WO2001085955A1 - Polypeptide rh116 et ses fragments et polynucleotides codant lesdits polypeptides et applications thérapeutiques - Google Patents

Polypeptide rh116 et ses fragments et polynucleotides codant lesdits polypeptides et applications thérapeutiques Download PDF

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WO2001085955A1
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rna
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polynucleotide
compound
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Georges Bahr
Cécile COCUDE
André Capron
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Istac
Institut Pasteur De Lille
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    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Definitions

  • RH116 POLYPEPTIDE AND ITS FRAGMENTS AND POLYNUCLEOTIDES ENCODING SAID POLYPEPTIDES AND THERAPEUTIC APPLICATIONS The present invention relates to a new 116 kDa polypeptide having sequence homologies with RNA helicases (DEXH box) called RH116 and its fragments, the cloning of cDNA and the polynucleotides encoding said polypeptides, cloning vectors and / or expression systems including said polynucleotides, cells transformed by said vectors and specific antibodies directed against said polypeptides.
  • the invention also relates to methods for detecting and / or assaying said polypeptides and polynucleotides, to the corresponding diagnostic kits, and to a method for screening for ligands, as well as to compounds useful as medicaments for prevention and / or treatment. therapeutic.
  • Muramylpeptides are, among the synthetic immunomodulators, those which have shown a large number of immunopharmacological effects on cells of the monocytic / macrophagic line potentiating their non-specific resistance to infection, increasing the tumor activity of macrophages, and also acting as adjuvants for vaccines.
  • Murabutide (MB) an analogue of muramyldipeptide (MDP) was selected for its particularly promising biological profile and its good tolerance in animals and humans. In fact, unlike MDP and many other analogues, it is shown that MB is not pyrogenic, does not induce inflammatory reactions and has not shown severe toxicity in clinical studies in healthy volunteers and of cancer patients.
  • MB is a promising antiviral agent in the field of AIDS (Acquired Immunodeficiency Syndrome).
  • HIV human immunodeficiency virus
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • the MB immunomodulator was the subject of a French patent issued No. FR 2 724 845 and entitled “Compositions of Muramyl peptides capable of inhibiting up to 100% the replication of an acquired immunodeficiency virus such as HIV ".
  • phase I and phase Ha clinical trials carried out on HIV + patients have demonstrated good clinical tolerance of MB.
  • MB exerts a strong inhibition of viral replication in the PBMCs of patients depleted in CD8 lymphocytes, activated by phytohemagglutinin (PHA) and cultured with interleukin 2 (IL-2).
  • PHA phytohemagglutinin
  • IL-2 interleukin 2
  • MB inhibits the level of HIV p24 viral protein in culture supernatants by 70 to 100%. This effect is correlated with the expression rate of viral messenger RNAs (non-spliced and single spliced).
  • analysis of the profile of secreted cytokines and chemokines has shown that MB induces the production of chemokines known to inhibit HIV replication. However, this induction does not seem to be fully correlated with the inhibitory effect of MB.
  • DD-RT-PCR Differential Display-RT-PCR
  • a first step of reverse transcription (RT) of the total cellular RNA in order to obtain DNA complementary to all the RNA which has a poly A tail.
  • a second step of amplification by Polymerase Chain Reaction (PCR) from cDNAs serving as templates and from different pairs of primers in the presence of a radio-labeled nucleotide.
  • the PCR products are then separated on gel by electrophoresis. The differentially amplified fragments are cut from the gel, re-amplified then clones and sequences.
  • DD-RT-PCR performed on PBMCs from an HIV + patient, allowed the inventors to select more than 130 fragments of cDNA differentially expressed after treatment with MB. These fragments were subcloned into the vector pCR2.1 (Invitrogen), then sequenced by automatic sequencing (ABI Prism 377, Perkin-Elmer). Sequences were analyzed for dome research using databases and the NCBI Basic Local Alignment Search Tool (Blast 2) server.
  • RNA helicases for review see Critical Rev. In Biochemistry and
  • RNA editing RNA editing
  • rRNA processing rRNA processing
  • RNA helicases are essential factors for cell differentiation and development, and some of them play a role in the transcription and replication of a single-strand RNA viral genome.
  • RNA helicases belong to the large group of enzymes capable of hydrolyzing nucleotides 5'-trisphosphates.
  • a motif also called “Walker” motif
  • RNA helicase superfamily II has made it possible to highlight a common central region which is characterized by the presence of eight highly conserved domains.
  • biochemical function of four of the eight domains conserved domains I, II, VI, and VIII
  • DEAD box or DEAD box motif
  • DEAD Asp-Glu-Ala-Asp
  • the RNA helicases belonging to the superfamily II are also called “DEAD Box” proteins (Linder et al., 1989).
  • RNA helicases On either side of the conserved central sequence, the amino- and carboxy-terminal ends of RNA helicases are characterized by sequences of variable length and content. It is suggested that these divergent regions are responsible for individual protein functions, while the highly conserved domains are involved in RNA helicase activity.
  • Domain I (A / G-X-X-G-X-G-K-T: Ala / Gly-X-X-Gly-X-Gly-lys-Thr) is described as motif A of ATPases (Walker et al, 1982).
  • Domain V or DEAD box (L-D-E-A-D-X-X-Leu: Leu-Asp-Glu-Ala-
  • Asp-XX-leu represents a specific form of the ATPase B motif (Walker and al, 1982) which seems to be involved in the hydrolysis of ATP (Pause and Sonenbery, 1992).
  • the VI domain or SAT motif (Ser-Ala-Thr) is located near the DEAD box and appears to be specific for RNA helicases. Domain VIII is characterized by the YIHRIGRXXR box (Tyr-Ile-His-
  • RH116 for 116 kDa RNA helicase of amino acid sequence SEQ ID No. 2. This sequence includes conserved consensus domains which are easily identifiable by a person skilled in the art and which make it possible to classify the RH116 polypeptide of the invention in the DEAH or DEXH subgroup (for a review see Luking. Et al, (1998)) Among these consensus areas retained, it is worth mentioning:
  • GSGKT sequence which corresponds to amino acids 332 to 336 of the sequence SEQ ID No. 2, and which constitutes the conserved domain I (G-GKT) of the RNA helicase superfamily.
  • DECH sequence which corresponds to amino acids 443 to 446 of the sequence SEQ ID No. 2 and which constitutes the conserved domain V (DE-H) of the superfamily of RNA helicases of the DEXH subgroup.
  • TAS sequence which corresponds to amino acids 488 to 490 of the sequence SEQ ID No. 2 and which constitutes the conserved domain VI (-A-) of the superfamily of RNA helicases of the DEAH subgroup.
  • the isolated polypeptide is characterized in that it comprises a polypeptide chosen from: a) a polypeptide of sequence SEQ ID No. 2; b) a polypeptide variant of a polypeptide of amino acid sequences defined in a); c) a polypeptide homologous to the polypeptide defined in a) or b) and comprising at least 80% identity, preferably 85%, 87
  • polypeptide will be used to also denote a protein or a peptide.
  • variant polypeptide will be understood to mean all of the mutated polypeptides which may exist naturally, in particular in humans, and which correspond in particular to truncations, substitutions, deletions and / or additions of amino acid residues.
  • homologous polypeptide is intended to denote the polypeptides having, with respect to the natural polypeptide RH116, certain modifications such as in particular a deletion, addition or substitution of at least one amino acid, a truncation, an elongation and / or a chimeric fusion.
  • homologous polypeptides those whose amino acid sequence has at least 80% identity, preferably at least 85%, 87%, 90%, 93%, 95%, 97%, 98%, are preferred. , 99% identity with the amino acid sequences of the polypeptides according to the invention.
  • a substitution one or more amino acids consecutive or non-consecutive, can be replaced by “equivalent” amino acids.
  • equivalent amino acid is intended here to denote any amino acid capable of being substituted for one of the amino acids of the basic structure without, however, modifying the essential functional characteristics or properties, such as their biological activities, of the corresponding polypeptides. such as the in vivo induction of antibodies capable of recognizing the polypeptide whose amino acid sequence is included in the amino acid sequence SEQ ID No. 2, or one of its fragments.
  • These equivalent amino acids can be determined either on the basis of their structural homology with the amino acids for which they are substituted, or on the results of cross-biological activity tests to which the different polypeptides are liable to give rise.
  • biologically active fragment is intended to denote in particular a fragment of the amino acid sequence of a polypeptide according to the invention having at least one of the characteristics or functional properties of the polypeptide according to the invention, in particular in that it comprises a helicase activity at ARN.
  • the variant polypeptide, the homologous polypeptide or the polypeptide fragment according to the invention has at least 10%, preferably 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% of RNA helicase activity.
  • RNA helicase activity Various protocols known to those skilled in the art have been described for measuring the RNA helicase activity of the polypeptides according to the invention; reference should be made to the articles by Lain et al (1990) and Lee and Hurwitz (1993).
  • the examples below propose biological functions for the RH116 protein according to the domains peptides of this protein and thus allow a person skilled in the art to identify the biologically active fragments.
  • polypeptide fragment is intended to denote a polypeptide comprising at least 15 consecutive amino acids, preferably 17, 20, 23, 25, 30, 40, 50, 100, 250 consecutive amino acids.
  • the polypeptide fragments according to the invention obtained by cleavage of said polypeptide by a proteolytic enzyme, by a chemical reagent, or alternatively by placing said polypeptide in a very acidic environment are also part of the invention.
  • a polypeptide according to the invention is a polypeptide consisting of the sequence SEQ ID No. 2 or of a sequence having at least 80% identity, preferably at least 85%, 90%, 95%, 98% and 99% identity with SEQ ID N ° 2 after optimal alignment.
  • polypeptide whose amino acid sequence having a percentage identity of at least 80%, preferably at least 85%, 90%, 95%, 98% and 99% after optimal alignment with a reference sequence is intended to denote the polypeptides having certain modifications with respect to the reference polypeptide, such as in particular one or more deletions, truncations, an elongation, a chimeric fusion, and / or one or more substitutions.
  • the variant polypeptides encoded by the variant peptide sequences as defined above are preferred, in particular the polypeptides whose amino acid sequence has at least one corresponding mutation in particular to a truncation, deletion, substitution and / or addition of at least one amino acid residue with respect to the sequences SEQ ID No. 2 or with one of their fragments, more preferably the variant polypeptides having a mutation related to a pathology.
  • the polypeptide according to the invention is characterized in that it comprises at least one conserved domain belonging to the superfamily of RNA helicases, these being preferably chosen from the G-GKT sequences corresponding to domain I, DEAD, DE -D, DEAH, correspondents to domain V, SAT, -A-, correspondents to domain VI, YIHRIGRR, HRIGR— R, -R-GR - R, - GR, correspondents to domain VIII.
  • the invention also relates to a purified or isolated polynucleotide characterized in that it codes for a polypeptide of sequence SEQ ID No. 2 as defined above.
  • the polynucleotide according to the invention has the sequence SEQ ID No. 1.
  • the purified or isolated polynucleotide according to the invention is characterized in that it comprises a polynucleotide chosen from: a) SEQ ID No. 1; b) the sequence of a fragment of at least 15 consecutive nucleotides, preferably at least 18, 21, 24, 27, 30, 35, 40, 50, 75, 100 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID No.
  • nucleic acid sequences identified under accession number AC 007750 and number AC0108176 in the GenBank database as well as with the exception of the genomic sequence of 95417 bp, as well as exception of the recorded nucleic sequences identified under access number N ° AW589567, N ° AW152541 and AW189584 in the EMBL database; c) a nucleic sequence having a percentage identity of at least 80%, preferably at least 85%, 90%, 95%, 98% and 99% after optimal alignment with a sequence defined in a) or b ); d) the complementary sequence or the RNA sequence corresponding to a sequence as defined in a), b) or c).
  • nucleic acid nucleic or nucleic acid sequence, polynucleotide, oligonucleotide, polynucleotide sequence, nucleotide sequence, terms which will be used interchangeably in the present description, is intended to denote a precise sequence of nucleotides, modified or not, making it possible to define a fragment or region of a nucleic acid, which may or may not contain non-natural nucleotides, and which may correspond to both double-stranded DNA, single-stranded DNA and transcripts of said DNAs, and / or an RNA fragment. It should be understood that the present invention does not relate to nucleotide sequences in their natural chromosomal environment, that is to say in the natural state. These are sequences which have been isolated and / or purified, that is to say that they have been taken directly or indirectly, for example by copying, their environment having been at least partially modified. This also means the nucleic acids obtained by chemical synthesis.
  • polynucleotide of complementary sequence is intended to denote any DNA whose nucleotides are complementary to those of SEQ ID No. 1 or of part of SEQ ID No. 1 and whose orientation is reversed.
  • percentage of identity between two nucleic acid or amino acid sequences within the meaning of the present invention is meant a percentage of identical nucleotides or amino acid residues between the two sequences to be compared, obtained after the best alignment, this percentage being purely statistical and the differences between the two sequences being distributed randomly and over their entire length.
  • Best alignment or “optimal alignment” is intended to denote the alignment for which the percentage of identity determined as below is the highest.
  • Sequence comparisons between two nucleic acid or amino acid sequences are traditionally carried out by comparing these sequences after having optimally aligned them, said comparison being carried out by segment or by "comparison window” to identify and compare the regions. sequence similarity locale.
  • the optimal alignment of the sequences for the comparison can be carried out, besides manually, by means of the algorithm of local homology of Smith and Waterman (1981), by means of the algorithm of local homology of Neddleman and Wunsch (1970 ), using the similarity search method of Pearson and Lipman (1988), using software IT using these algorithms (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI).
  • the BLAST program is preferably used with the BLOSUM 62 matrix.
  • the PAM or PAM250 matrices can also be used.
  • the percentage of identity between two nucleic acid or amino acid sequences is determined by comparing these two optimally aligned sequences, the nucleic acid or amino acid sequence to be compared can include additions or deletions by compared to the reference sequence for optimal alignment between these two sequences.
  • the percentage of identity is calculated by determining the number of identical positions for which the nucleotide or the amino acid residue is identical between the two sequences, by dividing this number of identical positions by the total number of positions compared and by multiplying the result obtained by 100 to obtain the percentage of identity between these two sequences.
  • nucleic acid sequences having a percentage identity of at least 80%, preferably at least 85%, 90%, 95%, 98% and 99% after optimal alignment with a reference sequence is meant the sequences nucleic acids having, with respect to the reference nucleic acid sequence, certain modifications such as in particular a deletion, a truncation, an elongation, a chimeric fusion, and / or a substitution, in particular pointwise, and whose nucleic sequence has at least 80%, preferably at least 85%, 90%, 95%, 98% and 99% identity after optimal alignment with the reference nucleic sequence.
  • These are preferably sequences whose complementary sequences are capable of specifically slrybriding with the sequences SEQ ID No. 1 of the invention.
  • the specific hybridization conditions or high stringency will be such that they ensure at least 80%, preferably at least 85%, 90%, 95%, 98% and 99% identity after optimal alignment. between one of the two sequences and the complementary sequence of the other.
  • Hybridization under conditions of high stringency means that the conditions of temperature and ionic strength are chosen in such a way that they allow hybridization to be maintained between two complementary DNA fragments.
  • high stringency conditions of the hybridization step for the purpose of defining the polynucleotide fragments described above are advantageously as follows.
  • DNA-DNA or DNA-RNA hybridization is carried out in two stages: (1) prehybridization at 42 ° C for 3 hours in phosphate buffer (20 mM, pH 7.5) containing 5 x SSC (1 x SSC corresponds to a 0.15 M NaCl + 0.015 M sodium citrate solution), 50% formamide, 7% sodium dodecyl sulfate (SDS), 10 x Denhardt's, 5% dextran sulfate and 1% salmon sperm DNA; (2) actual hybridization for 20 hours at a temperature depending on the size of the probe (ie: 42 ° C, for a probe of size> 100 nucleotides) followed by 2 washes of 20 minutes at 20 ° C in 2 x SSC + 2% SDS, 1 wash for 20 minutes at 20 ° C in 0.1 x SSC + 0.1% SDS.
  • the last washing is carried out in 0.1 x SSC + 0.1% SDS for 30 minutes at 60 ° C. for a probe of size> 100 nucleotides.
  • the high stringency hybridization conditions described above for a polynucleotide of defined size can be adapted by the skilled person for oligonucleotides of larger or smaller size, according to the teaching of Sambrook et al, 1989.
  • nucleic acid sequences having a percentage identity of at least 80%, preferably at least 85%, 90%, 95%, 98% and 99% after optimal alignment with the sequence according to the invention it is preferred also the variant nucleic sequences of SEQ ID N ° 1, or of their fragments, that is to say all of the nucleic sequences corresponding to allelic variants, that is to say individual variations of the sequences SEQ ID No. 1.
  • variant nucleic sequences of SEQ ID N ° 1, or of their fragments that is to say all of the nucleic sequences corresponding to allelic variants, that is to say individual variations of the sequences SEQ ID No. 1.
  • These natural mutated sequences correspond to polymorphisms present in mammals, in particular in humans and, in particular, to polymorphisms which can lead to the occurrence of a pathology.
  • the invention relates to a purified or isolated nucleic acid according to the present invention, characterized in that it comprises or consists of one of the sequences SEQ ID No. 1, their complementary sequences or the RNA sequences corresponding to SEQ ID No. 1.
  • the primers or probes characterized in that they comprise a sequence of a nucleic acid according to the invention, also form part of the invention.
  • the present invention for the detection, identification, assay or amplification of nucleic acid sequence also relates to the primers or probes according to the invention which can in particular make it possible to demonstrate or discriminate the sequences nucleic acid variants, or to identify the genomic sequence of genes whose cDNA is represented by SEQ ID No. 1, in particular using an amplification method such as the PCR method, or a related method.
  • the polynucleotides which can be used as probe or as primer in methods of detection, identification, assay or amplification of nucleic sequence have a minimum size of 15 bases, preferably at least 18 , 20, 25, 30, 40, 50 bases.
  • the polynucleotides according to the invention can thus be used as a primer and / or probe in methods using in particular the PCR technique (polymerase chain reaction) (Rolfs et al, 1991).
  • This technique requires the choice of pairs of oligonucleotide primers framing the fragment which must be amplified.
  • the amplified fragments can be identified, for example after an electrophoresis in agarose or polyacrylamide gel, or after a chromatographic technique such as gel filtration or ion exchange chromatography, then sequences.
  • the specificity of the amplification can be controlled using as primers the nucleotide sequences of polynucleotides of the invention and as templates, plasmids containing these sequences or the amplification products derived from them.
  • the amplified nucleotide fragments can be used as reagents in hybridization reactions in order to demonstrate the presence, in a biological sample, of a target nucleic acid of sequence complementary to that of said amplified nucleotide fragments.
  • the invention also relates to the nucleic acids capable of being obtained by amplification using primers according to the invention.
  • PCR-like is meant to denote all the methods implementing direct or indirect reproductions of the nucleic acid sequences, or in which the labeling systems have been amplified, these techniques are of course known. In general it is the amplification of DNA by a polymerase; when the original sample is an RNA, a reverse transcription should be carried out beforehand.
  • the target polynucleotide to be detected is an mRNA
  • the cDNA obtained will then serve as a target for the primers or probes used in the amplification or detection method according to the invention.
  • the probe hybridization technique can be carried out in various ways (Matthews et al, 1988).
  • the most general method consists in immobilizing the nucleic acid extracted from cells of different tissues or from cells in culture on a support (such as nitrocellulose, nylon, polystyrene) to produce, for example DNA chips, then to incubate , under well-defined conditions, the target nucleic acid immobilized with the probe. After hybridization, the excess probe is eliminated and the hybrid molecules formed are detected by the appropriate method (measurement of radioactivity, fluorescence or enzymatic activity linked to the probe).
  • the latter can be used as capture probes.
  • a probe called a “capture probe”
  • a probe is immobilized on a support and is used to capture by specific hybridization the target nucleic acid obtained from the biological sample to be tested and the target nucleic acid is then detected.
  • a second probe called a “detection probe”, marked by an easily detectable element.
  • anti-sense oligonucleotides that is to say those whose structure ensures, by hybridization with the target sequence, an inhibition of the expression of the product. corresponding.
  • Oligonucleotides which, by interaction with proteins involved in the regulation of the expression of the corresponding product, will induce either an inhibition or an activation of this expression.
  • Oligonucleotides according to the invention has a minimum size of 9 bases, preferably at least 10, 12, 15, 17, 20, 25, 30, 40, 50 bases.
  • the probes, primers and oligonucleotides according to the invention can be labeled directly or indirectly with a radioactive or non-radioactive compound, by methods well known to those skilled in the art, in order to obtain a detectable and / or quantifiable signal.
  • the unlabeled polynucleotide sequences according to the invention can be used directly as a probe or primer.
  • Non-radioactive entities are selected from ligands such as biotin, avidin, streptavidin, dioxygenin, haptens, dyes, luminescent agents such as radioluminescent, chemoluminescent, bioluminescent, fluorescent, phosphorescent agents.
  • the present invention also relates to the cloning and / or expression vectors comprising a nucleic acid or coding for a polypeptide according to the invention.
  • a vector can also contain the elements necessary for the expression and optionally for the secretion of the polypeptide in a host cell.
  • a host cell is also an object of the invention.
  • the invention relates to an antisense expression vector.
  • an expression vector contains a polynucleotide sequence according to the invention, inserted in reverse orientation into the expression vector.
  • an mRNA corresponding to DNA in the antisense vector hybridizes with an mRNA corresponding to DNA in the sense vector.
  • An antisense expression vector is a vector which expresses an antisense RNA of interest in an appropriate host cell, either constitutively or after induction.
  • the term antisense refers to any composition containing a specific nucleic acid sequence.
  • Antisense molecules can be produced by methods such as synthesis or transcription.
  • the complementary nucleotides combine with the natural sequences produced by the cell to form duplexes and thus block either the transcription or the translation of the polypeptide according to the invention. It is also within the scope of the invention to produce antisense molecules capable of pairing with the RNA molecule which is the substrate for the RH116 RNA helicase, in order to block its biological activity.
  • the new compounds identified capable of decreasing or abolishing the level of expression and / or the RNA helicase activity of the polypeptide according to the invention constitute antagonists of the polypeptide according to the invention.
  • Antagonist refers to a molecule which, when it binds to the polypeptide according to the invention, reduces the quantity or the duration of the effects of the biological or immunological activity of the RH116 polypeptide. Antagonists include proteins, nucleic acids, carbohydrates, and all molecules that may decrease the effects of RH116.
  • Said vectors preferably comprise a promoter, translation initiation and termination signals, as well as suitable regions for regulating transcription. They must be able to be maintained stably in the cell and may possibly have specific signals specifying the secretion of the translated protein.
  • the promoter can be the promoter naturally present upstream of the gene coding for the human RH116 polypeptide of the invention.
  • the different control signals are chosen according to the cell host used.
  • the nucleic acid sequences according to the invention can be inserted into vectors with autonomous replication within the chosen host, or vectors integrative of the chosen host.
  • viruses possibly being in particular adenoviruses (Perricaudet et a, 1992), retroviruses, lentiviruses, poxviruses or herpesviruses (Epstein et al, 1992).
  • adenoviruses Perricaudet et a, 1992
  • retroviruses retroviruses
  • lentiviruses poxviruses
  • herpesviruses Epstein et al, 1992.
  • viruses are, for example, retroviruses (Temin, 1986), or AAVs (Carter, 1993).
  • naked polynucleotides are preferred such as naked DNA or naked RNA according to the technique developed by the company VICAL, artificial bacteria chromosomes (BAC, bacterial artificial chromosome), artificial yeast chromosomes (YAC, yeast artificial chromosome) for expression in yeast, mouse artificial chromosomes (MAC) for expression in murine cells and preferably human artificial chromosomes (HAC, human artificial chromosome ) for expression in human cells.
  • VICAL artificial bacteria chromosomes
  • BAC bacterial artificial chromosome
  • YAC yeast artificial chromosome
  • MAC mouse artificial chromosomes
  • HAC human artificial chromosome
  • Such vectors are prepared according to the methods commonly used by those skilled in the art, and the resulting clones can be introduced into an appropriate host by standard methods, such as, for example, lipofection, electroporation, heat shock, transformation after chemical permeabilization of the membrane, cell fusion.
  • the invention furthermore comprises the host cells, in particular the eukaryotic and prokaryotic cells, transformed by the vectors according to the invention.
  • the host cells in particular the eukaryotic and prokaryotic cells, transformed by the vectors according to the invention.
  • the cells which can be used within the meaning of the present invention mention may be made of bacterial cells (Olins and Lee, 1993), but also yeast cells (Buckholz, 1993), as well as animal cells, in particular cell cultures. mammals (Edwards and Aruffo, 1993), including Chinese hamster ovary (CHO) cells and human cells.
  • a preferred cellular host for the expression of the proteins of the invention consists of COS cells and Hela cells.
  • the invention also includes transgenic animals, preferably mammals, except humans, comprising one of said cells transformed according to the invention. These animals can be used as models, for the study of the etiology of pathology linked to an alteration of the animal counterpart of the natural human RH116 protein or for the study of the effects of a viral infection caused by a RNA virus, such as HIV, on the expression of the RH116 protein in the presence or absence of an antiviral treatment, such as an RH116 antagonist, such as, for example, murabutide.
  • an antiviral treatment such as an RH116 antagonist, such as, for example, murabutide.
  • mammals according to the invention animals such as rodents, in particular mice, rats or rabbits, which express a polypeptide according to the invention, are preferred.
  • transgenic animals according to the invention can overexpress the gene coding for the protein according to the invention, or their homologous gene, or express said gene into which a mutation is introduced.
  • transgenic animals in particular mice, are obtained for example by transfection of a copy of this gene under the control of a strong promoter of ubiquitous nature, or selective for a type of tissue, or after viral transcription.
  • the transgenic animals according to the invention can be made deficient for the gene coding for the polypeptide of sequence SEQ ID No. 2, or their homologous genes, by targeted inactivation by homologous recombination using or not the LOX-P / CRE system recombinase (Rohlmann et al, 1996) or by any other system for inactivating the expression of this gene.
  • These transgenic animals are obtained for example by homologous recombination on embryonic stem cells, transfer of these stem cells to embryos, selection chimeras affected at the level of the reproductive lines, and growth of said chimeras.
  • the transformed cells or mammals as described above can also be used as models in order to study the interactions between the polypeptides according to the invention, and the chemical or protein compounds, involved directly or indirectly in the activities of the polypeptides according to the invention, this in order to study the various mechanisms and interactions involved. They can in particular be used for the selection of products interacting with the polypeptides according to the invention, in particular the protein of sequence SEQ ID No. 2 or their variants according to the invention, as a cofactor, or inhibitor, in particular competitive, or also having an agonist or antagonist activity of the activity of the polypeptides according to the invention.
  • said transformed cells or transgenic animals are used as a model in particular for the selection of compounds making it possible to decrease the level of expression or the RNA helicase activity of the RH116 polypeptide of the invention.
  • the cells and mammals according to the invention can be used in a method for producing a polypeptide according to the invention, as described below.
  • the method for producing a polypeptide of the invention in recombinant form, itself included in the present invention is characterized in that the transformed cells, in particular the cells of the present invention, are cultured under conditions allowing the expression and optionally the secretion of a recombinant polypeptide encoded by a nucleic acid sequence according to the invention, and which said recombinant polypeptide is recovered.
  • the recombinant polypeptides capable of being obtained by this production method also form part of the invention.
  • sequences of the recombinant polypeptides can also be modified in order to improve their solubility, in particular in aqueous solvents. Such modifications are known to those skilled in the art profession such as the deletion of hydrophobic domains or the substitution of hydrophobic amino acids by hydrophilic amino acids.
  • polypeptides can be produced from the nucleic acid sequences defined above, according to the techniques for producing recombinant polypeptides known to those skilled in the art.
  • the nucleic acid sequence used is placed under the control of signals allowing its expression in a cellular host.
  • An efficient system for producing a recombinant polypeptide requires having a vector and a host cell according to the invention. These cells can be obtained by introducing into host cells a nucleotide sequence inserted into a vector as defined above, then culturing said cells under conditions allowing replication and / or expression of the transfected nucleotide sequence.
  • the methods used for the purification of a recombinant polypeptide are known to those skilled in the art.
  • the recombinant polypeptide can be purified from lysates and cell extracts, from the culture medium supernatant, by methods used individually or in combination, such as fractionation, chromatography methods, immunoaffinity techniques using 'specific monoclonal or polyclonal antibodies, etc.
  • a preferred variant consists in producing a recombinant polypeptide fused to a “carrier” protein (chimeric protein).
  • the advantage of this system is that it allows stabilization and a decrease in the proteolysis of the recombinant product, an increase in the solubility during the in vitro renaturation and / or a simplification of the purification when the fusion partner has a affinity for a specific ligand.
  • the polypeptides according to the present invention can also be obtained by chemical synthesis using one of the many known peptide syntheses, for example techniques using solid phases (see in particular Stewart et al, 1984) or techniques using partial solid phases, by condensation of fragments or by synthesis in conventional solution.
  • the polypeptides obtained by chemical synthesis and which may contain corresponding unnatural amino acids are also included in the invention.
  • the invention also relates to a monoclonal or polyclonal antibody and its fragments, characterized in that they selectively and / or specifically bind a polypeptide according to the invention. Chimeric antibodies, humanized antibodies and single chain antibodies are also part of the invention.
  • the antibody fragments according to the invention are preferably Fab, F (ab ') 2 or Fv fragments.
  • the polypeptides according to the invention make it possible to prepare monoclonal or polyclonal antibodies.
  • the monoclonal antibodies can advantageously be prepared from dtrybridomas according to the technique described by Kohler and Milstein in 1975.
  • the polyclonal antibodies can be prepared, for example by immunization of an animal, in particular a mouse, with a polypeptide according to the associated invention to an adjuvant of the immune response, then purification of the specific antibodies contained in the serum of the immunized animals on an affinity column on which has been previously fixed the polypeptide having served as antigen.
  • the polyclonal antibodies according to the invention can also be prepared by purification on an affinity column, on which a polypeptide according to the invention has previously been immobilized.
  • the antibody is capable of inhibiting the interaction between the RH116 polypeptide and the RNA sequence on which the latter binds in order to alter the physiological function of said RH116 polypeptide.
  • the invention also relates to methods for the detection and / or purification of a polypeptide according to the invention, characterized in that they use an antibody according to the invention.
  • the invention further comprises purified polypeptides, characterized in that they are obtained by a method according to the invention.
  • the antibodies of the invention in addition to their use for the purification of polypeptides, can also be used for the detection of these polypeptides in a biological sample.
  • the antibodies of the invention may also be labeled in the same manner as described above for the nucleic probes of the invention and preferably with labeling of the enzymatic, fluorescent or radioactive type.
  • the antibodies of the invention also constitute a means of analysis of the expression of polypeptide according to the invention, for example by immunofluorescence, gold labeling, enzyme immunoconjugates. More generally, the antibodies of the invention can be advantageously used in any situation where the expression of a polypeptide according to the invention must be observed, and more particularly in immunocytochemistry, in immunohistochemistry or in “western blotting” experiments. ".
  • the antibodies of the invention can be advantageously used in any situation where the expression of a polypeptide according to the invention, normal or mutated, must be observed.
  • a method of detecting a polypeptide according to the invention in a biological sample comprising the steps of bringing the biological sample into contact with an antibody according to the invention and of demonstrating the antigen-antibody complex formed is also an object of the invention.
  • a reagent kit for the detection and / or the assay of a polypeptide according to the invention in a biological sample characterized in that it comprises the following elements: (i) a monoclonal or polyclonal antibody as described above; (ii) where appropriate, the reagents for constituting the medium suitable for the immunological reaction; (iii) reagents allowing the detection of antigen-antibody complexes produced by the immunological reaction.
  • This kit is particularly useful for carrying out Western Blotting experiments; these make it possible to study the regulation of the expression of the polypeptide according to the invention from tissues or cells.
  • This kit is also useful for immunoprecipitation experiments in order to highlight in particular the proteins interacting with the polypeptide according to the invention.
  • This kit is also useful for carrying out the detection and / or the assay of a polypeptide according to the invention using a method which involves the ELISA technique, immunofluorescence, radioimmunology (RIA technique) or an equivalent technique.
  • the invention also includes a method for detecting and / or assaying a polynucleotide according to the invention, in a biological sample, characterized in that it comprises the following steps: (i) isolation of the DNA from starting from the biological sample to be analyzed, or obtaining a cDNA from the RNA of the biological sample; (ii) specific amplification of the DNA coding for the polypeptide according to the invention using primers; (iii) analysis of the amplification products.
  • kits for the detection and / or the assay of a nucleic acid according to the invention, in a biological sample characterized in that it comprises the following elements: (i ) a pair of nucleic primers according to the invention, (ii) the reagents necessary for carrying out a DNA amplification reaction, and optionally (iii) a component making it possible to verify the sequence of the amplified fragment, more particularly a probe according to the invention.
  • the invention also includes a method of detecting and / or assaying nucleic acid according to the invention, in a biological sample, characterized in that it comprises the following steps: (i) bringing a polynucleotide into contact according to the invention with a biological sample; (ii) detecting and / or assaying the hybrid formed between said polynucleotide and the nucleic acid of the biological sample. It is also an object of the invention to provide a kit for the detection and / or the assay of acid.
  • nucleic acid according to the invention in a biological sample, characterized in that it comprises the following elements: (i) a probe according to the invention, (ii) the reagents necessary for carrying out a hybridization reaction , and / or where appropriate, (iii) a pair of primers according to the invention, as well as the reagents necessary for a DNA amplification reaction.
  • the biological sample according to the invention in which the detection and the dosage are carried out consists of a bodily fluid, for example a human or animal serum, blood, or by biopsies.
  • These mutations can be detected directly by analysis of the nucleic acid and the sequences according to the invention (RNA, or cDNA), but also by means of the polypeptides according to the invention.
  • the use of an antibody according to the invention which recognizes an epitope carrying a mutation makes it possible to discriminate between a "healthy" protein and a protein "associated with a pathology".
  • This diagnostic and / or prognostic evaluation method can be used preventively, or to serve for the establishment and / or confirmation of a clinical condition in a patient.
  • the analysis can be carried out by sequencing all or part of the gene (ie the exons), or by other methods known to those skilled in the art. In particular, methods based on PCR can be used, for example PCR-SSCP which makes it possible to detect point mutations. It is also possible to carry out the analysis by fixing a probe according to the invention on a DNA chip containing at least one polynucleotide according to the invention and hybridization on these microplates. A DNA chip containing a sequence according to the invention is also one of the objects of the invention.
  • a protein chip containing an amino acid sequence according to the invention is also an object of the invention.
  • a protein chip allows the study of interactions between the polypeptides according to the invention and other proteins or chemical compounds, and can thus be useful for the screening of compounds interacting with the polypeptides according to the invention. It is also possible to use the protein chips according to the invention to detect the presence of antibodies directed against the polypetides according to the invention in the serum of patients. It is also possible to use a protein chip containing an antibody according to the invention.
  • Substances can also be tested and identified for their ability to modulate the enzymatic activities of the polypeptide of the invention.
  • the term “a substance which modulates an enzymatic activity” is intended to denote a substance which changes the enzymatic activity with respect to the enzymatic activity measured in the absence of the substance to be tested.
  • a substance can partially or totally inhibit RNA helicase activity; such activity can be measured by methods known to those skilled in the art.
  • synthetic oligonucleotides can be immobilized on a matrix and hybridized with a labeled complementary oligoribonucleotide.
  • the hybrid oligoribonucleotides are then used with a polypeptide of the invention, which releases a certain measurable amount of the labeled oligoribonucleotide, not attached to the matrix, taking into account its RNA helicase activity.
  • the effects of the presence or absence of potential modulators of the RH116 RNA helicase of the invention or one of its fragments can thus be tested.
  • RNA helicase activity is estimated by the ratio between the amount of monomeric RNA on the amount of duplex RNA.
  • Other protocols are also available (Rozen and ⁇ Z. (1990); Pause et al (1992); Lain et al. (1993), Lee and Hurwitz (1993)). These tests can be carried out in microplates in order to simultaneously test large quantities of modulators, of inhibitors of the polypeptide according to the invention.
  • Such substances can be previously developed and selected by molecular modeling in order to identify substances capable of reacting with a polypeptide of the invention. It is possible to identify a substance which affects the ability of the protein of the invention to bind with ATP or other substrates, such as RNA, DNA or RNA / protein complexes. Substrates which interfere with a substrate binding site of the protein of the invention or with a site which affects such functional epitopes can be identified by methods known to those skilled in the art (for review, see Fruehleis and ⁇ l. (1987); Perun et al. (1989); Van de Waterbeemd (1994), Blundell (1996).
  • the invention therefore relates to a method for screening a compound capable of affecting the level of cellular expression and / or the RNA helicase activity of an RH116 polypeptide according to the invention and which comprises the following steps of (i ) bringing into contact a cell chosen from the host cell of the invention and a eukaryotic cell, preferably human, expressing or containing the polypeptide according to the invention, and one or more potential compounds or ligands capable of penetrating or to be introduced into said cell, and (ii) detection and / or measurement of the level of cellular expression and / or of RNA helicase activity.
  • the gene coding for the polypeptide according to the invention which is present in the host cell or in a eukaryotic cell, preferably human, corresponds at least to a polynucleotide sequence coding for the polypeptide of the invention preferably in the form of DNA genomic or cDNA, operably linked to the promoter sequence of the human RH116 gene or the homologous gene of an animal species such as the mouse.
  • the compounds screened by such a method and capable of affecting the level of expression of RH116 RNA helicase are preferably compounds capable of to interact with the regulatory polynucleotide sequences (promoter, upstream sequence, "enhancer”, “silencer”, “insulator”, etc.) of the gene naturally encoding the polypeptide according to the invention or the compounds capable of interacting with transcription factors (general transcription factors or tissue-specific factors) involved in regulating the transcription of the gene coding for the polypeptide according to the invention, to form a complex capable of affecting the transcription of the gene coding for the RH116 polypeptide of l invention, that is to say to increase, decrease, modulate or cancel the transcription of said gene.
  • the regulatory polynucleotide sequences promoter, upstream sequence, "enhancer”, “silencer”, “insulator”, etc.
  • transcription factors generally transcription factors or tissue-specific factors
  • the techniques for detecting and / or measuring transcriptional activity are known to those skilled in the art. Mention should in particular be made of the Northern Blotting and RT-PCR technologies which can be used with the polynucleotides of the invention used as a probe or a primer respectively.
  • the invention also relates to a method for screening a compound capable of affecting the RNA helicase activity of a polypeptide according to the invention and which comprises the following steps of (i) bringing said polypeptide into contact with a or more compound (s) or potential ligand (s) in the presence of reagents necessary for the implementation of RNA helicase activity, and (ii) detection and / or measurement of RNA helicase activity.
  • the methods of screening for compounds described above are characterized in that said screened compound decreases or annihilates the level of expression and / or the RNA helicase activity of the RH116 polypeptide of the invention.
  • the compound capable of being obtained by the methods described above and which decreases the expression level and / or the RNA helicase activity of the RH116 polypeptide of the invention is an RH116 antagonist and also constitutes one of the objects of the invention.
  • this compound is characterized in that it is chosen from a polynucleotide according to the invention used as an antisense nucleic acid sequence, an antisense expression vector according to the invention, an antibody according to the invention, muramylpeptides, of preferably Murabutide, or among any other antagonist of the polypeptide according to the invention.
  • partial or total blocking of the biological activity of the RH116 polypeptide of the invention and of its fragments constitutes a means of inhibiting or suppressing viral replication.
  • the non-spliced genomic RNA and the incompletely spliced mRNA of retroviruses such as HIV need to be exported into the cytoplasm for packaging and / or translation.
  • Such a process is mediated either by a transport element acting in CIS for simple retroviruses (CIS-acting constitutive transport element or CTE), or by the viral protein Rev acting in TRANS with response elements (Rev Responsive element for RRE) for complex retroviruses such as HIV.
  • the RH116 RNA helicase according to the invention is capable of constituting a cofactor for the CTE and also playing a role in gene expression mediated by the RRE and thus playing a role in the replication of HIV.
  • the present invention therefore proposes to provide compounds capable of partially or totally blocking the RNA helicase activity of the polypeptide of the invention in order to reduce or destroy the replication of viruses.
  • a polynucleotide according to the invention used as an antisense nucleic acid sequence, an antisense expression vector according to the invention, an antibody according to the invention, muramylpeptides, preferably Murabutide , or any other antagonist of the polypeptide according to the invention.
  • the muramylpeptides and the Murabutide constitute antagonists of RH116 in the cells of HIV + patients.
  • the present invention is not limited to the HIV virus alone but to all the viruses directly or indirectly involving an RNA helicase in its replication.
  • virus is meant the DNA or RNA viruses, single-stranded or double-stranded, enveloped or non-enveloped.
  • the viruses belong to the family of retroviridae, orthomyxoviridae, rhabdoviridae, bunyaviridae, adenoviridae, hepadnaviridae, herpesviridae, poxviridae.
  • the hepadnaviruses are the hepatitis B and hepatitis C viruses.
  • the biological activity of the polypeptide of the invention is not limited to post-transcriptional control of viral RNAs alone, but also participates in the control transcriptional of RNA in general.
  • the polypeptide of the invention constitutes a therapeutic target of interest for compounds capable of altering the RNA helicase activity involved in other normal or pathological biological processes.
  • the RNA helicase constitutes a target of choice for compounds intended for the treatment of cancer. Indeed, various articles in the scientific literature deal with the involvement of RNA helicases in tumorigenesis.
  • an overexpression of the DEAD-boxl protein (DDX1) is likely to play a role in the progression of tumors such as neuroblastoma (Nb) and retinoblastoma (Godbout et al.
  • RNA helicases have been implicated directly or indirectly in tumorigenesis.
  • the murine protein p68 is mutated in tumors induced by ultraviolet light; the DDX6 RNA helicase gene is located at the chromosomal breakpoint associated with B cell lymphoma.
  • a chimeric protein comprising DDX10 and the nucleoporin NUP98 seems to be involved in the pathogenesis of certain myeloid diseases .
  • the compounds capable of decreasing or canceling the RNA helicase activity of RH116 therefore constitute compounds of interest intended for the preventive or curative treatment of cancer.
  • cancers capable of being treated with the RH116 antagonist compounds
  • cancers such as adenocarcinoma, leukemia, lymphoma, melanoma, myeloma, sarcoma, glioma, teratocarcinoma and more particularly cancers of the adrenal gland, bladder, bones, marrow, breast, gastrointestinal tract, liver, lung, pancreas, ovary, uterus, testes, prostate and throat.
  • the compounds capable of decreasing or canceling the R11 helicase activity of RH116 therefore constitute compounds of interest intended for the preventive or curative treatment of other pathologies such as rheumatism, hereditary diseases, arthritis, l osteosclerosis, osteoporosis, acute and chronic infectious diseases, autoimmune diseases, diabetes, as well as problems related to organ rejection during transplantation. More particularly, the invention relates to immune and autoimmune diseases which also includes AIDS (Acquired Immunodeficiency Syndrome).
  • AIDS Acquired Immunodeficiency Syndrome
  • the inhibitors, antagonists and other compounds capable of decreasing or canceling the R11 helicase activity of RH116 constitute compounds of interest for the preventive or curative treatment of autoimmune diseases. Indeed, it was recently reported by Takeda et al. (1999) that RNA A helicase acts as an autoantigen in patients with systemic lupus erythematosus.
  • the polynucleotide according to the invention used as an antisense nucleic acid sequence, the antisense expression vector according to the invention, the antibody according to the invention, the muramylpeptides, and preferably the Murabutide, or any other RH116 polypeptide antagonist according to the invention can be used for the treatment of autoimmune diseases.
  • autoimmune diseases it is worth mentioning more particularly, uveitis, Bechet's disease, sarcoidosis, Sjôgren syndrome, rheumatoid arthritis, juvenile polyarthritis, Fiessinger-Leroy-Reiter syndrome, gout , osteoarthritis, systemic lupus erythematosus, systemic lupus erythematosus, polymyositis, myocarditis, primary biliary cirrhosis, Crohn's disease, ulcerative colitis, multiple sclerosis and other demyelinating diseases, aplastic anemia, thrombocytopenic purpura, multiple myeloma and B-cell lymphoma, Simmonds panhypopituitarism, Graves-Graves disease and Graves ophthalmopathy, subacute thyroiditis and Hashimoto, Addison's disease, insulin-dependent diabetes mellitus (type 1), Addison's disease,
  • the method for screening the compound of the invention is characterized in that said screened compound increases the level of expression and / or the RNA helicase activity of the RH116 polypeptide of the invention.
  • the compound thus screened also subject of the invention, constitutes an agonist of the polypeptide according to the invention.
  • the agonist compounds capable of being obtained by the process of the invention mention should be made of muramylpeptides, and preferably Murabutide; in fact, the inventors have demonstrated experimentally that the latter compound, Murabutide, increases the expression rate of RH116 in the cells of healthy donors, thus behaving like an agonist of the polypeptide of the invention.
  • the invention relates to a method for screening for compounds capable of affecting the functional activity of a polypeptide according to the invention.
  • a method for screening for compounds capable of affecting the functional activity of a polypeptide according to the invention comprises the steps of (i) bringing said polypeptide into contact with one or more potential ligand (s) in the presence of reagents necessary for the implementation of a reaction chosen from the splicing reaction nuclear and / or mitochondrial RNA, RNA editing reaction, rRNA maturation reaction, translation initiation reaction, export reaction of nuclear mRNA to the cytoplasm , and the reaction of degradation of the mRNAs and of (ii) detection and / or measurement of said reaction.
  • a reaction chosen from the splicing reaction nuclear and / or mitochondrial RNA, RNA editing reaction, rRNA maturation reaction, translation initiation reaction, export reaction of nuclear mRNA to the cytoplasm , and the reaction of degradation of the mRNAs and of (ii) detection and / or measurement of said reaction
  • the invention therefore relates to a compound characterized in that it is chosen from an antibody according to the invention, a polypeptide according to the invention, a polynucleotide according to the invention, an oligonucleotide according to the invention, a vector according to the invention , an antisense expression vector according to the invention, a cell according to the invention, a compound capable of being obtained by the various screening methods according to the invention as a medicament and in particular as active principles of medicament; these compounds will preferably be in soluble form, associated with a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • pharmaceutically acceptable vehicle means any type of vehicle usually used in the preparation of injectable compositions, that is to say a diluent, a suspending agent such as an isotonic or buffered saline solution.
  • these compounds will be administered by the systemic route, in particular by the intravenous route, by the intramuscular, intradermal route or by the oral route.
  • Their optimal methods of administration, dosages and dosage forms can be determined according to the criteria generally taken into account in establishing a treatment adapted to a patient such as for example the patient's age or body weight, the severity of his general condition, tolerance to treatment and side effects observed, etc.
  • the compounds of the invention as medicaments are intended for the prevention and / or treatment of pathologies selected from the group consisting of cancer, acute or chronic infectious diseases such as infections with HIV or the virus 'hepatitis
  • hereditary genetic diseases immune and autoimmune diseases, rheumatism, arthritis, atherosclerosis, osteoporosis, diabetes and the prevention of organ transplant rejection.
  • the antagonist compounds of the RH116 polypeptide are particularly preferred for the preparation of a medicament intended for the treatment of viral pathologies such as acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) or hepatitis.
  • AIDS acquired immunodeficiency syndrome
  • hepatitis hepatitis
  • This other antiviral agent is preferably chosen from (i) nucleotide or non-nucleotide reverse transcriptase inhibitors such as for example 3'-azido-3'deoxythymidine (AZT), 2 ', 3'-dideoxyinosine (ddl ), 2 ', 3'-dideoxycytidine (ddC), (-) 2', 3'-dideoxy-3'-theacytidine (3TC), 2 ', 3'- didehydro-2', 3'dideoxythymidine ( d4T), (-) 2'-deoxy-5-fluoro-3'- theacytidine (FTC), TIBO, HEPT, TSAO, ⁇ -APA, nevirapine, BAHP, phosphonoformic acid ( PFA) and (ii) viral protease inhibitors such as indinavir and saquinavir.
  • This method comprises administering to a patient who requires such treatment, a therapeutically effective amount of an antagonist of the polypeptide of the invention.
  • the invention also relates to the use of a polypeptide according to the invention, of a polynucleotide according to the invention, of an agonist compound of a RH116 polypeptide according to the invention for the preparation of a medicament intended for the prophylactic treatment of pathologies.
  • vaccines in general induce immunity to an infection or a disease by generating an immune response in a patient against a specific antigen associated with the infection or with the disease.
  • the purified antigens are weak immunogens.
  • immunomodulatory agents such as an adjuvant or an immunostimulant should be used to enhance the immune response.
  • one of the disadvantages of many adjuvants used today is their toxicity.
  • polypeptides and polynucleotides of the invention and the agonist compounds of an RH 116 polypeptide according to the invention can be used for the preparation of a medicament intended to provoke or to increase the immune response to a vaccine in a patient.
  • FIGURE 1 Strategy used for obtaining the 3 'end of the cDNA coding for RH116.
  • the short upper fragment is the initial 164 bp fragment obtained by DD-RT PCR and corresponds to the 3 ′ region of the cDNA coding for the RH 116 polypeptide of the invention. This longer fragment of 1260 bp was obtained after a 3 'RACE (lower line).
  • FIGURE 2 Strategy for obtaining the 5 'region of the cDNA coding for RH116.
  • A The part of the 5 ′ end was obtained after two PCR reactions (5 ′ RACE) for Rapid Amplification of cDNA Ends, ie rapid amplification of the ends of the cDNAs, the fragments obtained are symbolized in (.... ) (R3) and in (-) (R8). This strategy therefore enabled the inventors to obtain an open reading frame of 853 amino acids.
  • the HELI let HELI 2 oligonucleotides which will serve as primers for RT-PCR are indicated.
  • B The 5 'terminal part of the cDNA corresponding to the RH116 polypeptide was obtained after a PCR reaction using the primer R16 (5'RACE). The fragment obtained from
  • FIGURE 3 Amino acid sequence of the putative human RNA helicase RH 116 and comparison with the putative RNA helicase (RIG-1).
  • (AT) Schematic representation of the highly conserved amino acid regions characteristic of putative dependent ATP RNA helicases of the “DEAD-BOX” protein family. The conserved motif is framed (the "x> indicates any amino acid), a SAT motif, -A- is the highly conserved amino acid, S and T can be replaced by any amino acid in in any individual case (Luking et al, 1998). In the motif VI (X) ⁇ -2 indicates any of the 2 amino acids.
  • sequence homologies are presented in the intermediate line for the two sequences: the boxed sequences correspond to the conserved domains of RNA helicases; the G-GKT and DEXH domains correspond to the ATPase domains and the SAT (-A-) and RGR-R domains (GR— R), specific for RNA helicases, are responsible for the binding and unfolding of target RNA.
  • FIGURE 4 Northern-blot analysis of the expression of messenger RNA RH 116 in multiple human tissues (CLONTECH).
  • PolyA + RNA obtained from brain (1), heart (2), skeletal muscle (3), colon (4), thymus (5), spleen (6), kidney (7), liver (8), small intestine (9), placenta (10), lung (11), peripheral blood leukocytes (12) were hybridized with an oligonucleotide probe derived from the messenger RNA of RH 116 and marked at its end with 32 P phosphorus (upper part of the figure). Equivalent amounts of polyA + RNA are also hybridized with a ⁇ -actin probe used as a control (lower part of the figure). Both in the heart and in the skeletal muscle, there are two forms of ⁇ -actin messenger RNA, a 2 kb form and a 1.6-1.8 kb form. This size difference is not due to a degradation of the messenger RNA but to the hybridization of the probe with either the ⁇ form or the ⁇ form of actin (see the instructions from the manufacturer CLONTECH).
  • FIGURE 5 Inhibition of the expression of the messenger RNA RH 16 induced by the murabutide in PBMCs endogenously infected and depleted in CD8.
  • the PBMC activated by PHA and depreciated in
  • CD8 are maintained in culture, in the absence (medium) or in the presence of murabutide at 10 ⁇ g / ml for 6 or 24 hours.
  • A RNA samples
  • RNA RH 116 (20, 100 and 500 ng) are subject to amplification by RT PCR with a pair of specific primers to detect the messenger RNA RH 116.
  • the GAPDH messenger RNA (internal control) constitutively expressed is also amplified in the same samples.
  • B The mean percentage inhibition of the expression of the messenger RNA of RH 116 is observed in samples from 5 patients infected with HIV-1.
  • FIGURE 6 Immunoprecipitation of the RH 116 protein from cell extracts labeled with iodine 125 I obtained from U937 cells.
  • A Total cell extracts (1, 2) or nuclear extracts (3, 4) are labeled and immunoprecipitated using 20 ⁇ g of immunoglobulins purified from normal serum (1, 3) or murine serum obtained against protein RH 1161-335 (2,4). The samples are loaded onto an 8% SDS-PAGE gel.
  • FIGURE 7 The immuno-localization of the RH 116 protein in HeLa-CD4 + cells.
  • Hela-CD4 + cells fixed in methanol are incubated with normal murine serum (A), anti-histone Hl monoclonal antibodies (Santa Cruz) (B) or a murine anti-serum directed against protein RH I I61-335 (C), and are stained with anti-goat mouse IgG antibodies conjugated to FITC and / or with propidium iodide.
  • the immunofluorescence shows a green FITC staining (1), a red nuclear counter staining corresponding to propidium iodide (2) and the double staining (3).
  • FIGURE 8 Expression of the P24 viral antigen by HeLa CD4 + cells transfected and infected with the VIK-1 virus. Cells
  • HeLa CD4 + are transiently transfected, on the one hand with the pEGFP plasmid (GFP) or with the pEGFP plasmid into which the RH 116 or SSA cDNAs are respectively cloned (GFP-RH 116 and GFP-SSA respectively) and, on the other hand, with the plasmid pCR3 or the plasmid pCR3 in which is cloned Tat (pCR3-Tat); the cells are infected 24 hours later with the HIV-1 LAI virus. From 2 ven days after infection of the cells, the culture media were collected daily until
  • the viral replication is evaluated by the release of the P24 antigen by the cells (cell concentration normalized to 5 ⁇ 10 5 cells / ml) in the supernatants of the cultures of cells transfected with GFP, GFP-RH 116 or GFP-SSA ( A) and cells transfected with pCR3 or pCR3-Tat (B).
  • C Increase in the P24 antigen in the cells infected and transfected with GFP-RH 116, GFP-SSA or Tat compared with the respective corresponding controls (GFP or pCR3 respectively).
  • the results correspond to the mean values plus or minus the standard deviation of the values obtained for 5 (GFP-RH 116 and GFP-SSA) and for 3 independent experiments (pCR3-Tat).
  • FIGURE 9 RT semi-quantitative PCR representative of the expression of viral DNA and messenger RNA in HeLa-CD4 + cells transfected and infected with the HIV-I L ⁇ virus.
  • RNA samples 500, 100, 20 and 4 ng are subject to amplifications RT PCR with specific primers to detect overexpression of mRNAs encoding the protein RH 116, SSA-56 or TAT (A).
  • RNA samples are subjected to RT PCR amplifications to detect viral mRNA (B) with a pair of primers GAG04-GAG06 to detect non-spliced GAG or POL mRNAs and with a pair of primers BSS / KPNA to detect mid-size or simply spliced viral transcripts. These messenger RNAs are named based on the exons they contain and the proteins they produce (Neuman, 1994).
  • C The total DNA is extracted 24 hours after infection and variable concentrations (150, 30, 6 and 1.2 ng) are used as a template for amplification by PCR using a pair of primers GAG04 -GAG06 in order to detect the GAG gene of HIV-1. The cell equivalent is determined by amplification of the ⁇ -actin or GAPDH genes.
  • FIGURE 10 Detection of autoantibodies directed against the protein
  • LABORATOIRE DE VIROLOGIE, Lille, France and U937 cells are respectively cultivated in DMEM medium or RPMI 1640 medium supplemented with 10% heat-inactivated fetal calf serum (LIFE-TECHNOLOGIES-INVITROGEN, Cergy-Pontoise, France ), 2 mM L-glutamine (LIFE-TECHNOLOGIES-INVITROGEN, Cergy-Pontoise, France) and 1% gentamycin (SHERING-PLOUGH, Levallois-Perret, France).
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • the cells are then cultured in RPMI 1640 supplemented with 10% heat-inactivated AB serum (BLOOD TRANSFUSION ESTABLISHMENT, Lille, France) and then stimulated with phytohemaglutinin (PHA) (5 ⁇ g / ml for 3 days).
  • PHA phytohemaglutinin
  • the PBMCs are then cultured and then recovered in the presence or absence of murabutide (N-acetyl-muramyl-L-alanyl-D-glutamine-n-butyl ester) (supplied by ISTAC SA, Lille, France) (10 ⁇ g / ml) and interleukin 2 (IL-2) (10 ⁇ g / ml) for 6 or 24 hours.
  • murabutide N-acetyl-muramyl-L-alanyl-D-glutamine-n-butyl ester
  • IL-2 interleukin 2
  • DD-RT-PCR differential display-RT-PCR
  • oligo primers for 10 minutes in the presence of 2 mM of oligo primers (dT), T12BA (B being a mixture of G, T, C), T12VT (V being a mixture of A, G, C), T12HG (H being a mixture of A, C, T), T12DC (D being a mixture of A, G, T) and ribonuclease-free water, in a final volume of 11 ⁇ l .
  • the complementary DNA is then synthesized using the reverse transcriptase RNAse H Superscript (LIFE-TECHNOLOGIES-INVITROGEN, Cergy-Pontoise, France) in 25 ⁇ l containing 10 mM of dithiotreithol, 20 ⁇ m of dNTP for one hour at 37 ° C before denaturing for 10 min at 95 ° C.
  • RNAse H Superscript LIFE-TECHNOLOGIES-INVITROGEN, Cergy-Pontoise, France
  • the synthesized cDNA is then amplified with an Ampli Taq Gold polymerase unit (APPLIED BIOSYSTEMS, Foster City, CA, United States), 2.5 mM of MgCb, 2 ⁇ M of dNTP, 2 ⁇ Ci of 33 P-dATP (AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH) using specific primers downstream and random primers upstream: AP0: TAT CGA CTC CAA G (SEQ ID N ° 27); API: TTA GCT AGC ATG G (SEQ ID N ° 28); AP2: TGC TAA GAC TAG C (SEQ ID No. 29); AP3: TTG CAG TGT GTG A (SEQ ID No.
  • AP4 TGT GAC CAT TGC A (SEQ ID No. 31); AP5: TGT CTG CTA GGT A (SEQ ID No. 32); AP6: TGC ATG GTA GTC T (SEQ ID No. 33); AP7: TGT GTT GCA CCA T (SEQ ID No. 34); AP8: TAG ACG CTA GTG T (SEQ ID N ° 35); AP9: TTA GCT AGC AGA C (SEQ ID No. 36); AP10: TCA TGA TGC TAC C (SEQ ID No. 37); AP11: TAC TCC ATG ACT C (SEQ ID No. 38); AP12: TAT TAC AAC GAG G (SEQ ID No.
  • AP13 TAT TGG ATT GGT C (SEQ ID No. 40); AP14: TAT CTT TCT ACC C (SEQ ID No. 41); AP15: TAT TTT TGG CTC C (SEQ ID No. 42); API 6: TTA TCT ATA CAG G (SEQ ID No. 43); AP17: TTA TGG TAA AGG G (SEQ ID No. 44); AP18: TTA TCG GTC ATA G (SEQ ID No. 45); AP19: TTA GGT ACT AAG G (SEQ ID No. 46).
  • the amplification parameters are 1 min at 94 ° C, 1 min at 40 ° C, 1 min at 72 ° C, followed by a final extension step of 5 min at 72 ° C.
  • the PCR products are then separated by electrophoresis on a 6% gel polyacrylamide-8 M urea. After drying, the gel is then exposed on a Hyperfilm-HP film.
  • CDNA bands expressed in a different manner are excised from the gel, eluted in 100 ⁇ l of sterile water, precipitated then resuspended in 10 ⁇ l of sterile water.
  • the cDNA fragments are then re-amplified using the same pair of primers described above and subsequently cloned in the cloning vector TOPO TA PCR II (INVITROGEN, Groningen, Netherlands).
  • DNA sequencing The cloned cDNAs are used as a template for sequencing using the sequencing kit "PRISM Ready Reaction Dye Deoxy Terminator" from APPLIED BIOSYSTEMS. The samples are subjected to electrophoresis on an ABI 377 DNA sequencer; they are read automatically and then saved using the ABI Prism software, version 2.2.1, from APPLIED BIOSYSTEMS. Homology searches in nucleotide databases were performed using the Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) program.
  • BLAST Basic Local Alignment Search Tool
  • RNA plus kit Q-BIOgene, Illkirch, France
  • DNAsel The total cellular RNA extracted using the RNA plus kit (Q-BIOgene, Illkirch, France) is pretreated with DNAsel.
  • the synthesis of the first strand on the polyA + RNA was initiated with a p (dT) i5 primer (BOERHINGER MANNHEIM, ROCHE DIAGNOSTICS, France) and carried out by reverse transcriptase derived from the Moloney murine leukemia virus (M-MLV ) (PROMEGA, Madison, CA, USA) (1 hour at 37 ° C, 3 min at 92 ° C).
  • M-MLV Moloney murine leukemia virus
  • PROMEGA Moloney murine leukemia virus
  • PROMEGA Moloney murine leukemia virus
  • PCR amplification of GAPDH sequences is carried out to obtain internal control.
  • the specific oligonucleotide primers are as follows: GAPDH [Sense strand: 5'- GCC ATC AAT GAC CCC TTC ATT GAC-3 '(SEQ ID No.
  • anti-sense strand 5'- TGA CGA ACA TGG GGG CAT CAG CAG -3 '(SEQ ID N ° 20)], RH 116 (Sense direction: 5'- GGA AGT ACA ATG AGG GCC TAC AAA-3' (SEQ ID N ° 13); antisense strand: 5'-TCC TCA GTC CTA GTA TAT TGC TCC-3 '(SEQ ID N ° 14)], SSA-56 [Sense direction: 5'-GAA AGA GAG GTC GCA GAG GCC TGT-3' (SEQ ID N ° 47); antisense strand : 5'-TGA TAA GGC TGA GGA AGG GAA ATG-3 '(SEQ ID N ° 48)], Tat (Sense strand: 5'- CTA GAC CCC TGG AAG CAT CCA-3' (SEQ ID N ° 49); antisense strand: 5'-TCG GGC CTG TCG GGT CCC CTC-3 '(SEQ
  • PCR products are then separated on 2% agarose gels and then visualized by staining with ethidium bromide.
  • imaging systems IMAGE MASTER ID PRIME, AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH
  • the percentage variation in messenger RNA expression was deduced after normalization with respect to the levels of the corresponding internal standards, as previously described (Amiel and al, 1999).
  • the cloning of the full-length RH116 cDNA was carried out using the SMART TM RACE cDNA amplification kit (CLONTECH, Palo Alto, CA, USA) on polyA + RNA samples from PBMC of healthy patient deputized in CD8 .
  • SMART TM RACE cDNA amplification kit CLONTECH, Palo Alto, CA, USA
  • polyA + RNA samples from PBMC of healthy patient deputized in CD8 .
  • a human spleen bank ⁇ TriplEX TM Library CLONTECH
  • the Northern Blotting analysis was carried out using the “Multiple Tissue Northern” kit (MTN TM) (CLONTECH) according to the manufacturer's instructions.
  • MTN TM Multiple Tissue Northern
  • the polyA + RNA was hybridized with the oligonucleotides 5'-CGT GCT GAT TCC TCA GTC CTA GTA TAT TGC-3 '(SEQ ID N ° 26) and 5'-GCA TCT GCA ATG GCA AAC TTC TTG CAT GGC-3' (SEQ ID No. 18) e derived from the cDNA sequence of RH 116 and labeled at the ends with phosphorus 32 P.
  • the membranes are rehybridized with a cDNA probe of human ⁇ -actin. 8. Expression of the protein tagged with a His-Tag and production of mouse polyclonal antibodies:
  • a partial fragment corresponding to the first 335 amino acids of the messenger RNA RH116 was amplified using specific oligonucleotides (SEQ ID No. 21 and SEQ ID No. 22) and was subcloned into the vector pQE-81 (QIAGEN , Courtab ⁇ uf, France), previously cut with the enzymes BamHI and Sali.
  • the resulting plasmid pQE-81-His6-RH116 ⁇ -335 is then transformed into E. coli TOP 10F 'cells.
  • the transformed cells are then cultured and induced with 1 mM isopropyl-1-thio- ⁇ -D-galactopyranoside for 5 hours. Purification under denaturing conditions is carried out using Ni-NTA beads according to the manufacturer's recommendations (QIAexpressionist TM QIAGENE).
  • the partial recombinant protein RH I I61-335 (50 ⁇ g), emulsified in a complete Freund's adjuvant (SIGMA, Saint-Louis, MI, USA), is used to immunize a mouse by intraperitoneal injection. After 30 days, the animals are stimulated with 50 ⁇ g of the same recombinant protein emulsified with the incomplete Freund's adjuvant (SIGMA) and 15 days later with 50 ⁇ g of the same protein without adjuvant. The sera are collected 10 days after the last stimulation and are tested for the level of anti-RH116 antibodies.
  • SIGMA complete Freund's adjuvant
  • the immunoglobulins are then purified from the anti-sera according to the method using caprylic acid (Steinbuch and Audran, 1969) and concentrated by precipitation with saturated ammonium sulfate. Prior to immunization, sera are collected and used as a negative control. The anti-sera and immunoglobulin activities are tested by ELISA, as described below.
  • HeLa-CD4 + are cultured on chamber slides (NALGE, Nunc, Rochester, NY, USA) and fixed and permeabilized with a methanol / acetone mixture (2V / 1V) for 10 min at -20 ° C. After humidification in PBS containing 1% bovine serum albumin (BSA) for 30 min, the samples are incubated with the first antibody at room temperature for 45 min in PBS containing 0.5% BSA.
  • BSA bovine serum albumin
  • the normal mouse serum and the anti-serum directed against RH I I61-335 is used at a dilution of 1/20; the anti-histone 1 monoclonal antibody IgG2a (SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGIES, USA) and an antibody-control which corresponds to this type of isotype are used at a concentration of 1 / 50th.
  • the samples are stained with an anti-mouse IgG goat antibody conjugated to FITC (fluorescein isothiocyanate) (SIGMA). After several washes, the samples are incubated for 3 min in PBS containing 0.5 ⁇ g / ml of propidium iodide and then examined by fluorescence microscopy.
  • the subcellular fractionation is prepared as described in Li-Ru et al. (1999). Briefly, for the preparation of total cell lysates, the cells are lysed in a buffer containing 10 mM Tris-HCl pH 7, 1, 1 mM EDTA, 1% triton X-100, 1 mM PMSF, 1 mM Na3VO 4 , 10 ⁇ M E-64 (Trans-Epoxy-Succinylt-L-Leucylamido- (4-guanidino) -butane), 1 ⁇ g / ml of pepstatin and 0.1% aprotinin.
  • the cell pellets are incubated in a hypotonic buffer (20 mM HEPES pH 7.4, 1 mM MgCb, 10 mM KC1, 0.5% Nonidet P40, 0.5 mM dithiotreitol (DTT), 1 mM PMSF, 1 mM Na3V ⁇ 4, 10 ⁇ M E64, 1 ⁇ g / ml pepstatin, 0.1% aprotinin at 4 ° C.
  • a hypotonic buffer (20 mM HEPES pH 7.4, 1 mM MgCb, 10 mM KC1, 0.5% Nonidet P40, 0.5 mM dithiotreitol (DTT), 1 mM PMSF, 1 mM Na3V ⁇ 4, 10 ⁇ M E64, 1 ⁇ g / ml pepstatin, 0.1% aprotinin at 4 ° C.
  • the cell lysates are mixed with a 2 ⁇ SDS deposition buffer incubated at 100 ° C. for 5 min then separated by electrophoresis on a 15% SDS-PAGE polyacrylamide gel and finally transferred to a nitrocellulose membrane (Hybond-C-Amersham). .
  • the membranes are saturated with PBS (phosphate buffered saline) containing 5% non-fat milk for 1 hour at room temperature, followed by an incubation of the primary antibody (dilution 1 / 100th for the anti-histone 1 antibody; dilution 1 / 1000th for the anti-Golgi antibody 58 K) at 4 ° C overnight.
  • the membranes After washing with PBS 0.1% Tween-20, the membranes are incubated with a second antibody conjugated to horseradish peroxidase (1/1000) (SIGMA) at room temperature for 1 hour. The bands transferred to the membranes are detected by incubation with an enhanced chemiluminescence reagent (ECL) (Amersham) and exposed to a KODAK XOMAT film.
  • SIGMA horseradish peroxidase
  • each cell extract 500 ⁇ g of each cell extract are radiolabelled with 500 ⁇ Ci of iodine 125 I, using the chloramine T method.
  • 3 ⁇ 10 6 CPM of cell extracts are pretreated for 2 hours with normal mouse serum and 50 ⁇ l of protein G sepharose (PHARMACIA) in TNSTEN buffer (50 mM Tris-HCl pH8.2, 0.5 M NaCl, 0.1% SDS, 0.5%
  • the immunoprecipitations are carried out by adding 20 ⁇ g of immunoglobulins purified from anti-RH serum 1161-335 or normal serum and 50 ⁇ l of protein G sepharose. After an overnight incubation at 4 ° C, the sepharose beads are washed 10 times with TNSTEN buffer and then resuspended then boiled in a concentrated SDS-PAGE 2X deposition buffer. The proteins are separated on an 8% SDS PAGE gel and then analyzed by autoradiography. 13.
  • All the plasmids used are prepared using materials devoid of endotoxin (“EndoFree TM”, Giga Kit, QIAGEN).
  • EndoFree TM endotoxin
  • pEGFP-N1 mammalian expression vector pEGFP-N1 (CLONTECH).
  • the resulting chimeric construct consists of a full-length RH 116 protein fused to the carboxy-terminal end of the green fluorescence protein (GFP). The fusion in a correct reading frame of the cDNA is controlled by sequencing.
  • the coding sequence of any protein such as SSA was subcloned into the vector pEGFP-N1 (GFP-SSA) and used as a control.
  • SSA available in the inventors' laboratory
  • the transfection is carried out using Effectene (QIAGEN) as a transfection reagent and used according to the manufacturer's protocol.
  • 2 X 10 5 cells are seeded per well in 12-well plates and are subsequently transfected using 1 ⁇ g of DNA and 10 ⁇ l of Effectene in triplicate experiments.
  • the cells are infected with HIV-ILAI 24 hours after transfection.
  • the T cell strain with a tropism for HIV-ILAI is obtained from the Central Virology Laboratory in Lille, France.
  • 5 ⁇ 10 4 CPM of viral reverse transcriptase (RT) activity are added to each well.
  • the cells are incubated overnight at 37 ° C.
  • the viruses are then removed and the cells are washed twice and a fresh medium is added. 1 day after infection and for the following 4 days, the supernatants are collected in each of the wells and the cells are recovered and counted.
  • Viral replication is assessed by detecting HIV-1 DNA and RNA, 24 hours after infection or by detecting the presence of the p24 protein in the supernatants between 2 days and 5 days after infection.
  • RNA of HIV-1 Total cellular DNA is extracted from cells infected with HIV-1 24 hours after infection, then subjected to 35 cycles of amplification with DNA. "AmpliTaq Gold" polymerase. The PCR amplification of the ⁇ -actin sequences is carried out with the oligonucleotides 5'-GGG TCA GAA GGA TTC CTA TG-3 '(SEQ ID No. 51) and 5'-GGT CTC AAA CAT GAT CTG GG-3' ( SEQ ID N ° 52) to standardize the equivalence between cells.
  • the proviral DNA HIV-1 of each sample is measured using the primer GAG06 (5'-GCI TTI AGC CCI GAA GTI ATA CCC ATG-3 '; SEQ ID N ° 53) and GAG04 (5'-CAT ICT ATT TGT TCI TGA AGG GTA CTA G-3 '; SEQ ID N ° 54).
  • the total cellular RNA is extracted using the RNAplus kit (Q-BIOgene) and then amplified using rTth polymerase (Applied Biosystems) in the presence of the primer pair GAG06 -GAG04 to detect HIV-1 non-spliced GAG-POL mRNA and in the presence of the primer pair BSS (5'-GGC TTG CTG AIG NGC ICA CIG CAA GAG G-3 '; SEQ ID No. 55) - KPNA (5'-AGA GTI GTG GTT GNT TCN TTC CAC ACA G-3 '; SEQ ID No.
  • Viral replication is evaluated by measuring the level of p24 antigen in the culture supernatants using the HIV-1 p24 antigen test kit (Coulter, Miami, USA) according to the manufacturer's instructions.
  • the plates are covered with 1 ⁇ g / ml of RHI I61-335 in coating buffer (30 mM Na2CO3, 70 mM NaHCO ⁇ ) for 3 hours at 4 ° C. After 3 washes in PBS containing 0.05% Tween-20 (PBS-Tween), the plates are incubated for 2 hours with sera diluted from 1/300 to 1/2700. The plates are then washed and incubated overnight at 4 ° C. with a human IgG antibody (SIGMA) conjugated to peroxidase.
  • SIGMA human IgG antibody
  • the plates are developed for 30 minutes using 0.5 mg / ml of a substrate with O-phenylene-diamine-dihydrochloride (SIGMA) and 0.1% H 2 O2 and the reaction is stopped by the addition of 50 ⁇ l / well of HC1 IN.
  • SIGMA O-phenylene-diamine-dihydrochloride
  • the absorbance values are read at 492 nm using a reader automatic microplates (TITERTEK MULTISKAN, LABYSYSTEMS, Finland). Similar protocols are used to assess the presence of antiRH116 antibodies in the sera of immunized mice, except that the conjugate used is an anti-mouse antibody in place of an anti-human IgG antibody.
  • RNA of PBMC unstimulated and of PBMC depleted in CD8 stimulated by murabutide and obtained from an HIV-1 patient are analyzed by DD-RT-PCR.
  • the inventors have selected more than 130 differentially expressed cDNA fragments after treatment of the PBMCs of an HIV + patient with murabutide. These fragments were subcloned into the vector Pcr2.1 (Invitrogen), then sequenced by automatic sequencing (ABI Prism 377, Perkin-Elmer). The sequences were analyzed for homology searches using the databases and the Basic Local Alignment Search Tool (Blast 2) server of the NCBI.
  • Blast 2 Basic Local Alignment Search Tool
  • the expression of a number of genes appears to be upregulated or downregulated after treatment with murabutide for 6 or 24 hours. Of these, 3 genes correspond to aluminum repeats, 20 sequences correspond to ESTs or sequences from genomic databases, and 49 sequences are well characterized genes. Of the genes regulated by muramutide, 28 have increased expression and 21 have their expression inhibited. The expression profile of 14 positively regulated genes and 7 negatively regulated genes by murabutide was confirmed by RT-PCR or by reverse Northern-Blot in the form of "dot-blot" (data not shown) on PBMC RNA extracts depripped in CD8 obtained from 3 other patients.
  • the modulation of expression by murabutide was also verified among the sequences identified by DD-RT-PCR which correspond to ESTs or the genomic sequences of databases.
  • 6 clones exhibit increased expression: 4 clones (clones 1, 71, 87 and 99) following a treatment of 6 hours, 2 clones (clones 11 and 89) following a treatment of 24 hours.
  • 4 identified sequences induce an inhibition of expression: 2 clones (clones 7 and 10) following a 6 hour exposure to murabutide and 2 clones (clones 62 and 96) following a 24 hour exposure to murabutide.
  • the expression profile of the new murabutide-regulated gene corresponding to clone 10 was studied by semi-quantitative RT PCR and the corresponding full-length cDNA was cloned and characterized.
  • EXAMPLE 2 Full-length cloning of the RH116 gene modulated by murabutide.
  • the full length DNA sequence corresponding to clone 10 was obtained 5 'and 3' RACE strategy. Based on the cDNA fragments obtained by DDRT PCR, a first cycle of RACE 5 'and RACE 3' allowed the inventors to characterize the polyA + end of this new gene and to extend the cDNA sequence in the 5 'part of the gene. The complete 5 'end of the cDNA was obtained following 3 steps of 5' RACE. Screening of a cDNA library enabled the inventors to confirm the full length cDNA sequence. The complete nucleotide sequence was obtained by determining the overlapping sequences of 2 different clones. The full length cDNA sequence has been submitted to GeneBank (Accession # AY 017378).
  • a 164bp long fragment obtained by DD-RT-PCR
  • the inventors synthesized two specific primers including FI: 5 'TGA TGA GGG TGG TGA TGA TGA GTA TTG TG 3 '(SEQ ID N ° 4) in order to achieve a first amplification by the 5' and 3 'RACE.
  • the inventors were thus able to obtain a fragment of 1284 bp thanks to the amplification from FI.
  • This fragment was sequenced in several stages thanks to the specific internal primers F2 (5 '-GCA GTG AGT TCA AAC CCA TGA CAC AGA ATG -3') (SEQ ID N ° 5) and R2: (5'- CAG CAT TCT GAA TAG TCA AGA TTG GGA AAT G -3 ') (SEQ ID N ° 6); the sequence of this fragment corresponds to the sequence SEQ ID No. 7. This presents a framework open reading of 380 amino acids up to a potential stop codon which is followed after 119 bp by a poly A + tail ( Figure No. 1).
  • the inventors synthesized a primer R3 (SEQ ID No. 8) which corresponds to the complementary sequence of FI; the primer R3 made it possible after PCR to obtain a 194bp sequence (symbolized in dotted lines .... in FIG. 2A).
  • the inventors synthesized a new primer R8 (SEQ ID No. 9): 5'-GTA GGG CCT CAT TGT ACT TCC TCA AAT-3 ') in order to determine the sequence at position 5' of the cDNA : a PCR reaction made it possible to obtain a fragment of around 1200 bp (symbolized by a dash - - in FIG. 2a) (SEQ ID No. 10).
  • the complete sequencing of the fragment was carried out in several stages using internal oligonucleotides R8-seq 1 (5 'CTC CAA CAC CAG GTG AAG CTG 3') (SEQ ID No. 11) and R8-seq 2 (5 'CAG ATG AAG AGA ATG TGG CAG 3 ') (SEQ ID N ° 12).
  • the reading frame remains open and identifies a reading frame of 853aa.
  • HELI 1 (5 * - GGA AGT ACA ATG AGG GCC TAC AAA-3 ')
  • HELI 2 5'-tcc tca gTc cta gta tat tgc tcc-3 ')
  • SEQ ID N ° 14 5'-tcc tca gTc cta gta tat tgc tcc-3 '
  • the 5 ′ end of 964 bp obtained after the PCR reaction contains a potential ATG codon which is preceded by a STOP codon whose presence will be confirmed later.
  • This strategy therefore enabled the inventors to obtain an open reading frame (ORF open reading frame) of 1025 amino acids.
  • the complete sequence of the cDNA corresponding to RH116 is now 3372 bp and corresponds to SEQ ID No. 1 and codes for a protein of 1025 aa which corresponds to SEQ ID No. 2.
  • TGA STOP codon
  • the sequence of this fragment confirmed the presence of the TGA codon before the initiator ATG codon thus confirming that the inventors have the complete copy of the cDNA.
  • the cDNA sequence (3,372 base pairs) contains an initiation codon at position 155 and an open reading frame (ORF) of 3,075 base pairs as well as a 3 'non-transcribed region of 141 base pairs with a AATAAAA consensus polyadenylation signal located 24 base pairs upstream of a 21 base pair polyA + tail.
  • the ORF codes for a polypeptide of 1025 amino acids (FIG. 2B) with a calculated molecular mass of 116 kdaltons and an isoelectric point of 5.2.
  • RNA helicase superfamily conserved domains belonging to the RNA helicase superfamily and more specifically from the family of proteins known to have RNA dumblelase functions dependent on ATP.
  • classes of helicases based on this sequence homology (Luking et al, 1998) are present proteins called "DEAD-BOX".
  • An important characteristic of all “DEAD-BOX” RNA helicases is the presence of characteristic patterns spaced from each other by a conserved distance (Luking et al, 1998; Linder and Daugeron, 2000). Despite minor differences, these motifs are present in the new cloned sequence (FIG. 3 A and 3B).
  • RH 116 for RNA helicase 116 kdaltons
  • RH 116 constitutes a member of the sub-family of “DEAD-BOX” proteins of RNA helicases dependent on ATP.
  • the inventors also (T) noted the presence of a KKKK motif at position 349 amino acids, but no bi-partite motif of nuclear localization signal A could be clearly identified. 8 N-glycosylation sites were detected and potential phosphorization sites were found for cAMP-dependent kinase as well as protein kinase C; the biological significance of these sites has not been studied.
  • RH 116 protein exhibited, apart from its general sequence homology with the members of the “DEAD-BOX” protein family, a strong% of homology with a hypothetical and hitherto uncharacterized human RNA helicase, called “RIG-1” (FIG. 3b C) described by Sun, YW (Genbank, accession number: AF038963).
  • FIG. 3b C The alignment of the sequences is presented in FIG. 3b C.
  • the total identity of the amino acid sequence between the two proteins is 31% and the similarity which includes conservative exchanges is 44%.
  • EXAMPLE 4 Study by Northern blotting of the expression of the mRNA of RH 116 in different tissues.
  • RNAs from different tissues were tested by Northern-Blot using oligonucleotides labeled at their ends and derived from the cDNA sequence of RH 116; the nucleotide sequence 5'- GCA TCT GCA ATG GCA AAC TTC TTG CAT GGC-3 '(SEQ ID N ° 18) and the nucleotide sequence 5'- CGT GCT GAT TCC TCA GTC CTA GTA TAT TGC-3' (SEQ ID N ° 26) specific for the coding sequence was synthesized and labeled with 32 p ( ⁇ 4 Polynucleotide Kinase, Amersham) in order to serve as a probe for carrying out Northern blotting.
  • 32 p ⁇ 4 Polynucleotide Kinase, Amersham
  • EXAMPLE 5 Study by RT PCR of the differential expression of RH 116 in the PBMCs of HIV + patients and of healthy controls after treatment or without treatment with murabutide.
  • RH 116 messenger RNA is inhibited by murabutide.
  • the inventors further studied whether the RH 116 messenger RNA was a new gene modulated by murabutide using semi-quantitative RT PCR using specific oligonucleotides derived from the RH 116 cDNA.
  • PBMCs from patients (P) infected with HIV or from healthy control donors (C) are isolated, depleted in CD8 + lymphocytes (Dynabeads, Dynal) and stimulated by phytohemagglutinin PHA (5 ⁇ g / ml) for 3 days.
  • the cells are treated or not with Murabutide (10 ⁇ g / ml) in the presence of interleukin 2 (IL2) (lOU / ml) in RPMI medium supplemented with 10% fetal calf serum (SVF) for 6 hours or 24 hours at a rate of 5.10 6 cells minimum per condition.
  • IL2 interleukin 2
  • SVF fetal calf serum
  • the RNA of the cells is extracted (RNAplus, Quantum-bioprobe) then treated with DNase (Boerhinger) and retrotranscribed (RT) using an oligo (dT) in the presence of the reverse transcriptase Mu-MLV (Superscript II, Gibco).
  • the quality of RT is checked by PCR (25 cycles) using specific primers from GAPDH (5'GCC ATC AAT GAC CCC TTC ATT GAC 3 ') (SEQ ID N ° 19) and (5' TGA CGA ACA TGG GGG CAT CAG CAG 3 ') (SEQ ID No. 20) from 20, 100 and 500ng of total RNA.
  • the inventors carried out the RT-PCR (35cycles) using specific primers Héli 1 and Héli 2 of the new polypeptide RH116 (5 'GGA AGT ACA ATG AGG GCC TAC AAA 3') (SEQ ID N ° 13 ) and 5 'TCC TCA GTC CTA GTA TAT TGC TCC 3') (SEQ ID N ° 14).
  • the number of amplification cycles has been previously defined (35 cycles).
  • the amplified fragments are visualized on agarose gel (1%) in the presence of ethidium bromide, then quantified using the Imager master program (Pharmacia). For each dilution, the value given for the gene studied is related to that of GAPDH (Rapport ⁇ R).
  • the R of cells treated with Murabutide is reported to that of untreated cells. The results are then expressed as a% increase or inhibition of gene expression compared to the untreated cells. It should be noted that, for each dilution tested, the R can vary slightly, the average of the Rs was carried out, taking care to always be in the linear amplification phase.
  • FIG. 5 represents the results of RT-PCR obtained on the PBMCs of patients after 6 and 24 hours of treatment.
  • FIG. 5A A representative RT PCR performed on CD8-depressed PBMCs obtained from patients infected with HIV-1 is presented in FIG. 5A and shows a significant inhibition of the expression of messenger RNA following a treatment of 6 or 24 hours with murabutide.
  • the results presented in FIG. 5B show an average percentage inhibition of the expression of the messenger RNA of RH 116 and demonstrate that the treatment with murabutide of the PBMC depressed in CD8 of 5 patients induces a significant inhibition of the expression.
  • messenger RNA from RH 116 with maximum mean inhibition (90%) observed in patient N ° 5 following 6 hours of murabutide treatment, and this effect can be maintained after 24 hours, the maximum mean inhibition (57%) being observed in patient No. 3.
  • EXAMPLE 6 Expression of the recombinant protein in an E. coli bacterial system (pQE)
  • PCR was carried out on spleen cDNA from nucleotide primers corresponding to ATG: Heli ATG: (5'- TGA GAG GAT CCG ATG TCG AAT GGG TAT TCC 3 ') (SEQ ID N ° 21 ) and at STOP (5'-AAT GTC GAC CTA ATC CTC ATC ACT AAA TAA -3 ') (SEQ ID N ° 22).
  • the fragment was cloned into the vector pQE80 (Qiagen) digested with the restriction enzymes BamHI / Sal I.
  • the expression of the recombinant protein is induced by IPTG, the expression time has been optimized and estimated at two hours, indeed after 5 hours of induction the inventors do not detect any recombinant protein.
  • the protein is weak expressed (approximately 500 ⁇ g for 500 ml of culture) and is in soluble form.
  • EXAMPLE 7 Expression of the recombinant protein in a eukaryotic system.
  • the protein "RH116" being expressed in the cytoplasm or in the nucleus of mammalian cells the inventors have developed a strategy of overexpression of the recombinant protein in eukaryotic cells in order to appreciate its role in the regulation of HIV.
  • the complete copy of the cDNA was amplified from the primers heli-GFP-ATG (Xho I) (5'-TGA GAG CTC GAG ATG TCG AAT GGG TAT TCC ACA GAC -3 ') (SEQ ID N ° 23) and Heli-GFP (Bam HI) (5'- TGT TTA TTT AGT GAT GAG GAT CGG GAT CCG ATT GAA-3 ') (SEQ ID No.
  • the amplified fragment is cloned into the pEGFP vector digested with Xho I / Bam HI and then sequenced.
  • the cDNA coding for the "Green Fluorescent Protein” (GFP) is located 3 'from the cloned insert.
  • the complete copy of the cDNA was amplified from the primers Heli ATG Bam (5'- TGA GAG GATCCG ATG TCG AAT GGG TAT TCC -3 ') (SEQ ID N ° 21) and Heli STOP Xhol (5'-ttc aat ctc gag atc ctc atc act aaa taa aga -3 ') (SEQ ID N ° 25); the amplified fragment is cloned into the vector pcDNA6 digested with Bam HI / Xho I. In this system the protein is fused to 6 Histidines and to a V5 protein against which monoclonal antibodies are available.
  • EXAMPLE 8 Transfection into eukaryotic cells.
  • Transfection experiments were carried out in cos-7 cells and Hela cells using the recombinant plasmids pEGFP and pcDNA6 containing the complete sequence of the RH 116 polypeptide as described in example 5.
  • the transfections were carried out (Effectene -Qiagen) with l ⁇ g of recombinant plasmid and lO ⁇ l of Effectene.
  • RT-PCR analysis allowed confirming the overexpression of the mRNA coding for the RH116 polypeptide.
  • the expression of the recombinant fused proteins was verified by cytofluorometry (fusion with GFP) or by western blotting (fusion with V5-HIS6).
  • the molecular characterization of the native RH 116 protein was carried out using immunoglobulins purified from mouse serum directed against the partial recombinant RH 116i-335 protein. Cell labeling and immunoprecipitation generate a protein product of 130 to 140 kdaltons in agreement with the calculated molecular mass of the coded protein which must be highly glycosylated.
  • the RH 116 protein is immunoprecipitated in the total cell lysates obtained from U937 cells and in fractions enriched with nuclear extracts (FIG. 6A). Similar results are obtained on HeLa cells (data not shown).
  • FIG. 6A Similar results are obtained on HeLa cells (data not shown).
  • 6B presents the quality control of subcellular fractionations and shows enriched nuclear extracts which exhibit an increased expression of istone 1 (34 kdaltons) than in the total extract and a less expression of cytoplasmic proteins (60 kdaltons and 40 kdaltons about).
  • FIG. 7 A mouse antibody directed against the RH 1161-335 protein intensely stains the cytoplasm of HeLa-CD4 + cells (FIG. 7C). Normal mouse serum is used as a negative control (FIG. 7A) and nuclear staining is observed using a monoclonal anti-histone 1 antibody (FIG. 7B). The localization of the RH 116 protein is also confirmed by immunolocation studies of U937 cells (unpublished data).
  • the intracellular localization of the RH 116 protein in HeLa-CD4 + cells transfected by a chimeric cDNA construct coding for the full-length RH 116 protein fused to a carboxyterminal end of GFP (GFP-RH 116) is different.
  • the labeling of the GFP-RH 116 protein expressed in the transfected HeLa-CD4 + cells shows a cytoplasmic and nuclear localization (data not shown). This last observation is more consistent than the immunoprecipitation analyzes and the putative activity of members of the “DEAD-BOX” protein subfamily of RNA helicases.
  • RH 116 increases the expression of the viral protein P24.
  • the inventors sought to determine whether RH 116 could play a role in the regulation of expression of the virus.
  • the inventors began a study of the expression of P24 by HeLa-CD4 + cells transfected with the protein GFP-RH 116 and infected 24 hours later by the virus
  • FIG. 8A shows that the expression of the viral P24 antigen (in nanograms / ml ⁇ the standard deviation) in the supernatants of HeLa-CD4 + cells transfected with GFP-RH 116 is dramatically inhibited on day 3 (12.1 ⁇ 1.48 ng / ml) until day 5 (9 770 ⁇ 648 ng / ml) compared to cells expressing GFP (2.65 ⁇ 0.5 ng / ml and 690 ⁇ 272 ng / ml respectively on days 3 and 5).
  • FIG. 8B The level of P24 antigen in the supernatant of cells transfected with pCR3-Tat is presented in FIG. 8B (in nanograms / ml + standard deviation).
  • the results show a significant increase in the release of P24 by the cells transfected by Tat from day 2 (2.2 ⁇ 0.18 ng / ml) until day 5 (2.994 ⁇ 391 ng / ml) compared with cells transfected with pCR3 on day 2 (1 ⁇ 0.08 ng / ml) and on day (74 ⁇ 22 ng / ml).
  • Figure 8C shows the number of times of increase obtained in 3 or 5 independent experiments.
  • GFP-RH 116 induces a significant increase in P24 from day 2 (3.43 ⁇ 0.17) to day 5 (18.2 ⁇ 10) compared to the overexpression.
  • GFP-SSA day 2: 1, 18 ⁇ 0.25; day 5: 1.35 ⁇ 0.37) and an equivalent increase is obtained with overexpression of TAT (day 2: 3.0 ⁇ 8, 42; day 5: 18.7 + 4.2).
  • EXAMPLE 12 The RH 116 protein regulates the expression of the viral P24 mRNA.
  • the inventors isolated the total RNA from transfected and infected HeLa-CD4 + cells and then determined the level of unspiced messenger RNA , simply spliced or of intermediate size, by semi-quantitative RT PCR. The number of times of increase in expression of HIV messenger RNA is obtained in 3 separate experiments (mean + standard deviation) (data not shown).
  • cells transfected with GFP-RH 116 have a higher level of non-spliced RNA than cells transfected with GFP-SSA compared to cells transfected with GFP alone (respectively 3.14 + 1.5 and 0.81 + 0.12).
  • Intermediate or simply spliced HIV-1 mRNAs are also increased in cells transfected with GFP-RH 116 (2.81 + 0.73) compared to cells transfected with GFP-SSA (0.91 + 0.14).
  • FIG. 9A indicates that overexpression of RH 116, SSA or TAT mRNA is in transiently transfected cells.
  • FIG. 9B illustrates the increase in mRNAs not spliced, or of intermediate size, or simply spliced of the overexpressed proteins RH 116 (on the right) and TAT (on the left).
  • Figure 8C Study of the formation of proviral DNA ( Figure 8C) reveals that there is no significant difference in any of the transfected cells.
  • the RH 116 protein constitutes an autoantigen in patients infected with HIV-1.
  • RH 116 can be an autoantigen
  • the results presented in FIG. 10 significantly demonstrate an increase in the autoantibody levels in the sera of patients compared with those of healthy control.
  • the high levels of RH 116 autoantibodies observed in untreated HIV-1 patients are still significant even after significant treatment with effective anti-retroviral agents.

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Abstract

La présente invention concerne un nouveau polypeptide de 116 kDa présentant des homologies de séquences avec des hélicases à ARN (DEXH box) dénommé RH116 et ses fragments, le clonage de l'ADNc et les polynucléotides codant lesdits polypeptides, des vecteurs de clonage et/ou d'expression incluant lesdits polynucléotides, des cellules transformées par lesdits vecteurs et des anticorps spécifiques dirigés contre lesdits polypeptides. L'invention concerne également des procédés de détection et/ou de dosage desdits polypeptides et polynucléotides, les trousses de diagnostic correspondantes, et un procédé de criblage de ligands, ainsi que des composés utilisables à titre de médicament pour la prévention et/ou le traitement thérapeutique.

Description

« POLYPEPTIDE RH116 ET SES FRAGMENTS ET POLYNUCLEOTIDES CODANT LESDITS POLYPEPTIDES ET APPLICATIONS THERAPEUTIQUES ». La présente invention concerne un nouveau polypeptide de 116 kDa présentant des homologies de séquences avec des helicases à ARN (DEXH box) dénommé RH116 et ses fragments, le clonage de l'ADNc et les polynucleotides codant lesdits polypeptides, des vecteurs de clonage et/ ou d'expression incluant lesdits polynucleotides, des cellules transformées par lesdits vecteurs et des anticorps spécifiques dirigés contre lesdits polypeptides. L'invention concerne également des procédés de détection et/ ou de dosage desdits polypeptides et polynucleotides, les trousses de diagnostic correspondantes, et un procédé de criblage de ligands, ainsi que des composés utilisables à titre de médicament pour la prévention et/ou le traitement thérapeutique. Les muramylpeptides sont, parmi les immunomodulateurs de synthèse, ceux qui ont montré un grand nombre d'effets immunopharmacologiques sur les cellules de la lignée monocytaire /macrophagique potentialisant leur résistance non spécifique à l'infection, augmentant l'activité tumoricidale des macrophages, et aussi agissant comme adjuvants de vaccins. Le Murabutide (MB), analogue du muramyldipeptide (MDP) a été sélectionné pour son profil biologique particulièrement prometteur et sa bonne tolérance chez l'animal et chez l'homme. En effet, contrairement au MDP et à de nombreux autres analogues, il est démontré que le MB n'est pas pyrogène, n'induit pas de réactions inflammatoires et n'a pas montré de toxicité sévère lors des études cliniques chez des volontaires sains et de patients atteints de cancer.
De par ses capacités biologiques, le MB est un agent antiviral prometteur dans le domaine du SIDA (Syndrome d'Immunodéficience acquise). En effet, le MB inhibe la réplication du virus de immunodéficience humaine (VIH) dans les macrophages et les cellules dendritiques mais également dans les cellules mononuclées du sang périphérique (Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMC) de patients infectés. Ainsi, compte tenu de ces caractéristiques biologiques l'immunomodulateur MB a fait l'objet d'un brevet français délivré N° FR 2 724 845 et intitulé « Compositions de Muramyl peptides capables d'inhiber jusqu'à 100% la réplication d'un virus de rimmunodéficience acquise tel que le VIH». De plus, les essais cliniques de phase I et de phase Ha menés à terme sur des patients VIH+ ont démontré une bonne tolérance clinique du MB.
Les inventeurs ont démontré que le MB exerce une forte inhibition de la réplication virale dans les PBMCs de patients déplétées en lymphocytes CD8, activées par la phytohémagglutinine (PHA) et mises en culture avec de l'interleukine 2 (IL-2). En effet, le MB inhibe de 70 à 100% le taux de protéine virale p24 du VIH dans les surnageants de culture. Cet effet est corrélé au taux d'expression des ARN messagers viraux (non épissés et simple épissés). De plus, l'analyse du profil de cytokines et chimiokines sécrétées a démontré que le MB induisait la production de chimiokines connues comme inhibitrices de la réplication du VIH. Toutefois, cette induction ne semble pas être corrélêe en totalité avec l'effet inhibiteur du MB. L'inhibition de la réplication du VIH par le MB ne passe pas seulement par l'induction de la production de β-chimiokines puisque le MB intervient aussi au niveau de l'ADN proviral et de la transcription virale. L'absence de toxicité du MB dans ces mêmes cultures cellulaires a été vérifiée par les inventeurs qui ont constaté que non seulement le nombre de cellules vivantes reste inchangé en début de culture mais semble, de plus, augmenter en fin de culture.
Les résultats obtenus par les inventeurs suggèrent donc que le MB induit la production de cytokines ou d'autres facteurs non identifiés à ce jour, et qui possèdent une activité suppressive de la réplication du VIH.
Afin d'identifier ces nouveaux facteurs impliqués dans la régulation de la réplication virale, les inventeurs ont utilisé la méthodologie du « Differential Display-RT-PCR » (DD-RT-PCR) qui repose sur 2 étapes essentielles. Une première étape de reverse transcription (RT) de l'ARN total cellulaire afin d'obtenir des ADN complémentaires de tous les ARN qui possède une queue poly A. Ensuite, une deuxième étape d'amplification par Polymerase Chain Reaction (PCR) à partir des ADNc servant de matrice et de différents couples d'amorces en présence d'un nuclêotide radio-marqué. Les produits de PCR sont ensuite séparés sur gel par électrophorèse. Les fragments différentiellement amplifiés sont coupés du gel, ré-amplifiés puis clones et séquences.
La DD-RT-PCR, réalisée à partir de PBMCs d'un patient VIH+, a permis aux inventeurs de sélectionner plus de 130 fragments d'ADNc différentiellement exprimés après traitement au MB. Ces fragments ont été sous-clonés dans le vecteur pCR2.1 (Invitrogen), puis séquences par séquençage automatique (ABI Prism 377, Perkin-Elmer). Les séquences ont été analysées pour les recherches dliomologies en utilisant les banques de données et le serveur Basic Local Alignment Search Tool (Blast 2) du NCBI.
Les inventeurs ont identifié un nouveau polypeptide présentant des homologies de séquences avec des helicases à ARN. Les helicases à ARN (pour revue voir Critical Rev. In Biochemistry and
Molecular Biology (1998) 33 (4) : 259-296) représentent une large famille de protéines présentes dans tous les types de systèmes biologiques où l'ARN joue un rôle central. Elles sont distribuées de manière ubiquitaire dans une large gamme d'organismes et sont impliquées dans le processus d'épissage mitochondrial et nucléaire, l'édition de l'ARN (RNA editing), la maturation de rRNA (rRNA processing), l'initiation de la traduction, l'export des ARNm nucléaires et la dégradation des ARNm.
Les helicases à ARN constituent des facteurs indispensables à la différenciation et au développement cellulaire, et certaines d'entre elles jouent un rôle dans la transcription et la réplication de génome viral à ARN simple brin.
Les helicases à ARN appartiennent au large groupe des enzymes susceptibles d'hydroliser les nucléotides 5'-trisphosphates.
Une étude de comparaison de séquence des ATPases-ADN dépendantes a conduit à une nouvelle classification des NTPases selon le motif ATPase A.
Ainsi, les helicases à ADN se caractérisant par un motif A, encore appelé motif "Walker" (G-X-X-X-X-G-K-T), et appartiennent à la superfamille I, alors que les helicases à ARN présentent des variations dans ce domaine (A- X-X-G-X-G-K-T) et forment la superfamille II voisine (Gorbalenya et al, 1988). Des comparaisons des séquences conservées ont montré des liens étroits entre les différentes helicases à ARN, suggérant que ces protéines dérivent d'un ancêtre commun.
En effet, l'alignement de la séquence en acides aminés de différents membres de la superfamille II des helicases à ARN a permis de mettre en évidence une région centrale commune qui se caractérise par la présence de huit domaines hautement conservés. A l'heure actuelle, la fonction biochimique de quatre des huit domaines conservés (domaines I, II, VI, et VIII) ont été élucidés. Compte tenu de la forte homologie de séquence dans le cinquième des huit éléments structuraux, appelé motif "boîte DEAD" (ou "DEAD Box") (D-E-A-D : Asp-Glu-Ala-Asp), les helicases à ARN appartenant à la superfamille II sont également appelés protéines "Boîte DEAD" (Linder et al., 1989). L'existence de motifs DEAD divergents ont permis de subdiviser en sous-groupes la superfamille II des helicases à ARN. A ce jour, trois sous-groupes ont été identifiés. Le premier sous-groupe est formé par les protéines à boîte DEAD classique, les deux autres sous-groupes sont appelés DEAH et DEXH du fait de leur motif ATPase B divergent.
De part et d'autre de la séquence centrale conservée, les extrémités amino- et carboxy-terminales des helicases à ARN se caractérisent par des séquences de longueur et de contenu variables. Il est suggéré que ces régions divergentes sont responsables des fonctions protéiques individuelles, alors que les domaines hautement conservés sont impliqués dans l'activité hélicase à ARN.
Le domaine I (A/G-X-X-G-X-G-K-T : Ala/Gly-X-X-Gly-X-Gly-lys-Thr) est décrit comme le motif A des ATPases (Walker et al, 1982). Le domaine V, ou boîte DEAD (L-D-E-A-D-X-X-Leu : Leu-Asp-Glu-Ala-
Asp-X-X-leu représente une forme spécifique du motif ATPase B (Walker et al, 1982) qui semble impliqué dans l'hydrolyse de l'ATP (Pause and Sonenbery, 1992).
Le domaine VI ou motif SAT (Ser-Ala-Thr) est localisé à proximité de la boîte DEAD et semble spécifique des helicases à ARN. Le domaine VIII est caractérisé par la boîte YIHRIGRXXR (Tyr-Ile-His-
Arg-Ile-Gly-Arg-X-X-Arg) qui représente un motif qui est, comme SAT, spécifique aux helicases à ARN. Des expériences in vitro avec le facteur d'initiation de la traduction eIF-4A indiquent que ce domaine est critique pour la liaison à l'ARN. La présente invention a donc pour objet un polypeptide isolé dénommé
« RH116 » (pour hélicase à ARN de 116 kDa) de séquence d'acides aminés SEQ ID N°2. Cette séquence comprend des domaines consensus conservés qui sont aisément identifiables par l'homme du métier et qui permettent de classer le polypeptide RH116 de l'invention dans le sous-groupe DEAH ou DEXH (pour revue voir Luking. et al, (1998)) Parmi ces domaines consensus conservés, il convient de citer :
• la séquence GSGKT qui correspond aux acides aminés 332 à 336 de la séquence SEQ ID N°2, et qui constitue le domaine conservé I (G-GKT) de la superfamille des helicases à ARN. • la séquence DECH qui correspond aux acides aminés 443 à 446 de la séquence SEQ ID N°2 et qui constitue le domaine conservé V (DE-H) de la superfamille des helicases à ARN du sous-groupe DEXH.
Ces deux domaines consensus conservé sont impliqués dans la fonction
ATPase. * la séquence TAS qui correspond aux acides aminés 488 à 490 de la séquence SEQ ID N°2 et qui constitue le domaine conservé VI (-A-) de la superfamille des helicases à ARN du sous-groupe DEAH.
• la séquence RGRAR qui correspond aux acides aminés 820 à 824 de la séquence SEQ ID N°2 et qui constitue le domaine conservé VIII de la superfamille des helicases à ARN du sous-groupe DEAH. Ces deux domaines conservés (domaines VI et VIII) sont plus spécifiques des helicases à ARN et sont responsables de la liaison et du déroulement de l'ARN cible.
Le polypeptide isolé se caractérise en ce qu'il comprend un polypeptide choisi parmi : a) un polypeptide de séquence SEQ ID N°2 ; b) un polypeptide variant de polypeptide de séquences d'acides aminés défini en a) ; c) un polypeptide homologue au polypeptide défini en a) ou b) et comportant au moins 80 % d'identité, de préférence 85 %, 87
%, 90 %, 95 % , 97 % 98 %, 99 % d'identité avec ledit polypeptide de a) ; d) un fragment d'au moins 15 acides aminés consécutifs de préférence 17, 20, 23, 25, 30, 40, 50, 100, 250 amino-acides consécutifs d'un polypeptide défini en a), b) ou c) ; e) un fragment biologiquement actif d'un polypeptide défini en a), b) ou c).
Dans la présente description, on utilisera le terme polypeptide pour désigner également une protéine ou un peptide. On entendra par polypeptide variant l'ensemble des polypeptides mutés pouvant exister naturellement, en particulier chez l'être humain, et qui correspondent notamment à des troncatures, substitutions, délétions et/ou additions de résidus d'amino-acides.
Par polypeptide homologue, on entendra désigner les polypeptides présentant, par rapport au polypeptide naturel RH116, certaines modifications comme en particulier une délétion, addition ou substitution d'au moins un acide aminé, une troncature, un allongement et/ou une fusion chimérique. Parmi les polypeptides homologues, on préfère ceux dont la séquence d'acides aminés présente au moins 80 % d'identité, de préférence d'au moins 85 %, 87 %, 90 %, 93%, 95%, 97 %, 98 %, 99 % d'identité avec les séquences d'acides aminés des polypeptides selon l'invention. Dans le cas d'une substitution, un ou plusieurs acides aminés consécutifs ou non consécutifs, peuvent être remplacés par des acides aminés « équivalents ». L'expression acide aminé « équivalent » vise ici à désigner tout acide aminé susceptible d'être substitué à l'un des acides aminés de la structure de base sans cependant modifier les caractéristiques ou propriétés fonctionnelles essentielles, comme leurs activités biologiques, des polypeptides correspondants telles que l'induction in vivo d'anticorps capables de reconnaître le polypeptide dont la séquence d'acides aminés est comprise dans la séquence d'acides aminés SEQ ID N°2, ou l'un de ses fragments. Ces acides aminés équivalents peuvent être déterminés soit en s'appuyant sur leur homologie de structure avec les acides aminés auxquels ils se substituent, soit sur les résultats des essais d'activité biologique croisée auxquels les différents polypeptides sont susceptibles de donner lieu. A titre d'exemple, on mentionnera les possibilités de substitutions susceptibles d'être effectuées sans qu'il en résulte une modification approfondie des activités biologiques des polypeptides modifiés correspondants, les remplacements, par exemple, de la leucine par la valine ou l'isoleucine, de l'acide aspartique par l'acide glutamique, de la glutamine par l'asparagine, de l'arginine par la lysine etc., les substitutions inverses étant naturellement envisageables dans les mêmes conditions. Par fragment biologiquement actif, on entendra désigner en particulier un fragment de séquence d'acides aminés de polypeptide selon l'invention présentant au moins une des caractéristiques ou propriétés fonctionnelles du polypeptide selon l'invention, notamment en ce qu'il comporte une activité hélicase à ARN. Le polypeptide variant, le polypeptide homologue ou le fragment de polypeptide selon l'invention possède au moins 10 %, de préférence 20 % , 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % de l'activité hélicase à ARN. Différents protocoles connus de l'homme de l'art ont été décrits pour mesurer l'activité hélicase à ARN des polypeptides selon l'invention ; il convient de citer les articles de Lain et al (1990) et Lee et Hurwitz (1993). Les exemples ci-après proposent des fonctions biologiques pour la protéine RH116 en fonction des domaines peptidiques de cette protéine et permettent ainsi à l'homme du métier d'identifier les fragments biologiquement actifs.
Par fragment de polypeptide, on entend désigner un polypeptide comportant au minimun 15 acides aminés consécutifs, de préférence 17, 20, 23, 25, 30, 40, 50, 100, 250 amino-acides consécutifs. Les fragments de polypeptide selon l'invention obtenus par clivage dudit polypeptide par une enzyme protéolytique, par un réactif chimique, ou encore en plaçant ledit polypeptide dans un environnement très acide font également partie de l'invention. De préférence un polypeptide selon l'invention est un polypeptide constitué de la séquence SEQ ID N° 2 ou d'une séquence possédant au moins 80 % d'identité, de préférence au moins 85 %, 90 %, 95 %, 98 % et 99 % d'identité avec la SEQ ID N° 2 après alignement optimal. Par polypeptide dont la séquence d'acides aminés présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence d'au moins 85 %, 90 %, 95 %, 98 % et 99 % après alignement optimal avec une séquence de référence, on entend désigner les polypeptides présentant certaines modifications par rapport au polypeptide de référence, comme en particulier une ou plusieurs délétions, troncations, un allongement, une fusion chimérique, et/ ou une ou plusieurs substitutions.
Parmi les polypeptides dont la séquence d'acides aminés présente un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence d'au moins 85 %, 90 %, 95 %, 98 % et 99 % après alignement optimal avec les séquences SEQ ID N° 2 ou avec l'un de leurs fragments selon l'invention, on préfère les polypeptides variants codés par les séquences peptidiques variantes telles que précédemment définies, en particulier les polypeptides dont la séquence d'acides aminés présente au moins une mutation correspondant notamment à une troncation, délétion, substitution et/ ou addition d'au moins un résidu d'acide aminé par rapport aux séquences SEQ ID N°2 ou avec l'un de leurs fragments, de manière plus préférée les polypeptides variants présentant une mutation liée à une pathologie. Le polypeptide selon l'invention se caractérise en ce qu'il est comporte au moins un domaine conservé appartenant à la superfamille des helicases à ARN, ceux-ci étant choisi de préférence parmi les séquences G-GKT correspondant au domaine I, DEAD, DE-D, DEAH, correspondants au domaine V, SAT, -A-, correspondants au domaine VI, YIHRIGRR, HRIGR— R, -R-GR — R, — GR, correspondants au domaine VIII.
L'invention concerne également un polynucléotide purifié ou isolé caractérisé en ce qu'il code pour un polypeptide de séquence SEQ ID N°2 tel que défini précédemment. De manière préférée, le polynucléotide selon l'invention possède la séquence SEQ ID N°l.
Le polynucléotide purifié ou isolé selon l'invention se caractérise en ce qu'il comprend un polynucléotide choisi parmi : a) SEQ ID N° 1 ; b) la séquence d'un fragment d'au moins 15 nucléotides consécutifs, de préférence d'au moins 18, 21, 24, 27, 30, 35, 40, 50, 75, 100 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N° 1 à l'exception des séquences nucléiques identifiées sous le N° d'accession AC 007750 et N°AC0108176 dans la banque de données GenBank, ainsi qu'à l'exception de la séquence génomique de 95417 pb, ainsi qu'à l'exception des séquences nucléiques enregistrées identifiées sous numéro d'accès N°AW589567, N°AW152541 et AW189584 dans la banque de données EMBL ; c) une séquence nucléique présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence d'au moins 85 %, 90 %, 95 %, 98 % et 99 % après alignement optimal avec une séquence définie en a) ou b) ; d) la séquence complémentaire ou la séquence d'ARN correspondant à une séquence telle que définie en a), b) ou c).
Par acide nucléique, séquence nucléique ou d'acide nucléique, polynucléotide, oligonucléotide, séquence de polynucléotide, séquence nucléotidique, termes qui seront employés indifféremment dans la présente description, on entend désigner un enchaînement précis de nucléotides, modifiés ou non, permettant de définir un fragment ou une région d'un acide nucléique, comportant ou non des nucléotides non naturels, et pouvant correspondre aussi bien à un ADN double brin, un ADN simple brin que des produits de transcription desdits ADN, et/ ou un fragment d'ARN. II doit être compris que la présente invention ne concerne pas les séquences nucléotidiques dans leur environnement chromosomique naturel, c'est-à-dire à l'état naturel. Il s'agit de séquences qui ont été isolées et/ou purifiées, c'est-à-dire qu'elles ont été prélevées directement ou indirectement, par exemple par copie, leur environnement ayant été au moins partiellement modifié. On entend ainsi également désigner les acides nucléiques obtenus par synthèse chimique.
Par polynucléotide de séquence complémentaire, on entend désigner tout ADN dont les nucléotides sont complémentaires de ceux de la SEQ ID N° 1 ou d'une partie de la SEQ ID N° 1 et dont l'orientation est inversée. Par « pourcentage d'identité » entre deux séquences d'acides nucléiques ou d'acides aminés au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de nucléotides ou de résidus d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. On entend désigner par "meilleur alignement" ou "alignement optimal", l'alignement pour lequel le pourcentage d'identité déterminé comme ci-après est le plus élevé. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acides nucléiques ou d'acides aminés sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par « fenêtre de comparaison » pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Smith et Waterman (1981), au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Neddleman et Wunsch (1970), au moyen de la méthode de recherche de similarité de Pearson et Lipman ( 1988), au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI). Afin d'obtenir l'alignement optimal, on utilise de préférence le programme BLAST, avec la matrice BLOSUM 62. On peut également utiliser les matrices PAM ou PAM250.
Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acides nucléiques ou d'acides aminés est déterminé en comparant ces deux séquences alignées de manière optimale, la séquence d'acides nucléiques ou d'acides aminés à comparer pouvant comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence pour un alignement optimal entre ces deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide ou le résidu d'acide aminé est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions comparées et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences.
Par séquences nucléiques présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence d'au moins 85 %, 90 %, 95 %, 98 % et 99 % après alignement optimal avec une séquence de référence, on entend désigner les séquences nucléiques présentant, par rapport à la séquence nucléique de référence, certaines modifications comme en particulier une délétion, une troncation, un allongement, une fusion chimérique, et/ou une substitution, notamment ponctuelle, et dont la séquence nucléique présente au moins 80 %, de préférence au moins 85 %, 90 %, 95 %, 98 % et 99 % d'identité après alignement optimal avec la séquence nucléique de référence. Il s'agit de préférence de séquences dont les séquences complémentaires sont susceptibles de slrybrider spécifiquement avec les séquences SEQ ID N° 1 de l'invention. De préférence, les conditions d'hybridation spécifiques ou de forte stringence seront telles qu'elles assurent au moins 80 %, de préférence d'au moins 85 %, 90 %, 95 %, 98 % et 99 % d'identité après alignement optimal entre l'une des deux séquences et la séquence complémentaire de l'autre. Une hybridation dans des conditions de forte stringence signifie que les conditions de température et de force ionique sont choisies de telle manière qu'elles permettent le maintien de l'hybridation entre deux fragments d'ADN complémentaires. A titre illustratif, des conditions de forte stringence de l'étape d'hybridation aux fins de définir les fragments polynucléotidiques décrits ci-dessus, sont avantageusement les suivantes.
L'hybridation ADN-ADN ou ADN-ARN est réalisée en deux étapes : (1) préhybridation à 42°C pendant 3 heures en tampon phosphate (20 mM, pH 7,5) contenant 5 x SSC (1 x SSC correspond à une solution 0, 15 M NaCl + 0,015 M citrate de sodium), 50 % de formamide, 7 % de sodium dodécyl sulfate (SDS), 10 x Denhardt's, 5 % de dextran sulfate et 1 % d'ADN de sperme de saumon ; (2) hybridation proprement dite pendant 20 heures à une température dépendant de la taille de la sonde (i.e. : 42°C, pour une sonde de taille > 100 nucléotides) suivie de 2 lavages de 20 minutes à 20°C en 2 x SSC + 2 % SDS, 1 lavage de 20 minutes à 20°C en 0,1 x SSC + 0,1 % SDS. Le dernier lavage est pratiqué en 0, 1 x SSC + 0,1 % SDS pendant 30 minutes à 60°C pour une sonde de taille > 100 nucléotides. Les conditions d'hybridation de forte stringence décrites ci-dessus pour un polynucléotide de taille définie, peuvent être adaptées par l'homme du métier pour des oligonucléotides de taille plus grande ou plus petite, selon l'enseignement de Sambrook et al, 1989.
Parmi les séquences nucléiques présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence d'au moins 85 %, 90 %, 95 %, 98 % et 99 % après alignement optimal avec la séquence selon l'invention, on préfère également les séquences nucléiques variantes de SEQ ID N° 1, ou de leurs fragments, c'est-à-dire l'ensemble des séquences nucléiques correspondant à des variants alléliques, c'est-à-dire des variations individuelles des séquences SEQ ID N° 1. Ces séquences mutées naturelles correspondent à des polymorphismes présents chez les mammifères, en particulier chez l'être humain et, notamment, à des polymorphismes pouvant conduire à la survenue d'une pathologie. On entend également désigner par séquence nucléique variante tout ARN ou AD Ne résultant d'une mutation et/ ou variation d'un site d'épissage de la séquence nucléique génomique dont l'ADNc a pour séquence SEQ ID N° 1. Plus particulièrement, l'invention concerne un acide nucléique purifié ou isolé selon la présente invention, caractérisé en ce qu'il comprend ou est constitué de l'une des séquences SEQ ID N° 1, de leurs séquences complémentaires ou des séquences de l'ARN correspondant à SEQ ID N° 1. Les amorces ou sondes, caractérisées en ce qu'elles comprennent une séquence d'un acide nucléique selon l'invention, font également partie de l'invention. Ainsi, la présente invention pour la détection, l'identification, le dosage ou l'amplification de séquence d'acide nucléique concerne également les amorces ou les sondes selon l'invention qui peuvent permettre en particulier de mettre en évidence ou de discriminer les séquences nucléiques variantes, ou d'identifier la séquence génomique des gènes dont l'ADNc est représenté par SEQ ID N° 1, en utilisant notamment une méthode d'amplification telle que la méthode PCR, ou une méthode apparentée. Selon l'invention, les polynucleotides pouvant être utilisés comme sonde ou comme amorce dans des procédés de détection, d'identification, de dosage ou d'amplification de séquence nucléique, présentent une taille minimale de 15 bases, de préférence d'au moins 18, 20, 25, 30, 40, 50 bases.
Les polynucleotides selon l'invention peuvent ainsi être utilisés comme amorce et/ ou sonde dans des procédés mettant en oeuvre notamment la technique de PCR (amplification en chaîne par polymérase) (Rolfs et al, 1991). Cette technique nécessite le choix de paires d'amorces oligonucléotidiques encadrant le fragment qui doit être amplifié. On peut, par exemple, se référer à la technique décrite dans le brevet américain U.S. N° 4 683 202. Les fragments amplifiés peuvent être identifiés, par exemple après une électrophorèse en gel d'agarose ou de polyacrylamide, ou après une technique chromatographique comme la filtration sur gel ou la chromatographie échangeuse d'ions, puis séquences. La spécificité de l'amplification peut être contrôlée en utilisant comme amorces les séquences nucléotidiques de polynucleotides de l'invention et comme matrices, des plasmides contenant ces séquences ou encore les produits d'amplification dérivés. Les fragments nucléotidiques amplifiés peuvent être utilisés comme réactifs dans des réactions d'hybridation afin de mettre en évidence la présence, dans un échantillon biologique, d'un acide nucléique cible de séquence complémentaire à celle desdits fragments nucléotidiques amplifiés. L'invention vise également les acides nucléiques susceptibles d'être obtenus par amplification à l'aide d'amorces selon l'invention. D'autres techniques d'amplification de l'acide nucléique cible peuvent être avantageusement employées comme alternative à la PCR (PCR-like) à l'aide de couple d'amorces de séquences nucléotidiques selon l'invention. Par PCR-like on entend désigner toutes les méthodes mettant en œuvre des reproductions directes ou indirectes des séquences d'acides nucléiques, ou bien dans lesquelles les systèmes de marquage ont été amplifiés, ces techniques sont bien entendu connues. En général il s'agit de l'amplification de l'ADN par une polymérase ; lorsque l'échantillon d'origine est un ARN il convient préalablement d'effectuer une transcription reverse. Il existe actuellement de très nombreux procédés permettant cette amplification, comme par exemple la technique SDA (Strand Displacement Amplification) ou technique d'amplification à déplacement de brin (Walker et al, 1992), la technique TAS (Transcription-based Amplification System) décrite par Kwoh et al. (1989), la technique 3SR (Self-Sustained Séquence Réplication) décrite par Guatelli et al. (1990), la technique NASBA (Nucleic Acid Séquence Based Amplification) décrite par Kievitis et al. (1991), la technique TMA (Transcription Mediated Amplification), la technique LCR (Ligase Chain Reaction) décrite par Landegren et al. (1988), la technique de RCR (Repair Chain Reaction) décrite par Segev (1992), la technique CPR (Cycling Probe Reaction) décrite par Duck et al (1990), la technique d'amplification à la Q-béta-réplicase décrite par Miele et al. (1983). Certaines de ces techniques ont depuis été perfectionnées. Dans le cas où le polynucléotide cible à détecter est un ARNm, on utilise avantageusement, préalablement à la mise en oeuvre d'une réaction d'amplification à l'aide des amorces selon l'invention ou à la mise en œuvre d'un procédé de détection à l'aide des sondes de l'invention, une enzyme de type transcriptase inverse afin d'obtenir un ADNc à partir de l'ARNm contenu dans l'échantillon biologique. L'ADNc obtenu servira alors de cible pour les amorces ou les sondes mises en oeuvre dans le procédé d'amplification ou de détection selon l'invention.
La technique d'hybridation de sondes peut être réalisée de manières diverses (Matthews et al, 1988). La méthode la plus générale consiste à immobiliser l'acide nucléique extrait des cellules de différents tissus ou de cellules en culture sur un support (tels que la nitrocellulose, le nylon, le polystyrène) pour réaliser par exemple des puces à ADN, puis à incuber, dans des conditions bien définies, l'acide nucléique cible immobilisé avec la sonde. Après l'hybridation, l'excès de sonde est éliminé et les molécules hybrides formées sont détectées par la méthode appropriée (mesure de la radioactivité, de la fluorescence ou de l'activité enzymatique liée à la sonde) .
Selon un autre mode de mise en œuvre des sondes nucléiques selon l'invention, ces dernières peuvent être utilisées comme sondes de capture. Dans ce cas, une sonde, dite « sonde de capture », est immobilisée sur un support et sert à capturer par hybridation spécifique l'acide nucléique cible obtenu à partir de l'échantillon biologique à tester et l'acide nucléique cible est ensuite détecté grâce à une seconde sonde, dite « sonde de détection », marquée par un élément facilement détectable. Parmi les fragments d'acides nucléiques intéressants, il convient par ailleurs de citer en particulier les oligonucléotides anti-sens, c'est-à-dire dont la structure assure, par hybridation avec la séquence cible, une inhibition de l'expression du produit correspondant. Il faut également citer les oligonucléotides sens qui, par interaction avec des protéines impliquées dans la régulation de l'expression du produit correspondant, induiront soit une inhibition, soit une activation de cette expression. Les oligonucléotides selon l'invention présente une taille minimale de 9 bases, de préférence d'au moins 10, 12, 15, 17, 20, 25, 30, 40, 50 bases.
Les sondes, amorces et oligonucléotides selon l'invention peuvent être marqués directement ou indirectement par un composé radioactif ou non radioactif, par des méthodes bien connues de l'homme du métier, afin d'obtenir un signal détectable et/ ou quantifiable. Les séquences de polynucleotides selon l'invention non marquées peuvent être utilisées directement comme sonde ou amorce.
Les séquences sont généralement marquées pour obtenir des séquences utilisables pour de nombreuses applications. Le marquage des amorces ou des sondes selon l'invention est réalisé par des éléments radioactifs ou par des molécules non radioactives. Parmi les isotopes radioactifs utilisés, on peut citer le 3 P, le 33P, le 35S, le 3H ou le 125I. Les entités non radioactives sont sélectionnées parmi les ligands tels la biotine, l'avidine, la streptavidine, la dioxygénine, les haptènes, les colorants, les agents luminescents tels que les agents radioluminescents, chémoluminescents, bioluminescents, fluorescents, phosphorescents.
La présente invention concerne également les vecteurs de clonage et/ou d'expression comprenant un acide nucléique ou codant pour un polypeptide selon l'invention. Un tel vecteur peut également contenir les éléments nécessaires à l'expression et éventuellement à la sécrétion du polypeptide dans une cellule hôte. Une telle cellule hôte est également un objet de l'invention.
Selon un autre aspect, l'invention concerne un vecteur d'expression antisens. Un tel vecteur d'expression contient une séquence de polynucléotide selon l'invention, insérée en orientation inverse dans le vecteur d'expression. Ainsi, l'homme du métier reconnaît aisément qu'un ARNm correspondant à l'ADN dans le vecteur antisens hybride avec un ARNm correspondant à de l'ADN dans le vecteur sens. Un vecteur d'expression antisens est un vecteur qui exprime un ARN antisens d'intérêt dans une cellule hôte appropriée, soit de manière constitutive soit après induction. Le terme antisens se réfère à toute composition contenant une séquence d'acide nucléique spécifique. Les molécules antisens peuvent être produites par des méthodes telles que la synthèse ou la transcription. Lorsque de telles molécules sont introduites dans la cellule, les nucléotides complémentaires se combinent avec les séquences naturelles produites par la cellule pour former des duplexes et ainsi bloquer soit la transcription ou la traduction du polypeptide selon l'invention. Il entre également dans l'étendue de l'invention, de réaliser des molécules antisens susceptibles de s'apparier avec la molécule d'ARN qui est le substrat de l'hélicase à ARN RH116, afin d'en bloquer l'activité biologique. Les nouveaux composés identifiés susceptibles de diminuer ou d'abolir le taux d'expression et/ ou l'activité hélicase à ARN du polypeptide selon l'invention constituent des antagonistes du polypeptide selon l'invention. Le terme "antagoniste" se réfère à une molécule qui, lorsqu'elle se lie au polypeptide selon l'invention, diminue la quantité ou la durée des effets de l'activité biologique ou immunologique du polypeptide RH116. Les antagonistes incluent les protéines, les acides nucléiques, les carbohydrates, et toutes les molécules susceptibles de diminuer les effets de RH116.
Lesdits vecteurs comportent de préférence un promoteur, des signaux d'initiation et de terminaison de la traduction, ainsi que des régions appropriées de régulation de la transcription. Ils doivent pouvoir être maintenus de façon stable dans la cellule et peuvent éventuellement posséder des signaux particuliers spécifiant la sécrétion de la protéine traduite. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, le promoteur peut être le promoteur naturellement présent en amont du gène codant pour le polypeptide RH116 humain de l'invention.
Les différents signaux de contrôle sont choisis en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. A cet effet, les séquences d'acide nucléique selon l'invention peuvent être insérées dans des vecteurs à réplication autonome au sein de l'hôte choisi, ou des vecteurs intégratifs de l'hôte choisi.
Parmi les systèmes à réplication autonome, on utilise de préférence en fonction de la cellule hôte, des systèmes de type « plasmide », « cosmide » ou « mini-chromosome » ou des systèmes de type viral, les vecteurs viraux pouvant notamment être des adénovirus (Perricaudet et a , 1992), des rétrovirus, des lentivirus, des poxvirus ou des virus herpétiques (Epstein et al, 1992). L'homme du métier connaît les technologies utilisables pour chacun de ces systèmes.
Lorsque l'on souhaite l'intégration de la séquence dans les chromosomes de la cellule hôte, on peut utiliser par exemple des systèmes de type plasmidique ou viral ; de tels virus sont, par exemple, les rétrovirus (Temin, 1986), ou les AAV (Carter, 1993). Parmi les vecteurs non viraux, on préfère les polynucleotides nus tels que l'ADN nu ou l'ARN nu selon la technique développée par la société VICAL, les chromosomes artificiels de bactérie (BAC, bacterial artificial chromosome), les chromosomes artificiels de levure (YAC, yeast artificial chromosome) pour l'expression dans la levure, les chromosomes artificiels de souris (MAC, mouse artificial chromosome) pour l'expression dans les cellules murines et de manière préférée les chromosomes artificiels d'homme (HAC, human artificial chromosome) pour l'expression dans les cellules humaines.
De tels vecteurs sont préparés selon les méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones en résultant peuvent être introduits dans un hôte approprié par des méthodes standard, telles que par exemple la lipofection, l'électroporation, le choc thermique, la transformation après perméabilisation chimique de la membrane, la fusion cellulaire. L'invention comprend en outre les cellules hôtes, notamment les cellules eucaryotes et procaryotes, transformées par les vecteurs selon l'invention. Parmi les cellules utilisables aux sens de la présente invention, on peut citer les cellules bactériennes (Olins et Lee, 1993), mais aussi les cellules de levure (Buckholz, 1993), de même que les cellules animales, en particulier les cultures de cellules de mammifères (Edwards et Aruffo, 1993), et notamment les cellules d'ovaire de hamster chinois (CHO) et les cellules humaines. On peut citer également les cellules d'insectes dans lesquelles on peut utiliser des procédés mettant par exemple en œuvre des baculovirus (Luckow, 1993). Un hôte cellulaire préféré pour l'expression des protéines de l'invention est constitué par les cellules COS et les cellules Hela. L'invention comprend également les animaux transgéniques, de préférence les mammifères, excepté l'Homme, comprenant une desdites cellules transformées selon l'invention. Ces animaux peuvent être utilisés en temps que modèles, pour l'étude de l'étiologie de pathologie liée à une altération de l'homologue animal de la protéine RH116 naturelle humaine ou pour l'étude des effets d'une infection virale provoquée par un virus à ARN, tel le VIH, sur l'expression de la protéine RH116 en présence ou non d'un traitement anti-viral, tel qu'un antagoniste du RH116, comme par exemple le murabutide.
Parmi les mammifères selon l'invention, on préfère des animaux tels que les rongeurs, en particulier les souris, les rats ou les lapins, exprimant un polypeptide selon l'invention.
Les animaux transgéniques selon l'invention peuvent surexprimer le gène codant pour la protéine selon l'invention, ou leur gène homologue, ou exprimer ledit gène dans lequel est introduite une mutation. Ces animaux transgéniques, en particulier des souris, sont obtenus par exemple par transfection de copie de ce gène sous contrôle d'un promoteur fort de nature ubiquitaire, ou sélectif d'un type de tissu, ou après transcription virale.
Alternativement, les animaux transgéniques selon l'invention peuvent être rendus déficients pour le gène codant pour le polypeptide de séquence SEQ ID N° 2, ou leurs gènes homologues, par inactivation ciblée par recombinaison homologue en utilisant ou non le système LOX-P/CRE recombinase (Rohlmann et al, 1996) ou par tout autre système d'inactivation de l'expression de ce gène. Ces animaux transgéniques sont obtenus par exemple par recombinaison homologue sur cellules souches embryonnaires, transfert de ces cellules souches à des embryons, sélection des chimères affectées au niveau des lignées reproductrices, et croissance desdites chimères.
Les cellules ou mammifères transformés tels que décrits précédemment peuvent aussi être utilisés à titre de modèles afin d'étudier les interactions entre les polypeptides selon l'invention, et les composés chimiques ou protéiques, impliqués directement ou indirectement dans les activités des polypeptides selon l'invention, ceci afin d'étudier les différents mécanismes et interactions mis en jeu. Ils peuvent en particulier être utilisés pour la sélection de produits interagissant avec les polypeptides selon l'invention, notamment la protéine de séquence SEQ ID N°2 ou leurs variants selon l'invention, à titre de cofacteur, ou d'inhibiteur, notamment compétitif, ou encore ayant une activité agoniste ou antagoniste de l'activité des polypeptides selon l'invention. De préférence, on utilise lesdites cellules transformées ou animaux transgéniques à titre de modèle notamment pour la sélection de composés permettant de diminuer le taux d'expression ou l'activité hélicase à ARN du polypeptide RH116 de l'invention.
En plus de leur utilité à titre de modèle d'analyse, les cellules et mammifères selon l'invention sont utilisables dans une méthode de production d'un polypeptide selon l'invention, comme décrit ci-dessous. La méthode de production d'un polypeptide de l'invention sous forme recombinante, elle-même comprise dans la présente invention, se caractérise en ce que l'on cultive les cellules transformées, notamment les cellules de la présente invention, dans des conditions permettant l'expression et éventuellement la sécrétion d'un polypeptide recombinant codé par une séquence d'acide nucléique selon l'invention, et que l'on récupère ledit polypeptide recombinant. Les polypeptides recombinants susceptibles d'être obtenus par cette méthode de production font également partie de l'invention. Ils peuvent se présenter sous forme glycosylée ou non glycosylée et peuvent présenter ou non la structure tertiaire de la protéine naturelle. Les séquences des polypeptides recombinants peuvent être également modifiées afin d'améliorer leur solubilité, en particulier dans les solvants aqueux. De telles modifications sont connues de l'homme du métier comme par exemple la délétion de domaines hydrophobes ou la substitution d'acides aminés hydrophobes par des acides aminés hydrophiles.
Ces polypeptides peuvent être produits à partir des séquences d'acide nucléique définies ci-dessus, selon les techniques de production de polypeptides recombinants connues de l'homme du métier. Dans ce cas, la séquence d'acide nucléique utilisée est placée sous le contrôle de signaux permettant son expression dans un hôte cellulaire.
Un système efficace de production d'un polypeptide recombinant nécessite de disposer d'un vecteur et d'une cellule hôte selon l'invention. Ces cellules peuvent être obtenues par l'introduction dans des cellules hôtes d'une séquence nucléotidique insérée dans un vecteur tel que défini ci-dessus, puis la mise en culture desdites cellules dans des conditions permettant la réplication et/ ou l'expression de la séquence nucléotidique transfectée.
Les procédés utilisés pour la purification d'un polypeptide recombinant sont connus de l'homme du métier. Le polypeptide recombinant peut être purifié à partir de lysats et extraits cellulaires, du surnageant du milieu de culture, par des méthodes utilisées individuellement ou en combinaison, tels que le fractionnement, les méthodes de chromatographie, les techniques d'immunoaffinité à l'aide d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux spécifiques, etc.. . Une variante préférée consiste à produire un polypeptide recombinant fusionné à une protéine « porteuse » (protéine chimère). L'avantage de ce système est qu'il permet une stabilisation et une diminution de la protéolyse du produit recombinant, une augmentation de la solubilité au cours de la renaturation in vitro et/ ou une simplification de la purification lorsque le partenaire de fusion possède une affinité pour un ligand spécifique.
Les polypeptides selon la présente invention peuvent aussi être obtenus par synthèse chimique en utilisant l'une des nombreuses synthèses peptidiques connues, par exemple les techniques mettant en œuvre des phases solides (voir notamment Stewart et al, 1984) ou des techniques utilisant des phases solides partielles, par condensation de fragments ou par une synthèse en solution classique. Les polypeptides obtenus par synthèse chimique et pouvant comporter des acides aminés non naturels correspondants sont également compris dans l'invention. L'invention concerne également un anticorps monoclonal ou polyclonal et ses fragments, caractérisés en ce qu'ils lient sélectivement et/ ou spécifiquement un polypeptide selon l'invention. Les anticorps chimériques, les anticorps humanisés et les anticorps simple chaîne font également partie de l'invention. Les fragments d'anticorps selon l'invention sont de préférence des fragments Fab, F(ab')2 ou Fv.
Les polypeptides selon l'invention permettent de préparer des anticorps monoclonaux ou polyclonaux. Les anticorps monoclonaux pourront avantageusement être préparés à partir dtrybridomes selon la technique décrite par Kohler et Milstein en 1975. Les anticorps polyclonaux pourront être préparés, par exemple par immunisation d'un animal, en particulier une souris, avec un polypeptide selon l'invention associé à un adjuvant de la réponse immunitaire, puis purification des anticorps spécifiques contenus dans le sérum des animaux immunisés sur une colonne d'affinité sur laquelle a préalablement été fixé le polypeptide ayant servi d'antigène. Les anticorps polyclonaux selon l'invention peuvent aussi être préparés par purification sur une colonne d'affinité, sur laquelle a préalablement été immobilisé un polypeptide selon l'invention.
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, l'anticorps est capable d'inhiber l'interaction entre le polypeptide RH116 et la séquence d'ARN sur laquelle celle-ci se lie afin d'altérer la fonction physiologique dudit polypeptide RH116.
L'invention concerne également des méthodes pour la détection et/ ou la purification d'un polypeptide selon l'invention, caractérisées en ce qu'elles mettent en œuvre un anticorps selon l'invention. L'invention comprend en outre des polypeptides purifiés, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus par une méthode selon l'invention. Par ailleurs, outre leur utilisation pour la purification des polypeptides, les anticorps de l'invention, en particulier les anticorps monoclonaux, peuvent également être utilisés pour la détection de ces polypeptides dans un échantillon biologique. Pour ces différentes utilisations, les anticorps de l'invention pourront également être marqués de la même manière que décrit précédemment pour les sondes nucléiques de l'invention et de manière préférée avec un marquage de type enzymatique, fluorescent ou radioactif.
Les anticorps de l'invention constituent également un moyen d'analyse de l'expression de polypeptide selon l'invention, par exemple par immunofluorescence, marquage à l'or, immunoconjugués enzymatiques. Plus généralement, les anticorps de l'invention peuvent être avantageusement mis en oeuvre dans toute situation où l'expression d'un polypeptide selon l'invention doit être observée, et plus particulièrement en immunocytochimie, en immunohistochimie ou dans des expériences de « western blotting ».
Ils peuvent permettre notamment de mettre en évidence une expression anormale de ces polypeptides dans les tissus ou prélèvements biologiques. Plus généralement, les anticorps de l'invention peuvent être avantageusement mis en œuvre dans toute situation où l'expression d'un polypeptide selon l'invention, normal ou muté, doit être observée. Ainsi, un procédé de détection d'un polypeptide selon l'invention dans un échantillon biologique, comprenant les étapes de mise en contact de l'échantillon biologique avec un anticorps selon l'invention et de mise en évidence du complexe antigène-anticorps formé est également un objet de l'invention.
Entre également dans le cadre de l'invention, une trousse de réactif pour la détection et/ou le dosage d'un polypeptide selon l'invention dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants : (i) un anticorps monoclonal ou polyclonal tel que décrit précédemment ; (ii) le cas échéant, les réactifs pour la constitution du milieu propice à la réaction immunologique ; (iii) les réactifs permettant la détection des complexes antigène-anticorps produits par la réaction immunologique. Cette trousse est notamment utile à la réalisation d'expériences de Western Blotting ; celles-ci permettent d'étudier la régulation de l'expression du polypeptide selon l'invention à partir de tissus ou de cellules. Cette trousse est également utile aux expériences d'immunoprécipitation pour mettre en évidence notamment les protéines interagissant avec le polypeptide selon l'invention. Cette trousse est également utile pour réaliser la détection et/ ou le dosage d'un polypeptide selon l'invention en utilisant une méthode qui met en jeu la technique ELISA, rimmunofluorescence, la radio-immunologie (technique RIA) ou une technique équivalente.
L'invention comprend également une méthode de détection et/ ou de dosage d'un polynucléotide selon l'invention, dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : (i) d'isolement de l'ADN à partir de l'échantillon biologique à analyser, ou obtention d'un ADNc à partir de l'ARN de l'échantillon biologique ; (ii) d'amplification spécifique de l'ADN codant pour le polypeptide selon l'invention à l'aide d'amorces ; (iii) d'analyse des produits d'amplification. C'est également un objet de l'invention de fournir une trousse pour la détection et/ou le dosage d'un acide nucléique selon l'invention, dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants : (i) un couple d'amorces nucléiques selon l'invention, (ii) les réactifs nécessaires pour effectuer une réaction d'amplification d'ADN, et éventuellement (iii) un composant permettant de vérifier la séquence du fragment amplifié, plus particulièrement une sonde selon l'invention.
L'invention comprend aussi une méthode de détection et/ ou de dosage d'acide nucléique selon l'invention, dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : (i) de mise en contact d'un polynucléotide selon l'invention avec un échantillon biologique ; (ii) de détection et/ou de dosage de l'hybride formé entre ledit polynucléotide et l'acide nucléique de l'échantillon biologique. C'est également un objet de l'invention de fournir une trousse pour la détection et/ ou le dosage d'acide nucléique selon l'invention, dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants : (i) une sonde selon l'invention, (ii) les réactifs nécessaires à la mise en oeuvre d'une réaction d'hybridation, et/ ou le cas échéant, (iii) un couple d'amorces selon l'invention, ainsi que les réactifs nécessaires à une réaction d'amplification de l'ADN.
De préférence, l'échantillon biologique selon l'invention dans lequel sont réalisés la détection et le dosage est constitué par un fluide corporel, par exemple un sérum humain ou animal, du sang, ou par des biopsies.
Font également partie de l'invention, les méthodes de détermination d'une variabilité allélique, d'une mutation, d'une délétion, d'une perte dliétérozygotie ou de toute anomalie génétique du gène codant le polypeptide selon l'invention, caractérisées en ce qu'elles mettent en oeuvre une séquence d'acide nucléique, un polypeptide ou un anticorps selon l'invention. On peut détecter ces mutations directement par analyse de l'acide nucléique et des séquences selon l'invention (ARN, ou ADNc), mais également par l'intermédiaire des polypeptides selon l'invention. En particulier, l'utilisation d'un anticorps selon l'invention qui reconnaît un épitope portant une mutation permet de discriminer entre une protéine « saine » et une protéine « associée à une pathologie ».
Cette méthode de diagnostic et/ ou d'évaluation pronostique peut être utilisée de façon préventive, ou afin de servir à l'établissement et/ ou la confirmation d'un état clinique chez un patient. L'analyse peut être effectuée par séquençage de tout ou d'une partie du gène (i.e. les exons), ou par d'autres méthodes connues de l'homme du métier. On peut en particulier utiliser des méthodes basées sur la PCR, par exemple la PCR- SSCP qui permet de détecter des mutations ponctuelles. On peut également effectuer l'analyse par fixation d'une sonde selon l'invention sur une puce à ADN contenant au moins un polynucléotide selon l'invention et l'hybridation sur ces microplaques. Une puce à ADN contenant une séquence selon l'invention est également un des objets de l'invention. De même, une puce à protéines contenant une séquence d'acides aminés selon l'invention est aussi un objet de l'invention. Une telle puce à protéines permet l'étude des interactions entre les polypeptides selon l'invention et d'autres protéines ou des composés chimiques, et peut ainsi être utile pour le criblage de composés interagissant avec les polypeptides selon l'invention. On peut également utiliser les puces à protéines selon l'invention pour détecter la présence d'anticorps dirigés contre les polypetides selon l'invention dans le sérum de patients. On peut aussi mettre en œuvre une puce à protéines contenant un anticorps selon l'invention.
Des substances peuvent également être testées et identifiées pour leur aptitude à moduler les activités enzymatiques du polypeptide de l'invention. On entend désigner par "une substance qui module une activité enzymatique", une substance qui change l'activité enzymatique par rapport à l'activité enzymatique mesurée en absence de la substance à tester. Par exemple une telle substance peut inhiber partiellement ou totalement l'activité hélicase à ARN ; une telle activité peut être mesurée par des méthodes connues par l'homme de l'art. Par exemple des oligonucléotides synthétiques peuvent être immobilisés sur une matrice et hybride avec un oligoribonucléotide complémentaire marqué. Les oligoribonucléotides hybrides sont ensuite mis en œuvre avec un polypeptide de l'invention, qui relargue une certaine quantité mesurable de l'oligoribonucléotide marqué, non attaché à la matrice, compte tenu de son activité hélicase à ARN. Les effets de la présence ou de l'absence de modulateurs potentiels de l'hélicase à ARN RH116 de l'invention ou l'un de ses fragments peuvent ainsi être testés. Une autre alternative consiste à utiliser le protocole décrit par Jaramillo et al (1991) ; cette méthode consiste à mélanger un substrat ARN duplexe marqué au 32P, avec le polypeptide de l'invention dans une solution tamponnée ; la réaction est arrêtée par addition d'un mélange de glycérol/ SDS/ EDTA/ bleu de bromophénol ; le mélange est ensuite préparé sur un gel SDS-PAGE (8%) selon les conditions standards. L'activité hélicase à ARN est estimée par le rapport entre la quantité d'ARN monomère sur la quantité d'ARN duplexe. D'autres protocoles sont également disponibles (Rozen et αZ.(1990) ; Pause et al (1992) ; Lain et al. (1993), Lee et Hurwitz (1993)). Ces essais peuvent être réalisés dans des microplaques afin de tester simultanément de larges quantités de modulateurs, d'inhibiteurs du polypeptide selon l'invention.
De telles substances peuvent être au préalable développées et sélectionnées par modelage moléculaire afin d'identifier des substances susceptibles de réagir avec un polypeptide de l'invention. Il est possible d'identifier une substance qui affecte l'aptitude de la protéine de l'invention à lier avec l'ATP ou d'autres substrats, tels que l'ARN, l'ADN ou les complexes ARN/protéines. Les substrats qui interfèrent avec un site de liaison au substrat de la protéine de l'invention ou avec un site qui affecte de tels épitopes fonctionnels peuvent être identifiés par des méthodes connues de l'homme de l'art (pour revue, voir Fruehleis et άl.( 1987) ; Perun et al. (1989) ; Van de Waterbeemd (1994), Blundell (1996).
L'invention concerne donc une procédé de criblage d'un composé susceptible d'affecter le taux d'expression cellulaire et/ ou l'activité hélicase à ARN d'un polypeptide RH116 selon l'invention et qui comporte les étapes suivantes de (i) mise en contact d'une cellule choisie parmi la cellule hôte de l'invention et une cellule eucaryote, de préférence humaine, exprimant ou contenant le polypeptide selon l'invention, et d'un ou plusieurs composés ou ligands potentiels susceptibles de pénétrer ou d'être introduits dans ladite cellule, et de (ii) détection et/ou mesure du taux d'expression cellulaire et/ ou de l'activité hélicase à ARN. Le gène codant pour le polypeptide selon l'invention qui est présent dans la cellule hôte ou dans une cellule eucaryote, de préférence humaine, correspond au moins à une séquence polynucléotidique codant pour le polypeptide de l'invention de préférence sous la forme d'ADN génomique ou d'ADNc, lié de manière opérationnelle à la séquence promotrice du gène du RH116 humaine ou du gène homologue d'une espèce animale telle la souris. Les composés criblés par un tel procédé et susceptibles d'affecter le taux d'expression de l'hélicase à ARN RH116 sont de préférence des composés susceptibles d'interagir avec les séquences polynucléotidiques régulatrices (promoteur, séquence amont, « enhancer », « silencer », « insulator », etc..) du gène codant naturellement pour le polypeptide selon l'invention ou les composés susceptibles d'interagir avec des facteurs de transcription (facteurs de transcription généraux ou facteurs tissu-spécifiques) impliqués dans la régulation de la transcription du gène codant pour le polypeptide selon l'invention, pour former un complexe susceptible d'affecter la transcription du gène codant le polypeptide RH116 de l'invention, c'est-à-dire d'augmenter, de diminuer, de moduler ou d'annuler la transcription dudit gène. Les techniques de détection et/ou de mesure de l'activité transcriptionnelle sont connues de l'homme du métier. Il convient notamment de citer les technologies de Northern Blotting et de RT-PCR qui peuvent être mises en œuvre avec les polynucleotides de l'invention utilisés comme respectivement comme sonde ou comme amorce. L'invention concerne également un procédé de criblage d'un composé susceptible d'affecter l'activité hélicase à ARN d'un polypeptide selon l'invention et qui comporte les étapes suivantes de (i) mise en contact dudit polypeptide et d'un ou plusieurs composé(s) ou ligands potentiel(s) en présence de réactifs nécessaires à la mise en œuvre de l'activité hélicase à ARN, et de (ii) détection et/ ou mesure de l'activité hélicase à ARN.
Selon un mode préféré de réalisation, les procédés de criblage de composés précédemment décrits se caractérisent en ce que ledit composé criblé diminue ou annihilé le taux d'expression et/ou l'activité hélicase à ARN du polypeptide RH116 de l'invention. Le composé susceptible d'être obtenu par les procédés précédemment décrits et qui diminue le taux d'expression et/ ou l'activité hélicase à ARN du polypeptide RH116 de l'invention est un antagoniste de la RH116 et constitue également un des objets de l'invention ; ce composé se caractérise en ce qu'il est choisi parmi un polynucléotide selon l'invention utilisé en tant que séquence d'acide nucléique antisens, un vecteur d'expression antisens selon l'invention, un anticorps selon l'invention, les muramylpeptides, de préférence le Murabutide, ou parmi tout autre antagoniste du polypeptide selon l'invention.
En effet, le blocage partiel ou total de l'activité biologique du polypeptide RH116 de l'invention et de ses fragments constitue un moyen d'inhiber ou d'anihiler la réplication virale. En effet, l'ARN génomique non épissé et l'ARNm incomplètement épissé des rétrovirus tels le VIH nécessitent d'être exportés dans le cytoplasme pour l'empaquetage et/ou la traduction. Un tel processus est médié soit par un élément de transport agissant en CIS pour les rétrovirus simples (CIS-acting constitutive transport élément ou CTE), soit par la protéine virale Rev agissant en TRANS avec des éléments de réponse (Rev Responsive élément pour RRE) pour les rétrovirus complexes tels le VIH. L'hélicase à ARN RH116 selon l'invention est susceptible de constituer un cofacteur pour le CTE et jouer également un rôle dans l'expression de gène médié par le RRE et ainsi de jouer un rôle dans la réplication du VIH.
La présente invention se propose donc de fournir des composés susceptibles de bloquer partiellement ou totalement l'activité hélicase à ARN du polypeptide de l'invention pour diminuer ou annihiler la réplication de virus. Parmi ceux-ci il convient de citer un polynucléotide selon l'invention utilisé en tant que séquence d'acide nucléique antisens, un vecteur d'expression antisens selon l'invention, un anticorps selon l'invention, les muramylpeptides, de préférence le Murabutide, ou tout autre antagoniste du polypeptide selon l'invention. De préférence, les muramylpeptides et le Murabutide constituent des antagonistes de la RH116 dans les cellules de patients VIH+.
La présente invention ne se limite pas au seul virus VIH mais à l'ensemble des virus faisant intervenir directement ou indirectement une hélicase à ARN dans sa réplication. Par virus, on entend désigner les virus à ADN ou à ARN, monocaténaires ou bicaténaires, enveloppés ou non- enveloppés. De préférence, les virus appartiennent à la famille des rétroviridae, des orthomyxoviridae, des rhabdoviridae, des bunyaviridae, des adénoviridae, des hépadnaviridae, des herpesviridae, des poxviridae. De préférence, les hepadnavirus sont les virus de l'hépatite B et de l'hépatite C. L'activité biologique du polypeptide de l'invention n'est pas restreinte au seul contrôle post-transcriptionnelle des ARN viraux, mais participe également au contrôle transcriptionnel des ARN en général. Ainsi, le polypeptide de l'invention constitue-t-il une cible thérapeutique d'intérêt pour des composés susceptibles d'altérer l'activité hélicase à ARN intervenant dans d'autres processus biologiques normaux ou pathologiques. L'hélicase à ARN constitue une cible de choix pour des composés destinés au traitement du cancer. En effet, différents articles de la littérature scientifique traitent de l'implication des helicases à ARN dans la tumorigénèse. Ainsi une surexpression de la protéine DEAD-boxl (DDX1) est susceptible de jouer un rôle dans la progression des tumeurs telles que le neuroblastome (Nb) et le rétinoblastome (Godbout et al. 1998) en altérant la structure secondaire normale et le taux d'expression des ARN des cellules cancéreuses. D'autres helicases à ARN ont été impliquées directement ou indirectement dans la tumorigénèse. Ainsi la protéine murine p68 est mutée dans les tumeurs induites par la lumière ultra-violette ; le gène de l'hélicase à ARN DDX6 est situé au niveau du point de cassure chromosomique associé avec le lymphome des cellules B. De la même manière, une protéine chimérique comprenant DDX10 et la nucléoporine NUP98 semble être impliquée dans la pathogénèse de certaines maladies myêloïdes. Les composés susceptibles de diminuer ou d'annuler l'activité hélicase à ARN de RH116 constituent donc des composés d'intérêt destinés au traitement préventif ou curatif du cancer. Parmi les cancers susceptibles d'être traités par les composés antagonistes de la RH116, il convient de citer de manière non les cancers tels que l'adénocarcinome, la leucémie, le lymphome, le mélanome, le myélome, le sarcome, le gliome, le tératocarcinome et plus particulièrement les cancers de la glande adrénale, de la vessie, des os, de la moelle, du sein, du tractus gastro-intestinal, du foie, du poumon, du pancréas, de l'ovaire, de l'utérus, des testicules, de la prostate et de la gorge.
De même les composés susceptibles de diminuer ou d'annuler l'activité hélicase à ARN de RH116 constituent donc des composés d'intérêt destinés au traitement préventif ou curatif d'autres pathologies telles que le rhumatisme, les maladies héréditaires, l'arthrite, l'arthérosclérose, l'ostéoporose, les maladies infectieuses aigùes et chroniques, les maladies auto-immunes, les diabètes, ainsi que les problèmes liés à la rejet des organes lors de la transplantation. Plus particulièrement, l'invention concerne les maladies immunes et auto-immunes dont fait également partie le SIDA (Syndrome d'immunodéficience acquise) .
Les inhibiteurs, antagonistes et autres composés susceptibles de diminuer ou d'annuler l'activité hélicase à ARN de RH116 constituent des composés d'intérêt pour le traitement préventif ou curatif de maladies auto- immunes. En effet, il a été récemment rapporté par Takeda et al. (1999) que l'hélicase à ARN A agit comme un auto-antigène chez les patients atteints de lupus systémique érythémateux. Ainsi, le polynucléotide selon l'invention utilisé en tant que séquence d'acide nucléique antisens, le vecteur d'expression antisens selon l'invention, l'anticorps selon l'invention, les muramylpeptides, et de préférence le Murabutide, ou tout autre antagoniste du polypeptide RH116 selon l'invention, peuvent être utilisés pour le traitement des maladies auto-immunes. Parmi les maladies auto- immunes, il convient de citer plus particulièrement, l'uvéite, la maladie de Bechet, la sarcoïdose, le syndrome de Sjôgren, la polyarthrite rhumatoïde, la polyarthrite juvénile, le syndrome de Fiessinger-Leroy-Reiter, la goutte, l'ostéoarthrose, le lupus érythémateux systémique, le lupus érythémateux aigu disséminé, la polymyosite, la myocardite, la cirrhose biliaire primitive, la maladie de Crohn, la colite ulcéreuse, la sclérose en plaques et autres maladies démyélinisantes, l'anémie aplasique, le purpura thrombocytopénique, le myélome multiple et le lymphome à lymphocytes B, le panhypopituitarisme de Simmonds, la maladie de Basedow-Graves et l'ophtalmopathie de Graves, la thyroïdite subaiguë et la maladie de Hashimoto, la maladie d'Addison, le diabète sucré insulino-dépendant (type 1), la maladie d'Addison, le syndrome de détresse respiratoire de l'adulte, les allergies, l'anémie, l'asthme, l'anémie hémolytique auto-immune, la bronchite, la dermatite atopique, l'emphysémie, la lymphopénie épisodique. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le procédé de criblage de composé de l'invention se caractérise en ce que ledit composé criblé augmente le taux d'expression et/ ou l'activité hélicase à ARN du polypeptide RH116 de l'invention. Le composé ainsi criblé, également objet de l'invention, constitue un agoniste du polypeptide selon l'invention. Parmi les composés agonistes susceptibles d'être obtenu par le procédé de l'invention, il convient de citer les muramylpeptides, et de préférence le Murabutide ; en effet, les inventeurs ont démontré expérimentalement que ce dernier composé, le Murabutide, augmente le taux d'expression de RH116 dans les cellules de donneurs sains, se comportant ainsi comme un agoniste du polypeptide de l'invention.
Selon un autre mode de réalisation, l'invention porte sur un procédé de criblage de composés susceptibles d'affecter l'activité fonctionnelle d'un polypeptide selon l'invention. Un tel procédé comporte les étapes de (i) mise en contact dudit polypeptide et d'un ou plusieurs ligand(s) potentiel(s) en présence de réactifs nécessaires à la mise en œuvre d'une réaction choisie parmi la réaction d'épissage de l'ARN nucléaire et/ou mitochondrial, de réaction d'édition de l'ARN, de réaction de maturation de l'ARNr, de réaction d'initiation de la traduction, de la réaction d'export des ARNm nucléaire vers le cytoplasme, et la réaction de dégradation des ARNm et de (ii) détection et/ou mesure de ladite réaction. Le composé criblé susceptible d'être obtenu par le procédé entre également dans la portée de cette invention.
L'invention concerne donc un composé caractérisé en ce qu'il est choisi parmi un anticorps selon l'invention, un polypeptide selon l'invention, un polynucléotide selon l'invention, un oligonucléotide selon l'invention, un vecteur selon l'invention, un vecteur d'expression antisens selon l'invention, une cellule selon l'invention, un composé susceptible d'être obtenu par les différents procédés de criblage selon l'invention à titre de médicament et notamment en tant que principes actifs de médicament ; ces composés seront préférentiellement sous forme soluble, associés à un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Par véhicule pharmaceutiquement acceptable, on entend désigner tout type de véhicule employé habituellement dans la préparation de compositions injectables, c'est-à-dire un diluant, un agent de suspension tel une solution saline isotonique ou tamponnée. De préférence, ces composés seront administrés par voie systémique, en particulier par voie intraveineuse, par voie intramusculaire, intradermique ou par voie orale. Leurs modes d'administration, posologies et formes galéniques optimaux peuvent être déterminés selon les critères généralement pris en compte dans l'établissement d'un traitement adapté à un patient comme par exemple l'âge ou le poids corporel du patient, la gravité de son état général, la tolérance au traitement et les effets secondaires constatés, etc.
De préférence, les composés de l'invention à titre de médicament sont destinés à la prévention et/ ou au traitement de pathologies sélectionnées dans le groupe composé du cancer, des maladies infectieuses aiguës ou chroniques telles les infections par le VIH ou le virus de l'hépatite
B ou C, des maladies génétiques héréditaires, des maladies immunes et auto-immunes, du rhumatisme, de l'arthrite, de l'arthérosclérose, de l'ostéoporose, des diabètes et à la prévention des rejets de greffes d'organe.
Parmi les composés à titre de médicament de l'invention, les composés antagonistes du polypeptide RH116 sont particulièrement préféré pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de pathologies virales tel que le syndrome d'immunodéficience acquise (SIDA) ou l'hépatite.
C'est également un des objets de la présente invention de fournir une composition pharmaceutique pour le traitement préventif et curatif de pathologies virales et notamment du SIDA ou de l'hépatite caractérisée en ce qu'elle contient une quantité thérapeutiquement efficace d'un composé antagoniste d'un polypeptide RH116 et d'un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Plus particulièrement l'invention vise également à fournir un produit comprenant au moins un composé antagoniste de la RH116 et au moins un autre agent antiviral comme produit de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps en thérapie anti-virale, de préférence anti-VIH. Cet autre agent antiviral est de préférence choisi parmi (i) les inhibiteurs nucléotidiques ou non-nucléotidiques de la reverse transcriptase tel que par exemple le 3'-azido-3'déoxythymidine (AZT), le 2',3'-didéoxyinosine (ddl), le 2',3'-didéoxycytidine (ddC), le (-)2',3'-didéoxy-3'-théacytidine (3TC), le 2',3'- didéhydro-2',3'didéoxythymidine (d4T), le (-)2'-déoxy-5-fluoro-3'- théacytidine (FTC), le TIBO, le HEPT, le TSAO, l'α-APA, la névirapine, le BAHP, l'acide phosphonoformique (PFA) et (ii) les inhibiteurs de la protéase virale tels l'indinavir et le saquinavir.
Selon un autre mode de réalisation, il est également dans l'étendue de l'invention de fournir une méthode de traitement thérapeutique ou prophylactique de maladie associée à une augmentation de l'expression ou de l'activité du polypeptide RH116 selon l'invention. Cette méthode comprend d'administrer à un patient qui nécessite un tel traitement, une quantité thérapeutiquement efficace d'un antagoniste du polypeptide de l'invention.
L'invention porte également sur l'utilisation d'un polypeptide selon l'invention, d'un polynucléotide selon l'invention, d'un composé agoniste d'un polypeptide RH116 selon l'invention pour la préparation d'un médicament destiné au traitement prophylactique de pathologies. En effet, les vaccins en général induisent une immunité à une infection ou à une maladie en générant une réponse immune chez un patient contre un antigène spécifique associé avec l'infection ou avec la maladie. Cependant, dans beaucoup de cas, les antigènes purifiés sont de faibles immunogènes. Dans de tels cas, des agents immunomodulateurs tels un adjuvant ou un immunostimulant doivent être employés pour augmenter la réponse immune. Cependant, l'un des désavantages de nombreux adjuvants employés à l'heure actuelle est leur toxicité. Il existe donc un réel besoin d'identifier de nouveaux composés qui permettent d'augmenter les réponses immunes spécifiques ; c'est ce que se propose de faire la présente invention. En effet, les polypeptides et les polynucleotides de l'invention et les composés agonistes d'un polypeptide RH 116 selon l'invention peuvent être utilisés pour la préparation d'un médicament destiné à provoquer ou à augmenter la réponse immune à un vaccin chez un patient.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description avec les exemples représentés ci-après. Dans ces exemples on se référera aux figures suivantes.
FIGURE 1 : Stratégie utilisée pour l'obtention de l'extrémité 3' de l'ADNc codant pour le RH116.
Le court fragment supérieur est le fragment initial de 164 pb obtenu par le DD-RT PCR et correspond à la région 3' de l'ADNc codant pour le polypeptide RH 116 de l'invention. Ce fragment plus long de 1260 pb a été obtenu après un 3' RACE (trait inférieur).
FIGURE 2 : Stratégie d'obtention de la région 5' de l'ADNc codant pour le RH116. (A) La partie de l'extrémité 5' a été obtenue après deux réactions de PCR (5'RACE) pour Rapid Amplification of cDNA Ends, i.e. amplification rapide des extrémités des ADNc, les fragments obtenus sont symbolisés en (....) (R3) et en ( — ) (R8). Cette stratégie a donc permis aux inventeurs d'obtenir un cadre de lecture ouvert (ORF open reading frame) de 853 acides aminés. Les oligonucléotides HELI let HELI 2 qui serviront d'amorces pour les RT-PCR, sont indiqués. (B) La partie 5' terminale de l'ADNc correspondant au polypeptide RH116 a été obtenue après une réaction de PCR à partir de l'amorce R16 (5'RACE). Le fragment obtenu de
964pb est symbolisé en pointillé ( ) .
FIGURE 3 : Séquence en amino-acides de l'hélicase à ARN putative humaine RH 116 et comparaison avec l'hélicase ARN putative (RIG-1). (A) Représentation schématique des régions en amino-acides hautemenl conservées caractéristiques des ARN helicases ATP dépendantes putatives de la famille des protéines « DEAD-BOX ». Le motif conservé est encadré (le « x > indique n'importe quel amino-acide), un motif SAT, -A- est l'amino-acide hautement conservé, S et T peuvent être remplacés par n'importe quel acide aminé dans n'importe cas individuel (Luking et al, 1998). Dans le motif VI (X)ι-2 indique n'importe lequel des 2 acides aminés. (B) Séquence en amino- acides de la protéine RH 116 déduite à partir de la séquence d'ADNc (Nc d'accession EMBL AYO 17378). 6 motifs conservés caractéristiques de lε famille des protéines « DEAD-BOX » sont indiqués par des lettres en gras. (C] Alignement de séquence du cadre de lecture ouvert de 1025 aa (clone 10.5] (séquence supérieure) avec une hélicase à ARN humaine (RIG-1) décrite pai SUN Y.W. (Numéro d'accès AF 038963) (séquence inférieure). Les homologies de séquences sont présentées dans la ligne intermédiaire aux deux séquences. Les séquences encadrées correspondent aux domaines conservés des helicases à ARN ; les domaines G-GKT et DEXH correspondent aux domaines ATPase et les domaines SAT (-A-) et RGR-R (GR— R), spécifiques des helicases à ARN, sont responsables de la liaison et du déroulement de l'ARN cible.
FIGURE 4 : Analyse en Northern-blot de l'expression de l'ARN messager RH 116 dans de multiples tissus humains (CLONTECH).
L'ARN polyA+ obtenu à partir de cerveau (1), de cœur (2), de muscle squelettique (3), de côlon (4), de thymus (5), de rate (6), de rein (7), de foie (8), d'intestin grêle (9), de placenta (10), de poumon (11), de leucocytes du sang périphérique (12) ont été hybrides avec une sonde oligonucléotidique dérivée de l'ARN messager de RH 116 et marquée à son extrémité au phosphore 32P (partie supérieure de la figure). Des quantités équivalentes d'ARN polyA+ sont également hybridées avec une sonde β-actine utilisée comme contrôle (partie inférieure de la figure). A la fois dans le cœur et dans le muscle squelettique, il existe deux formes d'ARN messager β-actine, une forme de 2 kb et une forme de 1,6-1,8 kb. Cette différence de taille n'est pas due à une dégradation de l'ARN messager mais à l'hybridation de la sonde avec soit la forme α soit la forme γ de l'actine (voir les instructions du fabricant CLONTECH).
FIGURE 5 : Inhibition de l'expression de l'ARN messager RH 16 induite par le murabutide dans des PBMC infectés de manière endogène et déplétês en CD8. Les PBMC activés par la PHA et dépiétés en
CD8 sont maintenus en culture, en absence (médium) ou en présence de murabutide à 10 μg/ml pendant 6 ou 24 heures. (A) Des échantillons d'ARN
(20, 100 et 500 ng) sont sujets à une amplification par RT PCR avec une paire d'amorces spécifiques pour détecter l'ARN messager RH 116. L'ARN messager GAPDH (contrôle interne) exprimé de manière constitutive est également amplifié dans les mêmes échantillons. (B) Le pourcentage d'inhibition moyen de l'expression de l'ARN messager de RH 116 est observé dans des échantillons de 5 patients infectés par le VIH- 1.
FIGURE 6 : Immuno-précipitation de la protéine RH 116 à partir d'extraits cellulaires marqués à l'iode 125I obtenues à partir de cellules U937. (A) Extraits cellulaires totaux ( 1, 2) ou extraits nucléaires (3, 4) sont marqués et immuno-précipités en utilisant 20 μg d'immunoglobulines purifiées à partir de sérum normal (1, 3) ou de sérum murin obtenu contre la protéine RH 1161-335 (2,4). Les échantillons sont chargés sur un gel SDS- PAGE à 8%. (B) La qualité du fractionnement cellulaire est vérifiée par une analyse en Western-Blot en utilisant un anticorps dirigé contre la protéine de 58 kDa de l'appareil de Golgi (protéine cytoplasmique) et un anticorps anti-histone 1 (protéine nucléaire) dans des extraits totaux (1) et/ou des extraits nucléaires (2).
FIGURE 7 : L'immuno-localisation de la protéine RH 116 dans les cellules HeLa-CD4+. Les cellules Hela-CD4+ fixées au méthanol sont incubées avec du sérum murin normal (A), des anticorps monoclonaux anti-histone Hl (Santa Cruz) (B) ou un anti-sérum murin dirigé contre la protéine RH I I61-335 (C), et sont colorées avec des anticorps IgG anti-souris de chèvre conjugués au FITC et/ ou avec l'iodure de propidium. L'immuno- fluorescence montre une coloration au FITC verte (1), une contre-coloration nucléaire rouge correspondant à l'iodure de propidium (2) et la double coloration (3).
FIGURE 8 : Expression de l'antigène viral P24 par des cellules HeLa CD4+ transfectées et infectées par le virus VIK-l^. Les cellules
HeLa CD4+ sont transfectées de manière transitoire, d'une part avec le plasmide pEGFP (GFP) ou avec le plasmide pEGFP dans lequel sont respectivement clones les ADNc de RH 116 ou de SSA (GFP-RH 116 et GFP- SSA respectivement) et, d'autre part, avec le plasmide pCR3 ou le plasmide pCR3 dans lequel est clone Tat (pCR3-Tat) ; les cellules sont infectées 24 heures après par le virus VIH- 1 LAI. A partir du 2ême jour après l'infection des cellules, les milieux de culture sont collectés quotidiennement jusqu'au
5ème jour#
La réplication virale est évaluée par le relargage de l'antigène P24 par les cellules (concentration cellulaire normalisée à 5 x 105 cellules/ml) dans les surnageants des cultures de cellules transfectées avec la GFP, GFP-RH 116 ou GFP-SSA (A) et de cellules transfectées avec pCR3 ou pCR3-Tat (B). (C) Augmentation de l'antigène P24 dans les cellules infectées et transfectées par GFP-RH 116, GFP-SSA ou Tat comparées avec les contrôles correspondants respectifs (GFP ou pCR3 respectivement). Les résultats correspondent aux valeurs moyennes plus ou moins l'écart type des valeurs obtenues pour 5 (GFP-RH 116 et GFP-SSA) et pour 3 expériences indépendantes (pCR3-Tat).
FIGURE 9 : RT PCR semi-quantitative représentative de l'expression de l'ADN viral et de l'ARN messager dans des cellules HeLa-CD4+ transfectées et infectées par le virus VIH-IL^. Les échantillons d'ARN (500, 100, 20 et 4 ng) sont sujets à des amplifications RT PCR avec des amorces spécifiques pour détecter une surexpression des ARNm codant pour la protéine RH 116, SSA-56 ou TAT (A). Les échantillons d'ARN sont soumis à des amplifications de RT PCR pour détecter l'ARNm viral (B) avec une paire d'amorces GAG04-GAG06 pour détecter les ARNm non épissés GAG ou POL et avec une paire d'amorces BSS/KPNA pour détecter des transcrits viraux de taille intermédiaire ou simplement épissés. Ces ARN messagers sont nommés sur la base des exons qu'ils contiennent et des protéines qu'ils produisent (Neuman, 1994). (C) L'ADN total est extrait 24 heures après l'infection et des concentrations variables (150, 30, 6 et 1,2 ng) sont utilisées comme matrice pour une amplification par PCR au moyen d'une paire d'amorces GAG04-GAG06 afin de détecter le gène GAG du VIH- 1. L'équivalent cellulaire est déterminé par amplification des gènes β-actine ou GAPDH.
FIGURE 10 : Détection d'auto-anticorps dirigés contre la protéine
RH 116 dans des patients contrôle sains et des patients infectés par le VIH avant et après traitement anti-rétroviral. Les barres horizontales reflètent les valeurs moyennes arithmétiques.
EXEMPLES
MATERIELS ET METHODES
1. Cellules et conditions de culture : Les cellules HeLa-CD4+ (fournies par le Docteur HUBER,
LABORATOIRE DE VIROLOGIE, Lille, France) et les cellules U937 sont cultivées respectivement dans du milieu DMEM ou dans du milieu RPMI 1640 complémenté avec 10% de sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur (LIFE-TECHNOLOGIES-INVITROGEN, Cergy-Pontoise, France), 2 mM L- glutamine (LIFE-TECHNOLOGIES-INVITROGEN, Cergy-Pontoise, France) et 1% de gentamycine (SHERING-PLOUGH, Levallois-Perret, France).
2. Préparation des cellules mononucléaires humaines du sang périphériques (PBMC) : Le sang veineux est collecté à partir de patients séropositifs au VIH- 1 et des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) sont isolées par centrifugation sur Ficoll-Hypaque (AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH, Uppsala, Suède). Les cellules sont lavées avec soin pour éliminer les plaquettes et sont déplétées en cellules CD8+ en utilisant des billes électromagnétiques couvertes d'un anticorps anti-CD8 (DYNAL, Oslo, Norvège). Les PBMC dêplétés obtenus par la mise en œuvre du protocole du fabricant contiennent moins de 3% de cellules CD8+ après analyse par cytométrie de flux. Les cellules sont ensuite cultivées dans du RPMI 1640 supplémenté avec 10% de sérum AB inactivê par la chaleur (ETABLISSEMENT DE TRANSFUSION SANGUINE, Lille, France) puis stimulées avec de la phytohémaglutinine (PHA) (5 μg/ml pendant 3 jours). Les PBMC sont ensuite cultivés puis récupérés en présence ou en absence de murabutide (N-acétyl-muramyl-L-alanyl-D-glutamine-n-butyl ester) (fournis par ISTAC SA, Lille, France) (10 μg/ml) et d'interleukine 2 (IL-2) (10 μg/ml) pendant 6 ou 24 heures.
3. Expérience de « differential display-RT-PCR » (DD-RT-PCR) : La DD-RT-PCR a été réalisée sur des extraits d'ARN totaux de PBMC activés par la PHA et dépiétés en CD8 obtenus de patients VIH- 1, tels que précédemment décrits (Liang et Pardee, 1992 avec certaines modifications). Brièvement, 1 mg d'ARN total est incubé à 75°C pendant 10 minutes en présence de 2 mM d'amorces oligo (dT), T12BA (B étant un mélange de G, T, C), T12VT (V étant un mélange de A, G, C), T12HG (H étant un mélange de A, C, T), T12DC (D étant un mélange de A, G, T) et d'eau dépourvue de ribonucléase, dans un volume final de 11 μl. L'ADN complémentaire (ADNc) est ensuite synthétisé à l'aide de la reverse-transcriptase RNAse H Superscript (LIFE-TECHNOLOGIES-INVITROGEN, Cergy-Pontoise, France) dans 25 μl contenant 10 mM de dithiotréithol, 20 μm de dNTP pendant une heure à 37°C avant une dénaturation de 10 min à 95°C. L'ADNc synthétisé est ensuite amplifié avec une unité de polymérase Ampli Taq Gold (APPLIED BIOSYSTEMS, Foster City, CA, Etats-Unis), 2,5 mM de MgCb, 2 μM de dNTP, 2 μCi de 33P-dATP (AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH) en utilisant des amorces spécifiques en aval et des amorces aléatoires en amont : AP0: TAT CGA CTC CAA G (SEQ ID N° 27); API: TTA GCT AGC ATG G (SEQ ID N° 28); AP2: TGC TAA GAC TAG C (SEQ ID N° 29); AP3: TTG CAG TGT GTG A (SEQ ID N° 30); AP4: TGT GAC CAT TGC A (SEQ ID N° 31); AP5: TGT CTG CTA GGT A (SEQ ID N° 32); AP6 : TGC ATG GTA GTC T (SEQ ID N° 33); AP7: TGT GTT GCA CCA T (SEQ ID N° 34); AP8: TAG ACG CTA GTG T (SEQ ID N° 35); AP9: TTA GCT AGC AGA C (SEQ ID N° 36); AP10: TCA TGA TGC TAC C (SEQ ID N° 37); AP11: TAC TCC ATG ACT C (SEQ ID N° 38); AP12: TAT TAC AAC GAG G (SEQ ID N° 39); AP13: TAT TGG ATT GGT C (SEQ ID N° 40); AP14: TAT CTT TCT ACC C (SEQ ID N° 41); AP15: TAT TTT TGG CTC C (SEQ ID N° 42); API 6: TTA TCT ATA CAG G (SEQ ID N° 43); AP17: TTA TGG TAA AGG G (SEQ ID N° 44); AP18: TTA TCG GTC ATA G (SEQ ID N° 45); AP19: TTA GGT ACT AAG G (SEQ ID N° 46). Les paramètres de l'amplification sont 1 min à 94°C, 1 min à 40°C, 1 min à 72°C, suivies par une étape d'extension finale de 5 min à 72°C. Les produits PCR sont ensuite séparés par électrophorèse sur un gel à 6% polyacrylamide-8 M urée. Après séchage, le gel est ensuite exposé sur un film Hyperfilm-HP. Des bandes ADNc exprimées de manière différente sont excisées du gel, éluées dans 100 μl d'eau stérile, précipitées puis resuspendues dans 10 μl d'eau stérile. Les fragments d'ADNc sont ensuite réamplifiés en utilisant le même couple d'amorces décrit précédemment et subséquemment clones dans le vecteur de clonage TOPO TA PCR II (INVITROGEN, Groningen, Pays-Bas).
4. Séquençage de l'ADN : Les ADNc clones sont utilisés comme matrice pour le séquençage en utilisant le kit de séquençage « PRISM Ready Reaction Dye Deoxy Terminator » de APPLIED BIOSYSTEMS. Les échantillons sont soumis à électrophorèse sur un séquenceur d'ADN ABI 377 ; il sont lus automatiquement puis enregistrés en utilisant le logiciel ABI Prism, version 2.2.1, de APPLIED BIOSYSTEMS. Des recherches d'homologie dans des banques de données de nucléotides ont été réalisées en utilisant le programme Basic Local Alignment Search Tool (BLAST).
5. RT PCR semi-quantitative pour la détection de l'expression de gènes :
L'ARN cellulaire total extrait en utilisant le kit RNA plus (Q-BIOgene, Illkirch, France) est prétraité avec de la DNAsel. La synthèse du premier brin sur l'ARN polyA+ a été amorcée avec une amorce p(dT)i5 (BOERHINGER MANNHEIM, ROCHE DIAGNOSTICS, France) et réalisée par la reverse-transcriptase dérivée du virus de la leucémie murine de Moloney (M-MLV) (PROMEGA, Madison, CA, USA) (1 heure à 37°C, 3 min à 92°C). L'ADNc résultant est ensuite soumis à 25 à 35 cycles répétés d'amplification avec l'ADN polymérase AmpliTaq Gold (APPLIED BIOSYSTEMS). L'amplification PCR des séquences GAPDH est réalisée pour obtenir un contrôle interne. Les amorces oligonucléotidiques spécifiques sont les suivantes : GAPDH [Brin sens : 5'- GCC ATC AAT GAC CCC TTC ATT GAC-3' (SEQ ID N°19) ; brin antisens : 5'- TGA CGA ACA TGG GGG CAT CAG CAG -3' (SEQ ID N° 20)], RH 116 (Brin sens : 5'- GGA AGT ACA ATG AGG GCC TAC AAA-3' (SEQ ID N°13) ; brin antisens : 5'-TCC TCA GTC CTA GTA TAT TGC TCC-3' (SEQ ID N° 14)], SSA-56 [Brin sens : 5'-GAA AGA GAG GTC GCA GAG GCC TGT-3' (SEQ ID N°47); brin antisens : 5'-TGA TAA GGC TGA GGA AGG GAA ATG-3' (SEQ ID N°48)], Tat (Brin sens : 5'- CTA GAC CCC TGG AAG CAT CCA-3' (SEQ ID N°49); brin antisens : 5'-TCG GGC CTG TCG GGT CCC CTC-3' (SEQ ID N°50)].
Tous les produits PCR sont ensuite séparés sur gels d'agarose à 2% puis visualisés par une coloration au bromure d'éthidium. En utilisant des systèmes d'imagerie (IMAGE MASTER ID PRIME, AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH), le pourcentage de variation d'expression d'ARN messager a été déduit après normalisation par rapport aux taux des standards internes correspondants, tel que précédemment décrit (Amiel et al, 1999).
6. Clonage de l'ADNc pleine longueur :
Le clonage de l'ADNc pleine longueur RH116 a été réalisé en utilisant le kit d'amplification SMART™ RACE cDNA (CLONTECH, Palo Alto, CA, USA) sur des échantillons d'ARN polyA+ à partir de PBMC de patient sain dépiétés en CD8. De plus, une banque humaine de rate (λ TriplEX™ Library CLONTECH) a été criblée avec des sondes spécifiques marquées au phosphore 32P selon les instructions du fabricant.
7. Analyse par Northern Blotting :
L'analyse par Northern Blotting a été réalisée en utilisant le kit « Multiple Tissue Northern » (MTN™) (CLONTECH) selon les instructions du fabricant. L'ARN polyA+ a été hybride avec les oligonucléotides 5'-CGT GCT GAT TCC TCA GTC CTA GTA TAT TGC-3' (SEQ ID N° 26) and 5'-GCA TCT GCA ATG GCA AAC TTC TTG CAT GGC-3' (SEQ ID N° 18) e dérivés de la séquence ADNc de RH 116 et marqués aux extrémités par du phosphore 32P. Les membranes sont réhybridées avec une sonde ADNc de β-actine humaine. 8. Expression de la protéine marquée avec un His-Tag et production d'anticorps polyclonaux de souris :
Un fragment partiel correspondant au 335 premiers acides aminés de l'ARN messager RH116 a été amplifié en utilisant des oligonucléotides spécifiques (SEQ ID N°21 et SEQ ID N°22) et a été sous-cloné dans le vecteur pQE-81 (QIAGEN, Courtabœuf, France), préalablement coupé avec les enzymes BamHI et Sali. Le plasmide résultant pQE-81-His6-RH116ι-335 est ensuite transformé dans les cellules E. coli TOP 10F'. Les cellules transformées sont ensuite cultivées et induites par 1 mM d'isopropyl-1-thio- β-D-galactopyranoside pendant 5 heures. La purification en conditions dénaturantes est réalisée en utilisant des billes Ni-NTA selon les recommandations du fabricant (QIAexpressionist™ QIAGENE).
La protéine recombinante partielle RH I I61-335 (50 μg), émulsifiée dans un adjuvant complet de Freund (SIGMA, Saint-Louis, MI, USA), est utilisée pour immuniser une souris par injection intrapéritonéale. Après 30 jours, les animaux sont stimulés avec 50 μg de la même protéine recombinante émulsifiée avec l'adjuvant incomplet de Freund (SIGMA) et 15 jours plus tard avec 50 μg de la même protéine sans adjuvant. Les sera sont collectés 10 jours après la dernière stimulation et sont testés pour le taux d'anticorps anti-RH116. Les immunoglobulines sont ensuite purifiées à partir des anti-sera selon la méthode utilisant l'acide caprylique (Steinbuch et Audran, 1969) et concentrées par précipitation au sulfate d'ammonium saturé. Avant l'immunisation, les sera sont collectés et utilisés comme contrôle négatif. Les activités d'anti-sera et d'immunoglobuline sont testées par ELISA, tel que décrit ci-dessous.
9. Analyses par immunofluorescence indirecte :
Pour les analyses par immunofluorescence indirecte, les cellules
HeLa-CD4+ sont cultivées sur des lames à chambre (NALGE, Nunc, Rochester, NY, USA) et fixées et perméabilisées avec un mélange méthanol/ acétone (2V/ 1V) pendant 10 min à -20°C. Après humidification dans du PBS contenant 1% de sérum albumine bovine (BSA) pendant 30 min, les échantillons sont incubés avec le premier anticorps à température ambiante pendant 45 min dans du PBS contenant 0,5% de BSA. Le sérum de souris normale et l'anti-sérum dirigé contre RH I I61-335 est utilisé à une dilution de l/20ème ; l'anticorps monoclonal IgG2a anti-histone 1 (SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGIES, USA) et un anticorps-contrôle qui correspond à ce type d'isotype sont utilisés à une concentration de l/50ème. Après 3 lavages dans du PBS, les échantillons sont colorés avec un anticorps de chèvre IgG anti-souris conjugué à du FITC (fluorescéine isothiocyanate) (SIGMA). Après plusieurs lavages, les échantillons sont incubés 3 min dans du PBS contenant 0,5 μg/ml d'iodure de propidium puis examinés par microscopie de fluorescence.
10. Fractionnement sub -cellulaire :
Le fractionnement sub-cellulaire est préparé tel que décrit dans Li-Ru et al. (1999). Brièvement, pour la préparation des lysats cellulaires totaux, les cellules sont lysées dans un tampon contenant 10 mM Tris-HCl pH 7, 1, 1 mM EDTA, 1% triton X-100, 1 mM PMSF, 1 mM Na3VO4, 10 μM E-64 (Trans-Epoxy-Succinylt-L-Leucylamido-(4-guanidino)-butane), 1 μg/ml de pepstatine et 0, 1% d'aprotinine. Pour la préparation des fractions nucléaires, les culots cellulaires sont incubés dans un tampon hypotonique (20 mM HEPES pH 7,4, 1 mM MgCb, 10 mM KC1, 0,5% Nonidet P40, 0,5 mM dithiotréitol (DTT), 1 mM PMSF, 1 mM Na3Vθ4, 10 μM E64, 1 μg/ml pepstatine, 0, 1 % aprotinine à 4°C pendant 30 min. Après centrification, les culots résultant contenant les noyaux sont resuspendus dans un tampon à haute force ionique (1 mM HEPES, pH7,4, 20% glycérol, 0,4 M NaCl, 1 mM MgCb, 10 mM KC1, 0,5 mM DTT, 1 mM PMSF, 1 mM Na3VO4, 10 μM E64, 1 μg/ml pepstatine, 10 μg/ml leupeptine, 0, 1 % aprotinine. La qualité du fractionnement est contrôlée par Western-blotting en utilisant des anticorps monoclonaux dirigés contre ltristone 1 (SANTA-CRUZ BIOTECHNOLOGY) (protéine nucléaire) et dirigée contre la protéine de Golgi 58K (SIGMA) (protéine cytoplasmique). 11. Analyse par Western-blotting :
Les lysats cellulaires sont mélangés avec un tampon de dépôt 2 X SDS incubés à 100°C pendant 5 min puis séparés par électrophorèse sur un gel polyacrylamide SDS-PAGE à 15% et enfin transférés sur une membrane de nitrocellulose (Hybond-C-Amersham). Les membranes sont saturées avec du PBS (phosphate Buffered Saline) contenant 5% de lait non gras pendant 1 heure à température ambiante, suivie par une incubation de l'anticorps primaire (dilution l/ 100ème pour l'anticorps anti-histone 1 ; dilution l/ 1000ème pour l'anticorps anti-Golgi 58 K) à 4°C pendant la nuit. Après des lavages avec du PBS 0, 1% Tween-20, les membranes sont incubées avec un second anticorps conjugué à la péroxydase de raifort (1/ 1000) (SIGMA) à température ambiante pendant 1 heure. Les bandes transférées sur les membranes sont détectées par incubation avec un réactif de chemiluminescence augmentée (ECL) (Amersham) et exposées à un film KODAK XOMAT.
12. Immunoprécipitation :
500 μg de chaque extrait cellulaire sont radiomarqués avec 500 μCi d'iode 125I, en utilisant la méthode à la chloramine T. 3 x 106 CPM d'extraits cellulaires sont pré-traités pendant 2 heures avec un sérum de souris normale et 50 μl de protéine G sépharose (PHARMACIA) dans un tampon TNSTEN (50 mM Tris-HCl pH8,2, 0,5 M NaCl, 0,1% SDS, 0,5%
Triton X100, 5 mM EDTA, 0,02 % NaN3, avec 0, 1% d'aprotinine). Les immunoprécipitations sont réalisées en ajoutant 20 μg d'immunoglobulines purifiées à partir du sérum anti-RH 1161-335 ou de sérum normal et 50 μl de protéine G sépharose. Après une incubation sur la nuit à 4°C, les billes de sépharose sont lavées 10 fois avec un tampon TNSTEN et ensuite resuspendues puis bouillies dans un tampon de dépôt SDS-PAGE 2X concentré. Les protéines sont séparées sur un gel SDS PAGE à 8% puis analysées par autoradiographie. 13. Transfection de l'ADN :
Tous les plasmides utilisés sont préparés en utilisant des matériaux dépourvus d'endotoxine (« EndoFree™ », Giga Kit, QIAGEN). Pour l'expression transitoire dans les cellules HeLa-CD4+, un fragment Xhol- BamHI comprenant l'ADNc RH116 est sous-cloné dans un vecteur d'expression de mammifère pEGFP-Nl (CLONTECH). La construction chimérique résultante consiste en une protéine RH 116 pleine longueur fusionnée à l'extrémité carboxy-terminale de la protéine de fluorescence verte (GFP). La fusion dans un cadre correct de lecture de l'ADNc est contrôlée par séquençage. La séquence codante d'une protéine quelconque telle SSA (disponible dans le laboratoire des inventeurs) a été sous-clonée dans le vecteur pEGFP-Nl (GFP-SSA) et utilisées comme contrôle. Pour le contrôle positif, les inventeurs ont étudié les effets d'une expression transitoire de Tat clone dans pCR3 tel que précédemment décrit (Billaut- Mulot et al, 2001) ; le pCR3 natif constitue le contrôle correspondant. La transfection est réalisée en utilisant Effectene (QIAGEN) comme réactif de transfection et utilisé selon le protocole du fabricant. Brièvement, la veille de la transfection, 2 X 105 cellules sont ensemencées par puits dans des plaques de 12 puits et sont subséquemment transfectées en utilisant 1 μg d'ADN et 10 μl d'Effectene dans des expériences en triplicata. Les cellules sont infectées par le VIH- ILAI 24 heures après la transfection.
14. Infections in vitro :
La souche de cellules T présentant un tropisme pour le VIH- ILAI est obtenue à partir du Laboratoire de Virologie Centrale de Lille, France. Pour infecter des cellules transfectées, 5 X 104 CPM d'activité reverse- transcriptase virale (RT) sont ajoutés dans chaque puits. Les cellules sont incubées sur la nuit à 37°C. Les virus sont ensuite retirés et les cellules sont lavées 2 fois et un milieu frais est ajouté. 1 jour après l'infection et pendant les 4 jours suivants, les surnageants sont collectés dans chacun des puits et les cellules sont récupérées et comptées. La réplication virale est évaluée par la détection de l'ADN et de l'ARN du VIH- 1 , 24 heures après l'infection ou par la détection de la présence de la protéine p24 dans les surnageants entre 2 jours et 5 jours après l'infection.
15. Détection de l'ADN et de l'ARN du VIH-1 L'ADN cellulaire total est extrait des cellules infectées par le VIH- 1 24 heures après l'infection, puis soumis à 35 cycles d'amplification avec l'ADN polymérase « AmpliTaq Gold ». L'amplification PCR des séquences de β- actine est réalisée avec les oligonucléotides 5'-GGG TCA GAA GGA TTC CTA TG-3' (SEQ ID N°51) et 5'-GGT CTC AAA CAT GAT CTG GG-3' (SEQ ID N°52) pour standardiser l'équivalence entre les cellules. L'ADN proviral VIH- 1 de chaque échantillon est mesuré en utilisant l'amorce GAG06 (5'-GCI TTI AGC CCI GAA GTI ATA CCC ATG-3'; SEQ ID N° 53) et GAG04 (5'-CAT ICT ATT TGT TCI TGA AGG GTA CTA G-3'; SEQ ID N°54). Pour mesurer le taux d'ARN de VIH-1, l'ARN cellulaire total est extrait en utilisant le kit RNAplus (Q-BIOgene) et ensuite amplifié en utilisant la rTth polymérase (Applied Biosystems) en présence de la paire d'amorces GAG06-GAG04 pour détecter l'ARNm GAG-POL non épissé du VIH-1 et en présence de la paire d'amorces BSS (5'-GGC TTG CTG AIG NGC ICA CIG CAA GAG G-3' ; SEQ ID N°55)- KPNA (5'-AGA GTI GTG GTT GNT TCN TTC CAC ACA G-3' ; SEQ ID N°56) pour détecter la taille intermédiaire de l'ARN messager simplement épissé tel que précédemment décrit (Amiel et al, 1999). Tous les produits PCR sont séparés sur gel d'acrylamide et visualisés par une coloration au bromure d'éthidium. En utilisant des systèmes d'imagerie (Image Master ID Prime ; Amersham PHARMACIA BIOTECH), le changement d'expression de l'ADN VIH-1 et de l'ARN est déduit après normalisation par rapport aux contrôles standard internes correspondants (respectivement GAPDH ou β- actine). Brièvement, les taux d'ARN VIH sont normalisés au taux de β-actine en calculant le ratio du volume de la bande d'ARN du VIH sur celle de la β- actine. Ainsi, le taux d'augmentation de l'expression du VIH est déduit par comparaison des cellules transfectées par RH116, SSA ou Tat avec les cellules HeLa CD4+ transfectées par GFP ou pCR3. 16. Test p24
La réplication virale est évaluée en mesurant le taux d'antigène p24 dans les surnageants de culture en utilisant le kit d'essai d'antigène p24 de VIH- 1 (Coulter, Miami, USA) selon les instructions du fabricant.
17. Détection par ELISA des auto-anticorps dans les sera de patients VIH+ :
Pour évaluer la présence d'anticorps dirigés contre RH 116 dans les sera de patients VIH-1, un groupe de 32 sujets infectés par le VIH-1 ont été testés avant et après traitement avec des agents antirétroviraux potentiels. Le groupe était constitué de 8 femmes et de 24 hommes ayant une moyenne d'âge de 37 ans (gamme 25-64). Avant le début de la thérapie antirétrovirale, la charge virale plasmatique moyenne était de 421326 copies/ml et le nombre moyen (+ l'écart type) de cellules CD4+ était de 150 (+ 14) cellules/μl. Après une durée moyenne de traitement de 14 mois avec 2 inhibiteurs de reverse-transcriptase et un inhibiteur de protéase, la charge virale est tombée à un taux moyen de 3272 copies/ml et le nombre de cellules CD4+ a augmenté jusqu'à 313 (+ 23) cellules/μl. Les taux d'anticorps dans le sérum des patients sont comparés avec ceux présents dans le sérum de 40 contrôles sains de sexes et d'âges correspondants. La présence d'autoanticorps contre RH116 dans les sera a été recherchée par
ELISA. Brièvement, les plaques sont couvertes avec 1 μg/ml de RHI I61-335 dans du tampon de coating (30 mM Na2C03, 70 mM NaHCOβ) pendant 3 heures à 4°C. Après 3 lavages dans du PBS contenant 0,05% de Tween-20 (PBS-Tween), les plaques sont incubées pendant 2 heures avec des sera dilués de 1/300 jusqu'à 1/2700. Les plaques sont ensuite lavées et incubées sur la nuit à 4°C avec un anticorps IgG humain (SIGMA) conjugué à la péroxydase. Après 3 lavages avec du PBS-Tween et un lavage avec du PBS, les plaques sont développées pendant 30 minutes en utilisant 0,5 mg/ml d'un substrat au O-phénylène-diamine-dihydrochloride (SIGMA) et 0,1% H2O2 et la réaction est stoppée par l'addition de 50 μl/puits de HC1 IN. Les valeurs d'absorbance sont lues à 492 nm en utilisant un lecteur de microplaques automatiques (TITERTEK MULTISKAN, LABYSYSTEMS, Finlande). Des protocoles similaires sont utilisés pour évaluer la présence des anticorps antiRH116 dans les sera de souris immunisées, à l'exception que le conjugué utilisé est un anticorps antisouris à la place d'un anticorps antihumain IgG.
EXEMPLE 1 : Identification du gène RH 116 modulé par le murabutide par DD-RT-PCR.
Les échantillons d'ARN de PBMC non stimulé et de PBMC déplêté en CD8 stimulé par le murabutide et obtenu à partir d'un patient VIH-1 sont analysés par DD-RT-PCR. Les inventeurs ont sélectionné plus de 130 fragments d'ADNc différentiellement exprimés après traitement des PBMC de patient VIH+ au murabutide. Ces fragments ont été sous-clonés dans le vecteur Pcr2.1 (Invitrogen), puis séquences par séquençage automatique (ABI Prism 377, Perkin-Elmer). Les séquences ont été analysées pour les recherches d'homologie en utilisant les banques de données et le serveur Basic Local Alignment Search Tool (Blast 2) du NCBI.
L'expression d'un certain nombre de gènes apparaît être régulée de manière positive ou négative après un traitement avec le murabutide pendant 6 ou 24 heures. Parmi ceux-ci, 3 gènes correspondent à des répétitions alu, 20 séquences correspondent avec des EST ou des séquences des banques de données génomiques, et 49 séquences sont des gènes bien caractérisés. Parmi les gènes régulés par le muramutide, 28 présentent une expression accrue et 21 ont leur expression inhibée. Le profil d'expression de 14 gènes régulés de manière positive et de 7 gènes régulés de manière négative, par le murabutide a été confirmé par RT-PCR ou par reverse Northern-Blot sous forme de « dot-blot » (données non montrées) sur des extraits d'ARN de PBMC dépiétés en CD8 obtenus à partir de 3 autres patients. La modulation de l'expression par le murabutide a également été vérifiée parmi les séquences identifiées par DD- RT-PCR qui correspondent à des EST ou les séquences génomiques des banques de données. Ainsi, 6 clones présentent une expression accrue : 4 clones (clones 1, 71, 87 et 99) suite à un traitement de 6 heures, 2 clones (clones 11 et 89) suite à un traitement de 24 heures. D'autre part, 4 séquences identifiées induisent une inhibition de l'expression : 2 clones (clones 7 et 10) suite à une exposition de 6 heures au murabutide et 2 clones (clones 62 et 96) suite à une exposition de 24 heures au murabutide. Le profil d'expression du nouveau gène régulé par le murabutide et correspondant au clone 10 a été étudié par RT PCR semi-quantitative et l'ADNc pleine longueur correspondant a été clone et caractérisé.
EXEMPLE 2 : Clonage pleine longueur du gène RH116 modulé par le murabutide.
La séquence d'ADN pleine longueur correspondant au clone 10 a été obtenue stratégie 5' et 3' RACE. En se basant sur les fragments d'ADNc obtenus par DDRT PCR, un premier cycle de RACE 5' et de RACE 3' a permis aux inventeurs de caractériser l'extrémité polyA+ de ce nouveau gène et d'étendre la séquence d'ADNc dans la partie 5' du gène. L'extrémité 5' complète de l'ADNc a été obtenue suite à 3 étapes de 5' RACE. Le criblage d'une librairie d'ADNc a permis aux inventeurs de confirmer la séquence d'ADNc pleine longueur. La séquence nucléotidique complète a été obtenue en déterminant les séquences chevauchantes de 2 clones différents. La séquence d'ADNc pleine longueur a été soumise à GeneBank (N° d'accession AY 017378).
Plus précisément, à partir d'un fragment long de 164pb (SEQ ID N°3) obtenu par du DD-RT-PCR, les inventeurs ont synthétisé deux amorces spécifiques dont FI: 5' TGA TGA GGG TGG TGA TGA TGA GTA TTG TG 3' (SEQ ID N°4) afin de réaliser une première amplification par le 5' et 3' RACE. Les inventeurs ont ainsi pu obtenir un fragment de 1284pb grâce à l'amplification à partir de FI. Ce fragment a été séquence en plusieurs étapes grâce aux amorces internes spécifiques F2 (5' -GCA GTG AGT TCA AAC CCA TGA CAC AGA ATG -3') (SEQ ID N°5) et R2 : (5'- CAG CAT TCT GAA TAG TCA AGA TTG GGA AAT G -3') (SEQ ID N°6) ; la séquence de ce fragment correspond à la séquence SEQ ID N°7. Celle-ci présente un cadre de lecture ouvert de 380 acides aminés jusqu'à un codon Stop potentiel lequel est suivi après 119pb par une queue poly A+ (figure N° l).
Afin d'obtenir la partie 5' de l'ADNc, les inventeurs ont synthétisé une amorce R3 (SEQ ID N°8) qui correspond à la séquence complémentaire de FI ; l'amorce R3 a permis après PCR d'obtenir une séquence de 194pb (symbolisé en pointillé .... dans la figure 2A).
A partir de cette séquence les inventeurs ont synthétisé une nouvelle amorce R8 (SEQ ID N°9): 5'-GTA GGG CCT CAT TGT ACT TCC TCA AAT-3') afin de déterminer la séquence en position 5' de l'ADNc : une réaction de PCR a permis d'obtenir un fragment d'environ 1200 pb (symbolisé en tiret — — dans la figure 2a) (SEQ ID N°10). Le séquençage complet du fragment a été réalisé en plusieurs étapes grâce à des oligonucléotides internes R8-seq 1 (5 'CTC CAA CAC CAG GTG AAG CTG 3') (SEQ ID N° l l) et R8-seq 2 (5' CAG ATG AAG AGA ATG TGG CAG 3') (SEQ ID N° 12). Le cadre de lecture reste ouvert et permet d'identifier un cadre de lecture de 853aa.
A partir de ces deux séquences les inventeurs ont synthétisé deux amorces HELI 1 (5*- GGA AGT ACA ATG AGG GCC TAC AAA-3') (SEQ ID N° 13) et HELI 2 (5'-tcc tca gTc cta gta tat tgc tcc-3') (SEQ ID N° 14), respectivement prises sur le fragment FI et R3, afin de réaliser des RT-PCR pour l'analyse de l'expression différentielle de l'ARNm correspondant (Voir exemple N°4)
A partir de la séquence SEQ ID N° 10, les inventeurs ont synthétisé une nouvelle amorce R16 (5'-CTA AGC AGC TGA CAC TTC CTT CTG CCA AAC TTG TGT CTG -3') (SEQ ID N° 15) afin de remonter en 5' de l'ADNc ; une réaction de PCR a permis d'obtenir un fragment de 964pb (symbolisé en pointillé ( ), figure 2b).
L'extrémité 5' de 964 pb obtenue après la réaction de PCR (5'RACE) contient un codon ATG potentiel qui est précédé d'un codon STOP dont la présence sera confirmé ultérieurement. Cette stratégie a donc permis aux inventeurs d'obtenir un cadre de lecture ouvert (ORF open reading frame) de 1025 acides aminés. La séquence complète de l'ADNc correspondant à RH116 est maintenant de 3372pb et correspond à la SEQ ID N° l et code pour une protéine de 1025 aa qui correspond à la SEQ ID N°2.
Une stratégie de PCR à l'aide de deux amorces F4: (5'-ggg ccc tgt gga caa cet cgt cat tgt-3') (SEQ ID N° 16) et R14: (5'-CCA GAG TGG CTG TTT ACA TTG CCA AGG ATC ACT-3') (SEQ ID N° 17) spécifiques de la séquence SEQ ID N° l a été développée afin de confimer la présence du codon d'initiation de la traduction ATG ainsi que la présence du codon STOP (TGA) en amont de celui-ci. Pour cela les inventeurs ont réalisé une PCR sur une matrice 5' RACE à l'aide des deux amorces citées précédemment, et ont obtenu un fragment de taille expectée, qui a été clone et séquence. La séquence de ce fragment a confirmé la présence du codon TGA avant le codon ATG initiateur confirmant ainsi que les inventeurs possèdent la copie complète de l'ADNc. La séquence ADNc (3 372 paires de bases) contient un codon d'initiation en position 155 et un cadre ouvert de lecture (ORF) de 3 075 paires de bases ainsi qu'une région 3' non transcrite de 141 paires de bases avec un signal de polyadénylation consensus AATAAAA situé 24 paires de bases en amont d'une queue polyA+ de 21 paires de bases. L'ORF code pour un polypeptide de 1 025 acides aminés (FIG. 2B) avec une masse moléculaire calculée de 116 kdaltons et un point isoélectrique de 5,2.
EXEMPLE 3 : Etude de comparaison de la séquence pleine longueur de RH 116 avec les séquences des bases de données . Les inventeurs ont comparé la séquence en acides aminés déduite de
1025 acides aminés avec les séquences présentes dans les banques de données.
Les inventeurs ont identifié dans cette séquence des domaines conservés appartenant à la superfamille des helicases à ARN et plus précisément de la famille des protéines connues pour avoir des fonctions dnélicase à ARN dépendantes de l'ATP. Parmi les classes dliélicases basées sur cette homologie de séquence (Luking et al, 1998) sont présentes les protéines appelées « DEAD-BOX ». Une caractéristique importante de toutes les helicases à ARN « DEAD-BOX » est la présence de motifs caractéristiques espacés les uns des autres par une distance conservée (Luking et al, 1998 ; Linder et Daugeron, 2000). Malgré des différences mineures, ces motifs sont présents dans la nouvelle séquence clonée (FIG. 3 A et 3B). De ce fait, les inventeurs considèrent que cette protéine, appelée RH 116 (pour RNA hélicase 116 kdaltons), constitue un membre de la sous- famille des protéines « DEAD-BOX » des ARN-hélicases dépendantes de l'ATP. Les inventeurs égalemer^T)ont noté la présence d'un motif KKKK à la position 349 amino-acides mais aucun motif bi-partite de signal de localisation nucléaire A n'a pu clairement être identifié. 8 sites de N- glycosylation ont été détectés et des sites potentiels de phosphorisation ont été trouvés pour la kinase cAMP dépendante ainsi que la protéine kinase C ; la signification biologique de ces sites n'a pas été étudiée. Au cours des recherches effectuées dans les banques de données, les inventeurs ont noté que la protéine RH 116 présentait, en dehors de son homologie de séquence générale avec les membres de la famille des protéines « DEAD-BOX » un fort % d'homologie avec une hélicase à ARN humaine hypothétique et jusqu'à présent non caractérisée, appelée « RIG- 1 » (FIG. 3b C) décrite par Sun, Y.W (Genbank, numéro d'accession : AF038963). L'alignement des séquences est présenté en figure 3b C. L'identité totale de séquence en amino-acides entre les deux protéines est de 31% et la similarité qui inclut des échanges conservatifs est de 44%.
L'interrogation de différentes banques de données a permis aux inventeurs de retrouver des parties de la séquence nucléotidique dans d'autres clones génomiques différents. Une partie de la séquence est retrouvée dans le clone NH0576116 enregistré sous le numéro d'accession gb/AC007750, la seconde partie est retrouvée dans le clone génomique RP11-214A4 enregistré sous le n°AC108176. Il convient également de citer les EST (expressed séquences tags) enregistrées sous les numéros d'accès AW 589567, AW 152541 et AW 189584 dans la banque de données EMBL qui présentent respectivement 100%, 99%, 97% d'homologie avec respectivement les fragments de séquence 2879-3350, 2870-3350, 2818- 3350 de la séquence SEQ ID N° l.
EXEMPLE 4 : Etude par Northern blotting de l'expression de l'ARNm de RH 116 dans différents tissus.
Des ARN de polyA+ de différents tissus ont été testés par Northern-Blot en utilisant des oligonucléotides marqués à leur extrémité et dérivés de la séquence en ADNc de RH 116 ; la séquence nucléotidique 5'- GCA TCT GCA ATG GCA AAC TTC TTG CAT GGC-3' (SEQ ID N° 18) et la séquence nucléotidique 5'- CGT GCT GAT TCC TCA GTC CTA GTA TAT TGC-3' (SEQ ID N° 26) spécifique de la séquence codante a été synthétisée et marquée au 32p (φ4 Polynucléotide Kinase, Amersham) afin de servir de sonde pour réaliser un Northern blotting. L'hybridation d'une membrane contenant 2μg d'ARN poly A+ (Clontech) a révélé le résultat présenté à la figure 4. Un signal spécifique correspondant à un ARN messager d'une taille estimée à environ 3,5 kb a été détecté indiquant que la séquence d'ADNc isolée était une séquence pleine longueur (figure N°4). Le taux d'expression de l'ARN messager dans 12 tissus humains (cerveau, cœur, muscle squelettique, côlon, thymus, rate, rein, foie, intestin grêle, placenta, poumon, leucocytes du sang périphérique) a été étudié. L'intensité du signal radioactif est légèrement réduite dans le cerveau, le côlon, le thymus, l'intestin grêle et dans les leucocytes du sang périphérique et un signal radioactif très intense est présent dans le cœur et les reins.
EXEMPLE 5 : Etude par RT PCR de l'expression différentielle de RH 116 dans les PBMCs de patients VIH+ et de contrôles sains après traitement ou sans traitement par le murabutide.
L'expression de l'ARN messager de RH 116 est inhibée par le murabutide. Les inventeurs ont en outre étudié si l'ARN messager RH 116 était un nouveau gène modulé par le murabutide en utilisant la RT PCR semi-quantitative utilisant des oligonucléotides spécifiques dérivés de l'ADNc de RH 116. Des PBMC de patients (P) infectés par le VIH ou de donneurs sains contrôles (C) sont isolées, déplétées en lymphocytes CD8+ (Dynabeads, Dynal) et stimulées par la phytohémagglutinine PHA (5μg/ml) pendant 3 jours. Puis, les cellules sont traitées ou non par le Murabutide (lOμg/ml) en présence d'interleukine 2 (IL2) (lOU/ml) dans un milieu RPMI supplémenté par 10 % de sérum de veau fœtal (SVF) pendant 6 heures ou 24 heures à raison de 5.106 cellules minimum par condition. Après traitement, l'ARN des cellules est extrait (RNAplus, Quantum-bioprobe) puis traité à la DNase (Boerhinger) et retrotranscrit (RT) à l'aide d'un oligo(dT) en présence de la reverse transcriptase Mu-MLV (Superscript II, Gibco). La qualité des RT est vérifiée par PCR (25 cycles) à l'aide d'amorces spécifiques de la GAPDH (5'GCC ATC AAT GAC CCC TTC ATT GAC 3') (SEQ ID N° 19) et (5' TGA CGA ACA TGG GGG CAT CAG CAG 3') (SEQ ID N°20) à partir de 20, 100 et 500ng d'ARN total. Puis, les inventeurs ont réalisé les RT-PCR (35cycles) à l'aide d'amorces spécifiques Héli 1 et Héli 2 du nouveau polypeptide RH116 (5' GGA AGT ACA ATG AGG GCC TAC AAA 3') (SEQ ID N° 13) et 5' TCC TCA GTC CTA GTA TAT TGC TCC 3' ) (SEQ ID N° 14). Le nombre de cycles d'amplification a été mis au point au préalable (35 cycles). Les fragments amplifiés sont visualisés sur gel d'agarose (1%) en présence de bromure d'éthidium, puis quantifiés grâce au programme Imager master (Pharmacia). Pour chaque dilution, la valeur donnée pour le gène étudié est rapportée à celle de la GAPDH (Rapport≈R). Pour chaque patient et chaque temps (6h ou 24h), le R des cellules traitées au Murabutide est rapporté à celui des cellules non traitées. Les résultats sont alors exprimés en % d'augmentation ou d'inhibition de l'expression du gène par rapport au cellules non traitées. Il est à noter que, pour chaque dilution testée, le R peut varier faiblement, la moyenne des R a été effectuée en prenant soin d'être toujours dans la phase linéaire d'amplification.
Cette étude a été menée sur 12 patients et 10 contrôles sains. L'étude sur les patients montrent une inhibition significative de l'expression du gène du RH 116 après un traitement de 6 ou 24 h au Murabutide par rapport au cellules non traitées. D'autre part, l'étude réalisée sur des PBMCs de donneurs sains révèlent une augmentation très significative de l'expression du gène de RH116 notamment après 6 heures de traitement au Murabutide.
La figure 5 représente les résultats de RT-PCR obtenus sur les PBMCs de patients après 6 et 24 heures de traitement.
Une RT PCR représentative réalisée sur des PBMC dépiétés en CD8 obtenue à partir de patients infectés par le VIH-1 est présentée FIG. 5A et montre une inhibition significative de l'expression de l'ARN messager suite à un traitement de 6 ou 24 heures avec le murabutide. Les résultats présentés dans la figure 5B présentent un pourcentage moyen d'inhibition de l'expression de l'ARN messager de RH 116 et démontrent que le traitement avec le murabutide des PBMC dépiétés en CD8 de 5 patients induit une inhibition importante de l'expression de l'ARN messager de RH 116 avec une inhibition moyenne maximale (90%) observée dans le patient N° 5 suite à 6 heures de traitement par le murabutide, et cet effet peut être maintenu après 24 heures, la moyenne maximum d'inhibition (57%) étant observée chez le patient N°3.
EXEMPLE 6 : Expression de la protéine recombinante en système bactérien E. coli (pQE)
Une PCR a été réalisée sur de l'ADNc de rate à partir d'amorces nucléotidiques correspondant à l'ATG: Heli ATG: (5'- TGA GAG GAT CCG ATG TCG AAT GGG TAT TCC 3') (SEQ ID N°21) et au STOP (5'-AAT GTC GAC CTA ATC CTC ATC ACT AAA TAA -3') (SEQ ID N°22).
Le fragment a été clone dans le vecteur pQE80 (Qiagen) digéré par les enzymes de restriction BamHI/Sal I .
Après transformation de bactéries TOP 10F', l'expression de la protéine recombinante est induite par l'IPTG, le temps d'expression a été optimisé et estimé à deux heures, en effet après 5 heures d'induction les inventeurs ne détectent pas de protéine recombinante. La protéine est faiblement exprimée (environ 500μg pour 500 ml de culture) et se présente sous forme soluble.
EXEMPLE 7 : Expression de la protéine recombinante en système eucaryote.
La protéine "RH116" étant exprimée dans le cytoplasme ou dans le noyau de cellules de mammifères les inventeurs ont développé une stratégie de surexpression de la protéine recombinante dans des cellules eucaryotes afin d'apprécier son rôle dans la régulation du VIH. Pour cela, la copie complète de l'ADNc a été amplifiée à partir des amorces heli-GFP-ATG (Xho I) (5'-TGA GAG CTC GAG ATG TCG AAT GGG TAT TCC ACA GAC -3') (SEQ ID N°23) et Heli-GFP (Bam HI) (5'- TGT TTA TTT AGT GAT GAG GAT CGG GAT CCG ATT GAA-3') (SEQ ID N°24) ; le fragment amplifié est clone dans le vecteur pEGFP digéré par Xho I/Bam HI puis séquence. Le cDNA codant pour la "Green Fluorescent Protein" (GFP) est situé en 3' de l'insert clone.
D'autre part, la copie complète de l'ADNc a été amplifiée à partir des amorces Heli ATG Bam (5'- TGA GAG GATCCG ATG TCG AAT GGG TAT TCC -3') (SEQ ID N°21) et Heli STOP Xhol (5'-ttc aat ctc gag atc ctc atc act aaa taa aga -3')(SEQ ID N°25) ; le fragment amplifié est clone dans le vecteur pcDNA6 digéré par Bam HI /Xho I. Dans ce système la protéine est fusionnée à 6 Histidines et à une protéine V5 contre laquelle des anticorps monoclonaux sont disponibles.
EXEMPLE 8 : Transfection en cellules eucaryotes.
Des expériences de transfection ont été réalisées dans les cellules cos-7 et cellules Hela à l'aide des plasmides recombinants pEGFP et pcDNA6 contenant la séquence complète du polypeptide RH 116 tels que décrits dans l'exemple 5. Les transfections ont été réalisées (Effectene-Qiagen) avec lμg de plasmide recombinant et lOμl d'Effectene. Une analyse en RT-PCR a permis de confirmer la surexpression de l'ARNm codant pour le polypeptide RH116. L'expression des protéines recombinantes fusionnées a été vérifiée par cytofluorométrie (fusion avec la GFP) ou en western blotting (fusion avec V5-HIS6).
EXEMPLE 9 : Caractérisation moléculaire de l'ADNc codant pour la protéine RH 116.
La caractérisation moléculaire de la protéine RH 116 native a été réalisée en utilisant des immunoglobulines purifiées à partir de sérum de souris dirigé contre la protéine RH 116i-335 recombinante partielle. Le marquage cellulaire et l'immuno-précipitation génèrent un produit protéique de 130 à 140 kdaltons en accord avec la masse moléculaire calculée de la protéine codée qui doit être hautement glycosylée. La protéine RH 116 est immuno-précipitée dans les lysats cellulaires totaux obtenus à partir de cellules U937 et dans des fractions enrichies en extraits nucléaires (FIG. 6A). Des résultats similaires sont obtenus sur des cellules HeLa (données non montrées). La figure 6B présente le contrôle de qualité de fractionnements sous-cellulaires et montre des extraits nucléaires enrichis qui présentent une expression accrue d istone 1 (34 kdaltons) que dans l'extrait total et une expression moindre de protéines cytoplasmiques (60 kdaltons et 40 kdaltons environ).
EXEMPLE 10 : Etude d'immunolocalisation de la protéine RH 116.
Pour examiner la location cellulaire de la protéine RH 116 native, les inventeurs ont réalisé des expériences d'immunocytochimie sur des cultures en monocouches de cellules HeLa-CD4+ (FIG. 7). Un anticorps souris dirigé contre la protéine RH 1161-335 colore intensément le cytoplasme des cellules HeLa-CD4+ (FIG. 7C). Un sérum de souris normale est utilisé comme contrôle négatif (FIG. 7A) et une coloration nucléaire est observée en utilisant un anticorps monoclonal anti-histone 1 (FIG. 7B). La localisation de la protéine RH 116 est également confirmée par des études d'immunolocalisation de cellules U937 (données non publiées). D'autre part, la localisation intracellulaire de la protéine RH 116 dans les cellules HeLa-CD4+ transfectées par une construction d'ADNc chimérique codant pour la protéine RH 116 pleine longueur fusionnée à une extrémité carboxyterminale de la GFP (GFP-RH 116) est différente. De fait, le marquage de la protéine GFP-RH 116 exprimée dans les cellules HeLa- CD4+ transfectées montre une localisation cytoplasmique et nucléaire (données non montrées). Cette dernière observation est plus consistante que les analyses d'immunoprécipitation et l'activité putative de membres de la sous-famille des protéines « DEAD-BOX » des ARN helicases.
EXEMPLE 11 : RH 116 augmente l'expression de la protéine virale P24.
Dans un but d'élucider le rôle putatif de la protéine RH 116, dont l'expression est inhibée par l'activité « inhibiteur du VIH » du murabutide, les inventeurs ont cherché à déterminer si RH 116 pouvait jouer un rôle dans la régulation de l'expression du virus. Ainsi, les inventeurs ont entamé une étude de l'expression de P24 par les cellules HeLa-CD4+ transfectées par la protéine GFP-RH 116 et infectées 24 heures plus tard par le virus
L'examen microscopique d'une culture à différents moments et l'analyse par la coloration au bleu trypan a révélé que l'infection de cellules transfectées par la GFP-RH 116 affecte la viabilité des cellules comparées à celle des cellules transfectées par la GFP ou des cellules GFP-SSA (une protéine sans rapport). Ainsi, les inventeurs ont normalisé les taux d'antigène P24 pour 5 x 105 cellules. L'étude de l'expression de la protéine virale P24 dans les surnageants de cellules HeLa-CD4+ exprimant la GFP, ou la GFP-RH 116, ou la GFP-SSA, a été réalisée au cours de 5 expériences indépendantes. L'étude de l'expression de la protéine virale P24 dans les surnageants de cellules HeLa-Cd4+ transformées par pCR3 et par pCR3-Tat a été réalisée dans 3 expériences indépendantes. Les figures 8A et 8B présentent des résultats obtenus. La figure 8A montre que l'expression de l'antigène P24 viral (en nanogrammes/ml ± la déviation standard) dans les surnageants de cellules HeLa-CD4+ transfectés par la GFP-RH 116 est dramatiquement inhibée au jour 3 (12,1 ±1,48 ng/ml) jusqu'au jour 5 (9 770 ± 648 ng/ml) comparés aux cellules exprimant la GFP (2,65 ± 0,5 ng/ml et 690 ± 272 ng/ml respectivement aux jours 3 et 5).
Le taux d'antigène P24 dans le surnageant des cellules transfectées par pCR3-Tat est présenté dans la figure 8B (en nanogrammes/ml + la déviation standard). Comme attendu, les résultats montrent une augmentation importante de la libération de P24 par les cellules transfectées par Tat à partir du jour 2 (2,2 ±0,18 ng/ml) jusqu'au jour 5 (2,994 ± 391 ng/ml) comparé avec les cellules transfectées par pCR3 au jour 2 (1 ±0,08 ng/ml) et au jour (74 ±22 ng/ml). La figure 8C présente le nombre de fois d'augmentation obtenu dans 3 ou 5 expériences indépendantes. Ces résultats indiquent clairement qu'une surexpression de la GFP-RH 116 induit une augmentation importante de P24 à partir du jour 2 (3,43 ± 0,17) jusqu'au jour 5 (18,2 ±10) comparé à la surexpression de la GFP-SSA (jour 2 : 1, 18 ±0,25 ; jour 5 : 1,35 ±0,37) et une augmentation équivalente est obtenue avec une surexpression de la TAT (jour 2 : 3,0 ±8,42 ; jour 5 : 18,7 + 4,2).
EXEMPLE 12 : La protéine RH 116 régule l'expression de l'ARNm P24 viral.
Pour déterminer le mécanisme de l'augmentation de l'expression de P24 en réponse à une surexpression de RH 116, les inventeurs ont isolé l'ARN total de cellules HeLa-CD4+ transfectées et infectées puis ont déterminé le taux d'ARN messager non épissé, simplement épissé ou de taille intermédiaire, par RT PCR semi-quantitative. Le nombre de fois d'augmentation d'expression d'ARN messager du VIH est obtenu dans 3 expériences séparées (moyenne + l'écart type) (données non présentées). Tout d'abord, les cellules transfectées par la GFP-RH 116 présentent un taux plus élevé d'ARN non épissé que les cellules transfectées par la GFP- SSA comparé aux cellules transfectées par la GFP seule (respectivement 3, 14 + 1,5 et 0,81 + 0,12). Les ARNm de VIH-1 de taille intermédiaire ou simplement épissés sont également augmentés dans les cellules transfectées par la GFP-RH 116 (2,81 + 0,73) comparé aux cellules transfectées par la GFP-SSA (0,91 + 0, 14).
En ce qui concerne la surexpression de Tat, des résultats sont obtenus à partir de deux expériences indépendantes ; le taux d'ARN messager non épissé et de taille intermédiaire ou simplement épissé est respectivement de 4,75 ±1,25 et de 4,18 ±0,31. Une analyse de RT PCR obtenue 3 jours après l'infection est présentée dans la figure 9. La figure 9A indique que la surexpression des ARNm de RH 116, SSA ou TAT est dans les cellules transfectées de manière transitoire. La figure 9B illustre l'augmentation des ARNm non épissés, ou de taille intermédiaire, ou simplement épissés des protéines surexprimées RH 116 (à droite) et TAT (à gauche) . L'étude de la formation de l'ADN proviral (figure 8C) révèle qu'il n'y a pas de différence significative dans aucune des cellules transfectées. Ces résultats suggèrent que la régulation de l'expression du VIH par RH 116 est réalisée au niveau transcriptionnel ou post-transcriptionnel.
EXEMPLE 13 : La protéine RH 116 constitue un auto-antigène chez les patients infectés par le VIH- 1.
La question de savoir si RH 116 peut être un auto-antigène a été étudiée par analyse ELISA en utilisant des sera obtenus à partir de donneurs sains et de ceux obtenus à partir de patients VIH-1 testés avant et après un traitement anti-rétroviral. Les résultats présentés à la figure 10 démontrent de manière significative une augmentation des taux d'auto- anticorps dans les sera de patients comparés avec ceux de contrôle sain. De plus, les taux élevés d'auto-anticorps RH 116 observés dans les patients non traités VIH-1 sont toujours significatifs même après un traitement significatif avec des agents anti-rétroviraux efficaces. REFERENCES
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Claims

REVENDICATIONS
1. Polypeptide isolé dénommé RH116 de séquence d'acides aminés SEQ ID N°2.
2. Polypeptide isolé caractérisé en ce qu'il comprend un polypeptide choisi parmi : a) un polypeptide de séquence SEQ ID N°2 ; b) un polypeptide variant de polypeptide de séquences d'acides aminés défini en a) ; c) un polypeptide homologue au polypeptide défini en a) ou b) et comportant au moins 80 % d'identité avec ledit polypeptide de a) ; d) un fragment d'au moins 15 acides aminés consécutifs d'un polypeptide défini en a) ; e) un fragment biologiquement actif d'un polypeptide défini en a).
3. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 2 caractérisé en ce qu'il est comporte au moins un domaine conservé appartenant à la superfamille des helicases à ARN.
4. Polypeptide selon la revendication 3 caractérisé en ce que ledit domaine conservé est choisi parmi : - les séquences G-GKT correspondant au domaine I de la superfamille des helicases à ARN. - les séquences DEAD, DE-D, DEAH correspondant au domaine V de la superfamille des helicases à ARN.
5. Polynucléotide purifié ou isolé caractérisé en ce qu'il code pour un polypeptide selon la revendication 1.
6. Polynucléotide selon la revendication 5 de séquence SEQ ID N° l.
7. Polynucléotide isolé caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide choisi parmi : a) SEQ ID N° 1; b) la séquence d'un fragment d'au moins 15 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N° 1 à l'exception des séquences nucléiques enregistrées identifiées sous le numéro d'accès N°AC007750 et N°AC0108176 dans la banque de données GenBank et les séquences nucléiques enregistrées identifiées sous le numéro d'accès N°AW589567, N°AW 152541 et AW 189584 dans la banque de données EMBL ; c) une séquence nucléique présentant un pourcentage d'identité d'au moins 85 %, après alignement optimal avec une séquence définie en a) ou b) ; d) la séquence complémentaire ou la séquence d'ARN correspondant à une séquence telle que définie en a), b) ou c).
8. Utilisation d'un polynucléotide selon la revendication 7 en tant qu'amorce pour l'amplification ou la polymérisation de séquences nucléiques.
9. Utilisation in vitro d'un polynucléotide selon la revendication 7 en tant que sonde pour la détection de séquences nucléiques.
10. Utilisation in vitro d'un polynucléotide selon la revendication 7 en tant que séquence d'acide nucléique sens ou antisens pour contrôler l'expression du produit protéique correspondant.
11. Utilisation d'un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 8, 9, 10 caractérisé en ce que ledit polynucléotide est marqué directement ou indirectement par un composé radioactif ou un composé non radioactif.
12. Vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression comprenant un polynucléotide selon l'une des revendications 5 à 7 ou codant pour un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à
4.
13. Vecteur recombinant d'expression antisens comprenant un polynucléotide selon l'une des revendications 5 à 7 caractérisé en ce que ledit polynucléotide est inséré en orientation inverse dans ledit vecteur.
14. Cellule hôte, caractérisée en ce qu'elle est transformée par un vecteur selon l'une des revendications 12 et 13.
15. Animal, excepté l'homme, caractérisé en ce qu'il comprend une cellule selon la revendication 14.
16. Procédé de préparation d'un polypeptide recombinant caractérisé en ce que l'on cultive une cellule hôte selon la revendication 14 dans des conditions permettant l'expression et éventuellement la sécrétion dudit polypeptide recombinant et que l'on récupère ledit polypeptide recombinant.
17. Polypeptide recombinant obtenu par le procédé selon la revendication 16.
18. Anticorps monoclonal ou polyclonal et ses fragments caractérisé en ce qu'il lie sélectivement un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 4 ou 17.
19. Procédé de détection et/ou de dosage d'un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 4 ou 17, dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mise en contact de l'échantillon biologique avec un anticorps selon la revendication 18; b) mise en évidence du complexe antigène-anticorps formé.
20. Trousse de réactifs pour la mise en œuvre d'un procédé selon la revendication 19 dans un échantillon biologique par réaction immunologique, caractérisé en ce qu'elle comprend les éléments suivants : a) un anticorps monoclonal ou polyclonal selon la revendication 18; b) le cas échéant, les réactifs pour la constitution du milieu propice à la réaction immunologique ; c) les réactifs permettant la détection du complexe antigène- anticorps produit lors la réaction immunologique.
21. Procédé de détection et/ou de dosage d'un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 5 à 7 dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : a) isolement de l'ADN à partir de l'échantillon biologique à analyser, ou obtention d'un ADNc à partir de l'ARN de l'échantillon biologique ; b) amplification spécifique de l'ADN à l'aide d'amorces selon la revendication 8 ; c) analyse des produits d'amplification.
22. Procédé de détection et/ou de dosage d'un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 5 à 7 dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : a) Mise en contact d'un polynucléotide selon l'une des revendications 5 à 7 avec un échantillon biologique ; b) Détection et/ou dosage de l'hybride formé entre ledit polynucléotide et l'acide nucléique de l'échantillon biologique.
23. Puce à ADN caractérisée en ce qu'elle contient un polynucléotide selon l'une des revendications 5 à 7.
24. Puce à protéines caractérisée en ce qu'elle contient un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 4 ou 17, ou un anticorps selon la revendication 18.
25. Procédé de criblage d'un composé qui affecte le taux d'expression cellulaire et/ ou l'activité hélicase à ARN d'un polypeptide selon les revendications 1 à 4 ou 17 et qui comporte les étapes suivantes de: a) mise en contact d'une cellule choisie parmi la cellule hôte de la revendication 14 et une cellule eucaryote, de préférence humaine, exprimant ou contenant le polypeptide selon la revendication 1 à 4 ou 17, et d'un ou plusieurs composés potentiels susceptibles de pénétrer ou d'être introduits dans ladite cellule; b) détection et/ ou mesure du taux d'expression cellulaire et/ou de l'activité hélicase à ARN.
26. Procédé de criblage d'un composé qui affecte l'activité hélicase à ARN d'un polypeptide selon les revendications 1 à 4 ou 17 et qui comporte les étapes suivantes de: a) mise en contact dudit polypeptide et d'un ou plusieurs composé(s) potentiel(s) en présence de réactifs nécessaires à la mise en œuvre de l'activité hélicase à ARN; b) détection et/ou mesure de l'activité hélicase à ARN.
27. Procédé selon les revendications 25 et 26 caractérisé en ce que ledit composé criblé diminue le taux d'expression et/ ou l'activité hélicase à ARN du polypeptide selon les revendications 1 à 4 ou 17.
28. Composé obtenu par le procédé selon la revendication 27 caractérisé en ce qu'il est choisi parmi : a) un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 5 à 7 utilisé en tant que séquence d'acide nucléique antisens selon la revendication 10 ; b) un vecteur d'expression antisens selon la revendication 13 ; c) un anticorps selon la revendication 18 ; d) un antagoniste du polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 ou 17 ; e) les muramylpeptides.
29. Composé selon la revendication 28 caractérisé en ce que le muramylpeptide est le Murabutide.
30. Procédé selon les revendications 25 et 26 caractérisé en ce que ledit composé criblé augmente le taux d'expression et/ou l'activité hélicase à ARN du polypeptide selon les revendications 1 à 4 ou 17.
31. Composé agoniste du polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 ou 17 obtenu par le procédé selon la revendication 30.
32. Procédé de criblage de composés qui affectent l'activité fonctionnelle d'un polypeptide selon les revendications 1 à 4 ou 17 et qui comporte les étapes suivantes de: a) mise en contact dudit polypeptide et d'un ou plusieurs composê(s) potentiel(s) en présence de réactifs nécessaires à la mise en œuvre d'une réaction choisie parmi la réaction d'épissage de l'ARN nucléaire et/ou mitochondrial, de réaction d'édition de l'ARN, de réaction de maturation de l'ARNr, de réaction d'initiation de la traduction, de la réaction d'export des ARNm nucléaires vers le cytoplasme, et la réaction de dégradation des ARNm; b) détection et/ ou mesure de ladite réaction.
33. Composé caractérisé en ce qu'il est choisi parmi : a) un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 4 ou 17; b) un polynucléotide selon l'une des revendications 5 à 7 ; c) un vecteur selon la revendication 12 ou 13 ; d) une cellule selon la revendication 14 e) un anticorps selon la revendication 18 ; f) un composé selon l'une des revendications 28, 29 et 31 ; à titre de médicament.
34. Composé selon la revendication 33 à titre de médicament destiné à la prévention et/ ou au traitement de pathologie sélectionnée dans le groupe composé du cancer, des maladies infectieuses aiguës ou chroniques, des maladies génétiques héréditaires, des maladies immunes et auto-immunes, du rhumatisme, de l'arthrite, de l'arthérosclérose, de l'ostéoporose, des diabètes et à la prévention des rejets de greffes d'organes.
35. Composé selon la revendication 34 caractérisé en ce que ladite maladie infectieuse est sélectionnée parmi le SIDA ou l'hépatite C.
36. Utilisation d'un composé selon la revendication 33 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de pathologies virales.
37. Utilisation selon la revendication 36 caractérisé en ce que la pathologie virale est le syndrome d'immunodéficience acquise (SIDA).
38. Composition pharmaceutique pour le traitement préventif et curatif du SIDA caractérisée en ce qu'elle contient une quantité thérapeutiquement efficace d'un composé selon la revendication 33 et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
39. Produit comprenant au moins un composé selon la revendication 33 et au moins un autre agent antiviral comme produit de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps en thérapie an ti- virale, de préférence anti-VIH.
40. Utilisation selon la revendication 36 caractérisé en ce que la pathologie virale est l'hépatite B ou C .
41. Utilisation d'un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 5 à 7 et/ ou d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 et 17 et/ ou d'un agoniste d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 et 17 pour la préparation d'un médicament destiné à provoquer ou à augmenter la réponse immune à un vaccin chez un patient.
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