JP2002508178A - ヒトの脳由来のｋｃｎｑ２カリウムチャネル - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 新規のヒト脳由来のカリウムチャネルポリペプチドが記載されており、その際、該ペプチドは発生的に制御され、かつ分化したニューロンに組織特異的である。新規のカリウムチャネルポリペプチドをコードする全長ｃＤＮＡならびにヒト脳由来のカリウムチャネル生体分子の内部構造領域およびアミノ酸残基配列が開示されている。方法はカリウムチャネル生体分子の生物学的活性を調節し、従って神経生理機能を制御する化合物を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は新規のヒトの脳由来のカリウムチャネルポリペプチドの核酸配列およ
びアミノ酸配列、ならびに天然の生体分子の生物学的および／または薬理学的活
性を調節する化合物の同定のための前記配列の使用に関する。また本発明は生体
高分子に関連または媒介される病態生理学的疾患の診断、研究、予防および治療
に関する。

【０００２】発明の背景 カリウムチャネルは巨大分子および機能的多様性の膜内在性タンパク質であり
、かつ実質的に全てのホニュウ類細胞に存在する。脳内のニューロンのカリウム
チャネルは主に負の静止膜電位の維持ならびに活動電位による膜再分極の制御の
役割を担っている。一定のカリウムチャネルが属するサブファミリーによっては
、膜電位の変化、Ｃａ²⁺の細胞内濃度の増加またはリガンド（アセチルコリン、
アドレナリン、ドーパミン、ガラニン、カルシトニンの遺伝子関連ペプチド、ソ
マトスタチンおよびＡＴＰ）のその受容体への結合によって活性化することがで
きる。種々の電位依存性カリウムチャネルの薬理学的同定は、１種以上のタイプ
のカリウムチャネルを遮断することができる標準化合物へのその感受性によって
達成される。カリウムチャネル遮断薬として知られている化合物は、塩化テトラ
エチルアンモニウム（ＴＥＡ）、４−アミノピリジン（４−ＡＰならびに２−Ａ
Ｐおよび３−ＡＰ）、３，４−ジアミノピリジンおよび２，３−ジアミノピリジ
ン、ＢａＣｌ₂、ＣｓＣｌ、ストリキニン、フェンシクリジン、ピリドスチグミ ン、９−アミノアクリジン、ＤｕＰ−９９６（３，３−ビス（４−ピリジニルメ
チル）−１−フェニルインドリン−２−オン；リノピリジン）、クロフィリウム
、キニジン、アミノキノリンおよびキニンを含む。巨大分子および機能的多様性
のためカリウムチャネルは種々の病体生理学的適応症のための薬剤開発の可能な
標的である。前記適応症は記憶退行、発作、てんかん、多発性硬化症、ハンチン
トン舞踏病、不安、鬱病、精神病、尿失禁、糖尿病、喘息、早期分娩、高血圧、
心虚血、偏頭痛、自己免疫疾患、癌、移植片拒絶および不整脈を含む（Toral, J
., et al., Use of Cultured Human Neuroblastoma Cells in Rapid Discovery
of the Voltage-gated Potassium-channel Blockers, J. Pharm. Pharmacol., 4
6:731(1994)）。

【０００３】 ホニュウ類の脳のカリウムチャネル媒介性のニューロンの再分極はインビトロ
でのニューロンを延命化し、かつニューロンのアポトーシス研究の主要なモデル
になっている（例えばShan Ping Yu, et al., Mediation of Neuronal Apoptosi
s by Enhancement of Outward Potassium Current, Science, 278:114(1997)参 照）。アポトーシスによるニューロンの死は、脳の発生段階でのニューロン前駆
細胞の排除を制御する主要な機構であり、かつ正常な神経生理機能に必須である
。カリウムの欠乏によって誘発されるアポトーシスは、特定のＲＮＡおよびタン
パク質の合成、インターロイキン１変換酵素様プロテアーゼ活性の誘導ならびに
フリーラジカル発生を含む事象の致死カスケードを誘発することが証明されてい
る。またニューロンのアポトーシスは一定の病体生理学的疾患の状態を媒介する
。現行の調査者はヒトの神経変性疾患における成熟ニューロンの未熟死の重要性
に焦点を絞っている（Weller, M., et al., Development and Genetic Regulati
on of Programmed Neuronal Death, J. Neural Transm. Suppl., 50:115(1997) ）。

【０００４】 正常な神経生理機能の生体活性に欠陥がないことの重要性は今日臨床医学にお
いてニューロンの機能不全の顕著な証明の結果を容易にもたらした。神経発達学
的疾患および神経生理学疾患、例えば精神分裂病（schizophrenia）、不安およ び鬱病はニューロンの機能不全に関連する重大な生理学的事象である。精神分裂
病ならびに神経変性状態（ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病
、ロイゲーリー病（Lou Gehrig's））は目標管理を失ったニューロンのアポトー
シスであると最近では提案されている。異常型の神経発達プロセスは未熟なニュ
ーロンの死ならびに過剰なニューロン排除の機能不全の両者をもたらす。更に、
神経生理学的疾患、例えば発作およびてんかんにおける破局的神経変性は壊死と
アポトーシスとの分子合作であると提案されている（Stahl, S. M., J. Clin. P
sychiatry, Apoptosis: Neuronal Death by Design, (5): 183(1997)。

【０００５】 ＫＱＴカリウムチャネルのクローニングは、この巨大分子構造の理解を拡張す
るという利点を有している（Wang, Q., et al., Nature Genet., 12:17(1996）W
ei, A., et al., Neuropharmacology, Vol. 35(7): 805(1996); Curran, M. E.,
et al., Cell, 80: 795(1995); Barhanin, J., et al., Nature, 384, 78-80(1
996); Sanguinetti, M. C., et al., Nature, 384: 80(1996); Attali, B., Nat
ure, 384: 25(1996)）。

【０００６】 最近、ヒトの繊維芽細胞腫系列からのカリウムチャネルの３９３アミノ酸のポ
リペプチドをコードするといわれている全長１．５ｋｂのｍＲＮＡ転写物が記載
されている（Yokoyama, M., et al., Identification and Cloning of Neurobla
stoma-Specific and Nerve Tissue-Specific Genes through Compiled Express
Profiles, DNA Research, 3:311(1996)）。

【０００７】 多数の神経生理学的機能の調節におけるカリウムチャネルの中心的役割はこれ
を治療開発のための特に重要な標的にすることである。あいにく、ヒトのニュー
ロンにおいてカリウムチャネルを排他的に遮断する化合物はまだ見いだされてい
ない。従って、神経生理学的活性の調節のための候補化合物をスクリーニングす
るための薬理学的標的として分化したニューロン由来のカリウムチャネルを同定
することが必要とされている。かかる調節剤は機能不全ニューロンによって生じ
る疾患の治療に潜在的に有用である。選択的なチャネル遮断薬は、神経発達学的
疾患および神経生理学的疾患ならびに脳のニューロンアポトーシスに関するカリ
ウムチャネルの神経薬理学に取り組むために必要である。

【０００８】 ニューロンのアポトーシスの活性化および発生に関連する生体分子の同定およ
び特徴付けは、神経生理学的疾患の抑制および／または遮断のための治療化合物
の開発に最も重要である（Stahl, S. M., J. Clin. Psychiatry, Apoptosis: Ne
uronal Death by Design, (5):183(1997)）。相当のスループットを有する機能 的アッセイの有用性はカリウムチャネル調節剤に焦点を絞った任意の薬剤開発プ
ログラムの必須の部分である。かかるアッセイは一連の作業で数百種の化合物を
スクリーニングできるべきである（Toral, J., et al., Use of Cultured Human
Neuroblastoma Cells in Rapid Discovery of the Voltage-gated Potassium-c
hannel Blockers, J. Pharm. Pharmacol., 46:731(1994)）。

【０００９】発明の概要 本発明は、カリウムチャネルのポリペプチドをコードする単離、精製されたポ
リヌクレオチド分子または配列番号：３に実質的に記載された配列を有するポリ
ペプチドをコードする核酸配列を有するその生物学的に活性な誘導体もしくは生
物学的に活性なその断片に関する。しかし本発明の単離、精製されたポリヌクレ
オチドは配列番号：１（新規のヒトの脳由来のカリウムチャネルｃＤＮＡ）およ
び配列番号：２（新規のヒトの脳由来のカリウムチャネル構造的コード領域）に
限定されるものではない。

【００１０】 更に、本発明は実質的に配列番号：３に記載されるアミノ酸配列を有し、かつ
カリウムチャネルポリペプチドとして機能する精製ポリペプチドに関する。

【００１１】 更に本発明は組み換え宿主細胞においてカリウムチャネルポリペプチドを発現
させるための発現ベクターに関し、その際、該ベクターは実質的に配列番号：３
に記載される配列を有するカリウムチャネルポリペプチドもしくはその生物学的
に活性な誘導体をコードする核酸配列を有する。

【００１２】 更に本発明はカリウムチャネルポリペプチドの発現のための発現ベクターを有
する宿主細胞に関し、その際、該ベクターは実質的に配列番号：３に記載される
配列を有するカリウムチャネルのポリペプチドもしくはその生物学的に活性な誘
導体をコードする核酸配列を有するポリヌクレオチドを有する。また本発明は実
質的に配列番号：３に記載されるアミノ酸配列を有するカリウムチャネルポリペ
プチドを、前記の宿主細胞を前記のポリペプチドの発現に適当な条件下で培養し
、宿主細胞培養から前記のポリペプチドを回収することによって製造する方法に
関する。また本発明は実質的に配列番号：３に記載されるアミノ酸配列を有する
カリウムチャネルを形成する能力を有するポリペプチドを、宿主細胞を前記ポリ
ペプチドの発現に適当な条件下で培養することによって製造する方法に関する。

【００１３】 本発明は更にカリウムチャネルの生物学的活性を調節する化合物を同定するに
あたり、 （ａ）カリウムチャネルの生物学的活性の候補化合物調節剤と配列番号：３に実
質的に記載されるような配列を有するカリウムチャネルポリペプチドとを混合し
、 （ｂ）候補化合物調節剤の効果を生物学的活性において測定する方法に関する。

【００１４】 本発明は更にカリウムチャネルの生物学的活性を調節する化合物を同定するに
あたり、 （ａ）カリウムチャネル生物学的活性の候補化合物調節剤と配列番号：３に実質
的に記載されている配列を有するカリウムチャネルポリペプチドを発現する宿主
細胞とを混合し、かつ （ｂ）候補化合物調節剤の効果を生物学的活性において測定する方法に関する。

【００１５】 本発明は更に神経生理機能を調節する化合物を同定するにあたり、 （ａ）神経生理機能の候補化合物モジュレーター（modulator）と実質的に配列 番号：３に記載されるような配列を有するカリウムチャネルのポリペプチドとを
混合し、かつ （ｂ）候補化合物調節剤の効果をカリウムチャネルの生物学的活性において測定
する方法に関する。

【００１６】 本発明は更に神経生理機能を調節する化合物を同定するにあたり、 （ａ）神経生理機能の候補化合物調節剤と実質的に配列番号：３に記載されるよ
うな配列を有するカリウムチャネルのポリペプチドを発現する宿主細胞とを混合
し、 （ｂ）候補化合物調節剤の効果をカリウムチャネルの生物学的活性において測定
する方法に関する。

【００１７】 また本発明は前記の方法によって同定され、かつカリウムチャネルの生物学的
活性を調節する活性化合物に関する。

【００１８】 また本発明は前記の方法によって同定された、神経生理機能を調節する活性化
合物に関する。

【００１９】 更に、本発明は前記の方法の少なくとも１つで活性な化合物を含有し、かつ該
化合物がカリウムチャネルの生物学的活性の調節剤である医薬品組成物に関する
。

【００２０】 更に、本発明は前記の方法の少なくとも１つで活性な化合物を含有し、かつ該
化合物が神経生理機能の調節剤である医薬品組成物に関する。

【００２１】 更に、本発明はカリウムチャネルに媒介される状態、またはヒトのカリウムチ
ャネルの生物学的活性に媒介される状態の治療を必要とする患者の新規の治療に
おいて、前記の方法の少なくとも１つで活性なカリウムチャネル調節化合物を適
用することに関する。

【００２２】 本発明の別の有利な態様は、神経生理機能に媒介される状態のかかる治療を必
要とする患者の新規の治療において、前記の方法の少なくとも１つで活性なカリ
ウムチャネル調節化合物を適用することに関する。

【００２３】 更に本発明は配列番号：２の全てを実質的に有するアンチセンスポリヌクレオ
チド分子またはその生物学的に有効な部分ならびに該アンチセンス分子の有効量
を適用することからなるカリウムチャネルポリペプチドの発現の阻害もしくはダ
ウンレギュレーションのための方法に関する。

【００２４】 更に本発明は配列番号：２の全てを実質的に有するアンチセンスポリヌクレオ
チド分子またはその生物学的に有効な部分ならびに該アンチセンス分子の有効量
を適用することからなる細胞における神経生理機能を調節するための方法に関す
る。

【００２５】 また本発明は配列番号：３に実質的に記載されるようなアミノ酸配列を有する
精製ポリペプチドに対して特異性を有する抗体に関する。

【００２６】 また本発明は配列番号：３に実質的に記載されるようなアミノ酸配列を有する
ポリペプチド配列を同定するための種々の診断組成物に関する。

【００２７】 図面の簡単な説明 図１は本明細書に記載されるような分化したニューロンに対して組織特異的な
脳由来のカリウムチャネルポリペプチドをコードする３０２９塩基のｃＤＮＡ核
酸配列を示す配列番号：１を表している。

【００２８】 図２は本明細書に記載されるような分化したニューロンに対して組織特異的な
ヒトの脳由来のカリウムチャネルポリペプチドをコードするｃＤＮＡ核酸配列の
ＡＴＧからＴＧＡの２５６５塩基の翻訳される構造領域である配列番号：２を表
している。

【００２９】 図３は本明細書に記載されるような分化したニューロンに対して組織特異的な
ヒトの脳由来のカリウムチャネルポリペプチドの８５４アミノ酸残基配列である
配列番号：３を表す。

【００３０】 図４はＨＮＳＰＣカリウムチャネルに属する１４２５塩基のｃＤＮＡ配列であ
る配列番号：４を表している。Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号Ｄ８２３４６。

【００３１】 図５は最近記載されたＨＮＳＰＣカリウムチャネルの３９３アミノ酸残基配列
である配列番号：５を表している。Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号Ｄ８２３４６；
Yokoyama, M., et al., Identification and Cloning of Neuroblastoma-Specif
ic and Nerve Tissue-Specific Genes through Compiled Express Profiles, DN
A Research, 3:311(1996)。

【００３２】 図６は最近記載されたヒトのＫｖＬＱＴ１カリウムチャネルの５８１アミノ酸
残基配列である配列番号：６を表している。Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号Ｕ４０
９９０、Ｕ７１０７７；Barhanin, J., et al., Nature, 384, 78-80(1996); Sa
nguinetti, M. C., et al., Nature, 384: 80(1996)。

【００３３】 図７は本明細書に記載される新規のヒトの脳由来のカリウムチャネルポリペプ
チドのアミノ酸残基配列（配列番号：３）ならびにカリウムチャネルポリペプチ
ドＨＮＳＰＣのアミノ酸残基配列（配列番号：５）およびｈＫｖＬＱＴ１（配列
番号：６）間の比較整合を表している。保存されているアミノ酸残基は四角で囲
った。ダッシュは整合を最適化するために導入したギャップを表す。この図に示
される配列はＤＮＡＳＴＡＲソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ、マジソン ＷＩ）の多配列整合プログラムを使用して作成した。

【００３４】 図８は本明細書に記載される新規のヒトの脳由来のカリウムチャネルポリペプ
チドのアミノ酸残基配列（配列番号：３）、ならびに予想される膜内外セグメン
トを示すカリウムチャネルポリペプチドＨＮＳＰＣ（配列番号：５）およびｈＫ
ｖＬＱＴ１（配列番号：６）のアミノ酸残基配列の疎水性プロット（hydropathy
plot）を表している。（Kyte, J., Doolittle, R. F., J. Mol. Biol., 157: 1
05(1982); DNASTAR Inc, Madison WI）。

【００３５】 図９は、（パネルＡ）本明細書に記載されるヒトの脳由来のカリウムチャネル
ポリペプチドコーディング領域（配列番号：２）に特異的な核酸プローブＮｏ１
を使用する；（パネルＢ）および（パネルＣ）ＨＮＳＰＣのｃＤＮＡ（配列番号
：４）とヒトの脳由来のカリウムチャネルポリペプチドコーディング領域（配列
番号：２）とに共通の核酸プローブＮｏ２を使用する複数の組織のノーザンブロ
ット分析を表す。

【００３６】 図１０は、（パネルＡ）本明細書に記載されるヒトの脳由来のカリウムチャネ
ルポリペプチドコーディング領域（配列番号：２）に特異的な核酸プローブＮｏ
．１を使用する；（パネルＢ）ＨＮＳＰＣのｃＤＮＡ（配列番号：４）と本明細
書に記載されるヒトの脳由来のカリウムチャネルポリペプチドコーディング領域
（配列番号：２）とに共通の核酸プローブＮｏ２を使用するヒトの脳の異なる領
域のノーザンブロット分析を表している。

【００３７】 図１１は、（パネルＡ）本明細書に記載されるヒトの脳由来のカリウムチャネ
ルポリペプチドコーディング領域（配列番号：２）に特異的な核酸プローブＮｏ
１を使用する；（パネルＢ）ＨＮＳＰＣのｃＤＮＡ（配列番号：４）と本発明に
記載されるヒトの脳由来のカリウムチャネルポリペプチドコーディング領域（配
列番号：２）とに共通の核酸プローブＮｏ２を使用するヒトの成人の脳およびヒ
トの胎児の脳、未誘導および神経細胞誘導性の神経芽細胞腫細胞系列ｉｍｒ−３
２および星状細胞のノーザンブロット分析を表している。

【００３８】 図１２はホニュウ類ＣＯＳ−７およびＨＥＫ２９３細胞系列における配列番号
：３機能的Ｋ⁺活動電流の発現および活性を示している。

【００３９】 Ａ．親細胞の活動電流の欠如に対する、トランスフェクションしたＣＯＳ−７
細胞の緩慢に活性化し、不活性化していないヒトの脳由来のカリウムチャネルサ
ブユニットの活動電流。活動電流上の実線は単一指数的である（τ＝２１６ｍｓ
）。

【００４０】 Ｂ．ＣＯＳ−７およびＨＥＫ２９３細胞で現れる配列番号：３サブユニットの
活動電流の標準化した平均（±ＳＥＭ；ｎ＝３−１２）定常状態活性の電圧依存
性。実線はデータにボルツマン適合（Boltzman fit）である（ＣＯＳ−７：Ｖ_{1/ 2} ：−６ｍＶ、傾斜率：１３；ＨＥＫ２９３：Ｖ_1/2：１２ｍＶ、傾斜率：１８）
。

【００４１】 Ｃ．配列番号：３サブユニット（ＨＥＫ２９３細胞）の［Ｋ⁺］₀における逆転
電位の依存性。逆転電位をピークテール活動電流から測定し、かつ液体接合部電
位を補正した。平均（±ＳＥＭ；ｎ＝３−６）データ点上の線形回帰（実線）は
１０倍の増加［Ｋ⁺］₀あたりの５９ｍＶの傾斜を示し、ネルンストの方程式によ
って予想されるようなＫ⁺に高度に選択的な電流を示す。

【００４２】 Ｄ．配列番号：３のサブユニットのテトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）によ
る濃度依存性阻害。赤線は平均（±ＳＥＭ、括弧中のｎ）データ点に対するヒル
適合（Hill fit）（ＩＣ₅₀：０．１３ｍＭ、傾斜率０．５９）。

【００４３】 図１３は配列番号：２（長い）および配列番号：４（短い）によるＣＯＳ−７
およびＨＥＫ２９３細胞の同時トランスフェクションの間のＫ⁺活動電流の効果 を示している。

【００４４】 Ａ．配列番号：２をトランスフェクトさせたＣＯＳ−７細胞における一連の段
階的電圧の増加により誘導される活動電流の典型的な重ね合わされた群。

【００４５】 Ｂ．配列番号：４および配列番号：２で５：１の比で同時トランスフェクショ
ンされた細胞からの（Ａ）と同様のプロトコールを使用して得られた活動電流の
重ね合わされた群。

【００４６】 Ｃ．配列番号：４と配列番号：２の組合せを指示される比で同時トランスフェ
クションした全てのＣＯＳ−７細胞およびＨＥＫ２９３細胞からの電流密度の概
略データ（平均±ＳＥＭ、ｘ軸下の括弧中のｎ）（^*ｐ＜０．０５の親細胞電流 密度とは異なることを表す、^**ワンウェイＡＮＯＶＡ（one-way ANOVA）による ｐ＜０．００１レベルを表す）。

【００４７】 図１４は活動電位依存性とｈＫｖＱＴ２Ｓ（配列番号：４）およびｈＫｖＱＴ
２Ｌ（配列番号：２）を５：１の比で同時トランスフェクションした細胞に対す
るｈＫｖＱＴ２Ｌ（配列番号：２）（＋空ベクター）をトランスフェクションし
たＣＯＳ−７細胞中の電流に関するキネティック。活動電位依存性（Ａ）と活動
キネティック（Ｂ）はＫｖＱＴ２Ｌ＋ＫｖＱＴ２Ｓ（ワンウェイＡＮＯＶＡ；ｐ
＞０．０５）で同時トランスフェクションした細胞に対するＫｖＱＴ２Ｌでトラ
ンスフェクションした細胞における電流に関してはあまり異ならない。

【００４８】 Ａ．標準化平均（±ＳＥＭ；ｎ＝５−６）定常状態の活動電流の活動電位依存
性。実線はデータに対してボルツマン適合である（ベクター＋ＫｖＱＴ２Ｌ：Ｖ _1/2 ：−６ｍＶ、傾斜率：１３，ＫｖＱＴ２Ｓ＋ＫｖＱＴ２Ｌ ５：１；Ｖ_1/2： −２ｍＶ、傾斜率：１２）。

【００４９】 Ｂ．電位段階の増大された範囲によって誘導される電流の活性化に対する単一
指数適合から得られる平均（±ＳＥＭ；ｎ＝５−６）τ。

【００５０】 図１５はヒトの脳腫瘍のノーザンブロット分析を示している。ｈＫｖＱＴ２（
配列番号：４）の短いスプライス変異体に相当する約２Ｋｂのバンドが脳腫瘍レ
ーンに検出されたが、同じ脳からの隣接した非腫瘍細胞または脳に転移した非脳
由来の腫瘍からの隣接した非腫瘍細胞においては検出されなかった。

【００５１】 図１６は未分化、分化およびβ−アミロイド処理したＳＮ５６およびＳＮ４８
中隔細胞系列のノーザンブロット分析を示している。配列番号：１／配列番号：
２特異的なバンドはコリン作動性ＳＮ５６細胞中に検出されるが、ＳＮ４８細胞
（カリウム電流を欠落している）においては検出されなかった。

【００５２】 図１７はラットおよびヒトのＫｖＱＴ３の代表的なアミノ酸残基配列である配
列番号：７および配列番号：８を示している。

【００５３】 発明の詳細な説明 特に記載がない限り、本明細書において使用される全ての技術的かつ科学的用
語は本発明に属する当業者によって一般に理解される同様の意味を有する。本明
細書中に引用されている全ての文献および特許は記載することにより引用したも
のとする。

【００５４】 本明細書で使用されるような生物学的活性は膜内外カリウムイオンを流動およ
び／または移送する能力または膜内外カリウムイオンの流動および／または移送
を制御する能力または別のサブユニット、リガンドもしくはコファクターとサブ
ユニットが結合する能力および／またはカリウムチャネルの薬理学的活性を調節
することを言う。

【００５５】 本明細書において使用されるような核酸配列はオリゴヌクレオチド、ヌクレオ
チドまたはポリヌクレオチド配列およびその断片および部分ならびにゲノム由来
もしくは合成由来のＤＮＡもしくはＲＮＡであり、これらは二本鎖またはセンス
鎖もしくはアンチセンス鎖を表す一本鎖であってよい。同様に、本明細書で使用
されるようなアミノ酸および／または残基配列はペプチドもしくはタンパク質配
列またはその部分である。

【００５６】 本明細書においては精製された分子、核酸もしくはアミノ酸配列が使用され、
天然の環境から分離し、かつ天然関連の少なくとも１種の他の成分から単離また
は分離される。

【００５７】 本発明において使用されるように、カリウムチャネル分子構造または本明細書
に開示されるポリペプチドは配列番号：３と実質的に類似の生物学的活性（機能
的または構造的に）を有する化合物または物品である。用語“機能的誘導体”は
“断片”、“誘導体”、“分解バリアント”、“類似体”および“ホモログ”な
らびに“化学的誘導体”を含むとする。用語“バリアント”は、構造および機能
においてカリウムチャネル分子またはその断片と実質的に類似の分子を意味する
。分子は、両分子が実質的に類似な構造を有するか、または両分子が類似の生物
学的活性を有する場合にはカリウムチャネルポリペプチドに“実質的に類似”で
ある。用語“類似体”は機能において全ての天然のポリペプチドまたはそのＣ−
末端断片に実質的に類似な分子である。

【００５８】 用語“調節”はカリウムチャネルの機能的特性を促進または阻害する能力のこ
とを表すために使用される。また用語“調節”はニューロンの生物物理学的活性
に影響を及ぼす能力を表すために使用される。

【００５９】 本明細書において使用される生物学的活性の調節または制御は、新規のカリウ
ムチャネルポリペプチドを含むが、それに制限されないカリウムチャネル生体分
子構造の結合、遮断、拮抗、抑制、中和または封鎖；ならびに本発明によって同
定された化合物によるカリウムチャネルの制御または作動または活性化を表す。

【００６０】 本明細書で使用されるような神経生理機能の調節はニューロンの生物物理学的
制御およびニューロンに関連または媒介される病理学的疾患の治療を表す。本発
明において使用されるような“実質的に記載されるような”は、変化してもよい
が、実質的に同様な生物学的機能を実質的に同様に実施する機能的誘導タンパク
質、ペプチドおよびＤＮＡ配列を表す。

【００６１】 本明細書において使用されるような生物学的に活性な断片はＮ−末端もしくは
Ｃ−末端またはその両端に関して欠損しているペプチド；または相応のポリヌク
レオチドコーディング領域の相応の５’末端または３’末端もしくはその両端に
関して欠損しており、該断片は同様の生物学的機能を実質的に実施するか、また
は実質的に同様に実質的に同様の機能を実施するペプチドをコードする。用語“
生物学的に活性な”はまた天然産生と実質的に同様の構造的、制御または生化学
的機能を有するホモログまたは類似体の活性をいう。

【００６２】 本明細書で使用される発現ベクターは、本発明の領域のコーディング領域を宿
主細胞における正確な転写および翻訳を通して異種タンパク質コーディング領域
を発現させる成分を有する核酸ベクター構築物を表す。通常発現ベクターは、異
種コーディング領域を転写するポリメラーゼが向かうプロモーター、異種コーデ
ィング領域を組み込むクローニングサイトならびに通常ポリアデニル化シグナル
を有する。発現ベクターはプラスミドベクター、レトロウイルスベクター、ウイ
ルスベクターおよび合成ベクターを含むが、これに制限されるものではない。

【００６３】 本明細書で使用されるような形質転換した宿主細胞はそのゲノムに安定に組み
込まれているか、またはエピソーム的に複製もしくは非複製のものとして直鎖状
核酸または転写物もしくは環状プラスミドまたはベクターの形で存在する本発明
のコーディング領域を有する細胞を表す。

【００６４】 本明細書で使用される直接の適用は本発明の態様（例えば配列番号：３；調節
剤化合物分子、アンチセンス分子、抗体分子）をコードする核酸構築物またはそ
の断片の直接の適用；および本発明の態様もしくはその断片の直接の適用、なら
びに、有利には適当な医薬品キャリアー中での有効な真核性発現ベクターによる
本発明の分子のインビボ導入を表す。本発明のポリヌクレオチドおよび治療分子
を核酸転写物の形で輸送してもよい。

【００６５】 カリウムチャネル カリウムチャネルは最も進化的に太古の、偏在しかつ多様なイオンチャネルで
ある。全ての真核生物に存在するカリウムチャネルは静止膜電位を調節し、種々
の細胞型の電気的興奮性をコントロールする。カリウムチャネルは内生的に拍動
する細胞のスパイク間隔の定義と同様に特異的に細胞において機能を有する。神
経系において、カリウムチャネルは最終的に知覚、学習および動作に重要な活動
電位形状を左右する役割のためシグナル伝達の主要なレギュレーターである（We
i, A., et al., Neuropharmacology, Vol. 35(7): 805(1996)）。正常な神経生 理機能の生体活性の保全の重要性は臨床医学において今日ニューロン不全の原因
の明白な証明の成果をもたらしている。

【００６６】 マウスの新皮質のニューロンの、例えば血清の欠乏または星状胞子によって誘
導されるアポトーシスは遅延整流（Ｉ_k）電流の初期の促進および全体の細胞内 Ｋ⁺のロスに関連している。テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）による外部Ｋ⁺ 電流の減退または高められた細胞外Ｋ⁺（Ｃａ²⁺、Ｃｌまたは他のＫ⁺チャネルの
遮断薬ではない）は、細胞内Ｃａ²⁺濃度の関連した増加を抑えてもアポトーシス
を低下させる。更にＫ⁺イオノホアであるバリノマイシンまたはＫ⁺チャネルを開
くクロマカリムへの暴露はアポトーシスを誘導する。促進されたＫ⁺流出は一定 の形のニューロンのアポトーシスを媒介することがある（Shan Ping Yu, et al.
, Mediation of Neuronal Apoptosis by Enhancement of Outward Potassium Cu
rrent, Science, 278:114(1997)。

【００６７】 Ｋ⁺の流出の増加がアポトーシスをもたらす第一段階であるという仮説の支持 において、選択的Ｋ⁺イオノホアであるバリノマイシンの適用は、例えば胸腺細 胞、リンパ球および腫瘍細胞におけるアポトーシスの引き金を引く。２０ｎＭの
バリノマイシンへの２４〜４８時間の暴露は皮質培養において、染色体の凝縮、
細胞体収縮、ヌクレオソーム内のＤＮＡ断片化およびシクロヘムイミドへの感受
性を特徴とする典型的なニューロンのアポトーシスを誘導する。更にまた、ホニ
ュウ類の中枢ニューロンにおけるＫ_ATPチャネルならびにＩ_k様電流を活性化する
Ｋ⁺チャネルを開くであるクロマカリムへの２４〜４８時間の暴露は典型的なニ ューロンのアポトーシスを誘導する。この証拠は外部Ｋ⁺電流の促進は皮質ニュ ーロンのアポトーシスの形成の主要なメディエーターであることを暗示している
。シャン・ピン・ユー他（Shan Ping Yu et al）は、特に不活性化されていない
遅延整流Ｋ⁺チャネルによる過剰なＫ⁺流出の遮断への介入は、疾患状態における
ニューロンのアポトーシスの減衰のためのストラテジーとして調査されている（
Shan Ping Yu, et al., Mediation of Neuronal Apoptosis by Enhancement of
Outward Potassium Current, Science, 278:114(1997)。

【００６８】 最近の分子クローニングおよび機能的発現実験は類似の機能的多様性を根底と
する遺伝子を明らかにし、多遺伝子ファミリーの幾つかの保存されたクラスにグ
ループ化することができる。特にＫＱＴチャネルは電位依存性チャネルと区別さ
れるコア領域を有する（Wei, A., et al., Neuropharmacology, Vol. 35(7): 80
5(1996)。

【００６９】 電位依存性カリウムチャネルのＫＱＴクラスは他の電位依存性カリウム（Ｋｖ
）チャネルとは進化的に異なる（Bahranin, J., et al., Nature, 384, 78-80(1
996)。最も注目すべき違いはサブファミリー特異的会合を媒介するＮ末端の三量
体化ドメインの不在である（Wei, A., et al., Neuropharmacology, Vol. 35(7)
:805(1996)。孔および６番目の膜内外領域において、保存された残基の唯一のパ
ターンによってＫＱＴチャネルとＫｖチャネルとは区別される、例えば孔を先行
するＡＤＡＬモチーフ、孔中のＫｘＰＱＴＷモチーフならびにＳ６中のＳＦＦＡ
ＬＰＡＧＩＬＧＳＧモチーフである。

【００７０】 ＫＱＴの遺伝子ファミリーの第１のメンバーはＫｖＬＱＴ１である。該遺伝子
の突然変異は、保因者が心不整脈を起こしやすくなる遺伝疾患である長期ＱＴ症
候群の形に関係する（Wang, Q., et al., Nature Genet., 12:17(1996)）。最近
、２種の独立の群によって、ＫｖＬＱＴ１ならびにＩＳＫと呼ばれる別の一回膜
貫通タンパク質は心臓に関連し、活動電位の再分極の原因である緩慢に活動する
カリウム電流Ｉ_KSを形成することが示された（Barhanin, J., et al., Nature,
384 78-80(1996); Sanguinetti, M. C., et al., Nature, 384:80(1996)。バル ハニン他およびサングネッティ他（Barhanin et al. and Sanguinetti et al） は最近、遅延整流Ｋ⁺チャネルの分子成分（新規の抗不整脈薬の調査において重 大な段階）を同定した（Nature, 384, 78-80(1996); Nature, 384:80(1996); At
tali, B., Nature, 384: 25(1996)）。ＣＯＳ細胞において、ＫｖＬＱＴ１発現 は電位依存性の、迅速に活性化し、かつ緩慢に不活性化する外部のＫ⁺電流を誘 導する。ＫｖＬＱＴ１のメッセンジャーＲＮＡはマウスの心臓、腎臓および唾液
腺に豊富であるが、脳、骨格筋および肝臓では殆ど検出できない。Ｉ_KSチャネル
の分子の同定は新規の抗不整脈薬のデザインを助長するはずである（Barhanin,
J., et al., Nature, 384:25(1996)。ＫｖＬＱＴ１のノーザンブロット分析はヒ
トの心臓、胎盤、肺、腎臓および膵臓における発現を示しているが、脳ではシグ
ナルは検出されない（Sanguinetti, M. C., et al., Nature, 384:80(1996)）。

【００７１】 最近、ヨコヤマ他（Yokoyoma, M., et al）はＨＮＳＰＣ（ヒトニューロン特 異的カリウムチャネル）と呼ばれる、神経芽細胞腫細胞系列（ＣＨＰ１３４）か
らの３９３アミノ酸ポリペプチドをコードする転写物を報告している（DNA Rese
arch, 3:311(1996)）。ヒトの神経芽細胞腫は、神経芽細胞または副腎髄質もし くは交換神経節中の交感神経の未分化神経細胞から生じる悪性腫瘍である。著者
はその称するところでは神経系で特異的に発現する遺伝子の同定を教示している
。ヨコヤマの転写物に相当する全長の１４２５塩基のｃＤＮＡは本明細書中に記
載（配列番号：４）しており、かつ配列番号：４の位置１７８〜１３５６に及ぶ
３９３アミノ酸のオープンリーディングフレームを有することを示している。Ｈ
ＮＳＰＣは神経系で特異的に発現する電位依存性カリウムチャネルの全ての構造
特性を有すると記載されている。３種の転写物が全長プローブを使用するノーザ
ンブロット分析で証明されている。１．５ｋｂの転写物は神経芽細胞腫細胞系列
で豊富である。ヒトの脳組織において、９．５ｋｂの転写物が主要成分として現
れ、かつ１．５ｋｂおよび３．８ｋｂ転写物がマイナー成分として現れる。胎児
の脳において、１．５ｋｂおよび９．５ｋｂの両者の転写物は豊富であるが、３
．８ｋｂの転写物は豊富でない（Yokoyama, M., et al., Identification and C
loning of Neuroblastoma-Specific and Nerve Tissue-Specific Genes through
Compiled Express Profiles, DNA Research, 3:311(1996)）。

【００７２】 新規のヒトの脳由来のカリウムチャネル生体分子は発生的に制御され、かつ分化
したニューロンに組織特異的である。

【００７３】 以下参照の分化したニューロンに組織特異的な新規のヒトの脳由来のカリウム
チャネルポリペプチドをコードする３０２９塩基のｃＤＮＡ核酸配列である配列
番号：１を本明細書に記載している。配列番号：２は、新規のヒトの脳由来の組
織特異的カリウムチャネルポリペプチドをコードするＡＴＧからＴＧＡまでの２
５６５塩基のｃＤＮＡ核酸配列の翻訳される構造領域である。配列番号：３は本
明細書に記載されるような分化したニューロン組織特異的なヒトの脳由来のカリ
ウムチャネルポリペプチドの８５４アミノ酸残基配列である。

【００７４】 参照および比較のために：配列番号：４はＨＮＳＰＣカリウムチャネルに属す
る１４２５塩基のｃＤＮＡ配列である（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号Ｄ８２３４
６）。配列番号：５は最近記載されたＨＮＳＰＣカリウムチャネルの３９３アミ
ノ酸残基配列である（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号Ｄ８２３４６）；Yokoyama,
M., et al., Identification and Cloning of Neuroblastoma-Specific and Ner
ve Tissue-Specific Genes through Compiled Express Profiles, DNA Research
, 3:311(1996)。配列番号：６は最近記載されたヒトのＫｖＬＱＴ１カリウムチ ャネルの５８１アミノ酸残基配列である（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号Ｕ４０９
９０、Ｕ７１０７７；Barhanin, J., et al., Nature, 384, 78-80(1996); Sang
uinetti, M. C., et al., Nature, 384:80(1996)）。

【００７５】 ８５４残基の発生的に制御されかつ本明細書に記載される組織特異的なヒトの
脳由来のカリウムチャネルポリペプチド（配列番号：３）は５８１アミノ酸のＫ
ｖＬＱＴ１（配列番号：６）とアミノ酸レベルで３７％の全ホモロジーを有し、
かつ３９３アミノ酸のＨＮＳＰＣ（配列番号：５）とアミノ酸レベルで４４％の
全ホモロジーを有する（その整合可能な配列において９５％）（図７に示される
比較）。新規の脳由来のカリウムチャネル（配列番号：３）ポリペプチドはＨＮ
ＳＰＣ（配列番号：５）と比較するとそのＣ末端に付加的な４６１アミノ酸を有
している。

【００７６】 ＨＮＳＰＣは上記に、幾つかの未分化の神経芽細胞腫細胞系列中の優勢な１．
５Ｋｂ転写物ならびに脳組織における９．５〜１０Ｋｂのバンドのノーザンブロ
ットでの認識に基づいて、“ヒトのニューロン特異的カリウムチャネル”として
いる。しかしながら、これらのバンドはヨコヤマ他によって、本明細書に記載さ
れる新規のｃＤＮＡ（配列番号：１）と９５％の局所的な類似性を有するＨＮＳ
ＰＣコーディング領域プローブを使用して検出された。事実、ヨコヤマ他によっ
てヒトの脳で観察された９．５〜１０Ｋｂのバンドは、本発明に記載される新規
のｃＤＮＡ（配列番号：１）に相当するが、更に以下に記載されるようなＨＮＳ
ＰＣではない。

【００７７】 新規の脳由来のカリウムチャネルはニューロンの分化後に高レベルで発現する。
神経細胞の分化は神経組織の正常な発生において、ならびに病理状態における増
殖および再生の間の細胞適応性の制御のために重要なプロセスである。神経芽細
胞系列ＩＭＲ−３２はニューロンの分化の研究のためのモデル系として広範囲に
使用される（Sher et al., J. Neurochemistry, 50:1708(1988)）。

【００７８】 配列番号：２の位置１２５７〜１４６１に相当する核酸プローブ（本明細書に
おいては以下に記載されるようにプローブＮｏ１と呼ぶ）は新規の脳由来のカリ
ウムチャネルｃＤＮＡのＣ末端のテール構造に及んでいる。プローブＮｏ２と呼
ばれる核酸プローブは配列番号：２の塩基位置９８９〜１１０９に相当する；こ
れは本明細書に記載される脳由来のカリウムチャネルの中心領域ならびに該ペプ
チドのＣ−末端に属するＨＮＳＰＣの領域の両者に共通の４０アミノ酸のための
相対コーディング領域に及んでいる。

【００７９】 核酸プローブ１は本明細書において、未誘導のＩＭＲ−３２細胞における非常
に弱い９．５〜１０Ｋｂのバンドが同定されることを証明されている；一方分化
ＩＭＲ−３２細胞においては劇的にアップレギュレーションな（〜２０⁺倍）発 現が判明している。従って、新規の脳由来のカリウムチャネルの発現ならびにニ
ューロンの分化の誘導との間には関連があり、このことは神経学的機能における
新規の生体分子の重要性を際立たせている。

【００８０】 核酸プローブ１を使用する複数の組織ブロットにおいて、際立った９．５〜１
０ｋｂの転写物は排他的にヒトの脳に見いだされる（図９）。該転写物は成人お
よび胎児の脳の両者に見られ（図１１）、かつ小脳、大脳皮質、髄質、後頭葉、
前頭葉、側頭葉および被殻において類似の強度で存在する（図１０）。

【００８１】 図９は、（パネルＡ）本明細書に記載されるヒトの脳由来のカリウムチャネル
ポリペプチドコーディング領域（配列番号：２）に特異的な核酸プローブＮｏ１
を使用する；（パネルＢ）および（パネルＣ）ＨＮＳＰＣのｃＤＮＡ（配列番号
：４）と本明細書に記載されるヒトの脳由来のカリウムチャネルポリペプチドコ
ーディング領域（配列番号：２）とに共通の核酸プローブＮｏ２を使用する、複
数の組織のノーザンブロット分析を表している。図１０は、（パネルＡ）本明細
書に記載されるヒトの脳由来のカリウムチャネルポリペプチドコーディング領域
（配列番号：２）に特異的な核酸プローブＮｏ１を使用する；（パネルＢ）ＨＮ
ＳＰＣのｃＤＮＡ（配列番号：４）と本明細書に記載されるヒトの脳由来のカリ
ウムチャネルポリペプチドコーディング領域（配列番号：２）とに共通の核酸プ
ローブＮｏ２を使用する、ヒトの脳の異なる領域のノーザンブロット分析を表し
ている。図１１は、（パネルＡ）本明細書に記載のヒトの脳由来のカリウムチャ
ネルポリペプチドコーディング領域（配列番号：２）を使用する；（パネルＢ）
ＨＮＳＰＣのｃＤＮＡ（配列番号：４）と本明細書に記載されるヒトの脳由来の
カリウムチャネルポリペプチドコーディング領域（配列番号：２）とに共通の核
酸プローブＮｏ２を使用する、ヒトの成人の脳およびヒトの胎児の脳、ｉｍｒ−
３２および星状細胞のノーザンブロット分析を表している。

【００８２】 本明細書に記載される脳由来のカリウムチャネルポリペプチド（配列番号：３
）は発生的に制御されて組織特異的にヒトの脳ならびにニューロンの分化に誘導
する神経芽腫瘍細胞細胞系列において発現される。このことは新規生体分子を成
人の脳で非常に低いレベルで発現し、かつ神経芽細胞腫細胞系列のニューロン分
化後に制御されないＨＮＳＰＣと機能的に区別し、かつ対比するのが重要である
。

【００８３】 脳由来のカリウムチャネルはニューロン細胞で発現し、ヒトの脳のグリア細胞に
おいては発現しない。ヒトの脳は興奮性ニューロンおよび非興奮性グリア細胞か
らなっている。グリア細胞はニューロン細胞よりも１０倍以上豊富である。ヒト
の脳における新規のカリウムチャネル転写物（配列番号：１）がニューロン細胞
または非ニューロン細胞において発現するかを評価するために、一次のヒトの胎
児の脳から培養した非ニューロンのグリア細胞のノーザンブロット分析を実施し
た。本発明に記載される脳由来のカリウムチャネルに属する転写物はグリア細胞
からのｍＲＮＡにおいて検出されず、脳のニューロン細胞でのその特異的発現が
実証された（図１１）。転写物（配列番号：１）は成人および胎児の両者に存在
する（図１１）。

【００８４】 ＨＮＳＰＣは神経芽細胞腫細胞系列において顕著に発現し、かつヒトの脳におい
ては発現しない。反対に、本明細書においてプローブ２によってネイティブＩＭ
Ｒ−３２細胞および分化ＩＭＲ−３２細胞（ＨＮＳＰＣを表す）において優先的
な１．５ｋｂのバンドが検出され、かつ分化したＩＭＲ−３２細胞（本明細書に
記載される新規の脳由来のカリウムチャネルに属する転写物を表す、図１１）に
おいては付加的な９．５〜１０Ｋｂのバンドが検出されることが実証されている
。従って、ＨＮＳＰＣは神経芽細胞腫細胞系列において優先的に発現するが、ヒ
トの脳においては優先的な転写物ではない。

【００８５】 プロープ２は脳の幾つかの領域において優勢な９．５〜１０Ｋｂのバンドを探
索する（図９および図１０）。これらの結果はプロープ１で見いだされる（以下
参照）ものに非常に類似しており、ヒトの脳における本発明に記載されるカリウ
ムチャネルポリペプチド（配列番号：３）の非常に高い発現を暗示している。１
．５ｋｂの転写物はヨコヤマ他によって記載されるようなＨＮＳＰＣを表すプロ
ーブ２（図９）を使用する試験で見いだされる。

【００８６】 前記のヨコヤマ他によって記載されたＨＮＳＰＣポリペプチド（配列番号：５
）は本明細書中ではＫＱＴファミリーに当たると認識される。本明細書に記載さ
れるｃＤＮＡはＫＱＴファミリーの新規のカリウムチャネルメンバーを表す。脳
腫瘍において、遺伝子制御は変化する。脳腫瘍は、本明細書に記載されるより長
い組織特異的カリウムチャネルポリペプチドより大量のＨＮＳＰＣ（配列番号：
５）を製造し、細胞増殖の増加を促すことが仮定されている。ＨＮＳＰＣ（配列
番号：５）はニューロン細胞系列および胎児の脳において豊富であるが、成人の
脳ではＨＮＳＰＣが殆どないし全くなく、一方本明細書に記載されるより長い組
織特異的カリウムチャネルポリペプチド（配列番号：３）は豊富である。よって
、新規カリウムチャネルに属する新規の配列番号：１のｃＤＮＡが脳腫瘍におい
て、配列番号：４のＨＮＳＰＣのｃＤＮＡの増加に伴ってダウンレギュレーショ
ンされることが予想される。

【００８７】 本発明に記載される脳由来のカリウムチャネルサブユニットの機能的発現はＨＮ
ＳＰＣによって抑制される電流を生ずる。

【００８８】 ホニュウ類細胞にトランスフェクトするとヒトの脳由来のカリウムチャネルの
ｃＤＮＡコーディング領域（配列番号：２）はカリウム選択的（図１２Ｃ）であ
りかつ外部に適用されたＴＥＡ（テトラエチルアンモニウム）（図１２Ｄ）によ
って強く遮断することができる強い電位依存性の外部電流（図１２Ａ、Ｂ）を生
ずる。配列番号：５のカリウムチャネルサブユニットを生ずるＨＮＳＰＣのｃＤ
ＮＡ（配列番号：４（配列番号：１の短いスプライス変異体））によるホニュウ
類細胞のトランスフェクションは機能的な電流を生じない。配列番号：２のＥＧ
ＦＰ（Enhanced Green Fluorescent Protein）融合構築物は、該チャネルサブユ
ニットの発現のためのマーカーとして緑色細胞を検出することを本明細書におい
て記載している。該構築物は“非融合”チャネルサブユニット（配列番号：３）
（図１３参照）に非常に類似した生物物理学的および薬理学的特性を有する機能
的チャネルを生産する。更に、ＥＧＦＰ−ＨＮＳＰＣと配列番号：３の同時発現
は得られる長期のスプライス変異体サブユニット配列番号：３によって生産され
るカリウム電流の抑制を惹起するが、重要な変化はチャネルゲーティングのキネ
ティックにおいて実証されない（図１４）（例ＸＩＶ参照）。

【００８９】 ニューロンの成長の点において、未成熟の成長している脳組織は配列番号：１
の短いスプライス変異体および長いスプライス変異体、例えば配列番号：３およ
び配列番号：５の両者を発現する。一方、成熟した成人の脳は主に長いスプライ
ス変異体配列番号：３を発現する（図１１）。短い方のサブユニットであるＨＮ
ＳＰＣ（配列番号：５）が長い変異体配列番号：３の機能を抑制し、変化した活
動電位着火頻度を含む事実は成長している脳のために重要である。

【００９０】 ヒトの脳腫瘍における配列番号：４の発現：診断で使用 ヒトの脳腫瘍のｍＲＮＡのノーザンブロット分析は、正常な成人の脳で非常に
弱く発現する短い転写物ＨＮＳＰＣ（配列番号：４）が成人の脳腫瘍においてア
ップレギュレーションされることが判明した（図１５）。この結果は、脳由来の
カリウムチャネルサブユニットの短いスプライス変異体（配列番号：４）と増殖
している脳細胞、例えば胎児の脳ならびに未分化の神経芽細胞腫細胞系列との観
察される関連の観点で転写物の検出可能なレベルが脳腫瘍組織を暗示するという
予想をもたらす。２種の形の成人の脳腫瘍ＲＮＡ、星状細胞腫および神経膠腫は
短い転写物配列番号：４に関して陽性である。同じ脳からの隣接した非腫瘍性細
胞からのコントロールＲＮＡは配列番号：４の転写物に関して陰性である。脳に
転移した非脳由来の腫瘍もまた配列番号：４転写物に関して陰性である。従って
、短い転写物配列番号：４のＰＣＲまたは脳腫瘍を伴う患者の髄液中での抗体に
よる検出を治療中の疾患の進行のモニタリングのための診断ツールまたは診断目
的のために使用してよい。例えば短い転写物に特異的である検出可能な１０７ｂ
ｐのＰＣＲバンドの発生は、配列番号：４の１２２５〜１２４７の位置に相当す
るフォワードプライマー：５’ＡＡＣＣＴＣＴＣＧＣＧＣＡＣＡＧＡＣＣＴＧＣ
Ａ３’（配列番号：９）ならびに配列番号：４の１３０８〜１３３１の位置に相
当するリバースプライマー５’ＡＡＣＡＧＴＴＧＣＴＴＧＧＴＧＧＣＡＧＧＡＧ
ＣＣ３’（配列番号：１０）を使用して達成される（例ＸＶ参照）。

【００９１】 β−アミロイド誘発ニューロン死における配列番号：３のカリウムチャネルサ
ブユニットの役割（ＳＮ５６細胞におけるＫ⁺チャネルをコードする遺伝子の分 子同定） 基底前頭葉のコリン作動性ニューロン（Colom et al., J. Neurochem., 70: 1
925(1998)）ならびにアルツハイマー病（ＡＤ）において早期に激しく減損する 皮質ニューロン（Yu, S. et al., Neurobiol Dis., 5(2): 81(1998)）は電位依 存性かつＴＥＡに感受性であるＫ⁺電流の特定のプロフィールを表す。Ｋ⁺電流は
生細胞の機能を制御する；当然のように、その変化は細胞の損傷ならびに引き続
いて死をもたらすことが予想される。β−アミロイドペプチド（Ａβ）はＡＤを
による患者におけるニューロン毒性に主要な役割を担っていると示されている。
コリン作動性中隔細胞系列ＳＮ５６はＴＥＡ感受性カリウム電流を生ずる。Ａβ
は前記の細胞においてカリウム電流を促進することが示されている。ＴＥＡを介
する電流の減衰はＡβ媒介性の毒性ニューロンを遮断することが実証されている
（Colom et al., J. Neurochem. 70: 1925(1998)）。非コリン作動性の中隔細胞
系列（ＳＮ４８）は顕著なカリウム電流を示さず、かつＡβ誘発性細胞死に耐性
である。ＳＮ５６におけるＫ⁺電流の生理学的特性および薬理学的プロフィール はクローニングおよび特徴付けされた遺伝子産物：電位依存性チャネルのｓｈａ
ｗサブファミリー、Ｋｖ３．１およびＫｖ３．２（Chandy and Gutman, Handboo
k of Receptors and Channels, (1995)）ならびにより最近に記載されたＫｖＱ Ｔサブファミリー、ＫｖＱＴ２および３（Singh et al., Nature Genetics(1998
)）の２種のサブファミリーの特性を暗示している（Charlier, et al., Nature
Genetics(1998)）。

【００９２】 前記のチャネルの１種またはその全てがＳＮ５６細胞におけるＫ⁺チャネルを コードするかどうかを調査するために、ノーザンブロット分析を実施した。未分
化および分化したＳＮ４８およびＳＮ５６細胞からの全ＲＮＡを標準的なプロト
コールによって単離した。１２種の微生物の各ＲＮＡ試料を、ラットおよびマウ
スの脳のＲＮＡ（ポジティブコントロールとして）２０μｇと一緒に１．０％の
アガロースゲル上に泳動し、ニトロセルロースにトランスファーし、かつ高度に
ストリンジェントな条件下でｓｈａｗサブファミリーの遺伝子（Ｋｖ３．１−Ｋ
ｖ３．４）または配列番号：２もしくは配列番号：４（ＫｖＱＴ２遺伝子の長い
選択スプライス変異体（alternative splice variant）および短い選択スプライ
ス変異体）を探索するために設計されたランダムプライムした（random primed ）³²Ｐ標識プローブにハイブリダイズさせる。オートラジオグラムは十分な時間
の間で暴露するので、殆ど豊富でない転写物１が存在する場合には明瞭に可視化
される。強い３．８ｋｂバンドおよび１．５ｋｂバンドが検出される。該バンド
は未分化および分化したＳＮ５６細胞の両者におけるそれぞれ長いスプライス変
異体および短いスプライス変異体（配列番号：２および配列番号：４）に相当す
る。このシグナルはＳＮ４８細胞においては非常に弱い（図１６参照）。

【００９３】 ＫｖＱＴ遺伝子の突然変異は良性の家族性新生児てんかんを引き起こす。

【００９４】 てんかん性疾患は世界中に約２０００〜４０００万の人々が羅患しており、か
つその４０％が病因が知られていない突発性全身型てんかんである（Idiopathic
Generalized Epilepsiesにおいて、Eds Malafosase A. et al., John Libbey,
London, 1994）。殆どの突発性てんかんは常染色体優性的に遺伝する。染色体２
０ｑ１３．３および染色体８ｑ２４のそれぞれの２つの座は良性の家族性新生児
痙攣との関連分析によってマッピングされている。前記の座のポジショナルクロ
ーニングによって、てんかん患者において突然変異を起こしているｈＫｖＱＴ２
（本明細書の配列番号：３）およびＫｖＱＴ３（例えば配列番号：７（図１７）
）のコーディング領域の２つのグループが同定されている（Singh N. A. et al.
, Nature Genetics, 18, 25(1998); Biervert C., et al., Science, 279: 403(
1998); Charlier C., et al., Nature Genetics, 18:53(1998)）。Ｓ６後のポア
領域およびＣ−末端における幾つかの点突然変異またはミスセンス／フレームシ
フト突然変異がてんかんの家族に見いだされている。これらの突然変異は相応の
Ｋ⁺チャネルの機能の損失をもたらす。ＨＮＳＰＣ（配列番号：５）の生物学的 および／または薬理学的活性に似たＣ−テールにおける１つの欠損は、機能的で
なく、かつアフリカツメガエルの卵細胞における同時発現の際に野生型のｈＫｖ
ＱＴ２（配列番号：３）電流の抑制を惹起することが示された（Biervert C., e
t al., Science, 279: 403(1998)）。ｍＫＱＴ２の少なくとも１１つのマウスの
スプライス変異体（配列番号：３のマウスのホモログ）は記載されており、その
全てがＣ−尾にある。前記のＣ−末端スプライス変異体はアフリカツメガエルの
卵細胞に機能的なチャネルを生産しない（Nakamura, M., et al., Receptors an
d Channels 5:255(1998)）。

【００９５】 カリウムチャネルは機能的な四量体であるので、１つの対立遺伝子における変
異体は、チャネル四量体の機能に致命的なことがある１つのサブユニットに優性
的な負の表現型をもたらすのに十分である。従ってチャネルの機能の病理学的損
失はてんかん症候群における再分極障害から惹起されるニューロンの興奮性亢進
をもたらすことが推測される。ヒトのＫｖＱＴ２アゴニスト、例えばチャネルオ
ープナーとして機能する配列番号：３の生物学的および／または薬理学的活性の
アゴニストは発作およびてんかんの治療において有用であると予想されている。
更に、正常なサブユニットを必要とする被験者、例えば異常な形で遺伝した被験
者への遺伝子治療を介する正常なサブユニットの移動は配列番号：３の異常なレ
ベルまたは様式によって媒介される疾患の治療に対する重大な治療価値があるこ
とが予想される。

【００９６】 脳内でのＭ電流の分子相関 Ｍ電流は多くのニューロン細胞型において見いだされる不活性化しない電位依
存性カリウム電流である（Marrion N. V., Control of M-Current, Ann. Rev. P
hysiol., 59:483(1997)に概説される）。各脳細胞において、Ｍ電流は、活動電 位の誘導の範囲において電流を持続させることによる膜の興奮性のコントロール
において主流である。Ｍ電流は、電流の促進または抑制のいずれかを惹起する受
容体型の広範な配列によって調節できる。事実、歴史的に用語Ｍ電流はムスカリ
ン様受容体刺激による時間および電位依存性のカリウム電流の観察される抑制に
基づいて作られた（Brawn D. A. and Adams, P. R., Nature, 283:673(1980)） 。Ｍ電流の抑制はより活動電位に点火しそうなニューロンを産生する膜の脱分極
をもたらす。また該電流は、交感神経のニューロンおよび海馬ＣＡ３のニューロ
ンにおける緩慢な興奮性のシナプス後部電位（ＥＰＳＰ）に基礎をなすＭ電流の
シナプス性の抑制によってシナプス的に制御される。従ってＭ電流の存在がニュ
ーロンの興奮性の制御に強力な効果を発揮することは明らかである。Ｍ電流のモ
ジュレーターは、神経伝達物質の放出を促進することが示されており、従って認
識促進物として魅力がある。

【００９７】 ホニュウ類細胞中で発現されるｈＫｖＱＴ２（配列番号：３）の生物物理学的
かつ薬理学的特性は、活性化および不活性化キネティクス、テール電流（tail c
urrent）およびバリウムによる遮断を含むニューロンにおけるＭ電流の特性に厳
密に一致している（図１２参照）。事実、ｈＫｖＱＴ２カリウムチャネルサブユ
ニット（配列番号：３）および該ファミリーの別のホモログＫｖＱＴ３（例えば
配列番号：７）のヘテロマルチマーはＭ電流を運ぶチャネルとして包含されてい
る（Neuroscience Meeting, Wang H. S., et al. Society for Neuroscience, 2
4: Abs#792.1(1998)）（図１７および図１８参照）。卵細胞においてｈＫＱＴ２
およびｈＫＱＴ３が同時発現させた後に、ＴＥＡによる遮断を含むネイティブの
Ｍ電流の全ての特性に類似した電流が発生する。更に単独で発現させた場合にＫ
ｖＱＴ３（配列番号：７）チャネルはアフリカツメガエルの卵細胞において非常
に低いカリウム電流を生み出すことが示された（Yang, W.P., et al., J. Biol.
Chem., 31:19419(1998)）。しかしながら、ｈＫｖＱＴ２のｍＲＮＡ（配列番号
：１）と同時注入すると、新規の特性を有する非常に活発な電流が生じ、２種の
チャネル型のヘテロマルチマー化が示される。

【００９８】 Ｍ電流のためにコードするチャネルの形成のために必須の配列番号：３のチャ
ネルサブユニットの観察される関連は、Ｍ電流活性の調節およびそれによるニュ
ーロン機能の調節をする小分子の同定ならびにデザインに関するスクリーニング
における事実上の関連を有する。薬剤開発スクリーニングで使用するために、細
胞系列は、安定にｈＫｖＱＴ２（配列番号：３）を単独にか、または配列番号：
３およびＫｖＱＴ１および／またはＫｖＱＴ３（配列番号：７）を含むが、それ
に限定されるものでないその関連ホモログを同時発現することが考慮されている
。ニューロンの機能は、例えば認識の促進および多動症候群ならびにそれに類似
するものを含む。

【００９９】 ｈＫｖＱＴ２（配列番号：３）およびＫｖＱＴ３（配列番号：７）に対する抗体
を使用する脳切片の免疫組織化学 抗体を、ｈＫｖＱＴ２（配列番号：３）およびＫｖＱＴ３（配列番号：７）に
対して配列番号：３のアミノ酸残基位置６４４〜６５８に相当するペプチドなら
びに配列番号：７のアミノ酸残基位置６３９〜６５３に相当するペプチドの使用
によって生じさせた。これらのペプチドを合成し、ＫＬＨにコンジュゲートさせ
、かつ免疫するウサギのために使用した。免疫後７〜８週間で得られた抗血清に
よりＥＬＩＳＡにおけるペプチドに対する抗体の非常に高い力価が得られた（＞
１：１０００００希釈）。抗血清はサンプルのラットの脳組織ならびにヒトの脳
組織における免疫組織化学を実施するために使用した。パラフィンで包まれた切
片を一次ｈＫｖＱＴ２またはｈＫｖＱＴ３抗血清の１：３０００希釈、引き続き
ＨＲＰコンジュゲートしたヤギ抗ウサギ血清の１：２００希釈でインキュベート
した。染色はＤＡＢ基質（Paragon Biotech Inc., Baltimore, MD）を使用して 可視化した。ｈＫｖＱＴ２およびｈＫｖＱＴ３抗体の両者のためのポジティブ染
色は小脳皮質プルキンエ細胞、脈絡膜の上衣細胞、基底前頭葉の大型ニューロン
に見られた。より弱い染色は皮質および海馬を含む脳の幾つかの他の領域からの
ニューロンに見られた。前免疫血清は検出可能な染色を示さなかった。ｈＫｖＱ
Ｔ２およびｈＫｖＱＴ３の両者の発現の重複プロフィールは顕著であり、かつ同
時の局在化を示唆している。

【０１００】 本明細書に記載されている脳由来のカリウムチャネルサブユニットＫｖＱＴ２
（配列番号：３）のために最近使用される他の名称はＫＱＴ２およびＫＣＮＱ２
を含んでいる。

【０１０１】変異体 また本発明はヒトの脳由来のカリウムチャネル分子配列番号：３の変異体を包
含している。例えば実質的に配列番号：３に記載される有利な変異体は、ヒトの
脳由来のカリウムチャネルアミノ酸配列（配列番号：３）またはその生物学的に
活性の断片に少なくとも８５％の全アミノ酸配列の類似性、より有利には少なく
とも９０％の全アミノ酸配列の類似性、最も有利には少なくとも９５％の全アミ
ノ酸配列の類似性を有するものである。

【０１０２】 本発明のヒトの脳由来のカリウムチャネル分子の“変異体”は１個以上のアミ
ノ酸の“置換”で異なるアミノ酸配列を有してよい。該変異体は、置換されるア
ミノ酸が構造的または化学的特性に類似している“保存的”変化、例えばロイシ
ンとイソロイシンとの置換を有していてよい。より稀に、該変異体は、“非保存
的”変化、例えばグリシンとトリプトファンとの置換を有してよい。類似の少数
の変異体はアミノ酸欠失または挿入、またはその両者を含んでいてもよい。どの
アミノ酸残基および幾つのアミノ酸残基が置換されていてよいかを決定する指標
は生物学的または免疫学的活性を破壊することなく挿入または欠失し、例えばこ
の分野でよく知られているコンピュータープログラム、例えばＤＮＡ Ｓｔａｒ ソフトウェアを使用して見いだしてよい。

【０１０３】 本発明は新規のヒトの脳由来のカリウムチャネルの核酸配列（配列番号：１お
よび配列番号：２）ならびにアミノ酸配列（配列番号：３）およびその変異体に
関し、かつカリウムチャネルおよびヒトの神経生理機能の活性を調節する化合物
の同定のために前記配列を使用することに関する。

【０１０４】 更に本発明は、本明細書に記載される核酸配列をカリウムチャネル生体分子の
アゴニストまたはアンタゴニストのためのアッセイとして発現系において使用す
ることに関する。また本発明はヒトの脳由来のカリウムチャネルに関する疾患お
よび／または機能不全ニューロンによって媒介される疾患の診断、研究、回避お
よび治療に関する。

【０１０５】 ヒトのニューロンのカリウムチャネルをコードするポリヌクレオチド配列また
はその機能的に同等の誘導体は本発明によれば配列番号：２の核酸配列の欠失、
挿入および／または置換を有するものを使用してもよい。本発明の生体分子の生
物学的に活性の変異体は配列番号：３のアミノ酸残基の欠失、挿入または置換を
有していてよい。実質的に配列番号：３に記載されている配列を有するポリペプ
チドまたはその生物学的に活性の断片をコードする核酸配列を有する精製ポリヌ
クレオチドは特に有利な本発明の態様である。

【０１０６】 配列番号：３のアミノ酸置換は、例えば残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、
親水性および／または両親媒性の性質における類似性を基礎として、カリウムチ
ャネルの生物学的活性が保持される限り成すことができる。例えば負に荷電した
アミノ酸はアスパラギン酸およびグルタミン酸を含み、正に荷電したアミノ酸は
リジンおよびアルギニンであり、類似の疎水性値を有する非電荷の極性のヘッド
基を有するアミノ酸はロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、
アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニンおよびチロ
シンを含む。

【０１０７】 本発明に記載されている新規のカリウムチャネルのニューロン特異的分子のア
ミノ酸配列をコードする核酸配列は、縮重コドン（同じアミノ酸をコードする異
なるコドン）の可能な置換のため指数的合計がある。従って非相同の発現のため
に選択されるオリゴヌクレオチド配列は有利には当業者によく知られているよう
に使用される特定の宿主発現系の最も一般的な特徴的ｔＲＮＡコドン認識を満た
すように調整される。

【０１０８】 アミノ酸の適当な保存的置換は当業者に公知であり、選択される合成法にかか
わらず得られるポリペプチドの生物学的活性を変化させることなく実施すること
ができる。用語“保存的置換”は、誘導体化されていない残基の代わりに化学的
に誘導体化した残基の使用することを含むが、但しかかるポリペプチドは所望の
結合活性を有する。Ｄ−異性体ならびに他の公知の誘導体を天然産生アミノ酸の
ために置換してもよい（例えばU.S. Patent No.5,652,369, Amino Acid Derivat
ives, issued July 29, 1997.参照）。有利には置換は、限定されるものではな いが以下の第１表に記載されるように実施される：

【０１０９】

【表１】

【０１１０】 本発明のヌクレオチド配列は、限定されないが遺伝子産物のクローニング、プ
ロセシングおよび／または発現を改変する変化を含む種々の理由でコーディング
配列を変化させるために工学してもよい。例えば突然変異を当業者に公知の方法
、例えば部位特異的突然変異して新規の制限部位を挿入するか、糖付加のパター
ンを変えるか、コドン選択を変化させる等の技術を使用して導入してもよい。

【０１１１】 本発明のヒトのカリウムチャネル分子の対立遺伝子は本発明の範囲内に含まれ
ている。本明細書で使用されるように、“対立遺伝子”または“対立遺伝子配列
”は本明細書に記載されるカリウムチャネル分子の選択的形である。対立遺伝子
は核酸の突然変異および、構造もしくは機能が場合により変化することがあるポ
リペプチドを産生するｍＲＮＡのスプライス変異体から得られる。いずれの挙げ
られた遺伝子は対立遺伝子形を有していないか、１種または多数の対立遺伝子形
を有していてよい。対立遺伝子をもたらす共通の突然変異による変化は一般にア
ミノ酸の天然の欠失、付加または置換に起因する。前記の変化の型のそれぞれは
単独または他のものと組み合わせて、挙げられた配列において１回以上生じてよ
い。

【０１１２】 本発明は部分的に、宿主細胞または生物の形質転換のために使用できる発現ベ
クター中での新規のカリウムチャネル分子をコードするポリヌクレオチドの封入
に関する。かかるトランスジェニック宿主は新規の神経生理学的分子および本明
細書に記載されるその変異体の製造のために有用である。

【０１１３】 また核酸配列は、腫瘍または癌細胞に限定されないがニューロンを含む細胞に
おけるゲノムヌクレオチド配列の発現をダウンレギュレート、低下または排除す
るのに有利なアンチセンス分子のデザインを提供する。

【０１１４】 本発明のヒトのカリウムチャネル生体分子は、結合するか、基質と競合するか
、生体分子により不活性化するか、もしくは拮抗する遮断薬、アンタゴニストま
たはインヒビターの同定のためのスクリーニングアッセイに使用することもでき
る。新規のカリウムチャネルは、カリウムチャネルを活性化するか、または生体
分子の製造を誘導するか、または生体分子のインビボもしくはインビトロで寿命
を延長させるアゴニストの同定のためのスクリーニングアッセイに使用すること
もできる。

【０１１５】 また本発明は配列番号：３に実質的に記載されるヒトのカリウムチャネルポリ
ペプチド分子もしくはその断片、天然産生遺伝子の発現の中断を可能にするアン
チセンス分子、アゴニスト、抗体、アンタゴニストもしくは天然の生体分子のイ
ンヒビターを有する医薬品化合物および医薬品組成物に関する。該組成物は機能
不全ニューロンに関連する状態および神経生理学的疾患の予防および／または治
療のために有用である。

【０１１６】 本発明の特に有利な態様は、カリウムチャネルの生物学的活性を妨げるか、ま
たは阻害する、神経生理機能を調節する化合物のスクリーニング方法に関する。

【０１１７】 薬理学的重要性 前記で議論したように、ノーザンブロット分析は、新規の生体分子が殆ど排他
的にヒトの脳のニューロン細胞（グリア細胞ではない）に限定されることを示し
ている（図９〜１１）。新規の転写物は、神経芽細胞腫細胞系列ＩＭＲ−３２に
おいては非常に少量であるが、これらの細胞のニューロンへの分化後には転写物
の重大なアップレギュレーションがある（図１１）。本明細書に記載される新規
の脳由来の発生的に制御されたカリウムチャネルはシナプス伝達および脳におけ
る電気的興奮性の調節に非常に重要な役割を果たすことがある。本明細書に記載
される新規の生体分子、例えば配列番号：２および配列番号：３ならびにその変
異体は認知疾患（例えば学習および記憶）、行動傷害（不安、鬱病）、精神障害
（例えば双極性障害、精神分裂病）、神経変性障害（例えばアルツハイマー病、
パーキンソン病）ならびに発育障害（例えば精神薄弱）ならびに喘息、偏頭痛、
てんかんおよび発作ならびに脳腫瘍における関連が深い。アルツハイマー病にお
けるニューロン性細胞の死のアポトーシス機構での役割が特に興味をもたれてい
る。

【０１１８】 ニューロンで特異的に発現する、発生的に制御されたヒトの脳由来のカリウム
チャネルの神経薬理学的機能不全ニューロンによって媒介される病体生理的障害
の診断、研究、予防および治療のために重要な能力を有している。本明細書に記
載される新規の核酸ならびにペプチド生体分子は、特にインビボでのカリウムチ
ャネルの生物学的活性を調節する化合物の同定および開発において特定の価値を
有する。

【０１１９】 本発明は、新規のヒトの脳由来のカリウムチャネルの核酸（配列番号：１およ
び配列番号：２）ならびにアミノ酸配列（配列番号：３）ならびにその変異体に
関し、かつ該配列を特殊化された細胞、特に前記のヒトのニューロンの活性を調
節する化合物を同定するために使用することに関する。

【０１２０】 本明細書に記載される脳由来のカリウムチャネルの生物学的活性を調節する化
合物（例えば小分子、ペプチド、類似体、擬態）は、精神分裂病、不安、鬱病、
脳腫瘍、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、ルイ−ゲーリッ
ヒ病、発作、てんかん、記憶変性、神経変性、多発性硬化症、精神病、尿失禁、
糖尿病、喘息、早期分娩、高血圧、心虚血および不整脈、偏頭痛、自己免疫疾患
、癌および移植片拒絶を含む種々の疾患状態の治療における使用のために検討さ
れている。

【０１２１】 新規のヒトの脳由来のカリウムチャネルを使用して、インビボでの生体分子の
異常なレベルを検出する前記に論じた診断用抗体をもたらすことができる。従っ
て、本発明の更なる態様によれば、生理学的、特に神経生理学的疾患を検出する
ための種々の診断用アッセイの部分として使用できるカリウムチャネルポリペプ
チドに対する抗体が提供される。

【０１２２】 本発明は、調節効果を有する分子、例えば本発明の脳由来のカリウムチャネル
ポリペプチドからなるカリウムチャネルの生物学的活性におけるアゴニストおよ
びアンタゴニストを含むがそれに限定されない化合物を同定するためのスクリー
ニングアッセイに関する。かかるアッセイは、本発明の核酸配列によってコード
される機能的Ｋ⁺チャネル発現産物を生成する発現系を提供し、発現系または発 現系の生成物と該生成物の生体活性におけるその調節効果を決定するために１つ
以上の分子と接触させ、かつ分子からＫ⁺チャネル発現調節が可能な候補を選択 する工程からなる。

【０１２３】 本発明の特に有利な態様は、実質的に配列番号：３に記載されるような配列を
有するポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片をコードする核酸配列から
なる精製ポリヌクレオチドで形質転換した宿主細胞である。この種の細胞または
その調製物は、当業者に公知の方法を使用して新規のカリウムチャネル活性の薬
理学的に活性なモジュレーターのスクリーニングのために使用してよい。例えば
１９９５年３月１４日に発表された米国特許第５３９７７０２号明細書（自己免
疫疾患のためのアッセイ及びその治療）；１９９７年６月１０日に発表された米
国特許第５６３７４７０号明細書（ホニュウ類の高いコンダクタンス（ｍａｘｉ
−Ｋ）カリウムチャネルの組み換えα−およびβ−サブユニットを発現する細胞
を使用するスクリーニングアレイ）；１９９７年３月４日に発表された米国特許
第５６０７８４３号明細書（アパミン結合タンパク質をコードする核酸配列）；
公表されたＰＣＴ国際出願ＷＯ９６０３４１５Ａ₁（ヒトのカリウムチャネル） ；１９９７年２月１１日に発表された米国特許第５６０２１６９号明細書（カリ
ウムチャネルモジュレーターとしての３−置換したオキシインドール誘導体）を
参照のこと。そのそれぞれは本明細書において参照することにより引用したもの
とする。

【０１２４】 かかるモジュレーターは潜在的に機能不全的に特殊化された細胞によって発症
する疾患の治療において有用であり、該疾患は限定されるものでなく、精神分裂
病、不安、鬱病、脳腫瘍、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病
、ルイゲーリッヒ病、発作、てんかん、記憶変性、神経変性、多発性硬化症、精
神病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、小脳変性、尿失禁、糖尿病、喘息、
早期分娩、高血圧、心虚血および不整脈、偏頭痛、自己免疫疾患、癌、移植片拒
絶、急性および慢性の炎症、アレルギー、増殖性疾患、貧血症、免疫性成分によ
る神経変性疾患ならびにリウマチ様関節炎を含む自己免疫疾患、Ｉ型糖尿病、重
症筋無力症、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、混合結合組織疾患
および実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を含む。

【０１２５】 潜在的な診断および治療用適用は、本明細書に記載されるヒトのカリウムチャ
ネル生体分子のモジュレーターに関しては明らかである。治療的介入に特に必要
な疾患に共通の病態生理的疾患の範囲は機能不全ニューロンによって発症する神
経生理学的疾患に限定されないがこれを含む。

【０１２６】一般的に許容できるベクター 本発明によれば、新規のニューロンのカリウムチャネルポリペプチド、該ポリ
ペプチドの断片、融合タンパク質またはその機能的に同等なものをコードするポ
リヌクレオチド配列を適当な宿主細胞でのニューロン生体分子の発現に照準を合
わせた組み換えＤＮＡ分子中で使用すしてよい。遺伝子コードの遺伝縮重のため
、実質的に同じかまたは機能的に同等なアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配
列を新規のニューロン生体分子のクローニングおよび発現のために使用してよい
。当業者によって理解されるであるように、非天然産生コドンを有するヌクレオ
チド配列をコードする新規のカリウムチャネルを製造することが有利な場合もあ
る。

【０１２７】 特定の開始シグナルはカリウムチャネルの核酸配列の効率的な翻訳のために必
要なこともある。これらのシグナルはＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含む。
新規のニューロンの核酸配列、例えば配列番号：２の場合には、その開始コドン
および上流配列を適当な発現ベクター中に挿入し、付加的な翻訳制御シグナルが
不必要なことがある。しかしながら、コーディング配列またはその部分だけを挿
入する場合には、ＡＴＧ開始コドンを含む外来の転写制御シグナルを提供せねば
ならない。更に開始コドンは、全インサートの転写を保証するために適切な読み
枠でなければならない。外来の転写エレメントおよび開始コドンは天然および合
成の両者の種々の由来であってよい。

【０１２８】 核酸配列、例えば配列番号：２を、適当なプロモーターおよび他の適当な転写
制御エレメントを有する発現ベクター中に分子クローニングし、真核または原核
の宿主細胞に移して新規のポリペプチドを製造することによって、組み換え的に
発現させて、生物学的に活性なニューロンのカリウムチャネル生体分子を製造し
てよい。かかる操作のための技術は、例えばモレキュラークローニング第２版（
Sambrook, J., et al., Molecular Cloning Second Edition, Cold Spring Harb
or Press(1990)）に完全に記載されており、かつ当業者に公知である。

【０１２９】 発現ベクターは本明細書においては、適当な宿主細胞におけるクローニングし
た遺伝子のコピーの転写ならびにそのｍＲＮＡの翻訳のためのＤＮＡ配列として
記載している。かかるベクターを使用して、種々の宿主、例えば細菌、藍藻類、
植物細胞、昆虫細胞、菌細胞、ヒトおよび動物の細胞で核酸配列を発現させるこ
とができる。特にデザインされたベクターは宿主間、例えば細菌−酵母、または
細菌−動物細胞、または細菌−菌細胞、または細菌−無脊椎動物細胞のＤＮＡの
シャトルを可能にする。

【０１３０】 種々のホニュウ類発現ベクターを使用して、本発明において開示されたニュー
ロン特異的組み換え分子およびその変異体をホニュウ類細胞中で発現させること
ができる。組み換え発現のために適当な市販のホニュウ類発現ベクターは限定さ
れないが、ｐｃＤＮＡ３（インビトロ利得）、ｐＭＣ１_neo（ストラタジーン） 、ｐＸＴ１（ストラタジーン）、ｐＳＧ５（ストラタジーン）、ＥＢＯ−ｐＳＶ
２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７５９３）、ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ３７１
１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴ_neo（３４２−１２）（ＡＴＣＣ３７２２４）、ｐ ＲＳＶ_gpt（ＡＴＣＣ３７１９９）、ｐＲＳＶ_neo（ＡＴＣＣ３７１９８）、ｐＳ
Ｖ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ３７４６０）
およびｌＺＤ３５（ＡＴＣＣ３７５６５）、ｐＬＸＩＮおよびｐＳＩＲ（クロン
テック）、ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ（クロンテック）を含む。インビトロ利得社は
本発明において効率的に使用できる広範な市販の発現ベクター／システムを提供
している（INVITROGEN, Carlsbad, CA. またPHARMINGEN product, vector and s
ystem San Diego, CA.も参照）。

【０１３１】 またバキュウロウイルス発現系を本発明で使用して、高収率の生物学的に活性
なタンパク質を製造してもよい。市販されているクロンテックのＢａｃＰａｋ^TM バキュウロウイルス発現システムおよびプロトコールのようなベクターが有利で
ある（CLONTECH, Palo Alto, CA. Miller, L.K., et al., Curr. Op.Genet.Dev.
3:97(1993); O'Reilly, D.R., et al., Baculovirus Expression Vectors:A Lab
oratory Manual, 127）。市販されているインビトロゲンのＭａｘＢａｃ^TMバキ ュウロウイルス発現システム、昆虫細胞およびプロトコールのようなベクターも
有利である（INVITROGEN, Carlsbad, CA）（例ＶＩ参照）。

【０１３２】宿主細胞の例 本発明のカリウムチャネル分子をコードするヌクレオチド配列で形質転換した
宿主細胞を発現ならびにコードするタンパク質の細胞培養からの回収のために適
当な条件下で培養してよい。本発明の特に有利な態様は、実質的に配列番号：３
に記載される配列を有するポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片をコー
ドする核酸配列からなる精製したポリヌクレオチドで形質転換した宿主細胞であ
る。この種の細胞またはその調製物を使用して、カリウムチャネルの生物学的活
性の薬理学的に活性なモジュレーターに関してスクリーニングできる。このよう
に同定されるモジュレーターは本明細書に記載されるような神経生理機能の調節
のために使用される。

【０１３３】 真核性の組み換え宿主細胞は本明細書に記載されるのと別の点で特に有利であ
り、かつ当業者によく知られている。制限されるものではないが、例として酵母
、限定されるものではないがヒト、ウシ、ブタ、サルおよび齧歯類由来のホニュ
ウ類細胞系列を含み、かつ限定されるものではないがショウジョウバエおよびカ
イコ由来細胞系列を含む昆虫細胞を含む。適当なことがあり、かつ市販されてい
るホニュウ類の種から得られた細胞系列は、限定されるものでないが、Ｌ細胞Ｌ
Ｍ（ＴＫ−）（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１．３）、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１．
２）、２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５７３）、Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ８６）
、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５０）
、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ６
１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＣＬ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６
５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６１
６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２６）およびＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ ＣＣ
Ｌ１７１）を含む。

【０１３４】 ストラタジーンのｈＮＴニューロン（ヒトニューロン）はトランスフェクショ
ン、イオンチャネル遺伝子の研究、および薬剤スクリーニングのために市販され
ている（ La Jolla, CA. Pleasure, S.J., et al., J.Neuroscience, 12: 1802(
1992); J. Neuroscience, 35:585(1993); Hiraka, G., et al., J. Virol., 65:
2732(1991); Wertkin, R., et al., PNAS, 90:9513(1993); Younkin, D.P., et
al., PNAS, 90: 2174(1993)）。

【０１３５】 発現ベクターは新規のカリウムチャネルポリペプチドを発現する宿主細胞中に
、複数の技術のいずれか１つを介して導入してよい。該技術は限定されないが形
質転換、トランスフェクション、リポフェクション、プロトプラスト融合および
エレクトロポレーションを含む。本発明での使用のために適用できるよく特徴付
けられたベクター、トランスフェクション試薬および条件および細胞培養材料を
含む異種発現のための市販のキットは良好に確立されており、かつ容易に入手可
能である（CLONTECH, Palo Alto, CA; INVITROGEN, Carlsbad, CA; PHARMINGEN,
San Diego, CA; STRATAGENE, Lajolla, CA）。発現ベクターを含有する細胞は クローンとして増殖させ、個々に分析して新規のニューロンのカリウムチャネル
生体分子の製造のレベルを決定する。ポリペプチドを発現する宿主細胞クローン
の同定は、限定されないが本明細書に記載される抗体による免疫学的活性、およ
び／または宿主細胞関連特異的カリウムチャネル活性の存在、および／または二
官能性の架橋試薬ジスクシンイミジル基質もしくは類似の架橋試薬を使用するニ
ューロンのポリペプチドとの特異的基質の共有的架橋能力を含む幾つかの方法で
実施してよい。

【０１３６】 本発明のニューロン生体分子を、タンパク質の精製を容易にするために付加し
た１種以上の付加的なポリペプチドドメインを有する組み換えタンパク質として
発現させてもよい。かかる精製を容易にするドメインは、限定されないが金属キ
レートペプチド、例えば固定金属上での精製を可能にするヒスチジン−トリプト
ファンモジュール（Porath, J., Protein Exp. Purif. 3: 263(1992)）、固定イ
ムノグロブリン上での精製を可能にするプロテインＡドメイン、ならびにＦＬＡ
ＧＳ伸長／アフィニティー精製システム（Immunex Corp, Seattle WA）で使用さ
れるドメインを含む。精製ドメインとカリウムチャネルコーディング領域間への
開裂可能なリンカー配列、例えばファクターＸＡまたはエンテロキナーゼ（イン
ビトロゲン、サンディエゴ、ＣＡ）の含有は精製を容易にするために有用である
。

【０１３７】 天然の条件およびプロトコール下での６×Ｈｉｓ−タグしたタンパク質の精製
のためのシステム、例えばクロンテック、ＴＡＬＯＮ^TM非変性タンパク質精製キ
ットは市販されており、有利である（クロンテック、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ ）。

【０１３８】 更に、宿主細胞株は挿入された配列の発現の調節のためか、または発現させた
タンパク質を所望のようにプロセシングする能力に関して選択してよい。かかる
ポリペプチドの修飾は、限定されないがアセチル化、カルボキシル化、グリコシ
ル化、ホスホリル化、リピデーションおよびアセチル化を含む。未完成形のタン
パク質を開裂させる翻訳後プロセシングは正確な挿入、フォールディングおよび
／または機能のために重要なことがある。種々の宿主細胞、例えばＣＨＯ、Ｈｅ
Ｌａ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８、ＮＩＨ−３Ｔ３、ＨＥＫ２９３等は翻訳後
活性のための特異的な細胞機関ならびに特徴的な機構であり、正確な修飾および
導入した外来タンパク質のプロセシングを保証するために選択してよい。

【０１３９】 組み換えタンパク質の長期で高収率の製造のために、安定な発現が有利である
。例えば、新規のカリウムチャネルポリペプチドを安定に発現する細胞系列をウ
イルス由来の複製起点もしくは外因性発現エレメントおよび選択可能なマーカー
遺伝子を有する発現ベクターを使用して形質転換してよい。ベクターの導入後に
、細胞を富化した培地で１〜２日間増殖させ、引き続き選択培地に移してよい。
選択可能なマーカーの目的は選択のために耐性を付与することであり、その存在
は導入された配列を連続的に発現する細胞の成長および再生を可能にする。安定
に形質転換した細胞の耐性菌集塊は細胞型に適当な組織培養技術を使用して増殖
させることができる。

【０１４０】 本明細書に記載されているヒトのニューロン生体分子は、外来タンパク質の細
胞内もしくは細胞外発現のためにデザインされた発現ベクター中に最適なｃＤＮ
Ａシストロンを挿入した後に酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中で製造できる。細
胞内発現の場合にはＥｍＢＬｙｅｘ４またはそれに類似のベクターをベータサブ
ユニットシストロンにライゲーションする（例えばRinas, U., et al., Biotech
nology, 8:543(1990); Horowitz, B., et al., J.Biol.Chem., 265:4189(1989) ）。細胞外発現のためには、カリウムチャネルコーディング領域、例えば配列番
号：２をよく特徴付けられた任意の一連の分泌シグナルを使用してよい酵母発現
ベクターにライゲーションする。発現させたカリウムチャネル分子のレベルは本
明細書に記載されているアッセイによって決定する。

【０１４１】 ポリクローナル抗体またはタンパク質に特異的なモノクローナル抗体のいずれ
かを使用して新規のカリウムチャネルの発現を検出および測定する種々のプロト
コールはこの分野において公知である。例は酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳ
Ａ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および蛍光活性細胞選別（ＦＡＣＳ）を
含む。２種の非干渉エピトープに反応性のモノクローナル抗体を使用する２部位
のモノクローナル抗体ベースのイムノアッセイを使用してよい。よく知られてい
る競合的結合技術を使用してもよい（Hampton, R., et al.(1990), Serological
Methods-a Laboratory Manual, APS Press, St Paul Minn.; Maddox, D.E., et
al.,J.Exp.Med.158:1211参照）。

【０１４２】 キャップされたｍＲＮＡのインビトロ合成 例えば全長ｃＤＮＡ（配列番号：１）を標準的手順で使用して、異種細胞、例
えばアフリカツメガエルの卵細胞またはヒトのニューロンを含む種々の型のホニ
ュウ類細胞において機能的発現のために生物学的に活性のｍＲＮＡを合成してよ
い（例えばGoldin A, Methods Enzymol, 207:279(1992);イオンチャネル遺伝子 の研究のために市販されているSTRATAGENE, hNT Neurons,La Jolla, CA.参照） 。

【０１４３】 実質的に配列番号：３に記載される生体活性配列を有するポリペプチドもしく
は生物学的に活性なその断片をコードしている本明細書に記載される新規のカリ
ウムチャネルのためのコーディング領域（例えば配列番号：２を有する領域）を
、例えばバクテリオファージプロモーター、例えばＳＰ６、Ｔ７もしくはＴ３プ
ロモーターに３’をクローニングしてよい。プロメガ（マジソン、ＷＩ）からの
ＰＧＥＭベクターは本発明で使用してよい有利なベクターの例である。この分野
で公知の標準ベクター、例えばメッセージの安定性を促進し、かつアフリカツメ
ガエルの卵細胞における特異的発現を増加させるｐＳＰ６４ＴまたはｐＢＳＴＡ
は特に有利である（Kreig and Melton, Nucleic Acids Res., 12:7057(1984））
。特に有利なベクターは、５’末端に位置するアフリカツメガエルのベータ−グ
ロブリン５’および３’の非翻訳ｍＲＮＡ領域ならびに遺伝子の３’末端にポリ
−Ａテールを有する。

【０１４４】 本明細書に記載されるカリウムチャネルをコードするインサートまたはその生
物学的に活性な断片（（例えば配列番号：１）または配列番号：２を有する領域
、またはその欠損型）を有するプラスミドベクターＤＮＡ構築物を次いで制限酵
素で切断し、構築物を３’〜構造コーディング領域に直線化してよい。直線化し
たベクターはフェノール−クロロホルム−イソアミルアルコールで抽出し、エタ
ノール沈殿させ、ＲＮＡｓｅ不含の水中に再懸濁させてから、転写鋳型として使
用すべきである。例えば転写反応を前記のように実施し、生物学的に活性なｍＲ
ＮＡを合成し、引き続きインビボもしくはインビトロで公知法によって翻訳させ
てよい。ｍＭｅｓｓａｇｅ ｍＭａｃｈｉｎｅ^TMキット（AMBION, Austin, TX） は生物学的に活性なｍＲＮＡの合成のために特に有利である。選択的に、ｍＲＮ
Ａ転写物を、ノーザン分析およびＲＮａｓｅ保護アッセイによる組織分布の分析
のためのプローブとして使用してよい。

【０１４５】 ｍＲＮＡ合成 ＰＧＥＭ（プロメガ、マジソン、ＷＩ） １０×ＳＰ６／Ｔ７バッファー ５ｕｌ １０×ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ（各５ｍＭ） ５ｕｌ １０×ＧＴＰ（５ｍＭ） １ｕｌ １０×ＧｐｐｐＧ（キャップ；５ｍＭ） ５ｕｌ ＤＴＴ（１Ｍ） ０．５ｕｌ ＲＮａｓｅインヒビター（４０Ｕ／ｕｌ） １．２５ｕｌ 水 ２７ｕｌ 直線化したＤＮＡ（１ｕｇ／ｕｌ） １〜５ｕｌ ＳＰ６またはＴ７のＲＮＡポリメラーゼ（２０Ｕ／ｕｌ） １〜３ｕｌ 全反応容量 ５０ｕｌ ３７℃で１〜２時間インキュベートした。ＲＮＡｓｅ不含のＤＮＡｓｅ１ｕｌ
を添加し、鋳型ＤＮＡを分解した。１０分間消化させた。水７５ｕｌを添加した
。フェノール／ＣＨＣｌ₃で抽出した。ＲＮＡをエタノール沈殿させた。アリコ ートで−７０℃下に保存した。

【０１４６】 機能的発現 生物学的に活性なｍＲＮＡを機能的発現のために異種細胞中に導入し、かつ当
業者に公知の方法によって分析した。例えば前記の例の構築物からの合成ｍＲＮ
Ａを機能的発現および分析のためにアフリカツメガエルの卵細胞中に注入した（
Goldin, A., Methods Enzyml., 207:266,(1992)）。異種のカリウムチャネルを 標準の２電極電位クランプ法を使用して試験した（例えばStuhmer, W., Methods
in Enzymol., 207:319, (1992); Kohler, et al., Science, 273:1709(1996)参
照）。細胞内部のカリウム濃度を、例えばカリウムイオノホアを添加することに
よって変化させてよい。これは受容体と同時発現させると、細胞内カリウムの増
加を惹起する。カリウム濃度は選択的にインサイド−アウトでパッチを引き、か
つ浴培地のカリウム濃度を変化させることによって変化させてよい（例えばGris
smer, S., et al., Calcium-activated Potassium Channels in Resting and Ac
tivatied Human T lymphocytes, J.Gen.Physiol, 102:601(1993)）。標準の生物
物理的パラメーター、例えば活性化、カリウム依存性、単チャネルコンダクタン
ス、不活性化、テール電流、カリウム選択性およびＴＥＡ、アパミンおよびその
他を含む種々のＫチャネル遮断薬の完全な薬理機能を試験してよい（Grissmer,
S., et al., Calcium-activated Potassium Channels in Resting and Activate
d Human T Lymphocyte, J. Gen. Physiol, 102:601(1993)）。

【０１４７】 選択的に、ｃＲＮＡ（ｃＤＮＡ構築物からの合成ｍＲＮＡ）を異種のホニュウ
類細胞、例えばＲＢＬ細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１３７８）および２９３細胞（Ａ
ＴＣＣ＃ＣＲＬ１５７３）中に導入してよく、標準的方法を使用して形質転換し
てよい。例えば、エッペンドルフのマイクロインジェクションシステムを使用し
てよい（マイクロマニピュレーター５１７１およびトランスジェクター５２４２
）。形質転換させた細胞をよく示されるパッチクランプ法（例えばIkeda, et al
., Pfueg. Arch. Eur. J. Physiol., 422:201(1992); Grissmer, et al., J. Ge
n. Physiol., 102:601(1993)）を使用して約４時間Ｋ+電流に関して分析してよ い。

【０１４８】 細胞系列における新規チャネルの過剰発現 本明細書に記載されているコーディング領域を含む一過性および／または安定
に形質転換された真核細胞は新規のカリウムチャネルの高レベル発現のために意
図されている。

【０１４９】 真核性の形質転換体は、本明細書に記載の新規のチャネルをインビボでブロッ
クする同定分子のための薬理学的ターゲット結合研究において使用するための本
発明の有利な態様である。ＨＥＫ細胞が特に有利である。

【０１５０】 新規チャネルのためのコーディング領域の一過性発現は標準的な技術によるホ
ニュウ類細胞への直接のランフェクションによって達成することができる（Omar
i, K. et al., J. Physiol., 499:369, (1997); Panyi, G. et al., J. Gen. Ph
ysiol., 107(3):409(1996)）。高レベルの一過性発現は標準的なウイルス系、例
えばバキュウロウイルス、アデノウイルスもしくはワクシニアウイルスを使用し
て達成することができる。これらの系から得られるチャネル数は典型的に１細胞
あたり５〜５００Ｋである（Kamb, A., Methods Enzymol. 207:423(1992); Sun,
T. et al., Biochemistry, 33(33): 9992(1994); Spencer, R.H., et al., J.
Biol. Chem., 272:2389(1997)。

【０１５１】 本明細書に記載される新規のカリウムチャネル（配列番号：３）もしくは生物
学的に活性の変異体をコードする配列またはその断片を使用する異種細胞の安定
トランスフェクションは、例えばＮＩＨ−３Ｔ３，Ｌ９２９，ＣＯＳ、ＨＥＫも
しくはＣＨＯ細胞を使用して実施できる（例えばEMBO,11(6):2033(1992); Griss
mer, et al., Mol.Pharm., 45:1227(1994)参照）。

【０１５２】 本発明で使用するために有利なベクターはインビトロゲン（Carlsbad, CA)か ら市販されているｐｃＤＮＡ／Ｎｅｏである。

【０１５３】 例えばＮＩＨ３Ｔ３細胞は６０ｍｍプレートで５０％の群集に成長し（培地お
よび条件は特定の細胞系列の必要条件による）、かつ新規のカリウムチャネル、
例えば配列番号：２のためのコーディング領域を含む純粋なＤＮＡ５ｕｌを提供
者（LIFE TECHNOLOGIES Gibco BRL, Bethesda, MD）によって記載されるような リポフェクション試薬を使用するｐＣＤＮＡ／Ｎｅｏにおいてトランスフェクシ
ョンさせる。トランスフェクション後に、細胞を１０％のＦＣＳを有する培地で
３日間の条件で３７℃でインキュベートした。細胞をトリプシン処理し、１００
ｍｍの皿に播種し、次いでＧ４１８（ネオマイシン）で選択した。異種コーディ
ング領域の安定導入を伴う唯一の細胞をＧ４１８の存在下に増殖させ、これはプ
ラスミド中にネオマイシン耐性遺伝子によって付与される。単離されたクローン
を２〜３回の精製にのために処理し、Ｋ⁺電流に関してパッチクランプ法を実施 した。

【０１５４】 新規の遺伝子、例えば配列番号：１は分化したニューロンにおいて高度に発現
し、かつカリウムチャネルは、限定されないが塩化テトラエチルアンモニウム（
ＴＥＡ）、４−アミノピリジン（４−ＡＰならびに２−ＡＰおよび３−ＡＰ）、
３，４−および２，３−ジアミノピリジン、ＢａＣｌ₂、ＣｓＣｌ、ストリキニ ン、フェンシクリジン、ピリドスチグミン、９−アミノアクリジン、ＤｕＰ−９
９６（３，３−ビス（４−ピリジニルメチル）−１−フェニルインドリン−２−
オン；リノピリジン）、クロフィリウム、キニジン、アミノキノリン及びキニン
を含む特定のリガンドによって有効にブロックされるので、本明細書に記載され
る新規のチャネル構造コーディング領域を非相同に過剰発現する種々の細胞系列
を放射線標識結合アッセイで使用して、新規のチャネルをブロックする薬理学的
に活性な分子を、結合アッセイまたは競合結合アッセイでの測定可能な代替物と
しての放射線標識したリガンドを使用してスクリーニングすることができる。限
定されないが、スチコダクチロトキシン、アパミン、カリブドトキシン、カリオ
トキシン、およびマルゴトキシンを含むペプチド毒を本明細書に記載される結合
アッセイにおけるリガンドとして使用してもよい（例えば例ＸＩ参照）。

【０１５５】 新規チャネルのモジュレーターを高スループットのスクリーニングするためのリ
ガンド結合アッセイ 本発明の態様は、本明細書に記載されているカルシウム活性化カリウムチャネ
ルコーディング領域（例えば配列番号：１またはその生物学的に活性な欠損型も
しくはキメラ融合）を非相同的に過剰に発現する細胞系列ならびに新規のチャネ
ルをブロックする薬理学的活性分子を同定するための結合アッセイでのその使用
である。

【０１５６】 例えば放射線標識したリガンドを使用する放射線標識結合アッセイは以前にヒ
ルおよびドイチュ他（Hill, R.J., Mol.Pharm., 48:98(1995), and Deutsch, C.
, et al., J.Biol.Chem., 266:3668(1991)）によって記載されたように使用して
よい。本明細書に記載されている新規のカリウムチャネルを過剰に発現する細胞
系列の膜調製物をＰｏｌｙｔｒｏｎを使用して２５秒間１３０００ＲＰＭで均質
化し、かつ低速（１００ｇ）で２分間回転させた。上清を高速（５００００ｇ）
で１０分間回転させた。ペレットをアッセイバッファー（５ｍＭのＮａＣｌ、５
ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、６ｍＭのグルコース、ｐＨ８．４）１ｍ
ｌ中に再懸濁し、かつ５０ｕｇ／ｍｌに希釈した。

【０１５７】 ９６ウェルのマクロタイタープレートの各ウェルに、アッセイバッファー１３
０ｕｌならびに試験分子化合物（試験薬剤は、例えば小分子、ペプチド、類似体
もしくは擬態化合物であってよい）／対照アッセイバッファー／非特異的（１０
ｎＭコールドリガンド）（非放射性）を添加し、５０ｕｇ／ｍｌで新規のカリウ
ムチャネルを過剰発現する細胞からの膜５０ｕｌならびに放射性リガンド（２５
ｐＭ；ＮＥＮ、２２００Ｃｉ／ミリモル）５０ｕｌを混合しながら２１℃で２０
分間インキュベートした。結合した放射性リガンドを溶液中の放射線標識されて
いないリガンドから、事前に浸したＧＦ／Ｃユニフィルター（パッカードインス
トゥルメント）上で濾過し、かつ氷冷洗浄バッファー中で洗浄することによって
分離した。乾燥後に、そのフィルタープレートにシンチレーション計数をした。
飽和試験からのデータにスカッチャード分析および線形回帰を実施した（Deutsc
h, et al., J. Biol. Chem., 266: 3668(1991)）。新規カリウムチャネルの結合
のための放射線標識したリガンドと競合する化合物が同定され、これは比計数に
減少をもたらした。

【０１５８】 別の態様において、フィルターを必要としないシンチレーション近接アッセイ
（ＳＰＡ）は、容易に高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）アッセイのため
に適応させることができる（Hoffman, R. et al., Anal. Biochem., 20370(1992
); Kienuis, C.B.M., et al., J.Recept. Res., 12:389(1992)）。

【０１５９】 新規のカリウムチャネルポリペプチドを異種発現する細胞における⁸⁶Ｒｂ（また
は⁴²Ｋ）溶出アッセイ 細胞を６ウェルプレートにおいてＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ中で群集に増殖させ
た。細胞を⁸⁶Ｒｂ（５ミリＣｉ／ｍｌ）を含有するＨＥＰＥＳバッファー（ｍＭ
で：ＮａＣｌ １３７，ＫＣｌ ４．７，ＭｇＳＯ₄ ０．６，ＣａＣｌ₂ １．８，
ＨＥＰＥＳ ２０，グルコース ７．７）中でインキュベーターにおいて３７℃で
一晩インキュベートした。インキュベーションが完了したとき、⁸⁶Ｒｂを含有す
るＨＥＰＥＳを吸引し、かつ細胞をトレーサー不含のＨＥＰＥＳで洗浄し、細胞
外⁸⁶Ｒｂを除去した。細胞をトレーサー不含のＨＥＰＥＳで３分間インキュベー
トし、３分後にＨＥＰＥＳを吸引し、新たなＨＥＰＥＳを細胞に添加した。⁸⁶Ｒ
ｂのベースの放出が定常状態に達した後に、細胞をより高いＫＣｌ（２０ｍＭ）
を有するＨＥＰＥＳに６分間（３分間×２）暴露し、引き続き２０ｍＭのＫＣｌ
および選択化合物を含有する別の溶液に１２分間（３分間×４）暴露した。該工
程の完了後に、ＮａＯＨ５００ｍｌをウェルに添加し、細胞を刮ぎ取った。対照
細胞を、２０ｍＭのＫＣｌおよびビヒクル（ＤＭＳＯ）を含有するＨＥＰＥＳで
１２分間処理した。実験の最後に、吸引した溶液および細胞における放射活性を
ガンマ計数器中で計数した。組織に残留する放射活性のパーセンテージとして表
現される１分あたりの放出された放射活性を示す流出速度定数（ｋ分^-1）を計算
した。結果は、速度定数におけるピーク増加ならびに候補化合物適用の前の１０
分間の平均速度定数の差異として得られた溶出速度定数において最大％増加とし
て表現した。

【０１６０】 選択的に生物学的に活性のペプチド配列番号：３を得るための本明細書に記載
の新規の核酸配列、例えば配列番号：２を異種発現する細胞系列（例えばＨＥＫ
２９３，ＣＨＯ、ＣＯＳもしくはＳＦ９）を⁸⁶ＲｂＣｌ（１０ミリＣｉ／ｍｌ）
で１８時間３７℃で５％のＣＯ₂中でインキュベートした。細胞を低Ｋ⁺のＨＢＳ
Ｓ培地で洗浄し、低Ｋ⁺のＨＢＳＳ中の５．５×１０⁶細胞／ｍｌで再懸濁した。
細胞懸濁液５０ｕｌを、ミリポアのマルチスクリーン９６ウェル０．６５ｕｍ濾
過プレート（＃ＭＡＤＶ−Ｎ６５５０）のウェルにおいて候補化合物１０ｕｌと
一緒に周囲温度で１５分間インキュベートした。次いで混合物を同じ温度で、膜
の脱分極によるＲｂ流出を開始させるために添加した１４０ｍＭのＫ⁺−ＨＢＳ Ｓ１２５ｕｌと一緒に２０分間インキュベートし、ＴＶ−１真空トランスファー
マニホルド（Pall Trinity Micro, Cortland, NY）を使用して標準９６ウェルの
マイクロタイタープレート中に濾過した；濾液１００ｕｌを除去し、ベックマン
の液体シンチレーション計数器（Palo Alto, CA）において１分間計数した。カ リウムチャネル活性を阻害する化合物はＲｂ溶出を低減させた（例ＸＩＩ参照）
。

【０１６１】 レーザーベースの蛍光イメージングプレートリーダー（ＦＬＩＰＲ） 本明細書に記載される新規のカリウムチャネルは電位依存性カリウムチャネル
の分子特徴の全てを有するので、新規の生体分子を機能的に発現する細胞におけ
る膜電位の変化を検出する蛍光アッセイは、チャネル活性を調節する小分子の迅
速なスクリーニングのための別の方法である。かかるアッセイは蛍光膜電位感知
色素、例えばビス−オキシノールを使用して構成してよい（Brauner, et al., B
iochimica et Biophysica Acta, 771:208(1984)）。例えば配列番号：２を発現 する細胞を前記色素および候補化合物モジュレーターと一緒にインキュベートす
る。膜の脱分極は細胞外部のカリウム濃度の増大によって引き起こされる。通常
、脱分極の感知における膜中での色素の分割は蛍光の変化をもたらす。配列番号
：２を発現する細胞は脱分極および流出カリウムイオンに関して明らかであり、
かつ拮抗的過分極および蛍光に変化する色素の効率の低下をもたらす。新規のカ
リウムチャネルのリガンド、アゴニストまたはアンタゴニストのいずれかは視覚
的に検出される蛍光の変化を調節する。ＦＬＩＰＲ機器は現在Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｉｎｃ（Sunnyvale, CA ）で市販されており、かつ非常に迅
速かつセンシティブな９６ウェルスクリーニングアッセイに適応させることがで
きる（例ＸＩＩＩ参照）。

【０１６２】 種々のスクリーニングアッセイ また本発明は新規のカリウムチャネルおよび／またはニューロンの生物学的活
性をインビボで調節する化合物のためのスクリーニング法に関する。前記の活性
を調節する化合物はＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、または非タンパク
質性有機分子であってよい。化合物はカリウムチャネルをコードするＤＮＡまた
はＲＮＡの発現を低下または減衰させることによって活性を調節するか、または
新規のカリウムチャネル自体の生物学的活性を拮抗または作動させてもよい。ヒ
トのカリウムチャネルをコードするＤＮＡまたはＲＮＡの発現またはポリペプチ
ドの機能を調節する化合物は種々のアッセイによって検出することができる。該
アッセイは、発現または機能の変化があるかどうかを決定する簡単な“イエス／
ノー”アッセイであってよい。該アッセイは、試験試料の発現または機能と標準
試料の発現または機能のレベルとを比較することによって定量することができる
。

【０１６３】 本明細書に記載されるヒトの脳由来のカリウムチャネル、その免疫原性断片も
しくはオリゴペプチドを、任意の種々の薬剤スクリーニング技術において治療化
合物をスクリーニングするために使用することができる。かかる試験において使
用される断片は溶液中に遊離させるか、固体担体に付着させるか、細胞表面上に
担わせるか、または細胞内に配置するかであってよい。活性の廃絶または結合複
合体の形成を、カリウムチャネル生体分子および薬剤間で試験して測定してよい
。従って本発明は、カリウムチャネルポリペプチドまたはその断片と特異的結合
アフィニティーに関して複数の化合物をスクリーニングするにあたり、複数の化
合物を提供し、本発明のポリペプチドもしくはその断片と複数の化合物のそれぞ
れとを適当な条件下で結合を可能にするのに十分な時間の間で結合させ、かつト
ランスアクチベーター分子もしくはその断片と複数の化合物のそれぞれとの結合
を検出し、それによってヒトの脳由来の生体分子を特異的に結合させる化合物を
同定する方法を提供している。

【０１６４】 カリウムチャネルポリペプチドの活性を調節する化合物を同定する方法は一般
に有利であり、これはカリウムチャネル生物学的活性の候補化合物モジュレータ
ーと実質的に配列番号：３に記載される配列を有するカリウムチャネルのポリペ
プチドとを結合させ、かつカリウムチャネルの生物学的活性における候補化合物
モジュレーターの効果（例えば物理的結合の相互作用、Ｋ⁺イオンを通過させる 能力、ニューロンでの神経生理学的効果）を測定することからなる。

【０１６５】 カリウムチャネルの生物学的活性を調節する化合物の同定のための更なる方法
は、カリウムチャネルの生物学的活性の候補化合物モジュレーターと配列番号：
３に実質的に記載される配列を有するカリウムチャネルポリペプチドを発現する
宿主細胞とを混合し、カリウムチャネルの生物学的活性における候補化合物モジ
ュレーターの効果（例えば物理的結合の相互作用、Ｋ⁺イオンを通過させる能力 、測定可能な生物物理的効果、ニューロンでの神経生理学的効果）の測定からな
る。

【０１６６】 別の有利な方法は神経生理機能を調節する化合物を同定するにあたり、神経生
理機能の候補化合物モジュレーターと配列番号：３に実質的に記載される配列を
有するカリウムチャネルポリペプチドとを混合し、かつカリウムチャネルの生物
学的活性における候補化合物モジュレーターの効果を測定する方法である。

【０１６７】 カリウムチャネルの活性を調節し、かつ／または神経生理機能を調節もしくは
制御する化合物を同定するにあたり、候補化合物モジュレーターと配列番号：３
に実質的に記載されている配列を有する（または例えば誘導性発現を介してカリ
ウムチャネルポリペプチドを発現可能にする）カリウムチャネルポリペプチドを
発現する宿主細胞とを混合し、かつカリウムチャネルの生物学的活性または生理
学的効果において候補化合物モジュレーターの効果を測定する方法が有利である
。モジュレーターのための有利な細胞アッセイは２つの一般的カテゴリー分類さ
れる： １）物理的なカリウムチャネルの生物学的活性の直接の測定および ２）生理学的または神経生理学的効果の測定。これらの方法は本明細書に記載
される外来の脳由来のカリウムチャネルまたはヒトのニューロンを含む外来細胞
中での過剰に発現させた組み換えカリウムチャネルポリペプチドを使用してよい
。

【０１６８】 生物学的結合活性の測定のためにカリウムチャネルポリペプチドを精製するた
めに、由来は、標準的プロテアーゼインヒビターの存在での１〜３回の凍結−解
凍サイクルによって調製した全ての細胞溶解物であってよい。カリウムチャネル
は部分的にもしくは完全に、標準的なタンパク質精製法によって精製してよい。
本明細書に記載されているカリウムチャネルポリペプチドを本明細書に記載の特
異抗体を使用するアフィニティークロマトグラフィーによるか、または更に本明
細書に記載される組み換え分子に工学されたエピトープタグに特異的なリガンド
によって精製してよい。次いで調製物を前記の結合活性に関してアッセイしてよ
い。

【０１６９】 配列番号：３に実質的に記載されるアミノ酸配列を有する精製ポリペプチドは
本発明の特に有利な態様である。

【０１７０】 本明細書に記載され、引用され、かつ意図されている方法に従って一般に同定
されたカリウムチャネルの活性を調節（有利には生理機能を制御する、最も有利
には神経生理機能を制御する）する化合物は本発明の殊に有利な態様である。

【０１７１】 本発明の殊に有利な態様は、本明細書に記載される新規のヒトの脳由来のカリ
ウムチャネルによって媒介される状態の治療を必要とする患者の治療にあたり、
本明細書に記載される方法によって同定されるカリウムチャネル調節化合物の治
療的に有効量を適用する方法である。

【０１７２】 本発明の別の特に有利な態様は、機能不全ニューロンによって媒介される状態
もしくは神経生理学的疾患の治療を必要とする患者の治療にあたり、本明細書に
記載の方法によって同定されるカリウムチャネル調節化合物の治療的に有効量を
適用する方法である。

【０１７３】 本発明の更に特に有利な態様は、神経生理機能によって媒介される状態の治療
を必要とする患者の治療にあたり、本明細書に記載の方法によって同定される神
経生理機能の化合物モジュレーターの治療的有効量を適用する方法である。

【０１７４】 酵母２−ハイブリッドシステム 本発明の別の態様において、配列番号：３に実質的に記載されるカリウムチャ
ネル分子または生物学的に活性のその断片をコードする核酸配列を融合タンパク
質をコードさせるように外来配列にライゲーションしてよい。例えば更に前記の
生物学的活性の調節のための化合物をスクリーニングするために、外来宿主細胞
での発現のための本明細書に記載されるようなカリウムチャネルのキメラ分子を
コードさせるのが有用なことがある。またキメラ構築物を使用して、酵母２−ハ
イブリッドシステムを使用して公知の方法で“バイト”を発現させ、本明細書に
記載の新規のニューロン生体分子と会合することがある付随する天然のペプチド
（accessory native peptide）を同定してよい（Fields, S., et al., Trends G
enet., 10:286(1994); Allen, J.B., et al., TIBS, 20:511(1995)）。タンパク
質：タンパク質の相互作用を転写アクチベーターの再構築によって酵母ベースの
遺伝的アッセイを使用して検出することができる酵母２−ハイブリッドシステム
が記載されている（Fields, S., Song, O., Nature 340:245(1989)）。２−ハイ
ブリッドシステムは、相互作用するタンパク質のペアが、転写活性化ドメインと
隣接のリポーター遺伝子の発現を調節するＤＮＡ結合部位とを極めて接近させる
能力を使用している。市販されているシステム、例えばクロンテックのＭａｔｃ
ｈｍａｋｅｒ^TMシステムおよびプロトコールを本発明で使用してよい（CLONTECH
, Palo Alto, CA.）。またＭｅｎｄｅｌｓｏｈｎ，Ａ，Ｒ．，Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．
，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，５：４８２（１９９４）；Ｐｈｉｚｉｃ
ｋｙ．Ｅ．Ｍ．，Ｆｉｅｌｄｓ，Ｓ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅ ｖ．，５９（１）：９４（１９９５）；Ｙａｎｇ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２３（７）：１１５２（１９９５）；Ｆｉｅｌ
ｄｓ，Ｓ．，Ｓｔｅｒｎｇｌａｎｚ，Ｒ．，ＴＩＧ，１０（８）：２８６（１９
９４）；および米国特許第５２８３１７３号明細書、タンパク質−タンパク質の
相互作用を検出するシステム、および同第５４６８６１４号明細書が参照され、
参照することにより引用されたものとする。

【０１７５】 例えば変更したスクリーニングシステムを、最近開発されたバージョンの“逆
Ｙ２Ｈ”アプローチでのようなポジティブ読み出しもしくはネガティブ読み出し
を使用して実施することができる（例えばVidal M, Braun P, Chen E, Boeke JD
, Harlow E(1996) Genetic characterization of a mammalian protein-protein
interaction domain by using a yeast reverse two-hybrid system, Proc Nat
l Acad Sci USA 17; 93(19):10321-10326; Vidal M, Brachmann RK, Fattaey A,
Harlow E, Boeke JD(1996) Reverse two-hybrid and one-hybrid systems to d
etect dissociation of protein-protein and DNA-protein interactions. Proc
Natl Acad Sci USA 17;93(19):10315-10320; White MA(1996) The yeast two-h
ybrid system: forward and reverse, Proc Natl Acad Sci USA 17;93(19): 100
01-10003; Leanna CA, Hannink M(1996), The reverse two-hybrid system: a g
enetic scheme for selection against specific protein/protein interaction
s, Nucleic Acids Res 1;24(17):3341-3347参照）。

【０１７６】抗体 本発明のニューロンの生体分子に単特異的な抗体をポリペプチドに対して反応
性の抗体を含有するホニュウ類の高血清から精製するか、またはコーラーとミル
スタイン（Kohler and Milstein, Nature, 256:495(1975)）の技術を使用してヒ
トの脳由来カリウムチャネルポリペプチドと反応性のモノクローナル抗体として
調製する。本明細書に記載されるような単特異性抗体は新規のヒトの脳由来のカ
リウムチャネルのために均一の結合特性を有する単一の抗体種もしくは多数の抗
体種として記載されている。本明細書に記載される均一の結合は、前記のような
新規の転写アクチベーターに関連するような特異抗原もしくはエピトープに結合
する抗体種の能力のことである。ヒトのニューロン性カリウムチャネル特異抗体
はマウス、ラット、モルモット、ブタ、ウサギ、ヤギ、ウマ等、有利にはウサギ
のような動物を場合により免疫アジュバントを使用して適当な濃度のヒトのニュ
ーロン性カリウムチャネルで免疫することによって得られる。

【０１７７】 免疫前血清を一次免疫前に収集する。各動物は許容できる免疫アジュバントに
関連するニューロン性カリウムチャネルポリペプチド約０．１ｍｇ〜約１０００
ｍｇを受容する。かかる許容できるアジュバントは限定されないが、フロイント
の完全、フロイントの不完全、ミョウバン沈殿物、コリネバクテリウムパルブム
およびｔＲＮＡを含有する油中水エマルジョンを含む。初期免疫は、皮下（ＳＣ
）、腹腔内（ＩＰ）または両方で多数の部位で有利にはフロイントの完全アジュ
バント中のニューロン性カリウムチャネルポリペプチドからなる。各動物は、規
則的な間隔、有利には１週間ごとに抗体価を測定するために採血する。動物は場
合により一次免疫後にブースターインジョクションされてよい。ブースターイン
ジョクションされる動物は一般に同一の経路でフロイントの不完全アジュバント
において等量の抗原が与えられる。ブースターインジョクションは最高の価が得
られるまで約３週間間隔で与えられる。各ブースター免疫の約７日後または単一
免疫後の約１週間ごとに動物を採血し、血清を収集し、かつアリコートを約−２
０℃で保存した。

【０１７８】 脳由来のカリウムチャネルポリペプチドと反応性のモノクローナル抗体（ｍＡ
Ｂ）は近交系マウス、有利にはＢａｌｂ／ｃをカリウムチャネルポリペプチドで
免疫することによって調製される。該マウスはＩＰまたはＳＣ経路によって、前
記で議論したような許容できる等量のアジュバント中に混合された約０．５ｍｌ
のバッファーもしくは生理食塩水中の新規のニューロン性カリウムチャネルポリ
ペプチド約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇ、有利には約１ｍｇで免疫される。フロイン
トの完全アジュバントが有利である。マウスは０日目に初期免疫を受け、かつ約
３〜約３０週間休息させる。免疫されたマウスはバッファー溶液、例えば燐酸緩
衝した生理食塩水中の約０．１〜約１０ｍｇのニューロン性カリウムチャネルポ
リペプチドの静脈内（ＩＶ）経路での１つ以上のブースター免疫を受ける。抗体
陽性マウスからのリンパ球、有利には脾リンパ球は免疫したマウスからの脾臓を
当業者に公知の標準的手順で分離することによって得られる。ハイブリドーマ細
胞は脾リンパ球と適当な融合パートナー、有利には骨髄腫細胞とを、安定なハイ
ブリドーマの形成を可能にする条件下で混合することによって調製される。融合
パートナーは限定されないが、マウス骨髄腫Ｐ３／ＮＳ１／Ａｇ４−１；ＭＰＣ
−１１；Ｓ−１９４およびＳｐ２／０であってよく、有利にはＳｐ２／０である
。抗体産生細胞および骨髄腫細胞を約１０００分子量のポリエチレングリコール
中で約３０％〜約５０％の濃度で融合させる。融合された骨髄腫細胞を当業者に
公知の方法でヒポキサンチン、チミジンおよびアミノプテリンを補ったダルベッ
コの変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）中での増殖によって選択する。上清液を約１
４日目、１８日目および２１日目に増殖陽性のウェルから収集し、抗原としてヒ
トのニューロン性カリウムチャネルポリペプチドを使用して、免疫アッセイ、例
えば固相イムノラジオアッセイ（ＳＰＩＲＡ）によって抗体形成に関してスクリ
ーニングする。また培養液をオークターロニー沈殿アッセイにおいて試験してｍ
ＡＢのイソ型を決定する。抗体陽性のウェルからのハイブリドーマ細胞を技術、
例えばソフトアガー技術（MacPherson, Soft Agar Techniques, in Tissue Cult
ure Methods and Applications Kruse and Paterson, Eds., Academic Press, 1
973）によってクローニングする。

【０１７９】 モノクローナル抗体を、プリスタンの初回抗原刺激をうけたＢａｌｂ／ｃマウ
スの初回抗原刺激の約４日後に約２×１０⁶〜約６×１０⁶のハイブリドーマ細胞
でのマウス１匹あたり約０．５ｍｌの注入によってインビボで調製する。腹水を
細胞移行の約８〜１２日後に収集し、かつモノクローナル抗体を当業者に公知の
方法で精製する。

【０１８０】 抗ヒトニューロン性カリウムチャネルポリペプチドｍＡＢのインビトロ製造は
約２％の胎児の仔ウシ血清を含有するＤＭＥＭ中でハイブリドーマを増殖させ、
十分な量の特異的ｍＡＢを得ることによって実施する。ｍＡＢは当業者に公知の
技術で精製される。

【０１８１】 診断アッセイ 腹水またはハイブリドーマ培養液の抗体価は、限定されないが沈殿、受身凝集
反応、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）技術およびラジオイムノアッセイ
（ＲＩＡ）技術を含む種々の血清学的アッセイもしくは免疫学的アッセイによっ
て決定される。類似の診断アッセイを使用して、生体液もしくは組織および細胞
の抽出物中での新規のカリウムチャネル生体分子の存在が検出される。

【０１８２】 ヒトのニューロンのカリウムチャネルポリペプチド特異抗体を使用する診断ア
ッセイはカリウムチャネルの異常な発現または異常な細胞増殖もしくは異常な神
経生理機能に関連する遺伝子の発現を特徴とする状態、疾患もしくは障害の診断
に有用である。本発明のニューロン性の生体分子のための診断アッセイは、抗体
および標識を使用してヒトの生体液、細胞、組織もしくは切片またはかかる組織
の抽出物においてヒトのカリウムチャネルポリペプチドを検出する方法を含む。
本発明のポリペプチドおよび抗体は修飾するか、または修飾しないで使用してよ
い。しばしば、ポリペプチドおよび抗体を共有結合もしくは非共有結合的に、そ
の無数のものが当業者によく知られているリポーター分子と結合させることによ
って標識する。

【０１８３】 各タンパク質に特異的なポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体を使
用するカリウムチャネルポリペプチドを測定する種々のプロトコールはこの分野
ではよく知られている。例は、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオ
イムノアッセイ（ＲＩＡ）および蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を含む。ヒト
の脳由来のカリウムチャネルポリペプチド上の２つの非干渉エピトープに反応性
のモノクローナル抗体を使用する２部位のモノクローナル抗体ベースのイムノア
ッセイが有利であるが、競合的結合アッセイを使用してもよい。前記のアッセイ
は、中でもマドックス他（Maddox, D.E. et al）．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５
８：１２１１（１９８３）；サイテス他（Sites, D. P., et al）．，基礎およ び臨床の免疫学（Basic and Clinical Immunology），Ｃｈ．２２、第４版、ラ ンゲ医学出版（Lange medical publication），Ｌｏｓ Ａｌｔｏｓ，ＣＡ（１９
８２）；米国特許第３６５４０９０号明細書、同第３８５０７５２号明細書およ
び同第４０１６０４３号明細書に記載されている。

【０１８４】 疾患の診断のための基礎を提供するために、ヒトのカリウムチャネルポリペプ
チドのための正常値または標準値を確立せねばならない。このことは正常な検体
、動物もしくはヒトから取られる生体液もしくは細胞抽出物とヒトのニューロン
性チャネル生体分子に対する抗体とを、当業者に公知の複合体形成に適当な条件
下で混合することによって達成することができる。標準の複合体形成量は、既知
量の抗体を既知濃度の精製カリウムチャネルポリペプチドと混合する、希釈列の
ポジティブコントロールとの比較によって定量してよい。次いで、正常な試料か
ら得られる標準値を、チャネル生体分子の発現に関連する疾患もしくは障害によ
って潜在的に影響される検体からの試料から得られる値と比較してよい。標準値
と検体値間の偏差は障害状態の存在を証明する。

【０１８５】 カリウムチャネル核酸、チャネルポリペプチドに対する抗体もしくはタンパク
質を含有するキットを製造してよい。かかるキットを使用して、カリウムチャネ
ル核酸にハイブリダイズする異種核酸が検出されるか、または試料中でのタンパ
ク質もしくはペプチド断片の存在が検出される。かかる特徴付けは限定されない
が、法医学的分析および疫学的研究を含む種々の目的のために有用である。

【０１８６】 本発明のＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、組み換えタンパク質および抗体を使用して
、新規のカリウムチャネルＤＮＡ、ＲＮＡもしくはタンパク質のレベルをスクリ
ーニングおよび測定してよい。組み換えタンパク質、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子お
よび抗体は、新規のヒトのカリウムチャネル生体分子の検出および型別のために
適当なキットの形成に導く。かかるキットは、少なくとも１つの容器に緊密に閉
じて保持するのに適当な区画化されたキャリアーを有する。キャリアーは、試薬
、例えば組み換えカリウムチャネルまたは新規のカリウムチャネル生体分子を検
出するのに適当な抗カリウムチャネル抗体を含有する。またキャリアーは検出の
手段、例えば標識抗原もしくは酵素の基質等を含有する。

【０１８７】 新規のカリウムチャネルをコードするポリヌクレオチド配列は、新規の神経生
理学的生体分子の発現に関連する状態もしくは疾患の診断のために使用してよい
。例えばカリウムチャネルをコードするポリヌクレオチド配列を生検からの液も
しくは組織のハイブリダイゼーションまたはＰＣＲで使用し、生体分子の発現を
検出してよい。かかる定性的または定量的な方法の形はサザンまたはノーザン分
析、ドットブロット技術もしくは他の膜を基礎とする技術；ＰＣＲ技術、ディッ
プスティック、ピン、チップおよびＥＬＩＳＡ技術を含むことができる。これら
の技術の全ては当業者に公知であり、かつ多くの市販の診断キットの基礎である
。またかかるアッセイを使用して、動物研究、臨床試験、もしくは個々の患者の
治療のモニタリングにおいて特定の治療様式の有効性を評価してよい。疾患が確
定したら、治療剤を適用し、かつ治療プロフィールを作成する。かかるアッセイ
を規則的な基礎において繰り返し、該プロフィールでの値が正常パターンもしく
は標準パターンに向かって、または戻って経過するかを評価してよい。連続的治
療プロフィールを使用して、数日もしくは数ヶ月間の間治療の有効性を示してよ
い。

【０１８８】 また新規のヒトのカリウムチャネルをコードするポリヌクレオチド配列を分析
で使用して、染色体の位置のマッピング、例えば疾患マーカーとの機能的関連に
関するスクリーニングをしてよい。更に本明細書に記載される配列はヒトの配列
の多型および疾患との可能な関連ならびに生物学的活性を調節し、かつ生理学的
疾患、最も有利には神経生理学的疾患をインビボで制御する化合物のデザインの
ための可能な多型の配列の中からヒト配列多型を選択する分析をすることが考慮
されている。更に該配列は、治療的臨床試験のための適当なヒトの検体および患
者の同定において使用されるスクリーニングツールとして検討されている。

【０１８９】 アフィニティカラムを介する精製 抗体を製造する方法はカリウムチャネルポリペプチド断片または全長の発生期
のヒトカリウムポリペプチドに特異的な抗体の製造のために使用してよいことは
当業者に容易に明らかである。特に、完全に機能的な生体分子もしくはその断片
に特異的な抗体を得ることは当業者に容易に明らかである。

【０１９０】 カリウムチャネルポリペプチド抗体アフィニティカラムは抗体をＡｆｆｉｇｅ
ｌ−１０（バイオラッド）に付加することによって製造され、その際、ゲル担体
は抗体がアガロースゲルビーズ担体と共有結合を形成するようにＮ−ヒドロキシ
スクシンイミドで活性化する。次いで抗体をスペーサーアームを有するアミド結
合を介してゲルに結合させる。次いで残留する活性化エステルを１Ｍのエタノー
ルアミン塩酸（ｐＨ８）で失活させる。カラムを水で洗浄し、０．２３Ｍのグリ
シン塩酸（ｐＨ２．６）で引き続き洗浄し、任意の非結合抗体または異種タンパ
ク質を除去する。次いで適当なデタージェントを有する燐酸緩衝された生理食塩
水（ｐＨ７．３）において平衡化し、かつ適当な膜溶解デタージェントが使用さ
れた、例えばヒトのカリウムチャネルポリペプチドを含有する細胞培養上清また
は細胞抽出物を緩慢にカラム中を通過させる。次いでカラムを、光学密度がバッ
クグラウンドに低下するまで燐酸緩衝した生理食塩水／デタージェントで洗浄し
、次いでタンパク質を０．２３Ｍグリシン塩酸（ｐＨ２．６）／デタージェント
で溶出させる。次いで精製カリウムチャネルポリペプチドを燐酸緩衝した生理食
塩水／デタージェントに対して透析する。

【０１９１】 組み換えカリウムチャネル分子は他の細胞タンパク質から、全長の発生期のヒ
トのカリウムチャネルポリペプチドまたは該生体分子のポリペプチド断片に特異
的なモノクローナルもしくはポリクローナル抗体を使用して製造したイムノアフ
ィニティーカラムの使用によって分離することができる。

【０１９２】 本明細書に記載されるカリウムチャネルポリペプチドを使用して、天然の生物
学的材料、例えば疾患組織から生物学的エフェクターをアフィニティー精製して
よい。アフィニティークロマトグラフィー技術は当業者に公知である。本明細書
に記載されるカリウムチャネルポリペプチドまたはその効果的な断片を固体基質
、例えばＣＮＢｒ活性化セファロースに提供者（ファルマシア, Piscataway, NJ
）のプロトコールに従って固定させ、関連の可能な分子を含有する均質化／緩衝
させた細胞溶液をカラムに通過させる。洗浄後に、カラムは生物学的エフェクタ
ーのみを保持し、これを引き続き、例えば０．５Ｍの酢酸もしくはＮａＣｌ勾配
を使用して溶出させる。

【０１９３】アンチセンス分子 本明細書中に提供されるｃＤＮＡ配列配列番号：１を本発明の別の態様に使用
して、アンチセンス構築物の使用によって外因性遺伝子の発現をノックアウトす
ることにより細胞中の新規のカリウムチャネルの生理学的関連性を研究してよい
。

【０１９４】 ホニュウ類細胞における本発明の新規のカリウムチャネルのダウンレギュレー
ト発現の方法を可能にするために、配列番号：２に実質的に記載される配列に相
補的なＤＮＡ配列を有する例のアンチセンス発現構築物は、例えばｐＲＥＰ１０
ベクター（インビトロゲン社）を使用して容易に構築することができる。転写物
は前記の型の構築物をトランスフェクションさせた細胞の野生株のカリウムチャ
ネルｍＲＮＡの翻訳を阻害することが予想される。アンチセンス転写物は天然の
遺伝子転写物の翻訳の阻害のために効果的であり、かつ本明細書に記載される効
果（例えば神経生理学的疾患の制御）の誘導を可能にする。翻訳は、開始コドン
でまたはその近隣でのｍＲＮＡの遮断によって最も効果的に阻害される。従って
カリウムチャネルｍＲＮＡ転写物の相応の５’−末端領域に相補的なオリゴヌク
レオチドが有利である。ハイブリダイゼーションを妨害する二次構造または三次
構造はこの領域で最小である。更に開始部位から３’方向に離れている配列はｍ
ＲＮＡ転写物のハイブリダイゼーションに殆ど影響が無い。それというのもリボ
ソームが、アンチセンス／センス二本鎖を解明してメッセージの翻訳を可能にす
るように見える“読み通し”現象のためである。新規のカリウムチャネルｍＲＮ
Ａの任意の部分に相補的であり、かつハイブリダイズするオリゴヌクレオチドは
治療的使用のために検討される。

【０１９５】 インビトロ活性を示すオリゴヌクレオチド配列の同定法が完全に記載されてい
る米国特許第５６３９５９５号明細書（Identification of Novel Drugs and Re
agents, issued Jun. 17, 1997）は引用することにより記載したものとする。前
記の公知のポリヌクレオチドから得られたランダムなオリゴヌクレオチド配列を
有する発現ベクターを細胞に形質転換する。次いで細胞をオリゴヌクレオチドの
所望の活性から得られる表現型に関してアッセイする。所望の表現型を有する細
胞が同定されたら、所望の活性を有するオリゴヌクレオチドの配列を同定できる
。同定はベクターの回収またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅および挿入
された核酸材料を有する領域の配列決定によって達成することができる。

【０１９６】 新規のカリウムチャネルポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に相
補的なヌクレオチド配列をアンチセンス治療のために合成することができる。こ
れらのアンチセンス分子はＤＮＡ、ＤＮＡの安定な誘導体、例えばホスホロチオ
エートもしくはメチルホスホネート、ＲＮＡ、ＲＮＡの安定な誘導体、例えば２
’−Ｏ−アルキルＲＮＡまたは他のオリゴヌクレオチドミメティックであってよ
い。生理学的に安定なアンチセンス分子の合成および効果を記載している１９９
７年７月２９日に提出された米国特許第５６５２３５５号明細書（Hybrid Oligo
nucleotide Phosporothioates）および１９９７年７月２９日に提出された米国 特許第５６５２３５６号明細書（Inverted Chimeric and Hybrid Oligonucleoti
des）は参照することにより引用されたものとする。カリウムチャネルアンチセ ンス分子はマイクロインジェクション、リポソーム封入もしくはアンチセンス配
列を有するベクターからの発現によって導入してよい。アンチセンス療法は、本
明細書に記載されるカリウムチャネルの生物学的活性を調節することが有益な疾
患の治療のために特に有用な場合がある。

【０１９７】 遺伝子治療 本明細書に記載されるカリウムチャネルポリペプチドを遺伝子治療を介して検
体に適用してよい。本発明のポリペプチドを前記のように標的器官の細胞に配達
してもよい。逆に、カリウムチャネルポリペプチドアンチセンス遺伝子治療を使
用して、標定器官の細胞中のポリペプチドの発現を調節し、このように生物学的
活性を制御してもよい。カリウムチャネルポリペプチドコーディング領域は、レ
シピエント宿主細胞の感染によるトランスアクチベーターポリペプチド核酸の移
行を媒介するウイルスベクター中にライゲーションすることができる。適当なウ
イルスベクターはレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘル
ペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス等を含む（１９９７年４月
２９日に提出された米国特許第５６２４８２０号明細書（Episomal Expression
Vector for Human Gene Therapy）参照）。

【０１９８】 本発明の核酸コーディング領域を効果的な真核性発現ベクター中に導入し、こ
れを遺伝子治療のために体細胞に適用もしくは組み込む（コーディング領域、有
利にはｍＲＮＡ転写物を有する核酸断片を体細胞に直接適用するか、または組み
込む）（１９９６年１２月３１日に提出された米国特許第５５８９４６６号明細
書参照）。かかる核酸およびベクターはエピソーム状で維持してよく、または宿
主の染色体ＤＮＡ中にプロウイルスまたは、遺伝子融合および適当な真核性の転
写および翻訳シグナル、すなわち効果的に配置されるＲＮＡポリメラーゼプロモ
ーター５’から遺伝子融合の転写開始シグナルおよびＡＴＧ翻訳開始コドンなら
びに終止コドンおよび効果的に３’をコーディング領域に配置した転写ポリアデ
ニル化シグナル）を含むその部分として組み込んでよい。選択的に、新規のカリ
ウムチャネルポリペプチドＤＮＡを遺伝子治療のために、リガンド−ＤＮＡ結合
物もしくはアデノウイルス−リガンド−ＤＮＡ結合物、リポフェクション膜融合
または直接的なマイクロインジェクションを使用する受容体を媒介する標的ＤＮ
Ａ移行を含む非ウイルス性技術によって細胞中に移行することができる。これら
の方法およびその変法は、この分野で確立された方法によるエクスビボならびに
インビボのヒト遺伝子治療のために適当である。

【０１９９】 ＰＣＲ診断 核酸配列、オリゴヌクレオチド、断片、部分もしくはそのアンチセンス分子を
体液もしくは生検組織の診断的アッセイで使用して、新規のヒトの脳由来のカリ
ウムチャネル分子の発現レベルを検出してよい。例えばｃＤＮＡ配列配列番号：
１からデザインされた配列または配列番号：２に含まれる配列を使用して、患者
のｍＲＮＡ転写の存在の検出または治療中の転写物の調節のモニタリングをする
ことができる。

【０２００】 標的核酸の増幅またはハイブリダイゼーションアッセイによるその後の分析の
ための１つの方法はポリメラーゼ連鎖反応（“ＰＣＲ”）またはＰＣＲ技術とし
て知られている。ＰＣＲ技術を使用して、本発明の配列を、互いに離れており、
かつ例えば前記の配列番号：１に記載の遺伝子配列を基礎としたオリゴヌクレオ
チドプライマーを使用して疑いのある試料において検出することができる。該プ
ライマーは二本鎖ＤＮＡの反対の鎖に相補的であり、５０〜４５０個のヌクレオ
チドまたはそれ以上（通常２０００ヌクレオチド以下）によって典型的に分離さ
れる。この方法は特異的なオリゴヌクレオチドを製造し、引き続き標的ＤＮＡの
変性、プライマー結合およびＤＮＡポリメラーゼでの伸長を繰り返すことで、プ
ライマー間隔に基づく予想される長さのＤＮＡ断片を得る必要がある。本発明の
１つの例の態様は例ＩＩに実質的に記載されるＰＣＲプライマーを有する配列番
号：２に実質的に記載される配列を有するポリヌクレオチド配列の同定のための
診断組成物である。標的配列の増幅の度合いは、実施されかつ簡単な式２ｎ（ｎ
はサイクル数である）によって理論的に計算されるサイクル数によって調節され
る（例えば Perkin Elmer, PCR Bibliography, Roche Molecular Systems, Bran
chburg, New Jersey; CLONTECH products, Palo Alto, CA; U.S.Patent No. 5,6
29,158, Solid Phase Diagnosis of Medical Conditions, issued May 13, 1997
参照）。

【０２０１】組成物 生物学的活性を有する新規のカリウムチャネルポリペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ
、アンチセンス配列、またはそのヒトのポリペプチド、または変異体および類似
体または本明細書に記載される方法によって同定される細胞生理機能を調節する
化合物に関連する配列を有する医薬品に有用な組成物は公知法に従って、例えば
製薬学的に認容性のキャリアーの添加によって配合してよい。かかるキャリアー
および配合法の例はレミントンの製薬科学（Remington's Pharmaceutical Scien
ces(Maack Publishing Co, Easton, PA）に見いだすことができる。効果的な適 用のために適当な製薬学的に認容性の組成物を形成するために、かかる組成物は
タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは化合物モジュレーターの有効量を含有する。

【０２０２】 本発明の治療もしくは診断用の組成物は個体に、ヒトの生理学的疾患もしくは
神経生理学的疾患を治療または診断するのに十分な量で適用する。有効量は個体
の状態、体重、性別および年齢のような種々のファクターに応じて変化させてよ
い。他のファクターは適用の様式である。

【０２０３】 用語“化学的誘導体”は、通常ベース化合物の部分でない付加的な化学的部分
を有する分子を記載している。かかる部分はベース化合物の溶解度、半減期、吸
収等を改善することがある。選択的に該部分はベース化合物の不所望な副作用を
低減するか、またはベース化合物の毒性を低下させることがある。かかる部分は
種々のテキスト、例えばレミントンの製薬科学に記載されている。

【０２０４】 本発明での使用のために適当な医薬品組成物は、活性成分を意図される目的の
達成のための有効量で含有する組成物を含む。有効用量の決定は当業者に公知で
ある。治療的有効用量は、例えば腫瘍細胞の細胞培養アッセイまたは動物モデル
、通常マウス、ウサギ、イヌもしくはブタで最初に見積もることができる。また
動物モデルを使用して、所望の濃度範囲および適用経路を得ることができる。次
いでかかる情報を使用して、ヒトにおける有用な用量および適用経路を決定する
ことができる。治療的有効用量は症状または状態を改善するタンパク質もしくは
その抗体、アンタゴニスト、またはインヒビターの量を示している。正確な適用
量は治療すべき患者を考慮して医者個人によって選択される。

【０２０５】 本明細書に開示される方法によって同定される化合物は、あらゆる可能な毒性
の低減を伴ってカリウムチャネルの生物学的活性および／または生理学的状態も
しくはその活性の最適な調節を得るために、慣用の試験によって定義した適当な
適用量で単独に使用してよい。更に、他の薬剤の同時適用もしくは連続適用が望
ましいことがある。

【０２０６】 医薬品組成物を個体に種々の経路、例えば皮下的に、局所的に、経口的に、か
つ筋肉内に提供してよい。医薬品組成物の適用は経口的または非経口的である。
非経口的送達は局所適用、動脈内適用（組織に直接）、筋肉内適用、皮下適用、
髄内適用、髄腔内適用、脳室内（心室内）適用、静脈内適用、腹腔内適用もしく
は鼻腔内適用を含む。また本発明の対象は、本発明の新規の治療法での使用のた
めの適当な局所医薬品製剤、経口医薬品製剤、全身性医薬品製剤および非経口医
薬品製剤を提供することである。本発明により生理学的状態の調節に使用するた
めの活性成分として同定された化合物を含有する組成物は適用のための慣用のビ
ヒクル中で広範な治療的剤形で適用することができる。例えば、化合物は、錠剤
、カプセル剤（それぞれ持効性および持続放出性を含む）、丸剤、粉剤、顆粒剤
、エリキシル剤、チンキ剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤およびエマルジョンのよ
うな剤形でか、または注入によって適用することができる。また同様に、これら
は静脈内（塊状注入）形、腹腔内形、皮下形、場合により閉塞させて局所形また
は筋肉内形で適用してもよく、その際、全ては製薬の分野の専門家によく知られ
た形を使用している。所望の化合物の非毒性の有効量はカリウムチャネル調節剤
として使用することができる。

【０２０７】 生成物の一日の用量は、成人あたり０．０１〜１０００ｍｇ／一日の広い範囲
内に変更させてよい。経口適用のために、有利には組成物は、治療すべき患者へ
の投与の症状調節のための活性成分０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．
０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０および５０．０ミリグラム
を含有する切れ目を入れた（scored）錠剤または切れ目を入れていない錠剤の形
で提供される。薬剤の有効量は、通常一日あたり約０．０００１ｍｇ／体重ｋｇ
〜約１００ｍｇ／体重ｋｇの投与レベルで供給される。より特に、範囲は一日あ
たり約０．００１ｍｇ／体重ｋｇ〜１０ｍｇ／体重ｋｇである。更に特に、範囲
は約０．０５〜約１ｍｇ／ｋｇで変化させる。もちろん、投与レベルは特定の化
合物の有効性に依存して変化させる。一定の化合物は他のものより有効である。
更に、投与レベルは化合物の生物学的利用能に依存して変化する。化合物がより
生物学的に利用可能かつ有効であれば、殆どの化合物は、限定されないが経口送
達を含む任意の送達経路によって適用する必要がない。カリウムチャネルモジュ
レーターの用量は所望の効果を得るために混合する際に調整する。一方、前記の
種々の薬剤の用量は、それぞれの薬剤を単独で使用する場合より病理を低減する
相乗的結果が得られるように独立に最適化し、かつ混合してよい。当業者はタン
パク質またはそのインヒビターに関するよりもヌクレオチドに関する種々の製剤
を使用する。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は特定の細胞
および状態に特異的である。

【０２０８】 例１ 全長ｃＤＮＡの同定 ｃＤＮＡの配列番号：１を新規のＫｖＱＴチャネルに関する初期のデータベー
ス検索から同定した。ｈＫｖＬＱＴ１の部分配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号
Ｕ４０９９０）を登録データベースに対するｔｂｌａｓｔｎ検索で使用し、公共
のドメインデータベースおよびＭｅｒｃｋ−ＷａｓｈＵクローンｙｎ７２ｇ１１
（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号Ｈ２３７０１）の検索のために引き続き使用され
る相同核酸配列を同定する。Ｍｅｒｃｋ−ＷａｓｈＵクローンのソースはヒトの
脳ライブラリーであった。組織を、破裂性大動脈瘤で死亡した５５歳の男性から
死後１７時間後に得た。出発ＲＮＡは、左大脳半球および右大脳半球、皮質白質
、基底核、視床、小脳、中脳、脳橋および髄質からの前頭皮質、頭頂皮質、側頭
皮質および後頭皮質を含む脳組織のプールから調製した。ｃＤＮＡ合成はＮｏｔ
Ｉ−オリゴ（ｄＴ）プライマーを使用して開始した。二本鎖ｃＤＮＡをサイズ選
択し、ＥｃｏＲＩアダプター（ファルマシア）にライゲーションし、ＮｏｔＩで
消化し、かつ改変ｐＴ７Ｔ３ベクター（ファルマシア）のＮｏｔＩおよびＥｃｏ
ＲＩの部位にクローニングした。ライブラリーはベント・ソアレス（Bento Soar
es）によって構築され、かつ２回の規格化がなされた（Soares, B., et al., PN
AS, 91:9228(1994)）。全長の情報はヒトの脳ｃＤＮＡライブラリーから５’お よび３’のＲＡＣＥ−ＰＣＲ技術（ｃＤＮＡ末端の迅速な増幅）を使用して得た
（Schaefer, Anal. Biochem., 227: 255(1995)）。

【０２０９】 例２ 全長クローニング 本明細書に記載される新規のｃＤＮＡ配列の３’末端をＨｕｍａｎ Ｂｒａｉ ｎ，Ｗｈｏｌｅ Ｍａｒａｔｈｏｎ Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ^TM（クロンテック、Pal
o Alto, CA; Cat.#7400-1）０．２５ｎｇから、製造者の推奨に従ってＡｄｖａ ｎｔａｇｅ^TM ＫｌｅｎＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｍｉｘ（クロンテ
ック Cat.#8417-1）を使用して５０ｍｌの反応で増幅させた。Ｍａｒａｔｈｏｎ
Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ^TMはｃＤＮＡ末端の迅速な増幅（RACE）で使用される二本
鎖のアダプターにライゲーションしたｃＤＮＡである。プライマーの一組の配列
は：５’ＡＡＣＣＴＣＴＣＧＣＧＣＡＣＡＧＡＣＣＴＧＣＡ３’（配列番号：１
の塩基位置１０５８〜１０８０に相当するフォワード）および５’ＣＣＡＴＣＣ
ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ３’（ユーザーマニュアルに示さ
れるｃＤＮＡアダプター（クロンテック Cat.#PT1156-1）に相当するリバース）
である。サイクルパラメーターはユーザーマニュアルに従ってプログラム１であ
った（簡単に言うと、４分間の伸長を伴うタッチダウンＰＣＲ）。５ｍｌのアリ
コートを製造者の推奨に従ってＡｄｖａｎｔａｇｅ^TM ＫｌｅｎＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｍｉｘを使用して５０ｍｌの反応で再び増幅させた。プ ライマー配列は：５’ＣＴＣＣＡＣＧＴＧＧＣＡＧＴＡＣＴＡＣＧＡＧＣ３’（
配列番号：１の塩基位置１０８１〜１１０３に相当するフォワード）および５’
ＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣ３’（ユーザーマニュアルに
示されるｃＤＮＡアダプターに相当するリバース）である。サイクルパラメータ
ーはユーザーマニュアルに従ってプログラム１であった（簡単に言うと、４分間
の伸長を伴うタッチダウンＰＣＲ）。ＰＣＲのアリコートを、ＥｔＢｒ０．５ｕ
ｇ／ｍｌを有する１％アガロース／１×ＴＡＥゲル上で泳動した。約１．２ｋｂ
の生成物をＱＩＡＧＥＮ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（QIAGEN, Santa
Clarita, CA; Cat.#28704）を使用して切り出して単離した。ゲル溶出物をＲｅ
ｇｕｌａｒ ｐＴ７ＢｌｕｅＴベクターキットとリガーゼ（ノバ利得、マジソン 、ＷＩ；Ｃａｔ．＃６９８３６−１）を使用してｐＴ７ＢｌｕｅＴベクター中に
ライゲーションし、かつＮｏｖａＢｌｕｅ細胞を製造者の推奨に従ってライゲー
ション反応物で形質転換した。４個のコロニーを配列決定し、プライマーをデザ
インして、Ｈｕｍａｎ Ｂｒａｉｎ，Ｗｈｏｌｅ Ｍａｒａｔｈｏｎ Ｒｅａｄｙ
ｃＤＮＡ^TM０．５ｎｇからＲＡＣＥ生成物を再び増幅させ、かつＲＡＣＥ配列決
定データを確認した。Ａｄｖａｎｔａｇｅ^TM ＫｌｅｎＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙ ｍｅｒａｓｅ Ｍｉｘは製造者の推奨で５０ｍｌの反応で使用した。ＤＭＳＯを 最終濃度５％で含んでいる。サイクルパラメーターはユーザーマニュアルに従っ
てプログラム１であった（簡単に言うと、４分間の伸長を伴うタッチダウンＰＣ
Ｒ（touch-down PCR））であった。プライマーの一組の配列は、５’ＡＡＣＣＴ
ＣＴＣＧＣＧＣＡＣＡＧＡＣＣＴＧＣＡ３’（配列番号：１の塩基位置１０５８
〜１０８０に相当するフォワード）および５’ＧＡＣＣＣＡＡＧＧＣＣＧＣＡＧ
ＧＴＣＣＴＣＡＣＣ３’（配列番号：１の塩基位置２９９８〜３０３０に相当す
るリバース）である。

【０２１０】 配列番号：１に特異的な第一鎖ｃＤＮＡを、５ｍｇのヒューマンブレイン全Ｒ
ＮＡ（クロンテック、カタログ番号６４０２０−１）ならびに第一鎖ｃＤＮＡ合
成のためのＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ^TM予備増幅システム（ライフテクノロジー、
ガイテルスブルク、ＭＤ；カタログ番号１８０８９−０１１）を使用して構築し
た。製造者のプロトコール５．１（高ＧＣ含量を有する転写物の第一鎖ｃＤＮＡ
合成）を実施した。プライマー配列は５’ＧＡＣＣＣＡＡＧＧＣＣＧＣＡＧＧＴ
ＣＣＴＣＡＣＣ３’（配列番号：１の塩基位置２９９８〜３０３０に相当するリ
バース）を使用した。そのアリコート５ｍｌを製造者の推奨に従ってＡｄｖａｎ
ｔａｇｅ^TM ＫｌｅｎＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｍｉｘを使用して５
０ｍｌの反応で増幅させた。ＤＭＳＯは最終濃度５％で含んでいた。サイクルパ
ラメーターはユーザーマニュアルに従ってプログラム１であった（簡単に言うと
、４分間の伸長を伴うタッチダウンＰＣＲ）。プライマー配列は：５’ＧＣＣＡ
ＧＧＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＣＡＧＡＡＧＴＣＧ３’（配列番号：１の塩基位置１
〜２５に相当するフォワード）および５’ＣＡＡＡＡＣＣＴＣＧＧＡＧＧＣＡＣ
ＣＧＴＧＣＴＧ３’（配列番号：１の塩基位置２６１４〜２６３７に相当するリ
バース）である。キア利得のＰＣＲ精製キット（キア利得、カタログ番号２８１
０４）を使用して精製し、かつＴＯＰＯ ＴＡクローニング^(R)キットデュアルプ
ロモーター（インビトロゲン、カールスバッド、ＣＡ；カタログ番号Ｋ４６００
−０１）を使用してｐＣＲ^(R)ＩＩ−ＴＯＰＯベクター中にライゲーションし、 ＴＯＰ１０細胞を製造者の推奨に従ってライゲーション反応物で形質転換した。
４個のコロニーを選択し、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ^TM３７７自動シーケンサーを使用 する両方向のインサートの配列決定をした。配列番号：１は前記のコーディング
領域の配列決定データならびにＲＡＣＥ生成物の配列決定からの３’ＵＴＲから
得られた。

【０２１１】 例３ ノーザン分析のための細胞の維持および調製ならびにＲＮＡの調製 グリア細胞の単離 ヒトの胎児の脳組織（１６〜２２齢期の胎児）をアナトミックギフトファウン
デーション（Anatomic Gift Foundation）（ウッドバイン，ＧＡ）から商業的に
得た。大脳半球を冷却した、滅菌のカルシウム不含のマグネシウム不含のハンク
ス液（ＨＢＳＳ，＃１４１７０−１１２、ライフテクノロジー／ギブコ−ＢＲＬ
、ガイサーズブルク、ＭＤ）中に入れた。髄膜を滅菌鉗子を使用して除去し、か
つ組織を滅菌ピペットにより破砕を繰り返すことによって分離した。組織を０．
０５％のトリプシン／０．５３ｍＭのＥＤＴＡ（＃２５３００−０５４，ライフ
テクノロジー／ギブコ−ＢＲＬ、ガイサーズブルク、ＭＤ）および０．１５ｍｇ
／ｍｌのＤＮＡｓｅ（＃Ｄ−５０２５，シグマケミカルＣｏ．，セントルイス、
ＭＯ）と一緒に緩慢に振盪しながら３７℃で４５分間インキュベートした。１０
％の胎児のウシ血清（ＦＢＳ、＃１６０００１−０３６，ギブコ−ＢＲＬ／ライ
フテクノロジー、ガイサーズブルク、ＭＤ）を懸濁液に添加して、トリプシン処
理を／停止させた。次いで細胞を２１０μｍおよび１４９μｍのポリプロピレン
メッシュ（＃０８−６７０−１８８および＃０８−６７０−１８９，フィッシャ
ーサイエンティフィック、ピッツバーグ、ＰＡ）に連続して通過させた。濾液を
２回洗浄し、かつ完全培地［ＤＭＥＭ（高グルコース、高Ｌ−グルタミンおよび
高ＨＥＰＥＳを有する）、ギブコ＃１２４３０−０５４；１００Ｕ−ｍｇ／μｌ
のペニシリン／ストレプトマイシン、ギブコ＃１５０７０−０３０；１０％のＦ
ＢＳ、ギブコ＃１６０００１−０３６］中で再懸濁した。細胞を８０００万／７
５ｃｍ²フラスコ（＃１２−５６５−５２，フィッシャーサイエンティフィック 、ピッツバーグ、ＰＡ）の密度でプレーティングした。培養を３７℃、５％のＣ
Ｏ₂で２週間インキュベートした（培養の中の細胞破片を除去するために１週間 に１回培地を交換した）。成熟培養は星状細胞、ニューロン、小神経膠細胞およ
び乏突起神経膠細胞からなる。

【０２１２】 純粋の星状細胞培養は、完全培地の除去（浮遊小神経膠細胞を含有する）およ
びニューロン、乏突起神経膠細胞および付着した小神経膠細胞を効率的に除去す
る培養のトリプシン処理３回によって得られた。星状細胞を０．０１％のｂ−Ｍ
Ｅ（シグマ、カタログ番号Ｍ７１５４）を有するバッファーＲＬＴ（キア利得）
中で２４時間以内に溶解させ、かつ使用するまで−８０℃で凍結させた。

【０２１３】 ＩＭＲ−３２細胞 ＩＭＲ−３２ヒト神経芽細胞腫（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−１２７；ロックヴィレ、
ＭＤ、ＵＳＡ）細胞を１０％の熱不活性化ＦＢＳ（ＪＲＨバイオサイエンス、カ
タログ番号１２１２６−７８−Ｈ）および２ｍＭのｌ−グルタミン（セルグロ（
Cellgro）、カタログ番号２０−００５−ＬＩ）を補ったＭＥＭ（スペシャリテ ィーメディア、カタログ番号ＳＬＭ−０３４−１３）中で５％のＣＯ₂の加湿雰 囲気下で３７℃において培養した。培地を週に２回取り換えた。細胞を１ｍＭの
ジブチリルｃＡＭＰ（アルドリッヒ、カタログ番号８５−１９６−５）および２
．５μＭの５−ブロモデオキシウリジン（シグマＢ−９２８５）を使用して培養
に分化した。細胞を０．０１％のｂ−ＭＥ（シグマ、カタログ番号Ｍ７１５４）
を有するバッファーＲＬＴ（キア利得）中で溶解させ、かつ使用するまで−８０
℃で凍結させた。

【０２１４】 溶解させた細胞を氷上で解凍し、ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ（キア利得、カタロ
グ番号７９６５４）によって加工して均質化した。次いで全ＲＮＡを製造者の説
明書に従ってＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キア利得カタログ番号７４１０３
）を使用して調製した。濃度を２６０ｎｍでの吸収によって決定した。

【０２１５】 ヒト脳、ヒト胎児脳およびラット脳の全ＲＮＡ（クロンテック、カタログ番号
６４０２０−１，６４０１９−１，６４０６０−１）を製造者の推奨に従って使
用のために沈殿させ、かつ再懸濁した。ヒト脳、ヒト胎児脳、ラット脳、Ｉｍｒ
−３２（未分化）、Ｉｍｒ−３２（分化）およびヒト胎児星状細胞からの全ＲＮ
Ａの２０ｕｇそれぞれを、５ｍｇのＲＮＡラダー（ライフテクノロジー、カタロ
グ番号１５６２０−０１６）と一緒に１％のアガロース／２．２Ｍのホルムアル
デヒド／１×ＭＯＰＳ変性ゲル上で５０Ｖで４．５時間泳動した。ＲＮＡを、製
造者のプロトコールに従って、正に荷電したナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ^TMＮ⁺、 アマルシャム＃ＲＰＮ２０３Ｂ）に一晩かけてトランスファーした。ＲＮＡをス
トラタジーン社のストラタリンカーを使用して膜に４０秒間ＵＶ架橋させた。

【０２１６】 ２種の多種組織ノーザンブロット（カタログ番号７７６０−１および７７５９
−１）およびヒト脳の種々の領域からのＲＮＡによるブロット（カタログ番号７
７５５−１）をクロンテック社から購入し、その際、各レーンは約２ｍｇのポリ
Ａ＋ＲＮＡを含有していた。

【０２１７】 使用したプローブ プローブ１：新規の脳由来のカリウムチャネル特異性：新規ポリペプチドのＣ
末端テールのコーディング領域に及ぶ配列番号：２の塩基位置１２５７〜１４６
１に相当する プローブ２：“共通”プローブ：ＫｖＱＴ２とＨＮＳＰＣに共通のＣ末端テー
ルの最初の４０アミノ酸をコードする領域に及ぶ配列番号：２の塩基位置９８９
〜１１０９に相当する プローブ１は１ｎｇのＨｕｍａｎ Ｂｒａｉｎ、Ｗｈｏｌｅ Ｍａｒａｔｈｏｎ
Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡを、製造者の推奨に従ってＡｄｖａｎｔａｇｅ^TMＫｌｅｎ
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼミックスを使用して５０ｍｌの反応で増幅させるこ
とで得ることができる。ＤＭＳＯを５％の最終濃度で含んでいた。プライマーの
一組の配列は１８Ｆおよび１９Ｒであった。２０１ｂｐ生成物をゲル分離し、２
６０ｎｍでの吸収によって定量した。アンプリコン５５ｎｇを、アンチセンスｓ
ｓＤＮＡプローブが得られるリバースプライマーを使用するプライマーエクステ
ンションによって標識した。最終反応条件：５０ｍｌ、１×反応バッファーＡ、
５％のＤＭＳＯ、２００ｎＭの１９Ｒ、２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧ
ＴＰ、５ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（フィッシャー）および５０ミリＣｉの ³² Ｐ−ｄＣＴＰ（デュポンＮＥＮ）。反応は９４℃で１分間および７２℃で１分
間でインキュベートし、これを全部で４サイクル反復した。標識した生成物を未
導入の放射活性ヌクレオチドから、製造者の推奨に従ってＰｒｏｂｅＱｕａｎｔ ^TM ／Ｇ−５０マイクロカラム（ファルマシア）を使用して精製した。

【０２１８】 プローブ２は配列番号：２を、製造者の推奨に従ってＡｄｖａｎｔａｇｅ^TMＫ
ｌｅｎ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼミックスを使用して５０ｍｌの反応で得られ
る。プライマーの一組の配列は：５’ＡＧＡＡＧＡＧＧＣＧＧＡＡＣＣＣＧＧＣ
ＡＧＣＡＧ３’（配列番号：２の塩基位置９８９〜１０１２に相当するフォワー
ド）および５’ＧＧＣＡＣＧＧＴＧＡＣＣＧＴＴＣＧＣＴＣＧＴＡＧ３’（配列
番号：２の塩基位置１０８４〜１１０９に相当するリバース）である。反応物を
製造者の推奨に従ってＱＩＡＧＥＮ ＰＣＲ精製キットを使用して精製した。１ ２１ｂｐのアンプリコンをアンチセンスｓｓＤＮＡプライマーが得られるリバー
スプライマーでプライマーエクステンションによって標識した。最終反応条件：
５０ｍｌ、１×反応バッファーＡ、１００ｎｇのアンプリコン、２００ｎＭのリ
バースプライマー、２００ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、５ＵのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（フィッシャー）、および５０ミリＣｉａ³²Ｐ−ｄＣＴＰ （デュポンＮＥＮ）。反応物を９４℃で１分間および７２℃で１分間インキュベ
ートし、これを全部で４サイクル反復した。標識された生成物を未導入の放射活
性ヌクレオチドから、製造者の推奨に従ってＰｒｏｂｅＱｕａｎｔ^TM／Ｇ−５０
マイクロカラム（ファルマシア）を使用して精製した。

【０２１９】 例４ ハイブリダイゼーション 放射活性プローブを使用して、２つの前記の多数の組織ブロット、ホームメイ
ドブロットおよびヒト脳ブロットにハイブリダイズさせた。ブロットを２×ＳＳ
Ｃ中ですすぎ、次いでノーザンＭＡＸ^TMプレハイブリダイゼーション／ハイブリ
ダイゼーション溶液中で４２℃で１時間プレハイブリダイズさせた。次いで溶液
を１〜２×１０⁷ｃｐｍ標識したプローブが添加と同時に取り換え、次いで一晩 ４２℃でハイブリダイズさせた。次いでブロットを（２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤ
Ｓ、５分間、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５分間、０．１×ＳＳＣ／０．５％
ＳＤＳ、３０分間）厳密に３７℃で２回簡単に０．１×ＳＳＣで洗浄した。次い
でブロットを２枚の増感スクリーン（intensifying screen）と一緒に−８０℃ でＢｉｏｍａｘ ＭＳ−１イメージングフィルム（コダック）に２４〜４８時間 暴露した。

【０２２０】 例５ 発現構築物の作成 配列番号：１のｃＤＮＡをＥｃｏＲＩ部位を使用してｐＣＲ^(R)ＩＩ−ＴＯＰ Ｏベクター（前記）から切除し、ｐＣＤＮＡ３のホニュウ類ベクター（インビト
ロゲン）中にサブクローニングした。アフリカツメガエルの卵細胞（Timpe, et
al., Nature, 331:143(1988)）での発現のために、ｃＤＮＡをＥｃｏＲＶおよび
ＨｉｎｄＩＩＩ部位を使用してｐＣＲ^(R)ＩＩ−ＴＯＰＯベクターから切除し、 ｐＫＧＥＭベクター（マルチクローニングサイトをフランキングしてメッセージ
の安定性を増加させるアフリカツメガエルのｂ−グロビン５’および３’ＵＴＲ
を有するプロメガ社の改変ＰＧＥＭベクター）中にサブクローニングした。これ
らの構築物は、標準的なパッチクランプおよび／または卵細胞技術を使用して新
規の脳由来のカリウムチャネルの機能的かつ生物物理的かつ薬理学的プロフィー
ルを得るために使用することができる。新規のニューロン特異性Ｋ⁺チャネルは 、ホニュウ類細胞（例えばＨＥＫ２９３、Ｃｏｓ、ＣＨＯ、ＲＢＬ−１等）中で
一過性または安定トランスフェクション、またはアフリカツメガエルの卵細胞へ
のＲＮＡのマイクロインジェクションによって、標準的なパッチクランプ（Hamm
ill, O. et al., Pfugers Arch. 391:85(1981））または２つの電極の電位クラ ンプ技術（Soreq, H. and Seidman., S. Methods Enzymol., 207:225(1992); Go
ldstein, A., et al., PNAS, 83:7503(1986)）を使用する完全な生物物理的かつ
薬理学的特徴付けのために容易に発現させることができる。

【０２２１】 例６ スクリーニング準備のためのバキュウロウイルス過剰発現 （組み換えバキュウロウイルス発現ベクターの作成ならびにＢＡＣ−ＴＯ−Ｂ
ＡＣ発現システム（ライフテクノロジー、ガイサーズブルク、ＭＤカタログ番号
１０３５９−０１６ ＢＡＣ−ＴＯ−ＢＡＣバキュウロウイルス発現システム） による遺伝子発現） 配列番号：２をｐＦＡＳＴＢＡＣ１中にクローニングし、組み換えプラスミド
をミニ−ａｔｔＴｎ７標的部位を有するバクミド（bacmid）およびヘルパープラ
スミドを有するＤＨ１０ＢＡＣコンピテント細胞に形質転換した。ｐＦＡＳＴＢ
ＡＣ１プラスミド上のミニ−Ｔｎ７エレメントを、ヘルパープラスミドによって
提供されるトランスポジションタンパク質の存在下にバクミド上のミニ−ａｔｔ
Ｔｎ７標的部位にトランスポーズさせる。組み換えバクミドを有するコロニーを
ｌａｃＺα遺伝子の分断によって同定した。高分子量ミニ−プレップＤＮＡを組
み換えバクミドを有する選択されたＥ．ｃｏｌｉクローンから調製し、次いで該
ＤＮＡを使用して昆虫細胞にトランスフェクションさせた。

【０２２２】 ｐＦＡＳＴＢＡＣ１へのクローニング ドナーベクターｐＦＡＳＴＢＡＣ１はポリヘドリンプロモーター、引き続きＢ
ａｍＨＩ（４０３２）からＨｉｎｄＩＩＩ（４１３７）までに広がる広範なＭＣ
Ｓを有している。ＢａｍＨＩ部位はＡＴＴへと突然変異させたポリヘドリン遺伝
子のオリジナルＡＴＧから３７ｂｐ下流である。従って、連続的に外来タンパク
質を発現させるためには、外来ＤＮＡ断片は自己のＡＴＧに引き続きオープンリ
ーディングフレーム（ＯＲＦ）を有さねばならない。外来ＤＮＡ断片はポリヘド
リンプロモーターに関して正しい方向でｐＦＡＳＴＢＡＣ１中にクローニングせ
ねばならない（すなわち、遺伝子の５’末端をＭＣＳの最初に選択された部位に
挿入せねばならない）。

【０２２３】 ｐＦＡＳＴＢＡＣ１および外来ＤＮＡ断片を適当な条件下で選択された制限エ
ンドヌクレアーゼによって５００ｎｇから１μｇのＤＮＡを消化することによっ
て調製した。ベクター中の１つだけの部位をクローニングサイトとして選択する
場合、適当な条件下でベクターを脱リン酸化する。ＤＮＡ断片をアガロースゲル
電気泳動によって精製し、関連の断片をＧＬＡＳＳＭＡＸ^(R)カートリッジを使 用するか、または同様の精製によってゲルから回収することができる。調製した
ベクターとインサート断片を適当な条件下でライゲーションした。

【０２２４】 クローニング 前記の初期のクローニングのために、系においてＤＨ１０ＢＡＣ細胞を使用し
ない。ＤＨ５αもしくはＤＨ１０Ｂコンピテント細胞を使用することができる。
形質転換物の混合物を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢアガープ
レート上にプレーティングする。

【０２２５】 方向性クローニングの分析のためには、スクリーニングのために６つのコロニ
ーで十分であった。非方向性クローニングのストラテジーに関しては１２つ以上
のコロニーが分析のために必要な場合がある。ミニプレップ法（例えばSchecter
, A.l., et al., Nature 312:513(1984)）を使用して一晩の培養からプラスミド
ＤＮＡを得て、制限エンドヌクレアーゼ消化もしくはＰＣＲ分析によって関連の
遺伝子の正しい挿入に変更した。

【０２２６】 トランスポジション １．５０μｇ／ｍｌのカナマイシン、７μｇ／ｍｌの利得タマイシン、１０μｇ
／ｍｌのテトラサイクリン、３００μｇ／ｍｌのＢｌｕｏ−ｇａｌおよび４０μ
ｇ／ｍｌのＩＰＴＧを含有するルリアアガープレートを調製した。配合のための
付加的なプロトコール参照（５．１および５．２部） ２．氷上でＤＨ１０ＢＡＣコンピテント細胞を解凍する、 ３．１００μｌの細胞を１５ｍｌのポリプロピレンチューブに分配する、 ４．約１ｎｇの組み換えドナープラスミド（５μｌ中）を添加し、かつ緩慢にＤ
ＮＡを細胞中にチューブの側面を軽く叩くことによって混合する、 ５．混合物を氷上で３０分間インキュベートする、 ６．４２℃の水浴に４５秒間移すことによって混合物に熱ショックを与える、 ７．混合物を氷上で２分間冷却する、 ８．混合物にＳＯＣ培地９００μｌを添加する、 ９．混合物を振盪インキュベーター中に３７℃で培地を撹拌して４時間入れる、
１０．ＳＯＣ培地を使用して細胞を連続的に１０^-1、１０^-2、１０^-3に希釈する
（すなわち、トランスポジション混合物：９００μｌのＳＯＣ培地＝１０^-1希釈
、これを使用して更に１０倍希釈して１０^-2希釈を得て、同様に１０^-3希釈を得
る）、 １１．各希釈物１００μｌをプレート上に入れ、かつ表面上に均等にのばす、 １２．３７℃で少なくとも２４時間インキュベートする（青色のコロニーが２４
時間前に可視化することはない）。

【０２２７】 組み換えＤＮＡの単離 白色のコロニーは組み換えバクミドを有し、従って組み換えバクミドＤＮＡの
単離のために選択される。ＤＮＡの単離の前に、候補コロニーをストリークし、
これらが本当に白色であることを確認する。

【０２２８】 １．白色のコロニーを約１００〜２００個のコロニーを有するプレートから選択
する、付記：この数は青色と白色のコロニーとの分類を容易にする、 ２．１０個の白色候補をとり、新たなプレートにストリークし、表現型を確認す
る。３７℃で一晩インキュベートする、 ３．Ｂｌｕｏ−ｇａｌおよびＩＰＴＧを含有するプレート上で白色の表現型を有
すると確証された単コロニーから、組み換えバクミドＤＮＡの単離のために液体
培養を準備する。

【０２２９】 以下のプロトコールは大きなプラスミド（＞１００ｋｂ）を単離するために専
用に開発され、バクミドＤＮＡの単離のために適合している。

【０２３０】 １．滅菌つまようじを使用して、単離された細菌の単コロニーを５０μｇ／ｍｌ
のカナマイシン、７μｇ／ｍｌの利得タマイシンおよび１０μｇ／ｍｌのテトラ
サイクリンを補ったＬＢ培地３ｍｌ中に接種する。１５ｍｌのスナップキャップ
のポリプロピレンチューブが適当である。２５０〜３００ｒｐｍで振盪して３７
℃で安定相に増殖させる（１６時間以下）。

【０２３１】 ２．培養１ｍｌを１．５ｍｌのマイクロ遠心分離チューブに移し、１４０００×
ｇで１分間遠心分離する、 ３．陰圧吸引によって上清を除去し、かつ溶液Ｉ［１５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８
．０）、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１００μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡ］０．３ｍｌ中
に各ペレットを再懸濁する。溶液ＩＩ（０．２ＮのＮａＯＨ、１％のＳＤＳ）０
．３ｍｌを添加し、緩慢に混合する。室温で５分間インキュベートする。付記：
懸濁液の外観は非常に混濁から殆ど半透明に変化するはずである。

【０２３２】 ４．３Ｍの酢酸カリウム（ｐＨ５．５）０．３ｍｌをゆっくり添加し、添加中に
緩慢に混合する。タンパク質およびＥ．ｃｏｌｉのゲノムＤＮＡの濃厚な白色沈
殿物が形成する。試料を氷上に５〜１０分間静置する、 ５．１４０００×ｇで１０分間遠心分離する。遠心分離中に、別のマイクロ遠心
分離チューブをラベルし、かつこれに無水イソプロパノール０．８ｍｌを添加す
る、 ６．イソプロパノールを含有するチューブに上清をゆっくり移す。白色の沈殿物
材料を回避する。チューブを数回緩慢に逆さにすることによって混合し、氷上に
５〜１０分間静置する。

【０２３３】 この工程で試料を−２０℃で一晩保管することができる。

【０２３４】 ７．試料を室温で１４０００×ｇで１５分間遠心分離する、 ８．上清を除去し、各チューブに７０％エタノール０．５ｍｌを添加する。数回
チューブを逆さにして、ペレットを洗浄する。室温で１４０００×ｇで５分間遠
心分離する。（場合により工程８を反復する） ９．できるだけ多量の上清を除去する。付記：ペレットはチューブの底から移動
することがあるので、上清を流すよりも上清を慎重に吸引するほうがよい。

【０２３５】 １０．ペレットを５〜１０分間、室温で空気乾燥させ、ＤＮＡを４０μｌのＴＥ
に溶解させる。チューブの底を随時緩慢に軽く叩いて溶液をチューブ内に静置さ
せる。一般にＤＮＡは、ペレットを過剰に乾燥させていない限り１０分以内に使
用することができる、 １１．ＤＮＡを−２０℃で保管する。しかしながら、トランスフェクション効率
が激しく低減するのを避けるために繰り返しの凍結／解凍サイクルを避ける。

【０２３６】 バクミドＤＮＡの調製物を高分子量ＤＮＡの存在を確認するためにアガロース
ゲル電気泳動によって分析する。

【０２３７】 組み換えバクミドＤＮＡによるＳｆ９細胞のトランスフェクション １．最終濃度０．５×でペニシリン／ストレプトマイシン（５０ユニット／ｍｌ
のペニシリン、５０ｕｐ／ｍｌのストレプトマイシン）を含有するＳｆ−９００
ＩＩＳＦＭ２ｍｌ中に９×１０⁵細胞／（６ウェルプレートの）３５ｍｍウェル を播種する。

【０２３８】 ２．細胞を２７℃で少なくとも１時間付着させる、 ３．以下の溶液を１２ｍｍ×７５ｍｍの滅菌チューブ中に調製する、 溶液Ａ；各トランスフェクションのために、ミニプレップバクミドＤＮＡを抗生
物質不含の１００μｌのＳｆ−９００ＩＩＳＦＭ中で５倍以下に希釈する。

【０２３９】 溶液Ｂ；各トランスフェクションのために、セルフェクチン（CELLFECTIN）試薬
を抗生物質不含の１００μｌのＳｆ−９００ＩＩＳＦＭ中で６ｕｌ以下に希釈す
る。

【０２４０】 ４．２つの液体を合し、緩慢に混合し、室温で１５〜４５分間インキュベートす
る、 ５．細胞を抗生物質不含のＳｆ−９００ＩＩＳＦＭ２ｍｌで洗浄する、 ６．各トランスフェクションのために、Ｓｆ−９００ＩＩＳＦＭ０．８ｍｌを、
液体ＤＮＡ複合体を含有する各チューブに添加する。緩慢に混合する。洗浄媒体
を細胞から吸引し、細胞上に希釈した液体ＤＮＡ複合体１ｍｌを入れる、 ７．細胞を２７℃のインキュベーター中で５時間インキュベートする、 ８．トランスフェクション混合物を除去し、かつ抗生物質を含有するＳｆ−９０
０ＩＩＳＦＭ２ｍｌを添加する。細胞を２７℃のインキュベーター中で４８時間
インキュベートする、 ９．トランスフェクションの開始４８〜７２時間後にタンパク質活性に関して細
胞をアッセイし；ウイルスを７２時間で採収する。

【０２４１】 組み換えバキュウロウイルスの採収／保存 １．トランスフェクション物からウイルスを採収する際に、上清（２ｍｌ）を滅
菌の、蓋付チューブに移す。５００×ｇで５分間遠心分離することによって澄明
にし、かつウイルス含有上清を新しいチューブに移す、 ２．初期のトランスフェクションから、ウイルス価２×１０⁷〜４×１０⁷ｐｆｕ
／ｍｌが予想されうる、 ３．暗所でウイルスを４℃で保存する。ウイルスの長期の保存のために、胎児の
ウシ血清（ＦＢＳ）を最終濃度少なくとも２％のＦＢＳに添加することが推奨さ
れる。またアリコートのウイルスストックの−７０℃での保存も推奨される、 ４．ウイルス価の決定のために、プラークアッセイを実施できる。プラーキング
（plaquing）法に関してはセクション５．１２のウイルスプラークアッセイ参照
、 ５．ウイルスストックを増幅させるために、懸濁培養または単層培養を感染多重
度（ＭＯＩ）０．０１〜０．１で感染させる。以下の式を使用する： 必要な接種量（ｍｌ）：所望のＭＯＩ（ｐｆｕ／ｍｌ）×（全細胞数） ウイルス接種物のウイルス価（ｐｆｕ／ｍｌ） 例えば、２×１０⁶細胞／ｍｌの培養５０ｍｌにＭＯＩ０．１のために２×１ ０⁷ｐｆｕ／ｍｌであるウイルスストック０．５ｍｌを感染させる。

【０２４２】 感染４８時間後にウイルスを採収する。これにより約１００倍のウイルスの増
幅が得られる。

【０２４３】 昆虫細胞への組み換えバキュウロウイルス粒子の感染 昆虫細胞のための最適感染条件を変化させることができる。感染の開始時点は
ＭＯＩは５〜１０である。より多くの情報に関しては、文献２を参照してくださ
い。発現させるべき各タンパク質に関して幾つかの実験を実施することが推奨さ
れる。

【０２４４】 ＭＯＩの最適化：細胞ポピュレーションを種々のＭＯＩ（例えば１、２、５、
１０）で感染させ、かつ細胞（または、タンパク質が分泌されているのであれば
培地）の採収後にタンパク質発現をアッセイする、 時間コース：細胞を一定のＭＯＩで感染させる。細胞（または培地）を以下の
時間間隔で採集する：２４時間、４８時間、７２時間および９６時間。発現に関
してアッセイする。

【０２４５】 トランスフェクションのための細胞の調製 １．トランスフェクションをする２４時間前に、６０ｍｍの組織培養皿に４×１
０⁵〜１１×１０⁵の対数増殖細胞を接種する。細胞はトランスフェクション時に
６０〜８０％の集密度を有するべきである、 ２．細胞を適当な培養培地５ｍｌ中で一晩増殖させる。

【０２４６】 複合体形成溶液の調製 １．滅菌の血清不含の抗生物質不含のＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ−ＳＡ）９００μｌを
ポリスチレンチューブに移す、 ２．リポタクシー（LipoTAXI）トランスフェクション試薬３５〜１００μｌを添
加する。チューブの側面を軽く叩いて混合する、 ３．対照プラスミド７μｇを対照反応に添加し、試験ＤＮＡ５〜１０μｇを試験
反応に添加する。安定トランスフェクションのために、ネガティブコントロール
を作成する、 ４．緩慢に撹拌し（ボルテックス禁止）、室温で１５〜３０分間インキュベート
する。

【０２４７】 活性化溶液の添加 １．標準培養培地を組織培養皿から吸引によって除去する、 ２．ＤＭＥＭ（血清は任意）１．５ｍｌをポリスチレンチューブ中のトランスフ
ェクション混合物に添加し、次いでこの全混合物（〜２．５ｍｌ）を組織培養皿
に、皿を渦動させながら滴下して移す、 ３．標準増殖条件（すなわち加湿インキュベーター中３７℃および５％ＣＯ₂） を使用して４〜６時間インキュベートする、 ４．通常の血清濃度の２倍の血清（ＤＭＥＭ＋Ｓ）を含有するＤＭＥＭ２．５ｍ
ｌを組織培養皿に添加し、かつ一晩インキュベートする、 ５．培地を新しい完全培地５．０ｍｌと取り換える、 ６．細胞型、リポーターシステムおよびプロモーター活性に依存して２４時間〜
７２時間インキュベートするか、または安定トランスフェクションの実施を進行
する。

【０２４８】 安定トランスフェクションの実施 １．活性溶液を添加している工程６からの細胞を所望の比（少なくとも１：１０
）で２４時間のインキュベート後に分配し、次いで一晩インキュベートする、 ２．選択抗生物質を組織培養皿に滴下して、その滴下の間隔に皿を渦動させて、
細胞系列に適当な濃度で適用する、 ３．培地を毎４〜７日に取り換え、かつ新たな選択抗生物質を適用する（だいた
い１週間に２回）、 ４．１〜２週間以内に安定コロニーが形成する。ネガティブＤＮＡコントロール
皿からの細胞は全滅した。

【０２４９】 リポタクシーホニュウ類トランスフェクションキットを使用する懸濁細胞のトラ
ンスフェクション トランスフェクションのための細胞の調製 １．６０ｍｍ皿あたり４×１０⁶〜１０×１０⁶細胞を、ＤＭＥＭ−ＳＡ７００μ
ｌ中に播種する。付記：リポタクシートランスフェクション試薬とＤＮＡとの最
適な比は各プラスミドおよび細胞系列に関して決定しなければならない。

【０２５０】 複合体形成溶液の調製 １．ＤＭＥＭ−ＳＡ９００μｌをポリスチレンチューブに移す、 ２．リポタクシートランスフェクション試薬３５〜１００μｌを添加する。チュ
ーブの側面を軽く叩いて混合する、 ３．対照プラスミド１０μｇを対照反応物に添加し、かつ試験ＤＮＡ７〜１５μ
ｇを試験反応物に添加する。安定トランスフェクションのためには、ネガティブ
コントロールを作成する、 ４．緩慢に混合し（ボルテックス禁止）、かつ室温で１５〜３０分間インキュベ
ートする。

【０２５１】 活性化した溶液の添加 １．ＤＭＥＭ（血清は任意）８００μｌをポリスチレンチューブ中のトランスフ
ェクション混合物に添加し、次いでこの全混合物（〜１．８ｍｌ）を組織培養皿
に滴下し、その間に皿は渦動させる、 ２．標準増殖条件（すなわち加湿インキュベーター中３７℃および５％ＣＯ₂） を使用して４〜６時間インキュベートする、 ３．新たな完全ＤＭＥＭ３ｍｌを組織培養皿に添加する、 ４．細胞型、リポーターシステムおよびプロモーター活性に依存して細胞を２４
〜７２時間インキュベートするか、または安定トランスフェクションを実施する
場合は工程１０に進む。

【０２５２】 安定トランスフェクションの実施 １．４８時間後に、選択のために使用されるべき新たな組織培養皿に工程９から
のトランスフェクトされた細胞密度の１／３以下で播種する、 ２．選択抗生物質を組織培養皿に滴下し、滴下の間隔で皿を渦動させ、細胞系列
に適当な濃度で適用する、 ３．毎４〜７日に培地を取り換え、かつ新たな選択抗生物質を適用する（だいた
い１週間に２回）、 ４．１〜２週間以内に安定コロニーが形成する。ネガティブＤＮＡコントロール
皿からの細胞は全滅する。

【０２５３】 トランスフェクションされた懸濁細胞の採収 １．トランスフェクションさせた細胞を１５ｍｌの遠心分離チューブに移し、２
００×ｇで５分間回転させて細胞を沈殿させる、 ２．上清を除去して廃棄し、ＰＢＳ１ｍｌを細胞ペレットに添加し、かつ得られ
た細胞懸濁液を１．７ｍｌのマイクロ遠心分離チューブに移す、 ３．２００×ｇで５分間、マイクロ遠心分離機中でチューブを回転させ、細胞を
沈殿させる、 ４．上清を除去して廃棄し、リシスバッファー１ｍｌを細胞ペレットに添加し、
かつ凍結するまで−２０℃に置く、 ５．細胞抽出物を解凍し、かつ１２０００×ｇで５分間、マイクロ遠心分離機中
でチューブを回転させて細胞破片を沈殿させる、 ６．上清をマイクロ遠心分離チューブに移し、かつ−２０℃で保管するか、また
はβ−ガラクトシダーゼアッセイに進める。

【０２５４】 例７ ＣａＰＯ₄トランスフェクションプロトコール 以下のプロトコールは１００ｍｍ培養皿のために最適化したものであり、全容
量はシングルトランスフェクションのためである。

【０２５５】 １．１００ｍｍの培養皿に対数増殖細胞を、トランスフェクションの２４時間以
内に５×１０⁵細胞／皿で接種する。これらの細胞は適当な培地１０ｍｌ中で一 晩に約１０〜２０％の集密度に増殖すべきである。ＲＰＭＩ系の培地をＣａＰＯ ₄ トランスフェクションのために使用できない。前記の培地における過剰な正電 荷は濃密な沈殿物の形成を惹起する。

【０２５６】 ＤＮＡ沈殿溶液の調製（１００ｍｍ培養皿あたり） 付記：ＤＮＡの最適量は、トランスフェクションされる細胞型に依存して変化す
る。対照プラスミドｐＷＬｎｅｏ（ライフテクノロジー、ガイサーズブルク、Ｍ
Ｄ）に関しては、１０μｇ／皿（環状ＤＮＡ１０〜３０μｇ／皿が殆どの場合に
推奨される）、 ２．所望の量のＤＮＡを蒸留した脱イオン水で４５０μｌに希釈する、 ３．混合物を室温で１０〜２０分間インキュベートさせる、 ４．十分な懸濁液を保証するために、溶液を緩慢に混合する。これを培養に滴加
し、かつプレートを緩慢に渦動させて均等に分布させる、 ５．細胞を１２〜２４時間インキュベートする。細胞型に依存して、最適なイン
キュベーション時間を変化させてよい。インキュベーション後に微細な沈殿物が
見いだされる、 付記：余分なインキュベーター空間を使用できるならば、トランスフェクション
効率をより低いＣＯ₂濃度（２〜４％ＣＯ₂）を使用して２〜３倍に改善すること
ができる。

【０２５７】 以下の工程（工程６）での沈殿の分離後に正常なＣＯ₂濃度に戻す。

【０２５８】 ６．１２〜２４時間のインキュベート後に、培地を除去し、ＰＢＳ（Ｃａもしく
はＭｇ不含）または血清不含の培地を使用して培養を２回すすぐ。新たな完全培
地（血清を含有する）を適用し、細胞を、細胞系列に最適なＣＯ₂濃度下に２４ 時間インキュベートする、 ７．細胞を所望の比（少なくとも１：１０）で分配し、かつ２４時間更にインキ
ュベートし、次いで安定トランスフェクタントの選択を適用する。

【０２５９】 例８ ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションプロトコール 以下のプロトコールは１００ｍｍの培養皿のために最適化されたものであり、
全容量はシングルトランスフェクションのためである。対照プラスミドｐＳＶ２
Ｃａｔ（ライフテクノロジー、ガイサーズブルク、ＭＤ）のためには、２μｇ／
１００ｍｍ皿を使用する。

【０２６０】 ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション（１００ｍｍの培養皿あたり） １．対数増殖細胞は７２時間以内に１００％の集密度が得られる密度で播種され
るべきである。トランスフェクションは播種の６〜２４時間後に実施すべきであ
る、 ２．ＤＮＡ（１〜２μｇ／１００ｍｍ皿）と燐酸緩衝した生理食塩水（１×ＰＢ
Ｓ）と混合して、最終容量１７０μｌにする、 ３．溶液＃３を１×ＰＢＳ８５μｌで希釈する、 ４．ＰＢＳ−ＤＮＡ混合物と溶液＃３−ＰＢＳ混合物とを合する、 ５．培養から培地を除去し、ＰＢＳで２回すすぐ、 ６．ＤＮＡ混合物（工程４から）を培養の中心に滴加し、緩慢に渦動させて溶液
を均等に分布させる。ＣＯ₂無しで、室温（〜２５℃）で１５分間インキュベー トする、 ７．溶液を除去し、培養をＰＢＳで緩慢にすすぐ（細胞はこの時点では殆ど付着
しない）、 ８．新たな完全培地１０ｍｌを培養に添加し、最適な培養条件下で増殖させる。

【０２６１】 選択 Ｇ４１８抗生物質選択法を使用する場合、全てのホニュウ類細胞系列は等しく
Ｇ４１８に感受性でないことを考慮する必要がある。最低の致死濃度は１００μ
ｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌであってよい。従って、選択のために使用すべき濃度は
、試験の開始前に各細胞系列に関して決定しなければならない。

【０２６２】 多くの細胞系列は既にこの種の選択が実施されているので、利用できる文献を
調べることが有用な場合もある。特定の細胞系列の感受性についての情報が得ら
れない場合には、その感受性を決定する簡単な方法は、個々のウェルにわたりＧ
４１８の濃度範囲を有するマルチウェルプレート中で培養を増殖させることであ
る。最適な濃度は１０〜１４日以内に全ての細胞を殺傷する最も低い濃度である
（迅速に分裂する細胞はより容易に殺傷できる。それというのも抗生物質は主に
分裂している細胞に作用すると思われるからである）。

【０２６３】 幾つかの場合において、初期の選択後にＧ４１８の濃度を低下させ、選択可能
なマーカー遺伝子を維持することが可能なことがある。例えばＮＩＨ３Ｔ３細胞
は一般に４００μｇ／ｍｌのＧ４１８で選択され、ｎｅｏ^r遺伝子の存在を２５ ０μｇ／ｍｌで維持することができる。

【０２６４】 クローン単離 選択プロセスをコロニーが可視化される所まで進行させた後に、最高細胞数の
細胞が得られるようにコロニーを単離し（クローンが生存する見込みが向上する
）、かつ１つのコロニーを別のコロニーからの細胞で汚染して変換するのを最小
化することは重要である。前記の両者の目的を達成する補助のために、コロニー
の単離時にクローニングリング（cloning ring）を使用することが推奨されてい
る。該リングは任意のオートクレーブ可能な材料からできており、内径５〜１０
ｍｍを有する。これらを媒体鉗子（medium forceps）および幾つかの形の接着剤
と１対で一緒に滅菌する（真空グリース(vacuum grease）はより良好にはたらく
）。

【０２６５】 コロニーの単離の前に、２４ウェルのマイクロタイター皿を準備し、新しいコ
ロニーを受容させる。新しいコロニーのために使用される容量は最小に保つべき
である。それというのも多くの型の細胞が培養における増殖のために幾つかの型
の他の細胞のサポートを必要としていると思われるからである。このサポートは
、希釈しすぎると無効になることがある幾つかの種類の可溶性の増殖因子を含む
。細胞増殖が最初に非常に乏しい場合において（皿表面の５％未満）、通常より
も高い濃度で増殖因子を添加することがしばしば有用である。

【０２６６】 付記：例えば細胞型が通常の培養条件下で１０％の胎児の仔ウシ血清を供給し
た培地でよりよく増殖する場合、細胞を非常に低い密度で播種した際によく増殖
させるために２０％の胎児仔ウシ血清を必要とすることがある。またより密に生
息した培養から培地を除去し、かつ濾過滅菌後に、それを使用して散在する培養
の増殖培地を補うのも有用なことがある。

【０２６７】 クローニングリングを使用して単コロニーを単離するために、コロニーを含有
する培養をＰＢＳ中で２回洗浄し、次いで全ての液体をプレートから除去するべ
きである。該リングは滅菌鉗子を使用してのみ取り扱うべきである。

【０２６８】 １．リングを滅菌接着剤中に浸し、かつ乾燥した滅菌表面に対して軽く叩き、接
着剤を外部のエッジの周りに均等にのばす、 ２．リングを採収すべきコロニーの周りにあてる（乾燥を避けるために迅速に作
業する）、 ３．４〜５滴のトリプシンを各リングに滅菌した綿栓したパスツールピペットを
使用して添加する、 ４．１コロニーあたり〜３０秒間待ち、次いでトリプシンを２〜３回上下にピペ
ッティングすることによってコロニーを破壊する、 ５．トリプシン処理した細胞を２４ウェルのプレートに移す、 ６．幾らかの培地を２４ウェルプレートから除去し、リングの内部をすすいで、
全ての残余細胞を除去し、かつ皿に移す、 ７．２時間までの間に、プレートを顕微鏡で検査し、細胞が付着したかを決定す
る。これらが付着したら、２４ウェル中の培地を新たな完全培地と取り換えて、
全ての残留トリプシンを除去する。

【０２６９】 新しいクローン増殖の初期の段階の間には、時々培地を替えることが最もよく
（非常に散在する培養に関しては１週間に約１回）、このことは任意の可溶性因
子の維持に有利である。古い培地と、新たな増殖因子を含有する培地とを取り換
える代わりに培地に外因性の増殖因子を添加することも最善である。

【０２７０】 小さい培養が密に増殖したら、これらを大きな培養容器（通常最初は６ウェル
のマイクロタイタープレート）に移し、幾つかの型の他の細胞として同様に処理
してよい（初めての選択は新たなクローンの生存を全体を通して維持すべきであ
る）。

【０２７１】 例９ スクリーニング化合物のためのトランスフェクトしたＨＥＫ細胞の膜調製 膜は、Ｔ−１５０（またはＴ−１７５もしくはＴ−２２５）フラスコのそれぞ
れ中のＨＥＫ細胞が集密である時に調製する。

【０２７２】 細胞の各フラスコからの膜調製は以下のようにする： １．細胞培養培地を流出させ、かつ保存しておく（それというのも常にフラスコ
の取り扱いによって流出してしまった幾らかの細胞を含んでいるので）、 ２．細胞の集密層を約８ｍｌの燐酸緩衝した生理食塩水（ＰＢＳ）で３７℃です
すぐ。これによって工程３で使用されるトリプシンを阻害することがある残留し
ている胎児の仔ウシ血清が除去される。すすいだＰＢＳもまた保存しておき、流
出した全ての他の細胞を捕捉する、 ３．約５ｍｌのトリプシン−ＥＤＴＡを３７℃で添加する。該フラスコをまた閉
じ、細胞の全層にわたりトリプシン洗浄させた。約３０秒で幾らかの細胞が浮遊
し、ラボベンチ上でフラスコを強く叩いて残留細胞を流出させる。新たな培地を
素早くフラスコに添加してトリプシン反応を／停止する。各５ｍｌのトリプシン
に対して約１０ｍｌの培地を添加する。トリプシン／細胞／培地を遠心分離チュ
ーブ中でピペッティングする。フラスコを約５ｍｌより大の培地ですすぎ、かつ
他のチューブと混合する、 ４．細胞を２５０×ｇで８分間の回転によって洗浄する。個々の細胞ペレットを
少量のアッセイバッファー中に再懸濁し、これらを１つのチューブに合する、 ５．ポリトロン（Polytron）を使用して２５秒間１３０００ＲＰＭで均質化する
、 ６．低速回転：８００ＲＰＭ（〜１００×ｇ）２分間；上清を取っておき、ペレ
ットを廃棄する、 ７．高速回転：上清を高速チューブに移し、かつ２００００ＲＰＭ（５００００
×ｇ）で１０分間回転させる。上清を廃棄し、ペレットの上にアッセイバッファ
ー１ｍｌを添加する、 ８．ドライアイス上で凍結させ、チューブの蓋を閉め、かつ−８０℃で保存する
。膜を５０ｕｇ／ｍｌに希釈し、かつ各ウェルにおいて２．５ｕｇ使用する（５
０ｕｇ／ｍｌの５０ｕｌ）。

【０２７３】 例１０ トランスフェクションしたＨＥＫ細胞からの膜における放射線標識したリガンド
の競合結合 ９６ウェルのマイクロタイタープレートの方法；ＧＦ／Ｃフィルターでの濾過に
よる結合および遊離の分離 この例で使用される放射線標識リガンドは限定されないが、塩化テトラエチル
アンモニウム（ＴＥＡ）、４−アミノピリジン（４−ＡＰならびに２−ＡＰおよ
び３−ＡＰ）、３，４−ジアミノピリジンおよび２，３−ジアミノピリジン、Ｂ
ａＣｌ₂、ＣｓＣｌ、ストリキニン、フェンシクリジン、ピリドスチグミン、９ −アミノアクリジン、ＤｕＰ−９９６（３，３−ビス（４−ピリジニルメチル）
−１−フェニルインドリン−２−オン；リノピリジン）、クロフィリウム、キニ
ジン、アミノキノリンおよびキニンを含む。

【０２７４】 アッセイバッファー： 洗浄バッファー ５ｍＭのＮａＣｌ ２００ｍＭのＮａＣｌ ５ｍＭのＫＣｌ ２０ｍＭのＨＥＰＥＳ １０ｍＭのＨＥＰＥＳ トリス塩基でｐＨ８．０する ６ｍＭのグルコース トリス塩基でｐＨ８．４にする。

【０２７５】 膜：トランスフェクションさせたＨＥＫ細胞膜 アッセイにおいてウェルあたり２．５ｕｇのタンパク質を使用する。

【０２７６】 その他：９６ウェルのマイクロタイタープレート、ファルコン、丸底、組織培養
処理していない ９６ウェルのユニフィルター（Unifilter）、ＧＦ／Ｃ、パッカードインストゥ ルメントＣｏ マイクロシント（Microsint）−２０シンチレーション発光体、パッカード トップカウントシンチレーション計数器、パッカード ポリエチレンイミン、０．６％、ユニフィルターの浸漬のため 放射線標識されたリガンド、例えばＴＥＡ、２２００Ｃｉ／ミリモル １０ｎＭのコールドリガンド（cold ligand）（例えばＴＥＡ）で定義される非 特異的結合 アッセイ：１３０ｕｌのアッセイバッファー ２０ｕｌの試験化合物または対照または非特異 ５０ｕｇ／ｍｌの膜５０ｕｌ（各ウェルに添加されるタンパク質２．５ｕｇ） ５０ｕｌの放射性リガンド［最終］２５ｐＭ 全容量２５０ｕｌ アッセイ法： ９６ウェルプレートの１ウェルあたり１３０ｕｌを入れる、 候補化合物（薬剤）または対照溶液（更にバッファーまたは試験化合物希釈物
）、または非特異的（コールドリガンド１０ｎＭで定義した）を２０ｕｌ添加す
る、 事前に調製した膜をアッセイプレートに添加し、膜をプレインキュベートし、
バッファー、試験化合物等を添加し、２１℃で５分間タイター−テックプレート
ミキサー（Titer-Tek plate mixer）上で混合する、 ５０ｕｌの放射性リガンドを［最終］２５ｐＭで添加し、２１℃で２０分間イ
ンキュベートし、プレートミキサー上で混合する、 結合した放射性リガンドを遊離リガンドから、事前に浸漬させたＧＦ／Ｃユニ
フィルターでの濾過によって分離し、氷冷した洗浄バッファーを使用して２回急
速に洗浄する、 ユニフィルターを一晩乾燥させる、 乾燥したら、２５ｕｌのマイクロシント−２０をユニフィルターに添加し、ト
ップカウント（TopCount）（パッカード）シンチレーション計数器中で計数する
。

【０２７７】 例１１ 放射性リガンド結合アッセイ この例で使用される放射性リガンドは限定されないが、塩化テトラエチルアン
モニウム（ＴＥＡ）、４−アミノピリジン（４−ＡＰならびに２−ＡＰおよび３
−ＡＰ）、３，４−ジアミノピリジンおよび２，３−ジアミノピリジン、ＢａＣ
ｌ₂、ＣｓＣｌ、ストリキニン、フェンシクリジン、ピリドスチグミン、９−ア ミノアクリジン、ＤｕＰ−９９６（３，３−ビス（４−ピリジニルメチル）−１
−フェニルインドリン−２−オン；リノピリジン）、クロフィリウム、キニジン
、アミノキノリンおよびキニンを含む。

【０２７８】 ニューロン（培養（およびトランスフェクションおよび形質転換）のために市
販されている）（ならびにヒトの分裂終了ＣＮＳ細胞、例えばストラタジーン社
，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を放射性リガンド（〜１−２×１０³Ｃｉ／ミリモル
）と一緒に１２×７５ｍｍのポリスチレンチューブ中でインキュベートする。特
に記載がない限り、細胞を１０ｍＭのＮａＨｅｐｅｓ、５ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭ
のＮａＣｌおよび６ｍＭのグルコースを含有する等張性スクロース培地ｐＨ８．
４（培地Ｉ）中に懸濁し、回転振盪器上で室温で放射性リガンドと一緒に１時間
インキュベートする。非特異的結合を１０ｎＭの天然のコールド放射性リガンド
の存在下に決定する。ストックの細胞懸濁液を希釈することによって、４００μ
ｌの全容量中の最終細胞濃度２．５×１０⁵細胞／ｍｌが得られる。インキュベ ーションの完了時に、試料を４ｍｌの氷冷急冷溶液（Quench solution）で希釈 し、これは２００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ（遊離酸）を含有し、
これはトリス塩基で滴定されてｐＨ８．０である。急冷した試料をＧＦ／Ｃガラ
スマイクロファイバーフィルターを通して濾過し、その際、該膜はポリエチレン
イミン０．６％中で事前に浸漬されており、かつ氷冷溶液で２回洗浄されている
。三通りの試料を各試験ポイントのために使用する。平均の標準偏差は典型的に
５％未満である。異なる細胞調製物はある程度異なる非特異／全放射性リガンド
結合の比が生じてもよい。放射性リガンドのストック溶液を１００ｍＭのＮａＣ
ｌ、２０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．４）、０．１％のウシ血清アルブミン中で
調製する。

【０２７９】 データの分析−飽和試験からのデータにスカッチャード（Scatchard）分析を 実施し、かつ線形回帰を実施して、平衡解離定数（Ｋ₄）および最大受容体濃度 （Ｂ_max）を得る。これらの決定のための相関係数は典型的に０．９５より大き い。競合試験からのデータをチャンおよびプルゾフの標準的方法によって分析し
て、Ｋ_i値を決定する。解離速度定数（ｋ₁）をリガンド解離対時間の１次プロッ
トから直接決定する。リガンド解離速度（ｋ₁）を式：ｋ₁＝ｋ_obe（［ＬＲ］_e／
（［Ｌ］［ＬＲ］_max））から決定し、その際式中［Ｌ］はリガンドの濃度であ り、［ＬＲ］_eは平衡時の複合体の濃度であり、［ＬＲ］_maxは存在する受容体の
最大数であり、ｋ_obeは時間に対する擬似１次プロットｌｎ（［ＬＲ］_e／｛［Ｌ
］_e−［ＬＲ］_t｝］の傾斜である。また放射性リガンドの会合速度および解離速
度を種々のリガンド濃度で結合する放射線標識物のキネティックの測定、これら
のデータの片対数表現からのリガンドの各濃度におけるｋ_obeの測定ならびにｋ_{o be} 対リガンド濃度のプロットの傾斜およびｙ交点のそれぞれからのｋ₁およびｋ_{- 1} の測定によって決定する。

【０２８０】 放射性リガンド結合アッセイをドイチュ他（Deutsch, C., et al., J. of Bio
logical Chemistry, 266: No.6, 3668-3674(1991)）によって実質的に記載され るように本発明で使用してよい。

【０２８１】 例１２⁸⁶ Ｒｂ流出薬剤スクリーニングアッセイ（⁸⁶Rb efflux Drug Screening Assay） 高濃度の細胞外カリウムイオンによるヒト神経芽細胞腫の脱分極は電位依存性
カリウムチャネルの活性化を惹起する。かかるカリウムチャネルの活性は、脱分
極刺激に応じて予備負荷された標的細胞からの⁸⁶Ｒｂの流出を追跡することによ
って効率的かつ迅速にモニターされることが証明されている。アッセイ媒体中で
未知の活性を有する化合物を含有することは本明細書に記載のカリウムチャネル
の新規の遮断薬の同定をもたらす（Toral, J., et al., 電位依存性カリウムチ ャネル遮断薬の迅速な発見における培養されたヒト神経芽細胞腫の使用, J. Pha
rm. Pharmacol., 46: 731(1994)）。候補化合物による個々のＫ⁺チャネルの遮断
は該アッセイによって容易に検出できる⁸⁶Ｒｂ流出の重大な低下をもたらす。ト
ラル他（Toral, J., et al）は該アッセイを連続的に使用して、ニューロンおよ
び心細胞（cardiocyte）における電位依存性カリウムチャネルの遮断を可能にす
る複数の新規の化学構造を発見した。前記化合物のカリウムチャネル遮断活性は
、電気生理学的技術ならびにクローニングしたニューロンの電位依存性カリウム
チャネルをトランスフェクションした培養されたホニュウ類細胞から⁸⁶Ｒｂ流出
によって検査されている。

【０２８２】 機能的な高容量⁸⁶Ｒｂ流出アッセイは９６ウェルのマイクロタイタープレート
中で実施され、これはカリウムチャネル遮断薬の検出および同定のための迅速か
つ高容量の１次スクリーニング法である。適用は培養されたヒト神経芽細胞腫細
胞におけるカリウムチャネルの遮断薬の検出のために記載されている（Toral, J
., et al., 電位依存性カリウムチャネル遮断薬の迅速な発見における培養され たヒト神経芽細胞腫の使用, J. Pharm. Pharmacol., 46: 731(1994)）。

【０２８３】 ニューロンの表現型に対する分化のための高度に精製されたヒトＮＴ２ニュー
ロン細胞ならびにｈＮＴ中枢神経系分裂終了細胞は、カリウムチャネル遺伝子の
研究を可能にするトランスフェクションならびに本明細書に記載されるアッセイ
のために、ストラタジーン（STRATAGENE, La Jolla, CA）から入手される。

【０２８４】 バッファーおよび試薬 バッファー ＭＯＰＳ−ＰＳＳ、ｐＨ７．４（ＮａＣｌ １２０ｍＭ；ＫＣｌ ７．０ｍＭ；Ｃ
ａＣｌ₂ ２．０ｍＭ；ＭｇＣｌ₂ １．０ｍＭ；ウアバイン １０μＭ；４−モル ホリンプロパンスルホン酸、ＭＯＰＳ ２０ｍＭ） 脱分極溶液 ＮａＣｌの相当濃度を取り換えたＫＣｌ（８０ｍＭ）を含有するＭＯＰＳ−ＰＳ
Ｓ 候補化合物をＭＯＰＳ−ＰＳＳまたはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のい
ずれか中の１０〜１００ｍＭのストック濃度で溶解させ、引き続きインキュベー
ションバッファー中に所望の濃度に希釈する。候補化合物をウシ血清アルブミン
（０．１＠ｗ／ｖ）を含有するＭＯＰＳ−ＰＳＳ中に５０〜５００μＭのストッ
ク濃度で溶解させる。

【０２８５】 細胞培養および⁸⁶Ｒｂ負荷 ヒト神経芽細胞腫細胞ＴＥ６７１をアメリカンタイプカルチャーコレクション
（ＨＴＢ１３９）から得て、１０％の胎児のウシ血清、４．５ｇＬ^-1のグルコー
スおよび２．０ｍＭのＬ−グルタミンを補ったダルベッコ変性イーグル培地中に
３７℃で保持する。細胞をダニエル他（Daniel, S., et al., J. Pharmacol. Me
thods, 25:185(1991)）によって記載されるように９６マイクロタイタープレー ト中でプレーティングして、かつ⁸⁶Ｒｂを負荷する。

【０２８６】⁸⁶ Ｒｂ流出アッセイ手順 マイクロタイタープレート中の増殖培地を、プレートを素早く払うことによっ
て廃棄する。付着細胞層を１２路のピペッターを使用してＭＯＰＳ−ＰＳＳ２０
０μＬで３回洗浄する。細胞を、候補化合物カリウムチャネル遮断薬の存在また
は不在下に２００μＬのＭＯＰＳ−ＰＳＳまたは２０μＬの脱分極溶液で室温で
３０分間インキュベートする。各ウェルからの上清（１５０μＬ）を除去し、計
数する。細胞層を２００μＬの０．１％のＴｗｅｅｎ２０中に溶解させ、１５０
μＬをパッカード２２００ＣＡ液体シンチレーション計数器中で計数する。全て
の上清は７．０ｍＬの蒸留水中でカウントする。

【０２８７】 パーセント流出は以下のように算出される： ％全流出＝（上清中の１分間あたりのカウント） （上清中の１分間あたりのカウント＋細胞抽出物中の１分間あたりのカウント）
×１００ かつパーセント正味流出の値は以下のように算出される： ％正味流出＝％全流出−％基礎流出（basal efflux） ［式中、％全流出は１００ｍＭのＫＣｌを含有する脱分極溶液によって誘導され
るものであり、基礎流出は生理食塩水、ＭＯＰＳ−ＰＳＳ中で観察される⁸⁶Ｒｂ
の流出（漏れ）である］。

【０２８８】 例１３ ＦＬＩＰＲ^TM光学的スクリーニングシステム モレキュラーデバイスコーポレーション、サンニヴァーレ、ＣＡ ＦＬＩＰＲ（蛍光イメージングプレートリーダー）をまず９６ウェルのマイク
ロタイタープレート中で細胞の膜電位を測定するための大容量スクリーニングツ
ールとして実施されるようにデザインした。ＦＬＩＰＲを、例えば特定の細胞内
イオンおよび細胞内ｐＨの測定において蛍光アッセイに応用する。

【０２８９】 蛍光方式で、ＦＬＩＰＲは９６ウェルのマイクロタイタープレートの底部の発
光ならびに冷却したＣＣＤカメラを使用する全９６ウェルからの蛍光を同時に測
定することによって作業する。ＦＬＩＰＲにおける励起光学素子はプレートを底
部から発光させ、放射光学素子は底部からプレートを読む。このことは機械中で
光学的に測定されるマイクロプレートは透明な底部を有することを必要とする。

【０２９０】 典型的な測定アッセイは細胞を有する１つの９６ウェルプレートおよびスクリ
ーニングすべき候補化合物を有する１つ（または２つ）の９６ウェルプレートを
使用することからなる。

【０２９１】 ＦＬＩＰＲの検出光学素子は冷却したＣＣＤ（電荷結合デバイス）技術を基礎
としている。各キネティックの更新に応じて、該システムは、全ての個々のウェ
ルに関するシグナルを同時に記録するマイクロプレートの底部の写真を撮る。細
胞ベースのアッセイのための感受性の増強は光学的検出を介して達成され、これ
は細胞単層におけるシグナル単離を見込んでいる。この技術はバックグラウンド
蛍光が存在する（例えば細胞外色素からの）アッセイのために非常に重要である
。ＦＬＩＰＲを効率的なスクリーニングツールにするために、該機器は吸引でき
、かつ２つの別々の液体添加マイクロプレートから、光学的に試験される第３の
マイクロプレート中に分配できる正確な９６ウェルピペッターを含んでいる。全
システムはＰＣおよびウインドウズベースのソフトウェアインターフェースを介
してコントロールされている。該インターフェースはアッセイ開発、品質コント
ロールおよびデータマネージメントのためのフレキシブルなツールを提供してい
る。

【０２９２】 測定は、ＣＨＯ、ＨＥＫ、Ａ１０、ＥＣＶ５０、１次培養したニューロン細胞
およびその他を含む多数の種々の細胞系列における、電位依存性およびリガンド
依存性の両者に関して記録している。

【０２９３】

【表２】

【０２９４】 色素負荷する細胞に必要な成分 ２５０ｍＭのプロベネシド その都度新たに調製する ７１０ｍｇのプロベネシド ５ｍｌのハンクス＋２０ｍＭのＨｅｐｅｓ中に溶解させた５ｍｌの１．０ＮのＮ
ａＯＨ １ｍＭの色素 分子プローブＦｌｕｏ３、ＡＭ Ｆ−１２４１ カルシウムグリーン１、ＡＭ Ｃ−３０１１ １ｍｇのＦｌｕｏ３、ＡＭまたはＣａ−グリーン１、ＡＭ ４４３μｌのＭＤＳＯ−色素を溶解させる ＤＭＳＯ中の４４３μｌの２０％のプルロン酸 溶液をアリコートで−２０℃に保存する。

【０２９５】 数回、凍結および解凍することができる。

【０２９６】 選択的に、凍結させておく２ｍＭの色素溶液ならびに室温にする２０％のプル
ロン酸溶液を調製し、かつ２つの溶液を使用の前に１：１の比で混合する。

【０２９７】 ２０％のプルロン酸： 分子プローブＰ−６８６７ チューブ中で秤量し、かつＤＭＳＯ中に３７℃で溶解させる。

【０２９８】 室温に冷却させ、かつ等分する。室温で保存する。

【０２９９】 ＤＭＳＯ： 含水量が低いＤＭＳＯを使用する。

【０３００】 例えば；５ｍｌのアンプル中のシグマＤ２６５０ 細胞培養設備で必要とされかつ使用される他のアイテム： ・１２路のピペットロ５０〜２００μｌ、例えばブリンクマン、パート＃５００
８１３０−３ ・滅菌ピペットチップ２００μｌ、例えばＥ＋Ｋサイエンティフィック（電話番
号４０８−３７８−２０１３）、パート＃３５０７−Ｒ９６５）（９６チップの
１０ラック） ・プレートウェルから培地を除去するためのアスピレーター、例えば：１２ピン
吸気アスピレーター、パート＃８５１３８８または８ピン吸気アスピレーター、
パート＃９５１３８１（ヒートンサイエンスプロダクツ（電話番号：８００−２
２５−１４３７）） ・５ｍＬ、１０ｍＬ、２５ｍＬの滅菌血清学ピペット ・２〜２５ｍＬのピペットのための再充電可能なピペッター ・滅菌組織培養水 ・グローブ ・細胞増殖のための培養培地 ・細胞の生存のためのＥＤＴＡおよびトリプシン／ＥＤＴＡ ・血球計および計数器 滅菌試験管１５ｍＬおよび５０ｍＬ ・１ＮのＮａＯＨ溶液 ＦＬＩＰＲ試験 膜電位 ＦＬＩＰＲは基本的に電位感受性色素ＤｉＢＡＣ（４）₃（モレキュラープロ ーブＢ４３８）を使用して膜電位の測定のために開発された。アッセイプロトコ
ールは、ミシガン州カラマズーのアップジョンファルマシアのビンス・グロッピ
（Vince Groppi）博士によって開発された。

【０３０１】 細胞培養 ＦＬＩＰＲからの品質データに必要な１つの基準は、測定される細胞がウェル
の底部にあることである。このことは、必ずしも細胞が付着している必要性がな
いことを意味している。この必要性はマイクロプレートウェルの底部からの蛍光
に対する感受性を増強するＦＬＩＰＲでの光学的検出のためである。非付着性細
胞を使用できるが、懸濁液中では使用できない。一般に、非付着性細胞を回転さ
せて沈降させ、擬似単層をプレートの底部に形成させる。

【０３０２】 幾つかの細胞型は付着を保証するために被覆（例えばポリ−Ｄ−リジン）を必
要とする。典型的なプロトコールは、使用前に滅菌環境でマイクロプレートをコ
ーティングすることを含む。

【０３０３】 以下の手順は、本明細書に記載される新規のカリウムチャネル、例えば配列番
号：２を過剰発現する細胞を調製するためにＦＬＩＰＲのために使用される。

【０３０４】 １日目：形質転換またはトランスフェクションされた異種発現細胞のストック
培養を１×トリプシン／ＥＤＴＡを有するＴ７５フラスコから分離する。典型的
にＴ７５フラスコは２×１０⁶細胞を含有している。異種発現細胞を約０．２５ ×１０⁵細胞／ｍｌに希釈し、かつ細胞０．２ｍｌを９６ウェルプレートの各ウ ェルに分配する。前記のように、各ウェルに０．５×１０⁴のＡ１０細胞をプレ ーティングする。このように、Ｔ７５フラスコは３日間の増殖後に４つの集密状
態の９６ウェルプレートを生じさせる。

【０３０５】 ３日目：異種発現細胞に慎重に新たな培地を供給する。単層を破壊しないよう
に気をつける。

【０３０６】 ４日目：細胞はＦＬＩＰＲでの分析の用意ができている。

【０３０７】 前記の手順後に、９６プレートの各ウェルにおいて均一な単層の細胞が達成さ
れるべきである。いずれにせよ単層が不均一であると思われれば、実験は中止し
、新たな培養を調製する。

【０３０８】 ４日目に引き続き前記の手順を実施し（前記のセクション参照）、ＦＬＩＰＲ
の試験のためのプレートはここで製造する。過剰増殖させずに、Ａ１０細胞を連
続的に４日目〜６日目で使用することができる。

【０３０９】 較正 ＦＬＩＰＲはポジティブコントロールウェルおよびネガティブコントロールウ
ェルを使用して較正スキームを導入することができる。ネガティブコントロール
は典型的に非刺激性液体バッファーが添加されている。ネガティブコントロール
を使用して、設備およびアッセイが正確に作動し、平坦な基準線が得られ、かつ
少しもないべきである応答がないことが確認される。ポジティブコントロールウ
ェルを使用して、シグナル利得の変化をモニターする。利得の較正は１回の作動
の全データとプレートを較正する公知のポジティブとを比較することが有用であ
る。

【０３１０】 溶液の調製（膜電位アッセイ） 以下のプロトコールは約２つのマイクロプレートを試験するのに十分な溶液を
提供することを意図している： １．）ＥＢＳＳ中のＨＥＰＥＳバッファー２０ｍＭ溶液を１０ｍＬの１ＭのＨＥ
ＰＥＳの４９０ｍｌのＥＢＳＳへの添加によって調製する。該溶液はＥＢＳＳ＋
Ｈである。インキュベーションによって３７℃に加温する。

【０３１１】 ２．）５０μｌの１０ｍＭのＤｉＢＡＣをＥＢＳＳ＋Ｈ１００ｍｌに添加するこ
とによって５μＭのＤｉＢＡＣを含有するＥＢＳＳ＋Ｈ１００ｍｌを製造する。
該溶液はＥＢＳＳ＋Ｈ＋Ｄである。３７℃に維持する。該溶液はネガティブコン
トロールウェルにおいて、細胞を洗浄するため、かつ試験中の細胞を有する溶液
における培地として使用される。約６０ｍｌを試験プレートあたりに使用する。
１０ｍＭのＤｉＢＡＣストックはＤＭＳＯ中で粉末から製造する。ＤｉＢＡＣ１
０ｍＭストック：ＤｉＢＡＣは通常２５ｍｇの量になり、凍結および後の使用の
ためにＤＭＳＯ中の３００μｌのアリコート２０つまでを作るのに有用である。

【０３１２】 ３．）１０ｍＭのＤｉＢＡＣ５０μｌを５０ｍｌのＥＢＳＳ＋Ｈに添加すること
によって１０μＭのＤｉＢＡＣを含有する５０ｍｌのＥＢＳＳ＋Ｈを製造する。
該溶液はＥＢＳＳ＋Ｈ＋Ｄである。３７℃に保持する。この１０μＭの色素（２
×）溶液を作動中にピペットチップを予備浸漬するためにＦＬＩＰＲにおいて使
用する。ＤｉＢＡＣはプラスチックに吸収され、刺激性化合物はＤｉＢＡＣ中で
調製され、それによって細胞を含有する光学的に測定されるマイクロプレート中
の色素濃度が維持される。

【０３１３】 ４．）７．５ｍｌの４ＭのＫＣｌを９２．５ｍｌのＥＢＳＳ＝Ｈに添加すること
によって３００ｍＭのＫＣｌおよび５０ｍｌの１０ｍＭのＤｉＢＡＣを含有する
１００ｍｌのＥＢＳＳ＋Ｈ＋Ｄを製造する。該溶液はＥＢＳＳ＋Ｈ＋Ｄ＋３００
ＫＣｌである。３７℃に保持する。この１０×ＫＣｌ溶液は添加プレート中のポ
ジティブコントロールウェル（２０ｍｌの添加で１８０ｍｌに：最終濃度３０ｍ
ＭのＫＣｌにする）のために使用される。

【０３１４】 細胞プレートの調製 １．）増殖培地を細胞からマルチウェルピペッターを使用して除去する。８ウェ
ルピペッターを使用する際には、細胞が乾燥しないことを保証するために一度に
４行以下で実施する。予備加温したＥＢＳＳ＋Ｈ＋Ｄ２５０μｌを細胞に添加す
る。全プレートに前記のことを実施する。この作業は３７℃に設定したホットプ
レート上で実施して、温度の変動を最小限にするべきである。２５０μｌのＥＢ
ＳＳ＋Ｈ＋Ｄで２回洗浄する。

【０３１５】 ２．）再度１回で４行実施し、２５０μｌのＥＢＳＳ＋Ｈ＋Ｄを除去し、新たな
予備加温したＥＢＳＳ＋Ｈ＋Ｄ１８０μｌと取り換える。ピペッターチップが予
備浸漬されており、かつ色素洗浄剤を使用してする際に一貫して可変な希釈を避
けることを確実にする。

【０３１６】 ３．）細胞プレートを洗浄した後に、これをインキュベーター中に入れて３７℃
に釣り合わせる。

【０３１７】 ４．）細胞を最終洗浄の２時間以内にＦＬＩＰＲで試験すべきである。

【０３１８】 候補化合物（薬剤）添加プレートの調製 １．）ネガティブコントロールウェル中に２２０〜２５０μｌのＥＢＳＳ＋Ｈ＋
Ｄを入れる。ピペッターを５０μｌの液体レベルに下降させ、典型的に１回の作
動で僅かに２０μｌを吸引し、従って該プレートは数回使用できる。クリアーな
マイクロプレートを刺激プレートのために使用できる。平底プレートでＦＬＩＰ
Ｒ９６ウェルピペッターを使用すると、約５０μｌの死容量（dead volume）が 生じるが、ｖ底プレートでは死容量は１０〜２０μｌという少なさである。

【０３１９】 ２．）２２０〜２５０μｌのＥＢＳＳ＋Ｈ＋Ｄ＋３００ＫＣｌをデザインされた
ポジティブコントロールウェルに入れる。

【０３２０】 ３．）溶剤に未知のものがある場合、ネガティブコントロールウェル中に幾つか
の溶剤の濃度を含むことを確実にする。本試験において、ＤＭＳＯ０．１％未満
に維持するようにつとめた。

【０３２１】 ４．）薬剤添加プレートをインキュベーター中に入れ、３７℃に釣り合わせる。

【０３２２】 膜電位のための典型的な測定順序 スタートアップ手順 １．）レーザー水流および電気主要切断をオンにする。

【０３２３】 ２．）レーザーをつける。典型的に、レーザーは安定に１５〜３０分間必要とす
る。コヒーレントはレーザーに関して３０分間のウォームアップ安定期間が推奨
される。またこれらは（チューブの寿命のため）３時間より長期でダウンさせる
つもりである場合にだけレーザーは消し、さもなくばレーザーはつけたままにす
る。

【０３２４】 ３．）コンピューター、モニターおよびカメラコントローラーをつける。ＣＣＤ
カメラはそのカメラでデータをとる前の温度であることを確実にする。適切な温
度が点灯した緑色によって示されて、“ステータス”がカメラコントローラーで
点灯する。通常カメラの冷却には約５分間つかう。

【０３２５】 ４．）ＦＬＩＰＲ閉じこめを強化する。ＰＣがＦＬＩＰＲの強化以前に立ち上が
っていることを確実にする。システムはロックアップしていてよい。

【０３２６】 ５．）８０ｐｓｉの空気源のためにレギュレーターをつける。

【０３２７】 ６．）セルドロアが中であり、ピペットチップが上であることを保証することに
よっていかなるインターロックをクリアする。

【０３２８】 ７．）加湿チャンバーのために空気流を開始する（温度依存性アッセイのみ）。

【０３２９】 ８．）ＦＬＩＰＲコントロールソフトウェアアイコンをダブルクリックすること
によってＦＬＩＰＲコードを開始する。またピペッターはスタートアップ時に通
常のホーミングサイクル（homing cycle）を経過させる。温度コントロールが望
ましく、かつｓｅｔｕｐ．ｆｌｐファイル中にデフォルトオンとして設定されて
いない場合、セットアップ“ヒーター”を介してそれをつけてオプションをプル
ダウンする。温度センサーが安定化するためには約３０分間かかる。温度コント
ロールオプションが低圧制御された空気源をオンにする必要があることを取り消
す。

【０３３０】 ９．）温度コントロールを使用する場合には、温度警告インジケーターを待って
、ディスプレーウインドウ上でクリアする。

【０３３１】 データ収集 ＤｉＢＡＣの強い温度依存性のため、インキュベーターから細胞を移動させた
後に細胞をＦＬＩＰＲ細胞インキュベーションチャンバー中に直ちに入れること
がよい。

【０３３２】 細胞をＤｉＢＡＣを有する溶液中にいれたら、これらは２時間以内に試験すべ
きである。

【０３３３】 温度安定化時間を削減するために、細胞プレートおよび添加プレートはインキ
ュベーターから移動させ、ＦＬＩＰＲにおいて細胞インキュベーションチャンバ
ー中にできる限り素早く入れるべきである。より慎重に作業者がプレートを取り
扱えば、より素早くＤｉＢＡＣ温度は安定化し、より素早く蛍光ベースラインは
安定化する。

【０３３４】 その際、作業者は試験で使用すべきパラメーターを設定すべきである。セット
アッププルダウンメニューでの試験オプションの選択によって実施される。

【０３３５】 膜電位の測定のための典型的なシステムのセットアップ システム利得パラメーター レーザーの採用を３００ｍＷ周辺に設定する。

【０３３６】 ＤｉＢＡＣは明るいので、Ｆ／停止をＦ５．６周辺に設定する、すなわち０．
４秒周辺の少ないカメラ露光時間で絞りを絞るべきである（設定の仕方は以下に
記載されている）。

【０３３７】 一般的設定パラメーター ａ．）露出時間（カメラ調整時間）：通常約０．４秒 ｂ．）フィルター＃１（標準的フィルター） ｃ．）予備浸漬チップ（通常左のトレイから通常チェックされる） ｄ．）多数の添加剤 ｅ．）オートメーション：ユーザーのオプションの選択 第１の順序の定義下 ａ．）試料間隔（典型的に２０秒） ｂ．）試料カウント（所望の試験の長さに依存する）、通常ＤｉＢＡＣに関して
は１５分間で十分であり、２０秒の更新、および１５分間の全作動時間、４５つ
の試料をとることができる。

【０３３８】 ｃ．）第２の間隔（一般に速い更新のために使用されるためだけのＤｉＢＡＣで
通常必要ない） ｄ．）液体添加で確認される活性 ｅ．）添加すべき液体容量（ＤｉＢＡＣが温度感受性であり、より少量の添加容
量が有利であるので２０μｌ ｆ．）適用速度（細胞型に依存する、２０μｌ／秒は遅く、８０μｌは速い、よ
り良好に混合すると混合速度は速くなる、プレートの底部に移動せずに細胞が持
ちこたえることに依存する。

【０３３９】 ピペッティング下で ａ．）混合容量（一般に４０μｌ） ｂ．）混合数（一般に３、少量を大量に添加するので混合を実施し、ならびにＤ
ｉＢＡＣのキネティックは更新の間を省略できるほど遅い ｃ．）チップ位置、チェックしない、すなわち、チップはデータ収集の間はウェ
ルの外にある、それというのもＤｉＢＡＣ試験が遅く、ピペッターは前記の箱を
チェックしないことによって試料位置間の液体中に上昇および下降する時間を有
し、化合物が事前にプログラムされた送達前に細胞プレート中に浸出しないこと
を確実なものにすることができる。

【０３４０】 ｄ．）液体添加、一般にＤｉＢＡＣのため、これはチェックされる、すなわちウ
ェルは前記の例で２０μｌを添加した同量の液体を除去する。このことは顕著な
蛍光バックグラウンド成分の添加に関連する液体高さ依存性がないことを確実な
ものにしており、その際、これは添加化合物を有する溶液中のＤｉＢＡＣである
。これは場合により必要である。未チェックの箱では、液体を添加して、全ウェ
ル容量を２００μｌに変化させる（細胞プレートに既に添加された２０μｌ〜１
８０μｌであると仮定する）。

【０３４１】 試験を定義したらユーザーは“ライトバルブ”または作動“シグナルテスト”
オプションを使用してシグナルレベルチェックを実施する。これは、セットアッ
プエクスペリメントウィンドウで定義されている現行の露出時間に適したカメラ
露出を必要とし、かつプレートの全ての９６ウェルに関するシグナルカウントを
示している。また露出に関する平均シグナルカウント、最小シグナルカウントお
よび最大シグナルカウントの統計量を示している。カメラの全ダイナミックレン
ジは６５０００カウントなので、２５０００〜３００００の範囲のＤｉＢＡＣの
シグナルカウントで作業するのがよい。前記の利得レベルで、良好なＤｉＢＡＣ
シグナル（例えば膜脱分極）は５０００カウントのオーダーである。このような
基礎的蛍光レンジ２５〜３００００カウントの範囲での出発は、個々のカメラピ
クセルがデータ収集の間に飽和されないことを確実にさせる。

【０３４２】 シグナルカウントが高すぎるか、もしくは低すぎる場合、カメラ間隔の短縮ま
たは延長のそれぞれは正確なシグナルレベルが達成されるまで推奨される。０．
４秒未満の露出時間を所望のビデオレベルに低下させる必要がある場合、レーザ
ー源出力を小さくするか、または選択的にカメラの絞りを絞る。カメラの各Ｆ／
停止の増大は２分の１に検出感受性を低減させる。システム利得パラメーターに
関する一般的範囲は以下である： レーザー出力：１５０ｍＷおよび１ワットの間で作動させ、レーザーが毎日一
貫した場所で暖められるように約３００ｍＷにしておき、より利得が必要であれ
ば出力を増大させることを提案する。

【０３４３】 カメラＦ／停止（Ｆ／２〜Ｆ／２２で動作する）は、各停止は感受性において
２倍であり、その際、Ｆ／２は最高の感受性を有する最大の絞りであることに注
意する。これは、例えばＤｉＢＡＣアッセイを動作する場合に、変化を容易にし
、光からのがれさせる。

【０３４４】 カメラ露出時間：キネティック（マルチフレーム）データのために０．２秒よ
り長く作動する。これは露出時間が非常に短いので、カメラシャッターの開閉に
おける機械的振動によって時間的蛍光トレースにノイズを付与することがある。
このことはシングル（ノンキネティック）露出に関する論点ではない。

【０３４５】 シグナルレベルを設定した後に、作業者はベースライン安定性チェックを開始
する準備ができている。これは蛍光ベースラインが、平坦なベースライン蛍光を
もたらす熱平衡下であることを保証するために推奨される。これは試験の開始に
よって、通常２０秒の時間更新で、ピペッティングを行わないで実施することが
できる。これは細胞内カルシウムアッセイよりもＤｉＢＡＣにおいて議論される
。細胞プレートがＦＬＩＰＲ中にある場合の液体の温度に依存して、安定化は数
分間または２０分以下を費やす。

【０３４６】 ベースラインは平坦であると仮定され、そのときがアッセイの開始の時間であ
る。任意の時間に停止アイコンをヒットして、ベースラインを停止することがで
きる。ユーザーはベースラインが十分に平坦であると確信したら、ピペッターを
試験セットアップウインドウ、“第１の順序”ダイアログページで再びアクティ
ブな状態にする 試験は、測定した蛍光データ値を更新するリアルタイムディスプレーで、全測
定数が完了するまで継続させる。この点において、ピペッターはＦＬＩＰＲの右
側のピペットロードステーションに戻す。

【０３４７】 作動が完了したら、ユーザーはデータの移出（またはプロセス）の準備ができ
ている。これは基本的に元のデータファイル（既にハードディスク上に圧縮され
保存されている）をウェルあたりの蛍光シグナルカウントに変換する。データの
移出をセクション３．５で詳細に説明する。

【０３４８】 付記： 色素の負荷の後に、非蛍光塩バッファー中の幾らかの洗浄剤は、細胞外色素の
存在に関連するシグナル人工産物ならびに培地中の蛍光物に関連するバックグラ
ウンドを低減する必要がある。不適な洗浄と一緒に存在する主要な人工産物は強
力なバックグラウンド成分の希釈のための刺激の添加の後に鋭くシグナルは減衰
する。一般に化合物を非蛍光塩溶液、例えばハンクス、アールス等中に混入し、
かつ大量の添加（５０μｌ〜１００μｌ）が迅速な混合を保証することを主張す
る。

【０３４９】 細胞洗浄バッファーは試験中の細胞に使用されるのと同じ溶液であるべきであ
る。同様に、同じバッファーを使用して、キネティック試験の間の細胞における
不所望なｐＨ、浸透圧または形態変化が回避されるように刺激化合物を製造する
べきである。典型的に平衡化された塩溶液、例えばＨＢＳ、ＰＢＳまたはＥＢＳ
Ｓが使用される。化合物を、細胞が洗浄され、かつ試験の動作前に入れてあるの
と“厳密に”同じバッファー中で製造するのが重要である。

【０３５０】 典型的なプロトコールは１．５時間色素中に負荷し、例えば穏やかな洗浄器、
例えばデンレイセルウォッシュを使用してバッファー（ウェルあたり２００μｌ
）で３．４回洗浄することである。正確に何回の洗浄が必要であるかは細胞型に
依存している。時々、洗浄の間の待機期間（２前、２後）は、最終洗浄を実施す
る前により低い細胞外色素濃度に細胞を再平衡化させるのに良好である。細胞が
僅かに付着性であるならば、細胞外色素を完全に除去するために細胞を洗浄する
のとプレート外で細胞を洗浄するのとの交換条件がある。

【０３５１】 ピペッターディスペンス速度（pipettor dispense speed）は一般に約５０μ ｌ／秒であるべきである。しかしながら、細胞が僅かに付着性であれば、ユーザ
ーはディスペンス速度を低下させる必要がある。低いディスペンス速度は２０μ
ｌ／秒のオーダーであり、速い適用速度は約８０μｌ／秒である。前記の値は各
細胞型に関して実験で決定せねばならないが、一般に混合を促進するためにでき
る限り速く適用するのが有利である。交換条件はピペッティング速度がウェルの
底部に細胞が移動するほど強くてはならないということである。これは事実上、
カメラピクセルの視界から蛍光細胞が移動し、それによって液体添加後に蛍光ト
レースにおいて大量の低下（人工産物が）惹起される。

【０３５２】 データ作動（data run）の開始時に、細胞における色素負荷レベルをチェック
するために“シグナル試験”を実施することが有用である。負荷レベルプロトコ
ールを確立した際に、バックグラウンド蛍光カウントにおける読みを得るために
色素を全マイクロプレートに負荷しないことが有用である。前記の負荷されてい
ないウェルは洗浄工程等の間に丁度負荷された細胞のように処理すべきである。
主要なバックグラウンド成分（塩溶液が試験の間にバッファー中で使用されると
仮定）は、プラスチックのマイクロプレートから蛍光を発する。殆どの塩バッフ
ァー溶液は励起波長４８８ｎｍで無視できる蛍光を有する。

【０３５３】 約１００００〜２００００カウント（取り消し飽和（recall saturation）は ６５０００カウント）の出発蛍光レベル（バックグラウンドの上）での作業は基
礎的イオンレベルのために推奨される。再び、負荷レベルに依存して、これは約
０．３００Ｗのレーザー出力、０．４秒の調整時間およびＦ／停止設定Ｆ／２が
得られるべきである。

【０３５４】 異種過剰発現細胞のための特異的色素負荷プロトコール １．）細胞をプレーティングして集密状態にする；付着させる必要がある ２．）無水ＤＭＳＯ中で２ｍＭまでの色素ストックを製造する ３．）２０％ｗ／ｖのプルロン酸（本試験において非常に必要である）で希釈す
ることによって１ｍＭの色素ストックを製造する ４．）４０μｌの１ｍＭストックをローディングバッファーまたは媒体に添加す
ることによって４μＭの色素ローディングストックを製造する。これは１プレー
トに関して実施する。

【０３５５】 ５．）増殖培地およびプレーティングされた細胞からの血清を除去する。選択的
に、媒体および血清中に負荷させる場合、存在する媒体／血清に色素／媒体／血
清を添加する。これは吸引工程を省くが、必要であれば色素濃度を減らす。

【０３５６】 ６．）４μＭの色素（ウェルあたり〜１００ｕｌ）と一緒に細胞を１．０〜１．
５時間負荷させる。

【０３５７】 ７．）細胞をバッファー溶液で２回洗浄する。使用容量がウェルあたり少なくと
も２００μｌであるような良好な洗浄を得るべきである。

【０３５８】 ８．）細胞を１５分間再インキュベートする。

【０３５９】 ９．）２回以上バッファーで洗浄し、ウェル中に１００〜１５０μｌを残留させ
る。実際の残留容量は刺激プレートの製造において所望された希釈量に依存する
。最終容量は良好なウェルをより良好に一貫性にするように一貫することが重要
である。再インキュベーション無しに、引き続き４バッファー洗浄を実施するの
が適当である場合がある。これは通常、色素漏洩人工産物がネガティブコントロ
ールウェル中に存在するかしないかに基づいて実験的に決定される。

【０３６０】 例１４ 脳由来のカリウムチャネルサブユニット（配列番号：３）の機能的発現はＨＮＳ
ＰＣ（配列番号：５）によって抑制される電流を惹起する。

【０３６１】 配列番号：２および配列番号：４をホニュウ類発現ベクター中にクローニング
する：コーディング領域配列配列番号：２および配列番号：４を有するＥｃｏＲ
Ｉ断片をｐＣＲ２．１ベクター（インビトロ利得、カールスバッド、ＣＡ）から
それぞれ切断し、かつｐｃＤＮＡ３ベクター（インビトロ利得）のＥｃｏＲＩ部
位にライゲーションする。形質転換された細菌コロニーを、ベクターおよび遺伝
子特異的プライマーを使用してＰＣＲによって方向に関してスクリーニングした
。クローンをＤＮＡ配列決定によって確認した。

【０３６２】 配列番号：２のＮ−末端の促進された緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）融合構
築物の形成：ｐＣＲ２．１ベクター（前記）中の配列番号：２のＥｃｏＲＩ断片
をｐＥＧＦＰＣ１（クロンテック、パロ・アルト、ＣＡ（Cormack, B. P. et al
., Gene, 173:33(1996)）のＥｃｏＲＩ部位にライゲーションして、配列番号： ２のＮ−末端のＥＧＦＰ融合構築物を形成した。形質転換された細胞コロニーを
ＰＣＲによってセンス方向に関してスクリーニングし、かつＤＮＡ配列決定によ
って確認した。

【０３６３】 トランスフェクション：ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ、ロックヴィレ、ＭＤ）を
以下のようにトランスフェクションした：７０ｕｌのＬｉｐｏＴＡＸＩ（ストラ
タジーン、ラ・ヨラ、ＣＡ）をポリスチレンチューブに添加し、緩慢に混合した
。２（２）ｕｇのｐＥＦＧＰＣ１（トランスフェクションされた細胞のトレース
のために使用されるコントロールベクター）および５ｕｇの１種の構築物（ｐｃ
ＤＮＡ３中の配列番号：３またはｐｃＤＮＡ４中の配列番号：２）を液体／媒体
混合物に添加し、２０分間インキュベートした。２（２）ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥ
Ｍ Ｉを添加し、かつ緩慢に混合した。トランスフェクションされるべき細胞を ＯＰＴＩ−ＭＥＭ Ｉで１回洗浄し、かつ液体−ＤＮＡ混合物３ｍｌを洗浄した 細胞に添加し、かつ３７℃、５％のＣＯ₂で４〜６時間インキュベートした。次 いで細胞を１０％の熱不活性化したＦＢＳ（バイオウィッタカー、ウォーカーズ
ヴィレ、ＭＤ）、ＤＭＥＭ（メディアテック１０−０１７−ＣＶ）で処理した（
refed with）。同時発現実験のために、プロトコールにおいて２ｕｇのｐＥＧＦ
ＰＣ１（対照ベクター）、５ｕｇのｐｃＤＮＡ３ＱＴ２Ｌ（ｐｃＤＮＡ３中の配
列番号：２）および２０ｕｇのｐｃＤＮＡ３ＱＴ２Ｓ（ｐｃＤＮＡ３中の配列番
号：４）を使用した。細胞はパッチクランプを実施する２４〜４８時間前に３５
ｍｍ皿上で希釈し、かつ再プレーティングした。

【０３６４】 ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ、ロックヴィレ、ＭＤ）を以下のようにトランスフ
ェクションした：２５ｕｌのＤＭＲＩＥ−Ｃ試薬（ギブコＢＲＬ／ライフテクノ
ロジー、ガイサーズブルク、ＭＤ）をＯＰＴＩ−ＭＥＭ Ｉ（ギブコＢＲＬ／ラ イフテクノロジー、ガイサーズブルク、ＭＤ）２ｍｌに添加し、緩慢に混合し、
かつ２０分間インキュベートした。２（２）ｕｇのｐＥＧＦＰＣ１ＱＴ２Ｌ（配
列番号：２のＮ−末端に融合させたＥＧＦＰ）および７．３ｕｇのｐｃＤＮＡも
しくは９．３ｕｇのｐｃＤＮＡ３ＱＴ２Ｓ（ｐｃＤＮＡ３中の配列番号：４）（
ｈＫｖＱＴ２Ｌ（配列番号：２）構築物の５モル過剰のために）を液体／媒体混
合物中に添加し、緩慢に混合し、かつ２０分間インキュベートした。これに２（
２）ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ Ｉを添加し、緩慢に混合した。トランスフェクシ ョンされるべき細胞をＯＰＴＩ−ＭＥＭ Ｉで１回洗浄し、かつ４ｍｌの液体− ＤＮＡ混合物を洗浄した細胞に添加し、かつ３７℃、５％ＣＯ₂ で４〜６時間インキュベートした。次いで細胞を１０％の熱不活性化したＦＢＳ
（バイオウィッタカー、ウォーカーズヴィレ、ＭＤ）、ＤＭＥＭ（メディアテッ
ク１０−０１７−ＣＶ）で処理した。細胞をトリプシン処理し、希釈し、かつパ
ッチクランプの２４〜４８時間前に３５ｍｍ皿上で希釈しかつ再プレーティング
した。

【０３６５】 電気生理学：全ての記録は慣用の全細胞の形態を使用して得られた（Hammill,
O. P., et al., Pfluger Arch., 391, 85-100, 1981）。細胞を５ｕｇのｐｃＤ
ＮＡ３または２ｕｇのｐＥＧＦＰＱＴ２Ｌ（配列番号：２のＮ−末端に融合させ
たＥＧＦＰ）で試験の２４〜４８時間前にトランスフェクションした。細胞外溶
液は（ｍＭ）：１６０のＮａＣｌ、４．５のＫＣｌ、１のＭｇＣｌ₂、２のＣａ Ｃｌ₂、５のＨＥＰＥＳ、５のグルコース（ＮａＯＨによってｐＨ７．４、〜３ ２５ｍＯｓｍ）。Ｋ⁺感受性試験において、等モルのＮａ⁺をＫ⁺に置き換えた。 ピペット溶液は（ｍＭ）：１５０のＫ−アスパルテート、２のＭｇＣｌ₂，１の ＣａＣｌ₂、５のＨＥＰＥＳ、１．６のＥＧＴＡ（ＫＯＨによってｐＨ７．２、 〜３０５ｍＯｓｍ）。電位プロトコールを実施し、かつデータはｐＣｌａｍｐ６
．０ソフトウェア（アクソンInstr., CA）を使用して得られた。溶液変化および
薬剤適用は局所潅流系による。

【０３６６】 図１３を作成するために、細胞を２μｇのｐＥＧＦＰＱＴ２Ｌ（配列番号：２
）および５または１０倍のモル過剰の空ベクター（ｐｃＤＮＡ３）またはｐｃＤ
ＮＡ３ＱＴ２Ｓ（配列番号：４）で記録の２４〜４８時間前にトランスフェクシ
ョンした。電流を−６０ｍＶの保持電位から、１０ｍＶによって−４０ｍＶから
７０ｍＶに増大させた８５０ｍｓ電圧によって誘発した。電流を細胞容量に標準
化して電流密度を得た。赤色の実線はデータに単一指数関数的に適合した。

【０３６７】 例１５ ヒト脳由来の配列番号：４の発現の検出 羅患した組織および正常な組織を有するヒト腫瘍ブロットをインビトロ利得（
カールスバッド、ＣＡ（カタログ番号Ｄ５０３０−０１；ロット番号６０７３３
７９）から入手した。市販のブロットは異なる４ドナーからの腫瘍組織から単離
された全ＲＮＡを含有する。腫瘍組織および正常な組織を同じ作業部位で摘出し
た。２０μｇの全ＲＮＡを１レーンあたりにロードし、１％の変性ホルムアルデ
ヒドゲル上で泳動した。該ゲルをナイロン膜に真空ブロットし、ＵＶ照射および
ベーキングによって固定した。配列番号：２の核酸位置９８９〜１１０９に相当
する³²Ｐ−標識したＤＮＡプローブ（プローブ２）を作成し（前記）、Ｎｏｒｔ
ｈｅｒｎＭａｘ Ｐｒｅｈｙｂ／Ｈｙｂ Ｓｏｌｎ中で４２℃でブロットにハイブ
リダイズさせた（アンビオンInc., Austin, TX）。高度にストリンジェントな洗
浄を２×ＳＳＣ／０．５％ＳＤＳ中で５分間；２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで５
分間、０．１％のＳＳＣ／０．５％のＳＤＳで３０分間において３７℃でサンブ
ローク他（Sambrook et al, Cold Spring Harbor, Molecular Cloning(1989））
に従って２回実施した。ブロットをバイオマックスＭＳ−１フィルム（コダック
、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）に２枚の増感紙と一緒に−８０℃で５〜７日間暴
露した。

【０３６８】 発明の詳細な説明に記載される全ての文献および特許は記載することにより引
用したこととする。本発明の記載された方法およびシステムの種々の変更および
改変は本発明の範囲および精神からかけ離れない限り当業者により明らかである
。本発明は特に有利な態様に関して記載されるが、請求されるような本発明はか
かる特定の態様に極度に限定されるべきではないと理解されるべきである。実際
は、分子生物学または関連分野の当業者に明らかな本発明を実施するための種々
の変更および記載される様式は請求の範囲内であると意図している。 配列表 （１）一般的情報： （ｉ）出願人： （Ａ）名称：ゼネカ Ｌｔｄ （Ｂ）町：１５ Ｓｔａｎｈｏｐｅ Ｇａｔｅ （Ｃ）市：ロンドン （Ｄ）州：グレーターロンドン （Ｅ）国：英国 （Ｆ）郵便コード：Ｗ１Ｙ ６ＬＮ （Ｇ）電話：０１７１ ３０４ ５１５１ （Ｈ）テレファックス：０１７１ ８３４ ２０４２ （ｉｉ）発明の名称：ヒトの脳由来のＫＣＮＱ２カリウムチャネル （ｉｉｉ）配列の数：８ （ｉｖ）コンピューター読み取り可能形： （Ａ）媒体型：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ コンパチブル （Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：パテント イン リリース ＃１．０、バージョン ＃１
．３０（ＥＰＯ） （ｖｉ）優先権データ （Ａ）出願番号：ＧＢ９７２６３３９．６ （Ｂ）優先日：１９９７年１２月１３日 （２）配列番号：１に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ：３０２９塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：他の核酸 （ｘｉ）配列番号：１：

【０３６９】

【表３】

【０３７０】

【表４】

【０３７１】

【表５】

【０３７２】

【表６】

【０３７３】 （２）配列番号：２に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ：２５６５塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：他の核酸 （ｘｉ）配列番号：２：

【０３７４】

【表７】

【０３７５】

【表８】

【０３７６】

【表９】

【０３７７】 （２）配列番号：３に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ：８５４アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド （ｘｉ）配列番号：３：

【０３７８】

【表１０】

【０３７９】

【表１１】

【０３８０】

【表１２】

【０３８１】

【表１３】

【０３８２】

【表１４】

【０３８３】 （２）配列番号：４に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ：１４２５塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：他の核酸 （ｘｉ）配列番号：４：

【０３８４】

【表１５】

【０３８５】

【表１６】

【０３８６】 （２）配列番号：５に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ：３９３アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド （ｘｉ）配列番号：５：

【０３８７】

【表１７】

【０３８８】

【表１８】

【０３８９】

【表１９】

【０３９０】 （２）配列番号：６に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ：５８１アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド （ｘｉ）配列番号：６：

【０３９１】

【表２０】

【０３９２】

【表２１】

【０３９３】

【表２２】

【０３９４】 （２）配列番号：７に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ：８７２アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド （ｘｉ）配列番号：７：

【０３９５】

【表２３】

【０３９６】

【表２４】

【０３９７】

【表２５】

【０３９８】

【表２６】

【０３９９】 （２）配列番号：８に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ：８２５アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド （ｘｉ）配列番号：８：

【０４００】

【表２７】

【０４０１】

【表２８】

【０４０２】

【表２９】

【０４０３】

【表３０】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は分化したニューロンに対して組織特異的な脳由来のカリウムチャネルポ
リペプチドをコードする３０２９塩基のｃＤＮＡ核酸配列を表している。

【図２】 図２は分化したニューロンに対して組織特異的なヒトの脳由来のカリウムチャ
ネルポリペプチドをコードするｃＤＮＡ核酸配列のＡＴＧからＴＧＡの２５６５
塩基の翻訳される構造領域を表している。

【図３】 図３は分化したニューロンに対して組織特異的なヒトの脳由来のカリウムチャ
ネルポリペプチドの８５４アミノ酸残基配列を表している。

【図４】 図４はＨＮＳＰＣカリウムチャネルに属する１４２５塩基のｃＤＮＡ配列を表
している。

【図５】 図５はＨＮＳＰＣカリウムチャネルの３９３アミノ酸残基配列を表している。

【図６】 図６はヒトのＫｖＬＱＴ１カリウムチャネルの５８１アミノ酸残基配列を表し
ている。

【図７】 図７は新規のヒトの脳由来のカリウムチャネルポリペプチドのアミノ酸残基配
列ならびにカリウムチャネルポリペプチドＨＮＳＰＣのアミノ酸残基配列および
ｈＫｖＬＱＴ１（配列番号：６）間の比較整合を表している。印：印＃１：四角
で囲った残基は厳密にコンセンサスとマッチする。ＰＡＭ２５０残基質量テーブ
ル（PAM250 residue weight table）でのクラスタル法（Clustal method）を使 用している。

【図８】 図８は本明細書に記載される新規のヒトの脳由来のカリウムチャネルポリペプ
チドのアミノ酸残基配列、ならびに予想される膜内外セグメントを示すカリウム
チャネルポリペプチドＨＮＳＰＣおよびｈＫｖＬＱＴ１のアミノ酸残基配列の疎
水性プロットを表している。

【図９】 図９は、（パネルＡ）ヒトの脳由来のカリウムチャネルポリペプチドコーディ
ング領域に特異的な核酸プローブＮｏ１を使用する；（パネルＢ）および（パネ
ルＣ）ＨＮＳＰＣのｃＤＮＡとヒトの脳由来のカリウムチャネルポリペプチドコ
ーディング領域とに共通の核酸プローブＮｏ２を使用する複数の組織のノーザン
ブロット分析を表す。ＰＢＬ＝末梢血白血球。Ｃ＝７００ｂｐのハウスキーピン
グシクロフィリン転写物、ＲＮＡ負荷の標準化のために使用した。

【図１０】 図１０は、（パネルＡ）ヒトの脳由来のカリウムチャネルポリペプチドコーデ
ィング領域に特異的な核酸プローブＮｏ．１を使用する；（パネルＢ）ＨＮＳＰ
ＣのｃＤＮＡと本明細書に記載されるヒトの脳由来のカリウムチャネルポリペプ
チドコーディング領域とに共通の核酸プローブＮｏ２を使用するヒトの脳の異な
る領域のノーザンブロット分析を表している。Ｃ＝７００ｂｐのハウスキーピン
グシクロフィリン転写物、ＲＮＡ負荷の標準化のために使用した。

【図１１】 図１１は、（パネルＡ）ヒトの脳由来のカリウムチャネルポリペプチドコーデ
ィング領域に特異的な核酸プローブＮｏ１を使用する；（パネルＢ）ＨＮＳＰＣ
のｃＤＮＡと本発明に記載されるヒトの脳由来のカリウムチャネルポリペプチド
コーディング領域とに共通の核酸プローブＮｏ２を使用するヒトの成人の脳およ
びヒトの胎児の脳、未誘導および神経細胞誘導性の神経芽細胞腫細胞系列ｉｍｒ
−３２および星状細胞のノーザンブロット分析を表している。Ｃ＝７００ｂｐの
ハウスキーピングシクロフィリン転写物、ＲＮＡ負荷の標準化のために使用した
。

【図１２】 図１２はホニュウ類ＣＯＳ−７およびＨＥＫ２９３細胞系列における機能的Ｋ ⁺ 活動電流の発現および活性を示している。 Ａ．親細胞の活動電流の欠如に対する、トランスフェクションしたＣＯＳ−７
細胞の緩慢に活性化し、不活性化していないヒトの脳由来のカリウムチャネルサ
ブユニットの活動電流。 Ｂ．ＣＯＳ−７およびＨＥＫ２９３細胞で現れるサブユニットの活動電流の標
準化した平均（±ＳＥＭ；ｎ＝３−１２）定常状態活性の電圧依存性を示してい
る。 Ｃ．サブユニット（ＨＥＫ２９３細胞）の［Ｋ⁺］₀における逆転電位の依存性
を示している。 Ｄ．サブユニットのテトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）による濃度依存性阻
害を示している。

【図１３】 図１３は配列番号：２（長い）および配列番号：４（短い）によるＣＯＳ−７
およびＨＥＫ２９３細胞の同時トランスフェクションの間のＫ⁺活動電流の効果 を示している。 Ａ．配列番号：２をトランスフェクトさせたＣＯＳ−７細胞における一連の段
階的電圧の増加により誘導される活動電流の典型的な重ね合わされた群。 Ｂ．配列番号：４および配列番号：２で５：１の比で同時トランスフェクショ
ンされた細胞からの（Ａ）と同様のプロトコールを使用して得られた活動電流の
重ね合わされた群。 Ｃ．配列番号：４と配列番号：２の組合せを指示される比で同時トランスフェ
クションした全てのＣＯＳ−７細胞およびＨＥＫ２９３細胞からの電流密度の概
略データ（平均±ＳＥＭ、ｘ軸下の括弧中のｎ）（^*ｐ＜０．０５の親細胞電流 密度とは異なることを表す、^**ワンウェイＡＮＯＶＡ（one-way ANOVA）による ｐ＜０．００１レベルを表す）。

【図１４】 図１４は活動電位依存性とｈＫｖＱＴ２Ｓ（配列番号：４）およびｈＫｖＱＴ
２Ｌ（配列番号：２）を５：１の比で同時トランスフェクションした細胞に対す
るｈＫｖＱＴ２Ｌ（配列番号：２）（＋空ベクター）をトランスフェクションし
たＣＯＳ−７細胞中の電流に関するキネティック。活動電位依存性（Ａ）と活動
キネティック（Ｂ）はＫｖＱＴ２Ｌ＋ＫｖＱＴ２Ｓ（ワンウェイＡＮＯＶＡ；ｐ
＞０．０５）で同時トランスフェクションした細胞に対するＫｖＱＴ２Ｌでトラ
ンスフェクションした細胞における電流に関してはあまり異ならない。 Ａ．標準化平均（±ＳＥＭ；ｎ＝５−６）定常状態の活動電流の活動電位依存
性。実線はデータに対してボルツマン適合である（ベクター＋ＫｖＱＴ２Ｌ：Ｖ _1/2 ：−６ｍＶ、傾斜率：１３，ＫｖＱＴ２Ｓ＋ＫｖＱＴ２Ｌ ５：１；Ｖ_1/2： −２ｍＶ、傾斜率：１２）。 Ｂ．電位段階の増大された範囲によって誘導される電流の活性化に対する単一
指数適合から得られる平均（±ＳＥＭ；ｎ＝５−６）τ。

【図１５】 図１５はヒトの脳腫瘍のノーザンブロット分析を示している。ｈＫｖＱＴ２（
配列番号：４）の短いスプライス変異体に相当する約２Ｋｂのバンドが脳腫瘍レ
ーンに検出されたが、同じ脳からの隣接した非腫瘍細胞または脳に転移した非脳
由来の腫瘍からの隣接した非腫瘍細胞においては検出されなかった。

【図１６】 図１６は未分化、分化およびβ−アミロイド処理したＳＮ５６およびＳＮ４８
中隔細胞系列のノーザンブロット分析を示している。

【図１７】 図１７はラットＫｖＱＴ３の代表的なアミノ酸残基配列を示している。

【図１８】 図１８はヒトＫｖＱＴ３の代表的なアミノ酸残基配列を示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 11/06 Ａ６１Ｐ 15/06 15/06 25/00 25/00 25/08 25/08 25/16 25/16 25/24 25/24 25/28 25/28 35/00 35/00 37/00 37/00 43/00 １０５ 43/00 １０５ Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ０７Ｋ 14/705 16/28 16/28 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 1/68 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｄ 33/50 33/566 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/566 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ， ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，Ｌ Ｕ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ， ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，Ｕ Ｇ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 エドワード フィリップ クリスティアン アメリカ合衆国 デラウェア ウィルミン トン ピー オー ボックス 15437 コ ンコルド パイク 1800 (72)発明者 ナオミ ジーン ログスドン アメリカ合衆国 デラウェア ウィルミン トン ピー オー ボックス 15437 コ ンコルド パイク 1800

Claims (29)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 実質的に配列番号：３に記載されるような配列を有するポリ
   ペプチドまたはその生物学的に活性な断片をコードする核酸配列を有する精製ポ
   リヌクレオチド。
2. 【請求項２】 ポリヌクレオチド配列が実質的に配列番号：２に記載される
   ような配列を有する、請求項１記載のポリヌクレオチド。
3. 【請求項３】 請求項１記載のポリヌクレオチドを有する発現ベクター。
4. 【請求項４】 請求項２記載のポリヌクレオチドの完全体またはその生物学
   的に有用な部分を有するアンチセンス分子。
5. 【請求項５】 請求項３記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
6. 【請求項６】 実質的に配列番号：３に記載されるアミノ酸配列を有する精
   製ポリペプチド。
7. 【請求項７】 請求項６記載のポリペプチドに特異的な抗体。
8. 【請求項８】 実質的に配列番号：３に記載される生物学的に活性なポリペ
   プチドを発現する細胞を得る方法において、 ａ）請求項５記載の宿主細胞を前記ポリペプチドの発現に適当な条件下で培養す
   ることを特徴とする生物学的に活性なポリペプチドを発現する細胞を得る方法。
9. 【請求項９】 実質的に配列番号：３に記載されるアミノ酸配列を有するポ
   リペプチドを製造する方法において、 ａ）請求項５記載の宿主細胞を、前記のポリペプチドの発現に適当な条件下で培
   養し、かつ ｂ）宿主細胞培養から前記ポリペプチドを回収する ことを特徴とするポリペプチドを製造する方法。
10. 【請求項１０】 カリウムチャネルの生物学的活性を調節する化合物を同定
    する方法において、 （ａ）生物学的活性の候補化合物モジュレーターと実質的に配列番号：３に記載
    される配列を有するカリウムチャネルポリペプチドとを混合し、 （ｂ）生物学的活性において該候補化合物モジュレーターの効果を測定する ことを特徴とするカリウムチャネルの生物学的活性の調節化合物の同定方法。
11. 【請求項１１】 カリウムチャネルの生物学的活性を調節する化合物を同定
    する方法において、 （ａ）カリウムチャネルの生物学的活性の候補化合物モジュレーターと実質的に
    配列番号：３に記載される配列を有するカリウムチャネルポリペプチドを発現す
    る宿主細胞とを混合し、 （ｂ）生物学的活性において候補化合物モジュレーターの効果を測定する ことを特徴とするカリウムチャネルの生物学的活性の調節化合物の同定方法。
12. 【請求項１２】 神経生理機能を調節する化合物を同定する方法において、
    （ａ）神経生理機能の候補化合物モジュレーターと実質的に配列番号：３に記載
    される配列を有するカリウムチャネルのポリペプチドとを混合し、 （ｂ）カリウムチャネルの生物学的活性において候補化合物モジュレーターの効
    果を測定する ことを特徴とする神経生理機能を調節する化合物を同定する方法。
13. 【請求項１３】 神経生理機能を調節する化合物を同定する方法において、
    （ａ）神経生理機能の候補化合物モジュレーターと実質的に配列番号：３に記載
    される配列を有するカリウムチャネルのポリペプチドを発現する宿主細胞とを混
    合し、 （ｂ）カリウムチャネルの生物学的活性において候補化合物モジュレーターの効
    果を測定する ことを特徴とする方法。
14. 【請求項１４】 請求項１０記載の方法によって同定されるヒトのカリウム
    チャネルの生物学的活性を調節する化合物。
15. 【請求項１５】 請求項１１記載の方法によって同定されるヒトのカリウム
    チャネルの生物学的活性を調節する化合物。
16. 【請求項１６】 請求項１２記載の方法によって同定される神経生理機能を
    調節する化合物。
17. 【請求項１７】 請求項１３記載の方法によって同定される神経生理機能を
    調節する化合物。
18. 【請求項１８】 請求項１４記載のヒトのカリウムチャネルの生物学的活性
    を調節する化合物を含有する医薬品組成物。
19. 【請求項１９】 請求項１５記載のヒトのカリウムチャネルの生物学的活性
    を調節する化合物を含有する医薬品組成物。
20. 【請求項２０】 請求項１６記載の神経生理機能を調節する化合物を含有す
    る医薬品組成物。
21. 【請求項２１】 請求項１７記載の神経生理機能を調節する化合物を含有す
    る医薬品組成物。
22. 【請求項２２】 ヒトのカリウムチャネルの生物学的活性によって媒介され
    る状態の治療を必要とする患者の治療法において、請求項１４記載の調節化合物
    を適用することを特徴とする方法。
23. 【請求項２３】 ヒトのカリウムチャネルの生物学的活性によって媒介され
    る状態の治療を必要とする患者の治療方法において、請求項１５記載の調節化合
    物を適用することを特徴とする方法。
24. 【請求項２４】 神経生理機能によって媒介される状態の治療を必要とする
    患者の治療方法において、請求項１６記載の調節化合物を適用することを特徴と
    する方法。
25. 【請求項２５】 神経生理機能によって媒介される状態の治療を必要とする
    患者の治療方法において、請求項１７記載の調節化合物を適用することを特徴と
    する方法。
26. 【請求項２６】 請求項４記載のアンチセンス分子の有効量を細胞に適用す
    る、細胞のカリウムチャネルの発現を阻害する方法。
27. 【請求項２７】 請求項４記載のアンチセンス分子の有効量を細胞に適用す
    る、細胞の神経生理機能を調節する方法。
28. 【請求項２８】 実質的に配列番号：３に記載されるアミノ酸配列を有する
    ポリペプチド配列の同定のための請求項７記載の抗体を含有する診断組成物。
29. 【請求項２９】 実質的に配列番号：２に記載される配列を有するポリヌク
    レオチド配列またはその断片の同定のための、配列番号：１から得られるＰＣＲ
    プライマーを含有する診断組成物。 実質的に配列番号：４に記載される配列を有するポリヌクレオチド配列または
    その断片の同定のための、配列番号：４から得られるＰＣＲプライマーを含有す
    る診断組成物。