschaften des M-Stroms in Neuronen überein, einschließlich Aktivierungs- und Inaktivierungskinetik, Schweifströmen und Blockierung durch Barium. Siehe 11. Tatsächlich wurde ein Heteromultimer der hKvQT2-Kaliumkanaluntereinheit (wie vorliegend beschrieben, z. B. SEQ ID NO: 3) sowie ein weiteres Homolog dieser Familie, KvQT3 (z. B. SEQ ID NO: 7), als ein Kanal, der den M-Strom trägt, ins Gespräch gebracht. Neuroscience Meeting, Wang H. S., et al., Society for Neuroscience, 24: Abs Nr. 792,1 (1998). Siehe 17 und 18. Bei der Coexpression von hKQT2 und hKQT3 in Oozyten imitierte der erhaltene Strom alle Eigenschaften der nativen M-Ströme, einschließlich Blockierung durch TEA. Weiterhin wurde gezeigt, daß die alleinige Expression von KvQT3(SEQ ID NO: 7)-Kanälen sehr niedrige Kaliumströme in Xenopus-Oozyten produzierte. Yang, W. P., et al., J. Biol. Chem. 31: 19419 (1998). Bei Coinjektion mit hKvQT20-mRNA (SEQ ID NO: 1) entstanden jedoch sehr robuste Ströme mit neuartigen Eigenschaften, was auf eine Heteromultimerisierung der beiden Kanaltypen hindeutet.
  • Die beobachtete Beteiligung der für die Bildung des Kanals, der für den M-Strom codiert, integralen SEQ ID NO: 3-Kanaluntereinheit hat eine deutliche Auswirkung auf das Screening zur Identifizierung ebenso wie zur Konstruktion kleiner Moleküle, die die M-Stromaktivität modulieren und damit die Neuronenfunktion modulieren. Für die Verwendung bei Screens zur Wirkstoffentdeckung werden Zellinien in Betracht gezogen, die stabil hKvQT2 (SEQ ID NO: 3) allein exprimieren oder die SEQ ID NO: 3 und eine ihrer verwandten Homologen, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, KvQT1 und/oder KvQT3 (SEQ ID NO: 7) coexprimieren. Zu neuronalen Funktionen gehören beispielsweise Kognitionsverbesserung und Aufmerksamkeitsdefizitstörungen und dergleichen.
  • Immunhistochemie von Gehirnschnitten unter Verwendung von Antikörpern gegen hKvQT2 (SEQ ID NO: 3) und KvQT3 (SEQ ID NO: 7)
  • Unter Verwendung von Peptiden, die den Aminosäurerestpositionen 644–658 der SEQ ID NO: 3 ebenso wie den Resten 639–653 der SEQ ID NO: 7 entsprechen, wurden Antikörper gegen hKvQT2 (SEQ ID NO: 3) und KvQT3 (SEQ ID NO: 7) erzeugt. Die genannten Peptide wurden synthetisiert, mit KLH konjugiert und zur Immunisierung von Kaninchen verwendet. Die 7–8 Wochen nach der Immunisierung gewonnenen Antiseren ergaben sehr hohe Titer von Antikörpern gegen die Peptide in einem ELISA-Test (> 1:100.000-Verdünnung). Die Antiseren wurden zur Durchführung von Immunhistochemie an Probengewebe aus Rattenhirn ebenso wie an menschlichem Hirngewebe verwendet. In Paraffin eingebettete Schnitte wurden mit einer Verdünnung von 1:3000 des primären hKvQT2- oder hKvQT3-Antiserums und danach mit einer 1:200-Verdünnung von HRP-konjugiertem Ziege-Anti-Kaninchen-Antiserum inkubiert. Die Anfärbung erfolgte unter Verwendung des Substrats DAB (Paragon Biotech Inc., Baltimore, MD). Eine positive Anfärbung sowohl auf hKvQT2- als auch hKvQT3-Antikörper wurde in Purkinjee-Zellen in der Kleinhirnrinde, Ependymzellen des Plexus Choroideus und großen Neuronen im basalen Vorderhirn beobachtet. Eine schwächere Anfärbung wurde in Neuronen aus mehreren anderen Bereichen des Gehirns, einschließlich Kortex und Hippocampus, beobachtet. Präimmunseren zeigen keine nachweisbare Anfärbung. Das Überlappungsprofil der Expression sowohl von hKvQT2 als auch hKvQT3 war bemerkenswert und ließ auf eine Colokalisierung schließen.
  • Zu weiteren Namen, die in jüngerer Zeit für die vorliegend beschriebene, aus dem Gehirn stammende Kaliumkanaluntereinheit KvQT2 (SEQ ID NO: 3) verwendet wurden, gehören KQT2 (Wei et al., 1996, Neuropharmacology, 35: 805–829) und KCNQ2 (Biervert et al., 1998, Science, 279: 403–406).
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäuresequenzen (SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2) und Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 3) des neuen, aus dem menschlichen Gehirn stammenden Kaliumkanals sowie die Verwendung dieser Sequenzen zur Identifizierung von Verbindungen, die die Aktivität von Kaliumkanälen und die menschliche Neurophysiologie modulieren.
  • Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung der hier beschriebenen Nukleinsäuresequenzen in Expressionssystemen als Tests für Agonisten oder Antagonisten des Kaliumkanalbiomoleküls. Ebenso betrifft die Erfindung die Diagnose, Untersuchung, Vorbeugung und Behandlung einer Krankheit in Verbindung mit dem aus dem menschlichen Gehirn stammenden Kaliumkanal und/oder von durch nichtfunktionsfähige Neuronen vermittelten Krankheiten.
  • Polynukleotidsequenzen, die für den menschlichen Neuronenkaliumkanal (SEQ ID NO: 3) codieren, können gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden und umfassen Deletionen, Insertionen und/oder Substitutionen der Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO: 2. Ein gereinigtes Polynukleotid, das eine für das Polypeptid mit der Sequenz der SEQ ID NO: 3 codierende Nukleinsäuresequenz umfaßt, stellt eine besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar.
  • Nukleinsäuresequenzen, die für die Aminosäuresequenz des hier beschriebenen neuen neuronenspezifischen Kaliumkanalmoleküls codieren, stellen aufgrund der potentiellen Substitution degenerierter Codons (unterschiedliche Codons, die für die gleiche Aminosäure codieren) eine exponentielle Summe dar. Die zur heterologen Expression ausgewählte Oligonukleotidsequenz wird daher vorzugsweise so angefertigt, daß sie die häufigste charakteristische tRNA-Codonerkennung des jeweiligen verwendeten Wirtsexpressionssystems erfüllt, wie dem Fachmann allgemein bekannt ist.
  • Die Nukleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung können auch gentechnisch konstruiert werden, um eine codierende Sequenz aus verschiedenen Gründen zu verändern, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Änderungen, die die Klonierung, Prozessierung und/oder Expression des Genprodukts modifizieren. So können beispielsweise unter Verwendung von Techniken, die im Fachgebiet allgemein bekannt sind, z. B. Stellen gerichteter Mutagenes, Mutationen eingeführt werden, um neue Restriktionsstellen zu inserieren, Glykosylierungsmuster zu ändern, die Codonpräferenz zu verändern usw.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft teilweise den Einschluß des für das neue Kaliumkanalmolekül codierenden Polynukleotids in einem Expressionsvektor, der zur Transformation von Wirtszellen oder nichtmenschlichen Organismen verwendet werden kann. Solche transgenen Wirte eignen sich für die hier beschriebene Herstellung des neuen neurophysiologischen Moleküls und dessen Variationen.
  • Die Nukleinsäuresequenz sieht ebenso die Konstruktion von Antisense-Molekülen vor, die sich bei der Herunterregulierung, Verringerung oder dem Ausschalten der Expression der genomischen Nukleotidsequenz in Zellen, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Neuronen, sowie Tumor- oder Krebszellen, eignen.
  • Das menschliche Kaliumkanalbiomolekül der vorliegenden Erfindung läßt sich auch in Screening-Tests zur Identifizierung von Blockern, Antagonisten oder Inhibitoren verwenden, die Substrat binden, nachahmen oder anderweitig das Biomolekül inaktivieren oder mit diesem konkurrieren. Der neue Kaliumkanal läßt sich auch in Screening-Tests zur Identifizierung von Agonisten verwenden, die den Kaliumkanal aktivieren oder anderweitig die Produktion des Biomoleküls induzieren oder dessen Lebensdauer in vivo oder in vitro verlängern.
  • Die Erfindung betrifft ebenso pharmazeutische Verbindungen und Zusammensetzungen, die das im wesentlichen wie in der SEQ ID NO: 3 dargestellte menschliche Kaliumkanalpolypeptidmolekül oder Fragmente davon, Antisense-Moleküle, die zur Unterbrechung der Expression des natürlich vorkommenden Gens fähig sind, sowie Agonisten, Antikörper, Antagonisten oder Inhibitoren des nativen Biomoleküls umfassen. Diese Zusammensetzungen eignen sich zur Vorbeugung und/oder Behandlung von Leiden im Zusammenhang mit nichtfunktionsfähigen Neuronen und neurophysiologischen Störungen.
  • Besonders bevorzugte Ausführungsformen richten sich auf Verfahren zum Screening auf Verbindungen, die die Neurophysiologie modulieren, die die biologische Aktivität eines Kaliumkanals stören oder hemmen.
  • Pharmakologische Signifikanz
  • Wie oben erörtert, zeigt die Northern-Blot-Analyse, daß das neue Biomolekül fast ausschließlich auf neuronale Zellen (und nicht Gliazellen) des menschlichen Gehirns beschränkt ist (9–11). Das neue Transkript weist sehr geringe Mengen in der Neuroblastomzellinie IMR-32 auf, doch erfolgt nach Ausdiffernzierung dieser Zellen zu Neuronen eine signifikante Heraufregulierung des Transkripts (11). Der vorliegend beschriebene neue, aus dem Gehirn stammende entwicklungsmäßig regulierte Kaliumkanal könnte entscheidende Rollen bei der Modulation der synaptischen Übertragung und elektrischen Erregbarkeit im Gehirn spielen. Die Modulation der Funktion der hier beschriebenen neuen Biomoleküle, z. B. SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 3, und deren Variationen könnte weitreichende Auswirkungen auf kognitive Störungen (z. B. Lernen und Gedächtnis), Verhaltensstörungen (Angstzustände, Depression), psychiatrische Störungen (z. B. manisch-depressive Erkrankungen, Schizophrenie), neurodegenerative Störungen (z. B. Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson) sowie Entwicklungsstörungen (z. B. mentale Retardation) ebenso wie auf Asthma, Migräne, Epilepsie sowie Schlaganfall und Hirntumoren haben. Von besonderem Interesse wäre ihre Rolle bei apoptotischen Mechanismen des Neuronenzelltods bei Morbus Alzheimer.
  • Die Neuropharmakologie eines entwicklungsmäßig regulierten, aus dem menschlichen Gehirn stammenden Kaliumkanals, der spezifisch in Neuronen exprimiert wird, besitzt ein signifikantes Potential für die Diagnose, Untersuchung, Vorbeugung und Behandlung pathophysiologischer Störungen, die durch nichtfunktionsfähige Neuronen vermittelt werden. Die neue Nukleinsäure besitzt ebenso wie vorliegend beschriebene Peptidbiomoleküle einen besonderen Wert insbesondere bei der Identifizierung und Entwicklung von Verbindungen, die die biologische Aktivität des Kaliumkanals in vivo modulieren.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäuresequenzen (SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2) und Aminosäuresequenzen (SEQ ID NO: 3) eines neuen, aus dem menschlichen Gehirn stammenden Kaliumkanals und Variationen davon sowie die Verwendung dieser Sequenzen zur Identifizierung von Verbindungen, die die Aktivität spezialisierter Zellen, vor allem menschlicher Neuronen, modulieren, wie nachfolgend beschrieben.
  • Verbindungen (z. B. kleine Moleküle, Peptide, Analoge, Mimetika), die die biologische Aktivität des vorliegend beschriebenen, aus dem Gehirn stammenden Kaliumkanals modulieren, werden für die Verwendung bei der Behandlung verschiedener Krankheitszustände, einschließlich Schizophrenie, Angstzuständen, Depression, Hirntumoren, Morbus Huntington, Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson, Lou-Gehrig-Krankheit, Schlaganfall, Epilepsie, Gedächtnisabbau, Neurodegeneration, Multipler Sklerose, Psychose, Harninkontinenz, Diabetes, Asthma, Frühgeburt, Bluthochdruck, Herzischämie und Herzrhythmusstörungen, Migränen, Autoimmunkrankheiten, Krebs und Transplantatabstoßungen, in Betracht gezogen.
  • Der neue, aus dem menschlichen Gehirn stammende Kaliumkanal läßt sich zur Erzeugung diagnostischer Antikörper, wie nachfolgend erörtert, verwenden, um abnormale Niveaus des Biomoleküls in vivo nachzuweisen. Daher werden gemäß noch eines weiteren Aspekts der vorliegenden Erfindung Antikörper gegen das Kaliumkanalpolypeptid bereitgestellt, die als Teil verschiedener diagnostischer Tests zum Nachweis physiologischer, vor allem neurophysiologischer, Störungen verwendet werden können.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft einen Screeningtest zur Identifizierung von Molekülen, die eine modulierende Wirkung haben, z. B. Verbindungen, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Agonisten und Antagonisten, und zwar auf die biologische Aktivität des Kaliumkanals, der das aus dem Gehirn stammende Kaliumkanalpolypeptid der vorliegenden Erfindung umfaßt. Ein derartiger Test beinhaltet die Schritte der Bereitstellung eines Expressionssystems, das ein von einer Nukleinsäuresequenz der vorliegenden Erfindung codiertes funktionsfähiges K+-Kanalexpressionsprodukt produziert, des Inkontaktbringens des Expressionssystems oder des Produkts des Expressionssystems mit einem oder mehreren Molekülen zur Bestimmung seiner modulierenden Wirkung auf die Bioaktivität des Produkts sowie der Auswahl eines zur Modulierung der K+-Kanalexpression fähigen Kandidaten aus den Molekülen.
  • Besonders bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind mit einem gereinigten Polynukleotid transformierte Wirtszellen, wobei das Polynukleotid eine für das Polypeptid mit der im wesentlichen wie in der SEQ ID NO: 3 dargestellten Sequenz oder ein biologisch aktives Fragment davon codierende Nukleinsäuresequenz umfaßt. Zellen dieses Typs oder daraus hergestellte Präparationen können zum Screening auf pharmakolgisch aktive Modulatoren der neuen Kaliumkanalaktivität unter Verwendung von im Fachgebiet allgemein bekannten Verfahren verwendet werden. Siehe z. B. US-Patent Nr. 5,397,702 , Assay For and Treatment of Autoimmune Diseases, erteilt am 14. März 1995; US-Patent Nr. 5,637,470 , Screening array using cells expressing recombinant alpha and beta subunits of the mammalian large-conductance (maxi-K) potassium channel, erteilt am 10. Juni 1997; US-Patent Nr. 5,607,843 , Nucleid Acid Sequence Encoding Apamin Binding Protein, erteilt am 4. März 1997; veröffentlichte internationale PCT-Anmeldung WO9603415A1 Human Potassium Channel; und US-Patent Nr. 5,602,169 , 3-substituted oxindole derivatives as potassium channel modulators, erteilt am 11. Februar 1997.
  • Solche Modulatoren eignen sich potentiell bei der Behandlung einer Krankheit, die durch nichtfunktionsfähige spezialisierte Zellen, insbesondere Neuronen, manifestiert wird, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Schizophrenie, Angstzuständen, Depression, Hirntumoren, Morbus Huntington, Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson, Lou-Gehrig-Krankheit, Schlaganfall, Epilepsie, Gedächtnisabbau, Neurodegeneration, Multipler Sklerose, Psychose, amyotropher Lateralsklerose, Retinitis Pigmentosa, Kleinhirndegeneration, Harninkontinenz, Diabetes, Asthma, Frühgeburt, Bluthochdruck, Herzischämie und Herzrhythmusstörungen, Migränen, Autoimmunkrankheiten, Krebs, Transplantatabstoßungen, akuter und chronischer Entzündung, Allergien, proliferativer Störungen, Anämien, neurodegenerativer Krankheiten mit immunologischen Komponenten, ebenso wie Autoimmunkrankheiten, einschließlich rheumatoider Arthritis, Diabetes mellitus Typ 1, Myasthenia gravis, systemischem Lupus erythematosus, Sjögren-Syndrom, Sharp-Syndrom und experimenteller allergischer Enzephalomyelitis (EAE).
  • Potentielle diagnostische und therapeutische Anwendungen sind für Modulatoren des hier beschriebenen menschlichen Kaliumkanalbiomoleküls leicht ersichtlich. Zu bei Krankheiten häufig vorkommenden Bereichen pathophysiologischer Störungen, die des therapeutischen Eingriffs besonders bedürfen, gehören, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, neurophysiologische Störungen, die sich durch nichtfunktionsfähige Neuronen manifestieren.
  • Allgemein akzeptierbare Vektoren
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung können Polynukleotidsequenzen, die für das neue Neuronenkaliumkanalpolypeptid, Fragmente des Polypeptids, Fusionsproteine oder funktionelle Äquivalente davon codieren, in rekombinanten DNA-Molekülen, die die Expression des Neuronenbiomoleküls in entsprechenden Wirtszellen steuern, verwendet werden. Aufgrund der innewohnenden Degeneriertheit des genetischen Codes können andere DNA-Sequenzen, die weitgehend für die gleiche oder eine funktionsmäßig äquivalente Aminosäuresequenz codieren, zur Klonierung und Expression des neuen Neuronenbiomoleküls verwendet werden. Wie dem Fachmann ersichtlich ist, kann es vorteilhaft sein, neue Kaliumkanal-codierende Nukleotidsequenzen mit nichtnatürlich vorkommenden Codons herzustellen.
  • Ebenso können für eine effiziente Translation einer Kaliumkanalnukleinsäuresequenz spezifische Startsignale erforderlich sein. Zu diesen Signalen gehören das ATG-Startcodon und benachbarte Sequenzen. Falls die neue neuronale Nukleinsäuresequenz, z. B. SEQ ID NO: 2, ihr Startcodon und stromaufwärts liegende Sequenzen in den entsprechenden Expressionsvektor inseriert werden, sind weitere Translationskontrollsignale nicht unbedingt notwendig. Wird allerdings lediglich codierende Sequenz oder ein Teil davon inseriert, so müssen exogene Transkriptionskontrollsignale, einschließlich des ATG-Startcodons, bereitgestellt werden. Weiterhin muß das Startcodon im korrekten Leseraster vorliegen, um die Transkription der gesamten Insertion zu gewährleisten. Exogene Transkriptionselemente und Startcodons können aus verschiedenen Quellen stammen, die sowohl natürlich als auch synthetisch sein können.
  • Nukleinsäuresequenzen, z. B. SEQ ID NO: 2, können zur Herstellung eines biologisch aktiven neuronalen Kaliumkanalbiomoleküls rekombinant exprimiert werden, indem sie durch molekulare Klonierung in einen Expressionsvektor mit einem geeigneten Promotor und anderen entsprechenden Transkriptionsregulationselementen eingeführt und zur Herstellung des neuen Polypeptids in prokaryontische oder eukaryontische Wirtszellen überführt werden. Techniken für derartige Manipulationen sind beispielsweise vollständig bei Sambrook, J., et al., Molecular Cloning Second Edition, Cold Spring Harbor Press (1990) beschrieben und im Fachgebiet allgemein bekannt.
  • Expressionsvektoren werden hier als DNA-Sequenzen für die Transkription klonierter Kopien von Genen und die Translation ihrer mRNAs in eine entsprechende Wirtszelle beschrieben. Derartige Vektoren lassen sich zur Expression von Nukleinsäuresequenzen in verschiedenen Wirten, wie beispielsweise Bakterien, blaugrünen Algen, Pflanzenzellen, Insektenzellen, Pilzzellen, menschlichen und tierischen Zellen, verwenden. Spezifisch konstruierte Vektoren gestatten das Shuttling [Hin- und Herschicken] von DNA zwischen Wirten, wie beispielsweise Bakterien-Hefe oder Bakterien-Tierzellen oder Bakterien-Pilzzellen oder Bakterien-Invertebratenzellen.
  • Verschiedene Säugerexpressionsvektoren können zur Expression des vorliegend offenbarten rekombinanten neuronenspezifischen Moleküls und Variationen davon in Säugerzellen verwendet werden. Zu kommerziell erhältlichen Säugerexpressionsvektoren, die sich für die rekombinante Expression eignen, gehören, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, pcDNA2 (Invitrogen), pMC1neo Stratagene), pXT1 (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBO-pSV2-neo (ATCC 37593 [BPV-1(8-2) (ATCC37110), pdBPV-MMTneo (342-12) (ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198), pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (TCC 37460) und IZD35 (ATCC 37565), pLXIN und pSIR (CLONTECH), pIRES-EGFP (CLONTECH). Die Firma INVITROGEN stellt eine große Vielfalt kommerziell erhältlicher Säugerexpressionsvektorsysteme bereit, die sich auf wirksame Weise bei der vorliegenden Erfindung verwenden lassen. INVITROGEN, Carlsbad, CA. Siehe auch Produkte, Vektoren und Systeme der Firma PHARMINGEN, San Diego, CA.
  • Ebenso können bei der vorliegenden Erfindung Baculovirus-Expressionssysteme eingesetzt werden, um hohe Ausbeuten biologisch aktiven Proteins zu produzieren. Dabei sind Vektoren, wie beispielsweise das BacPakTM Baculovirus-Expressionssystem der Firma CLONTECH, und Vorschriften bevorzugt, die kommerziell erhältlich sind. CLONTECH, Palo Alto, CA. Miller, L. K., et al., Curr. Op. Genet. Dev. 3: 97 (1993); O'Reilly, D. R., et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, 127. Ebenso sind Vektoren, wie beispielsweise das MaxBacTM Baculovirus-Expressionssystem der Firma INVITROGEN, Insektenzellen und Vorschriften bevorzugt, die kommerziell erhältlich sind. INVITROGEN, Carlsbad, CA. Siehe BEISPIEL VI.
  • BEISPIELWIRTSZELLEN
  • Mit einer Nukleotidsequenz, die für ein Kaliumkanalmolekül der vorliegenden Erfindung codiert, transformierte Wirtszellen können unter für die Expression und die Gewinnung des codierten Proteins aus der Zellkultur geeigneten Bedingungen kultiviert werden. Besonders bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind dabei mit einem gereinigten Polynukleotid, das eine für das Polypeptid mit der weitgehend wie in der SEQ ID NO: 3 dargestellten Sequenz oder ein biologisch aktives Fragment davon codierende Nukleinsäuresequenz umfaßt, transformierte Wirtszellen. Zellen dieses Typs oder Präparationen davon können zum Screening auf pharmakologisch aktive Modulatoren der biologischen Aktivität des Kaliumkanals verwendet werden. Auf diese Weise identifizierte Modulatoren werden für die Regulation der Neurophysiologie, wie hier definiert, verwendet.
  • Eukaryontische rekombinante Wirtszellen sind ganz besonders bevorzugt, wie anderweitig hier beschrieben, oder sind dem Fachmann allgemein bekannt. Dazu gehören beispielsweise, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Hefe, Säugerzellen, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, aus dem Menschen, Rind, Schwein, Affen und Nager stammender Zellinien, sowie Insektenzellinien, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, aus Drosophila und Seidenraupen stammender Zellinien. Zu den aus Säugerspezies stammenden Zellinien, die geeignet sein können und die kommerziell erhältlich sind, gehören, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, L-Zellen L-M(TK-) (ATCC CCL 1.3), L-Zellen L-M (ATCC CCL 1.2), 293 (ATCC CRL 1573), Raji (ATCC CCL 86), CV-1 (ATCC CCL 70), COS-1 (ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), CHO-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 920, NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C1271 (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26 und MRC-5 (ATCC CCL 171).
  • STRATAGENE, hNT Neurons, menschliche Neuronen sind für die Transfektion, die Untersuchung von Ionenkanalgenen und für das Wirkstoff-Screening kommerziell erhältlich, LaJolla, CA. Pleasure, S. J., et al., J. Neuroscience, 12: 1802 (1992); J. Neuroscience, 35: 585 (1993); Hiraka, G., et al., J. Virol., 65: 2732 (1991); Wertkin, R., et al., PNAS, 90: 9513 (1993); Younkin, D. P., et al., PNAS, 90: 2174 (1993).
  • Der Expressionsvektor kann in Wirtszellen, die das neue neuronale Kaliumkanalpolypeptid exprimieren, über eine beliebige aus einer Reihe von Techniken, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Transformation, Transfektion, Lipofektion, Protoplastenfusion und Elektroporation, eingeführt werden. Kommerziell erhältliche Kits, die sich für die Verwendung mit der vorliegenden Erfindung zur heterologen Expression anwenden lassen, einschließlich gut charakterisierter Vektoren, Transfektionsreagenzien und Bedingungen, sowie Zellkulturmaterialien sind allgemein etabliert und leicht verfügbar. CLONTECH, Palo Alto, CA; INVITROGEN, Carlsbad, CA; PHARMINGEN, San Diege, CA; STRATAGENE, LaJolla, CA. Die expressionsvektorhaltigen Zellen werden klonal vermehrt und einzeln analysiert, um das Niveau der Produktion des neuen Neuronenkaliumkanalbiomoleküls zu bestimmen. Die Wirtszellklone, die das Polypeptid exprimieren, können mit mehreren Mitteln identifiziert werden, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, immunologischer Reaktivität mit vorliegend beschriebenen Antikörpern und/oder des Vorliegens Wirtszellen-assoziierter spezifischer Kaliumkanalaktivität und/oder der Fähigkeit zur kovalenten Quervernetzung von spezifischem Substrat an das neuronale Polypeptid mit dem bifunktionellen Quervernetzungsreagenz Disuccinimidylsuberat oder ähnlichen Quervernetzungsreagenzien.
  • Das Neuronenbiomolekül der vorliegenden Erfindung kann auch als rekombinantes Protein mit einer oder mehreren zusätzlichen Polypeptiddomänen, die zur Erleichterung der Proteinreinigung hinzugefügt wurden, exprimiert werden. Zu derartigen, die Reinigung erleichternden Domänen gehören, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, metallkomplexierende Peptide, wie beispielsweise Histidin-Tryptophan-Module, die die Reinigung an immobilisierten Metallen gestatten (Porath, J., Protein Exp. Purif. 3: 263 (1992)), Protein-A-Domänen, die die Reinigung an immobilisiertem Immunglobulin gestatten, sowie die im FLAGS-Extensions/Affinitätsreinigungssystem (Immunex Corp, Seattle WA) benutzte Domäne. Der Einschluß einer spaltbaren Linker-Sequenz, wie beispielsweise Faktor XA oder Enterokinase (Invitrogen, San Diego, CA) zwischen der Reinigungsdomäne und dem Kaliumkanal-codierenden Bereich, ist sinnvoll, um die Reinigung zu erleichtern.
  • Systeme, wie etwa der nichtdenaturierende Proteinreinigungskit TALONTM der Firma CLONTECH zur Aufreinigung von Proteinen mit 6 × His-Tag unter nativen Bedingungen, sowie Vorschriften, die kommerziell erhältlich sind, sind bevorzugt. CLONTECH, Palo Alto, CA.
  • Darüber hinaus kann ein Wirtszellenstamm aufgrund seiner Fähigkeit zur Modulation der Expression der inserierten Sequenzen oder zur Prozessierung des exprimierten Proteins in der gewünschten Weise gewählt werden. Zu derartigen Modifikationen des Polypeptids gehören, jedoch ohne darauf beschränkt zu sein, Acetylierung, Carboxylierung, Glycosylierung, Phosphorylierung, Lipidierung und Acylierung. Posttranslationale Prozessierung, bei der eine naszierende Form des Proteins gespalten wird, kann ebenso für die korrekte Insertion, Faltung und/oder Funktion von Wichtigkeit sein. Unterschiedliche Wirtszellen, wie beispielsweise CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38, NIH-3T3, HEK293 usw., besitzen spezifische Zellapparate und charakteristische Mechanismen für derartige posttranslationale Aktivitäten und können gewählt werden, um die korrekte Modifikation und Prozessierung des eingeführten Fremdproteins sicherzustellen.
  • Für die Langzeitproduktion rekombinanter Proteine mit hoher Ausbeute ist die stabile Expression bevorzugt. Beispielsweise können Zellinien, die das neue Kaliumkanalpolypeptid stabil exprimieren, mit Expressionsvektoren transformiert sein, die virale Replikationsursprünge oder endogene Expressionselemente sowie ein selektionierbares Markergen enthalten. Nach Einführung des Vektors kann man die Zellen 1–2 Tage in einem angereicherten Medium wachsen lassen, bevor auf das Selektionsmedium gewechselt wird. Der Zweck selektionierbaren Markers besteht im Verleihen von Resistenz gegenüber Selektion, wobei sein Vorhandensein das Wachstum und die Gewinnung von Zellen gestattet, die die eingeführten Sequenzen erfolgreich exprimieren. Resistente Zusammenballungen stabil transformierter Zellen lassen sich unter Verwendung von für den Zelltyp geeigneten Gewebekulturtechniken vermehren.
  • Das vorliegend beschriebene menschliche Neuronenbiomolekül kann in der Hefe S. cerevisiae produziert werden, nachdem das optimale cDNA-Cistron in zur Steuerung der intrazellulären oder extrazellulären Expression des heterologen Proteins konstruierte Expressionsvektoren inseriert wurde. Im Falle der intrazellulären Expression werden Vektoren, wie beispielsweise EmBLyex4 oder dergleichen, mit dem Cistron der Beta-Untereinheit ligiert. Siehe z. B. Rinas, U., et al., Biotechnology, 8: 543 (1990); Horowitz, B., et al., J. Biol. Chem., 265: 4189 (1989). Zur extrazellulären Expression wird ein Kaliumkanal-codierender Bereich, z. B. SEQ ID NO: 2, in Hefeexpressionsvektoren ligiert, bei denen eines aus einer Reihe gut charakterisierter Sekretionssignale eingesetzt werden kann. Die Niveaus des exprimierten Kaliumkanalmoleküls werden mit den hier beschriebenen Testverfahren bestimmt.
  • Im Fachgebiet sind verschiedene Vorschriften zum Nachweis und Messen der Expression des neuen Kaliumkanals bekannt, wobei entweder polyklonale oder monoklonale Antikörper, die spezifisch für das Protein sind, verwendet werden. Hierzu gehören beispielsweise der ELISA-Test (Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay), RIA-Test (Radioimmunoassay) und FACS-Test (Fluorescent Activated Cell Sorting). Dabei kann ein auf der Nutzung monoklonaler Antikörper, die gegen zwei einander nicht störende Epitope reaktiv sind, beruhender „Two-Site"-Immuntest eingesetzt werden. Ebenso können allgemein bekannte kompetivive Bindungstechniken eingesetzt werden. Siehe z. B. Hampton, R., et al. (1990), Serological Methods – a Laboratory Manual, APS Press, St Paul Minn., Maddox, D. E., et al., J. Exp. Med. 158: 1211.
  • In-vitro-Synthese von mRNA mit Cap
  • Die Vollängen-cDNA (SEQ ID NO: 1) kann zum Beispiel in Standardverfahrensweisen zur Synthese biologisch aktiver mRNA für die funktionelle Expression in heterologen Zellen, beispielsweise in Xenopus oocytes, oder in verschiedenen Typen von Säugerzellen, einschließlich menschlichen Neuronen, eingesetzt werden. Siehe z. B. Goldin A, Methods Enzymol, 207: 279 (1992); STRATAGENE, hNT Neurons, commercially available for the study of ion channel genes, La Jolla, CA.
  • Der codierende Bereich für den hier beschriebenen neuen Kaliumkanal (z. B. ein Bereich, der SEQ ID NO: 2 umfaßt), der für das Polypeptid mit einer weitgehend wie in der SEQ ID NO: 3 dargestellten bioaktiven Sequenz oder ein biologisch aktives Fragment davon codiert, kann 3' beispielsweise zu einem bakteriophagen Promoter, z. B. einem SP6-, T7- oder T3-Promoter, kloniert werden. Als Vektoren, die mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind beispielsweise die PGEM-Vektoren der Firma Promega, Madison, WI bevorzugt. Ganz besonders bevorzugt sind im Fachgebiet bekannte Standardvektoren, wie etwa pSP64T oder pBSTA, die die Stabilität der Message verbessern und die spezifische Expression in Xenopus oocytes erhöhen. Kreig und Melton, Nucleic Acids Res., 12: 7057 (1984). Diese besonders bevorzugten Vektoren enthalten die das 5'-Ende flankierenden 5'- und 3'-nichttranslatierten Xenopus-Beta-Globin-mRNA-Bereiche sowie einen Poly-A-Schwanz am 3'-Ende des Gens.
  • Ein Plasmidvektor-DNA-Konstrukt, das eine Insertion enthält, die für den hier beschriebenen neuen Kaliumkanal oder ein biologisch aktives Fragment davon codiert (z. B. SEQ ID NO: 1 oder ein die SEQ ID NO: 2 umfassender Bereich oder eine verkürzte Version davon), kann dann mit einem Restriktionsenzym geschnitten werden, so daß das Konstrukt 3' zum codierenden Strukturbereich linearisiert wird. Der linearisierte Vektor sollte für die Verwendung als Trans kriptionsmatrize mit Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol extrahiert, mit Ethanol präzipitiert und in RNase-freiem Wasser resuspendiert werden. Die Transkriptionsreaktion kann beispielsweise wie unten beschrieben durchgeführt werden, um biologisch aktive mRNA für die anschließende in-vivo- oder in-vitro-Translation mit im Fachgebiet allgemein bekannten Verfahren zu synthetisieren. Ganz besonders bevorzugt für die Synthese biologisch aktiver mRNA ist der mMessage mMachineTM-Kit der Firma AMBION, Austin, TX.
  • Als Alternative können die mRNA-Transkripte als Sonden für die Analyse der Gewebeverteilung mittels Northern-Analysen und/oder RNase-Protection-Assays verwendet werden. mRNA-Synthese
    PGEM, Promega, Madison, WI
    10 × SP6/T7-Puffer 5 μl
    10 × ATP, CTP, UTP (jeweils 5 mM) 5 μl
    10 × GTP (5 mM) 2 μl
    10 × GpppG (Cap; 5 mM) 5 μl
    DTT (1 M) 0,5 μl
    Rnase-Inhibitor (40U/μl) 1,25 μl
    Wasser 27 μl
    Linearisierte DNA (1 μg/μl) 1-5 μl
    SP6- oder T7-Polymerase (20U/μl) 1–3 μl
    GESAMTREAKTIONSVOLUMEN 50 μl
  • 1–2 Stunden bei 37 Grad inkubieren. Zum Abbau von Matrizen-DNA 1 μl RNase-freie DNase zugeben. 10 Minuten verdauen. 75 μl Wasser zugeben. Mit Phenol/CHCl3 extrahieren. RNA mit Ethanol fällen. In Portionen bei –70 Grad aufbewahren.
  • Funktionelle Expression
  • Biologisch aktive mRNA läßt sich für funktionelle Expression und Analysen mit im Fachgebiet allgemein bekannten Verfahren in heterologe Zellen einführen. So kann beispielsweise synthetische mRNA aus oben beschriebenen Beispielkonstrukten in Xenopus oocytes für funktionelle Expression und Analysen injiziert werden. Goldin, A., Methods Enxyml, 207: 266, (1992). Heterologe Kaliumkanäle können unter Verwendung von Zwei-Elektroden-„Voltage Clamp"-Standardtechniken untersucht werden. Siehe z. B. Stuhmer, W., Methods in Enzymol., 207: 319, (1992); Kohler, et al., Science, 273: 1708 (1996). Kaliumkonzentrationen in der Zelle können beispielsweise durch Zugabe eines Kaliumionophors, Coexpression mit einem Rezeptor, der einen Anstieg von intrazellulärem Kalium verursacht, verändert werden. Als Alternative können Kaliumkonzentrationen durch Umstülpen von Stückchen („Patches") und die Veränderung von Kaliumkonzentrationen im Badmedium verändert werden. Z. B. Grissmer, S., et al., Calcium-activated Potassium Channels in Resting and Activated Human T Lymphocytes, J. Gen. Physiol, 102: 601 (1993). Ebenso können biophysikalische Standardparameter, wie etwa Aktivierung, Kaliumabhängigkeit, Ein-Kanal-Leitfähigkeit, Inaktivierung, Schweifströme, Kaliumselektivität, sowie die genaue Pharmakologie verschiedener K-Kanalblocker, einschließlich TEA, Apamin und anderen, getestet werden. Grissmer, S., et al., Calcium-activated Potassium Channels in Resting and Activated Human T Lymphocytes, J. Gen. Physiol., 102: 601 (1993).
  • Als Alternative läßt sich cRNA (synthetische mRNA von einem cDNA-Konstrukt) in heterologe Säugerzellen, beispielsweise RBL-Zellen (ATCC # CRL 1378) und 293-Zellen (ATCC # CRL 1573), einführen und kann mit Standardverfahren des Standes der Technik transformiert werden. So kann beispielsweise das Eppendorf-Mikroinjektionssystem verwendet werden (Micromanipulator 5171 und Transjector 5242). Transformierte Zellen können auf K+-Ströme etwa 4 Stunden später unter Verwendung von „Patch-Clamp"-Techniken, die gut dokumentiert sind, analysiert werden. Z. B. Ikeda, et al., Pfueg. Arch. Eur. J. Physiol., 422: 201 (1992), Grissmer, et al., J. Gen. Physiol., 102: 601 (1993).
  • Überexpression des neuen Kanals in Zellinien
  • Für die Expression des neuen Kaliumkanals auf hohem Niveau werden transiente und/oder stabile eukaryontische Transfektantenzellen, die den bzw. die vorliegende beschriebenen codierenden Bereich bzw. Bereiche enthalten, in Betracht gezogen.
  • Bei eukaryontischen Transfektanten handelt es sich um bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung für den Einsatz in pharmakologischen Zielbindungsuntersuchungen zur Identifizierung von Molekülen, die den hier beschriebenen neuen Kanal in vivo blockieren. Dabei sind HEK-Zellen besonders bevorzugt.
  • Die transiente Expression codierender Bereiche des neuen Kanals läßt sich über direkte Transfektion in Säugerzellen mit Standardtechniken erreichen. Omari, K. et al., J. Physiol., 499: 369, (1997); Panyi, G., et al., J. Gen. Physiol., 107(3): 409 (1996). Eine transiente Expression auf hohem Niveau kann unter Verwendung viraler Standardsysteme, z. B. Baculovirus, Adenovirus oder Vacciniavirus, erreicht werden. Die sich aus diesen Systemen ergebende Kanalanzahl liegt typischerweise bei 5–500 K pro Zelle. Kamb, A., Methods Enzymol. 207: 423 (1992); Sun, T. et al., Biochemistry, 33(33): 9992 (1994); Spencer, R. H., et al., J. Biol. Chem., 272: 2389 (1997).
  • Die stabile Transfektion heterologer Zellen mit Sequenzen, die für den hier beschriebenen neuen Kaliumkanal codieren (SEQ ID NO: 3), oder biologisch aktiven Variationen oder Fragmenten davon läßt sich beispielsweise unter Verwendung von NIH-3t3-, L929-, COS-, HEK- oder CHO-Zellen bewerkstelligen. Siehe z. B. EMBO, 11 (6): 2003 (1992); Grissmer, et al., Mol. Pharm., 45: 1227 (1994).
  • Ein bevorzugter Vektor zur Verwendung mit der vorliegenden Erfindung ist pcDNA/Neo, der von der Firma INVITROGEN, Carlsbad, CA kommerziell erhältlich ist.
  • Zellen, beispielsweise NIH-3t3, werden in 60 mm-Platten bis zu 50% Konfluenz wachsen gelassen (Medien und Bedingungen entsprechen den Anforderungen der jeweiligen Zellinie) und mit 5 μg reiner DNA, die einen codierenden Bereich für den neuen Kaliumkanal, z. B. SEQ ID NO: 2, in pCDNA/Neo enthält, unter Verwendung des Reagenz Lipofection, wie von der Zulieferfirma beschrieben (LIFE TECHNOLOGIES Gibco BRL, Bethesda, MD), transfiziert. Nach der Transfektion werden die Zellen bei 37°C und den Bedingungen 3 Tage in Medium mit 10% FCS inkubiert. Die Zellen werden trypsinisiert, in 100 mm-Schalen ausgesät und anschließend mit 300 μg/ml G418 (Neomycin) selektioniert. Dabei wachsen lediglich Zellen, die eine stabile Integration des heterologen codierenden Bereichs aufweisen, in Gegenwart von G418, was durch das Neomycinresistenz-Gen im Plasmid vermittelt wird. Isolierte Klone werden weiteren 2 bis 3 Runden Aufreinigung ausgesetzt und anschließend einer „Patch-Clamp"-Analyse auf K+-Ströme unterzogen.
  • Da das neue Gen, z. B. SEQ ID NO: 1, in ausdifferenzierten Neuronen stark exprimiert wird und da Kaliumkanäle durch bestimmte Liganden, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Tetraethylammoniumchlorid (TEA), 4-Aminopyridin (4-AP, ebenso wie 2-AP und 3-AP), 3,4- und 2,3-Diaminopyridin, BaCl2, ScSl, Strychnin, Phencyclidin, Pyridostigmin, 9-Aminoacridin, DuP-996 (3,3-bis(4-Pyridinylmethyl)-1-phenylindolin-2-on; Linopiridin), Clofilium, Chinidin, Aminochinoline und Chinin, wirkungsvoll blockiert werden, lassen sich verschiedene Zellinien, die die hier beschriebenen, für den neuen Kanal codierenden Strukturbereiche heterolog überexprimieren, in radioaktiv markierten Bindungstests zum Screening auf pharmakologisch aktive Moleküle, die den neuen Kanal blockieren, verwenden, wobei als meßbares Verdrängungselement in einem Bindungstest oder kompetitiven Bindungstest ein radioaktiv markierter Liagand eingesetzt wird. Peptidtoxine, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Stichodactylotoxin, Apamin, Charybdotoxin, Kaliotoxin und Margotoxin, können ebenso als Liganden in den hier beschriebenen Bindungstests eingesetzt werden. Siehe beispielsweise BEISPIEL XI.
  • Ligandenbindungstest für das Screening auf Modulatoren des neuen Kanals mit hohem Durchsatz
  • Zellinien, die den hier beschriebenen, für den calciumaktivierten Kaliumkanal codierenden Bereich (z. B. SEQ ID NO: 1 oder eine biologisch aktive verkürzte Version davon oder eine chimärische Fusion) heterolog überexprimieren, sowie deren Verwendung in Bindungstests zur Identifizierung pharmakologisch aktiver Moleküle, die den neuen Kanal blockieren, stellen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar.
  • So kann beispielsweise ein radioaktiv markierter Bindungstest unter Verwendung eines radioaktiv markierten Liganden verwendet werden, wie bereits von Hill, R. J., Mol. Pharm., 48: 98 (1995) und Deutsch, C., et al., J. Biol. Chem., 266: 3668 (1991) beschrieben. Membranpräparationen von Zellinien, die den hier beschriebenen neuen Kaliumkanal überexprimieren, werden hergestellt, indem die Zellen unter Verwendung eines Polytron-Geräts 25 Sekunden bei 13.000 UpM homogenisiert und bei geringer Geschwindigkeit (100 g) 2 Minuten zentrifugiert werden. Der Überstand wird bei hoher Geschwindigkeit (50.000 g) 10 Minuten zentrifugiert. Das Sediment wird in 1 ml Testpuffer (5 Cl, 10 mM HEPES, 6 mM Glukose, pH 8,4) suspendiert und auf 50 μg/ml verdünnt.
  • In die Vertiefungen einer 96-Loch-Mikrotiterplatte werden jeweils 130 μl Testpuffer ebenso wie 20 μl Testmolekülverbindung (beim Testwirkstoff kann es sich beispielsweise um ein kleines Molekül, Peptid, Analog oder eine mimetische Verbindung handeln)/Kontrolltestpuffer/50 μl nichtspezifische (10 nM kalter Ligand) (nichtmarkierte) Membranen aus Zellen, die den neuen Kaliumkanal überexprimieren, mit 50 μg/ml und 50 μl Radioligand (25 pM; NEN, 2200 Ci/mmol) gegeben und 20 Minuten bei 21°C unter Mischen inkubiert. Der gebundene radioaktiv markierte Ligand wird vom freien radioaktiv markierten Liganden in Lösung durch Filtern über vorher benetzte GF/C Unifilters (Packard Instruments) und schnelles Waschen in eiskaltem Waschpuffer getrennt. Nach dem Trocknen werden die Filterplatten in einem Szintillationsmeßgerät gezählt. Die Daten aus den Sättigungsexperimenten werden einer Scatchard-Analyse und linearer Regression unterzogen. Deutsch, et al., J. Biol. Chem., 266: 3668 (1991). Verbindungen, die mit dem radioaktiv markierten Liganden um die Bindung des neuen Kaliumkanals konkurrieren, werden dadurch identifiziert, daß sie eine Reduzierung der spezifischen Zählwerte verursachen.
  • In einer weiteren Ausführungsform läßt sich ein Speicherbankarray-Test (Szintillation Proximity Assay), bei dem keine Filter benötigt werden, leicht an HTS-(Hight Throughput Screening)-Tests anpassen. Hoffman, R., et al., Anal. Biochem., 20370 (1992)); Kienuis, C. B. M., et al., J. Recept. Res., 12: 389 (1992).
  • 96Rb-(oder 42K-)Ausflußtests in Zellen, die das neue Kaliumkanalpolypeptid heterolog exprimieren
  • Zellen werden in sechs-Loch-Platten in DMEM + 10% FCS bis zur Konfluenz wachsen gelassen. Die Zellen werden über Nacht in einem Inkubator bei 37°C in einer HEPES-Pufferlösung (in mM:NaCl 137, KCl 4,7, MgSO4 0,6, CaCl2 1,8, HEPES 20, Glukose 7,7) mit 86Rb (5 mCi/ml) inkubiert. Nach Beendigung der Inkubation wird 86Rb enthaltendes HEPES abgesaugt und die Zellen werden mit Tracer-freiem HEPES zur Abtrennung von extrazellulären 86Rb gewaschen. Die Zellen werden 3 Minuten mit Tracer-freiem HEPES inkubiert, wobei am Ende der 3 Minuten HEPES abgesaugt und frisches HEPES zu den Zellen gegeben wird. Nachdem die basale Freisetzung von 86Rb einen Steady-State errreicht hat, werden die Zellen HEPES mit einer höheren KCl-Konzentration (20 mM) 6 Minuten (3 min.X2) und anschließend einer weiteren Lösung mit 20 mM KCl und der gewünschten Verbindung 12 Minuten (3 min.X4) ausgesetzt. Nach Beendigung dieses Vorgangs werden 500 ml NaOH in die Vertiefungen gegeben und die Zellen abgekratzt. Die Kontrollzellen werden mit HEPES mit 20 mM KCl und Vehikel (DMSO) 12 min behandelt. Am Ende des Experiments wird die Radioaktivität in den abgesaugten Lösungen sowie den Zellen in einem Gammazähler ausgezählt. Die Ausflußgeschwindigkeitskonstanten (k min–1), die die freigesetzte Radioaktivität pro Minute, ausgedrückt als Prozentanteil der im Gewebe verbleibenden Radioaktivität, repräsentieren, werden berechnet. Die Ergebnisse werden als maximaler Anstieg der Ausflußgeschwindigkeitskonstante in %, erhalten als Unterschied zwischen dem Spitzenanstieg der Geschwindigkeitskonstante und der durchschnittlichen Geschwindigkeitskonstante über 10 Minuten vor Zugeben der Kandidatenverbindung, ausgedrückt. Siehe auch BEISPIEL XII.
  • Als Alternative wird eine Zellinie (z. B.: HEK 293, CHO, COS oder SF9), die eine hier beschriebene neue Nukleinsäuresequenz, z. B. SEQ ID NO: 2 unter Erhalt des biologisch aktiven Peptids SEQ ID NO: 3, heterolog exprimiert, mit 86RbCl (10 mCi/ml) 18 Stunden bei 37 Grad in 5% CO2 inkubiert. Die Zellen werden in niedrig-K+-HBSS-Medium gewaschen und bei 5,5 × 106 Zellen/ml in niedrig-K+-HBSS resuspendiert. 50 μl der Zellsuspension werden 15 Minuten bei Umgebungstemperatur mit 10 μl Kandidatenverbindung in einer Vertiefung einer Multi-Screen-96-Loch-Filtrationsplatte (0,65 μm; Millipore, Nr. MADV-N6550) inkubiert. Anschließend wird der Ansatz 20 Minuten bei der gleichen Temperatur mit 125 μl 140 mM K+-HBSS, das zum Start des Rb-Ausflusses über Membrandepolarisierung zugegegeben wurde, inkubiert und mit einer TV-1-Vakuumtransfer-Absaugeinrichtung (Pall Trinity Micro, Cortland, NY) in 96-Loch-Standardmikrotiterplatten filtriert; 100 μl des Filtrats werden entnommen und eine Minute in einem Flüssigkeitsszintillationszählgerät der Firma Beckman (Palo Alto, CA) gezählt. Verbindungen, die die Kaliumkanalaktivität hemmen, weisen einen reduzierten Rb-Ausfluß auf. Siehe auch Beispiel XII.
  • Plattenlesegerät mit Fluoreszenzabbildung auf Laserbasis (FLIPR)
  • Da der hier beschriebene neue Kaliumkanal alle molekularen Merkmale eines spannungsgesteuerten Kaliumkanals aufweist, stellt ein Fluoreszenztest, bei dem Änderungen des Membranpotentials in das neue Biomolekül funktionell exprimierenden Zellen nachgewiesen werden, ein weiteres Verfahren für das schnelle Screening kleiner Moleküle, die die Kanalaktivität modulieren, dar. Ein solcher Test kann unter Verwendung von Membranpotential wahrnehmenden Fluoreszenzfarbstoffen, wie etwa Bisoxynol, aufgebaut werden. Brauner, et al., Biochimica et Biophysica Acta, 771: 208 (1984). Zum Beispiel werden SEQ ID NO: 2 exprimierende Zellen mit dem Farbstoff und dem Kandidatenverbindungsmodulator inkubiert. Die Membrandepolarisierung wird durch Erhöhen der Kaliumkonzentration außerhalb der Zellen ausgelöst. Normalerweise verteilt sich der Farbstoff bei Wahrnehmung von Depolarisierung in die Membran, was zu einer Fluoreszenzänderung führt. SEQ ID NO: 2 exprimierende Zellen würden sich als Reaktion auf die Depolarisierung unter Ausfluß von Kaliumionen öffnen und zu einer entgegengesetzt wirkenden Hyperpolarisierung und reduzierter Effizienz der Fluoreszenzänderung des Farbstoffs führen. Durch das Vorhandensein von Liganden, und zwar entweder Agonisten oder Antagonisten, des neuen Kaliumkanals würden Fluoreszenzänderungen moduliert, die optisch nachgewiesen werden. Das FLIPR-Gerät ist nun im Handel über die Firma Molecular Devices Inc., Sunnyvale, CA erhältlich und kann an einen sehr schnellen und empfindlichen 96-Loch-Screening-Test angepaßt werden. Siehe BEISPIEL XIII.
  • Verschiedene Screening-Tests
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso Verfahren zum Screening auf Verbindungen, die die biologische Aktivität des neuen Kaliumkanals und/oder die biologische Aktivität von Neuronen in vivo modulieren. Bei den Verbindungen, die diese Aktivitäten modulieren, kann es sich um DNA, RNA, Peptide, Proteine oder nichtproteinartige organische Moleküle handeln. Dabei können die Verbindungen die Aktivität durch Erhöhen oder Abschwächen der Expression von DNA oder RNA, die für den Kaliumkanal codiert, modulieren oder die biologische Aktivität des neuen Kaliumkanals selbst antagonisieren oder agonisieren. Verbindungen, die die Expression von den menschlichen Kaliumkanal codierender DNA oder RNA oder die Funktion des Polypeptids modulieren, können mit einer Vielfalt von Tests nachgewiesen werden. Bei dem Test kann es sich um einen einfachen „Ja/Nein"-Test handeln, um zu bestimmen, ob eine Änderung der Expression oder Funktion vorliegt. Der Test kann als quantitativer Test durchgeführt werden, indem die Expression oder Funktion einer Testprobe mit den Niveaus der Expression oder Funktion in einer Standardprobe verglichen wird.
  • Der vorliegend beschriebene aus dem menschlichen Gehirn stammende Kaliumkanal, seine immunogenen Fragmente oder Oligopeptide lassen sich zum Screening therapeutischer Verbindungen bei einer von verschiedenen Arzneistoff-Screening-Techniken einsetzen. Das in einem solchen Test eingesetzte Fragment kann dabei frei in Lösung, gebunden an einen festen Träger, geträgert auf einer Zelloberfläche oder intrazellulär lokalisiert vorliegen. Man kann das Beseitigen der Aktivität oder die Ausbildung von Bindungskomplexen zwischen dem Kaliumkanalbiomolekül und dem zu testenden Stoff messen. Dementsprechend wird durch die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Screening mehrerer Verbindungen auf eine spezifische Bindungsaffinität mit dem Kaliumkanalpolypeptid oder einem Fragment davon bereitgestellt, wobei man in dem Verfahren mehrere Verbindungen bereitstellt, ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung oder ein Fragment davon mit einer von mehreren Verbindungen jeweils über einen ausreichend langen Zeitraum, der die Bindung unter geeigneten Bedingungen gestattet, kombiniert und die Bindung des Transaktivatormoleküls oder eines Fragments davon an einer der mehreren Verbindungen nachweist, wodurch die Verbindungen, die das aus dem menschlichen Gehirn stammende Biomolekül spezifisch binden, identifiziert werden.
  • Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die die Aktivität eines Kaliumkanalpolypeptids modulieren, sind allgemein bevorzugt, wobei man in diesen Verfahren einen Kandidatenverbindungsmodulator einer biologischen Kaliumkanalaktivität mit einem Polypeptid eines Kaliumkanals mit der weitgehend wie in der SEQ ID NO: 3 dargestellten Sequenz kombiniert und einen Effekt des Kandidatenverbindungsmodulators auf die biologische Aktivität des Kaliumkanals (z. B. physikalische Bindungswechselwirkung, Fähigkeit zum Durchlassen von K+-Ionen, neurophysiologischer Effekt auf Neuronen) mißt.
  • Ein weiteres Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die die biologische Aktivität eines Kaliumkanals modulieren, umfaßt die Kombination eines Kandidatenverbindungsmodulators einer biologischen Kaliumkanalaktivität mit einer Wirtszelle, die ein Kaliumkanalpolypeptid mit der weitgehend wie in der SEQ ID NO: 3 dargestellten Sequenz exprimiert, und das Messen eines Effekts des Kandidatenverbindungsmodulators auf die biologische Aktivität des Kaliumkanals (z. B. physikalische Bindungswechselwirkung, Fähigkeit zum Durchlassen von K+-Ionen, meßbarer biophysikalischer Effekt, neurophysiologischer Effekt auf Neuronen).
  • Ein weiteres bevorzugtes Verfahren besteht in der Identifizierung von Verbindungen, die die Neurophysiologie modulieren, wobei man einen Kandidatenverbindungsmodulator der Neurophysiologie mit einem Polypeptid eines Kaliumkanals mit der weitgehend wie in der SEQ ID NO: 3 dargestellten Sequenz kombiniert und einen Effekt des Kandidatenverbindungsmodulators auf eine biologische Aktivität des Kaliumkanals mißt.
  • Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die die Aktivität eines Kaliumkanals modulieren und/oder die Neurophysiologie modulieren oder regulieren, sind ebenso bevorzugt, wobei man in den Verfahren einen Kandidatenverbindungsmodulator mit einer Wirtszelle, die ein Kaliumkanalpolypeptid mit der weitgehend wie in der SEQ ID NO: 3 dargestellten Sequenz exprimiert (oder zur Expression eines Kaliumkanalpolypeptids z. B. über induzierbare Expression fähig ist), kombiniert und ein Effekt des Kandidatenverbindungsmodulators auf eine biologische Aktivität oder einen physiologischen Effekt des Kaliumkanals mißt. Bevorzugte zelluläre Tests für Modulatoren fallen in zwei allgemeine Kategorien:
    • 1) Direkte Messung der physikalischen biologischen Kaliumkanalaktivität und 2) Messung des physiologischen oder neurophysiologischen Effekts. Bei diesen Verfahren kann der hier beschriebene endogene, aus dem Gehirn stammende Kaliumkanal oder überexprimiertes rekombinantes Kaliumkanalpolypeptid in heterologen Zellen, einschließlich menschlichen Neuronen, eingesetzt werden.
  • Bei der Quelle zur Aufreinigung eines Kaliumkanalpolypeptids zur Messung einer biologischen Bindungsaktivität kann es sich um ein Lysat ganzer Zellen handeln, das mittels eines bis dreier Zyklen aus Einfrieren und Auftauen in Gegenwart von Standardproteaseinhibitoren präpariert wird. Der Kaliumkanal kann teilweise oder vollständig mit Standardverfahren der Proteinreinigung aufgereinigt werden. Die hier beschriebenen Kaliumkanalpolypeptide können Affinitätschromatographie unter Verwendung eines vorliegend beschriebenen spezifischen Antikörpers oder mit für ein Epitop-Tag, das gentechnisch in das ebenfalls hier beschriebene rekombinante Molekül eingebaut wird, spezifischen Liganden aufgereinigt werden. Die Präparation kann dann auf Bindungsaktivität wie beschrieben getestet werden.
  • Gereinigte Polypeptide, die die weitgehend wie in der SEQ ID NO: 3 dargestellte Aminosäuresequenz umfassen, sind ganz besonders bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung.
  • Verbindungen, die allgemein nach hier beschriebenen, zitierten und in Betracht gezogenen Verfahren identifiziert werden und die die Aktivität eines Kaliumkanals modulieren (vorzugsweise die Physiologie, am meisten bevorzugt die Neurophysiologie regulieren), stellen ganz besonders bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar.
  • Bei einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich um ein Verfahren zur Behandlung eines Patienten, der einer solchen Behandlung bedarf, gegen ein Leiden, das von dem hier beschriebenen neuen, aus dem menschlichen Gehirn stammenden Kaliumkanal vermittelt wird, wobei man in dem Verfahren eine therapeutisch wirksame Menge einer mit einem hier beschriebenen Verfahren identifizierten Kaliumkanal modulierenden Verbindung verabreicht.
  • Eine weitere ganz besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung eines Patienten, der einer solchen Behandlung bedarf, gegen ein Leiden, das durch nichtfunktionsfähige Neuronen vermittelt wird, oder eine neurophysiologische Störung, wobei man in dem Verfahren eine therapeutisch wirksame Menge einer mit einem hier beschriebenen Verfahren identifizierten Kaliumkanal modulierenden Verbindung verabreicht.
  • Eine weitere, ganz besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung eines Patienten, der einer solchen Behandlung bedarf, gegen ein Leiden, das über die Neurophysiologie vermittelt wird, wobei man in dem Verfahren eine therapeutisch wirksame Menge eines mit einem hier beschriebenen Verfahren identifizierten Verbindungsmodulators der Neurophysiologie verabreicht.
  • Hefe-2-Hybrid-System
  • In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform kann eine Nukleinsäuresequenz, die für ein weitgehend wie in der SEQ ID NO: 3 dargestelltes Kaliumkanalmolekül oder ein biologisch aktives Fragment davon codiert, an eine heterologe Sequenz zur Codierung eines Fusionsproteins ligiert werden. So kann es beispielsweise für das Screening von Verbindungen auf die Modulation biologischer Aktivität, nachfolgend weiter beschrieben, sinnvoll sein, ein chimäres Kaliumkanalmolekül, wie hier beschrieben, zur Expression in heterologen Wirtszellen zu codieren. Chimäre Konstrukte können auch zur Expression eines „Köders" („Bait") gemäß im Fachgebiet allgemein bekannten Verfahren unter Verwendung eines Hefe-2-Hybrid-Systems verwendet werden, um zusätzliche native Peptide zu identifizieren, die mit dem hier beschriebenen neuen neuronalen Biomolekül assoziiert sein können. Es wurde bereits ein Hefe-2-Hybrid-System beschrieben, wobei sich Protein:Protein-Wechselwirkungen unter Verwendung eines genetischen Tests auf Hefebasis über die Rekonstitution von Trans kriptionsaktivatoren nachweisen lassen. Fields, S., et al., Trends Genet., 10: 286 (1994); Allen, J. B., et al., TIBS, 20: 511 (1995). Dabei machte sich das 2-Hybrid-System die Fähigkeit eines Paars wechselwirkender Proteine zunutze, eine Transkriptionsaktivierungsdomäne in enge Nachbarschaft zu einer DNA-Bindungsstelle zu bringen, die die Expression eines unmittelbar benachbarten Reportergens reguliert. Bei der vorliegenden Erfindung können kommerziell erhältliche Systeme, wie etwa die MatchmakerTM-Systeme der Firma CLONTECH, und Vorschriften eingesetzt werden. CLONTECH, Palo Alto CA.
  • Siehe auch Mendelsohn, A. R., Brent, R., Curr. Op. Biotech., 5: 482 (1994); Phizicky. E. M., Fields, S., Microbiological Rev., 59(1): 94 (1995); Yang, M., et al., Nucleic Acids Res., 23(7): 1152 (1995); Fields, S., Stemglanz, R., TIG, 10(8): 286 (1994); sowie US-Patente 5,283,173 , System to Detect Protein-Protein Interactions, und 5,468,614 .
  • Beispielsweise lassen sich modifizierte Screening-Systeme entweder mit einem positiven Readout oder mit einem negativen Readout praktisch durchführen, wie etwa die in den kürzlich entwickelten Versionen des „Reverse Y2H"-Ansatzes. Siehe z. B. Vidal M, Braun P, Chen E, Boeke JD, Harlow E (1996) Genetic characterization of a mammalian Protein-Protein interaction domain by using a yeast reverse two-hybrid system, Proc Natl Acad Sci U S A 17; 93(19): 10321–10326; Vidal M, Brachmann RK, Fattaey A, Harlow E, Boeke JD (1996) Reverse two-hybrid and one-hybrid systems to detect dissociation of Protein-Protein and DNA-Protein interactions. Proc Natl Acad Sci U S A 17; 93(19): 10315–10320; White MA (1996) The yeast two-hybrid system: forward and reverse, Proc Natl Acad Sci U S A 17;93(19): 10001–10003; Leanna CA, Hannink M (1996), The reverse two-hybrid system: a genetic scheme for selection against specific Protein/Protein interactions, Nucleic Acids Res 1;24(17): 3341–3347.
  • Antikörper
  • Monospezifische Antikörper gegen das neuronale Biomolekül der vorliegenden Erfindung werden aus Säugerantiseren, die gegen das Polypeptid reaktive Antikörper enthalten, aufgereinigt oder als monoklonale Antikörper, die mit einem aus dem menschlichen Gehirn stammenden Kaliumkanalpolypeptid reagieren, unter Verwendung der Technik nach Kohler und Milstein, Nature, 256: 495 (1975) präpariert. Monospezifische Antikörper, wie hier verwendet, bedeutet eine einzelne Antikörperspezies oder mehrere Antikörperspezies mit homogener Bindungscharakteristik für den neuen, aus dem menschlichen Gehirn stammenden Kaliumkanal. Homogene Bindung, wie hier verwendet, bezieht sich auf die Fähigkeit der Antikörperspezies, an ein spezifisches Antigen oder Epitop, wie etwa solchen, die mit dem neuen Transkriptionsaktivator assoziiert sind, wie beschrieben zu binden. Für den menschlichen neuronalen Kaliumkanal spezifische Antikörper werden produziert, indem Tiere, wie etwa Mäuse, Ratten, Meerschweinchen, Kaninchen, Ziegen, Pferde und dergleichen, wobei Kaninchen bevorzugt sind, mit einer entsprechenden Konzentration des menschlichen neuronalen Kaliumkanals entweder mit oder ohne einem Immunadjuvanz immunisiert werden.
  • Vor der ersten Immunisierung wird das Präimmunserum gesammelt. Jedes Tier erhält zwischen etwa 0,1 mg und etwa 1000 mg neuronales Kaliumkanalpolypeptid, das mit einem unbedenklichen Immunadjuvanz assoziiert ist. Zu solchen unbedenklichen Adjuvanzien gehören, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, komplettes Freundsches Adjuvanz, inkomplettes Freundsches Adjuvanz, Alum-Präzipitat, Wasser-in-Öl-Emulsion mit Corynebacterium parvum und tRNA. Die erste Immunisierung erfolgt mit einem neuronalen Kaliumkanalpolypeptid in vorzugsweise komplettem Freundschem Adjuvanz an mehreren Stellen entweder subkutan (SC), intraperitoneal (IP) oder sowohl SC als auch IP. Jedes Tier wird in regelmäßigen Zeitabständen, vorzugsweise wöchentlich, ausgeblutet, um den Antikörpertiter zu bestimmen. Nach der ersten Immunisierung können die Tiere Auffrischinjektionen erhalten oder nicht. Denjenigen Tieren, die Auffrischinjektionen erhalten, wird im allgemeinen eine gleiche Menge des Antigens in inkomplettem Freundschem Adjuvanz auf dem gleichen Weg verabreicht. Auffrischinjektionen werden in Zeitabständen von etwa 3 Wochen gegeben, bis maximale Titer erhalten werden. Etwa 7 Tage nach jeder Auffrischimmunisierung oder etwa wöchentlich nach einer Einzelimmunisierung werden die Tiere ausgeblutet, das Serum gesammelt und Portionen bei etwa –20°C gelagert.
  • Monoklonale Antikörper (mAb), die mit dem aus dem Gehirn stammenden Kaliumkanalpolypeptid reagieren, werden durch Immunisieren von Inzuchtmäusen, vorzugsweise Balb/c, mit einem Kaliumkanalpolypeptid hergestellt. Dabei werden die Mäuse über den IP- oder SC-Weg mit etwa 0,1 mg bis etwa 10 mg, vorzugsweise etwa 1 mg, des neuen neuronalen Kaliumkanalpolypeptids in etwa 0,5 ml Puffer oder Kochsalzlösung, enthalten in einem gleichen Volumen eines unbedenklichen Adjuvanz, wie oben erörtert, immunisiert. Dabei ist komplettes Freundsches Adjuvanz bevorzugt. Die Mäuse erhalten eine erste Immunisierung an Tag 0 und erholen sich danach etwa 3 bis etwa 30 Wochen lang. Immunisierten Mäusen werden eine oder mehrere Auffrischimmunisierungen von etwa 0,1 bis etwa 10 mg neuronalem Kaliumkanalpolypeptid in einer Pufferlösung, wie etwa phosphatgepufferter Kochsalzlösung, über den intravenösen (IV-)Weg gegeben. Lymphozyten aus antikörperpositiven Mäusen, vorzugsweise Milzlymphozyten, werden gewonnen, indem man die Milz aus immunisierten Mäusen mit im Fachgebiet bekannten Standardverfahrensweisen entfernt. Hybridomzellen werden produziert, indem man die Milzlymphozyten mit einem geeigneten Fusionspartner, vorzugsweise Myelomzellen, unter Bedingungen mischt, die die Ausbildung stabiler Hybridomen gestatten. Zu möglichen Fusionspartnern zählen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Mausmyelome P3/NS1/Ag 4-1; PMC-11; S-194 und Sp 2/0, wobei Sp 2/0 bevorzugt ist. Die Antikörper produzierenden Zellen und Myelomzellen werden in Polyeethylenglycol mit einem Molekulargewicht von etwa 1000 bei Konzentrationen von etwa 30% bis etwa 50% fusioniert. Fusionierte Hybridomzellen werden durch Wachstum in mit Hypoxanthin, Thymidin und Aminopterin supplementiertem DMEM (Dulbecco's modified Eagles Medium) mit im Fachgebiet bekannten Verfahrensweisen selektioniert. Überstandsflüssigkeiten werden aus wachstumspositiven Vertiefungen etwa am Tag 14, 18 und 21 gesammelt und einem Screening auf Antikörperproduktion mit einem Immuntest, wie etwa dem SPIRA-Test (Solid Phase Immunoradio Assay) unter Verwendung des menschlichen neuronalen Kaliumkanalpolypeptids als Antigen unterzogen. Die Kulturflüssigkeiten werden ebenso im Ouchterlony-Präzipitationstest getestet, um den Isotyp des aAb zu bestimmen. Hybridomzellen aus antikörperpositiven Vertiefungen werden mit einer Technik, wie etwa der Soft-Agar-Technik von Kruse und Paterson, Hrsg., Academic Press, 1973, kloniert.
  • Monoklonale Antikörper werden in vivo durch Injektion von mit ungefähr 0,5 ml Pristan pro Maus geprimten Balp/c-Mäusen mit etwa 2 × 106 bis etwa 6 × 106 Hybridomzellen etwa 4 Tage nach dem Priming produziert. Ascitesflüssigkeit wird ungefähr 8–12 Tage nach dem Zelltransfer gesammelt, und die monoklonalen Antikörper werden mit im Fachgebiet bekannten Techniken aufgereinigt.
  • Die in-vitro-Produktion des gegen das menschliche neuronale Kaliumkanalpolypeptid gerichteten mAb wird durchgeführt, indem man die Hybridome in DMEM mit etwa 2% fötalem Kälberserum wachsen läßt, so daß man ausreichende Mengen des spezifischen mAb erhält. Die mAb werden mit im Fachgebiet bekannten Techniken aufgereinigt.
  • Diagnostische Tests
  • Antikörpertiter von Ascites- oder Hybridomkulturflüssigkeiten werden mit verschiedenen serologischen oder immunologischen Tests bestimmt, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Präzipitation, passiver Agglutinierung, der ELISA-(Enzyme-Linked Immunoabsorbent Antibody)-Technik und RIA(Radioimmunoassay)-Techniken. Ähnliche diagnostische Tests werden zum Nachweis des Vorhandenseins des neuen Kaliumkanalbiomoleküls in Körperflüssigkeiten oder Gewebe- und Zellextrakten verwendet.
  • Diagnostische Tests unter Verwendung von für das menschliche Neuronenkaliumkanalpolypeptid spezifischen Antikörpern eignen sich für die Diagnose von Leiden, Störungen oder Krankheiten, die durch abnormale Expression des Kaliumkanals oder Expression von mit abnormalem Zellwachstum oder abnormalem Neurophysiologie assoziierten Genen gekennzeichnet sind. Zu den diagnostischen Tests für das neurale Biomolekül der vorliegenden Erfindung gehören Verfahren, bei denen der Antikörper und eine Markierung zum Nachweis des menschlichen Kaliumkanalpolypeptids in menschlichen Körperflüssigkeiten, Zellen, Geweben oder Schnitten oder Extrakten solcher Gewebe genutzt werden. Dabei können die Polypeptide und Antikörper der vorliegenden Erfindung mit oder ohne Modifikationen verwendet werden. Häufig werden die Polypeptide und Antikörper markiert, indem sie entweder kovalent oder nichtkovalent mit einem Reportermolekül, das dem Fachmann in unzähligen Varianten allgemein bekannt ist, verbunden werden.
  • Im Fachgebiet ist eine Vielzahl von Vorschriften zur Messung des Kaliumkanalpolypeptids bekannt, wobei entweder polyklonale oder monoklonale Antikörper, die für das jeweilige Protein spezifisch sind, verwendet werden. Dazu gehören beispielsweise der ELISA-Test (Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay), RIA-Test (Radioimmunoassay) und der FACS-Test (Fluorescent Activated Cell Sorting). Ein zwei-Stellen-Immuntest, der auf der Nutzung monoklonaler Antikörper, die gegenüber zwei einander nicht störenden Epitopen des menschlichen, aus dem Gehirn stammenden Kaliumkanalpolypeptids reagieren, beruht, ist zwar bevorzugt, doch kann auch ein kompetitiver Bindungstest eingesetzt werden. Diese Tests sind unter anderem bei Maddox, D. E. et al., J. Exp. Med. 158: 1211 (1983); Sites, D. P., et al., Basic and Clinical Immunology, Kap. 22, 4. Aufl., Lange Medical Publications, Los Altos, CA (1982); US-Patenten Nr. 3,654,090 , Nr. 3,850,752 und Nr. 4,016,043 beschrieben.
  • Um eine Grundlage für die Diagnose einer Krankheit zu schaffen, müssen Normal- bzw. Standardwerte für die Expression des menschlichen Kaliumkanalpolypeptids festgelegt werden. Dies wird dadurch bewerkstelligt, daß man Körperflüssigkeiten oder Zellextrakte, die normalen Individuen, bei denen es sich entweder um Tiere oder Menschen handeln kann, entnommen wurden, mit Antikörper gegen das menschliche Neuronenkanalbiomolekül unter Bedingungen, die sich für die Komplexbildung eignen und die im Fachgebiet allgemein bekannt sind, kombiniert. Die gebildete Menge an Standardkomplex kann quantifiziert werden, indem man sie mit einer Verdünnungsreihe positiver Kontrollen vergleicht, wobei eine bekannte Menge an Antikörper mit bekannten Konzentrationen des aufgereinigten Kaliumkanalpolypeptids kombiniert wird. Anschließend können aus Normalproben erhaltene Standardwerte mit Werten, die aus Proben von Individuen, die möglicherweise von einer Störung oder Krankheit im Zusammenhang mit der Kanalbiomolekülexpression betroffen sind, erhalten wurden, verglichen werden. Das Vorliegen des Krankheitszustands wird durch die Abweichung zwischen Standardwert und den Werten des Individuums bestätigt.
  • Es können Kits hergestellt werden, die die Kaliumkanalnukleinsäure, Antikörper gegen ein Kanalpolypeptid oder Protein enthalten. Derartige Kits werden zum Nachweis heterologer Nukleinsäure, die an Kaliumkanalnukleinsäure hybridisiert, oder zum Nachweis des Vorhandenseins von Protein- oder Peptidfragmenten in einer Probe verwendet. Eine derartige Charakterisierung eignet sich für verschiedenartige Zwecke, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, forensische Analysen und epidemologische Untersuchungen.
  • Die DNA-Moleküle, RNA-Moleküle, das rekombinante Protein sowie Antikörper der vorliegenden Erfindung können zum Screening und Messen von Konzentrationen der neuen Kaliumkanal-DNA, -RNA oder des neuen Kaliumkanalproteins verwendet werden. Die rekombinanten Proteine, DNA-Moleküle, RNA-Moleküle und Antiköper bieten sich für die Formulierung von zum Nachweis und zur Typisierung des neuen menschlichen Kaliumkanalbiomoleküls geeigneten Kits an. Ein solcher Kit würde einen kompartimentalisierten Träger umfassen, der geeignet ist, wenigstens einen Behälter auf eng begrenztem Raum zu halten. Der Träger würde ferner Reagenzien umfassen, wie etwa rekombinanten Kaliumkanal oder Anti-Kaliumkanal-Antikörper, die sich zum Nachweis des neuen Kaliumkanalbiomoleküls eignen. Der Träger kann ebenso ein Nachweismittel, wie beispielsweise ein markiertes Antigen oder Enzymsubstrate oder dergleichen, enthalten.
  • Polynukleotidsequenzen, die für den neuen Kaliumkanal codieren, können für die Diagnose von Leiden oder Krankheiten verwendet werden, mit denen die Expression des neuen neurophysiologischen Biomoleküls assoziiert ist. So können beispielsweise für einen Kaliumkanal codierende Polynukleotidsequenzen bei der Hybridisierung oder PCR-Tests von Flüssigkeiten oder Geweben aus Biopsien zum Nachweis der Expression des Biomoleküls verwendet werden. Dabei kann die Form solcher qualitativen oder quantitativen Verfahren Southern- oder Nothern-Analyse, Dot-Blot oder andere Technologien auf Membranbasis, PCR-Techniken, Tauchstab-(Dip Stick), Pin-, Chip- und ELISA-Techniken umfassen. Alle diese Techniken sind im Fachgebiet allgemein bekannt und bilden die Grundlage für viele kommerziell erhältliche diagnostische Kits. Derartige Tests können auch zur Beurteilung der Wirksamkeit eines bestimmten therapeutischen Behandlungsregimes in Untersuchungen mit Tieren, klinischen Testreihen oder bei der Überwachung der Behandlung eines individuellen Patienten verwendet werden. Sobald eine Krankheit etabliert ist, wird ein Therapeutikum verabreicht und ein Behandlungsprofil erzeugt. Solche Tests können regelmäßig wiederholt werden, um zu beurteilen, ob die Werte im Profil sich auf das normale bzw. Standardmuster hinbewegen oder dahin zurückkehren. Nacheinander erstellte Behandlungsprofile können verwendet werden, um die Wirksamkeit der Behandlung über einen Zeitraum von mehreren Tagen oder mehreren Monaten zu zeigen.
  • Polynukleotidsequenzen, die für den neuen menschlichen Kaliumkanal codieren, können ebenso in Analysen zur Kartierung chromosomaler Orte eingesetzt werden, z. B. zum Screening auf die funktionelle Assoziation mit Krankheitsmarkern. Zudem werden die hier beschriebenen Sequenzen für die Verwendung zur Identifizierung menschlicher Sequenzpolymorphismen und einer möglichen Assoziation mit einer Krankheit ebenso wie Analysen zur Auswahl einer optimalen Sequenz aus möglichen polymorphen Sequenzen für die Konstruktion von Verbindungen zur Modulierung der biologischen Aktivität und damit Regulation physiologischer Störungen, am stärksten bevorzugt neurophysiologischer Störungen in vivo, in Betracht gezogen. Weiterhin werden die Sequenzen als Screening-Werkzeuge zur Verwendung bei der Identifizierung geeigneter menschlicher Versuchspersonen und Patienten für klinische Therapieversuchsreihen in Betracht gezogen.
  • Aufreinigung über Affinitätssäulen
  • Dem Fachmann ist leicht ersichtlich, daß Verfahren zur Herstellung von Antikörpern für die Produktion von für Kaliumkanalpolypeptidfragmente oder das naszierende menschliche Kaliumkanalpolypeptid in voller Länge spezifischen Antikörpern genutzt werden können. Insbesondere ist dem Fachman leicht ersichtlich, daß Antikörper erzeugt werden können, die für das voll funktionsfähige Biomolekül oder Fragmente davon spezifisch sind.
  • Kaliumkanalpolypeptid-Antikörperaffinitätssäulen werden hergestellt, indem die Antikörper auf Affigel-10 (Biorad), einem Gelträger, der mit N-Hydroxysuccinimidestern aktiviert ist, so daß die Antikörper kovalente Verknüpfungen mit dem Aggarosegelkügelchenträger eingehen, gegeben werden. Die Antikörper werden dann an das Gel über Amidbindungen mit dem Spacer-Arm gekoppelt. Die restlichen aktivierten Ester werden dann mit 1 M-Ethanolamin-HCl (pH 8) gequencht. Die Säule wird mit Wasser und anschließend mit 0,23 M Glycin-HCl (pH 2,6) gewaschen, um eventuell vorhandenen nichtkonjugierten Antikörper oder überschüssiges Protein abzutrennen. Anschließend wird die Säule in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH 7,3) mit entsprechendem Detergenz äquilibriert, und die Zellkulturüberstände oder Zellextrakte, die beispielsweise menschliches Kaliumkanalpolypeptid enthalten und unter Verwendung entsprechender membranauflösender Detergenzien hergestellt wurden, werden langsam über die Säule gegeben. Die Säule wird dann mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung/Detergenz gewaschen, bis die optische Dichte auf den Hintergrundwert fällt, wonach das Protein mit 0,23 M Glycin-HCl (pH 2,6)/Detergenz eluiert wird. Das gereinigte Kaliumkanalpolypeptid wird anschließend gegen phosphatgepufferte Kochsalzlösung/Detergenz dialysiert.
  • Rekombinante Kaliumkanalmoleküle lassen sich von anderen Zellproteinen unter Verwendung einer Immunaffinitätssäule, die mit für das naszierende menschliche Kaliumkanalpolypeptid voller Länge oder Polypeptidfragmente des Biomoleküls spezifischen monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern hergestellt wurde, trennen.
  • Die hier beschriebenen Kaliumkanalpolypeptide können zur Affinitätsreinigung biologischer Effektoren aus nativen biologischen Materialien, z. B. Krankheitsgewebe, verwendet werden. Affinitätschromatographietechniken sind dem Fachmann allgemein bekannt. Ein vorliegend beschriebenes Kaliumkanalpeptid oder ein wirksames Fragment davon wird an eine feste Matrix, z. B. CNBr-aktivierte Sepharose, nach der Vorschrift der Zulieferfirma (Pharmacia, Piscataway, NJ), fixiert und eine homogenisierte/gepufferte zelluläre Lösung, die ein potentielles interessierendes Molekül enthält, wird über die Säule gegeben. Nach dem Waschen bleibt auf der Säule lediglich der biologische Effektor zurück, der anschließend, z. B. mit 0,5 M Essigsäure oder einem NaCl-Gradienten, eluiert wird.
  • Antisense-Moleküle
  • Die hier bereitgestellte cDNA-Sequenz SEQ ID NO: 1 kann in einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform zur Untersuchung der physiologischen Relevanz des neuen Kaliumkanals in Zellen verwendet werden, indem die Expression des endogenen Gens durch Verwendung von Antisense-Konstrukten ausgeschaltet wird.
  • Um Verfahren zur Herunterregulierung der Expression des neuen Kaliumkanals der vorliegenden Erfindung in Säugerzellen zu ermöglichen, kann ein Beispiel-Antisense-Expressionskonstrukt, das die Komplement-DNA-Sequenz zu der weitgehend wie in der SEQ ID NO: 2 dargestellten Sequenz enthält, leicht konstruiert werden, beispielsweise unter Verwendung des Vektors pREP10 (Invitrogen Corporation). Man erwartet dabei, daß Transkripte die Translation der Wildtyp-Kaliumkanal-mRNA in mit dieser Art von Konstrukt transfizierten Zellen hemmen. Antisense-Transkripte sind bei der Hemmung der Translation des nativen Gentranskripts wirksam und in der Lage, die hier beschriebenen Effekte (z. B. Regulation neurophysiologischer Störungen) zu induzieren. Die Translation wird am wirksamsten durch Blockieren der mRNA an einer Stelle am oder in der Nähe des Startcodons gehemmt. Somit sind zum entsprechenden 5'-terminalen Bereich des Kaliumkanal-mRNA-Transkrips komplementäre Oligonukleotide bevorzugt. In diesem Bereich liegt nur eine minimale Sekundär- oder Tertiärstruktur vor, die die Hybridisierung stören könnte. Zudem können Sequenzen, die in 3'-Richtung zu weit von der Startstelle entfernt sind, weniger wirksam bei der Hybridisierung der mRNA-Transkripte sein, und zwar aufgrund eines „Read-Through"-Phänomens, wodurch das Ribosom den Antisense/Sense-Duplex aufzulösen scheint, um die Translation der Message zu gestatten. Oligonukleotide, die zu einem beliebigen Anteil der neuen Kaliumkanal-mRNA komplementär sind und damit hybridisieren können, werden für die therapeutische Verwendung in Betracht gezogen.
  • Verfahren zur Identifizierung von Oligonukleotidsequenzen, die in-vivo-Aktivität zeigen, sind ausführlich in dem US-Patent Nr. 5,639,595 , Identification of Novel Drugs and Reagents, erteilt am 17. Juni 1997, beschrieben. Dabei werden Expressionsvektoren, die von bereits bekannten Polynukleotiden abgeleitete Oligonukleotidzufallssequenzen enthalten, in Zellen transformiert. Die Zellen werden dann auf einen Phänotyp getestet, der sich aus der gewünschten Aktivität des Oligonukleotids ergibt. Nachdem Zellen mit dem gewünschten Phänotyp identifiziert wurden, läßt sich die Sequenz des Oligonukleotids mit der gewünschten Aktivität identifizieren. Die Identifizierung läßt sich bewerkstelligen, indem der Vektor isoliert wird oder eine Amplifikation mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) durchgeführt wird und der das inserierte Nukleinsäurematerial enthaltende Bereich sequenziert wird.
  • Nukleotidsequenzen, die zu der das neue Kaliumkanalpolypeptid codierende Polynukleotidsequenz komplementär sind, können für die Antisense-Therapie synthetisiert werden. Bei diesen Antisense-Molekülen kann es sich um DNA, stabile Derivate von DNA, wie z. B. Phosphorothioate oder Methylphosphonate, RNA, stabile Derivate von RNA, wie z. B. 2'-O-Alkyl-RNA oder andere Oligonukleotidmimetika handeln. US-Patent-Nr. 5,652,355 , Hybrid Oligonucleotide Phosphorothioates, erteilt am 29. Juli 1997, und US-Patent Nr. 5,652,356 , Inverted Chimeric and Hybrid Oligonucleotides, erteilt am 29. Juli 1997, beschreiben die Synthese und Wirkung physiologisch stabiler Antisense-Moleküle. Kaliumkanal-Antisense-Moleküle können in Zellen durch Mikroinjektion, Liposomenverkapselung oder durch Expression von die Antisense-Sequenz tragenden Vektoren eingeführt werden. Die Antisense-Therapie kann besonders für die Behandlung von Krankheiten, bei denen es vorteilhaft ist, die biologische Aktivität des hier beschriebenen Kaliumkanals zu modulieren, sinnvoll sein.
  • Gentherapie
  • Ein hier beschriebenes Kaliumkanalpolypeptid kann einem Individuum über Gentherapie verabreicht werden. Dabei kann ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung Zellen von Zielorganen auf diese Weise zugeführt werden. Umgekehrt kann eine Kaliumkanalpolypeptid-Antisense-Gentherapie verwendet werden, um die Expression des Polypeptids in den Zellen von Zielorganen zu modulieren und somit die biologische Aktivität zu regulieren. Der für das Kaliumkanalpolypeptid codierende Bereich läßt sich in virale Vektoren ligieren, die die Übertragung der Transaktivatorpolypeptid-Nukleinsäure über die Infektion von Empfängerwirtszellen vermitteln. Zu geeigneten viralen Vektoren gehören Retrovirus, Adenovirus, Adeno-assoziiertes Virus, Herpesvirus, Vacciniavirus, Poliovirus und dergleichen. Siehe z. B.
  • US-Patent Nr. 5,624,820 , Episomal Expression Vector for Human Gene Therapy, erteilt am 29. April 1997.
  • Codierende Nukleinsäurebereiche der vorliegenden Erfindung werden in wirksame eukaryontische Expressionsvektoren eingebaut, die entweder direkt verabreicht oder zur Gentherapie in somatische Zellen eingeführt werden (ein einen codierenden Bereich, vorzugsweise mRNA-Transkripte, umfassendes Nukleinsäurefragment kann ebenso direkt verabreicht oder in somatische Zellen eingeführt werden). Siehe z. B. US-Patent Nr. 5,589,466 , erteilt am 31. Dez. 1996. Derartige Nukleinsäuren und Vektoren können episomal bleiben oder in die chromosomale Wirts-DNA in Form eines Provirus oder eines Teils davon, der die Genfusion und entsprechende eukaryontische Transkriptions- und Translationssignale, d. h. einen wirksam positionierten RNA-Polymerase-Promotor 5' zur Transkriptionsstartstelle und dem ATG-Translationsstartcodon der Genfusion ebenso wie Terminationscodon(s) sowie Transkriptspolyadenylierungssignale, die wirksam 3' zum codierenden Bereich positioniert sind, enthält, eingebaut sein. Als Alternative kann die neue Kaliumkanalpolypeptid-DNA zur Gentherapie mit nichtviralen Techniken, einschließlich rezeptorvermitteltem gezieltem DNA-Transfer unter Verwendung von Ligand-DNA-Konjugaten oder Adenovirus-Ligand-DNA-Konjugaten, Lipofektionmembranfusion oder direkter Mikroinjektion, in Zellen übertragen werden. Diese Verfahrensweisen und Variationen davon eignen sich für die Gentherapie am Menschen sowohl ex vivo als auch in vivo gemäß etablierten Verfahren auf diesem Gebiet.
  • PCR-Diagnostik
  • Die Nukleinsäuresequenz, Oligonukleotide, Fragmente, Teile oder Antisense-Moleküle davon können in diagnostischen Tests von Körperflüssigkeiten oder durch Biopsie erhaltenen Geweben verwendet werden, um das Expressionsniveau des neuen, aus dem menschlichen Gehirn stammenden Kaliumkanalmoleküls nachzuweisen. So können beispielsweise von der cDNA-Sequenz SEQ ID NO: konstruierte Sequenzen oder in der SEQ ID NO: 2 enthaltene Sequenzen zum Nachweis des Vorhandenseins der mRNA-Transkripte in einem Patienten oder zur Überwachung der Modulation von Transkripten während der Behandlung verwendet werden.
  • Ein Verfahren zur Amplifikation von Zielnukleinsäuren oder zur späteren Analyse mit Hybridisierungstests ist als Polymerasekettenreaktion („PCR") bzw. PCR-Technik bekannt. Die PCR-Technik läßt sich zum Nachweis von erfindungsgemäßen Sequenzen in verdächtigen Proben anwenden, wobei Oligonukleotidprimer verwendet werden, die voneinander räumlich getrennt sind und auf der genetischen Sequenz, z. B. SEQ ID NO: 1, wie hier angegeben, beruhen. Die Primer sind zu gegenüberliegenden Strängen eines Doppelstrang-DNA-Moleküls komplementär und typischerweise durch etwa 50 bis 55 Nukleotide oder mehr (üblicherweise nicht mehr als 2000 Nukleotide) voneinander getrennt. Bei diesem Verfahren werden die spezifischen Oligonukleotidprimer hergestellt und danach wiederholte Zyklen aus Ziel-DNA-Denaturierung, Primerbindung und Verlängerung mit einer DNA-Polymerase durchgeführt, so daß DNA-Fragmente der auf dem Abstand der Primer beruhenden erwarteten Länge erhalten werden. Bei einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung handelt es sich um eine diagnostische Zusammensetzung zur Identifzierung einer die weitgehend wie in der SEQ ID NO: 2 dargestellte Sequenz umfassenden Polynukleotidsequenz, wobei die Zusammensetzung die weitgehend wie in BEISPIEL II dargestellten PCR-Primer umfaßt. Das Ausmaß der Amplifikation einer Zielsequenz wird über die Anzahl der durchgeführten Zyklen kontrolliert und theoretisch über die einfache Formel 2n, worin n gleich der Zyklusanzahl ist, berechnet. Siehe z. B. Perkin Elmer, PCR Bibliography, Roche Molecular Systems, Branchburg, New Jersey; CLONTECH Products, Palo Alto, CA; US-Patent Nr. 5,629,158 , Solid Phase Diagnosis of Medical Conditions, erteilt am 13. Mai 1997.
  • Zusammensetzungen
  • Pharmazeutisch geeignete Zusammensetzungen, die Sequenzen in Verbindung mit den neuen Kaliumkanalpolypeptid-, -DNA-, -RNA-, -Antisense-Sequenzen oder das menschliche Polypeptid selbst oder Varianten und Analoge, die biologische Aktivität aufweisen, oder anderweitige Verbindungen, die die Zellphysiologie modulieren und mit hier beschriebenen Verfahren identifiziert wurden, umfassen, können gemäß bekannten Verfahren, wie beispielsweise durch Beimischen eines pharmazeutisch unbedenklichen Trägers formuliert werden. Beispiele für solche Träger und Formulierungsverfahren finden sich in Remington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co., Easton, PA). Um eine für die wirksame Verabreichung geeignete pharmazeutisch unbedenkliche Zusammensetzung zu bilden, enthalten derartige Zusammensetzungen eine wirksame Menge des Proteins, der DNA, der RNA oder des Verbindungsmodulators.
  • Erfindungsgemäße therapeutische oder diagnostische Zusammensetzungen werden einem Individuum in ausreichenden Mengen zur Behandlung oder Diagnose menschlicher physiologischer Störungen oder neurophysiologischer Störungen verabreicht. Dabei kann die wirksame Menge entsprechend einer Vielfalt von Faktoren, wie beispielsweise dem Zustand, Gewicht, Geschlecht und Alter des Individuums, variieren. Zu weiteren Faktoren zählt die Art der Verabreichung.
  • Der Ausdruck „chemisches Derivat" beschreibt ein Molekül, das zusätzliche chemische Gruppierungen enthält, die normalerweise nicht Teil des Grundmoleküls sind. Derartige Gruppierungen können die Löslichkeit, Halbwertszeit, Absorption usw. des Grundmoleküls verbessern. Alternativ können die Gruppierungen unerwünschte Nebenwirkungen des Grundmoleküls abschwächen oder die Toxizität des Grundmoleküls verringern. Beispiele für solche Gruppierungen sind in verschiedenen Texten beschrieben, wie beispielsweise Remington's Pharmaceutical Sciences.
  • Zu für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeigneten pharmazeutischen Zusammensetzungen gehören Zusammensetzungen, bei denen die wirksamen Bestandteile in einer wirksamen Menge enthalten sind, um den beabsichtigten Zweck zu erfüllen. Die Bestimmung einer wirksamen Dosis liegt ohne Zweifel im Bereich des fachmännischen Könnens. Die therapeutisch wirksame Dosis läßt sich zunächst entweder in Zellkulturtests, z. B. von neoplastischen Zellen, oder in Tiermodellen, üblicherweise Mäusen, Kaninchen, Hunden oder Schweinen, bestimmen. Das Tiermodell wird ebenso verwendet, um einen gewünschten Konzentrationsbereich und den gewünschten Verabreichungsweg zu erhalten. Derartige Informationen können dann zur Bestimmung geeigneter Dosierungen und Verabreichungswege beim Menschen verwendet werden. Eine therapeutisch wirksame Dosis bezieht sich dabei auf diejenige Menge an Protein oder dessen Antikörpern, Antagonisten oder Inhibitoren, die die Symptome oder das Leiden lindert. Die genaue Dosierung wird vom jeweiligen Arzt im Hinblick auf den zu behandelnden Patienten gewählt.
  • Nach den hier offenbarten Verfahren identifizierte Verbindungen können allein in entsprechenden durch routinemäßiges Testen definierten Dosierungen verwendet werden, um eine optimale Modulierung einer biologischen Kaliumkanalaktivität und/oder einer physiologischen Bedingung oder dessen Aktivität bei Minimierung jeglicher potentieller Toxizität zu erreichen. Darüber hinaus kann die gleichzeitige Verabreichung oder nacheinanderfolgende Verabreichung anderer Agenzien wünschenswert sein.
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können dem Individuum über verschiedene Wege, wie etwa subkutan, topical, oral und intramuskulär, zugeführt werden. Pharmazeutische Zusammensetzungen werden oral oder parenteral verabreicht. Zu Verfahren der parenteralen Zuführung gehören die topische, intraarterielle (direkt in das Gewebe), intramuskuläre, subkutane, intramedulläre, intrathekale, intraventrikuläre, intravenöse, intraperitoneale oder intranasale Verabreichung. Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist auch die Bereitstellung geeigneter topischer, oraler, systemischer und parenteraler pharmazeutischer Forumlierungen zur Verwendung bei dem neuen Behandlungsverfahren der vorliegenden Erfindung. Die gemäß der vorliegenden Erfindung als wirksamer Bestandteil zur Verwendung bei der Modulation physiologischer Bedingungen identifizierte Verbindungen enthaltenden Zusammensetzungen können in vielen verschiedenen therapeutischen Dosierungsformen in herkömmlichen Vehikeln zur Verabreichung verabreicht werden. So lassen sich die Verbindungen beispielsweise in solchen oralen Dosierungsformen wie Tabletten, Kapseln (jeweils einschließlich Formulierungen mit protrahierter Freigabe und langfristiger Freigabe), Pillen, Pulvern, Granulaten, Elixieren, Tinkturen, Lösungen, Supsensionen, Sirupen und Emulsionen, oder durch Injektion verabreichen. Gleichfalls können sie auch in intravenöser (sowohl Bolus als auch Infusion), intraperitonealer, subkutaner, topischer, mit oder ohne Okklusion, oder intramuskulärer Form verabreicht werden, wobei alle verwendeten Formen dem Durchschnittsfachmann auf dem pharmazeutischen Gebiet allgemein bekannt sind. Eine wirksame, jedoch nicht toxische Menge der gewünschten Verbindung läßt sich als kaliumkanalmodulierendes Agens einsetzen.
  • Die tägliche Dosierung der Produkte kann über einen weiten Bereich von 0,01 bis 1000 mg pro erwachsenen Menschen/pro Tag variiert werden. Für die orale Verabreichung werden die Zusammensetzungen vorzugsweise in Form von Tabletten mit oder ohne Bruchrille mit 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 10,0, 15,0, 25,0, und 50,0 Milligramm des wirksamen Inhaltsstoffs für die symptomatische Einstellung der Dosierung auf den zu behandelnden Patienten bereitgestellt. Eine wirksame Menge des Arzneistoffs wird gewöhnlicherweise auf einem Dosierungsniveau von etwa 0,001 mg/kg bis etwa 100 mg/kg Körpergewicht pro Tag zugeführt. Insbesondere liegt der Bereich zwischen etwa 0,01 mg/kg und 10 mg/kg Körpergewicht pro Tag. Ganz besonders variiert der Bereich von etwa 0,05 bis etwa 1 mg/kg. Natürlich variiert das Dosierungsniveau je nach der Potency der jeweiligen Verbindung. Bestimmte Verbindungen sind stärker wirksam als andere. Darüber hinaus hängt das Dosierungsniveau von der Bioverfügbarkeit der Verbindung ab. Je höher die Bioverfügbarkeit und Potency der Verbindung, desto weniger Verbindung wird für die Verabreichung über einen beliebigen Zuführungsweg, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, der oralen Zuführung, benötigt. Bei einer Kombination der Kaliumkanalmodulatoren werden die Dosierungen so eingestellt, daß die gewünschten Effekte erzielt werden. Andererseits können Dosierungen dieser verschiedenen Agenzien unabhängig optimiert und kombiniert werden, um ein synergistisches Ergebnis zu erzielen, wobei der Krankheitszustand stärker reduziert wird, als wenn die Agenzien jeweils allein verwendet würden. Vom Fachmann werden andere Formulierungen für Nukleotide als für Proteine oder deren Inhibitoren eingesetzt. Analog ist die Zuführung von Polynukleotiden oder Polypeptiden spezifisch für bestimmte Zellen und Bedingungen.
  • Beispiel 1
  • Identifizierung von Vollängen-cDNA
  • Die cDNA SEQ ID NO: 1 wurde in einer ersten Datenbanksuche nach neuen KvQT-Kanälen identifiziert. Die Teilsequenz von hKvLQT1, Genbank-Zugangsnummer U40990, wurde in einer tblastn-Suche gegen eine firmeneigene Datenbank zur Identifizierung einer homologen Nukleinsäuresequenz verwendet, die anschließend durch Durchsuchung einer öffentlich zugänglichen (Public Domain) Datenbank verwendet wurde, wobei der Merck-WashU-Klon yn72gl1 (Genbank-Zugangsnummer H23701) identifiziert wurde. Bei der Gewebequelle für den Merck-WashU-Klon handelte es sich um eine Bibliothek von menschlichem Gehirn. Das Gewebe wurde 17 Stunden nach dem Tod eines 55 Jahre alten Mannes, der an einem rupturierten Aneurysma der Aorta gestorben war, erhalten. Die Ausgangs-RNA wurde aus einer Sammlung von Hirngeweben, einschließlich dem frontalen, parietalen, temporalen und okkipitalen Kortex aus der linken und der rechten Hirnhälfte, subkortikaler weißer Substanz, basalen Ganglien, Thalamus, Zerebellum, Mittelhirn, Pons und Markhirn, hergestellt. Die cDNA-Synthese wurde mit einem NotI-Oligo(dT)-Primer gestartet. Doppelstrang-cDNA wurde nach Größe selektioniert, an EcoRI-Adaptoren (Pharmacia) ligiert, mit NotI verdaut und in die NotI- und EcoRI-Stellen eines modifizierten pT7T3-Vektors (Pharmacia) kloniert. Die Bibliothek wurde von Bento Soares konstruiert und durchlief zwei Normierungsrunden. Soares, B., et al., PNAS, 91: 9228 (1994). Vollängeninformation wurde unter Verwendung von 5'- und 3'-RACE-PCR-Techniken (schnelle Amplifikation von cDNA-Enden) aus der cDNA-Bibliothek des menschlichen Gehirns erhalten. Schaefer, Anal. Biochem. 227, 227: 255 (1995).
  • Beispiel 2
  • Vollängen-Klonierung
  • Das 3'-Ende der hier beschriebenen neuen cDNA-Sequenz wurde von 0,25 ng Human Brain, Whole Marathon Ready cDNATM (Clontech, Palo Alto, CA; Kat.-Nr. 7400-1) in einem 50 ml-Reaktionsansatz unter Verwendung von AdvantageTM KlenTaq DNA Polymerase Mix (Clontech Kat.-Nr. 8417-1) nach den Empfehlungen des Herstellers amplifiziert. Bei Marathon Ready cDNATM handelt es sich um eine doppelsträngige, Adaptor-ligierte cDNA, die bei der RACE-Technik (Rapid Amplification of cDNA Ends) verwendet wird. Die Primersatzsequenzen sind 5' AACCTCTCGCGCACAGACCTGCA 3' (Vorwärts, entspricht Basenpositionen 1058–1080 der SEQ ID NO: 1) und 5' CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC 3' (Rückwärts, entspricht dem cDNA-Adaptor, siehe Benutzerhandbuch, Clontech Kat.-Nr. PT1156-1). Die Zyklusparameter entsprachen dem Benutzerhandbuch, Programm 1 (in Kürze: Touchdown-PCR mit Verlängerungsreaktionen von 4 min). Ein 5 ml-Aliquot wurde in einem 50 ml-Reaktionsansatz unter Verwendung des AdvantageTM KlenTaq DNA Polymerase Mix nach den Empfehlungen des Herstellers nochmals amplifiziert. Die Primersequenzen sind: 5' CTCCACGTGGCAGTACTACGAGC 3' (Vorwärts, entspricht Basenpositionen 1081–1103 der SEQ ID NO: 1) und 5' ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC 3' (Rückwärts, entspricht dem cDNA-Adaptor, siehe Benutzerhandbuch). Die Zyklusparameter entsprachen dem Benutzerhandbuch, Programm 1 (in Kürze: Touchdown-PCR mit Verlängerungsreaktionen von 4 min). Ein Aliquot der PCR wurde auf einem 1% Aggarose/1 × TAE-Gel mit EtBr (0,5 μg/ml) gefahren. Ein Produkt von ungefähr 1,2 kb wurde ausgeschnitten und mit dem QIAGEN-Gel-Extraction Kit (QIAGEN, Santa Clarita, CA; Kat.-Nr. 28704) isoliert. Das Geleluat wurde in den pT7BlueT-Vector unter Verwendung des Regular pT7BlueT-Vectors Kit plus Ligase (Novagen, Madison, WI; Kat.-Nr. 69836-1) ligiert, und NovaBlue-Zellen wurden mit dem Ligationsansatz nach den Empfehlungen des Herstellers transformiert. 4 Kolonien wurden sequenziert, und ein Primer wurde zur nochmaligen Amplifikation des RACE-Produkts von 0,5 ng Human Brain, Whole Marathon Ready cDNATM sowie zur Bestätigung der RACE-Sequenzierungsdaten konstruiert. AdvantageTM KlenTaq DNA Polymerase Mix wurde in einem 50 ml-Reaktionsansatz nach den Empfehlungen des Herstellers verwendet. Dieser Ansatz enthielt DMSO in einer Endkonzentration von 5%. Die Zyklusparameter entsprachen dem Benutzerhandbuch, Programm 1 (in Kürze: Touchdown-PCR mit Verlängerungsreaktionen von 4 min). Die Primersatzsequenzen sind 5' AACCTCTCGCGCACAGACCTGCA 3' (Vorwärts, entspricht den Basenpositionen 1058–1080 der SEQ ID NO: 1) und 5' GACCCAAGGCCGCAGGTCCTCACC 3' (Rückwärts, entspricht den Basenpositionen 2998–3030 der SEQ ID NO: 1).
  • Die SEQ ID NO: 1-spezifische Erststrang-cDNA wurde unter Verwendung von 5 mg Human Brain Total RNA (Clontech Kat.-Nr. 64020-1) und des SUPERSCRIPTTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis (Life Technologies, Gaithersburgh, MD; Kat.-Nr. 18089-011) konstruiert. Es wurde der Herstellervorschrift 5.1 gefolgt – First Strand cDNA Synthesis of Transcripts with High GC Content. Verwendete Primersequenz: 5' GACCCAAGGCCGCAGGTCCTCACC 3' (Rückwärts, entspricht den Basenpositionen 2998–3030 der SEQ ID NO: 1). Ein 5 ml-Aliquot wurde in einem 50 ml-Reaktionsansatz unter Verwendung des AdvantageTM KlenTaq DNA Polymerase Mix nach den Empfehlungen des Herstellers amplifiziert. Der Ansatz enthielt DMSO in einer Endkonzentration von 5%. Die Zyklusparameter entsprachen dem Benutzerhandbuch, Programm 1 (in Kürze: Touchdown-PCR mit Verlängerungsreaktionen von 4 min). Primersequenzen:
    5' GCCAGGCACCATGGTGCAGAAGTCG 3' (Vorwärts, entspricht den Basenpositionen 1–25 der SEQ ID NO: 1) und 5' CAAAACCTCGGAGGCACCGTGCTG 3' (Rückwärts, entspricht den Basenpositionen 2614–2637 der SEQ ID NO: 1). Der Reaktionsansatz wurde mit dem QIAGEN PCR Purification Kit (QIAGEN Kat.-Nr. 28104) und in den pCR®II-TOPO-Vektor unter Verwendung des TOPO TA Cloning® Kit Dual Promoter (Invitrogen, Carlsbad, CA; Kat.-Nr. K4600–01) ligiert, und TOP10-Zellen wurden mit dem Ligationsansatz nach den Empfehlungen des Herstellers transformiert. Vier Kolonien wurden für die Insertionssequenzierung in beiden Richtungen mit dem ABI PrismTM 377-Sequenzierautomaten ausgewählt. SEQ ID NO: ergibt sich aus den Sequenzierdaten für diesen codierenden Bereich und den 3'UTR-Daten aus der Sequenzierung des RACE-Produkts.
  • Beispiel 3
  • Haltung von Zellen und Präparation von RNA für die Northern-Analysen-Isolierung von Gliazellen
  • Menschliche fötale Hirngewebe (16 bis 22 Wochen alte Föten) wurden kommerziell von der Anatomic Gift Foundation (Woodbine, GA) erworben. Hirnhälften wurden in gekühlte, sterile, calciumfreie, magnesiumfreie HBSS-Lösung (Hanks Balanced Salt Solution, Nr. 14170-112, Life Technologies/Gibco-BRL, Gaithersburgh, MD) gelegt. Die Hirnhäute wurden mit sterilen Pinzetten entfernt, und das Gewebe zunächst durch wiederholte Triturierung durch sterile Pipetten hindurch dissoziiert. Das Gewebe wurde mit 0,05% Trypsin/0,53 mM EDTA (Nr. 25300-054, Life Technologies/Gibco-BRL, Gaithersburgh, MD) und 0,15 mg/ml DNAsa (Nr. D-5025, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) 45 Minuten unter leichten Schütteln bei 37°C inkubiert. Die Trypsinisierung wurde durch Zugabe von 10% FBS (Fetal Bovine Serum [fötales Rinderserum], Nr. 160001-036, Gibco-BRL/Life Technologies, Gaithersburgh, MD) zu der Suspension gestoppt. Die Zellen wurden dann nacheinander über ein 210 μm- bzw. 149 μm-Polypropylengewebe (Nr. 08-670-188 und Nr. 08-670-189, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) gegeben. Das Filtrat wurde zweimal gewaschen und in Komplettmedium [DMEM (mit hoher Konzentration von Glucose, L-Glutamin und HEPES), Gibco Nr. 12430-054; 100 U-μg/ml Penicilin/Streptomicin, Gibco Nr. 15070-030; 10% FBS, Gibco Nr. 160001-036] resuspendiert. Die Zellen wurden mit einer Dichte von 80 Millionen/75 cm2-Kolben (Nr. 12-565-52, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) ausplattiert. Die Kulturen wurden 2 Wochen bei 37°C, 5% CO2 inkubiert (wobei nach einer Woche in Kultur ein Medienwechsel zur Abtrennung von Zelltrümmern durchgeführt wurde). Die reifen Kulturen bestanden aus Astrozyten, Neuronen, Mikroglia und Oligodendrozyten.
  • Reine Astrozytenkulturen wurden erhalten, indem (schwimmende Mikroglia enthaltendes) Komplettmedium entfernt und die Kulturen dreimal trypsinisiert wurden, wobei Neuronen, Oligodendendrozyten und gebundene Mikroglia auf wirksame Weise abgetrennt wurden. Die Astrozyten wurden im Puffer RLT (QIAGEN) mit 0,01% b-ME (Sigma Kat.-Nr. M7154) innerhalb von 24 Stunden lysiert und bis zur Verwendung bei –80°C eingefroren.
  • IMR-32-Zellen:
  • Menschliche IMR-32-Neuroblastomzellen (ATCC Nr. CCL-127; Rockville, MD, USA) wurden in MEM (Specialty Media Kat.-Nr. SLM-034-13), supplementiert mit 10% hitzeinaktiviertem FBS (JRH Bioscience Kat.-Nr. 12126-78-H) und 2 mM 1-Glutamin (Cellgro Kat.-Nr. 20-005-LI) in einer luftbefeuchteten 5% CO2-Atmosphäre bei 37°C kultiviert. Das Medium wurde zweimal wöchentlich gewechselt. Die Zellen wurden mit 1 mM Dibutyryl-CAMP (Aldrich Kat.-Nr. 85-196-5) und 2,5 μM 5-Bromdesoxyuridin (Sigma B-9285) zu den Kulturen differenziert. Die Zellen wurden im Puffer RLT (QIAGEN) mit 0,01% b-ME (Sigma Kat.-Nr. M7154) lysiert und bis zur Verwendung bei –80°C eingefroren.
  • Lysierte Zellen wurden auf Eis aufgetaut und zur Homogenisierung über einen QIAshredder (QIAGEN Kat.-Nr. 9654) gegeben. Anschließend wurde Gesamt-RNA mit dem RNeasy Mini Kit (QIAGEN Kat.-Nr. 74103) nach den Anweisungen des Herstellers präpariert. Die Konzentration wurde über Absorption bei 260 nm bestimmt.
  • Human Brain, Human Fetal Brain und Rat Brain Total RNA (Clontech Kat.-Nr. 64020-1, 64019-1, 64060-1) wurden zur Verwendung nach den Empfehlungen des Herstellers präzipitiert und resuspendiert. Jeweils 20 μg Gesamt-RNA aus Human Brain, Human Fetal Brain und Rat Brain, Imr-32 (undifferenziert), Imr-32 (ausdifferenziert) zusammen mit 5 mg RNA (Life Technologies Kat.-Nr. 15620-016) auf einem denaturierenden Gel (1% Aggarose/2,2 M Formaldehyd/1 × MOPS) 4,5 Std. bei 50 V gefahren. RNA wurde über Nacht auf eine positiv geladene Nylonmembran (HybondTM N+, Amersham Nr. RPN203B) nach der Vorschrift des Herstellers übertragen. Die RNA wurde unter Verwendung des Stratalinker der Firma Stratagene 40 s mit der Membran UV-quervernetzt.
  • Zwei Mehrfachgewebe-Northern-Blots (Kat.-Nr. 7760-1 und 7759-1) sowie ein Blot mit RNA aus unterschiedlichen Bereichen des menschlichen Gehirns (Kat.-Nr. 7755-1) wurden von der Firma Clontech, Inc. erworben, wobei jede Spur ungefähr 2 mg Poly A+-RNA enthielt.
  • Verwendete Sonden
    • Sonde 1: spezifisch für den neuen, aus dem Gehirn stammenden Kaliumkanal: entspricht Basenpositionen 1257 bis 1461 der SEQ ID NO: 2, womit der codierende Bereich für den C-terminalen Schwanz des neuen Polypeptids abgedeckt wird.
    • Sonde 2: „allgemeine" Sonde: entspricht den Basenpositionen 989–1109 der SEQ ID NO: 2, womit der die ersten 40 Aminosäuren des C-terminalen Schwanzes codierende Bereich, der sowohl in KvQT2 als auch HNSPC vorhanden ist, abgedeckt wird.
  • Sonde 1 wurde durch Amplifizieren von 1 ng Human Brain, Whole Marathon Ready-cDNA in einem 50 ml-Reaktionsansatz unter Verwendung AdvantageTM KlenTaq DNA Polymerase Mix nach den Empfehlungen des Herstellers erzeugt. Der Ansatz enthielt DMSO in einer Endkonzentration von 5%. Die Primersatzsequenzen sind: 18F und 19R. Ein 201 pb großes Produkt wurde per Gel isoliert und über Absorption bei 260 nm quantifiziert. Fünfundvierzig ng des Amplifikats wurden durch Primerverlängerung mit einem Rückwärtsprimer, woraus sich eine Antisense-ssDNA-Sonde ergibt, markiert. Endgültige Reaktionsbedingungen: 50 ml, 1 × Reaktionspuffer A, 5% DMSO, 19R 200 nM, dATP, dTTP, dGTP 200 μM, 5 U DNA-Polimerase Taq (Fisher) und 50 mCi a32P-dCTP (Dupont NEN). Der Reaktionsansatz wurde 1 min bei 94°C und 1 min bei 72°C inkubiert, wobei dies über insgesamt 4 Zyklen wiederholt wurde. Das markierte Produkt wurde von nichteingebautem radioaktivem Nukleotid unter Verwendung von ProbeQuantTM/G-50 Micro Collumns (Pharmacia) nach den Empfehlungen des Herstellers gereinigt.
  • Sonde 2 wurde durch Amplifizieren der SEQ ID NO: 2 in einem 50 ml-Reaktionsansatz unter Verwendung des AdvantageTM KlenTaq DNA Polymerase Mix nach den Empfehlungen des Herstellers erzeugt. Die Primersatzsequenzen sind: 5' AGAAGAGGCGGAACCCGGCAGCAG 3' (Vorwärts, entspricht Basenposition 989–1012 der SEQ ID NO: 2) und 5' GGCACGGTGACCGTTCGCTCGTAG 3' (Rückwärts, entspricht Basenpositionen 1084–1109 der SEQ ID NO: 2). Der Reaktionsansatz wurde mit dem QIAGEN PCR Purification Kit nach den Empfehlungen des Herstellers aufgereinigt. Das 121 pb große Amplifikat wurde durch Primerverlängerung mit dem Rückwärtsprimer markiert, wodurch sich eine Antisense-ssDNA-Sonde ergibt. Endgültige Reaktionsbedingungen: 50 ml, 1 × Reaktionspuffer A, 100 ng Amplifikat, 200 nM Rückwärtsprimer, dATP, dTTP, dGTP 200 mM, 5 U Taq DNA-Polymerase (Fisher) und 50 mCi a322-dCTP (Dupont NEN). Der Reaktionsansatz wurde 1 min bei 94°C und 1 min bei 72°C inkubiert, wobei dies über insgesamt 4 Zyklen wiederholt wurde. Das markierte Produkt wurde von nichteingebautem radioaktivem Nukleotid unter Verwendung von ProbeQuantTM/G-50 Micro Collumns (Pharmacia) nach den Empfehlungen des Herstellers gereinigt.
  • Beispiel 4
  • Hybridisierungen
  • Radioaktive Sonden wurden zur Hybridisierung der zwei Mehrfachgewebe-Blots, des selbst hergestellten Blots und des oben beschriebenen Human Brain-Blots verwendet. Die Blots wurden in 2 × SSC gespült und danach in NorthernMAXTM Prehybridizaton/Hybridization Solution 1 Std. bei 42°C vorhybridisiert. Anschließend wurde die Lösung gegen die gleiche Lösung unter Zugabe von 1–2 × 107 cpm markierter Sonde ausgetauscht und der Ansatz über Nacht bei 42°C hybridisiert. Danach wurden die Blots zweimal stringent: 2 × SSC, 0,5% SDS, 5 min, 2 × SSC, 0,1% SDS, 5 min, 0,1 × SSC/0,5% SDS 30 min, 37°C sowie kurz mit 0,1 × SSC gewaschen. Danach wurden die Blots zwischen 24 und 48 Stunden Biomax MS-1-Film (Kodak) und zwei Verstärkerfolien bei –80°C in Kontakt gebracht.
  • Beispiel 5
  • Erzeugung des Expressionskonstrukts
  • SEQ ID NO: 1-cDNA wurde unter Verwendung der Eco RI-Stellen aus dem Vektor pCR®II-TOPO (supra) ausgeschnitten und in den Säugervektor pCDNA3 (Invitrogen) subkloniert. Zur Expression in Xenopus-Oozyten (Timpe, et al., Nature, 331: 143 (1988)) wurde die cDNA aus dem pCR®II-TOPO-Vektor unter Verwendung der EcoRV- und Hind III-Stellen ausgeschnitten und in den Vektor pKGEM (einen modifizierten PGEM-Vektor von Promega, der die Mehrfachklonierungsstelle flankierende 5'- und 3'-UTR-b-Globin-Sequenzen aus Xenopus zur Erhöhung der Message-Stabilität enthält) subkloniert. Diese Konstrukte lassen sich zur Erstellung funktionaler sowie biophysikalischer und pharmakologischer Profile des neuen, aus dem Gehirn stammenden Kaliumkanals unter Verwendung von Patch-Clamp- und/oder Oozyten-Standardtechniken verwenden. Der neue neuronenspezifische K+-Kanal läßt sich leicht in Säugerzellen (z. B. HEK 293, Cos, CHO, RBL-1, usw.) über transiente oder stabile Transfektion oder durch Mikroinjektion von RNA in Xenopus oocytes für eine gründliche biophysikalische und pharmakologische Charakterisierung unter Verwendung von Patch-Clamp-(Hammill, O. et al., Pfugers Arch. 391: 85 (1981) oder Zwei-Elektroden-Voltage-Clamp-Standardtechniken (Soreq, H. y Seidman., S. Methods Enzymol., 207: 225 (1992); Goldstein, A., et al., PNAS, 83: 7503 (1986) exprimieren.
  • Beispiel 6
  • Baculovirus-Überexpressionssystem für Screening-Präparation
  • (Erzeugung rekombinanter Baculovirusexpressionsvektoren und Genexpression mit den BAC-TO-BAC Expression System, Life Technologies, Gaithersburgh, MD Kat.-Nr. 10359-016 BAC-to-BAC Baculovirus Expression System) SEQ ID NO: 2 wird in pFASTBAC1 und das rekombinante Plasmid in DH10BAC-kompetente Zellen transformiert, die das Bacmid mit einer mini-attTn7-Zielstelle und das Helferplasmid enthalten. Das mini-Tn7-Element auf dem pFASTBAC1-Plasmid kann in Gegenwart von durch das Helverplasmid bereitgestellten Transpositionsproteinen an die mini-attTn7-Zielstelle auf dem Bacmid transponieren. Rekombinante Bacmide enthaltende Kolonien werden über die Unterbrechung IaoZα-Gens identifiziert. Hochmolekulare Minipräp-DNA wird aus das rekombinante Bacmid enthaltenden selektionierten E. coli-Klonen präpariert, und diese DNA wird dann zur Transfektion von Insektenzellen verwendet.
  • Klonierung in pFASTBAC1
  • Der Donorvektor pFASTBAC1 enthält den Polyhedrinpromotor, gefolgt von einer ausgedehnten MCS (Multiple Cloning Site [Mehrfachklonierungsstelle]), die von BamHI (4032) bis Hind III (4137) reicht. Die BamH I-Stelle liegt 37 bp stromabwärts vom ursprünglichen ATG des Polyhedrin-Gens, das zu ATT mutiert wurde. Daher muß, um ein Fremdprotein erfolgreich zu exprimieren, das Fremd-DNA-Fragment sein eigenes ATG mit daran anschließendem offenem Leseraster (ORF [Open Reading Frame]) enthalten. Das Fremd-DNA-Fragment muß in der korrekten Orientierung in bezug auf den Polyhedrinpromotor kloniert werden (d. h. das 5'-Ende des Gens muß in die erste ausgewählte Stelle der MCS inseriert werden).
  • Präparieren von pFASTBAC1 und des Fremd-DNA-Fragments durch Verdauen von 500 ng bis 1 μg DNA mit der bzw. den ausgewählten Restriktionsendonuklease(n) unter den entsprechenden Bedingungen. Falls nur eine Stelle im Vektor als Klonierungsstelle gewählt wird, den Vektor unter den entsprechenden Bedingungen dephosphorylieren. DNA-Fragmente können über Aggarosegelelektrophorese aufgereinigt und die interessierenden Fragmente aus dem Gel unter Verwendung einer GLASSMAX®-Kassette oder über eine gleichwertige Reinigung gewonnen werden. Den präparierten Vektor und die präparierten Insertionsfragmente unter den entsprechenden Bedingungen ligieren.
  • Klonierung
  • Für diese erste Klonierung bitte nicht die DH10BAC-Zellen im System verwenden. Es können kompetente DH5α- oder DH10B-Zellen verwendet werden. Den Transformationsansatz auf LB-Agarplatten mit 100 μg/ml Ampicillin ausplattieren.
  • Zur Analyse eines gerichteten Klonierungsexperiments reichen 6 Kolonien für das Screening aus; für eine nichtgerichtete Klonierungsstrategie müssen möglicherweise mindestens 12 Kolonien analysiert werden. Plasmid-DNA aus Übernachtkulturen unter Verwendung eines Minipräparationsverfahrens (z. B. Schecter, A. I., et al., Nature 312: 513 (1984)) präparieren und die korrekte Insertion des interessierenden Gels durch Restriktionsendonukleaseverdauung oder PCR-Analyse bestätigen.
  • Transposition
    • 1. Luria-Agar-Platten mit: 50 μg/ml Kanamycin, 7 μg/ml Gentamycin; 10 μg/ml Tetracyclin; 300 μg/ml Bluo-gal und 40 μg/ml IPTG herstellen. Siehe zusätzliche Vorschriften für Formulierungen (Abschnitte 5.1 und 5.2).
    • 2. Die kompetenten DH10BAC-Zellen auf Eis auftauen.
    • 3. 100 μl der Zellen in 15-ml-Polypropylenröhrchen verteilen.
    • 4. Ungefähr 1 ng rekombinantes Donorplasmid (in 5 μl) zugeben und die DNA durch Antippen der Röhrchenseite vorsichtig in die Zellen einmischen.
    • 5. Das Gemisch auf Eis 30 min inkubieren.
    • 6. Das Gemisch durch Überführen in ein Wasserbad (42°C, 45 s) einem Hitzeschock unterziehen.
    • 7. Das Gemisch auf Eis 2 min abkühlen.
    • 8. 900 μl S.O.C.-Medium zum Gemisch geben.
    • 9. Das Gemisch in einen Schüttelinkubator bei 37°C und mittlerer Schüttelgeschwindigkeit stellen (4 h).
    • 10. Die Zellen mit S.O.C.-Medium in Reihe auf 10–1, 10–2, 10–3 verdünnen (d. h. 100 μl Transpositionsansatz: 900 μl S.O.C.-Medium = 10–1-Verdünnung, diese noch mal 10fach verdünnen, so daß eine 10–2-Verdünnung erhalten wird, und analog für die 10–3-Verdünnung).
    • 11. Jeweils 100 μl der Verdünnungen auf die Platten ausbringen und gleichmäßig über die Oberfläche verteilen.
    • 12. Wenigstens 24 h bei 37°C inkubieren (blaue Kolonien sind möglicherweise nicht vor 24 h sichtbar).
  • Isolierung rekombinanter DNA
  • Weiße Kolonien enthalten das rekombinante Bacmid und werden daher für die Isolierung rekombinanter Bacmid-DNA ausgewählt. Vor der Isolierung der DNA werden Kandidatenkolonien ausgestrichen, um sicherzustellen, daß sie tatsächlich weiß sind.
    • 1. Weiße Kolonien von einer Platte mit ungefähr 100 bis 200 Kolonien auswählen. ANMERKUNG: Diese Anzahl erleichtert die Unterscheidung zwischen blauen und weißen Kolonien.
    • 2. Ca. 10 weiße Kandidaten wählen und zur Bestätigung des Phänotyps auf frischen Platten ausstreichen. Über Nacht bei 37°C inkubieren.
    • 3. Von einer Einzelkolonie, deren Phänotyp als weiß auf Platten mit Bluo-Gal und IPTG bestätigt wurde, eine Flüssigkultur zur Isolierung rekombinanter Bacmid-DNA ansetzen.
  • Die folgende Vorschrift ist spezifisch zur Isolierung großer Plasmide (> 100 kb) entwickelt und an die Isolierung von Bacmid-DNA angepaßt.
    • 1. Mit einem sterilen Zahnstocher eine isolierte Bakterieneinzelkolonie zum Animpfen in 2 ml mit 50 μg/ml Kanamycin, 7 μg/ml Gentamycin und 10 μg/ml Tetracyclin supplementiertes LB-Medium einführen. Dabei ist ein 15-ml-Polypropylenröhrchen mit Schnappdeckel geeignet. Bei 37°C unter Schütteln bei 250 bis 300 rpm bis zur stationären Phase (bis zu 16 h) wachsen lassen.
    • 2. 1 ml Kultur in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführen und 1 min bei 14.000 × g zentrifugieren.
    • 3. Der Überstand durch Absaugen im Vakuum entfernen und die Sedimente jeweils in 0,3 ml Solution I [Tris-HCl 15 mM (pH 8,0), EDTA 10 mM, 100 μg/ml RnasaA] resuspendieren (durch vorsichtiges Mischen am Vortex oder, falls notwendig, durch Auf- und Abpipettieren). 0,3 ml Solution II (NaOH 0,2 N, 1% SDS) zugeben und vorsichtig mischen. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren. Anmerkung: Die Suspension sollte ihr Aussehen von sehr trübe zu fast durchsichtig ändern.
    • 4. Langsam 0,3 ml 3 M Kaliumacetat (pH 5,5) zugeben, während der Zugabe vorsichtig mischen. Es bildet sich ein dicker weißer Niederschlag aus Protein und genomischer E. coli-DNA. Die Probe 5 bis 10 min auf Eis stellen.
    • 5. 10 min bei 14.000 × g zentrifugieren. Während der Zentrifugation ein weiteres Mikrozentrifugenröhrchen beschriften und mit 0,8 ml absolutem Isopropanol füllen.
    • 6. Den Überstand vorsichtig in das Röhrchen mit Isopropanol überführen. Dabei möglichst kein weißes Niederschlagmaterial mitnehmen. Den Ansatz durch mehrmaliges Umdrehen des Röhrchens vorsichtig mischen und 5 bis 10 min auf Eis stellen. An diesem Punkt kann die Probe bei –20°C über Nacht gelagert werden.
    • 7. Die Probe 15 min bei 14.000 × g und Raumtemperatur zentrifugieren.
    • 8. Den Überstand entfernen und in die Röhrchen jeweils 0,5 ml 70% Ethanol geben. Das Röhrchen mehrere Male umdrehen, um das Sediment zu waschen. 5 min bei 14.000 × g bei Raumtemperatur zentrifugieren. (Schritt 8 gegebenenfalls wiederholen.)
    • 9. Soviel Überstand wie möglich entfernen. Anmerkung: Das Sediment kann sich vom Boden des Röhrchens ablösen, so daß es besser ist, den Überstand vorsichtig abzusaugen als abzugießen.
    • 10. Das Sediment kurz an der Luft trocknen (5 bis 10 min bei Raumtemperatur), und die DNA in 40 μl TE lösen. Dabei die Lösung im Röhrchen unter gelegentlichem leichtem Antippen des Röhrchenbodens sitzenlassen. Die DNA ist im allgemeinen innerhalb von 10 min gebrauchsfertig, solange die Sedimente nicht übermäßig getrocknet sind.
    • 11. Die DNA bei –20°C aufbewahren. Zur Vermeidung einer drastischen Verringerung der Transfektionseffizienz sind jedoch wiederholte Zyklen aus Einfrieren und Auftauen zu vermeiden.
  • Präparationen von Bacmid-DNA können zur Bestätigung des Vorhandenseins hochmolekularer DNA mittels Aggarosegelelektrophorese analysiert werden.
  • Transfektion von Sf9-Zellen mit rekombinanter Bacmid-DNA
    • 1. Pro 35-mm-Vertiefung (einer 6-Loch-Platte) 9 × 105 Zellen in 2 ml Sf-900 II SFM mit Penicillin/Streptomycin in einer Endkonzentration von 0,5 × (50 Einheiten/ml Penicillin, 50 up/ml Streptomycin) aussäen.
    • 2. Zellen wenigstens 1 h bei 27°C anhaften lassen.
    • 3. Die folgenden Lösungen in sterilen Röhrchen (12 × 75 mm) ansetzen: Lösung A: Für jede Transfektion ca. 5 up Minipräp-Bacmid-DNA in 100 μl Sf-900 II SFM ohne Antibiotika verdünnen. Lösung B: Für jede Transfektion, ca. 6 μl CELLFECTIN in 100 μl Sf-900 II SFM ohne Antibiotika verdünnen.
    • 4. Die beiden Lösungen vereinen, vorsichtig mischen und 15 bis 45 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    • 5. Die Zellen einmal mit 2 ml Sf-900 II SFM ohne Antibiotika waschen.
    • 6. Für jede Transfektion jeweils 0,8 ml Sf-900 II SFM in das Röhrchen mit den Lipid-DNA-Komplexen geben. Vorsichtig mischen. Waschmedium von den Zellen absaugen und letztere mit 1 ml der verdünnten Lipid-DNA-Komplexe überschichten.
    • 7. Zellen 5 h in einem Inkubator (27°C) inkubieren.
    • 8. Die Transfektionsansätze entfernen und 2 ml Sf-900 II SFM mit Antibiotika zugeben. Zellen in einem Inkubator (27°C) 48 h inkubieren.
    • 9. 48 bis 72 h nach dem Transfektionsstart Zellen auf Proteinaktivität testen; Virus zum Zeitpunkt 72 h ernten.
  • Ernte/Lagerung von rekombinantem Baculovirus
    • 1. Beim Ernten des Virus vom Transfektionsansatz den Überstand (2 ml) in ein steriles verdeckeltes Röhrchen überführen. Durch Zentrifugation (5 min bei 500 × g) klären und den virushaltigen Überstand in ein frisches Röhrchen überführen.
    • 2. Von der ursprünglichen Transfektion können Virustiter von 2 × 107 bis 4 × 107 pfu/ml erwartet werden.
    • 3. Das Virus lichtgeschützt bei 4°C aufbewahren. Für die Langzeitlagerung des Virus ist die Zugabe von fötalem Rinderserum (FBS) in einer Endkonzentration von wenigstens 2% FBS empfohlen. Ebenso ist die Lagerung einer Portion der Virusstammlösung bei –70°C empfohlen.
    • 4. Zur Bestimmung des Virustiters kann ein Plaque-Assay durchgeführt werden. Siehe Abschnitt 5.12, viraler Plaque Assay, hinsichtlich Vorschriften im Zusammenhang mit Plaques.
    • 5. Zur Amplifizierung von Virusstammlösungen eine Suspensions- oder Monolager-Kultur mit einer MOI (Multiplicity of Infektion) von 0,01 bis 0,1 infizieren. Dabei die folgende Formel anwenden:
      Figure 00960001
    • Zum Beispiel: eine 50-ml-Kultur von 2 × 106 Zellen/ml mit 0,5 ml einer Virusstammlösung, d. h. 2 × 107 pfu/ml, infizieren, um eine MOI von 0,1 zu erhalten.
  • Virus 48 h nach Infektion ernten. Daraus ergibt sich ungefähr eine 100fache Amplifikation des Virus.
  • Infektion von Insektenzellen mit rekombinanten Baculoviruspartikeln
  • Optimale Infektionsbedingungen für Insektenzellen können variieren. Ein Startpunkt für die Infektion ist eine MOI von 5 bis 10. Für weitere Informationen sei auf Literaturstelle 2 verwiesen. Es wird empfohlen, daß für jedes zu exprimierende Protein mehrere Experimente ausgeführt werden.
  • MOI-Optimierung: Eine Population von Zellen mit verschiedenen MOIs (z. B. 1, 2, 5, 10) infizieren und Proteinexpression nach Ernten der Zellen (oder Medien, falls das Protein sezerniert wird) testen.
  • Zeitlicher Verlauf: Zellen bei konstanter MOI infizieren. Zellen (oder Medien) in den folgenden Zeitabständen ernten: 24 h, 48 h, 72 h, und 96 h. Auf Expression testen.
  • Vorbereiten der Zellen für die Transfektion
    • 1. Vierundzwanzig Stunden vor der Transfektion eine 60-mm-Gewebekulturschale mit 4 × 105–11 × 105 exponentiell wachsenden Zellen beimpfen. Die Zellen sollten zum Zeitpunkt der Transfektion 60–80% konfluent sein.
    • 2. Die Zellen über Nacht in 5 ml des entsprechenden Kulturmediums wachsen lassen.
  • Herstellen der Komplexbildungslösung
    • 1. 900 μl steriles serumfreies, antibiotikafreies DMEM (DMEM-SA) in ein Polystyrolröhrchen überführen.
    • 2. 35–100 μl LipoTAXI-Transfektionsreagenz zugeben. Die Seite des Röhrchens zum Mischen antippen.
    • 3. 7 μg des Kontrollplasmids in den Kontrollansatz und 5–10 μg der Versuchs-DNA in den Versuchsansatz geben. Für stabile Transfektionen eine negative Kontrolle ansetzen.
    • 4. Vorsichtig mischen (nicht am Vortex) und 15–30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
  • Zugabe der aktivierten Lösung
    • 1. Das Standardkulturmedium aus der Gewebekulturschale durch Absaugen entfernen.
    • 2. 1,5 ml DMEM (gegebenenfalls mit Serum) zum Transfektionsansatz im Polystyrolröhrchen geben und danach diesen Gesamtansatz (~2,5 ml) tropfenweise unter Schwenken der Schale in die Gewebekulturschale überführen.
    • 3. 4–6 Stunden unter Verwendung von Standardwachstumsbedingungen (d. h. 37°C und 5% CO2 in einem luftbefeuchteten Inkubator) inkubieren.
    • 4. 2,5 ml DMEM mit Serum (DMEM + S) mit der doppelten normalen Serumkonzentration in die Gewebekulturschale geben und über Nacht inkubieren.
    • 5. Das Medium durch 5,0 ml frisches Komplettmedium ersetzen.
    • 6. Die Zellen 24–72 Stunden, je nach Zelltyp, Reportersystem und Promotoraktivität inkubieren oder weiter zum Punkt Durchführen einer stabilen Transfektion.
  • Durchführen einer stabilen Transfektion
    • 1. Die Zellen aus Schritt 6 des Punkts Zugabe der aktivierten Lösung in das gewünschte Verhältnis (mindestens 1:10) nach der 24stündigen Inkubation teilen und anschließend über Nacht inkubieren.
    • 2. Selektionsantibiotika in die Gewebekulturschale eintropfen, unter Schwenken der Schale zwischen den Tropfen und mit einer für die Zellinie geeigneten Konzentration.
    • 3. Das Medium austauschen und frische Selektionsantibiotika alle 4–7 Tage (ungefähr zweimal pro Woche) zugeben.
    • 4. Stabile Kolonien bilden sich innerhalb von 1–2 Wochen. Zellen von der negativen DNA-Kulturschale sterben ab.
  • Transfizieren von Suspensionszellen mit dem LipoTAXI-Säugertransfektionskit
  • Vorbereiten der Zellen für die Transfektion
    • 1. 4 × 106–10 × 106 Zellen pro 60-mm-Schale in 700 μl DMEM-SA aussäen. Anmerkung: Das optimale Verhältnis von LipoTAXI-Transfektionsreagenz zu DNA muß für jedes Plasmid und jede Zellinie bestimmt werden.
  • Herstellen der Komplexbildungslösung
    • 1. 900 μl DMEM-SA in ein Polystyrolröhrchen überführen.
    • 2. 35–100 μl LipoTAXI-Transfektionsreagenz zugeben.
    • Die Seite des Röhrchens zum Mischen antippen.
    • 3. 10 μg des Kontrollplasmids zum Kontrollansatz und 7–15 μg der Versuchs-DNA zum Versuchsansatz geben. Für stabile Transfektionen eine Negativkontrolle ansetzen.
    • 4. Vorsichtig mischen (nicht am Vortex) und 15–30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
  • Zugabe der aktivierten Lösung
    • 1. 800 μl DMEM (gegebenenfalls mit Serum) zum Transfektionsansatz in Polystyrolröhrchen geben und anschließend diesen gesamten Ansatz (~1,8 ml) tropfenweise unter Schwenken der Gewebekulturschale in diese geben.
    • 2. 4–6 Stunden unter Verwendung von Standardwachstumsbedingungen (d. h. 37°C und 5% CO2 in einem luftbefeuchteten Inkubator) inkubieren.
    • 3. 3 ml frisches Komplett-DMEM in die Gewebekulturschale geben.
    • 4. Die Zellen je nach Zelltyp, Reportersystem und Promotoraktivität 24–72 Stunden inkubieren oder mit Schritt 10 fortfahren, falls eine stabile Transfektion durchgeführt wird.
  • Durchführen einer stabilen Transfektion
    • 1. Nach 48 Stunden eine für die Selektion zu verwendende frische Gewebekulturschale mit nicht mehr als einem Drittel der Dichte der transfizierten Zellen aus Schritt 9 beimpfen.
    • 2. Selektionsantibiotika tropfenweise in die Gewebekulturschale eintragen, und zwar unter Schwenken der Schale zwischen den Tropen mit einer der für die Zellinie geeigneten Konzentration.
    • 3. Das Medium austauschen und frische Selektionsantibiotika alle 4–7 Tage (ungefähr zweimal pro Woche) zugeben.
    • 4. Stabile Kolonien bilden sich innerhalb von 1–2 Wochen. Zellen von der negativen DNA-Kulturschale sterben ab.
  • Ernten der transfizierten suspendierten Zellen
    • 1. Die transfizierten Zellen in 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführen und zum Sedimentieren der Zellen 5 Minuten bei 200 × g zentrifugieren.
    • 2. Den Überstand entfernen und verwerfen, 1 ml PBS zum Zellsediment geben und die erhaltene Zellsuspension in ein 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführen.
    • 3. Das Röhrchen in einer Mikrozentrifuge 5 Minuten bei 200 × g zum Sedimentieren der Zellen zentrifugieren.
    • 4. Den Überstand entfernen und verwerfen, 1 ml Lysepuffer zum Zellsediment geben und bis zum Einfrieren bei –20°C stehenlassen.
    • 5. Den Zellextrakt auftauen und das Röhrchen in einer Mikrozentrifuge bei 12.000 × g 5 Minuten zum Sedimentieren der Zelltrümmer zentrifugieren.
    • 6. Den Überstand in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen überführen und bei –20°C lagern oder mit dem B-Galactosidase-Test fortfahren.
  • Beispiel 7
  • CaPO4-Transfektionsvorschrift
  • Die folgende Vorschrift ist auf 100-mm-Kulturschalen optimiert, wobei sich alle Volumina auf eine Einzeltransfektion beziehen.
    • 1. 100-mm-Kulturschalen mit exponentiell wachsenden Zellen bei 5 × 105 Zellen pro Schale nicht früher als 24 Stunden vor der Transfektion beimpfen. Diese Zellen sollten über Nacht in 10 ml des entsprechenden Mediums zu einer Konfluenz von ungefähr 10–20% angezogen werden. Die RPMI-Reihe von Medien läßt sich für die CaPO4-Transfektion nicht verwenden. Durch die überschüssige positive Ladung in diesen Medien bildet sich ein dichter Niederschlag. Herstellung der DNA Precipitate Solution (pro 100-mm-Kulturschale) ANMERKUNG: Die optimale Menge an DNA variiert je nach dem transfizierten Zelltyp. Für das Kontrollplasmid pWLneo (Life Technologies, Gaithersburg, MD) 10 μg/Schale verwenden (in den meisten Fällen werden 10–30 μg zirkuläre DNA/Schale empfohlen).
    • 2. Gewünschte DNA-Menge mit destilliertem entionisiertem Wasser auf 450 μl verdünnen.
    • 3. Ansatz 10–20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren lassen.
    • 4. Zur Sicherstellung einer angemessenen Suspension die Lösung vorsichtig mischen. Diese tropfenweise in die Kultur geben und dabei die Platte zur gleichmäßigen Verteilung leicht schwenken.
    • 5. Zellen 12–24 Stunden inkubieren. Die optimale Inkubationszeit kann je nach Zelltyp variieren. Nach der Inkubation wird ein feiner Niederschlag beobachtet. ANMERKUNGEN: Falls freier Inkubatorplatz zur Verfügung steht, kann die Transfektionseffizienz durch Verwendung niedrigerer CO2-Konzentrationen (2–4% CO2) um das Zwei- bis Dreifache verbessert werden. Nach Entfernen des Niederschlags im nachfolgenden Schritt (Schritt 6) zu normalen CO2-Konzentrationen zurückkehren.
    • 6. Nach 12–24 Stunden Inkubation Medium entfernen und die Kultur zweimal mit PBS (ohne Ca oder Mg) oder Medium ohne Serum spülen. Frisches (serumhaltiges) Komplettmedium zugeben, und die Zellen unter einer für die Zellinie optimalen CO2-Konzentration 24 Stunden inkubieren lassen.
    • 7. Zellen in den gewünschten Verhältnissen (mindestens 1:10) teilen und weitere 24 Stunden inkubieren, bevor die Selektion stabiler Transfektanten vorgenommen wird.
  • Beispiel 8
  • DEAE-Dextran-Transfektionsvorschrift
  • Die folgende Vorschrift wurde für 100-mm-Kulturschalen optimiert, wobei alle Volumina für eine Einzeltransfektion gelten. Für das Kontrollplasmid pSV2 Cat (Life Technologies, Gaithersburg, MD) 2 μg/Schale verwenden.
  • DEAE-Dextran-Transfektion (pro 100-mm-Kulturschale)
    • 1. Exponentiell wachsende Zellen sollten mit einer Dichte, die innerhalb von 72 Stunden zu ca. 100% Konfluenz führt, ausgesät werden. Die Transfektion sollte 6–24 Stunden nach dem Aussäen durchgeführt werden.
    • 2. DNA (1–2 μg/100-mm-Schale) mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (1 × PBS) auf ein Endvolumen von 170 μl mischen.
    • 3. 85 μl Solution #3 mit 85 μl 1 × PBS verdünnen.
    • 4. Den PBS-DNA-Ansatz mit dem Solution #3-PBS-Ansatz vereinen.
    • 5. Medien von den Kulturen entfernen und zweimal mit PBS spülen.
    • 6. Den DNA-Ansatz (aus Schritt 4) tropfenweise in die Mitte der Kultur geben und zur gleichmäßigen Verteilung der Lösung leicht schwenken. 15 Minuten bei Raumtemperatur (ca. 25°C) ohne CO2 inkubieren.
    • 7. Die Lösung entfernen und die Kultur vorsichtig mit PBS spülen (an diesem Punkt haften die Zellen nur schlecht).
    • 8. 10 ml frisches Komplettmedium zu der Kultur geben und unter optimalen Kulturbedingungen wachsen lassen.
  • Selektion
  • Bei Verwendung des G418-Antibiotikaselektionsverfahrens ist es wichtig, sich ins Gedächtnis zu rufen, daß nicht alle Säugerzellinien gleichermaßen empfindlich auf G418 sind. Die minimale letale Konzentration kann in einem Bereich von 100 μg/ml bis 1 mg/ml liegen. Daher muß die für die Selektion zu verwendende Konzentration für jede Zellinie bestimmt werden, bevor mit dem Experiment begonnen werden kann.
  • Da viele Zellinien bereits dieser Art von Selektion unterzogen wurden, kann ein Hinzuziehen der verfügbaren Literatur sinnvoll sein. Falls keine Informationen über die Empfindlichkeit einer bestimmten Zellinie zur Verfügung stehen, besteht ein einfacher Weg zur Bestimmung ihrer Empfindlichkeit darin, Kulturen in einer Platte mit mehreren Vertiefungen („Multiwell Plate") anzuziehen, wobei eine Bandbreite von G418-Konzentrationen zwischen den einzelnen Vertiefungen vorliegt. Die optimale Konzentration ist dann die niedrigste Konzentration, bei der alle Zellen innerhalb von 10–14 Tagen abgetötet werden (Schnell teilende Zellen können leichter abgetötet werden, da das Antibiotikum hauptsächlich auf sich teilenden Zellen zu wirken scheint.).
  • In einigen Fällen besteht die Möglichkeit, die G418-Konzentration nach der ersten Selektion zu reduzieren und dabei noch das selektionierbare Markergen zu behalten. Beispielsweise werden NIH 3T3-Zellen allgemein in 400 μg/ml G418 selektioniert, wobei das Vorliegen des neo-Gens bei 250 μg/ml aufrechterhalten werden kann.
  • Klonisolierung
  • Nachdem der Selektionsvorgang soweit fortgeschritten ist, daß Kolonien sichtbar sind, ist es wichtig, die Kolonien auf eine Weise zu isolieren, bei der die maximale Anzahl an Zellen erhalten wird (wodurch die Wahrscheinlichkeit des Überlebens des Klons steigt), und die Möglichkeit einer Kontamination einer Kolonie mit Zellen von einer anderen Kolonie zu minimieren. Um diese beiden Ziele zu erreichen, wird empfohlen, bei der Isolierung von Kolonien Klonierungsringe zu verwenden. Die Ringe können dabei aus einem beliebigen autoklavierbaren Material hergestellt sein und weisen einen Innendurchmesser von 5–10 mm auf. Zusammen mit einer mittelgroßen Pinzette und irgendeiner Art von Haftmittel (Vakuumfett funktioniert gut) sterilisieren.
  • Vor Isolierung der Kolonien 24-Loch-Mikrotiterschalen zur Aufnahme der neuen Klone vorbereiten. Das für die neuen Klone verwendete Volumen sollte auf ein Minimum beschränkt werden, da viele Arten von Zellen die Unterstützung anderer Zellen des gleichen Typs zu benötigen scheinen, um in Kultur zu wachsen. An dieser Unterstützung kann eine gewisse Art von löslichem Wachstumsfaktor beteiligt sein, der bei einer zu starken Verdünnung unwirksam werden kann. In solchen Fällen, bei denen das Zellwachstum anfangs sehr spärlich ist (< 5% der Schalenoberfläche), ist es häufig hilfreich, Wachstumsfaktoren mit höheren Konzentrationen als üblich zuzugeben.
    • ANMERKUNG: Wächst beispielsweise ein Zelltyp gut in mit 10% fatalem Kälberserum supplementiertem Medium unter normalen Kulturbedingungen, so kann er 20% fötales Kälberserum für gutes Wachstum benötigen, wenn die Zellen bei sehr geringer Dichte ausgesät sind. Ebenso kann es sinnvoll sein, Medium aus einer dichter besiedelten Kultur zu entfernen und nach Sterilfiltration zum Supplementieren des Wachstumsmediums der spärlich besiedelten Kulturen zu verwenden.
  • Zur Isolierung von Einzelkolonien unter Verwendung von Klonierungsringen sollte die die Kolonien enthaltende Kultur zweimal in PBS gewaschen werden und anschließend die gesamte Flüssigkeit aus der Platte entfernt werden. Die Ringe sollten ausschließlich mit einer sterilen Pinzette gehandhabt werden.
    • 1. Die Ringe in das sterile Haftmittel tauchen und leicht gegen eine trockene, sterile Oberfläche abtupfen, um das Haftmittel gleichmäßig um die äußeren Ränder herum zu verteilen.
    • 2. Die Ringe um die zu erntenden Kolonien legen (dabei schnell arbeiten, um ein Austrocknen zu verhindern).
    • 3. Jeweils 4–5 Tropfen Trypsin mit einer sterilen Pasteur-Pipette mit Wattestopfen in jeden Ring geben.
    • 4. Ca. 30 Sekunden pro Kolonie warten, danach die Kolonie durch 2–3 maliges Auf- und Abpipettieren des Trypsins aufbrechen.
    • 5. Die trypsinisierten Zellen in eine 24-Loch-Platte überführen.
    • 6. Etwas Medium aus der 24-Loch-Platte entnehmen, die Innenseite des Rings zur Entfernung eventuell noch vorhandener Zellen spülen und in die Platte überführen.
    • 7. Nach ca. 2 Stunden die Platte mit einem Mikroskop untersuchen, um zu bestimmen, ob die Zellen angehaftet sind. Ist dies der Fall, dann das Medium in der 24-Loch-Platte gegen frisches Komplettmedium austauschen, um eventuell noch vorhandenes Trypsin zu entfernen.
  • Während der frühen Phasen des neuen Klonwachstums ist es am besten, das Medium so selten wie möglich zu wechseln (etwa einmal pro Woche bei sehr dünn besiedelten Kulturen), was bei der Beibehaltung eventuell vorhandener löslicher Faktoren hilft. Am besten ist es, zum Medium exogene Wachstumsfaktoren zuzugeben statt das alte Medium durch Medium mit frischen Wachstumsfaktoren zu ersetzen.
  • Sobald die kleinen Kulturen bis zur Konfluenz gewachsen sind, können sie in größere Kulturgefäße (üblicherweise zunächst 6-Loch-Mikrotiterplatten) überführt und auf die gleiche Weise wie andere Zellen desselben Typs behandelt werden (die ursprüngliche Selektion sollte über die gesamte Lebensdauer des neuen Klons beibehalten werden).
  • Beispiel 9
  • Membranpräparation von tranfizierten HEK-Zellen für das Screening von Verbindungen
  • Membranen werden präpariert, wenn die HEK-Zellen in den T-150-(oder T-175- oder T-225-)Kolben jeweils Konfluenz erreicht haben.
  • Die Präparation der Membranen aus den Kolben mit den Zellen wird jeweils wie folgt durchgeführt:
    • 1. Das Zellkulturmedium abgießen und aufbewahren (da es immer einige Zellen enthält, die gerade durch das Handhaben des Kolbens abgelöst wurden).
    • 2. Die konfluente Zellschicht mit etwa 8 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), 37°C, spülen. Dadurch werden Reste des fötalen Kälberserums, die das in Schritt 3 verwendete Trypsin hemmen können, abgetrennt. Das PBS von der Spülung ebenfalls aufbewahren, um weitere eventuell abgelöste Zellen aufzufangen.
    • 3. Etwa 5 ml Trypsin-EDTA, 37°C, zugeben. Den Kolben langsam vor und zurück schaukeln, so daß sich die Trypsinwaschlösung über die gesamte Zellschicht verteilen kann. In etwa 30 s werden einige der Zellen losgelöst; den Kolben kräftig auf den Labortisch aufklopfen, um die restlichen Zellen zu lösen. Frisches Medium schnell in den Kolben geben, um die Trypsinreaktion zu stoppen. Dabei etwa 10 ml Medium pro 5 ml Trypsin zugeben. Das Trypsin/Zellen/Medium-Gemisch in ein Zentrifugenröhrchen pipettieren. Den Kolben mit weiteren etwa 5 ml Medium spülen und mit den anderen Röhrchen vereinen.
    • 4. Die Zellen durch Zentrifugieren (250 × g, 8 min) waschen. Die einzelnen Zellsedimente in einem kleinen Volumentestpuffer resuspendieren und dann in einem Röhrchen vereinigen.
    • 5. Die Zellen am Polytron homogenisieren (25 s, 13000 UpM).
    • 6. ZENTRIFUGATION BEI NIEDRIGER GESCHWINDIGKEIT: 800 UpM (~100 × g) 2 min; den Überstand aufbewahren; das Sediment verwerfen.
    • 7. ZENTRIFUGATION BEI HOHER GESCHWINDIGKEIT: Den Überstand in Hochgeschwindigkeitsröhrchen überführen und bei 20.000 UpM (50.000 × g) 10 min zentrifugieren. Den Überstand verwerfen; 1 ml Testpuffer oben auf das Sediment geben.
    • 8. Auf Trockeneis einfrieren; die Röhrchen verdeckeln und bei –80°C aufbewahren.
  • Die Membranen auf 50 μg/ml verdünnen und jeweils 2,5 μg pro Vertiefung (50 μl von 50 μg/ml) verwenden.
  • Beispiel 10
  • Verfahren zur kompetitiven Bindung radioaktiv markierter Liganden in einer 96-Loch-Mikrotiterplatte mit Membranen aus transfizierten HEK-Zellen; Trennung von gebundenem und freiem Anteil durch Filtration über GF/C-Filter
  • Zu in diesem Beispiel verwendeten radioaktiv markierten Liganden zählen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Tetraethylammoniumchlorid (TEA), 4-Aminopyridin (4-AP, ebenso wie 2-AP und 3-AP), 3,4- und 2,3-Diaminopyridin, BaCl2, CsCl, Strychnin, Fencyclidin, Pyridostigmin, 9-Aminoacrydin, DuP-996 (3,3-Bis(4-pyridinylmethyl)-1-fenylindolin-2-on; Linopyridin), Clofilium, Chinidin, Aminochinoline und Chinin.
    Testpuffer Waschpuffer
    5 mM NaCl 200 mM NaCl
    5 mM KCl 20 mM HEPES
    10 mM HEPES pH 8,0 mit Tris-Base
    6 mM Glucose
    mit IRIS-Base auf pH 8,4 bringen
    Membranen: transfizierte HEK-Zellmembranen 2,5 μg Protein pro Vertiefung im Test verwenden;
    Verschiedenes 96-Loch-Mikrotiter platten, Falcon, Rundboden, nicht gewebekulturbehandelt 96-Loch-Unifilter, GF/C, Packard Instruments Co. Microscint-20 Scintillationsfluorofor, Packard Top Count-Scintillationszähler, Packard Polyethylenimin, 0,6% zum Einweichen von Unifilternter Ligand, z. B. radioaktiv markierter Ligand, z. B. TEA, 2200 Ci/mmol Nichtspezifische Bindung definiert mit 10 nM kaltem Liganden (z. B. TEA)
    Test: 130 μl Testpuffer 20 μl Testverbindung oder Kontrolle oder nichtspezifisch 50 μl Membranen mit 50 μg/ml (pro Vertiefung 2,5 μg Protein zugegeben) 50 μl Radioligand [Endkonzentration] 25 pM 250 μl Gesamtvolumen
  • Testverfahren:
    • 130 μl pro Vertiefung in 96-Loch-Platte geben.
    • 20 μl Kandidatenverbindung (Arzneistoff) oder Kontrollösung (mehr Puffer oder Testverbindungsverdünnungsmittel) oder nichtspezifische Lösung (definiert mit 10 nM kaltem Liganden).
    • Die zuvor präparierten Membranen in die Testplatte geben und Membran plus Puffer, Testverbindungen usw. 5 min bei 21°C vorinkubieren, am Titer-Tek-Plattenmischgerät mischen.
    • 50 μl Radioliganden zugeben [Endkonzentration], 25 pM, und 20 min bei 21°C inkubieren, auf dem Plattenmischgerät mischen.
    • Gebundenen vom freien Radioliganden durch Filtern über die zuvor eingeweichten GF/C-Unifilter trennen; Zweimal schnell mit eiskaltem Waschpuffer waschen.
    • Unifilter-Platten über Nacht trocknen lassen.
    • Nach dem Trocknen Unifilter mit jeweils 25 μl Microscint-20 versetzen und im Top-Count (Packard) Scintillationszähler zählen.
  • Beispiel 11
  • Radioligandenbindungstests
  • Zu den radioaktiv markierten Liganden für die Verwendung in diesem Beispiel gehören, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Tetraethylamoniumchlorid (TEA), 4-Aminopyridin (ebenso wie 2-AP und 3-AP), 3,4- und 2,3-Diaminopyridin, BaCl2, CsCl, Strychnin, Fencyclidin, Pyridostigmin, 9-Aminoacrydin, DuP-996 (3,3-Bis(4-pyridinylmethyl)-1-fenylindolin-2-on; Linopyridin), Clofilium, Chinidin, Aminochinoline und Chinin.
  • Neuronen (für die Kultur (und für die Transfektion und Transformation) kommerziell erhältlich, ebenso wie postmitotische CNS-Zellen, beispielsweise von der Firma STRATAGENE, La Jolla, CA) werden in Polystyrolröhrchen (12 × 75 mm) mit einem Radioliganden (~1–2 × 103 Ci/mmol) inkubiert. Falls nicht anders angegeben, werden die Zellen in isotonischen Saccharosemedium (Medium I) mit 10 mM Na-HEPES, 5 mM KCl, 5 mM NaCl und 6 mM Glucose, pH 8,4 suspendiert und mit dem Radioliganden 1 h bei Raumtemperatur auf einem Rotationsschüttler inkubiert. Die nichtspezifische Bindung wird in Gegenwart von 10 mM nativem kaltem Radioliganden bestimmt.
  • Zellstammsuspensionen werden auf eine Zellendkonzentration von 2,5 × 105 Zellen/ml in einem Gesamtvolumen von 400 μl verdünnt. Am Ende der Inkubationszeit werden Proben mit 4 ml eiskalter Quench-Lösung, die 200 mM NaCl, 20 mM HEPES (freie Säure) titriert auf pH 8,0 mit Tris-Base, enthält, verdünnt. Die gequenchten Proben werden durch GF/C-Glas Mikrofaserfilter filtriert, die zuvor in 0,6% Polyethylenimin eingeweicht worden waren, und zweimal mit eiskalter Quench-Lösung gewaschen. Für jeden experimentellen Punkt werden Dreifachbestimmungen durchgeführt. Die Standardabweichung vom Mittelwert beträgt typischerweise weniger als 5%. Unterschiedliche Zellpräparationen können etwas unterschiedliche Verhältnisse von nichtspezifischer zu gesamter Radioligandenbindung ergeben. Stammlösungen des Radioliganden werden in 100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,1% Rinderserumalbumin hergestellt.
  • Datenanalyse – Daten von Sättigungsexperimenten werden einer Scatchard-Analyse unterzogen, wobei eine lineare Regression durchgeführt wird, so daß sich eine Gleichgewichtsdissoziationskonstante (K4) und eine maximale Rezeptorkonzentration (Borax) ergibt. Die Korrelationskoeffizienten für diese Bestimmungen liegen typischerweise oberhalb von 0,95. Die Daten aus Kompetitionsexperimenten werden zur Bestimmung von Ki-Werten nach dem Standardverfahren von Cheng und Prusoff analysiert. Die Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante (κ1) wird direkt von einer grafischen Auftragung erster Ordnung der Ligandendissoziation gegen die Zeit bestimmt. Die Geschwindigkeit der Ligandenassoziation (k1) wird nach der Gleichung k1 – kobe([LR]e/([L][LR]max)) bestimmt, wobei [L] die Konzentration an Liganden, [LR]e die Konzentration des Komplexes im Gleichgewicht, [LR]max die maximale Anzahl vorhandener Rezeptoren und Kobe die Steigung der grafischen Auftragung pseudoerster Ordnung von ([LR]e/{[L]e – [LR]t}) gegen die Zeit bedeutet. Die Assoziation- und Dissoziationsge schwindigkeit des Radioliganden werden auch bestimmt, indem man die Kinetik der Bindung des radioaktiven Elements bei unterschiedlichen Ligandenkonzentrationen mißt, kobe bei jeder Ligandenkonzentration von halblogarithmischen Darstellungen dieser Daten bestimmt und k1 bzw. k–1 von der Steigung bzw. y-Achsenabschnitt der grafischen Auftragung von kobe gegen die Ligandenkonzentration bestimmt.
  • Die Radioligandenbindungstests können bei der vorliegenden Erfindung im wesentlichen wie bei Deutsch, C. et al., J. of Biological Chemistry, 266: Nr. 6, 3668-3674 (1991) beschrieben verwendet werden.
  • Beispiel 12
  • 86Rb-Ausfluß-Arzneistoff-Screening-Test
  • Die Depolarisierung menschlicher Neuroblastomzellen durch hohe Konzentrationen extrazellulärer Kaliumionen führt zur Aktivierung der spannungsgesteuerten Kaliumkanäle. Es wird demonstriert, das die Aktivität solcher Kaliumkanäle effektiv und schnell beobachtet wird, indem man den Ausfluß von 86Rb aus vorher beladenen Zielzellen als Antwort auf den Depolarisierungsreiz verfolgt. Der Einschluß von Verbindungen mit unbekannter Aktivität im Testmedium führt zur Identifizierung neuer Blocker des hier beschriebenen Kaliumkanals. Siehe Toral, J., et al., Use of Cultured Human Neuroblastoma Cells in Rapid Discovery of the Voltage-Gated Potassium-channel Blockers, J. Pharm. Pharmacol., 46: 731 (1994). Die Blockierung einzelner K+-Kanäle durch eine Kandidatenverbindung führt zu einer deutlichen Abnahme des 86Rb-Ausflusses, die sich leicht mit diesem Test nachweisen läßt. Von Toral, J. et al. wurde dieser Test erfolgreich eingesetzt, um eine Reihe neuer chemischer Strukturen zu entdecken, die in der Lage sind, die spannungsgesteuerten Kaliumkanäle in Neuronen und Cardiozyten zu blockieren. Die kaliumkanalblockierende Aktivität dieser Verbindungen wurde mit elektrophysiologischen Techniken ebenso wie über den 86Rb-Ausfluß aus mit klonierten neuronalen spannungsgesteuerten Kaliumkanälen transfizierten kultivierten Säugerzellen bestätigt.
  • Der 86Rb-Ausflu1-Funktionstest mit hohem Volumen wird in 96-Loch-Mikrotiterplatten durchgeführt und stellt ein schnelles primäres Screening-Verfahren mit hohem Volumen für den Nachweis und die Identifizierung von Kaliumkanalblockern dar. Die Anwendung wird für den Nachweis von Blockern des Kaliumkanals in kultivierten menschlichen Neuroblastomzellen beschrieben. Toral, J. et al., Use of Cultured Human Neuroblastoma Cells in Rapid Discovery of the Voltage-Gated Potassium-channel Blockers, J. Pharm. Pharmacol., 46: 731 (1994).
  • Hochgereinigte menschliche NT2-Neuronenzellen und postmitotische hNT-Zellen des zentralen Nervensystems zur Differenzierung auf den neuronalen Phänotyp hin sind von der Firma STRATAGENE, La Jolla, CA, für die Transfektion erhältlich, um die Untersuchung der hier beschriebenen Kaliumkanal-Gene und -Tests zu gestatten.
  • Puffer und Reagenzien
  • Puffer
    • MOPS-PSS, pH 7,4 (NaCl 120 mM; KCl 7,0 mM; CaCl2 2,0 mM; MgCl2 1,0 mM; Ouabaina 10 μM; 4-Morpholinapropansulfonsäure MOPS 20 mM).
  • Depolarisierungslösung
  • MOPS-PSS mit KCl (80 mM) statt der entsprechenden Konzentrationen an NaCl.
  • Kandidatenverbindungen werden bei einer Stammlösungskonzentration von 10–100 mM entweder in MOPS-PSS oder Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst und anschließend in Inkubationspuffer auf die gewünschte Konzentration verdünnt. Kandidatenverbindungen werden in MOPS-PSS mit (0,1 @ p/v) bei einer Stammlösungskonzentration von 50–500 μM gelöst.
  • Zellkultur und 86Rb-Beladung
  • Menschliche Neuroblastomzellen TE671 werden von der American Type Culture Collection (HTB 139) bezogen und bei 37°C in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), supplementiert mit 10% fötalem Kälberserum, 4,5 gl–1 Glucose und 2,0 mM L-Glutamin gehalten. Zellen werden in 96-Loch-Mikrotiterplatten ausplattiert und mit 86Rb beladen, wie von Daniel, S. et al., J. Pharmacol. Methods, 25: 185 (1991) beschrieben.
  • 86Rb-Ausfluß-Testverfahren
  • Das Wachstumsmedium in der Mikrotiterplatte wird mittels eines scharfen Abschlagens der Platte verworfen. Die anhaftende Zellschicht wird dreimal mit jeweils 200 μl MOPS-PSS unter Verwendung eines 12-Kanal-Pipettiergeräts gewaschen. Die Zellen werden 30 Minuten bei Raumtemperatur entweder mit 200 μl MOPS-PSS oder 20 μl der Depolarisierungslösungen in Gegenwart bzw. Abwesenheit einer Kaliumkanalblocker-Kandidatenverbindung inkubiert. Der Überstand (150 μl pro Vertiefung) wird abgenommen und gezählt. Die Zellschicht wird in 200 μl 0,1% Tween 20 in Wasser solubilisiert, und 150 μl hiervon werden ebenso im Flüssigkeitsscintillationszähler Packard 2200 CA gezählt. Alle Überstände werden in 7,0 ml destilliertem Wasser gezählt.
  • Der prozentuale Ausfluß wird wie folgt berechnet:
    Figure 01130001
    Figure 01140001
    und der Wert für den prozentualen Nettoausfluß wird wie folgt berechnet: % Nettoausfluß = % Gesamtausfluß – % Basalausflußwobei % Gesamtausfluß den durch die Depolarisierungslösung mit 100 mM KCl induzierten Ausfluß bedeutet. Bei dem Basalausfluß handelt es sich um den in der physiologischen Kochsalzlösung, MOPS-PSS, beobachteten Ausfluß (Auslauf) von 89Rb.
  • Beispiel 13
  • Optisches FLPRTM-Screening-System
  • Molecular Device Corporation, Sunnyvale, CA
  • Der FLIPR (Fluorescent Imaging Plate Reader) war zunächst dafür vorgesehen, als Werkzeug zum Screening großer Volumen für Messungen des Membranpotentials von Zellen in 96-Loch-Mikrotiterplatten zu dienen. Die FLIPR-Technik wird auf Fluoreszenztests angewandt, wie etwa bei der Messung bestimmter intrazellulärer Ionen und intrazellulärer pH-Werte. Die FLIPR-Technik kann auch bei Nicht-Fluoreszenz-Tests angewandt werden.
  • Im Fluoreszenzmodus arbeitet der FLIPR so, daß der Boden einer 96-Loch-Mikroplatte beleuchtet und die Fluoreszenz von allen 96 Vertiefungen gleichzeitig unter Verwendung einer gekühlten CCD-Kamera gemessen wird. Mit der Anregungsoptik im FLIPR wird dabei die Platte von unten her beleuchtet und mit der Emissionsoptik von unten gelesen. Dies macht es erforderlich, daß die im Gerät optisch gemessene Mikroplatte einen klaren Boden aufweist.
  • Der typische Meßtest besteht in der Verwendung einer 96-Loch-Platte mit Zellen und einer (oder zwei) 96-Loch-Platte(n) mit den dem Screening zu unterziehenden Kandidatenverbindungen.
  • Die Detektionsoptik des FLIPR beruht auf der gekühlten CCD(Charged Coupled Device)-Technik. Bei jeder kinetischen Aktualisierung nimmt das System ein Bild vom Boden einer Mikroplatte auf, wobei ein Signal für alle einzelnen Vertiefungen gleichzeitig aufgezeichnet wird. Eine verbesserte Empfindlichkeit für Tests auf Zellbasis wird über einen optischen Nachweis erreicht, der die Signalisolierung auf einem Zellmonolayer gestattet. Diese Technik ist sehr wichtig bei Tests, bei denen eine Hintergrundfluoreszenz vorhanden ist (wie etwa von extrazellulärem Farbstoff). Damit der FLIPR zu einem wirkungsvollen Screening-Werkzeug wird, enthält das Instrument ein genaues 96-Loch-Pipettiergerät, mit dem aus zwei separaten Flüssigkeitszugabemikroplatten in eine dritte Mikroplatte, die optisch getestet wird, abgesaugt und verteilt werden kann. Das gesamte System wird über einen PC und einer Software-Schnittstelle auf Windows-Basis gesteuert. Die Schnittstelle stellt flexible Werkzeuge für die Testentwicklung, Qualitätskontrolle und Datenverwaltung bereit.
  • Messungen werden sowohl für spannungsgesteuerte als auch ligandengesteuerte Calciumkanäle auf vielen unterschiedlichen Zellinien, einschließlich CHO, HEK, A10, ECV50, primär kultivierten neuronalen Zellen und anderen, aufgezeichnet. Indikatoren mit einer Wellenlänge im sichtbaren Bereich, namentlich Fluo-3 und Calcium Green-1 werden gebrauchsfertig verwendet.
    Beschreibung vorgeschlagene Lieferfirma Telefonnummer Artikelnummer
    Platten mit schwarzen Wänden, klarem Boden, gewebekulturbehandelt, steril Corning/Costar 800-492-1110 3603
    Packard Instruments 800-856-0734 203-639-2402 6005182
    Nunc V-Bottom-96-Loch-Platte Fisher 800-766-7000 12-565-216 Nunc-Teil-Nr. 249128
    nichtsterile Deckel für Nunc-Platten PGC Scientific 800-424-3300 6-6112-21
    Sterile Wanne für Multikanal-Pipettiergerät Fisher 800-766-7000 13-681-101
    nichtsterile Wanne für Multikanal-Pipettiergerät Fisher 800-766-7000 13-681-100
    Autotip, 96-Spitzen-Ständer, schwarze Spitzen, nichtsteril, 200 μl Robins Scientific 800-752-8585 1053-24-0
    Hank's Balanced Salt Solution Gibco 800-828-6686 14065-056
    HEPES-Pufferlösung 1X Irvine Scientific 800-437-5706 9319
    Probenecid, kristallin Sigma 800-325-3010 P8761
    Fluo-3-AM-Ester Molecular Probes 800-438-2209 541-465-8300 F-1241
    Ca-Green AM-Ester Molecular Probes C-3011
    Pluronsäure Molecular P-6867
    Beschreibung vorgeschlagene Lieferfirma Telefonnummer Artikelnummer
    Probes
    DiBac(4)3, Bis-Oxonol-Farbstoff für Membranpotential Molecular Probes B-438
    BCECF AM-Ester für intrazellulären pH Molecular Probes B-1150
  • Für die Farbstoffbeladung der Zellen benötigte Komponenten:
  • 250 mM Probenecid:
    • jeden Tag jeweils frisch ansetzen: 710 mg Probenecid 5 ml 1,0N NaOH – solubilisieren in 5 ml Hanks + 20 mM Hepes
  • 1 mM Farbstoff:
    • Molecular Probes Fluo3, AM F-1241 Calcium Green 1, AM C-3011 1 mg Fluo3, AM oder Ca-Green1, AM 443 μl MDSO – Farbstoff solubilisieren 443 μl 20% Pluronsäure in DMSO Lösung portionsweise bei –20°C lagern. Läßt sich mehrmals einfrieren und auftauen.
  • Als Alternative eine 2 mM Farbstofflösung, die eingefroren aufbewahrt wird, und eine 20% Pluronsäurelösung, die bei Raumtemperatur aufbewahrt wird, herstellen und die zwei Lösungen vor Gebrauch im Verhältnis 1:1 mischen.
  • 20% Pluronsäure:
    • Molecular Probes P-6867 in ein Röhrchen einwiegen und in DMSO bei 37°C solubilisieren, zum Beispiel: 400 mg/2 ml DMSO. Auf Raumtemperatur abkühlen lassen und portionieren. Bei Raumtemperatur lagern.
  • DMSO:
    • DMSO mit geringem Wassergehalt verwenden.
    • Zum Beispiel: Sigma D2650 in 5-ml-Ampullen.
  • Andere Artikel, die in einer Zellkultureinrichtung benötigt und verwendet werden:
    • • 12-Kanal-Pipettiergerät, 50–200 μl, zum Beispiel Brinkman, Artikel-Nr. 5008130-3
    • • Sterile Pipettenspitzen, 200 μl, zum Beispiel E + K Scientific (Tel: 408-378-2013), Artikel-Nr. 3507-R965) (10 Ständer mit je 96 Spitzen)
    • • Absauggerät zur Entfernung von Medium aus den Plattenvertiefungen. Beispiel: 12-Kopf-Absaugrohrgerät, Artikel-Nr. 851388, oder 8-Kopf-Absaugrohrgerät, Artikel-Nr. 951381 (von Wheaton Science Products (Tel: 800-225-1437)
    • • sterile serologische Pipetten (5 ml, 10 ml, 25 ml)
    • • Wiederaufladbares Pipettiergerät für 2–25-ml-Pipetten
    • • Steriles Gewebekulturwasser
    • • Handschuhe
    • • Kulturmedium zur Anzucht von Zellen
    • • EDTA und Trypsin/EDTA für lebende Zellen
    • • Hämazytometer und Zählgerät
    • • Sterile Reagenzröhrchen, 15 ml und 50 ml
    • • 1N NaOH-Lösung.
  • FLIPR-Test
  • Membranpotential
  • FLIPR wurde im Grunde genommen für die Messung von Membranpotential unter Verwendung des spannungsempfindlichen Farbstoffs DiBAC(4)3 (Molecular Probes B-438) entwickelt. Die Testvorschrift wurde von Dr. Vince Groppi von Upjohn-Pharmacia in Kalamazoo, Michigan, entwickelt.
  • Zellkultur
  • Ein notwendiges Kriterium für Qualitätsdaten vom FLIPR besteht darin, daß sich die gemessenen Zellen am Boden der Vertiefung befinden. Dies bedeutet nicht unbedingt, daß die Zellen anhaften. Diese Notwendigkeit ist auf den optischen Nachweis im FLIPR zurückzuführen, wodurch die Empfindlichkeit gegenüber Fluoreszenz vom Boden der Mikroplattenvertiefung verstärkt wird. Nicht anhaftende Zellen können ebenso verwendet werden, jedoch keine Zellen in Suspension. Im allgemeinen werden nicht anhaftende Zellen herunterzentrifugiert, wobei sie am Boden der Platte einen Pseudo-Monolager ausbilden.
  • Einige Zelltypen benötigen eine Beschichtung (z. B. Poly-D-Lysin), um ein Anhaften zu gewährleisten. Dabei würden in typischen Vorschriften die Mikroplatten vor der Verwendung in einer sterilen Umgebung beschichtet.
  • Die folgende Verfahrensweise wird zur Präparation von Zellen, die den hier beschriebenen neuen Kaliumkanal überexprimieren, z. B. SEQ ID NO: 2, für FLIPR verwendet.
    • Tag 1: Stammkulturen transformierter oder transfizierter heterologer Expressionszellen werden von T75-Kolben mit 1X Trypsin/EDTA abgelöst. Typischerweise enthält ein T75-Kolben 2 × 106 Zellen. Die heterologen Expressionszellen werden auf ungefähr 0,25 × 105 Zellen/ml verdünnt, und 0,2 ml werden jeweils auf die einzelnen Vertiefungen einer 96-Loch-Platte verteilt. Auf diese Weise werden in jede Vertiefung 0,5 × 104 A10-Zellen ausplattiert. So erhält man von einem T75-Kolben nach dreitägigem Wachstum etwa 4 konfluente 96-Loch-Platten.
    • Tag 3: Die heterologen Expressionszellen werden vorsichtig mit frischem Medium gefüttert. Dabei wird darauf geachtet, den Monolager nicht zu zerstören.
    • Tag 4: Zellen stehen zur Analyse im FLIPR bereit.
  • Gemäß dieser Verfahrensweise sollte man in jeder Vertiefung einer 96-Loch-Platte einen gleichförmigen Zellmonolayer erhalten. Falls der Monolager irgendwie nicht gleichförmig erscheint, wird das Experiment beendet, und man präpariert frische Kulturen.
  • Nach Befolgen der obigen Verfahrensweise bis zu Tag 4 (siehe vorhergehender Abschnitt), ist es nun an der Zeit, die Platten für das Testen im FLIPR vorzubereiten. Die A10-Zellen können aufgrund ihrer geringen Neigung zum Überwachsen möglicherweise erfolgreich an Tag 4–6 eingesetzt werden.
  • Kalibrierung
  • Die FLIPR-Technik kann ein Kalibrierungsschema unter Verwendung positiver und negativer Kontrollvertiefungen beinhalten. Bei den Negativkontrollen handelt es sich typischerweise um Zugaben eines nichtstimulierenden flüssigen Puffers. Die Negativkontrollen werden dazu verwendet, die korrekte Arbeitsweise sowohl des Instruments als auch des Tests sicherzustellen, so daß sich flache Grundlinien ergeben und keine Reaktion dort auftritt, wo keine erwartet wird. Die positiven Kontrollvertiefungen werden zur Beobachtung von Änderungen der Signalstärke verwendet. Die Stärkenkalibrierung eignet sich zum Vergleichen aller Daten innerhalb eines einzelnen Laufs mit bekannten Positivkontrollen, wodurch die Platte kalibriert wird.
  • Herstellung von Lösungen (Membranpotentialtest)
  • Mit der folgenden Vorschrift sollen genug Lösungen zum Testen von ungefähr zwei Mikroplatten bereitgestellt werden:
    • 1.) Eine 20 mM Lösung von HEPES-Puffer in EBSS durch Zugabe von 10 ml 1 M HEPES zu 450 ml EBSS herstellen. Diese Lösung wird EBSS + H genannt. Auf 37°C durch Inkubation aufwärmen.
    • 2.) 100 ml EBSS + H mit 5 μM DiBAC durch Zugabe von 50 μl 10 mM DiBAC zu 100 ml EBSS + H herstellen. Diese Lösung wird EBSS + H + D genannt. Bei 37°C aufbewahren. Diese Lösung wird in den negativen Kontrollvertiefungen, zum Waschen der Zellen und auch als Medium in Lösung mit den Zellen während des Testens verwendet. Dabei werden ungefähr 60 ml pro Testplatte verwendet. Die 10 mM DiBAC-Stammlösung wird aus dem Pulver in DMSO hergestellt. Bezüglich der 10 mM DiBAC-Stammlösung: DiBAC wird normalerweise in Mengen von je 25 mg geliefert, so daß es sinnvoll ist, etwa um 20 Portionen von je 300 μl in DMSO zum Einfrieren und zur späteren Verwendung herzustellen.
    • 3.) 50 ml EBSS + H mit 10 μM DiBAC durch Zugabe von 50 μl 10 mM DiBAC zu 50 ml EBSS + H herstellen. Diese Lösung wird EBSS + H + D genannt. Bei 37°C aufbewahren. Diese 10 μM Farbstofflösung (2X) wird im FLIPR zur Vorbehandlung der Pipettenspitzen während eines Laufs verwendet. DiBAC wird in den Kunststoff aufgenommen, und es ist die Stimulusverbindungen werden im DiBAC präpariert, wodurch die Farbstoffkonzentration in den die Zellen enthaltenden optisch gemessenen Mikroplattenvertiefungen beibehalten wird.
    • 4.) 100 ml EBSS + H + D mit 300 mM KCl durch Zugabe von 7,5 ml 4 M KCl zu 92,5 ml EBSS = H und 50 ml 10 mM DiBAC herstellen. Diese Lösung wird EBSS + H + D + 300 KCl genannt.
  • Bei 37°C aufbewahren. Diese 10XKCl-Lösung wird für die positiven Kontrollvertiefungen (Zugabe von 20 ml zu 180 ml: Endkonzentration dadurch: 30 mM KCl) in der Zugabenplatte verwendet.
  • Vorbereitung der Zellplatte
    • 1.) Wachstumsmedium von den Zellen mit einem Multi-Well-Pipettor (Pipettiergerät für mehrere Vertiefungen) abnehmen. Falls ein 8-Well-Pipettor verwendet wird, nicht mehr als 4 Zeilen gleichzeitig pipettieren, um sicherzustellen, daß die Zellen nicht austrocknen. 250 μl vorgewärmtes EBSS + H + D zu den Zellen geben. Dies für die gesamte Platte durchführen. Diese Arbeit sollte auf einer Heizplatte, die auf 37°C eingestellt ist, ausgeführt werden, um Temperaturschwankungen zu minimieren. Zwei Waschschritte mit jeweils 250 μl EBSS + H + D durchführen.
    • 2.) Die 250 μl EBSS + H + D abnehmen und durch 180 μl frisches vorgewärmtes EBSS + H + D ersetzen, wobei wiederum 4 Zeilen gleichzeitig behandelt werden. Es sollte sichergestellt werden, daß die Pipettorspitzen vorbehandelt sind und sich bei der Handhabung der Farbstoffwaschlösungen einheitlich verhalten, um Verdünnungsunterschiede zu vermeiden.
    • 3.) Nach dem Waschen der Zellplatte, diese in den Inkubator zur Aquilibrierung auf 37°C legen.
    • 4.) Die Zellen sollten im FLIPR innerhalb von 2 Stunden nach dem letzten Waschschritt getestet werden.
  • Vorbereitung der Kandidatenverbindung-(Arzneistoff-)Zugabeplatte
    • 1.) 220–250 μl EBSS + H + D in die negativen Kontrollvertiefungen geben. Der Pipettor reicht bis zum 50 μl-Flüssigkeitsniveau und saugt typischerweise nur 20 μl pro Lauf ab, so daß diese Platte mehrere Male verwendet werden kann. Klare Mikroplatten können für die Stimulusplatten verwendet werden. Die Verwendung des FLIPR-96-Loch-Pipettiergeräts zusammen mit einer Platte mit flachem Boden führt zu einem Todvolumen von etwa 50 μl, wohingegen eine Platte mit v-Boden Todvolumen bis hinunter 10–20 μl aufweisen kann.
    • 2.) 220–250 μl EBSS + H + D + 300 KCl in die vorgesehenen positiven Kontrollvertiefungen geben.
    • 3.) Falls die unbekannten Elemente in einem Lösungsmittel vorliegen, sollte sichergestellt werden, daß die gleiche Konzentration an Lösungsmittel in den negativen Kontrollvertiefungen vorliegt. Nach unserer Erfahrung versuchen, wenn möglich unterhalb von 0,1% DMSO zu bleiben.
    • 4.) Die Azneistoffzugabeplatte in den Inkubator legen und auf 37°C äquilibrieren.
  • Typische Mefabfolge für Membranpotential
  • Vorgehensweise beim Hochfahren
    • 1.) Den Laser-Wasserfluß und die elektrische Netzunterbrechungsschaltung einschalten.
    • 2.) Den Laser einschalten. Der Laser braucht typischerweise etwa 15 bis 30 Minuten zur Stabilisierung. Coherent empfielt eine 30minütige Aufwärmstabilisierungsphase für den Laser. Ebenso empfehlen sie (aufgrund der Röhrenlebensdauer), den Lasser nur dann abzuschalten, wenn eine Pause von mehr als 3 Stunden geplant ist, ansonsten den Laser anlassen.
    • 3.) Den Computer, Monitor und die Kamerasteuereinheit einschalten. Dabei sicherstellen, daß die CCD-Kamera vor der Aufnahme von Daten mit der Kamera die Temperatur erreicht hat. Die korrekte Temperatur wird durch ein Aufleuchten des grünes „Status"-Licht auf der Kamerasteuereinheit angezeigt. Normalerweise beträgt die Abkühlzeit der Kamera etwa 5 Minuten.
    • 4.) Das FLIPR-Gehäuse hochfahren. Dabei sicherstellen, daß der PC vor dem Hochfahren des FLIPR-Gehäuses hochgefahren ist. Ansonsten kann das System möglicherweise hängen bleiben.
    • 5.) Den Regulator für die 80 psi-Luftquelle einschalten.
    • 6.) Eventuell vorhandene Verhakungen beseitigen, indem sichergestellt wird, daß sich die Zellschublade in der „In"-Position befindet und die Pipettenspitzen sich in der „Ab"-Position befinden.
    • 7.) Den Luftstrom für die Luftfeuchtigkeitskammer starten (nur bei temperaturabhängigen Tests).
    • 8.) Den FLIPR-Code durch Doppelclicken des FLIPR-Kontrollsoftware-Icons starten. Der Pipettor durchläuft ebenso den normalen „Homing"-Zyklus beim Hochfahren. Falls eine Temperaturregelung erwünscht ist und nicht in der Datei setup.flip automatisch eingestellt ist, diese über das „Pull Down"-Wahlmenü Setup „Heaters" einschalten. Die Temperaturfühler brauchen ungefähr 30 Minuten zur Stabilisierung. Es sei daran erinnert, daß die Temperaturregelungswahlmöglichkeit erfordert, daß die Niedrigdruck-regulierte Luftquelle ebenso eingeschaltet ist.
    • 9.) Warten, bis die Temperaturwarnanzeigen vom Bildschirmfenster verschwunden sind, falls eine Temperaturregelung verwendet wird.
  • Datensammlung
  • Aufgrund der starken Temperaturabhängigkeit von DiBAC ist es eine gute Idee, die Zellen nach Entnahme aus dem Inkubator sofort in die FLIPR-Zellinkubationskammer zu stellen.
  • Sobald die Zellen in die Lösung mit DiBAC gestellt wurden, sollten sie innerhalb von 2 Stunden getestet werden.
  • Zur Verkürzung der Temperaturstabilisierungszeit sollte die Zellplatte und die Zugabeplatte aus dem Inkubator genommen und so schnell wie möglich in die Zellinkubationskammer im FLIPR gestellt werden. Je vorsichtiger der Benutzer im Umgang mit den Platten ist, desto schneller stabilisiert sich die DiBAC-Temperatur und desto schneller stabilisieren sich die Fluoreszenzgrundlinien.
  • Der Benutzer muß dann die im Experiment zu verwendenden Parameter einstellen. Dazu die Wahlmöglichkeit Experiment unter dem Setup-Pull-Down-Menü wählen.
  • Typischer Systemaufbau für Messungen von Membranpotential
  • Systemverstärkungsparameter (gain):
  • Angenommen wird, daß der Laser auf etwa 300 mW eingestellt ist.
  • Da DiBAC hell ist, sollte die Blende auf etwa F5.6 eingestellt werden, d. h. sie sollte etwas verengt werden, Kamerabelichtungszeit um 0,4 Sekunden (wie diese eingestellt wird, ist unten beschrieben).
  • Allgemeine Einstellungsparameter:
    • a.) Belichtungsdauer: (Kameraintegrationszeit): üblicherweise um 0,4 Sekunden
    • b.) Filter Nr. 1 (Standardfilter)
    • c.) Vorbehandlung der Spitzen (üblicherweise angeklickt, üblicherweise vom linken Trog)
    • d.) mehrere Zugaben
    • e.) Automatisierung: Wahlmöglichkeiten vom Anwender gewählt
  • Unter dem Menüpunkt „First Sequence Definition"
    • a.) Probenintervall (typischerweise 20 Sekunden)
    • b.) Probenzählwert (hängt von der gewünschten Versuchsdauer ab), üblicherweise reichen 15 Minuten für DiBAC, daher würden bei einer Aktualiserung alle 20 Sekunden und einer Gesamtlaufzeit von 15 Minuten 45 Proben entnommen.
    • c.) Zweites Intervall (üblicherweise nicht notwendig bei DiBAC, im allgemeinen nur für schnelle Aktualisierungen verwendet)
    • d.) Flüssigkeitszugabe als aktiv angeklickt
    • e.) zuzugebendes Flüssigkeitsvolumen (üblicherweise 20 μl, da DiBAC temperaturempfindlich ist und kleinere Zugabevolumen bevorzugt sind.
    • f.) Abgabegeschwindigkeit (hängt vom Zelltyp ab, 20 μl/s ist langsam, 80 μl schnell, besseres Mischen, je schneller die Mischgeschwindigkeit, hängt davon ab, was die Zellen widerstehen können, ohne daß sie auf den Boden der Platte relokalisiert werden.
  • Unter „Pipettieren"
    • a.) Mischvolumen (im allgemeinen 40 μl)
    • b.) Anzahl Mischungen (im allgemeinen 3, Mischen ist aufgrund der Zugabe eines kleinen Volumens zu einem großen Volumen empfohlen; ebenso ist die DiBAC-Kinetik langsam genug, um ein Weglassen zwischen den Aktualisierungen zu gestatten.
    • c.) Spitzenposition, nicht anklicken, d. h. Spitzen befinden sich außerhalb der Vertiefung während der Datensammlung, da das DiBAC-Experiment langsam ist, hat der Pipettor genügend Zeit, um zwischen Probenpunkten nach oben und in die Flüssigkeit zu gehen, wobei durch das Nichtanklicken dieser Box sichergestellt werden kann, daß die Verbindung nicht vor der vorprogrammierten Zuführung in die Zellplatte ausläuft.
    • d.) Flüssigkeitszugabe, dies ist für DiBAC im allgemeinen angeklickt, das heißt der Vertiefung wird die gleiche Menge an Flüssigkeit entnommen, die zugegeben wurde, in diesem Beispiel 20 μl. Dadurch wird sichergestellt, daß bei der Zugabe einer sehr stark fluoreszierenden Hintergrundkomponente, das heißt dem DiBAC in Lösung mit den Zugabeverbindungen, keine Flüssigkeitshöhenabhängigkeit assoziiert ist. Dies kann notwendig sein oder nicht. Bei Nichtanklicken dieser Box wird die Flüssigkeit zugegeben, wodurch sich das Gesamtvolumen der Vertiefung auf 200 μl ändert (unter der Annahme, daß 20 μl bis 180 μl bereits in die Zellplatte gegeben wurden).
  • Sobald das Experiment definiert wurde, führt der Anwender eine Signalniveauüberprüfung unter Verwendung der Wahlmöglichkeit „Light Bulb" oder Run „Signal Test" durch. Dabei wird eine Kamerabelichtung unter Verwendung der aktuellen, im Setup-Experiment-Fenster definierten Belichtungszeit genommen und die Signalzellwerte für alle 96 Vertiefungen der Platte angezeigt. Ebenso werden einige Statistikwerte der durchschnittlichen, minimalen und maximalen Signalzellwerte für die Belichtung angezeigt. Da der gesamte dynamische Bereich der Kamera 65.000 Counts beträgt, ist es eine gute Idee, mit Signalzählwerten im Bereich von 25.000 bis 30.000 DiBAC zu arbeiten. Bei diesen Verstärkungsniveaus liegt ein gutes physiologisches DiBAC-Signal (z. B. eine Membrandepolarisierung) in der Größenordnung von 5000 Counts. Somit hilft ein Beginn mit einem Grundfluoreszenzbereich von 25 bis 30.000 Counts sicherzustellen, daß die einzelnen Kamerabildpunkte während der Datensammlung nicht gesättigt werden.
  • Falls die Signalzählwerte zu hoch oder zu niedrig sind, wird ein Verkürzen bzw. Verlängern des Kamerabelichtungsintervalls empfohlen, bis das korrekte Signalniveau erreicht ist. Werden Belichtungszeiten von weniger als 0,4 Sekunden benötigt, um auf die gewünschten Videoniveaus zu kommen, so sollte die Laserquellenleistung heruntergefahren oder als Alternative die Kamerablendenöffnung verengt werden. Durch jede Erhöhung der Blendenöffnung der Kamera verringert sich die Nachweisempfindlichkeit um den Faktor 2. Allgemeine Bereiche für die Systemverstärkungsparameter sind wie folgt:
    • Laserleistung: zwischen 150 mW und 1 Watt fahren, wobei geraten wird, um 300 mW eingestellt zu lassen, so daß der Laser jeden Tag mit einer gleichmäßigen Geschwindigkeit aufwärmt, und die Leistung erhöhen, wenn mehr Verstärkung benötigt wird.
  • Kamerablende (zwischen F/2 und F/22 gefahren), wobei angemerkt wird, daß jeder Blendenwert einen Empfindlichkeitsfaktor 2 bedeutet, wobei F/2 die größte Blendenöffnung mit der höchsten Empfindlichkeit bedeutet. Hierbei handelt es sich um die Größe, die am leichtesten verändert werden kann, um Licht auszuschließen, beispielsweise beim Fahren des DiBAC-Tests.
    • Kamerabelichtungszeit: Oberhalb von 0,2 Sekunden gefahren, für kinetische (Mehrfachbild-)Daten. Der Grund hierfür ist, daß bei sehr kurzen Belichtungszeiten die mechanischen Vibrationen beim Öffnen und Schließen des Kameraverschlusses die zeitlichen Fluoreszenzverläufe mit Rauschen versehen können. Bei einer (nichtkinetischen) Einzelbelichtung zeigt sich dieses Problem nicht.
  • Nach dem Einstellen des Signalniveaus ist der Benutzer bereit, mit einer Grundlinienstabilitätsüberprüfung zu beginnen. Hierbei handelt es sich üblicherweise um eine gute Idee, um sicherzustellen, daß die Fluoreszenzgrundlinien sich im thermischen Gleichgewicht befinden, was zu einer flachen Grundlinienfluoreszenz führt. Dies läßt sich durch ds Starten eines Experiments, üblicherweise mit Aktualisierungen alle 20 Sekunden durchführen, wobei das Pipettieren deaktiviert ist. Dies ist eher ein Problem bei DiBAC-Tests als bei intrazellulären Calciumtests. Je nach der Temperatur der Flüssigkeit beim Plazieren der Zellplatte im FLIPR kann die Stabilisierung einige wenige Minuten oder bis zu 20 Minuten in Anspruch nehmen.
  • Unter der Annahme, daß die Grundlinien flach sind, kann dann der Test gestartet werden. Die Grundlinie kann zu jeder Zeit durch Anklicken des Stop-Icons gestoppt werden. Wenn der Anwender davon überzeugt ist, daß die Grundlinien flach genug sind, sollte der Pipettor im Fenster Experimental Setup, „First Sequence"-Dialog Seite, reaktiviert werden.
  • Das Experiment wird fortgesetzt, wobei die Echtzeitanzeige die gemessenen Fluoreszenzdatenwerte aktualisiert, bis die Gesamtzahl der Messungen durchgeführt wurde. An diesem Punkt kehrt der Pipettor zur Pipettenladestation auf der rechten Seite des FLIPR zurück.
  • Sobald der Lauf beendet ist, kann der Anwender die Daten exportieren (oder prozessieren). Dadurch werden die Rohdatendateien, die bereits komprimiert und auf der Festplatte gespeichert sind, in Fluoreszenzzählwerte pro Vertiefung umgewandelt. Das Exportieren von Daten wird ausführlich in Abschnitt 3.5 behandelt.
  • Anmerkungen
  • Nach der Beladung mit Farbstoff sind mehrere Waschschritte in einem nichtfluoreszierenden Salzpuffer erforderlich, um mit dem Vorhandensein von extrazellulären Farbstoff assoziierte Signalartefakte ebenso wie mit fluoreszierenden Elementen im Medium assoziiertes Hintergrundsignal zu reduzieren. Bei dem Hauptartefakt, das bei nichtkorrektem Waschen vorliegt, handelt es sich um eine scharfe Signalabnahme bei Zugabe des Stimulus aufgrund der Verdünnung der starken Hintergrundkomponente. Hierbei sollte daran erinnert werden, daß die Verbindungen im allgemeinen in einer nichtfluoreszierenden Salzlösung, z. B. Hanks, Earles, usw. zusammengemischt werden und daß große Volumenzugaben erfolgen (z. B. 50 μl bis 100 μl), um ein schnelles Mischen sicherzustellen.
  • Bei dem Zellwaschpuffer sollte es sich um die gleiche Lösung wie die mit den Zellen während des Testens verwendete Lösung handeln. Gleichfalls sollte dieser gleiche Puffer zur Herstellung der Stimulusverbindungen verwendet werden, um unerwünschte Änderungen von pH, Osmolarität oder Morphologie in den Zellen während eines kinetischen Experiments zu vermeiden. Typischerweise werden ausgewogene Salzlösungen, wie etwa HBS, PBS oder EBSS verwendet. Es ist sehr wichtig, daß die Verbindungen in „genau" dem gleichen Puffer hergestellt werden, wie dem Puffer, in dem die Zellen gewaschen werden und vor der Durchführung des Experiments sitzen.
  • In einer typischen Vorschrift würde 1,5 Stunden mit Farbstoff beladen, 3,4 Mal mit Puffer (200 μl pro Vertiefung) gewaschen, beispielsweise unter Verwendung eines milden Waschmediums wie etwa dem Denley CellWash. Die genaue Anzahl der notwendigen Waschschritte richtet sich nach dem Zelltyp. Manchmal ist es gut, zwischen den Waschschritten eine Wartezeit einzulegen (2 Waschschritte vor, 2 Waschschritte nach der Wartezeit), um den Zellen eine Reequilibrierung auf eine niedrigere extrazelluläre Farbstoffkonzentration zu gestatten, bevor der letzte Waschschritt durchgeführt wird. Falls die Zellen nur leicht anhaften, gibt es einen Kompromis zwischen dem gründlichen Waschen der Zellen zur Entfernung von extrazellulärem Farbstoff und dem Abwaschen der Zellen von den Platten.
  • Die Pipettorabgabegeschwindigkeit sollte im allgemeinen bei etwa 50 μl/Sekunde liegen. Haften die Zellen allerdings nur leicht an, so muß der Anwender eventuell die Abgabegeschwindigkeit reduzieren. Eine langsame Abgabegeschwindigkeit liegt in der Größenordnung von 20 μl/Sekunde, wobei eine schnelle Abgabegeschwindigkeit um die 80 μl/s liegt. Diese Werte müssen experimentell für jeden Zelltyp bestimmt werden, doch ist es im allgemeinen vorzuziehen, die Abgabe so schnell wie möglich durchzuführen, um das Mischen zu verbessern. Der Kompromiß besteht darin, daß die Pipettiergeschwindigkeit nicht so stark sein kann, als daß die Zellen am Boden der Vertiefung abgelöst werden. Dadurch werden die fluoreszierenden Zellen praktisch aus dem Gesichtsfeld der Kamerabildpunkte entfernt, was zu starken Abnahmen (Artefakten) in den Fluoreszenzverläufen bei der Zugabe von Flüssigkeit führt.
  • Zu Beginn einer Datenaufnahme ist es sinnvoll, einen „Signaltest" durchzuführen, um das Farbstoffbeladungsniveau in den Zellen zu überprüfen. Bei der Erstellung von Beladungsniveauvorschriften ist es sinnvoll, nicht die gesamte Mikroplatte mit Farbstoff zu beladen, um die Zellwerte für die Hintergrundfluoreszenz ablesen zu können. Diese nichtbeladenen Vertiefungen sollten hinsichtlich Waschschritten usw. genauso behandelt werden wie die beladenen Vertiefungen. Die vorherrschende Hintergrundkomponente (unter der Annahme, daß eine Salzlösung zum Puffer während des Experiments verwendet wird) besteht in der Fluoreszenz von den Plastikmikroplatten. Die meisten Salzpufferlösungen weisen bei Anregungswellenlängen von 488 nm eine vernachlässigbare Fluoreszenz auf.
  • Für basale Ionenniveaus wird ein Arbeiten mit Fluoreszenzstartniveaus (über Hintergrund) von etwa 10.000 bis 20.000 Counts (es sei daran erinnert, daß die Sättigung 65.000 Counts beträgt) empfohlen. Dies sollte wiederum je nach den Beladungsniveaus mit ungefähr 0,300 W Laserleistung, 0,4 s Integrationszeit und einer Blendeneinstellung von F/2 erreicht werden.
  • Spezifische Farbstoffbeladungsvorschrift für heterologe Überexpressionszellen
    • 1.) Zellen bis zur Konfluenz ausplattieren: müssen anhaften
    • 2.) Ca. 2 mM Farbstoffstammlösung in wasserfreiem DMSO ansetzen
    • 3.) 1 mM Farbstoffstammlösung durch Verdünnen mit 20% (w/v) Pluronsäure herstellen (nach unserer Erfahrung sehr notwendig)
    • 4.) 4 μM Farbstoffbeladungsstammlösung durch Zugabe von 40 μl 1 mM Stammlösung zu 10 ml Beladungspuffer oder -medium herstellen. Dies reicht für etwa eine Platte.
    • 5.) Wachstumsmedium und Serum von den ausplattierten Zellen abnehmen. Als Alternative beim Beladen in Medium und Serum einfach Farstoff/Medium/Serum zum bereits vorhandenen Medium/Serum geben. Dadurch entfällt ein Absaugschritt, allerdings wird Farbstoffkonzentration reduziert.
    • 6.) Zellen mit 4 μM Farbstoff (ca. 100 μl pro Vertiefung) 1,0 bis 1,5 Stunden beladen
    • 7.) Zellen zweimal mit Pufferlösung waschen. Ein gutes Waschen ist erwünscht, so daß Volumen von wenigstens 200 μl pro Vertiefung verwendet werden sollten.
    • 8.) Zellen nochmals 15 Minuten inkubieren.
    • 9.) Noch zweimal mit Puffer waschen, wobei 100–150 μl in den Vertiefungen zurückbleiben. Das tatsächlich zurückbleibende Volumen hängt von der gewünschten Verdünnungsmenge bei der Vorbereitung der Stimulusplatte ab. Es ist wichtig, daß die Endvolumen gleichmäßig sind, so daß für eine gute Übereinstimmung von Vertiefung zu Vertiefung gesorgt wird. Es kann zweckmäßig sein, 4 Pufferwaschschritte hintereinander ohne erneute Inkubation durchzuführen. Dies wird üblicherweise empirisch bestimmt, und zwar auf der Grundlage, ob ein Farbstoffauslaufartefakt in den negativen Kontrollvertiefungen vorhanden ist oder nicht.
  • Beispiel 14
  • Funktionelle Expression der aus dem Gehirn stammenden Kaliumkanaluntereinheit (SEQ ID NO: 3) ergibt Ströme, die von HNSPC (SEQ ID NO: 5) unterdrückt werden
  • Klonierung von SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 4 in Säugerexpressionsvektoren: Die Sequenzen der codierenden Bereiche, SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 4, enthaltende EcoRI-Fragmente wurden jeweils aus einem pCR2.1-Vektor (Invitrogen, Carlsbad, CA) ausgeschnitten und in die EcoRI-Stelle eines pcDNA3-Vektors (Invitrogen) ligiert. Transformierte Bakterienkolonien wurden einem Screening auf die Orientierung mittels PCR unterzogen, wobei vektor- und genspezifische Primer verwendet wurden. Die Klone wurden mittels DNA-Sequenzierung bestätigt
  • Erzeugung eines Fusionskonstrukts von SEQ ID NO: 2 mit N-terminalem EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein): Das EcoRI-Fragment von SEQ ID NO: 2 in einem pCR:1-Vektor (supra) wurde in die EcoRI-Stelle von pEGFPC1 (Clontech, Palo Alto, CA (Cormack, B. P. et al., Gene, 173: 33 (1996))) ligiert, so daß ein Fusionskonstrukt von SEQ ID NO: 2 mit N-terminalem EGFP erzeugt wurde. Transformierte Bakterienkolonien wurden einem Screening auf die sense-Orientierung mittels PCR unterzogen und durch DNA-Sequenzierung bestätigt.
  • Transfektion: HEK 293-Zellen (ATCC, Rockville, MD) wurden wie folgt transfiziert: 70 μl LipoTAXI (Stratagene, La Jolla, CA) wurden in ein Polystyrolröhrchen gegeben und vorsichtig gemischt. 2 μg pEFGPC1 (zur Verfolgung der transfizierten Zellen verwendeter Kontrollvektor) sowie 5 μg eines der Konstrukte (SEQ ID NO: 2 in pcDNA3 oder SEQ ID NO: 4 in pcDNA3) wurden zu dem Lipid/Medium-Gemisch gegeben und 20 Minuten inkubiert. Anschließend wurden 2 ml OPTI-MEM I zugegeben und vorsichtig gemischt. Zu transfizierende Zellen wurden einmal mit OPTI-MEM I gewaschen, und die 3 ml Lipid-DNA-Gemisch wurden zu den gewaschenen Zellen gegeben und der Ansatz 4–6 Stunden bei 37°C, 5% CO2 inkubiert. Anschließend wurden die Zellen erneut mit 10% hitzeaktiviertem FBS (Biowhittaker, Walkersville, MD) DMEM (Mediatech 10-017-CV) gefüttert. Für die Coexpressionsexperimente wurden in dieser Vorschrift 2 μg pEGFPC1 (Kontrollvektor), 5 μg pcDNA3QT2L ((SEQ ID NO: 2 in pcDNA3) sowie 20 μg pcDNA3QT2S (SEQ ID NO: 4 in pcDNA3) verwendet. Die Zellen wurden verdünnt und erneut auf 35 mm-Schalen 24–48 Stunden vor dem Patch-Clamping-Experiment ausplattiert.
  • COS-7-Zellen (ATCC, Rockville, MD) wurden wie folgt transfiziert: 25 μl DMRIE-C Reagent (Gibco BRL/Life Technologies, Gaithersburgh, MD) wurden zu 2 ml OPTI-MEM I (Gibco BRL/Life Technologies, Gaithersburgh, MD) gegeben, vorsichtig gemischt und 20 Minuten inkubiert. 2 μg pEGFPC1QT2L (an den N-Terminus der SEQ ID NO: 2 fusioniertes EGFP) und 7,3 μg pcDNA3 oder 9,3 μg pcDNA3QT2S (SEQ ID NO: 4 in pcDNA3) (für einen Überschuß von 5 Molar gegenüber dem hKvQT2L(SEQ ID NO: 2)- Konstrukt) wurden zu dem Lipid/Medium-Gemisch gegeben, vorsichtig gemischt und 20 Minuten inkubiert. Zu diesem Ansatz wurden dann 2 ml OPTI-MEM I gegeben und vorsichtig gemischt. Die zu transfizierende Zellen wurden einmal mit OPTI-MEM I gewaschen, und die 4 ml-Lipid-DNA-Gemisch wurden zu den gewaschenen Zellen gegeben und der Ansatz 4–6 Stunden bei 37°C, 5% CO2 inkubiert. Anschließend wurden die Zellen erneut mit 10% hitzeaktiviertem FBS (Biowhittaker, Walkersville, MD) DMEM (Mediatech 10-017-CV) gefüttert. Die Zellen wurden trypsinisiert, verdünnt und erneut auf 35 mm-Schalen 24–48 Stunden vor dem Patch-Clamping-Experiment ausplattiert.
  • Elektrophysiologie: Alle Aufzeichnungen wurden unter Verwendung der herkömmlichen Konfiguration für ganze Zellen vorgenommen (Hammill, O. P. et al., Pfluger Arch., 391, 85–100, 1981). Die Zellen wurden mit 5 μg pcDNA3 oder 2 μg pEGFPQT2L (an den N-Terminus der SEQ ID NO: 2 fusioniertes EGFP) 24–48 Stunden vor den Experimenten transfiziert. Die extrazelluläre Lösung enthielt (mM): 160 NaCl, 4,5 KCl, 1 MgCl2, 2 CaCl2, 5 HEPES, 5 Glucose (pH: 7,4 mit NaOH, ~325 mOsm). In den K+-Selektivitätsexperimenten wurde equimolares Na+ durch K+ substituiert. Die Pipettenlösung enthielt (in mM): 150 K-Aspartat, 2 MgCl2, 1 CaCl2, 5 HEPES, 1,6 EGTA (pH 7,2 mit KOH, ~305 mOsm). Die Durchführung der Spannungsprotokolle und die Aufnahme der Daten erfolgte unter Verwendung der pClamp 6.0-Software (Axon Instr., CA). Der Wechsel der Lösungen und die Applikation von Arzneistoffen erfolgte mit einem Lokalperfusionssystem.
  • Zur Erzeugung der 13 wurden Zellen mit 2 μg pEGFPQT2L (SEQ ID NO: 2) sowie einen 5- oder 10fachen molaren Überschuß an Leervektor (pcDNA3) oder pcDNA3QT2S (SEQ ID NO: 4) 24–48 Stunden vor den Aufzeichnungen transfiziert. Die Ströme wurden mit 850 ms langen Spannungsschritten hervorgerufen, die um jeweils 10 mV von –40 mV auf 70 mV von einem Haltepotential von ca. –60 mV erhöht wurden. Die Ströme werden auf die Zellkapazitanz normiert, woraus sich die Stromdichten ergeben. Die durchgezogenen roten Linien stellen monoexponentielle Anpassungen an die Daten dar.
  • Beispiel 15
  • Nachweis der Expression von SEQ ID NO: 4 in menschlichen Hirntumoren
  • Ein menschlicher Tumor-Blot mit erkrankten und normalen Geweben wurde von der Firma Invitrogen, Carlsbad CA (Kat.-Nr. D5030-01; Chargen-Nr. 607337) bezogen. Der kommerziell erhältliche Blot enthielt aus dem Tumorgewebe von vier verschiedenen Spendern isolierte Gesamt-RNA; Tumor- und Normalgewebe wurden an der gleichen Operationsstelle herausgeschnitten. Pro Spur wurden 20 Mikrogramm Gesamt-RNA aufgetragen und auf einem 1%igen denaturierenden Formaldehydgel laufengelassen. Das Gel wurde mittels Vakuum-Blotting auf eine Nylonmembran übertragen und mittels UV-Bestrahlung und Backen fixiert. Eine 32P-Sonde, die den Nukleotidpositionen 989–1109 der SEQ ID NO: 2 entsprach (Sonde 2), wurde erzeugt (supra) und mit dem Blot bei 42°C in NorthernMaxvorhybridisierungs-/Hybridisierungslösung (Ambion Inc., Austin, TX) hybridisiert. Hochstringente Waschschritte wurden zweimal jeweils 5 min in 2X SSC/0,5% Signaldatensequenz, 5 min in 2X SSC/0,1% SDS, 30 min in 0,1% SSC/0,5% Signaldatensequenz bei 37 Grad nach Sambrook et al., Cold Spring Harbor, Molecular Cloning (1989) durchgeführt. Der Blot wurde 5–7 Tage bei –80°C mit BioMax MS-1-Film (Kodak, Rochester, NY) und zwei Verstärkerfolien in Kontakt gebracht.
  • Verschiedene Modifikationen und Variationen der beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren und des beschriebenen erfindungsgemäßen Systems sind dem Fachmann ersichtlich, ohne daß dabei der Umfang der Erfindung verlassen wird. Obwohl die Erfindung in Zusammenhang mit spezifischen bevorzugten Ausführungen beschrieben wurde, versteht es sich, daß die Erfindung, wie beansprucht, nicht in unangemessener Weise auf solche spezifischen Ausführungsformen beschränkt sein sollte. In der Tat sollen verschiedene Modifkationen der beschriebenen Arten zur Durchführung der Erfindung, die dem Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie oder verwandten Gebieten offensichtlich sind, im Umfang der nachfolgenden Ansprüche liegen.
  • Schlüssel zu den Figuren
  • 1
    • cDNA des aus dem menschlichen Gehirn stammenden Kaliumkanals·SEQ ID NO:1
    • continued → Fortsetzung
  • 2
    • DNA-Strukturbereich des aus menschlichem Gehirn stammenden Kaliumkanals·SEQ ID NO: 2
    • continued → Fortsetzung
  • 3
    • Aus menschlichem Gehirn stammendes Kaliumkanalpeptid [Äminosäuresequenz]·SEQ ID NO: 3
  • 4
    • cDNA-Sequenz (HNSPC) von Ykoyama et al. (Genbank-Zugangsnr. D82346) SEQ ID NO: 4
  • 5
    • Aminosäuresequenz (HNSPC) von Yokoyama et al. SEQ ID NO: 5
  • 6
    • Aminosäuresequenz (HKvLOT1) von Sanguinetti et al. (Genbank-Zugangsnr. U40990, U71077) SEQ ID NO: 6
  • 7
    • SEQ ID NO: 6
    • Alignmentreport von 7. meg unter Verwendung der Clustal-Methode mit PAM250-Restgewichtungstabelle.
    • Montag, 24. November 1997 10.45
    • Page → Seite
    • Continued → Fortsetzung
    • Alignmentreport von 7. meg unter Verwendung der Clustal-Methode mit PAM250-Restgewichtungstabelle.
    • Montag, 24. November 1997 10.45
    • Dekoration „Dekoration 01": umrahmte Reste, die den Konsensus genau entsprechen
  • 8
    • SEQ ID NO: 3
    • Montag, 24. November 1997 11.22
    • Montag, 24. November 1997 11.21
    • Montag, 24. November 1997 11.21
  • 9
    • Herz
    • Gehirn
    • Plazenta
    • Lunge
    • Leber
    • Skelettmuskel
    • Niere
    • Pankreas
    • Mehrfachgewebe-Northern I
    • Sonde 1
    • Herz
    • Gehirn
    • Plazenta
    • Lunge
    • Leber
    • Skelettmuskel
    • Niere
    • Pankreas
    • Mehrfachgewebe-Northern I
    • Sonde 2
    • Milz
    • Thymus
    • Prostata
    • Testis
    • Ovarien
    • Dünndarm
    • Kolon
    • PBL
    • Mehrfachgewebe-Northern I
    • Sonde 2
    • PBL = Periphere Blutleukozyten
    • C = 700 bp großes Haushalt-Cyclophilin-Transkript, verwendet für die Normierung der RNA-Ladung
  • 10
    • Kleinhirn
    • Großhirnrinde
    • Markhirn
    • Rückenmark
    • Okzipitallappen
    • Frontallappen
    • Temporallappen
    • Putamen
    • Menschliches-Gehirn-Northern
    • Sonde 1
    • [unlesbar]
    • PBL = Periphere Blutleukozyten
    • C = 700 bp großes Haushalt-Cyclophilin-Transkript, verwendet für die Normierung der RNA-Ladung
  • 11
    • [unlesbar]
  • 12
    • A
    • Parental → Eltern
    • Transfected → transfiziert
    • D
    • Inhibition → Hemmung
  • 13
    • Density → Dichte
    • Cells → Zellen
    • Time → Zeit
    • Parental → Eltern
    • Long → lang
    • Vector → Vektor
    • Short → kurz
  • 14
    • Activation → Aktivierung
    • Long → lang
    • Vector → Vektor
    • Short → kurz
  • 15
    • [unlesbar]
  • 16
    • [unlesbar]
  • 17
    • Rat → Ratte-Accession Number → Zugangsnummer
  • 18
    • Human → menschlicher
    • Partial → teilweise
  • SEQUENZ PROTOKOLL
    Figure 01420001
  • Figure 01430001
  • Figure 01440001
  • Figure 01450001
  • Figure 01460001
  • Figure 01470001
  • Figure 01480001
  • Figure 01490001
  • Figure 01500001
  • Figure 01510001
  • Figure 01520001
  • Figure 01530001
  • Figure 01540001
  • Figure 01550001
  • Figure 01560001
  • Figure 01570001
  • Figure 01580001
  • Figure 01590001
  • Figure 01600001
  • Figure 01610001
  • Figure 01620001
  • Figure 01630001
  • Figure 01640001
  • Figure 01650001

Claims (11)

  1. Gereinigtes Polynukleotid, umfassend eine für das Polypeptid der SEQ ID NO: 3 codierende Nukleinsäuresequenz, wobei das Polypeptid die Fähigkeit besitzt, den Transmembranfluß und/oder -transport von Kaliumionen zu gestatten.
  2. Polynukleotid nach Anspruch 1, wobei die Polynukleotidsequenz die Sequenz der SEQ ID NO: 2 umfaßt.
  3. Expressionsvektor, umfassend das Polynukleotid nach Anspruch 1 oder 2.
  4. Wirtszelle, transformiert mit dem Expressionsvektor nach Anspruch 3.
  5. Gereinigtes Polypeptid der SEQ ID NO: 3, wobei das Polypeptid die Fähigkeit besitzt, den Transmembranfluß und/oder -transport von Kaliumionen zu gestatten.
  6. Verfahren zur Herstellung von Zellen, die ein Polypeptid der SEQ ID NO: 3 exprimieren, wobei das Polypeptid die Fähigkeit besitzt, den Transmembranfluß und/oder -transport von Kaliumionen zu gestatten, wobei man in dem Verfahren a) geeignete Wirtszellen mit einem eine für ein Polypeptid der SEQ ID NO: 3 codierende Nukleinsäure umfassenden Polynukleotid transformiert, wobei das Polypeptid die Fähigkeit besitzt, den Transmembranfluß und/oder -transport von Kaliumionen zu gestatten, und b) das von der eingeführten Nukleinsäure codierte Polypeptid exprimierende Zellen selektioniert.
  7. Verfahren zur Produktion eines Polypeptids der SEQ ID NO: 3, wobei das Polypeptid die Fähigkeit besitzt, den Transmembranfluß und/oder -transport von Kaliumionen zu gestatten, wobei man in dem Verfahren a) eine Wirtszelle gemäß Anspruch 4 unter für die Expression des Polypeptids geeigneten Bedingungen kultiviert und b) das Polypeptid aus der Wirtszellkultur gewinnt.
  8. Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die die biologische Aktivität eines Kaliumkanals modulieren, wobei man a) einen Kandidatenverbindungsmodulator von biologischer Aktivität mit einem Polypeptid der SEQ ID NO: 3 kombiniert, wobei das Polypeptid die Fähigkeit besitzt, den Transmembranfluß und/oder -transport von Kaliumionen zu gestatten, und b) eine Wirkung des Kandidatenverbindungsmodulators auf die Fähigkeit des Polypeptids zum Transmembranfluß und/oder -transport von Kaliumionen mißt.
  9. Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die die biologische Aktivität eines Kaliumkanals modulieren, wobei man a) einen Kandidatenverbindungsmodulator einer biologischen Kaliumkanalaktivität mit einer ein Polypeptid der SEQ ID NO: 3 exprimierenden Wirtszelle kombiniert, wobei das Polypeptid die Fähigkeit besitzt, den Transmembranfluß und/oder -transport von Kaliumionen zu gestatten, und b) eine Wirkung des Kandidatenverbindungsmodulators auf die Fähigkeit des unter Schritt (a) genannten Polypeptids zum Transmembranfluß und/oder -transport von Kaliumionen mißt.
  10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei es sich bei einer als Verbindung, die die biologische Aktivität eines Kaliumkanals moduliert, identifizierten Verbindung um einen Modulator der Neurophysiologie handelt.
  11. Verwendung eines gereinigten Polypeptids nach SEQ ID NO: 3 oder das Polypeptid exprimierender Wirtszellen oder einer aus den Zellen hergestellten Präparation bei einer Suche nach Verbindungen, die die Fähigkeit des Polypeptids zum Transmembranfluß und/oder -transport von Kaliumionen modulieren.
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