JP2003532424A

JP2003532424A - Ｒｈ１１６ポリペプチドとその断片、および前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと治療の用途

Info

Publication number: JP2003532424A
Application number: JP2001582544A
Authority: JP
Inventors: バール，ジョルジュ; コキュドゥ，セシル; キャプロン，アンドレ
Original assignee: Institut Pasteur de Lille
Current assignee: Institut Pasteur de Lille
Priority date: 2000-05-11
Filing date: 2001-05-11
Publication date: 2003-11-05
Also published as: CA2408576A1; US20040086500A1; FR2808801B1; EP1285074A1; WO2001085955A1; FR2808801A1; AU2001260413A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ＲＨ１１６と命名された、ＲＮＡヘリカーゼ（ＤＥＸＨボックス）との配列相同性を示す新規な１１６ｋＤａのポリペプチドと、その断片、ｃＤＮＡのクローニング、および前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むクローニングベクターおよび／または発現ベクター、前記ベクターで形質転換された細胞、および前記ポリペブチドに対する特異的な抗体に関するものである。本発明はまた、前記ポリペプチドとポリヌクレオチドを検出、かつ／または分析するための方法、対応する診断キット、そして予防および／または治療処置のための薬品として使用可能なリガンドや化合物のスクリーニングの方法に関するものでもある。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、ＲＨ１１６と命名されたＲＮＡヘリカーゼ（ＤＥＸＨボックス）と
の配列相同性を示す新規な１１６ｋＤａポリペプチドとその断片、ｃＤＮＡおよ
び前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのクローニング、前記ポリヌ
クレオチドを含むクローニングベクターおよび／または発現ベクター、前記ベク
ターで形質転換された細胞、および前記ポリペブチドに対する特異的な抗体に関
するものである。本発明はまた、前記ポリペプチドとポリヌクレオチドの検出お
よび／または分析の方法、対応する診断キット、およびリガンド、ならびに予防
および／または治療処置用の医薬品として使用可能な化合物のスクリーニング方
法に関するものでもある。

【０００２】ムラミルペプチドは、合成免疫調節薬の中でも、単球／マクロファージ系の細
胞に数多くの免疫薬理学的効果を示したものであり、それらの、感染に非特異的
な抵抗性を高め、マクロファージの殺腫瘍活性を増進し、またワクチンのアジュ
バントとしても作用する。ムラブチド（ＭＢ）は、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ
）の類似体であって、特に有望な生物学的特徴や、動物およびヒトにおける良好
な耐性を理由に選択したものである。実際、ＭＤＰやその他の多くの類似体とは
異なり、健常者の有志や癌患者における臨床研究の際に、ＭＢは発熱性ではなく
、炎症反応を誘発せず、重篤な毒性を示さなかったことが実証済である。

【０００３】その生物学的能力により、ＭＢはＡＩＤＳ（後天性免疫不全症候群）の分野に
おける有望な抗ウイルス剤である。実際、ＭＢはヒトの免疫不全ウイルス（ＨＩ
Ｖ）の複製を、マクロファージや樹状細胞、同様に、感染した患者の末梢血単核
細胞（ＰＢＭＣ）においても阻害する。従って、これら生物学的特性を考慮する
と、免疫調節薬ＭＢを対象にしたものには、「ＨＩＶのような後天性免疫不全ウ
イルスの複製を１００％まで阻害できるムラミルペプチド組成物」と題されたフ
ランス特許第ＦＲ２７２４８４５号がある。さらに、ＨＩＶ陽性の患者について
最後まで行ったフェーズＩとフェーズＩＩａ臨床試験により、ＭＢの良好な臨床
的耐性が実証されている。

【０００４】本発明者らが実証したところによると、ＭＢは、フィトヘマグルチニン（ＰＨ
Ａ）で活性化され、そしてインターロイキン２（ＩＬ−２）と培養された、ＣＤ
８リンパ球が減少した患者のＰＢＭＣｓにおけるウイルスの複製を強く抑制する
効果を発揮する。実際、ＭＢは培養物の上澄みにおけるＨＩＶのウイルスタンパ
ク質ｐ２４のレベルを７０から１００％阻害する。この効果は、（スプライシン
グされない、および一か所スプライシングされた）ウイルスのメッセンジャーＲ
ＮＡの発現レベルと相関関係を有する。さらに、分泌されたサイトカインとケモ
カインの特性の分析が示すところによると、ＭＢは、ＨＩＶ複製の阻害剤として
知られているケモカインの生成を誘発した。しかしながらこの誘発は、ＭＢの抑
制効果と完全な相関関係にあるとは思われない。ＭＢによるＨＩＶの複製の抑制
は、β−ケモカインの生成の誘導のみを必要とするのではないが、それはＭＢが
プロウイルスＤＮＡおよびウイルス転写のレベルにも関わっているからである。
これらの同じ細胞培養におけるＭＢの毒性の欠如は、本発明者らが検証済であり
、彼らが指摘していることは、培養開始時に生きている細胞の数が変わらないま
までいるだけでなく、さらに培養終了時に増えているようでもあるということで
ある。

【０００５】従って、本発明者らが得た結果から示唆されるのは、ＭＢはサイトカイン、あ
るいは今日まで識別されていない他の因子の生成を誘発することであり、そのよ
うな因子がＨＩＶの複製に対してサプレッサー活性をもつということである。

【０００６】ウイルス複製の調節に関わるこれらの新しい因子を識別するために、本発明者
らは、「ディファレンシャルディスプレイ−ＲＴ−ＰＣＲ（ＤＤ−ＲＴ−ＰＣＲ
）」という、２つの基本的な手順からなる方法を使用した。第一の手順は、全細
胞ＲＮＡの逆転写（ＲＴ）を行うことであり、ポリＡ尾部をもつＲＮＡすべての
相補的ＤＮＡが得られるようにする。ついで、第二の手順は、放射性同位元素で
標識されたヌクレオチドの存在下で、基質の役割を果たすｃＤＮＡと様々なプラ
イマー対でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅を行うことである。つぎ
にＰＣＲ産物を電気泳動によりゲル上で分離する。差次的に増幅した断片は、ゲ
ルから切り取り、再び増幅し、そしてクローニングしてシークエンスする。

【０００７】ＨＩＶ陽性の患者のＰＢＭＣｓを用いて行われるＤＤ−ＲＴ−ＰＣＲによって
、本発明者らは、ＭＢによる処理の後、差次的に発現した１３０を越えるｃＤＮ
Ａ断片を選ぶことができた。これらの断片を、ベクターｐＣＲ２．１(Ｉｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎ社)においてサブクローニングし、つぎに自動シークエンス（ＡＢ
ＩＰｒｉｓｍ３７７，Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）によりシークエンスした
。配列は、データバンクとＮＣＢＩ社のＢａｓｉｃＬｏｃａｌＡｌｉｇｎｍ
ｅｎｔＳｅａｒｃｈＴｏｏｌ（Ｂｌａｓｔ２）サーバーとを用いて、相同
性を調べるように分析された。

【０００８】本発明者らは、ＲＮＡヘリカーゼと配列相同性を示す新規なポリペプチドの存
在を突き止めた。

【０００９】ＲＮＡヘリカーゼ（文献ＣｒｉｔｉｃａｌＲｅｖ．ＩｎＢｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（１９９８）３３（４
）：２５９−２９６参照）は、ＲＮＡが中心的な役割を果たす全てのタイプの生
物システムに存在するタンパク質の膨大なファミリーを代表するものである。該
ＲＮＡヘリカーゼは、広い範囲の生物に偏在的に分布しており、ミトコンドリア
と核でのスプライシング過程、ＲＮＡ編集（ＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇ）、ｒＲＮ
Ａプロセッシング（ｒＲＮＡｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）、翻訳の開始、核ｍＲＮ
Ａの移出およびｍＲＮＡの分解に関連している。

【００１０】ＲＮＡヘリカーゼは、細胞の分化と発生にとって不可欠の要素をなし、その中
には、一本鎖ＲＮＡウイルスゲノムの転写と複製において、役割を果たすものも
ある。

【００１１】ＲＮＡヘリカーゼは、ヌクレオチド５’−三リン酸を加水分解することのでき
る酵素の大きなグループに属している。

【００１２】ＤＮＡ依存ＡＴＰアーゼの配列の比較検討は、ＡＴＰアーゼＡモチーフによ
るＮＴＰアーゼの新しい分類を可能にした。したがって、ＤＮＡヘリカーゼは、
別名「ウォーカー」モチーフ（Ｇ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｇ−Ｋ−Ｔ）とも呼ばれる
Ａモチーフに特徴づけられ、スーパーファミリーＩに属しているが、ＲＮＡヘリ
カーゼはこのドメイン（Ａ−Ｘ−Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ｇ−Ｋ−Ｔ）で変異を示し、近接
するスーパーファミリーＩＩを形成する（Ｇｏｒｂａｌｅｎｙａｅｔａｌ．
，１９８８）。

【００１３】保存された配列を比較すると、様々なＲＮＡヘリカーゼの間に密接な関連が見
られ、示唆されるのは、これらのタンパク質は共通の祖先から派生していること
である。

【００１４】事実、ＲＮＡヘリカーゼスーパーファミリーＩＩの様々なメンバーのアミノ酸
配列をアラインすることにより、高度に保存された八つのドメインの存在によっ
て特徴付けられる共通の中心領域が明らかになった。現在のところ、八つの保存
されたドメイン（ドメインＩ、ＩＩ、ＶＩそしてＶＩＩＩ）のうちの四つの生化
学的機能が解明されている。「ＤＥＡＤボックス」モチーフ（「ＤＥＡＤＢｏ
ｘ」）（Ｄ−Ｅ−Ａ−Ｄ：Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ）と呼ばれる、八つ
の構造要素の五番目において配列相同性が高いことを考慮すれば、スーパーファ
ミリーＩＩに属するＲＮＡヘリカーゼもまた、「ＤＥＡＤボックス」タンパク質
と呼ばれる（Ｌｉｎｄｅｒｅｔａｌ．，１９８９）。相違するＤＥＡＤモチ
ーフが存在することにより、ＲＮＡヘリカーゼのスーパーファミリーＩＩをサブ
グループに再分割することが可能となる。現在のところ、三つのサブグループが
識別されている。最初のサブグループは、従来のＤＥＡＤボックスタンパク質で
構成されており、他の二つのサブグループは、相違するＡＴＰアーゼＢモチー
フのために、ＤＥＡＨおよびＤＥＸＨと呼ばれている。

【００１５】保存された中心配列の両側で、ＲＮＡヘリカーゼのアミノ−末端およびカルボ
キシ−末端を特徴づけるのは、長さと内容の変化する配列である。そこから示唆
されることは、これらの相違する領域が個別のタンパク質機能を担当しており、
それに対し、高度に保存されたドメインがＲＮＡへリカーゼ活性に関わっている
ということである。

【００１６】ドメインＩ（Ａ／Ｇ−Ｘ−Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ｇ−Ｋ−Ｔ：Ａｌａ／Ｇｌｙ−Ｘ−Ｘ
−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ−ｌｙｓ−Ｔｈｒ）は、ＡＴＰアーゼのＡモチーフとして
記載されている（Ｗａｌｋｅｒｅｔａｌ．，１９８２）。

【００１７】ドメインＶ、あるいはＤＥＡＤボックス（Ｌ−Ｄ−Ｅ−Ａ−Ｄ−Ｘ−Ｘ−Ｌｅ
ｕ：Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｘ−Ｘ−ｌｅｕ）は、ＡＴＰア
ーゼＢモチーフの特異的な形態を示し（Ｗａｌｋｅｒｅｔａｌ．，１９８
２）、該モチーフはＡＴＰ加水分解に関わっていると思われる（Ｐａｕｓｅａ
ｎｄＳｏｎｅｎｂｅｒｙ，１９９２）。

【００１８】ドメインＶＩ、またはＳＡＴモチーフ（Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ）は、ＤＥＡ
Ｄボックスの近傍に位置し、そしてＲＮＡヘリカーゼに特異的なものと思われる
。

【００１９】ドメインＶＩＩＩを特徴づけるのは、ＹＩＨＲＩＧＲＸＸＲボックス（Ｔｙｒ
−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｘ−Ｘ−Ａｒｇ）であり
、該ボックスが示すモチーフは、ＳＡＴと同様にＲＮＡヘリカーゼに特異的なも
のである。翻訳開始因子ｅＩＦ−４Ａのインビトロでの実験は、このドメインが
ＲＮＡ結合に重要であることを示す。

【００２０】それゆえ本発明の対象は、アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮｏ２の「ＲＨ１１６
」と命名された、単離されたポリペプチド（１１６ｋＤａのＲＮＡヘリカーゼ）
である。この配列は保存された共通ドメインを含むが、該ドメインは当業者には
容易に識別できるものであって、かつ該ドメインは本発明のＲＨ１１６ポリペプ
チドを、ＤＥＡＨまたはＤＥＸＨサブグループに分類することを可能にする（Ｌ
ｕｋｉｎｇ．ｅｔａｌ．，（１９９８）参照）。これらの保存された共通ドメ
インのうちで、引用すべきは以下のものである：・配列ＳＥＱＩＤＮｏ２のアミノ酸３３２から３３６に対応し、かつＲＮＡ
ヘリカーゼスーパーファミリーの保存されたドメインＩ（Ｇ−ＧＫＴ）を構成す
るＧＳＧＫＴ配列。・配列ＳＥＱＩＤＮｏ２のアミノ酸４４３から４４６に対応し、サブグルー
プＤＥＸＨのＲＮＡヘリカーゼスーパーファミリーの保存されたドメインＶ（Ｄ
Ｅ─Ｈ）を構成するＤＥＣＨ配列。

【００２１】これらの二つの保存された共通ドメインは、ＡＴＰアーゼ機能に関わっている
。・配列ＳＥＱＩＤＮｏ２のアミノ酸４８８から４９０に対応し、かつサブグ
ループＤＥＡＨのＲＮＡヘリカーゼスーパーファミリーの保存されたドメインＶ
Ｉ（−Ａ−）を構成するＴＡＳ配列。・配列ＳＥＱＩＤＮｏ２のアミノ酸８２０から８２４に対応し、かつサブグ
ループＤＥＡＨのＲＮＡヘリカーゼスーパーファミリーの保存されたドメインＶ
ＩＩＩを構成するＲＧＲＡＲ配列。

【００２２】これらの二つの保存されたドメイン（ドメインＶＩとＶＩＩＩ）は、ＲＮＡヘ
リカーゼについてより特異的であり、また結合と標的ＲＮＡのアンフォールディ
ングを担っている。

【００２３】単離されたポリペプチドを特徴づけるのは、以下のものから選択されたポリペ
プチドを含むことである。ａ）配列ＳＥＱＩＤＮｏ２のポリペプチド；ｂ）ａ）で規定されたアミノ酸配列のポリペプチドの変異ポリペプチド；ｃ）ａ）またはｂ）で規定されたポリペプチドと相同であり、前記ａ）のポリペ
プチドと少なくとも８０％の同一性、好ましくは８５％、８７％、９０％、９５
％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するポリペプチド；ｄ）ａ）、ｂ）またはｃ）で規定されたポリペプチドの少なくとも１５の連続す
るアミノ酸、好ましくは１７、２０、２３、２５、３０、４０、５０、１００、
２５０の連続するアミノ酸断片；ｅ）ａ）、ｂ）またはｃ）で規定されたポリペプチドの生物学的に活性のある断
片。

【００２４】本明細書において、「ポリペプチド」という用語を使用するが、これはタンパ
ク質またはペプチドを等しく指すものである。

【００２５】変異ポリペプチドという用語は、天然に、特にヒトに存在しうる、かつアミノ
酸残基の、末端切断、置換、欠失および／または付加に特に対応する、突然変異
したポリペプチドの全体を指す。

【００２６】相同ポリペプチドという用語は、天然のＲＨ１１６ポリペプチドと比べて、例
えば特に少なくとも一つのアミノ酸の欠失、付加または置換、末端切断、伸長お
よび／またはキメラ融合のような幾つかの修飾を示すポリペプチドを指す。相同
ポリペプチドの中でも、好ましいのはアミノ酸配列が、本発明によるポリペプチ
ドのアミノ酸配列と、少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも８５％
、８７％、９０％、９３％、９５％、９７％、９８％、９９％の同一性を示すも
のである。置換の場合には、一つまたは複数の連続または非連続のアミノ酸を、
「同等の」アミノ酸で置換できる。「同等の」アミノ酸という表現は、ここでは
、基本構造のアミノ酸の一つと置換しうる一切のアミノ酸を指すが、ただし、ア
ミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮｏ２、またはその断片のうちの一つにそのアミノ酸
配列が含まれているようなポリペプチドを認識する能力のある抗体をインビボで
誘導するような、対応するポリペプチドに本質的な機能的特徴または特性、例え
ば生物学的活性を変更せずに置換するものである。これらの同等のアミノ酸が決
定されうるのは、置換するアミノ酸との構造的な相同性に基づいて、あるいは、
様々なポリペプチドが生成できる交わった生物活性についての解析結果に基づい
てである。例として言及するのは、結果として生じる対応する修飾されたポリペ
プチドの生物活性に深刻な変更をもたらすことなく実行されうる置換の可能性で
あるが、例えば、ロイシンをバリンまたはイソロイシンで、アスパラギン酸をグ
ルタミン酸で、グルタミンをアスパラギンで、アルギニンをリジンで置換えるこ
となどがあり、当然のことながら、同じ条件で逆の置換を行うことも考えられる
。

【００２７】生物学的に活性な断片という表現は、特にＲＮＡヘリカーゼ活性を有するとい
う点で、本発明によるポリペプチドの機能的特徴または特性の少なくとも一つを
有する、本発明によるポリペプチドのアミノ酸配列の断片を特に指す。本発明に
よる変異ポリペプチド、相同ポリペプチドまたはポリペプチド断片は、ＲＮＡヘ
リカーゼ活性の少なくとも１０％、好ましくは２０％、３０％、４０％、５０％
、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％を有する。当業者に知られている様
々なプロトコルが、本発明によるポリペプチドのＲＮＡヘリカーゼ活性を測定す
るために記述されているが、注目すべきは、Ｌａｉｎｅｔａｌ．（１９９０
）およびＬｅｅｅｔＨｕｒｗｉｔｚ（１９９３）の記事である。以下の例は
、ＲＨ１１６タンパク質のペプチドドメインに応じたこのタンパク質の生物学的
機能を提案するものであり、それにより、当業者が生物活性のある断片を識別で
きるようにするためのものである。

【００２８】ポリペプチド断片という用語は、少なくとも１５の連続するアミノ酸、好まし
くは１７、２０、２３、２５、３０、４０、５０、１００、２５０の連続するア
ミノ酸からなるポリペプチドを指す。タンパク質分解酵素や化学的試薬による前
記ポリペプチドの分断によって、あるいは前記ポリペプチドを非常に酸性の強い
環境に置くことによって得られた本発明によるポリペプチド断片もまた、本発明
の一部をなす。

【００２９】本発明のポリペプチドは好ましくは、配列ＳＥＱＩＤＮｏ２からなるポリ
ペプチドであるか、あるいは最適なアラインメントを施した後で、配列ＳＥＱ
ＩＤＮｏ２と少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも８５％、９０
％、９５％、９８％そして９９％の同一性を有する配列である。「最適なアライ
ンメントを施した後で、基準となる配列と、少なくとも８０％、好ましくは少な
くとも８５％、９０％、９５％、９８％そして９９％のパーセンテージ同一性を
示すアミノ酸配列のポリペプチド」という表現は、基準となるポリペプチドと比
べて、例えば特に一つまたは複数の欠失または末端切断、伸長、キメラ融合およ
び／または一つまたは複数の置換というような、幾つかの修飾を示すポリペプチ
ドを指す。

【００３０】最適なアラインメントを施した後で、配列ＳＥＱＩＤＮｏ２または本発明
によるそれらの断片の一つと、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％
、９０％、９５％、９８％そして９９％のパーセンテージ同一性を示すアミノ酸
配列のポリペプチドの中で好ましいのは、上記のような変異ペプチド配列によっ
てコードされた変異ポリペプチドであり、とりわけ配列ＳＥＱＩＤＮｏ２に
対して、またはそれらの断片の一つと、少なくとも一つのアミノ酸残基の、末端
切断、欠失、置換および／または付加に対応する少なくとも一つの突然変異を示
すアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、さらに望ましいのは、一つの病状
に関連する突然変異をもつ変異ポリペプチドである。

【００３１】本発明のポリペプチドの特徴は、ＲＮＡヘリカーゼスーパーファミリーに属す
る保存されたドメインを少なくとも一つ有することであり、そのようなドメイン
は、好ましくはドメインＩに対応するＧ−ＧＫＴ配列、ドメインＶに対応するＤ
ＥＡＤ、ＤＥ−ＤおよびＤＥＡＨ配列、ドメインＶＩに対応するＳＡＴおよび−
Ａ−配列、そしてドメインＶＩＩＩに対応するＹＩＨＲＩＧＲＲ、ＨＲＩＧＲ−
Ｒ、−Ｒ−ＧＲ−−Ｒそして−−−ＧＲ配列から選ばれる。

【００３２】本発明はまた、上記のような配列ＳＥＱＩＤＮｏ２のポリペプチドをコー
ドすることを特徴とする、精製され、または単離されたポリヌクレオチドに関す
るものでもある。好ましくは、本発明によるポリヌクレオチドは、配列ＳＥＱ
ＩＤＮｏ１を有するものである。

【００３３】本発明の精製され、または単離されたポリヌクレオチドの特徴は、ポリヌクレ
オチドが下記から選ばれることにある：ａ）ＳＥＱＩＤＮｏ１；ｂ）ＧｅｎＢａｎｋデータバンクにおけるアクセッション番号Ｎｏ．ＡＣ００７
７５０およびＮｏ．ＡＣ０１０８１７６で識別される核酸配列、また９５４１７
ｐｂのゲノム配列、さらにＥＭＢＬデータバンクにおけるアクセッション番号Ｎ
ｏ．ＡＷ５８９５６７、Ｎｏ．ＡＷ１５２５４１およびＮｏ．ＡＷ１８９５８４
で識別される登録された核酸配列も除く、配列ＳＥＱＩＤＮｏ１の少なくと
も１５の連続するヌクレオチド、好ましくは少なくとも１８、２１、２４、２７
、３０、３５、４０、５０、７５、１００の連続するヌクレオチド断片の配列；ｃ）ａ）またはｂ）で規定された配列と、最適なアラインメントを行った後に、
少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％そし
て９９％のパーセンテージ同一性を示す核酸配列；ｄ）ａ）、ｂ）またはｃ）で規定されたような配列に対応する、相補的配列また
はＲＮＡ配列。

【００３４】核酸、ヌクレオチド配列または核酸配列、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオ
チド、ポリヌクレオチド配列、そしてヌクレオチド配列という用語は、本明細書
においては無差別に用いられるが、変更されるかもしくはされない正確な一連の
ヌクレオチドを指し、それは核酸の断片または領域を規定することを可能にし、
天然ではないヌクレオチドを含むことも、また含まないこともあり、そして二本
鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、そして前記ＤＮＡの転写産物、および／またはＲＮＡ
断片に同様に対応することもできる。

【００３５】理解されるべきは、本発明は、天然の染色体環境、すなわち天然の状態でのヌ
クレオチド配列に関するものではないことである。本発明は、単離され、かつ／
または精製された配列に関するものであり、つまり直接または間接に、例えばコ
ピーにより採取されたものであって、その環境は少なくとも部分的に変更されて
いる。したがって、化学合成によって得られた核酸をも指す。

【００３６】相補的配列のポリヌクレオチドという表現は、そのヌクレオチドがＳＥＱＩ
ＤＮｏ１のヌクレオチド、またはＳＥＱＩＤＮｏ１の一部のヌクレオチド
に相補的であり、かつ逆方向の、一切のＤＮＡを指す。

【００３７】本発明の意味において、二つの核酸配列または二つのアミノ酸配列における「
パーセンテージ同一性」という用語は、最善のアラインメントをした後に得られ
る、比較すべき二つの配列の間で同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の割合
を指し、この割合は純粋に統計的であり、また二つの配列間の差異は無秩序に、
そしてその配列の全長にわたって分布している。「最善のアラインメント」また
は「最適のアラインメント」という用語は、以下のように決定されたパーセンテ
ージ同一性が最高になるようなアラインメントを指す。二つの核酸配列またはア
ミノ酸配列間の配列の比較は、従来、それらを最適な方法でアラインした後、こ
れらの配列を比較することにより行われているのであり、前記比較は、セグメン
トまたは「比較の窓」ごとに行われ、それにより配列が類似する局部的な領域を
識別し、そして比較することになる。その比較のためにこれらの配列を最適にア
ラインすることは、手動でやる以外にも、ＳｍｉｔｈｅｔＷａｔｅｒｍａｎ
（１９８１）の局部的相同アルゴリズムによって、Ｎｅｄｄｌｅｍａｎｅｔ
Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）の局部的相同アルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ
ｅｔＬｉｐｍａｎ（１９８８）の類似性検索方法によって、これらのアルゴ
リズムを用いるコンピューターソフトウェア（ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＧｅｎｅｔ
ｉｃｓＳｏｆｔｗａｒｅＰａｃｋａｇｅ，ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔ
ｅｒＧｒｏｕｐ，５７５ＳｃｉｅｎｃｅＤｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩに
記載のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ
およびＴＦＡＳＴＡ）などによって行うことができる。最適のアラインメントを
得るために、ＢＬＯＳＵＭ６２行列と共に、ＢＬＡＳＴプログラムを用いるこ
とが好ましい。ＰＡＭまたはＰＡＭ２５０行列もまた使用できる。

【００３８】二つの核酸またはアミノ酸配列間のパーセンテージ同一性は、最適にアライン
したこれらの二つの配列を比較することで決定されるが、比較すべき核酸または
アミノ酸配列は、これらの二配列間の最適なアラインメントにとって基準となる
配列に対する付加もしくは欠失を含んでいる可能性がある。パーセンテージ同一
性の計算は、二つの配列の間でヌクレオチドまたはアミノ酸残基が同一となるよ
うな同一位置の数を測定し、この同一位置の数を比較した位置の総数で割り、そ
してこれら二配列間のパーセンテージ同一性を得るように得られた結果を１００
倍することでなされる。

【００３９】最適なアラインメントを行った後に、基準となる配列と、少なくとも８０％、
好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％および９９％のパーセン
テージ同一性を示す核酸配列という表現で示すのは、基準となる核酸配列に対し
て、例えば特に、ある点において欠失、末端切断、伸長、キメラ融合、および／
または置換のような、幾つかの変更を有する核酸配列であり、その核酸配列は、
最適なアラインメントを行った後、基準となる核酸配列と、少なくとも８０％、
好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％および９９％の同一性を
示す。好ましくは、その相補的配列が、本発明の配列ＳＥＱＩＤＮｏ１と特
異的にハイブリダイズすることのできる配列を指す。望ましいことは、特異的な
、あるいは高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、二つの配
列の一方ともう一つの配列に相補的な配列との間で、最適なアラインメントを行
った後に、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、
９８％および９９％の同一性を確保できるものであることである。

【００４０】高いストリンジェンシーの条件の下でのハイブリダイゼーションが指すのは、
温度とイオン強度の条件を、二つの相補的なＤＮＡ断片の間でのハイブリダイゼ
ーションを維持することができるように選択するということである。例としては
、以上に説明したポリヌクレオチド断片を規定するためのハイブリダイゼーショ
ン手順の高いストリンジェンシーの条件は、以下であることが好適である。

【００４１】ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションを二つの手順で
行う：（１）リン酸緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）で４２℃で３時間のプレハ
イブリダイゼーションを行うが、該緩衝液は５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１
５ＭＮａＣｌ＋０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムの溶液に相当する）、５０％の
ホルムアミド、７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１０×Ｄｅｎｈａｒ
ｄｔ’ｓ、５％の硫酸デキストラン、そして１％の鮭の精子ＤＮＡを含有する；
（２）ハイブリダイゼーション自体を２０時間、プローブの長さに依存する温度
で行い（即ち：プローブの長さ＞１００ヌクレオチドでは４２℃）、続いて２×
ＳＳＣ＋２％ＳＤＳで２０分間２０℃での洗浄を２回、０．１×ＳＳＣ＋０．１
％ＳＤＳで２０分間２０℃での洗浄を１回行う。最後の洗浄を行うのは、０．１
×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳで３０分間６０℃で、プローブの長さ＞１００ヌクレ
オチドに対して行う。規定の長さのポリヌクレオチドについて上記に記述した高
いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、当業者によって、より
長いまたはより短いオリゴヌクレオチドに適用してもよいというのが、Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋｅｔａｌ．，１９８９が示すところである。

【００４２】最適なアラインメントを行った後、本発明の配列に対して、少なくとも８０％
、好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％および９９％のパーセ
ンテージ同一性を示す核酸配列の中で、望ましいのは、ＳＥＱＩＤＮｏ１、
またはそれらの断片の変異した核酸配列、つまり対立遺伝子変異体に対応する核
酸配列のすべて、すなわち配列ＳＥＱＩＤＮｏ１の個々の変異でもある。こ
れらの天然の突然変異した配列は、哺乳類、特にヒトに存在する多形性に、特に
ある病状の発生につながりかねない多形性に対応するものである。

【００４３】変異した核酸配列という表現が指すのは、一切のＲＮＡまたはｃＤＮＡでもあ
り、これらはそのｃＤＮＡが配列ＳＥＱＩＤＮｏ１を有するゲノム核酸配列
のスプライシング部位の突然変異、かつ／または変異の結果生じるものである。

【００４４】更に具体的には、本発明は、本発明によって精製され、または単離された核酸
に関するものであって、その特徴は、該核酸が、配列ＳＥＱＩＤＮｏ１の一
つ、その相補的配列、またはＳＥＱＩＤＮｏ１に対応するＲＮＡ配列を有し
、あるいはそれらから構成されていることである。本発明による核酸配列からな
ることを特徴とするプライマーまたはプローブもまた、本発明の一部をなす。し
たがって、核酸配列を検出し、識別し、解析し、または増幅するための本発明は
また、本発明によるプライマーまたはプローブに関するものでもあって、これら
が可能とするのは、特に変異した核酸配列を実証または区別すること、あるいは
ｃＤＮＡがＳＥＱＩＤＮｏ１で示される遺伝子のゲノム配列を識別すること
で、その際には特にＰＣＲ法のような増幅方法またはそれに類似する方法を用い
る。本発明によれば、核酸配列を検出し、識別し、解析し、または増幅する方法
においてプローブまたはプライマーとして使用可能なポリヌクレオチドは、最短
１５の塩基、好ましくは少なくとも１８、２０、２５、３０、４０、５０の塩基
の長さを示す。

【００４５】したがって本発明のポリヌクレオチドは、プライマーまたはプローブとして使
用されうるが、それは特にＰＣＲ（ポリメラーゼによる連鎖増幅）技法（Ｒｏｌ
ｆｓｅｔａｌ．，１９９１）を用いる方法においてである。この技法が要す
るのは、増幅されるべき断片と隣接する一対のオリゴヌクレオチドのプライマー
を選択することである。例えば、米国特許ＵＳＮｏ４６８３２０２号に記載され
た技法を参照されたい。増幅された断片が識別されるのは、例えばアガロースゲ
ル電気泳動またはポリアクリルアミド電気泳動の後、あるいはゲル濾過クロマト
グラフィーやイオン交換クロマトグラフィーのようなクロマトグラフィーの技法
の後であり、それからシークエンスすることができる。増幅の特異性が制御され
うるのは、本発明のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列をプライマーとして、
これら配列あるいはまた得られた増幅産物を含むプラスミドを基質として用いる
ことによる。増幅したヌクレオチド断片は、ハイブリダイゼーション反応におい
て試薬として用いてもよく、それにより、生物サンプルに、前記増幅したヌクレ
オチド断片の配列に相補的な配列の標的核酸が存在することを実証できる。本発
明はまた、本発明によるプライマーを用いた増幅によって得ることが可能な核酸
をも対象にしている。

【００４６】標的核酸増幅の他の技法は、有利には、本発明によるヌクレオチド配列の一対
のプライマーを用いるＰＣＲ（ＰＣＲ的）技法に代わるものとして用いられる。
ＰＣＲ的という用語は、核酸配列の直接または間接的な複製を実施する一切の方
法、あるいはまた、標識システムが増幅されている方法を指し、これら技法は言
うまでもなく、既に知られたものである。一般的に、ポリメラーゼでＤＮＡを増
幅することであり；オリジナルのサンプルがＲＮＡの場合には、前もって逆転写
を行うべきである。現在、この増幅を可能にする方法は、非常に多く存在してお
り、例えば、ＳＤＡ（ＳｔｒａｎｄＤｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔＡｍｐｌｉｆ
ｉｃａｔｉｏｎ）技法すなわちストランドを置換増幅する技法（Ｗａｌｋｅｒ
ｅｔａｌ．，１９９２）、Ｋｗｏｈｅｔａｌ．（１９８９）により記載さ
れたＴＡＳ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄＡｍｐｌｉｆｉｃａｔ
ｉｏｎＳｙｓｔｅｍ）技法、Ｇｕａｔｅｌｌｉｅｔａｌ．（１９９０）に
より記載された３ＳＲ（Ｓｅｌｆ−ＳｕｓｔａｉｎｅｄＳｅｑｕｅｎｃｅＲ
ｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）技法、Ｋｉｅｖｉｔｉｓｅｔａｌ．（１９９１）に
より記載されたＮＡＳＢＡ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＳｅｑｕｅｎｃｅＢ
ａｓｅｄＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）技法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ
ｉｏｎＭｅｄｉａｔｅｄＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）技法、Ｌａｎｄｅｇ
ｒｅｎｅｔａｌ．（１９８８）により記載されたＬＣＲ（ＬｉｇａｓｅＣ
ｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）技法、Ｓｅｇｅｖ（１９９２）により記載された
ＲＣＲ（ＲｅｐａｉｒＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）技法、Ｄｕｃｋｅｔ
ａｌ．（１９９０）により記載されたＣＰＲ（ＣｙｃｌｉｎｇＰｒｏｂｅ
Ｒｅａｃｔｉｏｎ）技法、Ｍｉｅｌｅｅｔａｌ．（１９８３）により記載さ
れたＱ−ベータ−レプリカ−ゼ増幅技法がある。これら技法には、それ以後、改
善されているものもある。

【００４７】検出する標的ポリヌクレオチドがｍＲＮＡである場合には、本発明によるプラ
イマーを用いた増幅反応を行う前、あるいは本発明のプローブを用いた検出方法
を行う前に、逆転写酵素型の酵素を用いるのが好適であり、それにより生物サン
プルにおいて得られたｍＲＮＡからｃＤＮＡを得るようにする。得られたｃＤＮ
Ａは、その際に、本発明による増幅または検出方法で用いられるプライマーまた
はプローブのための標的として役割を果たす。

【００４８】プローブのハイブリダイゼーション技法は、様々な方法で実施される（Ｍａｔ
ｔｈｅｗｓｅｔａｌ．，１９８８）。最も一般的な方法が含むのは、様々な
組織の細胞やサポート（例えばニトロセルロース、ナイロンまたはポリスチレン
）で培養した細胞から抽出した核酸を固定して、それにより例えばＤＮＡチップ
などを作成するようにすること、ついできちんと規定した条件で、プローブと共
に固定された標的核酸を培養することである。ハイブリダイゼーションの後、余
ったプローブを除去し、そして形成されたハイブリッド分子を適切な方法（プロ
ーブに関連する放射能、蛍光性または酵素活性の測定）によって検出する。

【００４９】本発明による核酸プローブのもう一つの実施例においては、該核酸プローブは
キャプチャープローブとして用いられる。この場合、「キャプチャープローブ」
というプローブはサポートに固定され、試験すべき生物サンプルから得た標的核
酸を特異的なハイブリダイゼーションによって捕らえるのに用い、そして次に標
的核酸が「検出プローブ」といわれる、検出しやすい因子で標識した、第二のプ
ローブを使って検出される。

【００５０】有利な核酸断片の中でも、更に言及すべきは、特にアンチセンスオリゴヌクレ
オチド、すなわち、標的配列とのハイブリダイゼーションにより、対応する産物
の発現の抑制を確実にする構造のオリゴヌクレオチドである。また同様に言及す
べきは、センスオリゴヌクレオチドであって、これは、対応する産物の発現の調
節に関わるタンパク質との相互作用により、この発現の抑制か活性化のどちらか
を誘発するものである。本発明によるオリゴヌクレオチドは、最短９の塩基、好
ましくは少なくとも１０、１２、１５、１７、２０、２５、３０、４０、５０の
塩基の長さである。

【００５１】本発明によるプローブ、プライマーおよびオリゴヌクレオチドは、当業者に周
知の方法により、放射性または非放射性の化合物によって直接または間接的に標
識することができ、それにより検出可能および／または定量化可能なシグナルが
得られるようにする。本発明によるポリヌクレオチド配列で、標識されないもの
を、プローブまたはプライマーとして直接使ってもよい。

【００５２】配列が一般的に標識されるのは、多くの用途に使用可能な配列が得られるよう
にするためである。本発明によるプライマーまたはプローブの標識は、放射性元
素または非放射性の分子で行われる。使用される放射性同位元素の中で言及すべ
きは、³²Ｐ、³³Ｐ、³⁵Ｓ、³Ｈまたは¹²⁵Ｉである。非放射性の物の選択は、ビオ
チン, アビジン, ストレプトアビジン、ジオキシゲニンのようなリガンド、ハプ
テン、着色剤、または放射性発光剤、化学発光剤、生物発光剤、蛍光剤または燐
光性の発光剤といった発光剤からなされる。

【００５３】本発明はまた、核酸を有し、または本発明によるポリペプチドをコードするク
ローニングベクターおよび／または発現ベクターに関するものである。このよう
なベクターはまた、宿主細胞におけるポリペプチドの発現および、場合によって
は分泌に必要な配列を含んでいてもよい。このような宿主細胞もまた本発明の課
題である。

【００５４】もう一つの側面として、本発明はアンチセンス発現ベクターにも関するもので
ある。このような発現ベクターは、発現ベクターに逆方向で挿入された、本発明
によるポリヌクレオチド配列が含まれている。そのようなわけで、当業者が容易
に認識できるのは、アンチセンスベクターのＤＮＡに対応するｍＲＮＡが、セン
スベクターのＤＮＡに対応するｍＲＮＡとハイブリダイズすることである。アン
チセンス発現ベクターとは、構成的な方法で、もしくは導入後に、適当な宿主細
胞において問題のアンチセンスＲＮＡを発現するベクターである。アンチセンス
という用語は、特異的な核酸配列を含む一切の組成物を指す。アンチセンス分子
は、合成または転写のような方法で作成可能である。このような分子を細胞に導
入する場合には、相補的なヌクレオチドは、細胞が生成する天然の配列と組み合
わされて、それにより二本鎖を形成し、ならびに本発明によるポリペプチドの転
写または翻訳のどちらかを阻害するようにする。また本発明の範囲内に含まれる
のは、ＲＨ１１６ＲＮＡヘリカーゼの基質であるＲＮＡ分子と対合しうるアンチ
センス分子を実現することで、それにより生物学的活性を阻害するようにするこ
とである。

【００５５】本発明によるポリペプチドの発現レベルおよび／またはＲＮＡヘリカーゼ活性
を減退または消失させることのできる識別された新規な化合物は、本発明による
ポリペプチドのアンタゴニストを構成する。「アンタゴニスト」という用語は、
本発明によるポリペプチドと結合する際に、ＲＨ１１６ポリペプチドの生物学的
または免疫学的な活性効果の量または持続時間を減少させる分子を指す。アンタ
ゴニストに含まれるのは、タンパク質、核酸、炭水化物およびＲＨ１１６の効果
を減じる能力のある分子すべてである。

【００５６】前記ベクターは、好ましくはプロモーター、翻訳の開始および終了のシグナル
、ならびに転写調節にふさわしい領域も含んでいることが望ましい。前記ベクタ
ーは、細胞において安定して維持できるものでなくてはならず、また場合によっ
ては翻訳されたタンパク質の分泌を指定する特殊なシグナルを所有してもよい。
本発明の特定の実施例によると、プロモーターは、本発明のヒトＲＨ１１６ポリ
ペプチドをコードする遺伝子の上流に天然に存在するプロモーターであってもよ
い。

【００５７】様々な制御シグナルは、使用される宿主細胞の機能に応じて選ばれる。したが
って、本発明による核酸配列が挿入されうるのは、選ばれた宿主の中で自律複製
するベクターの中、あるいは選ばれた宿主に統合したベクターの中である。

【００５８】自律複製システムの中でも、宿主細胞に応じて使用することが望ましいのは、
「プラスミド」、「コスミド」または「ミニ染色体」タイプのシステムか、ある
いはウイルス型のシステムであり、ウイルスベクターは特にアデノウイルス（Ｐ
ｅｒｒｉｃａｕｄｅｔｅｔａｌ．，１９９２）、レトロウイルス、レンチウ
イルス、ポックスウイルスまたはヘルペスウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎｅｔａ
ｌ．，１９９２）であってよい。当業者であれば、これらシステムのそれぞれに
ついて使用可能な技術を知っている。

【００５９】宿主細胞の染色体への配列の組み込みを望む場合には、例えば、プラスミドま
たはウイルス型のシステムを使ってもよく；そのようなウイルスとは、例えば、
レトロウイルス（Ｔｅｍｉｎ，１９８６）、またはＡＡＶ（Ｃａｒｔｅｒ，１９
９３）である。

【００６０】非ウイルスベクターの中で好ましいのは、ＶＩＣＡＬ社が開発した技術による
、裸のＤＮＡや裸のＲＮＡのような裸のポリヌクレオチド、バクテリア人工染色
体（ＢＡＣ，ｂａｃｔｅｒｉａｌａｒｔｉｆｉｃｉａｌｃｈｒｏｍｏｓｏｍ
ｅ）、酵母における発現のための酵母人工染色体（ＹＡＣ，ｙｅａｓｔａｒｔ
ｉｆｉｃｉａｌｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）、ネズミの細胞における発現のための
マウス人工染色体（ＭＡＣ，ｍｏｕｓｅａｒｔｉｆｉｃｉａｌｃｈｒｏｍｏ
ｓｏｍｅ），そして好ましくはヒト細胞における発現のためのヒト人工染色体（
ＨＡＣ，ｈｕｍａｎａｒｔｉｆｉｃｉａｌｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）である。

【００６１】そのようなベクターは、当業者によって広く一般的に用いられる方法にしたが
って用意されるのであって、その結果であるクローンを、標準的な方法で相応し
い宿主に導入してもよく、それには例えば、リポフェクション、エレクトロポレ
ーション、熱ショック、細胞膜に化学的に透過性付与した後での形質転換、また
は細胞融合がある。

【００６２】本発明はさらに、宿主細胞、特に本発明によるベクターによって形質転換した
真核細胞および原核細胞も含む。本発明の目的において使用可能な細胞の中で、
特に言及できるのは、バクテリア細胞（ＯｌｉｎｓｅｔＬｅｅ，１９９３）
だけでなく、酵母細胞（Ｂｕｃｋｈｏｌｚ，１９９３）もあり、また同様に動物
細胞、特に哺乳類細胞の培養物（ＥｄｗａｒｄｓｅｔＡｒｕｆｆｏ，１９９
３），そして特にチャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞およびヒト細胞
もある。また同様に言及できる昆虫細胞においては、例えばバキュロウイルス（
Ｌｕｃｋｏｗ，１９９３）を使う方法を用いることができる。本発明のタンパク
質を発現するために望ましい宿主細胞は、ＣＯＳ細胞とＨｅｌａ細胞からなるも
のである。

【００６３】本発明が同様に含むのは、ヒトを除く、好ましくは哺乳類の、トランスジェニ
ック動物であり、本発明による前記形質転換した細胞を一つ含んでいる。このよ
うな動物が使用されるのは、天然のヒトＲＨ１１６タンパク質の動物の相同物の
有害な変化に関連する病理学の病因論の研究モデル、あるいは、例えばムラブチ
ドのような、ＲＨ１１６アンタゴニストなどの、抗ウイルス治療がある、もしく
はないときの、ＲＨ１１６タンパク質の発現に対する、ＨＩＶウイルスのような
ＲＮＡウイルスが引き起こすウイルス感染の影響の研究モデルとしてである。

【００６４】本発明による哺乳類の中でも、好ましいのは、げっ歯類のような動物、特にマ
ウス、ラットまたはウサギのようなもので、本発明によるポリペプチドを発現す
るものである。

【００６５】本発明によるトランスジェニック動物は、本発明によるタンパク質をコードす
る遺伝子、またはそれらの相同遺伝子を過剰発現したり、また突然変異が導入さ
れる前記遺伝子を発現したりすることができる。このようなトランスジェニック
動物、特にマウスは、例えば、偏在する、性質の強い、または組織のタイプを選
択できるプロモーターの制御下で、あるいはウイルス転写の後に、この遺伝子の
コピーのトランスフェクションにより得られる。

【００６６】代わりに、本発明によるトランスジェニック動物は、配列ＳＥＱＩＤＮｏ
２のポリペプチドをコードする遺伝子を、もしくはその相同遺伝子を欠くものに
してもよいが、それはＬＯＸ−Ｐ／ＣＲＥ組換え酵素システム（Ｒｏｈｌｍａ
ｎｎｅｔａｌ．，１９９６）を使用する、もしくは使用しない相同組換えに
よって目標とされた不活性化により、またはこの遺伝子の発現を不活性化する他
のあらゆるシステムによってである。これらトランスジェニック動物を得る方法
には、例えば胚性幹細胞での相同組換え、これら幹細胞の胚への移入、生殖系で
影響を受けたキメラの選択、そして前記キメラの生長がある。

【００６７】上記のように形質転換をした細胞または哺乳類はモデルとしても用いられ、そ
れにより、本発明によるポリペプチドと、本発明によるポリペプチドの活性に直
接または間接に関わる化学化合物またはタンパク質化合物との間の相互作用を研
究するようにすることもでき、このことは関連する様々なメカニズムと相互作用
を研究するためである。それらは特に、本発明によるポリペプチド、特に配列Ｓ
ＥＱＩＤＮｏ２のタンパク質、または本発明によるそれらの変異体と相互作
用を行う生成物を選ぶために用いられうるが、該生成物は補因子、または阻害剤
、特に競合阻害剤として、あるいはまた本発明によるポリペプチドの活性に対し
てのアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性を有するものとして相互作用を行
う。好ましくは、前記形質転換された細胞またはトランスジェニック動物をモデ
ルとして用いるが、それは特に本発明のＲＨ１１６ポリペプチドの発現レベルま
たはＲＮＡヘリカーゼ活性を減退させることができる化合物を選ぶためである。

【００６８】分析モデルとしてのそれらの使用に加え、本発明による細胞や哺乳類を、以下
に説明するような、本発明によるポリペプチドの生産方法において用いることも
可能である。組換えの形式で本発明のポリペプチドを生産する方法は、それ自体
が本発明に含まれるものであるが、その特徴は、形質転換した細胞、特に本発明
の細胞の培養を、本発明による核酸配列によってコードされた組換えポリペプチ
ドが発現し、かつ場合に応じて分泌することを可能にするような条件の下で行う
ことであり、また前記組換えポリペプチドを回収することでもある。この生産方
法によって得られることのできる組換えポリペプチドもまた、本発明の一部であ
る。該ポリペプチドは、グリコシル化された、またはグリコシル化されていない
形で現れ、また天然タンパク質の三次構造を呈することも、また呈さないことも
ある。組換えポリペプチドの配列はまた修飾されてもよく、それにより特に水性
の溶剤における溶解性を改善する。そのような修飾は当業者に周知のもので、例
えば疎水性ドメインの欠失、疎水性アミノ酸の親水性アミノ酸への置換がある。

【００６９】これらのポリペプチドを、当業者に周知の組換えポリペプチド生産技法によっ
て、以上に規定された核酸配列から生産してもよい。この場合、使用する核酸配
列はシグナルの制御下に置かれ、該シグナルは細胞宿主における該ポリペプチド
の発現を可能にする。

【００７０】組換えポリペプチド生産の効率的なシステムは、本発明によるベクターと宿主
細胞の準備を必要とする。これらの細胞を得られるようにするのは、以上に規定
したベクターに挿入されたヌクレオチド配列の宿主細胞への導入であり、ついで
、前記細胞を、トランスフェクションしたヌクレオチド配列の複製および／また
は発現を可能にするような条件の下で培養することである。

【００７１】組換えポリペプチドを精製するために用いられる方法は、当業者に周知のもの
である。組換えポリペプチド精製は、細胞の溶解産物か抽出物から、あるいは培
地の上澄みから行われることができ、用いられる方法は、分画法、クロマトグラ
フィー法、特異的なモノクローナル抗体あるいはポリクローナル抗体を用いるイ
ムノアフィニティー技法などを単独で、または組み合わせて使用してもよい。好
ましい変異体は、「キャリア」タンパク質（キメラタンパク質）に融合した組換
えポリペプチドを生成したものからなる。このシステムの利点は、組換え産物の
タンパク質加水分解の安定化および減退、インビトロでの再生中の溶解性の増大
、および／また融合の相手が特異的なリガンドに親和性を有する場合の精製の単
純化、などを可能にすることである。

【００７２】本発明によるポリペプチドは、周知の多くのペプチド合成の一つを使っての化
学的合成、例えば固体相を用いる技法（特にＳｔｅｗａｒｔｅｔａｌ．，１
９８４参照）、または部分的固体相を用いる技法や、断片の濃縮、または従来の
溶液での合成によっても得ることができる。化学的合成によって得られ、かつ対
応する天然ではないアミノ酸を含むポリペプチドも、本発明に含まれる。

【００７３】本発明はまた、モノクローナルまたはポリクローナル抗体とその断片に関する
ものであり、それらは本発明によるポリペプチドに選択的におよび／または特異
的に結合することを特徴とするものである。キメラ抗体、ヒト化抗体、そして一
本鎖抗体もまた、本発明の一部をなす。本発明による抗体の断片は、好ましくは
Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２またはＦｖの断片であることが望ましい。

【００７４】本発明によるポリペプチドにより、モノクローナルまたはポリクローナル抗体
を用意することが可能になる。モノクローナル抗体は、有利には１９７５年にＫ
ｏｈｌｅｒｅｔＭｉｌｓｔｅｉｎによって記載された技法による、ハイブリ
ドーマから調製することができる。

【００７５】ポリクローナル抗体の調製は、例えば動物に、特にマウスに、免疫応答のアジ
ュバントを組み合わせた本発明によるポリペプチドで免疫性を与え、ついで、免
疫性を与えられた動物の血清に含まれた特異的な抗体を、抗原として用いられた
ポリペプチドを前もって固定させたアフィニティーカラム上で精製することによ
ってできる。本発明によるポリクローナル抗体の調製はまた、本発明によるポリ
ペプチドを前もって固定したアフィニティーカラム上で精製することによっても
できる。

【００７６】本発明のある特定の実施例によると、その抗体はＲＨ１１６ポリペプチドと、
それが結合するＲＮＡ配列との間の相互作用を抑制することができるが、それに
より前記ＲＨ１１６ポリペプチドの生理機能を弱める。

【００７７】本発明はまた、本発明によるポリペプチドの検出および／または精製方法にも
関するものであり、本発明による抗体を用いることを特徴とする。本発明はさら
にまた、精製されたポリペプチドを含み、本発明による方法によって得られるこ
とを特徴とする。

【００７８】更に、ポリペプチドの精製のためにそれらを用いる他にも、本発明の抗体、特
にモノクローナル抗体は、生物サンプルにおいてこれらポリペプチドを検出する
ためにも用いられ得る。

【００７９】このような様々な用途のため、本発明の抗体を、本発明の核酸プローブについ
て前述したものと同じ方法で、および好ましくは酵素タイプ、蛍光タイプまたは
放射性タイプの標識法で、標識する。

【００８０】本発明の抗体はまた、例えば免疫蛍光法、金標識、酵素免疫複合体による、本
発明のポリペプチドの発現を解析する手段を構成する。更に一般的には、本発明
の抗体を、本発明によるポリペプチドの発現が観察されるべきあらゆる状況にお
いて、そして更に具体的には免疫細胞化学、免疫組織化学または「ウェスタンブ
ロッティング」の実験において好適に使用することができる。

【００８１】それらの実験により、生物の組織または試料における、これらポリペプチドの
異常な発現を実証することが特に可能になる。

【００８２】更に一般的には、本発明の抗体を、有利にはあらゆる状況において使用するこ
とが可能であるが、この場合、本発明によるポリペプチドの発現は、正常でも突
然変異でも、観察されなければならない。したがって、生物サンプルにおける本
発明によるポリペプチドの検出方法は、生物サンプルを本発明による抗体と接触
させ、また形成された抗原−抗体複合体を実証するという手順からなるが、それ
もまた本発明の一つの対象である。

【００８３】また、本発明の範囲に含まれるのは、ある生物サンプルにおける本発明による
ポリペプチドの検出および／または解析のための試薬キットであり、その特徴は
：（ｉ）上述したようなモノクローナルまたはポリクローナル抗体、（ｉｉ）場
合によっては、免疫反応に好都合な培地を構成するための試薬、（ｉｉｉ）免疫
反応によって生成される抗原−抗体複合体を検出する試薬、という要素からなる
ことを特徴とする。このキットは特にウェスタンブロッティングの実験を行うの
に用いられる；これら実験により、組織または細胞からの本発明によるポリペプ
チドの発現の調節を研究することが可能になる。このキットはまた、本発明によ
るポリペプチドと相互作用するタンパク質を特に実証するための免疫沈降実験で
も用いられる。このキットはまた、本発明によるポリペプチドの検出および／ま
たは解析を行うのにも用いられるが、そこではＥＬＩＳＡ法、免疫蛍光法、放射
性免疫法（ＲＩＡ技法）またはそれと同等の技法を含む方法が用いられる。

【００８４】本発明はまた、ある生物サンプルにおける、本発明によるポリヌクレオチドを
検出および／または解析する方法であって、以下の手順を含むことを特徴とする
：それは（ｉ）分析すべき生物サンプルからＤＮＡを単離すること、もしくは生
物サンプルのＲＮＡからｃＤＮＡを得ること；（ｉｉ）プライマーを用いて本発
明によるポリペプチドをコードするＤＮＡを特異的に増幅すること；（ｉｉｉ）
増幅産物を分析することである。本発明はまた、生物サンプルにおける、本発明
による核酸の検出および／または解析のためのキットを提供することも対象とし
ており、以下の要素を含むことを特徴としている：それは（ｉ）本発明による一
対の核酸プライマー、（ｉｉ）ＤＮＡ増幅反応を行うのに必要な試薬、そして、
場合によっては（ｉｉｉ）増幅された断片の配列を検証することを可能にする構
成要素、より具体的には本発明によるプローブである。

【００８５】本発明はまた、生物サンプルにおいて、本発明による核酸を検出および／また
は解析する方法を含み、以下の手順を有することを特徴とする：それは（ｉ）生
物サンプルと本発明によるポリヌクレオチドを接触させること、（ｉｉ）前記ポ
リヌクレオチドと生物サンプルの核酸との間に形成されたハイブリッドを検出お
よび／または分析することである。本発明がまた対象とするのは、生物サンプル
において、本発明による核酸の検出および／または解析を行うためのキットを提
供することであって、以下の要素を含むことを特徴としている：それは（ｉ）本
発明によるプローブ、（ｉｉ）ハイブリダイゼーション反応を行う為に必要な試
薬、および／または場合によっては、（ｉｉｉ）本発明による一対のプライマー
、ならびにＤＮＡ増幅反応の為に必要な試薬である。

【００８６】好ましくは、検出と解析を行う本発明による生物サンプルは、例えばヒトまた
は動物の血清または血液のような体液、またはバイオプシーからなるものである
。

【００８７】同様に本発明の一部をなすのは、対立遺伝子変異性、突然変異、欠失、ヘテロ接
合度の喪失、あるいは本発明によるポリペプチドをコードする遺伝子の遺伝異常
の測定方法であり、本発明による核酸配列、ポリペプチドあるいは抗体を使用す
ることを特徴とするものである。

【００８８】これら突然変異を直接検出できるのは、本発明による核酸および配列（ＲＮＡ
またはｃＤＮＡ）を解析することによるが、本発明によるポリペプチドを介して
も可能である。特に、突然変異を有するエピトープを認識する本発明による抗体
の使用は、「健康な」タンパク質と「病理に関連する」タンパク質との間の区別
を可能にする。

【００８９】この診断および／または予後評価の方法は、予防的に、あるいは患者の臨床状
態を明らかにしおよび／または確認することに役立つように用いてもよい。解析
は、遺伝子（即ちエキソン）の全部または一部のシークエンシングによって実施
しても、あるいは当業者に周知の他の方法によって実施してもよい。特に使用し
うるのは、ＰＣＲに基づく方法で、例えばＰＣＲ−ＳＳＣＰは、点突然変異の検
出を可能にする。同様に実施しうる解析は、本発明によるプローブを、本発明に
よるポリヌクレオチドを少なくとも一つ含むＤＮＡチップに固定させること、も
しくはこれらマイクロプレートでハイブリダイゼーションを行うことによる。本
発明による配列を含むＤＮＡチップもまた、本発明の対象の一つである。

【００９０】同様に、本発明によるアミノ酸配列を含むタンパク質チップもまた、本発明の
対象の一つである。そのようなタンパク質チップにより、本発明によるポリペプ
チドと、他のタンパク質または化学化合物との間の相互作用の研究が可能になり
、そして本発明によるポリペプチドと相互作用する化合物をスクリーニングする
のに用いることもできる。本発明によるタンパク質チップは、患者の血清に本発
明によるポリペプチドに対する抗体が存在するのを検出するためにも使用できる
。本発明による抗体を含むタンパク質チップも使用できる。

【００９１】物質を試験、および識別するのは、本発明のポリペプチドの酵素活性を調節す
る能力についてである。「酵素活性を調節する物質」という表現は、試験すべき
物質がない場合に測定した酵素活性と比べ、酵素活性を変える物質を指す。例え
ばこのような物質は、ＲＮＡヘリカーゼ活性の一部または全部を抑制することが
でき；このような活性は、当業者に周知の方法で測定可能である。例えば、合成
オリゴヌクレオチドを一つの基質に固定し、そして標識した相補的オリゴリボヌ
クレオチドとハイブリダイズさせることができる。ハイブリダイズしたオリゴリ
ボヌクレオチドを、次いで本発明のポリペプチドと共に用いるが、該ポリペプチ
ドは、基質に付着していない、標識された、一定の測定可能な量のオリゴヌクレ
オチドを、ＲＮＡヘリカーゼ活性を前提にして塩析させる。本発明のＲＨ１１６
ＲＮＡヘリカーゼの潜在的な修飾因子、またはその一断片の有無による効果をそ
のように試験できる。もう一つの別のやり方は、Ｊａｒａｍｉｌｌｏｅｔａ
ｌ．（１９９１）により記載されたプロトコルを用いることからなり、；この方
法は、³²Ｐで標識した二本鎖ＲＮＡ基質と、本発明のポリペプチドとを緩衝溶液
において混合することで；反応は、グリセロール／ＳＤＳ／ＥＤＴＡ／ブロモフ
ェノールブルーの混合物を添加することによって止まり、該混合物をつぎに、標
準的な条件で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（８％）で調製する。ＲＮＡヘリカーゼ活
性が評価されるのは、二本鎖ＲＮＡの量に対する一本鎖ＲＮＡの量の比率による
。他のプロトコルも使用可能である（Ｒｏｚｅｎｅｔａｌ．（１９９０）；
Ｐａｕｓｅｅｔａｌ．（１９９２）;Ｌａｉｎｅｔａｌ．（１９９３）
，ＬｅｅｅｔＨｕｒｗｉｔｚ（１９９３））。これら解析はマイクロプレー
トで行われ、それにより本発明によるポリペプチドの大量の修飾因子、および／
または阻害剤の試験を同時に行うことが可能である。

【００９２】そのような物質は分子モデリングすることにより前もって明らかにし、選択さ
せておくこともでき、それにより本発明のポリペプチドと反応できる物質を識別
する。ＡＴＰ、あるいはＲＮＡ、ＤＮＡまたはＲＮＡ／タンパク質複合体のよう
な他の物質と結合する本発明のタンパク質の能力に影響を与える物質を識別する
ことは可能である。本発明のタンパク質の基質結合部位と、あるいは、そのよう
な機能のエピトープに影響を与える部位を妨害する基質は、当業者に周知の方法
で識別することが可能である（詳しくはＦｒｕｅｈｌｅｉｓｅｔａｌ．（１
９８７）；Ｐｅｒｕｎｅｔａｌ．（１９８９）；ＶａｎＤｅＷａｔｅｒ
ｂｅｅｍｄ（１９９４），Ｂｌｕｎｄｅｌｌ（１９９６）参照）。

【００９３】それゆえ本発明は、本発明によるＲＨ１１６ポリペプチドの細胞発現レベルお
よび／またはＲＮＡヘリカーゼ活性に影響を与えうる化合物のスクリーニング方
法に関するものであり、該方法は以下の手順、（ｉ）本発明の宿主細胞から選ん
だ細胞と、本発明によるポリペプチドを発現または含有する真核細胞の、好まし
くはヒトの細胞とを、前記細胞に浸透するか、あるいは導入される可能性のある
一つまたは複数の潜在的化合物もしくはリガンドと接触させること、および（ｉ
ｉ）細胞発現レベルおよび／またはＲＮＡヘリカーゼ活性を検出および／または
測定することからなる。宿主細胞または真核細胞、好ましくはヒトの細胞に存在
する、本発明によるポリペプチドをコードする遺伝子は、少なくとも本発明のそ
のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に対応しており、好ましくは
ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡの形態であり、ヒトＲＨ１１６遺伝子の、またはマ
ウスなどの動物種の相同遺伝子のプロモーター配列に機能的に連結されている。
そのような方法でスクリーニングされ、およびＲＨ１１６ＲＮＡヘリカーゼの発
現レベルに影響を与える可能性のある化合物は、好ましくは本発明によるポリペ
プチドを天然にコードする遺伝子の（プロモーター、上流配列、「エンハンサー
」、「サイレンサー」、「インスレーター」等の）調節ポリヌクレオチド配列と
相互作用する可能性のある化合物、または本発明によるポリペプチドをコードす
る遺伝子の転写の調節に関わる転写因子（基本転写因子または組織特異的因子）
と相互作用する可能性のある化合物であり、それにより本発明のＲＨ１１６ポリ
ペプチドをコードする遺伝子の転写に影響する、つまり前記遺伝子の転写を増大
させ、減少させ、調整し、もしくはなくす可能性のある複合体を形成する。転写
活性を検出および／または測定する技法は、当業者に周知である。特に言及すべ
きは、ノーザンブロッティング法とＲＴ−ＰＣＲ技術であり、これらは、プロー
ブあるいはプライマーとしてそれぞれに使用される本発明のポリペプチドと実行
可能なものである。

【００９４】本発明はまた、本発明によるポリペプチドのＲＮＡヘリカーゼ活性に影響を与
える可能性のある化合物をスクリーニングする方法に関係するものであり、それ
は以下の手順、（ｉ）前記ポリペプチドを、ＲＮＡヘリカーゼ活性を実現させる
のに必要な試薬の存在下で、一つまたは複数の潜在的な化合物またはリガンドと
接触させること、および（ｉｉ）ＲＮＡヘリカーゼ活性を検出および／または測
定すること、からなる。

【００９５】好ましい実施例においては、以上に記載した化合物をスクリーニングする方法
は、前記スクリーニングされた化合物が、本発明のＲＨ１１６ポリペプチドの発
現レベルおよび／またはＲＮＡヘリカーゼ活性を減退させ、あるいは消滅させる
ことを特徴とする。以上に記載した方法を用いて得られ、かつ本発明のＲＨ１１
６ポリペプチドの発現レベルおよび／またはＲＮＡヘリカーゼ活性を減退させる
化合物は、ＲＨ１１６のアンタゴニストであり、また本発明の目的の一つともな
っており；この化合物の特徴は、アンチセンス核酸配列として使用される本発明
によるポリヌクレオチド、本発明によるアンチセンス発現ベクター、本発明によ
る抗体、そしてムラミルペプチド、好ましくはムラブチド、または本発明による
ポリペプチドの他のあらゆるアンタゴニストから選ばれることである。

【００９６】実際、本発明のＲＨ１１６ポリペプチドおよびその断片の生物活性の一部また
は全部をブロックすることは、ウイルス複製を阻害あるいは消滅させる手段を構
成する。すなわち、スプライシングされていないゲノムＲＮＡと、ＨＩＶのよう
なレトロウイルスの不完全にスプライシングされたｍＲＮＡは、パッケージング
および／または翻訳のために、細胞質へと移出する必要がある。このようなプロ
セスを仲介するのは、単純なレトロウイルスの為のＣＩＳで作用する輸送配列（
ＣＩＳ作用の構成的な輸送配列またはＣＴＥ）によるか、あるいは、ＨＩＶのよ
うな複合レトロウイルスのための応答配列（ＲＲＥのＲｅｖ応答配列）とＴＲＡ
ＮＳで作用するＲｅｖウイルスタンパク質による。本発明によるＲＨ１１６ＲＮ
Ａヘリカーゼは、ＣＴＥの補因子を構成し、またＰＲＥが媒介する遺伝子発現に
おける役割をも果たし、ならびにＨＩＶ複製においても役割を果たす能力がある
。

【００９７】したがって本発明が提案するのは、本発明のポリペプチドのＲＮＡヘリカーゼ
活性を部分的または全体的にブロックする可能性のある化合物を提供することで
、それによりウイルス複製を減少または消滅させる。その中で特に言及すべきは
、アンチセンス核酸配列として使用される本発明によるポリヌクレオチド、本発
明によるアンチセンス発現ベクター、本発明による抗体、ムラミルペプチド、好
ましくはムラブチド、もしくは本発明によるポリペプチドの他のあらゆるアンタ
ゴニストである。好ましくは、ムラミルペプチドとムラブチドは、ＨＩＶ陽性患
者の細胞においてＲＨ１１６のアンタゴニストを構成する。

【００９８】本発明は、ＨＩＶウイルスのみに限定されるものではなく、その複製において
ＲＮＡヘリカーゼを直接または間接に伴うウイルス全体に限定するものである。
ウイルスという用語は、エンベロープのある、あるいはない、一本鎖または二本
鎖の、ＤＮＡまたはＲＮＡウイルスを指す。好ましくは、ウイルスは、レトロウ
イルス科、オルトミクソウイルス科、ラブドウイルス科、ブニヤウイルス科、ア
デノウイルス科、ヘパドナウイルス科、ヘルペスウイルス科またはポックスウイ
ルス科に属するものである。好ましくは、ヘパドナウイルスはＢ型肝炎ウイルス
またはＣ型肝炎ウイルスである。

【００９９】本発明のポリペプチドの生物活性は、ウイルスＲＮＡの転写後調節のみに限定
されるのではなく、一般のＲＮＡの転写調節にも貢献している。したがって、本
発明のポリペプチドが構成するのは、他の正常なあるいは異常な生物学的プロセ
スに関与するＲＮＡヘリカーゼ活性を弱める能力のある化合物にとっての有益な
療法標的である。

【０１００】ＲＮＡヘリカーゼは、癌を治療する目的の化合物にとっての選択の標的となる
。実際、科学論文の様々な記事では、ＲＮＡヘリカーゼの腫瘍形成への関与を論
じている。したがって、ＤＥＡＤ−ｂｏｘ１（ＤＤＸ１）タンパク質の過剰発現
が、神経芽細胞腫（Ｎｂ）と網膜芽細胞腫のような腫瘍の進行においてある役割
を果たす（Ｇｏｄｂｏｕｔｅｔａｌ．１９９８）が、それは癌細胞のＲＮＡ
の正常な二次構造と発現レベルとを損なうことによる。他のＲＮＡヘリカーゼが
、直接または間接に腫瘍形成に関与してきた。したがってネズミｐ６８タンパク
質は、紫外線に誘発され、腫瘍に突然変異し；すなわちＤＤＸ６ＲＮＡヘリカ
ーゼ遺伝子は、Ｂ細胞リンパ腫を伴う染色体の切断点に位置している。同様に、
ＤＤＸ１０とヌクレオポリンＮＵＰ９８を有するキメラタンパク質は、幾つかの
骨髄性疾患の病因に関連しているようである。それゆえ、ＲＨ１１６のＲＮＡヘ
リカーゼ活性を減退あるいはなくす能力のある化合物は、癌の予防または治療の
処置を目的とする有益な化合物となる。ＲＨ１１６のアンタゴニスト化合物で治
療可能な癌の中でも、特に言及すべきは、以下に上げるがそれに限定するもので
はない：腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、神経膠腫または奇形
癌、そして、更に具体的に副腎癌、膀胱癌、骨癌、骨髄癌、乳癌、消化管癌、肝
臓癌、肺癌、膵癌、卵巣癌、子宮癌、精巣癌、前立腺癌そして咽喉癌である。

【０１０１】同様に、ＲＨ１１６のＲＮＡヘリカーゼ活性を減退あるいはなくす能力のある
化合物は、それゆえ、以下の他の病の予防または治療処置を目的とした有益な化
合物をなすが、該病とは例えばリウマチ、遺伝疾患、関節炎、アテローム性動脈
硬化症、骨粗鬆症、急性または慢性感染症、自己免疫疾患、糖尿病、ならびに移
植の際の臓器拒絶に関連する問題である。更に具体的には、本発明はＡＩＤＳ（
後天性免疫不全症候群）をも含む免疫および自己免疫疾患に関するものである。

【０１０２】阻害剤、アンタゴニストおよびＲＨ１１６のＲＮＡヘリカーゼ活性を減退ある
いはなくす能力のある他の化合物は、自己免疫疾患の予防または治療の処置にと
って有益な化合物となる。実際、Ｔａｋｅｄａｅｔａｌ．（１９９９）によ
って最近報告されたところによると、ＲＮＡヘリカーゼＡは、全身性エリテマト
ーデスを患う患者において自己抗原として作用する。したがって、アンチセンス
核酸配列として用いられる本発明によるポリヌクレオチド、本発明によるアンチ
センス発現ベクター、本発明による抗体、ムラミルペプチド、そして好ましくは
ムラブチド、あるいは本発明によるＲＨ１１６ポリペプチドの他のあらゆるアン
タゴニストを、自己免疫疾患の治療処置に用いることが可能である。自己免疫疾
患の中でも、特に言及すべきは、ぶどう膜炎、ベーチェット病、サルコイドーシ
ス、シェーグレン症候群、慢性関節リウマチ、若年性関節炎、フィサンジェ−ル
ロイ−ライター症候群、痛風、変形性関節症、全身性エリテマトーデス、急性播
種性エリテマトーデス、多発性筋炎、心筋炎、原発性胆汁性肝硬変、クローン病
、潰瘍性結腸炎、多発性硬化症およびその他の脱髄性疾患、再生不良性貧血、血
小板減少性紫斑病、多発性骨髄腫およびＢリンパ腫、シモンズ症汎下垂体機能低
下症、バセドウ−グレイブス病およびバセドウ病眼病、亜急性甲状腺炎および橋
本病、アジソン病、インスリン依存性糖尿病（Ｉ型）、アジソン病、成人呼吸窮
迫症候群、アレルギー、貧血、喘息、自己免疫性溶血性貧血、気管支炎、アトピ
ー性皮膚炎、肺気腫そして偶発性リンパ球減少症である。

【０１０３】本発明のもう一つの実施例においては、本発明の化合物のスクリーニング方法
は、前記スクリーニングされた化合物が、本発明のＲＨ１１６ポリペプチドの発
現レベルおよび／またはＲＮＡヘリカーゼ活性を増進させることを特徴とする。
このようにスクリーニングされた化合物は、本発明の目的の一つでもあるが、本
発明によるポリペプチドのアゴニストとなる。本発明の方法によって得ることが
可能なアゴニスト化合物の中でも、特に言及すべきは、ムラミルペプチドで、好
ましくはムラブチドであり；実際、本発明者等が実験によって実証したところに
よると、後者の化合物、すなわちムラブチドは、健康なドナーの細胞においてＲ
Ｈ１１６の発現レベルを増大させ、そうして本発明のポリペプチドのアゴニスト
として機能する。

【０１０４】もう一つの実施例においては、本発明は、本発明によるポリペプチドの機能活
性に影響を与える能力のある化合物のスクリーニング方法を含んでいる。このよ
うな方法は、次の手順、（ｉ）核および／またはミトコンドリアのＲＮＡスプラ
イシング反応、ＲＮＡ編集反応、ｒＲＮＡプロセッシング反応、翻訳開始反応、
核ｍＲＮＡの細胞質への移出反応、そしてｍＲＮＡ分解反応の中から選んだ一つ
の反応を実現するのに必要な試薬の存在下で、前記ポリペプチドを一つまたは複
数の潜在的リガンドと接触させること、そして（ｉｉ）前記反応の検出および／
または測定をすることからなる。この方法によって得られる可能性のあるスクリ
ーニングされた化合物もまた、本発明の範囲に入る。

【０１０５】それゆえ本発明は、以下、本発明による抗体、本発明によるポリペプチド、本
発明によるポリヌクレオチド、本発明によるオリゴヌクレオチド、本発明による
ベクター、本発明によるアンチセンス発現ベクター、本発明による細胞、そして
本発明による様々なスクリーニング方法を用いて、薬品として、そして特に薬品
の活性原理として、得ることが可能な化合物、から選ばれることを特徴とする化
合物に関係するものであり；このような化合物は、薬学的に受け入れ可能な腑形
剤と組み合わさった、優先的に溶解可能な形態にすることとする。薬学的に受容
可能な腑形剤という表現では、注入できる組成物、すなわち希釈剤または懸濁剤
、例えば生理食塩水または緩衝食塩水を調製するのに従来用いられるあらゆるタ
イプの腑形剤を指す。好ましくはこれら化合物が投与されるのは、全身から、特
に静脈投与、筋肉投与、皮内投与または経口投与による。それらの最適な投与方
法、薬量および薬剤の形態が決定されるのは、患者に相応しい処置の確立を考慮
した一般的な基準になされるが、それは例えば、患者の年齢または体重、病状全
般の重篤性、治療への耐性および観察される副作用等である。

【０１０６】好ましくは、薬品としての本発明の化合物が目的とするのは、癌、ＨＩＶまた
はＢ型またはＣ型肝炎ウイルスによる感染症のような急性または慢性感染症、遺
伝性遺伝子疾患、免疫および自己免疫疾患、リウマチ、関節炎、アテローム性動
脈硬化、骨粗しょう症そして糖尿病からなるグループから選択された病の予防お
よび／または治療、そして臓器移植の拒絶反応の予防である。

【０１０７】本発明の薬品としての化合物の中でも、ＲＨ１１６ポリペプチドのアンタゴニ
スト化合物は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）または肝炎のようなウイルス
性の病変の治療を目的とした薬品の調製用に特に好まれる。

【０１０８】本発明の目的の一つはまた、ウイルス病、しかも特にＡＩＤＳまたは肝炎の予
防および治療の処置のための、薬学的組成物を提供することでもあって、該組成
物の特徴は、ＲＨ１１６ポリペプチドのアンタゴニスト化合物と、薬学的に受け
入れ可能な腑形剤を、治療上効果のある量含んでいることである。更に具体的に
本発明がまた目指すのは、抗ウイルス治療、好ましくは抗ＨＩＶ治療において同
時に、別々に、あるいは時間とともに分割して使用するための組み合わせ製品と
して、少なくとも一つのＲＨ１１６アンタゴニスト化合物と少なくとももう一つ
の他の抗ウイルス剤とを含む製品を供給することである。この他の抗ウイルス剤
は、好ましくは次に列挙するもの、（ｉ）例えば、３’−アジド−３’−デオキ
シチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’，３
’−ジデオキシシチジン（ｄｄＣ）、（−）２’，３’−ジデオキシ−３’−チ
アシチジン（３ＴＣ）、２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミ
ジン（ｄ４Ｔ）、（−）２’−デオキシ−５−フルオロ−３’−チアシチジン（
ＦＴＣ）、ＴＩＢＯ、ＨＥＰＴ、ＴＳＡＯ、α−ＡＰＡ、ネビラピン、ＢＡＨＰ
、ホスホノホルム酸（ＰＦＡ）のような逆転写酵素のヌクレオチドまたは非ヌク
レオチド阻害剤と、（ｉｉ）インジナビルやサキナビルのようなウイルスプロテ
アーゼ阻害剤から選ばれる

【０１０９】もう一つの実施例によれば、本発明の範囲内には、本発明によるＲＨ１１６ポ
リペプチドの発現または活性の増大に関連する疾患の治療または予防の処置の方
法を提供することにもある。この方法には、本発明のポリペプチドのアンタゴニ
ストの治療上効果のある量を、そのような処置を必要とする患者に投与すること
を含む。

【０１１０】本発明はまた、病の予防的処置を目的とする薬品の調製用の、本発明によるポ
リペプチド、本発明によるポリヌクレオチド、本発明によるＲＨ１１６ポリペプ
チドのアンタゴニスト化合物の使用にかかわる。実際、ワクチンは一般的に感染
もしくは疾患に対する免疫を誘発するが、それは患者において、感染もしくは疾
患に関連するある特異的な抗原に対する免疫反応を引き起こすことによる。しか
ながら、多くの場合、精製された抗原は、弱い免疫原である。そのような場合に
は、免疫反応を増大させるために、アジュバントまたは免疫刺激剤のような免疫
調節薬を用いなければならない。しかしながら、現在用いられている多くのアジ
ュバントの欠点の一つは、その毒性である。それゆえ現実に必要とされているの
は、特異的な免疫反応を増大させることができる新規な化合物を識別することで
あり；それは本発明において提案されていることである。実際、本発明のポリペ
プチドとポリヌクレオチド、そして本発明によるＲＨ１１６ポリペプチドのアゴ
ニスト化合物を、患者におけるワクチンへの免疫反応を引き起こし、または増大
させる目的の薬品調製のために、用いてよい。

【０１１１】本発明の他の特徴と利点は、以下に示す例を伴う説明において明らかになる。
これらの例においては、以下の図を参照されたい。

【０１１２】図１：ＲＨ１１６をコードするｃＤＮＡの３’末端を得るために用いられる方
法上部の短い断片は、ＤＤ−ＲＴＰＣＲで得られる１６４ｂｐの最初の断片で
あり、本発明のＲＨ１１６ポリペプチドをコードするｃＤＮＡの３’領域に対応
する。この１２６０ｂｐの、より長い断片は、３’ＲＡＣＥの後に得られるもの
である（下の線）。

【０１１３】図２：ＲＨ１１６をコードするｃＤＮＡの５’領域を得る方法（Ａ）５’末端部分が得られるのは、ＲａｐｉｄＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏ
ｎｏｆｃＤＮＡＥｎｄｓ、すなわちｃＤＮＡ末端の急速増幅（５’ＲＡＣ
Ｅ）のための、二度のＰＣＲ反応の後であり、得られた断片は（．．．．）（Ｒ
３）および（----）（Ｒ８）で表される。したがってこの方法により、本発明者
等は８５３個のアミノ酸のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ：ｏｐｅｎ
ｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ）を得ることができる。ＲＴ−ＰＣＲのためのプラ
イマーの役割を果たすオリゴヌクレオチドＨＥＬＩ１およびＨＥＬＩ２が示
されている。（Ｂ）ＲＨ１１６ポリペプチドに対応するｃＤＮＡの５' 末端部分
は、プライマーＲ１６からのＰＣＲ反応（５'ＲＡＣＥ）の後に得られた。９６
４ｂｐの得られた断片は、破線（----）で表される。

【０１１４】図３：ヒトＲＮＡヘリカーゼＲＨ１１６と推定されるアミノ酸配列とＲＮＡヘ
リカーゼ（ＲＩＧ−１）と推定されるものとの比較（Ａ）「ＤＥＡＤ−ＢＯＸ」タンパク質ファミリーのＡＴＰ依存ＲＮＡヘリカ
ーゼと推定されることを特徴とする高度に保存されたアミノ酸の領域の図示であ
る。保存されたモチーフ（「ｘ」は任意のアミノ酸を指す）は四角く囲まれ、Ｓ
ＡＴモチーフでは、−Ａ−は高度に保存されたアミノ酸であり、ＳとＴは、いず
れの個々の場合においても任意のアミノ酸とも置き換え可能である（Ｌｕｋｉｎ
ｇｅｔａｌ．，１９９８）。モチーフＶＩにおいて、（Ｘ）_1-2は、アミノ
酸２個のいずれかを指す。（Ｂ）ＲＨ１１６タンパク質のアミノ酸配列は、ｃＤ
ＮＡ配列（アクセッション番号ＥＭＢＬＡＹ０１７３７８）から導き出され
た。「ＤＥＡＤ−ＢＯＸ」タンパク質ファミリーの特徴をなす保存された６つの
モチーフは、太字で示されている。（Ｃ）１０２５ａａのオープンリーディング
フレーム（クローン１０．５）（上部の配列）とＳＵＮＹ．Ｗ．によって記載
されたヒトＲＮＡヘリカーゼ（ＲＩＧ−１）（アクセッション番号ＡＦ０３８９
６３）（下部の配列）との配列のアラインメント。配列の相同は、二つの配列の
中間の列に示されている。四角く囲まれた配列は、ＲＮＡヘリカーゼの保存され
たドメインに対応しており；ドメインＧ−ＧＫＴとＤＥＸＨは、ＡＴＰアーゼド
メインに対応しており、ＲＮＡヘリカーゼに特有のドメインＳＡＴ（−Ａ−）お
よびＲＧＲ−Ｒ（ＧＲ−−Ｒ）は、標的ＲＮＡの結合とアンフォールディングを
担っている。

【０１１５】図４：多様なヒト組織におけるＲＨ１１６メッセンジャーＲＮＡの発現のノー
ザンブロットによる分析（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）脳（１）、心臓（２）、骨格筋（３）、結腸（４）、胸腺（５）、脾臓（６）
、腎臓（７）、肝臓（８）、小腸（９）、胎盤（１０）、肺（１１）、そして末
梢血白血球（１２）から得たポリＡ＋ＲＮＡを、ＲＨ１１６メッセンジャーＲＮ
Ａ由来で、およびリン³²Ｐでその末端を標識したオリゴヌクレオチドプローブと
ハイブリダイズさせた（図の上部）。同等の量のポリＡ＋ＲＮＡもまた、コント
ロールとして用いられるβ−アクチン（β−ａｃｔｉｎ）プローブとハイブリダ
イズさせた（図の下部）。心臓と骨格筋には同時に、二つの形態のβ−アクチン
メッセンジャーＲＮＡ、２ｋｂの形態および１．６−１．８ｋｂの形態が存在す
る。このサイズの違いは、メッセンジャーＲＮＡの分解によるものではなく、ア
クチンのα形態またはγ形態の、プローブとのハイブリダイゼーションによるも
のである（メーカーＣＬＯＮＴＥＣＨ社からの指示参照）。

【０１１６】図５：内因性感染およびＣＤ８を消耗したＰＢＭＣにおけるムラブチド（Ｍｕ
ｒａｂｕｔｉｄｅ）によって誘発されるＲＨ１１６メッセンジャーＲＮＡの発現
の抑制ＰＨＡによって活性化されおよびＣＤ８を消耗したＰＢＭＣを、６ないし２４
時間、ムラブチドの無い状態（培地（ｍｅｄｉｕｍ））もしくは１０μｇ／ｍｌ
のムラブチドのある状態で、培養を維持する。（Ａ）ＲＮＡサンプル（２０、１
００および５００ｎｇ）を、ＲＨ１１６メッセンジャーＲＮＡを検出するために
、一対の特異的なプライマーでＲＴＰＣＲにより増幅する対象とする。構成的
に発現したＧＡＰＤＨメッセンジャーＲＮＡ（内部コントロール）もまた、同じ
サンプル内で増幅する。（Ｂ）ＲＨ１１６メッセンジャーＲＮＡ発現の抑制の割
合平均は、ＨＩＶ−１に感染した５人の患者サンプルにおいて観察された。

【０１１７】図６：Ｕ９３７細胞から得た¹²⁵Ｉヨウ素で標識した細胞抽出物からのＲＨ１
１６タンパク質の免疫沈降（Ａ）全細胞抽出物（Ｔｏｔａｌｅｘｔｒａｃｔｓ）（１、２）または核抽
出物（Ｎｕｃｌｅａｒｅｘｔｒａｃｔｓ）（３、４）を標識し、正常な血清（
１、３）またはＲＨ１１６_1-335タンパク質に対して得られたネズミ血清（２、
４）から精製された２０μｇの免疫グロブリンを用いて免疫沈降させた。サンプ
ルを８％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードした。（Ｂ）細胞分画の質はウェスタ
ンブロットによる分析で検証するが、それには全体抽出物（１）および／または
核抽出物（２）における、ゴルジ装置の５８ｋＤａタンパク質（細胞質タンパク
質）に対する抗体（Ａｎｔｉ−Ｇｏｌｇｉ）と、抗ヒストン１（核タンパク質）
抗体（Ａｎｔｉ−Ｈｉｓｔｏｎｅ）とが用いられる。

【０１１８】図７：ＨｅＬａ−ＣＤ４＋細胞におけるＲＨ１１６タンパク質の免疫局在メタノールで固定したＨｅＬａ−ＣＤ４＋細胞は、正常なネズミ血清（Ａ）、
抗ヒストンＨ１モノクローナル抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ社）（Ｂ）、または
ＲＨ１１６_1-335タンパク質に対するネズミ抗血清（Ｃ）で培養し、およびＦＩ
ＴＣと結合したヤギの抗マウスＩｇＧ抗体、および／またはヨウ化プロピジウム
で染色する。免疫蛍光法が示すのは、緑のＦＩＴＣ染色（１）、ヨウ化プロピジ
ウムに対応する赤の核の対比染色（２）、そして二重染色（３）である。

【０１１９】図８：トランスフェクションされ、かつＨＩＶ─１_LAIウイルスに感染したＨ
ｅＬａＣＤ４＋細胞によるウイルス抗原Ｐ２４の発現ＨｅＬａＣＤ４＋細胞は一時的にトランスフェクションされるが、一方では
、プラスミドｐＥＧＦＰ（ＧＦＰ）または、ＲＨ１１６またはＳＳＡのｃＤＮＡ
をそれぞれクローニングしたプラスミドｐＥＧＦＰ（それぞれＧＦＰ−ＲＨ１１
６およびＧＦＰ─ＳＳＡ）で行われ、他方では、プラスミドｐＣＲ３、あるいは
ＴａｔをクローニングしたプラスミドｐＣＲ３（ｐＣＲ３−Ｔａｔ）で行われる
が；それら細胞を２４時間後にＨＩＶ─１_LAIウイルスに感染させる。細胞の感
染後二日目から、培地を毎日、五日目まで回収する。

【０１２０】ウイルス複製の評価は、（５×１０⁵細胞／ｍｌで標準化した細胞濃度の）細
胞によるＰ２４抗原を、ＧＦＰ、ＧＦＰ−ＲＨ１１６またはＧＦＰ−ＳＳＡでト
ランスフェクションした細胞（Ａ）、およびｐＣＲ３またはｐＣＲ３−Ｔａｔで
トランスフェクションした細胞（Ｂ）の培養上澄みで塩析することによって行う
。（Ｃ）は感染し、ＧＦＰ−ＲＨ１１６、ＧＦＰ−ＳＳＡまたはＴａｔでトラン
スフェクションした細胞の、それぞれ対応するコントロール（ＧＦＰまたはｐＣ
Ｒ３それぞれ）と比較したときのＰ２４抗原の増大を示す。結果が対応するのは
、５回の（ＧＦＰ−ＲＨ１１６およびＧＦＰ−ＳＳＡ）および３回の個別実験（
ｐＣＲ３−Ｔａｔ）について得られた平均値±標準偏差である。

【０１２１】図９：ＨＩＶ─１_LAIウイルスに感染し、またトランスフェクションしたＨｅ
Ｌａ−ＣＤ４＋細胞におけるウイルスＤＮＡとメッセンジャーＲＮＡの発現を示
す半定量的ＲＴＰＣＲＲＮＡサンプル（５００、１００、２０および４ｎｇ）は、特異的なプライマ
ーでのＲＴＰＣＲ増幅の対象であり、それによりＲＨ１１６、ＳＳＡ−５６ま
たはＴＡＴタンパク質をコードするｍＲＮＡの過剰発現を検出する（Ａ）。ＲＮ
Ａサンプルは、ウイルスｍＲＮＡを検出する（Ｂ）ために、ＲＴＰＣＲ増幅を
受けるが、それはスプライシングされていないＧＡＧまたはＰＯＬのｍＲＮＡを
検出するための一対のプライマーＧＡＧ０４−ＧＡＧ０６、および中間のサイズ
で一か所スプライシングされたウイルス転写産物を検出するための一対のプライ
マーＢＳＳ／ＫＰＮＡを用いて行う。これらメッセンジャーＲＮＡは、それらが
含むエキソン（ｅｘｏｎ）、およびそれらが産生するタンパク質に基づいて名づ
けられた（Ｎｅｕｍａｎ，１９９４）。（Ｃ）全ＤＮＡを感染後２４時間抽出し
、様々な濃度（１５０、３０、６および１．２ｎｇ）を、一対のプライマーＧＡ
Ｇ０４−ＧＡＧ０６を用いてのＰＣＲ増幅の基質として用いるが、それによりＨ
ＩＶ─１のＧＡＧ遺伝子を検出する。同等の細胞を、β─アクチン（β−ａｃｔ
ｉｎ）またはＧＡＰＤＨ遺伝子の増幅により決定する。

【０１２２】図１０：コントロールの健常者と抗レトロウイルス治療の前後のＨＩＶ感染患
者におけるＲＨ１１６タンパク質に対する自己抗体の検出水平のバーは、算術平均値を示している。

【０１２３】例

【０１２４】材料と方法

【０１２５】１．細胞と培養条件（ＬＡＢＯＲＡＴＯＩＲＥＤＥＶＩＲＯＬＯＧＹ，Ｌｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃ
ｅのＨＵＢＥＲ博士によって提供される）ＨｅＬａ−ＣＤ４＋細胞とＵ９３７細
胞はそれぞれの培養を、ＤＭＥＭ培地またはＲＰＭＩ１６４０培地で行うが、両
培地は、熱により不活性化した１０％のウシ胎児血清（ＬＩＦＥ−ＴＥＣＨＮＯ
ＬＯＧＩＥＳ−ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ，Ｃｅｒｇｙ−Ｐｏｎｔｏｉｓｅ，Ｆｒａ
ｎｃｅ）、２ｍＭのＬ−グルタミン（ＬＩＦＥ−ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ−Ｉ
ＮＶＩＴＲＯＧＥＮ，Ｃｅｒｇｙ−Ｐｏｎｔｏｉｓｅ，Ｆｒａｎｃｅ）および１
％のゲンタマイシン（ＳＨＥＲＩＮＧ−ＰＬＯＵＧＨ，Ｌｅｖａｌｌｏｉｓ−Ｐ
ｅｒｒｅｔ，Ｆｒａｎｃｅ）を補われている。

【０１２６】２．ヒトの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の調製静脈血をＨＩＶ─１に血清反応陽性の患者から採取し、そして末梢血単核細胞
（ＰＢＭＣ）をＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（ＡＭＥＲＳＨＡＭＰＨＡＲＭ
ＡＣＩＡＢＩＯＴＥＣＨ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）に基づく遠心分離
により単離する。細胞を丁寧に洗浄して血小板を除去し、そして抗ＣＤ８抗体で
覆った電磁球（ＤＹＮＡＬ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）を用いてＣＤ８＋細胞を
消耗させる。メーカーのプロトコルの実行により得られた消耗したＰＢＭＣは、
フローサイトメトリーによる分析の後、３％未満のＣＤ８＋細胞を含む。続いて
細胞を、熱により不活性化した１０％のＡＢ血清（ＥＴＡＢＬＩＳＳＥＭＥＮＴ
ＤＥＴＲＡＮＳＦＵＳＩＯＮＳＡＮＧＵＩＮＥ，Ｌｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃ
ｅ）を補ったＲＰＭＩ１６４０で培養し、つぎにフィトヘマグルチニン（ＰＨ
Ａ）で刺激する（５μｇ／ｍｌで３日間）。つぎに、ＰＢＭＣを、ムラブチド（
Ｎ─アセチル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−グルタミン−ｎ−ブチルエステル
）（ＩＳＴＡＣＳＡ，Ｌｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅによって提供される）（１０
μｇ／ｍｌ）、およびインターロイキン２（ＩＬ−２）（１０μｇ／ｍｌ）の存
在下または不在下で、６ないし２４時間、培養してから、回収する。

【０１２７】３．「ディファレンシャルディスプレイ−ＲＴ−ＰＣＲ」（ＤＤ−ＲＴ−ＰＣ
Ｒ）実験前述したようにＤＤ−ＲＴ−ＰＣＲを、ＨＩＶ─１患者から得たＰＨＡの活性
化とＣＤ８の消耗をしたＰＢＭＣからの全ＲＮＡ抽出物で実施する（Ｌｉａｎｇ
ｅｔＰａｒｄｅｅ，１９９２に幾らか修正を加えた）。簡潔には、１ｍｇの
全ＲＮＡを、７５℃で１０分間、２ｍＭのオリゴ（ｄＴ）プライマー、Ｔ₁₂ＢＡ
（ＢはＧ、Ｔ、Ｃの混合物）、Ｔ₁₂ＶＴ（ＶはＡ、Ｇ、Ｃの混合物）、Ｔ₁₂ＨＧ
（ＨはＡ、Ｃ、Ｔの混合物）、Ｔ₁₂ＤＣ（ＤはＡ、Ｇ、Ｔの混合物）、そしてリ
ボヌクレアーゼのない水と共に、最終的な体積が１１μｌの状態で培養した。つ
ぎに相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、ＲＮアーゼＨスーパースクリプト逆転写酵素
（ＬＩＦＥ−ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ−ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ，Ｃｅｒｇｙ−
Ｐｏｎｔｏｉｓｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて合成するが、それは１０ｍＭのジチ
オスレイトール、２０μｍのｄＮＴＰを含む２５μｌにおいて３７℃で１時間行
い、その後に９５℃で１０分間変性させる。合成したｃＤＮＡをつぎに増幅する
が、それは、一ユニットのＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄポリメラーゼ（ＡＰＰ
ＬＩＥＤＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ，Ｕｎｉｔｅ
ｄ−Ｓｔａｔｅｓ）、２．５ｍＭのＭｇＣｌ₂、２μＭのｄＮＴＰ、および２μ
Ｃｉの³³Ｐ−ｄＡＴＰ(ＡＭＥＲＳＨＡＭＰＨＡＲＭＡＣＩＡＢＩＯＴＥＣ
Ｈ)で、つぎのような特異的な下流のプライマーと上流のランダムプライマーを
用いて行う：ＡＰ０：ＴＡＴＣＧＡＣＴＣＣＡＡＧ（ＳＥＱＩＤＮ
ｏ２７）；ＡＰ１：ＴＴＡＧＣＴＡＧＣＡＴＧＧ（ＳＥＱＩＤＮｏ
２８）；ＡＰ２：ＴＧＣＴＡＡＧＡＣＴＡＧＣ（ＳＥＱＩＤＮｏ２
９）；ＡＰ３：ＴＴＧＣＡＧＴＧＴＧＴＧＡ（ＳＥＱＩＤＮｏ３０
）；ＡＰ４：ＴＧＴＧＡＣＣＡＴＴＧＣＡ（ＳＥＱＩＤＮｏ３１）
；ＡＰ５：ＴＧＴＣＴＧＣＴＡＧＧＴＡ（ＳＥＱＩＤＮｏ３２）；
ＡＰ６：ＴＧＣＡＴＧＧＴＡＧＴＣＴ（ＳＥＱＩＤＮｏ３３）；Ａ
Ｐ７：ＴＧＴＧＴＴＧＣＡＣＣＡＴ（ＳＥＱＩＤＮｏ３４）；ＡＰ
８：ＴＡＧＡＣＧＣＴＡＧＴＧＴ（ＳＥＱＩＤＮｏ３５）；ＡＰ９
：ＴＴＡＧＣＴＡＧＣＡＧＡＣ（ＳＥＱＩＤＮｏ３６）；ＡＰ１０
：ＴＣＡＴＧＡＴＧＣＴＡＣＣ（ＳＥＱＩＤＮｏ３７）；ＡＰ１１
：ＴＡＣＴＣＣＡＴＧＡＣＴＣ（ＳＥＱＩＤＮｏ３８）；ＡＰ１２
：ＴＡＴＴＡＣＡＡＣＧＡＧＧ（ＳＥＱＩＤＮｏ３９）；ＡＰ１３
：ＴＡＴＴＧＧＡＴＴＧＧＴＣ（ＳＥＱＩＤＮｏ４０）；ＡＰ１４
：ＴＡＴＣＴＴＴＣＴＡＣＣＣ（ＳＥＱＩＤＮｏ４１）；ＡＰ１５
：ＴＡＴＴＴＴＴＧＧＣＴＣＣ（ＳＥＱＩＤＮｏ４２）；ＡＰ１６
：ＴＴＡＴＣＴＡＴＡＣＡＧＧ（ＳＥＱＩＤＮｏ４３）；ＡＰ１７
：ＴＴＡＴＧＧＴＡＡＡＧＧＧ（ＳＥＱＩＤＮｏ４４）；ＡＰ１８
：ＴＴＡＴＣＧＧＴＣＡＴＡＧ（ＳＥＱＩＤＮｏ４５）；ＡＰ１９
：ＴＴＡＧＧＴＡＣＴＡＡＧＧ（ＳＥＱＩＤＮｏ４６）。増幅パラ
メーターは、９４℃で１分、４０℃で１分、７２℃で１分、その後７２℃で５分
の最終伸長の手順が続く。ＰＣＲ産物をつぎに、６％ポリアクリルアミド─８Ｍ
尿素ゲルでの電気泳動により分離する。乾燥後、ゲルをつぎにＨｙｐｅｒｆｉｌ
ｍ−ＨＰフィルムにさらす。差次的に発現したｃＤＮＡバンドを、ゲルから切除
し、１００μｌの滅菌水に溶離し、沈殿させ、それから１０μｌの滅菌水で再懸
濁させる。ｃＤＮＡ断片をついで再増幅するが、それには以上に記載した同じプ
ライマー対を用いて行い、ついで、クローニングベクターＴＯＰＯＴＡＰＣ
ＲＩＩ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ，Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ，ＴｈｅＮｅｔｈｅｒ
ｌａｎｄｓ）にクローニングする。

【０１２８】４．ＤＮＡ配列：クローニングされたｃＤＮＡは、ＡＰＰＬＩＥＤＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社製
の「ＰＲＩＳＭＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎＤｙｅＤｅｏｘｙＴｅｒ
ｍｉｎａｔｏｒ」シークエンスキットを用いてシークエンスするために基質とし
て使用した。サンプルを、ＡＢＩ３７７ＤＮＡシークエンサーで電気泳動にかけ
るが；該配列は、ＡＰＰＬＩＥＤＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社製のＡＢＩＰｒｉ
ｓｍソフトウエア，ｖｅｒｓｉｏｎ２．２．１を用いて自動的に読み取られ、
そして記録される。ヌクレオチドデータバンクにおける相同性検索は、Ｂａｓｉ
ｃＬｏｃａｌＡｌｉｇｎｍｅｎｔＳｅａｒｃｈＴｏｏｌ(ＢＬＡＳＴ)プ
ログラムを用いて行われた。

【０１２９】５．遺伝子発現検出のための半定量的ＲＴＰＣＲ：ＲＮＡｐｌｕｓキット(Ｑ−ＢＩＯｇｅｎｅ，Ｉｌｌｋｉｒｃｈ，Ｆｒａｎｃ
ｅ) を用いて抽出した全細胞ＲＮＡは、ＤＮアーゼＩで前処理される。ポリＡ＋
ＲＮＡ上の第一鎖の合成は、ｐ（ｄＴ）₁₅プライマー（ＢＯＥＲＨＩＮＧＥＲ
ＭＡＮＮＨＥＩＭ，ＲＯＣＨＥＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＳ，Ｆｒａｎｃｅ）で開
始され、そしてモロニーマウス白血病ウイルス(Ｍ−ＭＬＶ)(ＰＲＯＭＥＧＡ，
Ｍａｄｉｓｏｎ，ＣＡ，ＵＳＡ) 由来の逆転写酵素によって実行した（３７℃で
１時間、９２℃で３分）。結果としてのｃＤＮＡをつぎに、ＡｍｐｌｉＴａｑ
ＧｏｌｄポリメラーゼＤＮＡ（ＡＰＰＬＩＥＤＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ）での反
復増幅に２５から３５回かける。ＧＡＰＤＨ配列のＰＣＲ増幅を行い、それによ
り内部コントロールが得られるようにする。特異的なオリゴヌクレオチドプライ
マーは次の通りである：ＧＡＰＤＨ［センス鎖：５’−ＧＣＣＡＴＣＡＡＴＧＡＣＣＣＣＴＴＣＡＴＴＧＡＣ−３’（ＳＥＱＩＤＮｏ１９）
；アンチセンス鎖：５’−ＴＧＡＣＧＡＡＣＡＴＧＧＧＧＧＣＡＴ
ＣＡＧＣＡＧ−３’（ＳＥＱＩＤＮｏ２０）］、ＲＨ１１６［センス鎖：
５’−ＧＧＡＡＧＴＡＣＡＡＴＧＡＧＧＧＣＣＴＡＣＡＡＡ−３
’（ＳＥＱＩＤＮｏ１３）；アンチセンス鎖：５’−ＴＣＣＴＣＡＧＴ
ＣＣＴＡＧＴＡＴＡＴＴＧＣＴＣＣ−３’（ＳＥＱＩＤＮｏ１４
）］、ＳＳＡ−５６［センス鎖：５’−ＧＡＡＡＧＡＧＡＧＧＴＣＧＣ
ＡＧＡＧＧＣＣＴＧＴ−３’（ＳＥＱＩＤＮｏ４７）；アンチセンス
鎖：５’−ＴＧＡＴＡＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＡＧＧＧＡＡＡＴＧ
−３’（ＳＥＱＩＤＮｏ４８）］、Ｔａｔ（センス鎖：５’−ＣＴＡＧＡ
ＣＣＣＣＴＧＧＡＡＧＣＡＴＣＣＡ−３’（ＳＥＱＩＤＮｏ４９
）；アンチセンス鎖：５’−ＴＣＧＧＧＣＣＴＧＴＣＧＧＧＴＣＣＣＣＴＣ−３’（ＳＥＱＩＤＮｏ５０））。

【０１３０】全ＰＣＲ産物をつぎに、２％のアガロースゲルで分離し、ついでエチジウムブ
ロマイド染色により視覚化する。映像化装置（ＩＭＡＧＥＭＡＳＴＥＲ１ＤＰＲＩＭＥ，ＡＭＥＲＳＨＡＭＰＨＡＲＭＡＣＩＡＢＩＯＴＥＣＨ）を用
いて、メッセンジャーＲＮＡ発現の割合の変化が、前述したように、対応する内
部標準のレベルに対する標準化を行った後で推定された（Ａｍｉｅｌｅｔａ
ｌ．，１９９９）。

【０１３１】６．完全長ｃＤＮＡのクローニング：完全長ＲＨ１１６ｃＤＮＡのクローニングは、ＳＭＡＲＴ（登録商標）ＲＡ
ＣＥｃＤＮＡ増幅キット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ，Ｕ
ＳＡ）を用いて、ＣＤ８を消耗した健常者のＰＢＭＣからのポリＡ＋ＲＮＡサン
プルで実行した。さらに、ヒト脾臓ライブラリー（λＴｒｉｐｌＥＸ（登録商標
）ＬｉｂｒａｒｙＣＬＯＮＴＥＣＨ）を、メーカーの指示に従って、リン³² Ｐで標識した特異的なプローブでスクリーニングした。

【０１３２】７．ノーザンブロッティング分析：ノーザンブロッティング分析は、メーカーの指示に従って、「Ｍｕｌｔｉｐｌ
ｅＴｉｓｓｕｅＮｏｒｔｈｅｒｎ」キット（ＭＴＮ（登録商標））（ＣＬＯ
ＮＴＥＣＨ）を用いて行われた。ポリＡ＋ＲＮＡをバイブリダイズするのは、オ
リゴヌクレオチド５’−ＣＧＴＧＣＴＧＡＴＴＣＣＴＣＡＧＴＣＣ
ＴＡＧＴＡＴＡＴＴＧＣ−３’（ＳＥＱＩＤＮｏ２６）および５’−
ＧＣＡＴＣＴＧＣＡＡＴＧＧＣＡＡＡＣＴＴＣＴＴＧＣＡＴ
ＧＧＣ−３’（ＳＥＱＩＤＮｏ１８）によるが、該オリゴヌクレオチドは、
ＲＨ１１６ｃＤＮＡ配列由来で、また末端をリン³²Ｐで標識したものである。膜
は、ヒトβ−アクチンｃＤＮＡプローブと再びハイブリダイズさせた。

【０１３３】８．Ｈｉｓ−Ｔａｇで標識したタンパク質の発現とマウスのポリクローナル抗
体の作成：ＲＨ１１６メッセンジャーＲＮＡの第一の３３５個のアミノ酸に対応する部分
的断片は、特異的なオリゴヌクレオチド（ＳＥＱＩＤＮｏ２１とＳＥＱＩ
ＤＮｏ２２）を用いて増幅し、そして前もってＢａｍＨＩとＳａｌＩ酵素によ
って切断された、ベクターｐＱＥ−８１（ＱＩＡＧＥＮ，Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕ
ｆ，Ｆｒａｎｃｅ）にサブクローニングした。結果としてのプラスミドｐＱＥ−
８１−Ｈｉｓ６−ＲＨ１１６_1-335を、つぎに大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’細胞へと形
質転換する。形質転換した細胞を、つぎに培養して、１ｍＭのイソプロピル−１
−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシドで、５時間誘導する。変性条件下での精製
は、メーカーの推奨により、Ｎｉ─ＮＴＡビーズ（ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｉｓｔ（登録商標）ＱＩＡＧＥＮＥ）を用いて行う。

【０１３４】ＲＨ１１６_1-335の部分的に組換えられたタンパク質（５０μｇ）を、完全な
フロイントアジュバント（ＳＩＧＭＡ，Ｓａｉｎｔ−Ｌｏｕｉｓ，ＭＩ，ＵＳＡ
）に乳化させ、腹腔内注射してマウスを免疫化する。その動物を、３０日後に不
完全なフロイントアジュバント（ＳＩＧＭＡ）に乳化した同じ組換えタンパク質
５０μｇにより、さらに１５日後にアジュバントのない同じタンパク質５０μｇ
により刺激する。血清を回収するのは最後の刺激から１０日後で、そして抗ＲＨ
１１６抗体のレベルを試験する。つぎに免疫グロブリンを、カプリル酸を用いる
方法（ＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｔＡｕｄｒａｎ，１９６９）に従って抗血清か
ら精製し、そして飽和した硫酸アンモニウムでの沈殿により濃縮する。免疫化の
前に、血清を回収して、ネガティブコントロールとして用いる。抗血清と免疫グ
ロブリンの活性を、以下に述べるように、ＥＬＩＳＡ法で試験する。

【０１３５】９．間接蛍光抗体法による解析: 間接蛍光抗体法による解析については、ＨｅＬａ−ＣＤ4 ＋細胞をチャンバー
スライド（ＮＡＬＧＥ，Ｎｕｎｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ，ＵＳＡ）で培養
し、−２０℃で１０分間、メタノール／アセトン（２Ｖ／１Ｖ）混合物で固定し
そして透過性を与える。１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳで３
０分間加湿したあと、サンプルを０．５％のＢＳＡを含むＰＢＳで４５分間、室
温で一次抗体と培養する。正常なマウスの血清とＲＨ１１６_1-335に対する抗血
清を、１／２０に希釈して用いるが；そこでアンチヒストン１モノクローナルＩ
ｇＧ２ａ抗体（ＳＡＮＴＡＣＲＵＺＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ，ＵＳ
Ａ）と、このタイプの同位体に対応するコントロールの抗体を１／５０の濃度で
用いる。ＰＢＳでの三回の洗浄の後、サンプルを、ＦＩＴＣ（フルオレイセンイ
ソチオシアネート）（ＳＩＧＭＡ）と結合したヤギの抗マウスＩｇＧ抗体で染色
する。数回の洗浄後、サンプルを０．５μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムを含む
ＰＢＳで３分間培養し、つぎに蛍光顕微鏡で検査する。

【０１３６】１０．亜細胞の分画：亜細胞の分画を、Ｌｉ−Ｒｕｅｔａｌ．（１９９９）により記載されてい
る通りに準備する。簡潔には、細胞の全細胞溶解物を準備するために、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＬｐＨ７．１、１ｍＭＥＤＴＡ、１％トリトンＸ−１０
０、１ｍＭＰＭＳＦ、１ｍＭＮａ₃ＶＯ₄、１０μＭＥ−６４（トランス−
エポキシ−サクシニル−Ｌ−ロイシルアミド−（４−グアニジノ）−ブタン）、
１μｇ／ｍｌのペプスタチン、および０．１％のアプロチニンを含む緩衝液で細
胞を溶解する。核分画の準備には、細胞ペレットを、低張緩衝液（２０ｍＭＨ
ＥＰＥＳｐＨ７．４、１ｍＭＭｇＣｌ₂、１０ｍＭＫＣｌ、０．５％のＮ
ｏｎｉｄｅｔＰ４０、０．５ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１ｍＭ
ＰＭＳＦ、１ｍＭＮａ₃ＶＯ₄、１０μＭＥ６４、１μｇ／ｍｌペプスタチン
、そして０．１％のアプロチニン）で３０分間、４℃で培養する。遠心分離の後
、結果として生じた、核を含むペレットを、イオン強度の高い緩衝液（１ｍＭ
ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４、２０％グリセロール、０．４ＭＮａＣｌ、１ｍＭ
ＭｇＣｌ₂ 、１０ｍＭＫＣｌ、０．５ｍＭＤＴＴ、１ｍＭＰＭＳＦ、１ｍ
ＭＮａ₃ＶＯ₄、１０μＭＥ６４、１μｇ／ｍｌペプスタチン、１０μｇ／ｍ
ｌロイペプチン、そして０．１％のアプロチニン）で再び懸濁させる。分画の質
は、ヒストン１（ＳＡＮＴＡＣＲＵＺＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ）（核タ
ンパク質）、および５８Ｋゴルジタンパク質（ＳＩＧＭＡ）（細胞質タンパク質
）に対するモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティング法で制御する
。

【０１３７】１１．ウェスタンブロッティング法による分析細胞溶解物を、１００℃で５分間培養した２×ＳＤＳローディングバッファー
と混合し、つぎに１５％ポリアクリルアミドＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでの電気泳動
によって分離し、そして最後にはニトロセルロース膜（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｃ−Ａｍ
ｅｒｓｈａｍ）上に移す。膜を５％の無脂肪ミルクを含むＰＢＳ（リン酸緩衝生
理食塩水）で室温で１時間飽和させ、その後で一次抗体（アンチヒストン１抗体
を１／１００に希釈；抗５８Ｋゴルジ抗体を１／１０００に希釈）を４℃で一晩
培養する。ＰＢＳ０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０での洗浄後、膜は、セイヨウワ
サビペルオキシダーゼに結合した二次抗体（１／１０００）（ＳＩＧＭＡ）と室
温で１時間培養する。膜に移したバンドを、強化した化学ルミネセンス試薬（Ｅ
ＣＬ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で培養することにより検出し、そしてＫＯＤＡＫ
ＸＯＭＡＴフィルムに露光する。

【０１３８】１２．免疫沈降それぞれの細胞抽出物の５００μｇは、クロラミンＴ方法を用いて、５００μ
Ｃｉの¹²⁵Ｉヨウ素で放射性同位元素による標識をする。３×１０⁶ＣＰＭの細胞
抽出物を、正常なマウス血清と５０μｌのプロテインＧセファロース（ＰＨＡＲ
ＭＡＣＩＡ）と共に２時間前処理するが、それはＴＮＳＴＥＮ緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．２、０．５ＭＮａＣｌ、０．１％ＳＤＳ、０．
５％トリトンＸ１００、５ｍＭＥＤＴＡ、０．０２％ＮａＮ₃、そして０
．１％のアプロチニン）において行う。免疫沈降は、抗ＲＨ１１６_1-335血清か
ら、または正常な血清と５０μｌのプロテインＧセファロースから精製した、２
０μｇの免疫グロブリンを添加することによって行う。４℃で一晩培養した後、
セファロースビーズをＴＮＳＴＥＮ緩衝液で十回洗浄し、つぎに２Ｘ濃縮ＳＤＳ
−ＰＡＧＥローディングバッファーにおいて再懸濁、ついで沸騰させる。タンパ
ク質は、８％ＳＤＳＰＡＧＥゲル上に分離し、つぎにオートラジオグラフィー
により分析する。

【０１３９】１３．ＤＮＡトランスフェクション：使用されたすべてのプラスミドは、エンドトキシンのない材料（「ＥｎｄｏＦ
ｒｅｅ（登録商標）」、ＧｉｇａＫｉｔ、ＱＩＡＧＥＮ）を用いて調製した。
ＨｅＬａ−ＣＤ４＋細胞における一過性発現のために、ＲＨ１１６ｃＤＮＡを含
むＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ断片を、哺乳類発現ベクターｐＥＧＦＰ−Ｎ１（ＣＬＯ
ＮＴＥＣＨ）にサブクローニングする。結果として生じるキメラ構造物は、グリ
ーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のカルボキシ末端の端に融合した、完全長ＲＨ１
１６タンパク質からなる。ｃＤＮＡの正確なリーディングフレームにおける融合
の制御は、シークエンシングによる。（本発明者等の実験室で得ることが可能な
）ＳＳＡのような任意のタンパク質のコード配列は、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクター
にサブクローニングし（ＧＦＰ−ＳＳＡ）、コントロールとして用いた。ポジテ
ィブコントロールについて、本発明者等が研究したのは、前述したようなｐＣＲ
３にクローニングされたＴａｔの一過性発現の効果であり（Ｂｉｌｌａｕｔ−Ｍ
ｕｌｏｔｅｔａｌ．，２００１）；つまり天然のｐＣＲ３は、対応するコン
トロールとなる。トランスフェクションは、トランスフェクション試薬としてメ
ーカーのプロトコルに従ってＥｆｆｅｃｔｅｎｅ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて行う
。簡潔には、トランスフェクションの前日に、ウェル当たり２×１０⁵個の細胞
を１２ウェルプレートに播種し、ついで三回の実験において、１μｇのＤＮＡと
１０μｌのＥｆｆｅｃｔｅｎｅを用いてトランスフェクションする。細胞は、ト
ランスフェクションの２４時間後にＨＩＶ−１_LAIに感染させる。

【０１４０】１４．インビトロ感染ＨＩＶ−１_LAIに対する親和性をもったＴ細胞株を、ＬａｂｏｒａｔｏｉｒｅｄｅＶｉｒｏｌｏｇｉｅＣｅｎｔｒａｌｅｄｅＬｉｌｌｅ，Ｆｒａｎ
ｃｅから入手した。トランスフェクションした細胞を感染させるために、５×１
０⁴ＣＰＭのウイルス逆転写酵素（ＲＴ）を、各ウェルに加える。細胞を、３７
℃で一晩培養する。つぎにウイルスを除去し、細胞を２度洗浄し、新鮮な培地を
加える。感染の１日後、および次の４日間、上澄みをそれぞれのウェルにおいて
採取し、細胞を回収し、数える。ウイルス複製の評価は、感染の２４時間後のＨ
ＩＶ−１のＤＮＡとＲＮＡの検出により、あるいは、感染の２日から５日後の間
の、上澄みにおけるｐ２４タンパク質の存在の検出により行う。

【０１４１】１５．ＨＩＶ−１のＤＮＡとＲＮＡの検出全細胞ＤＮＡを、感染の２４時間後に、ＨＩＶ−１に感染した細胞から抽出し
、そして「ＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄ」ＤＮＡポリメラーゼで３５回の増幅に
かける。β−アクチン配列のＰＣＲ増幅は、オリゴヌクレオチド５’−ＧＧＧ
ＴＣＡＧＡＡＧＧＡＴＴＣＣＴＡＴＧ−３’（ＳＥＱＩＤＮｏ５
１）および５’−ＧＧＴＣＴＣＡＡＡＣＡＴＧＡＴＣＴＧＧＧ−３
’（ＳＥＱＩＤＮｏ５２）で実行し、それにより細胞間の等価性を標準化す
る。各サンプルのＨＩＶ−１プロウイルスＤＮＡの測定に使うのは、プライマ−
ＧＡＧ０６（５’−ＧＣＩＴＴＩＡＧＣＣＣＩＧＡＡＧＴＩＡＴＡＣＣＣＡＴＧ−３’；ＳＥＱＩＤＮｏ５３）およびＧＡＧ０４（５’−
ＣＡＴＩＣＴＡＴＴＴＧＴＴＣＩＴＧＡＡＧＧＧＴＡＣＴＡ
Ｇ−３’；ＳＥＱＩＤＮｏ５４）である。ＨＩＶ−１のＲＮＡのレベルを測
定するため、全細胞ＲＮＡを、ＲＮＡｐｌｕｓキット（Ｑ−ＢＩＯｇｅｎｅ）を
使って抽出し、次にｒＴｔｈポリメラーゼ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ）を使って増幅を行うが、その際に存在するのは、ＨＩＶ−１のスプライシ
ングされていないＧＡＧ−ＰＯＬｍＲＮＡを検出するための一対のプライマー
ＧＡＧ０６−ＧＡＧ０４であり、また前述したような（Ａｍｉｅｌｅｔａｌ
．，１９９９）一か所スプライシングされたメッセンジャーＲＮＡの中間的なサ
イズを検出するための一対のプライマーＢＳＳ（５’−ＧＧＣＴＴＧＣＴＧＡＩＧＮＧＣＩＣＡＣＩＧＣＡＡＧＡＧＧ−３’；ＳＥＱＩＤＮｏ５５）−ＫＰＮＡ（５’−ＡＧＡＧＴＩＧＴＧＧＴＴＧＮＴＴ
ＣＮＴＴＣＣＡＣＡＣＡＧ−３’；ＳＥＱＩＤＮｏ５６）である。
ＰＣＲ産物の全てを、アクリルアミドゲル上で分離させ、エチジウムブロマイド
染色によって視覚化する。映像システム（ＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒ１ＤＰ
ｒｉｍｅ；ＡｍｅｒｓｈａｍＰＨＡＲＭＡＣＩＡＢＩＯＴＥＣＨ）を使って
、ＨＩＶ−１ＤＮＡとＲＮＡの発現の変化を、対応する標準的な内部コントロー
ル（それぞれＧＡＰＤＨまたはβ−アクチン）に対する標準化の後に推定する。
簡潔には、ＨＩＶＲＮＡレベルを、β−アクチンレベルに標準化するが、それ
にはβ−アクチンの体積に対するＨＩＶのＲＮＡバンドの体積の比率を計算する
ことによる。したがって、ＨＩＶ発現の増加率は、ＲＨ１１６、ＳＳＡまたはＴ
ａｔでトランスフェクションした細胞と、ＧＦＰまたはｐＣＲ３でトランスフェ
クションしたＨｅＬａＣＤ４＋細胞を比較することにより推定される。

【０１４２】１６．ｐ２４試験ウイルス複製の評価を行うのは、ＨＩＶ−１ｐ２４抗原試験キット（Ｃｏｕｌ
ｔｅｒ，Ｍｉａｍｉ，ＵＳＡ）をメーカーの指示に従って用い、培養物の上澄み
におけるｐ２４抗原レベルを測定することによる。

【０１４３】１７．ＨＩＶ陽性患者の血清における自己抗体のＥＬＩＳＡ法による検出ＨＩＶ−１患者の血清におけるＲＨ１１６に対する抗体の存在を評価するため
に、ＨＩＶ−１に感染した３２人の被験者グループを、潜在的抗レトロウイルス
剤による治療の前と後に試験した。グループは女性８人と男性２４人からなり、
（２５から６４歳の範囲で）平均年齢３７歳である。抗レトロウイルス治療を始
める前に、血漿中の平均ウイルス量は、４２１３２６コピー／ｍｌであり、ＣＤ
４＋細胞の平均数（＋標準偏差）は１５０（＋１４）細胞／μｌである。２つの
逆転写酵素阻害剤と一つのプロテアーゼ阻害剤での１４ヶ月の平均的な治療期間
の後、ウイルス量は３２７２コピー／ｍｌの平均レベルに落ち、そしてＣＤ４＋
細胞の数は３１３（＋２３）細胞／μｌまで増加した。患者の血清における抗体
レベルを、対応する性別と年齢のコントロールの健常者４０人の血清に存在する
レベルと比較する。血清におけるＲＨ１１６に対する自己抗体の存在を、ＥＬＩ
ＳＡ法により追求した。簡潔には、プレートを１μｇ／ｍｌのＲＨ１１６_1-335
でコーティングするが、それはコーティング緩衝液（３０ｍＭＮａ₂ＣＯ₃、７
０ｍＭＮａＨＣＯ₃）において３時間４℃で行う。０．０５％のＴｗｅｅｎ−
２０（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）を含むＰＢＳでの三回の洗浄後、プレートを１／３
００から１／２７００に希釈した血清で２時間培養する。つぎにプレートを洗浄
し、ペルオキシダーゼに結合したヒトＩｇＧ抗体（ＳＩＧＭＡ）で４℃で一晩培
養する。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎでの３回の洗浄、およびＰＢＳでの一回の洗浄後、
プレートを３０分間、０−フェニレンジアミン二塩酸塩（ＳＩＧＭＡ）の基質０
．５ｍｇ／ｍｌと、０．１％Ｈ₂Ｏ₂を用いて成長させ、そして反応を、１ＮＨ
Ｃｌの５０μｌ／ウェルの添加により止める。吸光度は、自動マイクロプレート
リーダー（ＴＩＴＥＲＴＥＫＭＵＬＴＩＳＫＡＮ，ＬＡＢＹＳＹＳＴＥＭＳ，
Ｆｉｎｌａｎｄ）を使って、４９２ｎｍで読み取る。同様のプロトコルを用いて
、免疫化したマウスの血清における抗ＲＨ１１６抗体の存在を評価するが、抗ヒ
トＩｇＧ抗体の代わりに抗マウス抗体を結合に用いることは例外である。

【０１４４】例１：ムラブチドにより調節されたＲＨ１１６遺伝子のＤＤ−ＲＴ−ＰＣＲに
よる識別

【０１４５】刺激していないＰＢＭＣからの、そしてムラブチドで刺激した、ＣＤ８を消耗
し、ＨＩＶ−１患者から得たＰＢＭＣからのＲＮＡのサンプルを、ＤＤ−ＲＴ−
ＰＣＲにより分析する。本発明者等は、ＨＩＶ陽性患者のＰＢＭＣをムラブチド
で処理した後、差次的に発現する１３０を越えるｃＤＮＡ断片を選択した。これ
らの断片を、ベクターＰｃｒ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へとサブクローニ
ングし、つぎに自動シークエンス（ＡＢＩＰｒｉｓｍ３７７，Ｐｅｒｋｉｎ
−Ｅｌｍｅｒ）でシークエンスした。配列の分析は、相同性を検索するためであ
り、データバンクとＮＣＢＩのＢａｓｉｃＬｏｃａｌＡｌｉｇｎｍｅｎｔ
ＳｅａｒｃｈＴｏｏｌ（Ｂｌａｓｔ２）サーバーとを用いた。

【０１４６】一定数の遺伝子の発現は、ムラブチドで６ないし２４時間処理した後、正の調
節または負の調節をされているように思われる。これらのうち３つの遺伝子はａ
ｌｕ反復に対応し、２０の配列がＥＳＴまたはゲノムデータバンクの配列に対応
し、そして４９の配列がよく特徴づけられた遺伝子である。ムラブチドで調節さ
れた遺伝子のうち、２８が増大した発現を示し、２１が抑制された発現を有した
。ムラブチドにより正の調節をされた１４の遺伝子と、負の調節をされた７の遺
伝子の発現特性を、ＲＴ−ＰＣＲにより、または他の３患者から得た、ＣＤ８を
消耗したＰＢＭＣのＲＮＡ抽出物での「ドットブロット」の形（データは示され
ていない）での逆ノーザンブロット法により確認した。ムラブチドによる発現の
調節も、ＥＳＴに対応するＤＤ−ＲＴ−ＰＣＲによって識別された配列、または
データバンクのゲノム配列から確認した。したがって、６つのクローンが増大し
た発現を示したが：４つのクローン（クローン１、７１、８７および９９）は６
時間の処理に続いて、２つのクローン（クローン１１と８９）は２４時間の処理
に続いてである。他方で、識別された４の配列は発現の抑制を誘発する：すなわ
ち２つのクローン（クローン７と１０）はムラブチドへの６時間の曝露に続いて
、そして２つのクローン（クローン６２と９６）はムラブチドへの２４時間の曝
露に続いてである。

【０１４７】ムラブチドによって調節され、かつクローン１０に対応する新しい遺伝子の発
現特性を、半定量的ＲＴＰＣＲにより研究し、そして対応する完全長ｃＤＮＡ
をクローニングして特徴付けた。

【０１４８】例２：ムラブチドによって調節されたＲＨ１１６遺伝子の完全長クローニング

【０１４９】クローン１０に対応する完全長ＤＮＡ配列を、５’および３’ＲＡＣＥ方法で
得た。ＤＤＲＴＰＣＲによって得たｃＤＮＡ断片を基に、５’ＲＡＣＥと３’
ＲＡＣＥの第一のサイクルにより、本発明者等が、この新しい遺伝子のポリＡ＋
末端を特徴付け、そしてｃＤＮＡ配列を遺伝子の５’部分で伸長させることがで
きるようになった。ｃＤＮＡの完全な５’末端は、５’ＲＡＣＥの３つの手順を
経て得た。ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングにより、本発明者等が完全長
ｃＤＮＡ配列を確認することが可能になった。完全なヌクレオチド配列を得たの
は、２つの異なるクローンの重複する配列を決定することによる。完全長ｃＤＮ
Ａの配列を、ＧｅｎｅＢａｎｋに提出した（アクセッション番号ＡＹ０１７３
７８）。

【０１５０】更に詳細には、ＤＤ−ＲＴ−ＰＣＲによって得た長さ１６４ｂｐの断片（ＳＥ
ＱＩＤＮｏ３）から、本発明者等は二つの特異的なプライマ−を合成したが
、そこにはＦ１：５’ＴＧＡＴＧＡＧＧＧＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧ
ＡＧＴＡＴＴＧＴＧ３’（ＳＥＱＩＤＮｏ４）が含まれ、それによ
り５’および３’ＲＡＣＥによる第一の増幅を実現するようにする。したがって
本発明者等は、Ｆ１からの増幅により１２８４ｂｐの断片を得ることができた。
この断片は幾つかの手順でシークエンスしたが、それは特異的な内部プライマー
Ｆ２（５’−ＧＣＡＧＴＧＡＧＴＴＣＡＡＡＣＣＣＡＴＧＡＣＡ
ＣＡＧＡＡＴＧ−３’）（ＳＥＱＩＤＮｏ５）およびＲ２：（５’−Ｃ
ＡＧＣＡＴＴＣＴＧＡＡＴＡＧＴＣＡＡＧＡＴＴＧＧＧＡＡ
ＡＴＧ−３’）（ＳＥＱＩＤＮｏ６）を用いることにより；この断片の配
列は、配列ＳＥＱＩＤＮｏ７に対応する。このことが示すのは、潜在的な終
止コドンまでの３８０個のアミノ酸のオープンリーディングフレームであり、該
終止コドンの１１９ｂｐ後に、ポリＡ＋尾部が続く（図１）。

【０１５１】ｃＤＮＡの５’部分を得るために、本発明者等が合成したのは、プライマーＲ
３（ＳＥＱＩＤＮｏ８）であり、それはＦ１に対して相補的な配列に対応し
ており；プライマーＲ３は、ＰＣＲ後に、１９４ｂｐの配列を得ることを可能に
する（図２Ａに点線．．．．で示される）。

【０１５２】この配列から、本発明者等が合成したのは新しいプライマーＲ８（ＳＥＱＩ
ＤＮｏ９）：５’−ＧＴＡＧＧＧＣＣＴＣＡＴＴＧＴＡＣＴＴＣ
ＣＴＣＡＡＡＴ−３’）であり、それにより決定するのはｃＤＮＡの位置５
’における配列であり：ＰＣＲ反応により、約１２００ｂｐの断片（図２ａに破
線−−−−で示される）を得ることが可能になった（ＳＥＱＩＤＮｏ１０）
。断片の完全なシークエンシングを実現するのはいくつかの手順により、それは
内部オリゴヌクレオチドＲ８−ｓｅｑ１（５’ＣＴＣＣＡＡＣＡＣＣＡ
ＧＧＴＧＡＡＧＣＴＧ３’）（ＳＥＱＩＤＮｏ１１）およびＲ８−
ｓｅｑ２（５’ＣＡＧＡＴＧＡＡＧＡＧＡＡＴＧＴＧＧＣＡＧ
３’）（ＳＥＱＩＤＮｏ１２）を用いることによる。リーディングフレーム
はオープンのままであり、それにより８５３ａａのリーディングフレームの識別
が可能になる。

【０１５３】これらの二つの配列から、本発明者等が合成したのは、二つのプライマーＨＥ
ＬＩ１（５’−ＧＧＡＡＧＴＡＣＡＡＴＧＡＧＧＧＣＣＴＡＣ
ＡＡＡ−３’）（ＳＥＱＩＤＮｏ１３）およびＨＥＬＩ２（５’−ｔｃｃｔｃａｇＴｃｃｔａｇｔａｔａｔｔｇｃｔｃｃ−３’）（ＳＥＱＩＤＮｏ１４）であるが、それぞれ断片Ｆ１とＲ３から取って、それにより
対応するｍＲＮＡの差次的な発現の分析のためのＲＴ−ＰＣＲを行う（例４参照
）。

【０１５４】配列ＳＥＱＩＤＮｏ１０から、本発明者等が合成したのは、一つの新しい
プライマーＲ１６（５’−ＣＴＡＡＧＣＡＧＣＴＧＡＣＡＣＴＴＣ
ＣＴＴＣＴＧＣＣＡＡＡＣＴＴＧＴＧＴＣＴＧ−３’）（ＳＥＱ
ＩＤＮｏ１５）であり、それによりｃＤＮＡを５’に戻すようにしたが；ＰＣ
Ｒ反応により、９６４ｂｐ断片（図２ｂで破線（−−−−−）で示される）を得
ることが可能になった。

【０１５５】ＰＣＲ反応（５’ＲＡＣＥ）の後に得られた９６４ｂｐの５’末端は、潜在的
なＡＴＧコドンを含み、それに先行して終止コドンが位置し、その存在は後に確
認されることになる。それゆえこの方法により、本発明者等は１０２５個のアミ
ノ酸のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆ
ｒａｍｅ）を得ることができた。

【０１５６】ＲＨ１１６に対応するｃＤＮＡの完全な配列は、ここでは３３７２ｂｐであり
、ＳＥＱＩＤＮｏ１に対応し、ＳＥＱＩＤＮｏ２に対応する１０２５ａ
ａのタンパク質をコードする。

【０１５７】ＳＥＱＩＤＮｏ１の特異的な二つのプライマ−Ｆ４：（５’−ｇｇｇｃ
ｃｃｔｇｔｇｇａｃａａｃｃｔｃｇｔｃａｔｔｇｔ−３’）（Ｓ
ＥＱＩＤＮｏ１６）およびＲ１４：（５’−ＣＣＡＧＡＧＴＧＧＣＴ
ＧＴＴＴＡＣＡＴＴＧＣＣＡＡＧＧＡＴＣＡＣＴ−３’）（ＳＥ
ＱＩＤＮｏ１７）を用いるＰＣＲ方法が開発されたのは、ＡＴＧ翻訳開始コ
ドンの存在、ならびにそのコドンの上流における終止コドン（ＴＧＡ）の存在を
確かめるためである。そのため、本発明者等は、以上に述べた二つのプライマー
を用いて５’ＲＡＣＥ基質でＰＣＲを行い、またクローニングおよびシークエン
スされた、期待したサイズの断片を得た。この断片の配列により確認されたのは
、開始コドンであるＡＴＧコドンの前にＴＧＡコドンが存在することであり、そ
のようにして、本発明者等はｃＤＮＡの完全なコピーを得たことを確認した。

【０１５８】ｃＤＮＡ配列（３３７２の塩基対）が含むのは、位置１５５での開始コドン一
つと、３０７５の塩基対のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、ならびに
２１の塩基対のポリＡ＋尾部の２４塩基対上流に位置するコンセンサスポリアデ
ニル化シグナルＡＡＴＡＡＡＡを伴う１４１塩基対の３’非転写領域が一つある
。ＯＲＦは１０２５個のアミノ酸ポリペプチドをコードするが（図２Ｂ）、１１
６ｋダルトンの計算された分子量と５．２の等電点をもつ。

【０１５９】例３：完全長のＲＨ１１６配列とデータベースの配列との比較研究

【０１６０】本発明者等は、１０２５個のアミノ酸の推定されたアミノ酸配列と、データベ
ースに存在する配列とを比較した。

【０１６１】本発明者等が識別したのは、この配列における、ＲＮＡヘリカーゼスーパーフ
ァミリー、より正確には、ＡＴＰ依存ＲＮＡヘリカーゼ機能をもつことが知られ
ているタンパク質ファミリーに属する保存されたドメインである。この配列相同
性に基づくヘリカーゼのクラス（Ｌｕｋｉｎｇｅｔａｌ．，１９９８）の中
にあるのは、「ＤＥＡＤ−ＢＯＸ」と呼ばれるタンパク質である。すべての「Ｄ
ＥＡＤ−ＢＯＸ」ＲＮＡヘリカーゼの一つの重要な特徴は、保存された距離で互
いに間隔をおいて、特徴的なモチーフが存在することである（Ｌｕｋｉｎｇｅ
ｔａｌ．，１９９８；ＬｉｎｄｅｒｅｔＤａｕｇｅｒｏｎ，２０００）。
小さな差異はあるものの、これらモチーフは、クローニングされた新しい配列に
も存在する（図３Ａと３Ｂ）。その点から、本発明者等が考えたことは、ＲＨ１
１６と呼ばれる、このタンパク質（１１６ｋダルトンのＲＮＡヘリカーゼ）が、
ＡＴＰ依存ＲＮＡヘリカーゼの「ＤＥＡＤ−ＢＯＸ」タンパク質のサブファミリ
ーのメンバーを構成することである。本発明者等はまた、アミノ酸の位置３４９
にＫＫＫＫモチーフが存在することにも注目したが、二極性の核局在化シグナル
モチーフＡははっきりと識別されなかった。８か所のＮ−グリコシル化部位が検
出され、潜在的なリン酸化部位が、ｃＡＭＰ依存キナーゼならびにプロテインキ
ナーゼＣについても見いだされた；これら部位の生物学的重要性はまだ研究され
ていない。

【０１６２】データバンクで行われた検索の過程で、本発明者等が注目したのは、ＲＨ１１
６タンパク質が、「ＤＥＡＤ−ＢＯＸ」タンパク質ファミリーのメンバーと全般
的に配列が相同的であることのほかに、仮説上の、および現在のところまだ特徴
付けられておらず、「ＲＩＧ−１」（図３ｂＣ）と呼ばれる、Ｓｕｎ，Ｙ．Ｗ
（Ｇｅｎｂａｎｋ，アクセッション番号：ＡＦ０３８９６３）によって記載され
たヒトＲＮＡヘリカーゼと、高いパーセンテージの相同性を示すことである。配
列のアラインメントは、図３ｂＣに示されている。二つのタンパク質間の全ア
ミノ酸配列の同一性は３１％であり、保存的な交換を含む類似性は４４％である
。

【０１６３】様々なデータバンクの検索により、本発明者等は他の様々なゲノムクローンに
ヌクレオチド配列の一部を見つけることができた。配列の一部分は、アクセッシ
ョン番号ｇｂ／ＡＣ００７７５０で登録されたＮＨ０５７６１１６クローンに見
出され、第二の部分はＮｏＡＣ１０８１７６で登録されたゲノムクローンＲＰ１
１−２１４Ａ４に見出された。また特に言及すべきは、ＥＭＢＬデータバンクに
おいてアクセッション番号ＡＷ５８９５６７、ＡＷ１５２５４１およびＡＷ１８
９５８４で登録されているＥＳＴ（発現した配列タグ）であって、これらそれぞ
れが、配列ＳＥＱＩＤＮｏ１の配列２８７９−３３５０、２８７０−３３５
０および２８１８−３３５０の断片のそれぞれと、１００％、９９％および９７
％の相同性を示していることである。

【０１６４】例４：ＲＨ１１６のｍＲＮＡのさまざまな組織における発現のノーザンブロッ
ティング法による研究

【０１６５】さまざまな組織のポリＡ＋ＲＮＡを試験するのはノーザンブロット法によるが
、用いたのは、末端を標識し、かつＲＨ１１６のｃＤＮＡ配列由来のオリゴヌク
レオチドであり；コード配列に特異的な、ヌクレオチド配列５’−ＧＣＡＴＣ
ＴＧＣＡＡＴＧＧＣＡＡＡＣＴＴＣＴＴＧＣＡＴＧＧＣ−３’
（ＳＥＱＩＤＮｏ１８）およびヌクレオチド配列５’−ＣＧＴＧＣＴＧ
ＡＴＴＣＣＴＣＡＧＴＣＣＴＡＧＴＡＴＡＴＴＧＣ−３’（ＳＥ
ＱＩＤＮｏ２６）を合成し、そして³²Ｐ（Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ，
Ａｍｅｒｓｈａｍ）で標識し、それによりノーザンブロッティング法を実行する
プローブの役目を果たすようにした。２μｇのポリＡ＋ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃ
ｈ）を含む膜のハイブリダイゼーションの結果を図４に示した。

【０１６６】約３．５ｋｂに見積もられたサイズのメッセンジャーＲＮＡに対応する特異的
なシグナルが検出されたが、それは単離したｃＤＮＡ配列が完全長配列であるこ
とを示す（図４）。１２のヒト組織（脳、心臓、骨格筋、結腸、胸腺、脾臓、腎
臓、肝臓、小腸、胎盤、肺および末梢白血球）におけるメッセンジャーＲＮＡの
発現レベルを研究した。放射性シグナルの強度は、脳、結腸、胸腺、小腸および
末梢白血球ではやや下がっているが、非常に強力な放射性シグナルが心臓と腎臓
に現れた。

【０１６７】例５：ムラブチド処理後、または処理のない、ＨＩＶ陽性患者とコントロール
の健常者とのＰＢＭＣｓにおけるＲＨ１１６の差次的な発現のＲＴＰＣＲによ
る研究

【０１６８】ＲＨ１１６のメッセンジャーＲＮＡの発現は、ムラブチドにより抑制される。
本発明者等がさらに研究したのは、ＲＨ１１６メッセンジャーＲＮＡが、ムラブ
チドにより調節された新しい遺伝子なのかどうかであり、その際にＲＨ１１６の
ｃＤＮＡ由来の特異的なオリゴヌクレオチドを用いた半定量的ＲＴＰＣＲを用
いた。

【０１６９】ＨＩＶに感染した患者（Ｐ）の、あるいはコントロールの健康なドナー（Ｃ）
のＰＢＭＣを、単離し、ＣＤ８＋リンパ球を消耗し（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ，Ｄｙ
ｎａｌ）、およびフィトヘマグルチニンＰＨＡ（５μｇ／ｍｌ）で３日間刺激し
た。ついで、条件ごとに最低５．１０⁶個の細胞の割合で、６ないし２４時間、
１０％のウシ胎児血清（ＳＶＦ）を補ったＲＰＭＩ培地で、インターロイキン２
（ＩＬ２）（１０Ｕ／ｍｌ）の存在の下に、ムラブチド（１０μｇ）により、そ
れら細胞を処理し、または処理せずにおいた。処理の後に、細胞のＲＮＡを抽出
し（ＲＮＡｐｌｕｓ，Ｑｕａｎｔｕｍ−ｂｉｏｐｒｏｂｅ）、ついでＤＮアーゼ
（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ）で処理し、そしてＭｕ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｓｕｐｅ
ｒｓｃｒｉｐｔＩＩ，Ｇｉｂｃｏ）の存在下でオリゴ（ｄＴ）を用いて逆転写
（ＲＴ）した。ＲＴの質を検証したのは、ＰＣＲ（２５サイクル）によるが、そ
の際に用いるのは、２０、１００および５００ｎｇの全ＲＮＡからの、ＧＡＰＤ
Ｈに特異的なプライマー、（５’ＧＣＣＡＴＣＡＡＴＧＡＣＣＣＣＴ
ＴＣＡＴＴＧＡＣ３’）（ＳＥＱＩＤＮｏ１９）および（５’ＴＧＡＣＧＡＡＣＡＴＧＧＧＧＧＣＡＴＣＡＧＣＡＧ３’）（ＳＥＱＩＤＮｏ２０）である。つぎに本発明者等は、ＲＴ−ＰＣＲ（３５サイクル
）を行ったが、その際に使用したのは、新しいＲＨ１１６ポリペプチドに特異的
なプライマーＨｅｌｉ１とＨｅｌｉ２（５’ＧＧＡＡＧＴＡＣＡＡＴ
ＧＡＧＧＧＣＣＴＡＣＡＡＡ３’）（ＳＥＱＩＤＮｏ１３）およ
び（５’ＴＣＣＴＣＡＧＴＣＣＴＡＧＴＡＴＡＴＴＧＣＴＣＣ
３’）（ＳＥＱＩＤＮｏ１４）である。増幅のサイクル数は、前もって決定
された（３５サイクル）。増幅した断片を、エチジウムブロマイドが存在するア
ガロースゲル（１％）上で視覚化し、つぎにｐｒｏｇｒａｍｍｅＩｍａｇｅｒ
ｍａｓｔｅｒ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて定量化する。各希釈ごとに、研
究対象の遺伝子についての所与の値を、ＧＡＰＤＨの値と関係づける（割合＝Ｒ
）。各患者および各時間（６時間ないし２４時間）ごとに、ムラブチドで処理し
た細胞のＲを、処理をしていない細胞のＲに関係づける。結果は、処理をしてい
ない細胞に対する遺伝子発現の増加ないし抑制の％で表した。注意すべきは、各
希釈の検査ごとに、Ｒはわずかに変化することがあることであり、複数のＲの平
均は、常に増幅の直線位相にあるように注意して算出されたことである。

【０１７０】この研究は、１２人の患者と１０人のコントロールの健常者について行われた
。患者についての研究により明らかになったのは、６ないし２４時間のムラブチ
ドでの処理後に、ＲＨ１１６遺伝子の発現が、処理をしていない細胞に対して有
意に抑制されたことである。一方で、健康なドナーのＰＢＭＣｓで行った研究に
より明らかにされたことは、ＲＨ１１６遺伝子の発現に非常に有意な増大がある
ことであるが、それは特にムラブチドで処理した６時間後である。

【０１７１】図５は、処理の６および２４時間後に、患者のＰＢＭＣｓについて得られたＲ
Ｔ−ＰＣＲの結果を示している。

【０１７２】ＨＩＶ−１に感染した患者から得たＣＤ８を消耗したＰＢＭＣについて行った
典型的なＲＴＰＣＲは、図５Ａに示されており、またムラブチドで６ないし２
４時間処理した後の、メッセンジャーＲＮＡの発現が有意に抑制されることを示
している。

【０１７３】図５Ｂに示される結果が示すのは、ＲＨ１１６メッセンジャーＲＮＡ発現抑制
の平均割合であり、実証しているのは、５人の患者のＣＤ８を消耗したＰＢＭＣ
をムラブチドで処理すると、ＲＨ１１６メッセンジャーＲＮＡの発現が相当に抑
制されることであり、このときムラブチド処理の６時間後に患者第５号に最大平
均抑制（９０％）が観察されており、そしてこの効果は、２４時間維持可能であ
り、最大平均抑制（５７％）は患者第３号で観察された。

【０１７４】例６：大腸菌システム（ｐＱＥ）における組換えタンパク質の発現

【０１７５】ＰＣＲを行ったのは脾臓ｃＤＮＡであり、ＡＴＧ：ＨｅｌｉＡＴＧ：（５’
−ＴＧＡＧＡＧＧＡＴＣＣＧＡＴＧＴＣＧＡＡＴＧＧＧＴＡＴＴＣＣ３’）（ＳＥＱＩＤＮｏ２１）、およびＳＴＯＰ（５’−ＡＡＴＧＴＣＧＡＣＣＴＡＡＴＣＣＴＣＡＴＣＡＣＴＡＡＡＴＡＡ
−３’）（ＳＥＱＩＤＮｏ２２）に対応するヌクレオチドプライマーを用い
た。

【０１７６】断片を、ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ制限酵素で消化したベクターｐＱＥ８０（Ｑ
ｉａｇｅｎ）にクローニングした。

【０１７７】ＴＯＰ１０Ｆ’バクテリアの形質転換後、組換えタンパク質の発現をＩＰＴ
Ｇで誘発し、発現時間を最適化し２時間と見積もったが、実際には、５時間の誘
発後にも、本発明者等は組換えタンパク質を全く検出できなかった。タンパク質
は弱く発現しており（培養物の５００ｍｌ当たり約５００μｇ）、しかも可溶性
の形を呈している。

【０１７８】例７：真核生物システムにおける組換えタンパク質の発現

【０１７９】「ＲＨ１１６」タンパク質は、哺乳類の細胞の細胞質ないし核に発現するので
、本発明者等は、真核細胞に組換えタンパク質を過剰に発現させる方法を開発し
、それによりＨＩＶの制御における役割を評価した。

【０１８０】そのために、ｃＤＮＡの完全なコピーの増幅に用いたプライマーは、ｈｅｌｉ
−ＧＦＰ−ＡＴＧ（ＸｈｏＩ）（５’−ＴＧＡＧＡＧＣＴＣＧＡＧＡ
ＴＧＴＣＧＡＡＴＧＧＧＴＡＴＴＣＣＡＣＡＧＡＣ−３’）（Ｓ
ＥＱＩＤＮｏ２３）およびＨｅｌｉ−ＧＦＰ（ＢａｍＨＩ）（５’−ＴＧ
ＴＴＴＡＴＴＴＡＧＴＧＡＴＧＡＧＧＡＴＣＧＧＧＡＴＣＣ
ＧＡＴＴＧＡＡ−３’）（ＳＥＱＩＤＮｏ２４）であり；増幅した断片
を、ＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩで消化したベクターｐＥＧＦＰにクローニングし、
それからシークエンスした。「グリーン蛍光タンパク質」（ＧＦＰ）をコードす
るｃＤＮＡは、クローニングした挿入断片の３’に位置づけられた。

【０１８１】更に、ｃＤＮＡの完全なコピーの増幅に用いたプライマーは、ＨｅｌｉＡＴ
ＧＢａｍ（５’−ＴＧＡＧＡＧＧＡＴＣＣＧＡＴＧＴＣＧＡＡＴＧＧＧＴＡＴＴＣＣ−３’）（ＳＥＱＩＤＮｏ２１）およびＨｅｌｉＳＴＯＰＸｈｏＩ（５’−ｔｔｃａａｔｃｔｃｇａｇａｔｃｃｔ
ｃａｔｃａｃｔａａａｔａａａｇａ−３’）（ＳＥＱＩＤＮｏ２
５）であり、増幅した断片を、ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩで消化したベクターｐｃ
ＤＮＡ６にクローニングした。このシステムにおいて、タンパク質は６つのヒス
チジンおよびタンパク質Ｖ５に融合させるが、該タンパク質に対しては、モノク
ローナル抗体が使用できる。

【０１８２】例８：真核細胞におけるトランスフェクション

【０１８３】トランスフェクション実験は、ｃｏｓ−７細胞とＨｅｌａ細胞において実施し
、それに使用したのは、例５で述べたような、ＲＨ１１６ポリペプチドの完全な
配列を含む、組換えプラスミドｐＥＧＦＰとｐｃＤＮＡ６である。

【０１８４】トランスフェクションを行ったのは（Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ−Ｑｉａｇｅｎ）、
１μｇの組換えプラスミドと１０μｌのＥｆｆｅｃｔｅｎｅによる。ＲＴ−ＰＣ
Ｒ分析により、ＲＨ１１６ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの過剰発現を確認
できた。融合した組換えタンパク質の発現の検証は、フローサイトメトリー（Ｇ
ＦＰとの融合）またはウェスタンブロッティング法（Ｖ５−ＨＩＳ６との融合）
で行った。

【０１８５】例９：ＲＨ１１６タンパク質をコードするｃＤＮＡ分子の特徴付け

【０１８６】天然のＲＨ１１６タンパク質分子の特徴付けは、免疫グロブリンを用いて行っ
たが、該免疫グロブリンは、部分的に組換えたＲＨ１１６_1-335タンパク質に対
するマウスの血清を精製したものである。細胞の標識、および免疫沈降は、１３
０から１４０ｋダルトンのタンパク質産物を産生するが、それはコードされたタ
ンパク質の計算された分子量と整合しており、該タンパク質は高度にグリコシル
化されていなければならない。ＲＨ１１６タンパク質は、Ｕ９３７細胞から得ら
れた全細胞溶解物、および核抽出物の濃縮分画で免疫沈降した（図６Ａ）。類似
の結果は、ＨｅＬａ細胞についても得られる（データは示されていない）。図６
Ｂは、亜細胞分画の質の制御を示し、また濃縮された核抽出物を表すが、該抽出
物は、全抽出物におけるヒストン１（３４ｋダルトン）の増大した発現、および
細胞質タンパク質のより少ない発現（約６０ｋダルトンと４０ｋダルトン）を示
している。

【０１８７】例１０：ＲＨ１１６タンパク質の免疫局在の研究

【０１８８】天然のＲＨ１１６タンパク質の細胞局在を調べるため、本研究者等が行ったの
は、ＨｅＬａ−ＣＤ４＋細胞の単層培養での免疫細胞化学実験である（図７）。
ＲＨ１１６_1-335タンパク質に対するマウスの抗体は、ＨｅＬａ−ＣＤ４＋細胞
の細胞質を強く染色する（図７Ｃ）。正常なマウスの血清をネガティブコントロ
ールとして用い（図７Ａ）、そして核の染色を抗ヒストン１モノクローナル抗体
の使用によって観察する（図７Ｂ）。ＲＨ１１６タンパク質の局在もまた、Ｕ９
３７細胞の免疫局在の研究によって確認される（データは公開されていない）。
更に、異なっているのは、ＧＦＰ（ＧＦＰ−ＲＨ１１６）のカルボキシ末端に融
合した完全長ＲＨ１１６タンパク質をコードするキメラｃＤＮＡ構造体によって
トランスフェクションしたＨｅＬａ−ＣＤ４＋細胞におけるＲＨ１１６タンパク
質の細胞内の局在である。実際、トランスフェクションしたＨｅＬａ−ＣＤ４＋
細胞で発現したＧＦＰ−ＲＨ１１６タンパク質の標識は、細胞質と核での局在を
示す（データは示されていない）。この所見は、免疫沈降分析や、ＲＮＡヘリカ
ーゼの「ＤＥＡＤ−ＢＯＸ」タンパク質サブファミリーメンバーの推定上の活性
より、はるかに確実なものである。

【０１８９】例１１：ＲＨ１１６によるＰ２４ウイルスタンパク質の発現の増大

【０１９０】ムラブチドの「ＨＩＶ阻害剤」活性によって発現が抑制される、ＲＨ１１６タ
ンパク質の推定上の役割を解明する目的において、本発明者等が明らかにしよう
と試みたのは、ＲＨ１１６がウイルスの発現の制御におけるある役割を果たせる
かどうかである。したがって、本発明者等が着手したのは、ＧＦＰ−ＲＨ１１６
タンパク質をトランスフェクションされ、かつＨＩＶ−１_LAIウイルスに２４時
間後に感染したＨｅＬａ−ＣＤ４＋細胞によるＰ２４の発現の研究である。

【０１９１】様々な時点での培養物の顕微鏡検査、トリパンブルー染色による分析が明らか
にしたことは、ＧＦＰ−ＲＨ１１６でトランスフェクションした細胞の感染は、
ＧＦＰによってトランスフェクションした細胞やＧＦＰ−ＳＳＡ（関連のないタ
ンパク質）細胞の感染と比較して、細胞の生存率に影響することである。したが
って本発明者等は、５×１０⁵の細胞ごとにＰ２４抗原のレベルを標準化した。
ＧＦＰ、ＧＦＰ−ＲＨ１１６またはＧＦＰ−ＳＳＡを発現するＨｅＬａ−ＣＤ４
＋細胞の上澄みにおけるＰ２４ウイルスタンパク質の発現の研究を、５つの個別
実験で行った。ｐＣＲ３とｐＣＲ３−Ｔａｔで形質転換したＨｅＬａ−ＣＤ４＋
細胞の上澄みにおけるＰ２４ウイルスタンパク質の発現の研究は、３つの個別実
験で行った。図８Ａと８Ｂに示されるのは、得られた結果である。図８Ａが示す
のは、ＧＦＰ−ＲＨ１１６でトランスフェクションしたＨｅＬａ−ＣＤ４＋細胞
の上澄みにおけるＰ２４抗原（ナノグラム／ｍｌ±標準偏差）の発現が、ＧＦＰ
を発現する細胞（第３日と第５日でそれぞれ２．６５±０．５ｎｇ／ｍｌと６９
０±２７２ｎｇ／ｍｌ）と比べ、第３日（１２．１±１．４８ｎｇ／ｍｌ）から
第５日（９７７０±６４８ｎｇ／ｍｌ）まで劇的に抑制されたことである。

【０１９２】ｐＣＲ３−Ｔａｔでトランスフェクションした細胞の上澄みにおけるＰ２４抗
原のレベルは、図８Ｂに（ナノグラム／ｍｌ＋標準偏差）で示されている。予想
された通り、その結果が示すのは、ｐＣＲ３でトランスフェクションした細胞の
第２日（１±０．０８ｎｇ／ｍｌ）および第５日（７４±２２ｎｇ／ｍｌ）に比
べ、第２日（２．２±０．１８ｎｇ／ｍｌ）から第５日（２．９９４±３９１ｎ
ｇ／ｍｌ）までＴａｔでトランスフェクションした細胞によるＰ２４放出の相当
な増大である。図８Ｃは、３または５の個別実験で得られた増加倍率を示してい
る。これらの結果が明らかに示すのは、ＧＦＰ−ＲＨ１１６の過剰発現は、ＧＦ
Ｐ−ＳＳＡの過剰発現（第２日：１．１８±０．２５；第５日：１．３５±０．
３７）に比べて、第２日（３．４３±０．１７）から第５日（１８．２±１０）
まで、Ｐ２４の相当な増大を誘発することであり、また同等な増加がＴＡＴの過
剰発現で得られることである（第２日：３．０±８．４２；第５日：１８．７±
４．２）。

【０１９３】例１２：ＲＨ１１６タンパク質によるウイルスＰ２４ｍＲＮＡの発現調節

【０１９４】ＲＨ１１６の過剰発現に反応してＰ２４の発現が増大するメカニズムを決定す
るために、本発明者等は、トランスフェクションされかつ感染したＨｅＬａ−Ｃ
Ｄ４＋細胞の全ＲＮＡを単離し、つぎに、スプライシングされていない、一か所
スプライシングされた、あるいは中間サイズのメッセンジャーＲＮＡのレベルを
、半定量的ＲＴＰＣＲにより決定した。ＨＩＶのメッセンジャーＲＮＡ発現の
増加倍率を、３つの個別実験で得た（平均＋標準偏差）（データは示されていな
い）。まず始めに、ＧＦＰ単独でトランスフェクションした細胞と比較して、Ｇ
ＦＰ−ＲＨ１１６でトランスフェクションをした細胞はＧＦＰ−ＳＳＡでトラン
スフェクションした細胞よりも、スプライシングされていないＲＮＡでより高い
レベルを示した（それぞれ３．１４＋１．５および０．８１＋０．１２）。中間
のサイズの、または一か所スプライシングされたＨＩＶ−１のｍＲＮＡもまた、
ＧＦＰ−ＳＳＡでトランスフェクションした細胞（０．９１＋０．１４）に比べ
、ＧＦＰ−ＲＨ１１６でトランスフェクションした細胞（２．８１＋０．７３）
において増加した。

【０１９５】Ｔａｔの過剰発現に関しては、二つの独立した実験から結果が得られ；スプラ
イシングされていない、および中間サイズの、または一か所スプライシングされ
たメッセンジャーＲＮＡレベルは、それぞれ４．７５±１．２５および４．１８
±０．３１である。感染の３日後に得られたＲＴＰＣＲの分析が、図９に示さ
れている。図９Ａは、ＲＨ１１６、ＳＳＡまたはＴＡＴのｍＲＮＡの過剰発現が
、一過性トランスフェクションされた細胞において起こったことを示す。図９Ｂ
が示すのは、過剰に発現したＲＨ１１６タンパク質（右側）とＴＡＴタンパク質
（左側）の、スプライシングされていない、または中間サイズの、または一か所
スプライシングされたｍＲＮＡの増大である。プロウイルスＤＮＡの形成の研究
（図８Ｃ）が明らかにしたことは、トランスフェクションした細胞のいずれにも
有意な差はないことである。これらの結果が示唆することは、ＲＨ１１６による
ＨＩＶの発現の調節は、転写または転写後のレベルで起きることである。

【０１９６】例１３：ＨＩＶ−１に感染した患者における自己抗原を構成するＲＨ１１６タ
ンパク質

【０１９７】ＲＨ１１６が自己抗原となりうるかという問題は、ＥＬＩＳＡ分析により、健
康なドナーから得た血清と、抗レトロウイルス治療の前と後にＨＩＶ−１患者か
ら得た血清とを用いて研究された。図１０に示された結果は、コントロールの健
常者からのものと比較して、患者からの血清における自己抗体レベルが有意に増
加していることを実証している。その上、治療を行わないＨＩＶ−１患者におい
て観察されたＲＨ１１６自己抗体の高レベルは、効果的な抗レトロウイルス剤で
の有意な治療を行った後でさえも、常に有意なものとなっている。

【０１９８】参考文献Ａｍｉｅｌｅｔａｌ．（１９９９）Ｊ．ＩｎｆｅｃｔＤｉｓ．１７９：８
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．ＮｅｄｄｌｅｍａｎｅｔＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．
４８：４４３．ＯｌｉｎｓｅｔＬｅｅ（１９９３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ４：５２０．ＰａｕｓｅａｎｄＳｏｎｅｎｂｅｒｙ（１９９２）ＥＭＢＯＪ．１１：２
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ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４．Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔｅｔａｌ．（１９９２）ＬａＲｅｃｈｅｒｃｈｅ
２３：４７１．Ｐｅｒｕｎｅｔａｌ．（１９８９）ＥｄｓＣｏｍｐｕｔｅｒ−ａｉｄｅｄｄｒｕｇｄｅｓｉｇｎ（ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒＩｎｃ．ＮｅｗＹ
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１４：１５６２．Ｒｏｌｆｓ，Ａ．ｅｔａｌ．（１９９１）Ｂｅｒｌｉｎ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−
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ｐｔｉｄｅｓｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍ．Ｃｏｍｐａｎｙ
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ｅｎｅｔｒａｎｓｆｅｒ．ＩｎＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉＲ．，Ｅｄ．Ｇ
ｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒ．ＶａｎｄｅＷａｔｅｒｂｅｅｍｄ，ＡｄｖａｎｃｅｄＣｏｍｐｕｔｅｒ−
ａｓｓｉｓｔｅｄｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｉｎｄｒｕｇｄｉｓｃｏｖｅｒ
ｙ（Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ，Ｗｅｉｎｓｈｅｉｍ，１９９４
）．Ｗａｌｋｅｒｅｔａｌ．（１９８２），ＥＭＢＯＪ．１：９４５−９５１
．

【０１９９】

【図面の簡単な説明】

【図１】ＲＨ１１６をコードするｃＤＮＡの３’末端を得る方法を示した図
。

【図２】ＲＨ１１６をコードするｃＤＮＡの５’領域を得る方法を示した図
。

【図３】ヒトＲＮＡヘリカーゼＲＨ１１６と推定されるアミノ酸配列とＲＮ
Ａヘリカーゼ（ＲＩＧ−１）と推定されるものとの比較を示した図。

【図４】多様なヒト組織におけるＲＨ１１６メッセンジャーＲＮＡ発現のノ
ーザンブロットによる分析結果。

【図５】内因性感染およびＣＤ８を消耗したＰＢＭＣにおけるムラブチドに
よって誘発されるＲＨ１１６メッセンジャーＲＮＡの発現の抑制を示した図。

【図６】Ｕ９３７細胞から得た¹²⁵Ｉヨウ素で標識した細胞抽出物からのＲ
Ｈ１１６タンパク質の免疫沈降を示した図。

【図７】ＨｅＬａ−ＣＤ４＋細胞におけるＲＨ１１６タンパク質の免疫局在
を示した写真。

【図８】トランスフェクションされ、かつＨＩＶ─１_LAIウイルスに感染し
たＨｅＬａＣＤ４＋細胞によるウイルス抗原Ｐ２４の発現を示したグラフ。

【図９】ＨＩＶ─１_LAIウイルスに感染し、またトランスフェクションした
ＨｅＬａ−ＣＤ４＋細胞におけるウイルスＤＮＡとメッセンジャーＲＮＡの発現
を示す半定量的ＲＴＰＣＲの結果。

【図１０】コントロールの健常者と抗レトロウイルス治療の前後のＨＩＶ感
染患者におけるＲＨ１１６タンパク質に対する自己抗体の検出を示したグラフ。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｐ 9/10 ４Ｂ０６４ 48/00 19/02 ４Ｂ０６５Ａ６１Ｐ 3/10 19/10 ４Ｃ０８４ 9/10 29/00 １０１４Ｃ０８５ 19/02 31/04 ４Ｈ０４５ 19/10 31/12 29/00 １０１ 31/18 31/04 35/00 31/12 37/00 31/18 37/06 35/00 Ｃ０７Ｋ 16/40 37/00 Ｃ１２Ｍ 1/00 Ａ 37/06 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ０７Ｋ 16/40 1/19 Ｃ１２Ｍ 1/00 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/15 9/00 1/19 Ｃ１２Ｑ 1/25 1/21 1/68 Ａ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 9/00 33/50 ＺＣ１２Ｑ 1/25 33/53 Ｄ 1/68 ＭＧ０１Ｎ 33/15 33/577 Ｂ 33/50 37/00 １０２ 33/53 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/577 5/00 Ａ 37/00 １０２ 15/00 Ｆ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＣ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者バール，ジョルジュフランス共和国，エフ−59800 リール，リュナショナル，266 (72)発明者コキュドゥ，セシルフランス共和国，エフ−59112 アヌラン，リュシャルルギューノ，２ (72)発明者キャプロン，アンドレフランス共和国，エフ−59133 ファランパン，リュデュキャピテンジャスマン，８Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA35 BB14 BB20 BB24 BB41 BB51 CB01 DA13 DA36 FA20 FB02 FB03 FB05 FB08 GC10 4B024 AA12 AA13 AA14 BA07 CA04 CA09 DA02 EA04 GA11 HA12 4B029 AA21 AA23 BB20 CC03 4B050 CC03 DD11 LL03 4B063 QA18 QQ20 QQ44 QR01 QR48 QR55 QR59 QR62 QR77 QR80 QR82 QS24 QS25 QS28 QS34 QS36 QX04 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA01 DA13 4B065 AA93X AA93Y AB01 AC14 BA02 BB19 CA27 CA45 CA46 4C084 AA02 AA13 AA17 DC50 NA14 ZA451 ZA961 ZA971 ZB011 ZB081 ZB151 ZB261 ZB351 ZC351 ZC551 4C085 AA13 BB31 CC02 CC04 CC21 DD33 DD86 4H045 AA10 AA11 AA30 CA40 DA76 DA89 EA22 EA28 EA50 EA51 EA52 FA72 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】アミノ酸配列ＳＥＱＩＤＮｏ２の、ＲＨ１１６と命名され
た単離されたポリペプチド。
【請求項２】単離されたポリペプチドであって、ａ）配列ＳＥＱＩＤＮｏ２のポリペプチド；ｂ）ａ）で規定されたアミノ酸配列のポリペプチドの変異ポリペプチド；ｃ）ａ）またはｂ）で規定されたポリペプチドと相同であり、ａ）の前記ポリ
ペプチドと少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド；ｄ）ａ）で規定されたポリペプチドの、少なくとも１５の連続するアミノ酸断
片；ｅ）ａ）で規定されたポリペプチドの生物学的に活性な断片から選ばれたポリペプチドを含むことを特徴とする、ポリペプチド。
【請求項３】ＲＮＡヘリカーゼスーパーファミリーに属する保存されたドメ
インを少なくとも一つ有することを特徴とする、請求項１または２のいずれかに
記載のポリペプチド。
【請求項４】前記保存されたドメインが、以下：・ＲＮＡヘリカーゼスーパーファミリーのドメインＩに対応するＧ−ＧＫＴ配列
、・ＲＮＡヘリカーゼスーパーファミリーのドメインＶに対応するＤＥＡＤ、ＤＥ
−Ｄ、ＤＥＡＨ配列から選ばれることを特徴とする、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】請求項１に記載のポリペプチドをコードすることを特徴とする
、精製または単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】配列ＳＥＱＩＤＮｏ１の請求項５に記載のポリヌクレオチ
ド。
【請求項７】以下：ａ）配列ＳＥＱＩＤＮｏ１；ｂ）ＧｅｎＢａｎｋデータバンクでアクセッション番号Ｎｏ．ＡＣ００７７５
０およびＮｏ．ＡＣ０１０８１７６で識別される登録核酸配列、およびＥＭＢＬ
データバンクでアクセッション番号Ｎｏ．ＡＷ５８９５６７、Ｎｏ．ＡＷ１５２
５４１およびＡＷ１８９５８４で識別される登録核酸配列を除く、配列ＳＥＱ
ＩＤＮｏ１の少なくとも１５の連続するヌクレオチド断片の配列；ｃ）ａ）またはｂ）で規定された配列で最適なアラインメントを行った後、少
なくとも８５％のパーセンテージ同一性を示す核酸配列；ｄ）ａ）、ｂ）またはｃ）で規定されたような配列に対応する相補的配列また
はＲＮＡ配列から選ばれたポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、単離されたポリヌクレ
オチド。
【請求項８】核酸配列の増幅または重合のために、プライマーとして、請求
項７に記載のポリヌクレオチドを使用する方法。
【請求項９】核酸配列の検出のために、プローブとして、請求項７に記載の
ポリヌクレオチドをインビトロで使用する方法。
【請求項１０】対応するタンパク質産物の発現を制御するために、センス核
酸配列またはアンチセンス核酸配列として、請求項７に記載のポリヌクレオチド
をインビトロで使用する方法。
【請求項１１】前記ポリヌクレオチドが、放射性化合物または非放射性化合
物によって直接または間接に標識されることを特徴とする、請求項８、９、１０
のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項１２】組換えクローニングベクターおよび／または組換え発現ベク
ターであって、請求項５から７のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドを含む
か、もしくは請求項１から４のいずれか一つに記載のポリペプチドをコードする
組換えベクター。
【請求項１３】前記ポリヌクレオチドが、前記ベクターに逆方向に挿入され
ることを特徴とする、請求項５から７のいずれか一つに記載のポリヌクレオチド
を含む、組換えアンチセンス発現ベクター。
【請求項１４】請求項１２と１３のいずれかに記載のベクターによって形質
転換されていることを特徴とする、宿主細胞。
【請求項１５】請求項１４に記載の細胞を含むことを特徴とする、ヒトを除
く動物。
【請求項１６】組換えポリペプチドの作成方法であって、請求項１４に記載
の宿主細胞を、前記組換えポリペプチドの発現、および場合によっては分泌を可
能にする条件下で培養することと、前記組換えポリペプチドを回収することを特
徴とする方法。
【請求項１７】請求項１６に記載の方法によって得られる組換えポリペプチ
ド。
【請求項１８】請求項１から４または１７のいずれか一つに記載のポリペプ
チドを選択的に結合することを特徴とする、モノクローナル抗体またはポリクロ
ーナル抗体およびその断片。
【請求項１９】生物サンプルにおける、請求項１から４または１７のいずれ
か一つに記載のポリペプチドの検出および／または分析の方法であって、以下の
手順：ａ）生物サンプルを請求項１８に記載の抗体と接触させること、ｂ）形成された抗原−抗体複合体を実証すること、を含むことを特徴とする方法。
【請求項２０】免疫反応により、生物サンプルにおいて、請求項１９に記載
の方法を実行するための試薬キットであり、以下の要素：ａ）請求項１８に記載のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、ｂ）場合によっては、免疫反応に好都合な培地を構成するための試薬、ｃ）免疫反応の際に生じた抗原−抗体複合体の検出を可能にする試薬、を含むことを特徴とする、試薬キット。
【請求項２１】生物サンプルにおける、請求項５から７のいずれか一つに記
載のポリヌクレオチドの検出および／または分析の方法であって、以下の手順：
ａ）分析すべき生物サンプルからＤＮＡを単離するか、もしくは生物サンプルの
ＲＮＡからｃＤＮＡを得ること、ｂ）請求項８に記載のプライマーを用いてＤＮＡを特異的に増幅すること、ｃ）増幅産物を分析すること、を有することを特徴とする方法。
【請求項２２】生物サンプルにおける、請求項５から７のいずれか一つに記
載のポリヌクレオチドの検出および／または分析の方法であって、以下の手順：
ａ）請求項５から７のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドを、生物サンプル
と接触させること、ｂ）前記ポリヌクレオチドと生物サンプルの核酸の間に形成されたハイブリッド
を、検出および／または分析すること、を有することを特徴とする方法。
【請求項２３】請求項５から７のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドを
含むことを特徴とするＤＮＡチップ。
【請求項２４】請求項１から４または１７のいずれか一つに記載のポリペプ
チド、または請求項１８に記載の抗体を含むことを特徴とするタンパク質チップ
。
【請求項２５】請求項１から４または１７のいずれか一つに記載のポリペプ
チドの細胞発現レベルおよび／またはＲＮＡヘリカーゼ活性に影響を与える化合
物のスクリーニング方法であって、以下の手順：ａ）請求項１４に記載の宿主細胞、および請求項１から４または１７のいずれか
一つに記載のポリペプチドを発現または含有する、好ましくはヒトの、真核細胞
から選ばれた細胞を、前記細胞に浸透または導入されることのできる一つまたは
複数の潜在的化合物と接触させること、ｂ）細胞発現レベルおよび／またはＲＮＡヘリカーゼ活性を検出および／または
測定することを有するスクリーニング方法。
【請求項２６】請求項１から４または１７のいずれか一つに記載のポリペプ
チドのＲＮＡヘリカーゼ活性に影響を与える化合物のスクリーニング方法であり
、以下の手順：ａ）前記ポリペプチドを、ＲＮＡヘリカーゼ活性の実施に必要な試薬の存在下で
、一つまたは複数の潜在的化合物と接触させること、ｂ）ＲＮＡヘリカーゼ活性を検出および／または測定することを有するスクリーニング方法。
【請求項２７】前記スクリーニングされた化合物が、請求項１から４または
１７のいずれか一つに記載のポリペプチドの発現レベルおよび／またはＲＮＡヘ
リカーゼ活性を下げることを特徴とする、請求項２５または２６のいずれかに記
載の方法。
【請求項２８】請求項２７に記載の方法によって得られる化合物であり、以
下：ａ）請求項１０に記載のアンチセンス核酸配列として用いられる、請求項５から
７のいずれか一つに記載のポリヌクレオチド、ｂ）請求項１３に記載のアンチセンス発現ベクター、ｃ）請求項１８に記載の抗体、ｄ）請求項１から４または１７のいずれか一つに記載のポリペプチドのアンタゴ
ニスト、ｅ）ムラミルペプチドから選ぶことを特徴とする化合物。
【請求項２９】ムラミルペプチドはムラブチドであることを特徴とする、請
求項２８に記載の化合物。
【請求項３０】前記スクリーニングされた化合物が、請求項１から４または
１７のいずれか一つに記載のポリペプチドの発現レベルおよび／またはＲＮＡヘ
リカーゼ活性を上げることを特徴とする、請求項２５または２６のいずれかに記
載の方法。
【請求項３１】請求項３０に記載の方法を用いて得られる、請求項１から４
または１７のいずれか一つに記載のポリペプチドのアゴニスト化合物。
【請求項３２】請求項１から４または１７のいずれか一つに記載のポリペプ
チドの機能的な活性に影響する化合物のスクリーニング方法であり、以下の手順
：ａ）前記ポリペプチドを、核および／またはミトコンドリアのＲＮＡスプライシ
ング反応、ＲＮＡ編集反応、ｒＲＮＡプロセッシング反応、翻訳開始反応、核ｍ
ＲＮＡの細胞質への移出反応、そしてｍＲＮＡ分解反応の中から選ばれた反応を
実施するのに必要な試薬の存在下で、一つまたは複数の潜在的化合物と接触させ
ること、ｂ）前記反応を検出および／または測定すること。を有することを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項３３】以下：ａ）請求項１から４または１７のいずれか一つに記載のポリペプチド、ｂ）請求項５から７のいずれか一つに記載ポリヌクレオチド、ｃ）請求項１２または１３に記載のベクター、ｄ）請求項１４に記載の細胞、ｅ）請求項１８に記載の抗体、ｆ）請求項２８、２９および３１のいずれか一つに記載の化合物、から薬品として選ばれることを特徴とする化合物。
【請求項３４】癌、急性または慢性の感染症、遺伝性遺伝子疾患、免疫およ
び自己免疫疾患、リウマチ、関節炎、アテローム性動脈硬化症, 骨粗鬆症および
糖尿病からなるグループから選ばれた病の予防および／または治療、そして臓器
移植拒絶反応の予防を目的とした薬品として、請求項３３に記載の化合物。
【請求項３５】前記感染症は、ＡＩＤＳとＣ型肝炎から選ばれることを特徴
とする、請求項３４に記載の化合物。
【請求項３６】ウイルス病の治療を目的とした薬品の調製のために、請求項
３３に記載の化合物を使用する方法。
【請求項３７】ウイルス病が、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）であるこ
とを特徴とする、請求項３６に記載の使用方法。
【請求項３８】治療上有効な量の請求項３３に記載の化合物と薬学的に受け
入れ可能な賦形剤とを含有することを特徴とする、ＡＩＤＳの予防と治療の処置
用の薬学的組成物。
【請求項３９】抗ウイルス治療、好ましくは抗ＨＩＶ治療において、同時に
、別々にまたは時間とともに分割して使用する組み合わせ薬品のように、請求項
３３に記載の少なくとも一つの化合物と、少なくとも一つの他の抗ウイルス剤と
からなる薬品。
【請求項４０】ウイルス病が、Ｂ型またはＣ型肝炎であることを特徴とする
、請求項３６に記載の使用方法。
【請求項４１】患者の体内におけるワクチンへの免疫反応を引き起こし、ま
たはそれを増進させることを目的とした薬品を調製するために、請求項５から７
のいずれか一つに記載のポリヌクレオチド、および／または請求項１から４およ
び１７のいずれか一つに記載のポリペプチド、および／または請求項１から４お
よび１７のいずれか一つに記載のポリペプチドのアゴニストを使用する方法。