KR20210040948A - 단핵구 및 대식세포의 염증성 표현형을 조절하기 위한 조성물 및 방법, 그리고 이의 면역요법 용도 - Google Patents

단핵구 및 대식세포의 염증성 표현형을 조절하기 위한 조성물 및 방법, 그리고 이의 면역요법 용도 Download PDF

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타티아나 아이. 노보브란트세바
이고르 펠드만
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베르조 테라퓨틱스, 아이엔씨.
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Abstract

본 발명은 부분적으로, 단핵구 및 대식세포 염증성 표현형을 조절하기 위한 조성물 및 방법의 확인 및 이의 면역요법 용도에 기초한다.

Description

단핵구 및 대식세포의 염증성 표현형을 조절하기 위한 조성물 및 방법, 및 이의 면역요법 용도
관련 출원에 대한 상호 참조
이 출원은 2018년 6월 29일자로 출원된 미국 가출원 제62/692,463호, 2019년 2월 26일자로 출원된 미국 가출원 제62/810,683호, 2019년 6월 4일자로 출원된 미국 가출원 제62/857,199호 및 2019년 6월 27일자로 출원된 미국 가출원 제62/867,532호의 우선권을 주장하며; 상기 기초출원 각각의 전체 내용은 참조에 의해 그 전문이 본 명세서에 원용된다.
단핵구와 대식세포는 불리한 이물질, 박테리아 및 죽은 또는 죽어가는 세포를 섭취함으로써 신체를 보호하는 세포인 포식세포의 한 유형이다. 단핵구 및 대식세포 외에도, 포식세포는 호중구, 수지상 세포 및 비만 세포를 포함한다.
대식세포는 전형적으로 식균 작용으로 알려진 과정을 통해 신체를 순찰하고, 세포 찌꺼기 및 이물질, 예컨대 병원균, 미생물 및 암 세포를 삼켜 소화시키는 대형의 백혈구 세포로 알려져 있다. 또한, 조직 대식세포 및 순환하는 단핵구-유래 대식세포를 포함하는 대식세포는 선천성 및 후천성 면역 체계 둘 다의 중요한 매개체이다.
대식세포 표현형은 전형적 또는 대안적 경로(예를 들어, 문헌[Classen et al. (2009) Methods Mol. Biol. 531:29-43] 참조)를 통한 활성화에 의존한다. 전형적으로 활성화된 대식세포는 인터페론 감마(interferon gamma: IFNγ) 또는 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide: LPS)에 의해 활성화되며, M1 표현형을 나타낸다. 이러한 전-염증성 표현형은 면역 체계의 증가된 염증 및 자극과 관련이 있다. 대안적으로 활성화된 대식세포는 IL-4, IL-10 및 IL-13과 같은 사이토카인에 의해 활성화되며, M2 표현형을 나타낸다. 이러한 항-염증성 표현형은 면역 반응의 감소, 상처 치유의 증가, 조직 복구의 증가 및 배아의 발달과 관련이 있다.
비-병리적 조건하에서, 면역-자극 대식세포 및 면역-조절성 대식세포의 균형잡힌 집단이 면역 체계에 존재한다. 균형의 섭동(perturbation)은 다양한 질환 병태를 초래할 수 있다. 일부 암에서, 예를 들어, 종양은 상처-치유 경로를 활성화하고, 새로운 혈관의 성장(즉, 혈관신생)을 촉진하며, 종양에 영양분과 성장 신호를 제공하는 항-염증성의, 전-종양성 M2 표현형에 유리하게 대식세포 집단을 분극화시키는(polarize) 면역 인자(예를 들어, 사이토카인 및 인터류킨)를 분비한다. 이러한 M2 대식세포는 종양 관련 대식세포(tumor associated macrophage: TAM) 또는 종양 침윤 대식세포(tumor infiltrating macrophage)로 칭해진다. 종양 미세환경에서 TAM은 암 진행 및 전이의 중요한 조절인자(regulator)이다(문헌[Pollard (2004) Nat. Rev. Cancer 4:71-78]). 대식세포 유전자 표적(예를 들어, CSF1R 및 CCR2)을 저해하도록 설계된 소분자 및 단일클론 항체가 대식세포 표현형의 조절인자(modulator)로서 예컨대, 전-종양성 대식세포(예를 들어, TAM) 및 종양 형성을 저해할 수 있는 전-염증성 대식세포의 균형을 조절함으로써 조사되었다. 대식세포 집단의 균형을 조절하기 위해 단핵구 및 대식세포의 동원, 분극화, 활성화 및/또는 기능을 조절하는 요법은 대식세포 면역요법으로 지칭된다. 그러나, 대식세포 생물학 분야의 발전에도 불구하고, 대식세포 면역요법에 사용하기 위한 대식세포 및 작용제의 염증성 표현형을 조절하기 위한 새로운 표적(예를 들어, 유전자 및/또는 유전자 산물)이 여전히 필요하다.
본 발명은 적어도 부분적으로, 단핵구 및/또는 대식세포의 염증성 표현형이 본 명세서에 기재된 하나 이상의 바이오마커(예를 들어, 표 1, 표 2, 실시예 등에 열거된 표적)의 카피 수, 양 및/또는 활성을 조절함으로써 조절될 수 있다는 발견과 치료, 진단, 예후 예측 및 스크리닝 목적을 위한 이들 바이오마커 및/또는 조절성 작용제의 용도에 기초한다.
예를 들어, 일 양태에서, 적어도 하나의 작용제와 접촉한 후 증가된 염증성 표현형을 갖는 단핵구 및/또는 대식세포를 생성하는 방법으로서, 단핵구 및/또는 대식세포를 유효량의 적어도 하나의 작용제와 접촉시키는 단계를 포함하되, 적어도 하나의 작용제는 a) 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 하향조절하는 작용제 및/또는 b) 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 상향조절하는 작용제인, 증가된 염증성 표현형을 갖는 단핵구 및/또는 대식세포를 생성하는 방법이 제공된다.
본 발명의 임의의 양태에 적용될 수 있고/있거나 본 명세서에 기재된 임의의 다른 실시형태와 조합될 수 있는 다양한 실시형태가 더 제공된다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 증가된 염증성 표현형을 갖는 단핵구 및/또는 대식세포는 작용제 또는 작용제들과 접촉한 후 다음 중 하나 이상을 나타낸다: a) 분화 클러스터 80(CD80), CD86, MHCII, MHCI, 인터류킨 1-베타(IL-1β), IL-6, CCL3, CCL4, CXCL10, CXCL9, GM-CSF 및/또는 종양 괴사 인자 알파(TNF-α)의 증가된 발현 및/또는 분비; b) CD206, CD163, CD16, CD53, VSIG4, PSGL-1, TGFb 및/또는 IL-10의 감소된 발현 및/또는 분비; c) IL-1β, TNF-α, IL-12, IL-18, GM-CSF, CCL3, CCL4 및 IL-23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 사이토카인 또는 케모카인의 증가된 분비; d) IL-1β, IL-6 및/또는 TNF-α의 발현 대 IL-10의 발현의 증가된 비; e) 증가된 CD8+ 세포독성 T 세포 활성화; f) CD8+ 세포독성 T 세포 활성화의 증가된 동원; g) 증가된 CD4+ 헬퍼 T 세포 활성; h) CD4+ 헬퍼 T 세포 활성의 증가된 동원; i) 증가된 NK 세포 활성; j) NK 세포의 증가된 동원; k) 증가된 호중구 활성; l) 증가된 대식세포 활성; 및/또는 m) 현미경에 의해 평가된 바와 같이 증가된 방추형 형태, 외관의 편평함 및/또는 수상돌기의 수. 다른 실시형태에서, 작용제 또는 작용제들과 접촉시킨 단핵구 및/또는 대식세포는 세포의 집단에 포함되며, 작용제는 세포의 집단에서 제1형 및/또는 M1 대식세포의 수를 증가시키고/시키거나 제2형 및/또는 M2 대식세포의 수를 감소시킨다. 여전히 다른 실시형태에서, 작용제 또는 작용제들과 접촉시킨 단핵구 및/또는 대식세포는 세포의 집단에 포함되며, 작용제 또는 작용제들은 세포의 집단에서 하기 i) 내지 ii)의 비를 증가시킨다: i) 제1형 및/또는 M1 대식세포 및 ii) 제2형 및/또는 M2 대식세포.
다른 양태에서, 적어도 하나의 작용제와 접촉한 후 감소된 염증성 표현형을 갖는 단핵구 및/또는 대식세포를 생성하는 방법으로서, 단핵구 및/또는 대식세포를 유효량의 적어도 하나의 작용제와 접촉시키는 단계를 포함하되, 작용제는 a) 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 상향조절하는 작용제 및/또는 b) 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 하향조절하는 작용제인, 감소된 염증성 표현형을 갖는 단핵구 및/또는 대식세포를 생성하는 방법이 제공된다.
위에 기재된 바와 같이, 본 발명의 임의의 양태에 적용될 수 있고/있거나 본 명세서에 기재된 임의의 다른 실시형태와 조합될 수 있는 다양한 실시형태가 더 제공된다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 감소된 염증성 표현형을 갖는 단핵구 및/또는 대식세포는 작용제 또는 작용제들과 접촉한 후 다음 중 하나 이상을 나타낸다: a) 분화 클러스터 80(CD80), CD86, MHCII, MHCI, 인터류킨 1-베타(IL-1β), IL-6, CCL3, CCL4, CXCL10, CXCL9, GM-CSF 및/또는 종양 괴사 인자 알파(TNF-α)의 감소된 발현 및/또는 분비; b) CD206, CD163, CD16, CD53, VSIG4, PSGL-1 및/또는 IL-10의 증가된 발현 및/또는 분비; c) IL-1β, TNF-α, IL-12, IL-18 및 IL-23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 사이토카인의 감소된 분비; d) IL-1β, IL-6 및/또는 TNF-α의 발현 대 IL-10의 발현의 감소된 비; e) 감소된 CD8+ 세포독성 T 세포 활성화; f) 감소된 CD4+ 헬퍼 T 세포 활성; g) 감소된 NK 세포 활성; h) 감소된 전-염증성 호중구 활성; i) 감소된 대식세포 활성; 및/또는 j) 현미경에 의해 평가된 바와 같이 감소된 방추형 형태, 외관의 편평함 및/또는 수상돌기의 수. 다른 실시형태에서, 작용제 또는 작용제들과 접촉시킨 단핵구 및/또는 대식세포는 세포의 집단에 포함되며, 작용제는 세포의 집단에서 제1형 및/또는 M1 대식세포의 수를 감소시키고/시키거나 제2형 및/또는 M2 대식세포의 수를 증가시킨다. 여전히 다른 실시형태에서, 작용제 또는 작용제들과 접촉시킨 단핵구 및/또는 대식세포는 세포의 집단에 포함되며, 작용제 또는 작용제들은 세포의 집단에서 다음의 i) 내지 ii)의 비를 감소시킨다: i) 제1형 및/또는 M1 대식세포 및 ii) 제2형 및/또는 M2 대식세포. 또 다른 실시형태에서, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 하향조절하는 작용제 또는 작용제들은 소분자 저해제, CRISPR 가이드 RNA(gRNA), RNA 간섭 작용제, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 단일-가닥 핵산, 이중-가닥 핵산, 압타머, 리보자임, DNA자임, 펩타이드, 펩타이도모방체(mimetic), 항체, 인트라바디 또는 세포이다. RNA 간섭 작용제는 예를 들어, 작은 간섭 RNA(siRNA), 작은 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로 RNA(miRNA) 또는 피위-결합 RNA(piRNA)이거나 이들을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 하향조절하는 작용제 또는 작용제들은 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적에 특이적으로 결합하는, 항체 및/또는 인트라바디 또는 이들의 항원 결합 단편을 포함한다. 여전히 다른 실시형태에서, 항체 및/또는 인트라바디 또는 이의 항원 결합 단편은 낙타, 뮤린, 키메라, 인간화된 것, 인간, 검출 가능하게 표지된 것이고, 효과기 도메인을 포함하며, Fc 도메인을 포함하고/하거나 Fv, Fav, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)2 및 다이어바디 단편(diabodies fragment)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시형태에서, 항체 및/또는 인트라바디 또는 이들의 항원 결합 단편은 세포독성 작용제에 접합된다. 다른 실시형태에서, 세포독성 작용제는 화학치료제, 생물학적 작용제, 독소 및 방사성 동위원소로 이루어진 군으로부터 선택된다. 여전히 다른 실시형태에서, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 상향조절하는 작용제 또는 작용제들은 표 1 및/또는 표 2에 열거된 하나 이상의 표적을 암호화하는 핵산 분자 또는 이들의 단편, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 하나 이상의 표적의 폴리펩타이드 또는 이들의 단편(들), 표 1 및/또는 표 2에 열거된 하나 이상의 표적에 결합하는 활성화 항체 및/또는 인트라바디, 또는 표 1 및/또는 표 2에 열거된 하나 이상의 표적에 결합하는 소분자이다. 또 다른 실시형태에서, 대식세포는 제1형 대식세포, M1 대식세포, 제2형 대식세포, M2 대식세포, M2c 대식세포, M2d 대식세포, 종양-관련 대식세포(TAM), CD11b+ 세포, CD14+ 세포 및/또는 CD11b+/CD14+ 세포를 포함하되, 선택적으로 세포 및/또는 대식세포는 표적을 발현한다. 다른 실시형태에서, 단핵구 및/또는 대식세포는 시험관내 또는 생체외에서 접촉된다. 여전히 다른 실시형태에서, 단핵구 및/또는 대식세포 일차 단핵구 및/또는 일차 대식세포이다. 또 다른 실시형태에서, 단핵구 및/또는 대식세포는 작용제 또는 작용제들과 접촉하기 전에 정제 및/또는 배양된다. 다른 실시형태에서, 단핵구 및/또는 대식세포는 생체내에서 접촉된다. 여전히 다른 실시형태에서, 단핵구 및/또는 대식세포는 작용제의 전신, 종양 부근 또는 종양내 투여에 의해 생체내에서 접촉된다. 또 다른 실시형태에서, 단핵구 및/또는 대식세포는 조직 미세환경에서 접촉된다. 다른 실시형태에서, 방법은 단핵구 및/또는 대식세포를 염증성 표현형을 조절하는 적어도 하나의 면역치료제와 접촉시키는 단계를 더 포함하되, 선택적으로 면역치료제는 면역관문 저해제, 면역-자극성 효능제(agonist), 염증성 작용제, 세포, 암 백신 및/또는 바이러스를 포함한다.
여전히 다른 실시형태에서, i) 본 명세서에 기재된 방법에 따라 생성된 단핵구 및/또는 대식세포 및/또는 ii) 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 양 및/또는 활성을 하향조절하기 위한 siRNA를 포함하는 조성물이 제공된다.
또 다른 양태에서, 적어도 하나의 작용제와 접촉한 후 대상체에서 단핵구 및/또는 대식세포의 염증성 표현형을 증가시키는 방법으로서, 유효량의 적어도 하나의 작용제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 적어도 하나의 작용제는 a) 단핵구 및/또는 대식세포에서 또는 그 위에서 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 하향조절하는 작용제 및/또는 b) 단핵구 및/또는 대식세포에서 또는 그 위에서 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 상향조절하는 작용제인, 대상체에서 단핵구 및/또는 대식세포의 염증성 표현형을 증가시키는 방법이 제공된다.
위에 기재된 바와 같이, 본 발명의 임의의 양태에 적용될 수 있고/있거나 본 명세서에 기재된 임의의 다른 실시형태와 조합될 수 있는 다양한 실시형태가 더 제공된다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 증가된 염증성 표현형을 갖는 단핵구 및/또는 대식세포는 작용제 또는 작용제들과 접촉한 후 다음 중 하나 이상을 나타낸다: a) 분화 클러스터 80(CD80), CD86, MHCII, MHCI, 인터류킨 1-베타(IL-1β), IL-6, CCL3, CCL4, CXCL10, CXCL9, GM-CSF 및/또는 종양 괴사 인자 알파(TNF-α)의 증가된 발현 및/또는 분비; b) CD206, CD163, CD16, CD53, VSIG4, PSGL-1 및/또는 IL-10의 감소된 발현 및/또는 분비; c) IL-1β, TNF-α, IL-12, IL-18 및 IL-23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 사이토카인의 증가된 분비 ; d) IL-1β, IL-6 및/또는 TNF-α의 발현 대 IL-10의 발현의 증가된 비; e) 증가된 CD8+ 세포독성 T 세포 활성화; f) 증가된 CD4+ 헬퍼 T 세포 활성; g) 증가된 NK 세포 활성; h) 증가된 호중구 활성; i) 증가된 대식세포 활성; 및/또는 j) 현미경에 의해 평가되는 바와 같이 증가된 방추형 형태, 외관의 편평함 및/또는 수상돌기의 수. 다른 실시형태에서, 작용제 또는 작용제들은 제1형 및/또는 M1 대식세포의 수를 증가시키고, 제2형 및/또는 M2 대식세포의 수를 감소시키고/시키거나 다음 i) 내지 ii)의 비를 증가시키되, 대상체에서 i)은 제1형 및/또는 M1 대식세포이고 ii)는 제2형 및/또는 M2 대식세포이다. 여전히 다른 실시형태에서, 대상체에서 세포독성 CD8+ T 세포의 수 및/또는 활성은 작용제 또는 작용제들의 투여 후에 증가된다. 또 다른 실시형태에서, 적어도 하나의 작용제와 접촉한 후 대상체에서 단핵구 및/또는 대식세포의 염증성 표현형을 감소시키는 방법은 유효량의 적어도 하나의 작용제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 적어도 하나의 작용제는 a) 단핵구 및/또는 대식세포에서 또는 그 위에서 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 상향조절하는 작용제 및/또는 b) 단핵구 및/또는 대식세포에서 또는 그 위에서 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 하향조절하는 작용제이다. 다른 실시형태에서, 감소된 염증성 표현형을 갖는 단핵구 및/또는 대식세포는 작용제 또는 작용제들과 접촉한 후 다음 중 하나 이상을 나타낸다: a) 분화 클러스터 80(CD80), CD86, MHCII, MHCI, 인터류킨 1-베타(IL-1β), IL-6, CCL3, CCL4, CXCL10, CXCL9, GM-CSF 및/또는 종양 괴사 인자 알파(TNF-α)의 감소된 발현 및/또는 분비; b) CD206, CD163, CD16, CD53, VSIG4, PSGL-1 및/또는 IL-10의 증가된 발현 및/또는 분비; c) IL-1β, TNF-α, IL-12, IL-18 및 IL-23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 사이토카인의 감소된 분비; d) IL-1β, IL-6 및/또는 TNF-α의 발현 대 IL-10의 발현의 감소된 비; e) 감소된 CD8+ 세포독성 T 세포 활성화; f) 감소된 CD4+ 헬퍼 T 세포 활성; g) 감소된 NK 세포 활성; h) 감소된 호중구 활성; i) 감소된 대식세포 활성; 및/또는 j) 현미경에 의해 평가되는 바와 같이 감소된 방추형 형태, 외관의 편평함 및/또는 수상돌기의 수. 여전히 다른 실시형태에서, 작용제 또는 작용제들은 제1형 및/또는 M1 대식세포의 수를 감소시키고, 제2형 및/또는 M2 대식세포의 수를 증가시키고/시키거나 i) 내지 ii)의 비를 감소시키되, 대상체에서 i)은 제1형 및/또는M1 대식세포이고 ii)는 제2형 및/또는 M2 대식세포이다. 또 다른 실시형태에서, 대상체에서 세포독성 CD8+ T 세포의 수 및/또는 활성은 작용제의 투여 후 감소된다. 다른 실시형태에서, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 하향조절하는 작용제는 소분자 저해제, CRISPR 가이드 RNA(gRNA), RNA 간섭 작용제, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드 또는 펩타이도모방체 저해제, 압타머, 항체, 인트라바디 또는 세포이다. RNA 간섭 작용제는 예를 들어, 작은 간섭 RNA(siRNA), 작은 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로RNA(miRNA) 또는 피위-결합 RNA(piRNA)이거나 이를 포함할 수 있다. 여전히 다른 실시형태에서, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 하향조절하는 작용제는 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적에 특이적으로 결합하는 항체 및/또는 인트라바디 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 항체 및/또는 인트라바디 또는 이의 항원 결합 단편은 낙타, 뮤린, 키메라, 인간화된 것, 인간, 검출 가능하게 표지된 것이고, 효과기 도메인을 포함하며, Fc 도메인을 포함하고/하거나 Fv, Fav, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)2 및 다이어바디 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 실시형태에서, 항체 및/또는 인트라바디 또는 이의 항원 결합 단편은 세포독성 작용제에 접합된다. 여전히 다른 실시형태에서, 세포독성 작용제는 화학치료제, 생물학적 작용제, 독소 및 방사성 동위원소로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시형태에서, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 상향조절하는 작용제는 표 1 및/또는 표 2에 열거된 하나 이상의 표적을 암호화하는 핵산 분자 또는 이의 단편, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 하나 이상의 표적의 폴리펩타이드 또는 이의 단편(들), 표 1 및/또는 표 2에 열거된 하나 이상의 표적에 결합하는 활성화 항체 및/또는 인트라바디 또는 표 1 및/또는 표 2에 열거된 하나 이상의 표적에 결합하는 소분자이다. 다른 실시형태에서, 대식세포는 제1형 대식세포, M1 대식세포, 제2형 대식세포, M2 대식세포, M2c 대식세포, M2d 대식세포, 종양-관련 대식세포(TAM), CD11b+ 세포, CD14+ 세포 및/또는 CD11b+/CD14+ 세포를 포함하며, 선택적으로 세포 및/또는 대식세포는 표적을 발현한다. 여전히 다른 실시형태에서, 작용제 또는 작용제들은 작용제의 전신, 종양 부근 또는 종양내 투여에 의해 생체내로 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 작용제 또는 작용제들은 조직 미세환경에서 단핵구 및/또는 대식세포와 접촉한다. 다른 실시형태에서, 방법은 단핵구 및/또는 대식세포를 염증성 표현형을 조절하는 적어도 하나의 면역치료제와 접촉시키는 단계를 더 포함하되, 선택적으로 면역치료제는 면역관문 저해제, 면역-자극성 효능제, 염증성 작용제, 세포, 암 백신 및/또는 바이러스를 포함한다.
다른 양태에서, 대상체에서 염증을 증가시키는 방법으로서, 유효량의 a) 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 하향조절하기 위해 적어도 하나의 작용제와 접촉시킨 단핵구 및/또는 대식세포 및/또는 b) 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 상향조절하기 위해 적어도 하나의 작용제와 접촉시킨 단핵구 및/또는 대식세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 염증을 증가시키는 방법이 제공된다.
위에 기재된 바와 같이, 본 발명의 임의의 양태에 적용될 수 있고/있거나 본 명세서에 기재된 임의의 다른 실시형태와 조합될 수 있는 다양한 실시형태가 더 제공된다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 대식세포는 제1형 대식세포, M1 대식세포, 제2형 대식세포, M2 대식세포, M2c 대식세포, M2d 대식세포, 종양-관련 대식세포(TAM), CD11b+ 세포, CD14+ 세포 및/또는 CD11b+/CD14+ 세포를 포함하되, 선택적으로 세포 및/또는 대식세포는 표적을 발현한다. 다른 실시형태에서, 단핵구 및/또는 대식세포는 대상체의 단핵구 및/또는 대식세포에 대하여 유전자 조작된 것, 자가유래, 동계(syngeneic) 또는 동종이계(allogeneic)이다. 여전히 다른 실시형태에서, a)의 적어도 하나의 작용제와 접촉되는 단핵구 및/또는 대식세포는 b)의 적어도 하나의 작용제와 접촉되는 단핵구 및/또는 대식세포와 상이하다. 또 다른 실시형태에서, a)의 적어도 하나의 작용제와 접촉되는 단핵구 및/또는 대식세포는 b)의 적어도 하나의 작용제와 접촉되는 단핵구 및/또는 대식세포와 동일하다. 다른 실시형태에서, 작용제 또는 작용제들은 전신으로, 종양 근처로 또는 종양 내부로 투여된다.
여전히 다른 실시형태에서, 대상체에서 염증을 감소시키는 방법으로서, 유효량의 a) 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 상향조절하는 적어도 하나의 작용제와 접촉시킨 단핵구 및/또는 대식세포 및/또는 b) 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 하향조절하는 적어도 하나의 작용제와 접촉시킨 단핵구 및/또는 대식세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 염증을 감소시키는 방법이 제공된다.
위에 기재된 바와 같이, 본 발명의 임의의 양태에 적용되고/되거나 본 명세서에 기재된 임의의 다른 실시형태와 조합될 수 있는 다양한 실시형태가 더 제공된다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 대식세포는 제1형 대식세포, M1 대식세포, 제2형 대식세포, M2 대식세포, M2c 대식세포, M2d 대식세포, 종양-관련 대식세포(TAM), CD11b+ 세포, CD14+ 세포 및/또는 CD11b+/CD14+ 세포를 포함하되, 선택적으로 세포 및/또는 대식세포는 표적을 발현한다. 다른 실시형태에서, 단핵구 및/또는 대식세포는 대상체의 단핵구 및/또는 대식세포에 대하여 유전자 조작된 것, 자가유래, 동계 또는 동종이계이다. 여전히 다른 실시형태에서, a)의 적어도 하나의 작용제와 접촉되는 단핵구 및/또는 대식세포는 b)의 적어도 하나의 작용제와 접촉되는 단핵구 및/또는 대식세포와 상이하다. 또 다른 실시형태에서, a)의 적어도 하나의 작용제와 접촉되는 단핵구 및/또는 대식세포는 b)의 적어도 하나의 작용제와 접촉되는 단핵구 및/또는 대식세포와 동일하다. 다른 실시형태에서, 작용제 또는 작용제들은 전신으로, 종양 근처로 또는 종양 내부로 투여된다.
또 다른 양태에서, 세포독성 CD8+ T 세포-매개성 살해 및/또는 면역관문 요법에 대해 대상체에서 암 세포를 감작시키는(sensitizing) 방법으로서, 치료적 유효량의 a) 단핵구 및/또는 대식세포에서 또는 그 위에서 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 하향조절하는 적어도 하나의 작용제 및/또는 b) 단핵구 및/또는 대식세포에서 또는 그 위에서 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 상향조절하는 적어도 하나의 작용제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암 세포를 감작시키는 방법이 제공된다.
위에 기재된 바와 같이, 본 발명의 임의의 양태에 적용되고/되거나 본 명세서에 기재된 임의의 다른 실시형태와 조합될 수 있는 다양한 실시형태가 더 제공된다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 방법은 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 하양조절하는 적어도 하나의 작용제를 투여하는 단계를 더 포함한다. 다른 실시형태에서, 작용제는 소분자 저해제, CRISPR 가이드 RNA(gRNA), RNA 간섭 작용제, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드 또는 펩타이도모방체 저해제, 압타머, 항체, 인트라바디 또는 세포이다. RNA 간섭 작용제는 예를 들어, 작은 간섭 RNA(siRNA), 작은 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로RNA(miRNA) 또는 피위-결합 RNA(piRNA)이거나 이를 포함할 수 있다. 여전히 다른 실시형태에서, 작용제는 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적에 특이적으로 결합하는 항체 및/또는 인트라바디 또는 이들의 항원 결합 단편을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 항체 및/또는 인트라바디 또는 이들의 항원 결합 단편은 낙타, 뮤린, 키메라, 인간화된 것, 인간, 검출 가능하게 표지된 것이고, 효과기 도메인을 포함하며, Fc 도메인을 포함하고/하거나 Fv, Fav, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)2 및 다이어바디 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 실시형태에서, 항체 및/또는 인트라바디 또는 이들의 항원 결합 단편은 세포독성 작용제에 접합된다. 여전히 다른 실시형태에서, 세포독성 작용제는 화학치료제, 생물학적 작용제, 독소 및 방사성 동위원소로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시형태에서, 방법은 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 상향조절하는 적어도 하나의 작용제를 투여하는 단계를 더 포함한다. 다른 실시형태에서, 작용제는 표 2에 열거된 하나 이상의 표적을 암호화하는 핵산 분자 또는 이의 단편, 표 2에 열거된 하나 이상의 표적의 폴리펩타이드 또는 이의 단편(들), 표 2에 열거된 하나 이상의 표적에 결합하는 활성화 항체 및/또는 인트라바디 또는 표 2에 열거된 하나 이상의 표적에 결합하는 소분자이다.
다른 양태에서, 세포독성 CD8+ T 세포-매개성 살해 및/또는 면역관문 요법에 대해 암에 걸린 대상체에서 암 세포를 감작시키는 방법으로서, 치료적 유효량의 a) 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 하향조절하기 위해 적어도 하나의 작용제와 접촉시킨 단핵구 세포 및/또는 대식세포 세포 및/또는 b) 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 상향조절하기 위해 적어도 하나의 작용제와 접촉시킨 단핵구 세포 및/또는 대식세포 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암에 걸린 대상체에서 암 세포를 감작시키는 방법이 제공된다.
위에 기재된 바와 같이, 본 발명의 임의의 양태에 적용될 수 있고/있거나 본 명세서에 기재된 임의의 다른 실시형태와 조합될 수 있는 다양한 실시형태가 더 제공된다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 대식세포는 제1형 대식세포, M1 대식세포, 제2형 대식세포, M2 대식세포, M2c 대식세포, M2d 대식세포, 종양-관련 대식세포(TAM), CD11b+ 세포, CD14+ 세포 및/또는 CD11b+/CD14+ 세포를 포함하되, 선택적으로 세포 및/또는 대식세포는 표적을 발현한다. 다른 실시형태에서, 단핵구 및/또는 대식세포는 대상체의 단핵구 및/또는 대식세포에 대하여 유전자 조작된 것, 자가유래, 동계 또는 동종이계이다. 여전히 다른 실시형태에서, a)의 적어도 하나의 작용제와 접촉되는 단핵구 및/또는 대식세포는 b)의 적어도 하나의 작용제와 접촉되는 단핵구 및/또는 대식세포와 상이하다. 또 다른 실시형태에서, a)의 적어도 하나의 작용제와 접촉되는 단핵구 및/또는 대식세포는 b)의 적어도 하나의 작용제와 접촉되는 단핵구 및/또는 대식세포와 동일하다. 다른 실시형태에서, 작용제 또는 작용제들은 전신으로, 종양 근처로 또는 종양 내부로 투여된다. 여전히 다른 실시형태에서, 방법은 적어도 하나의 면역요법을 대상체에게 투여함으로써 대상체에서 암을 치료하는 단계를 더 포함하되, 선택적으로 면역요법은 면역관문 저해제, 면역-자극성 효능제, 염증성 작용제, 세포, 암 백신 및/또는 바이러스를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 면역관문 저해제는 PD-1, PD-L1, PD-L2 및 CTLA-4로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 실시형태에서, 면역관문은 PD-1이다. 여전히 다른 실시형태에서, 작용제 또는 작용제들은 암에서 증식하는 세포의 수를 감소시키고/시키거나 암 세포를 포함하는 종양의 부피 또는 크기를 감소시킨다. 또 다른 실시형태에서, 작용제 또는 작용제들은 암 세포를 포함하는 종양을 침윤하는 CD8+ T 세포의 양 및/또는 활성을 증가시킨다. 여전히 다른 실시형태에서, 작용제 또는 작용제들은 a) 암 세포를 포함하는 종양을 침윤하는 M1 대식세포의 양 및/또는 활성을 증가시키고/시키거나, b) 침윤 암 세포를 포함하는 종양을 침윤하는 M2 대식세포의 양 및/또는 활성을 감소시킨다. 또 다른 실시형태에서, 방법은 암을 치료하기 위한 적어도 하나의 추가적인 요법 또는 양생법(regimen)을 대상체에게 투여하는 단계를 더 포함한다. 다른 실시형태에서, 요법은 작용제 이전에, 이와 동시에 또는 이후에 투여된다.
여전히 다른 실시형태에서, 적어도 하나의 표적을 조절함으로써 이의 염증성 표현형을 증가시킬 수 있는 단핵구 및/또는 대식세포를 확인하는 방법으로서, a) 단핵구 및/또는 대식세포로부터 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 결정하는 단계; b) 대조군에서 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 결정하는 단계; 및 c) a) 및 b) 단계에서 검출된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 비교하는 단계를 포함하되; 적어도 하나의 표적의 대조군 카피 수, 양 및/또는 활성과 비교하여 단핵구 및/또는 대식세포에서 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성의 존재 또는 증가 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성의 부재 또는 감소는, 적어도 하나의 표적을 조절함으로써 단핵구 및/또는 대식세포가 이의 염증성 표현형을 증가시킬 수 있음을 나타내는, 염증성 표현형을 증가시킬 수 있는 단핵구 및/또는 대식세포를 확인하는 방법이 제공된다.
위에 기재된 바와 같이, 본 발명의 임의의 양태에 적용될 수 있고/있거나 본 명세서에 기재된 임의의 다른 실시형태와 조합될 수 있는 다양한 실시형태가 더 제공된다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 방법은 세포를 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적을 조절하는 작용제와 접촉시키고, 이를 권장, 처방 또는 투여하는 단계를 더 포함한다. 다른 실시형태에서, 방법은 대상체가 하나 이상의 표적을 조절함으로써 염증성 표현형을 증가시키는 것으로부터 혜택을 받지 않는 것으로 결정되는 경우, 세포를 표 1 및/또는 표 2에 열거된 하나 이상의 표적을 조절하는 작용제 이외의 암 요법과 접촉시키고, 이를 권장, 처방 또는 투여하는 단계를 더 포함한다. 여전히 다른 실시형태에서, 방법은 세포를 면역 반응을 증가시키는 적어도 하나의 추가적인 작용제와 접촉시키고/시키거나 이를 투여하는 단계를 더 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 추가적인 작용제는 표적화 요법, 화학요법, 방사선 요법 및/또는 호르몬 요법으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 실시형태에서, 대조군은 대상체가 속한 동일한 종의 구성원으로부터 유래된다. 여전히 다른 실시형태에서, 대조군은 세포를 포함하는 샘플이다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 암을 앓고 있다. 다른 실시형태에서, 대조군은 대상체로부터의 암 샘플이다. 여전히 다른 실시형태에서, 대조군은 대상체로부터의 비-암성 샘플이다.
또 다른 양태에서, 적어도 하나의 표적을 조절함으로써 이의 염증성 표현형을 감소시킬 수 있는 단핵구 및/또는 대식세포를 확인하는 방법으로서, a) 단핵구 및/또는 대식세포로부터 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 결정하는 단계; b) 대조군에서 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 결정하는 단계; 및 c) a) 및 b) 단계에서 검출된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 비교하는 단계를 포함하되; 단핵구 및/또는 대식세포에서 적어도 하나의 표적의 대조군 카피 수, 양 및/또는 활성과 비교하여 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성의 부재 또는 감소 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성의 존재 또는 증가는, 단핵구 및/또는 대식세포가 적어도 하나의 표적을 조절함으로써 이의 염증성 표현형을 감소시킬 수 있음을 나타내는, 염증성 표현형을 감소시킬 수 있는 단핵구 및/또는 대식세포를 확인하는 방법이 제공된다.
위에 기재된 바와 같이, 본 발명의 임의의 양태에 적용될 수 있고/있거나 본 명세서에 기재된 임의의 다른 실시형태와 조합될 수 있는 다양한 실시형태가 더 제공된다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 방법은 단핵구 및/또는 대식세포를 표 1 및/또는 표 2에 열거된 하나 이상의 표적을 조절하는 작용제 또는 작용제들과 접촉시키고 이를 권장, 처방 또는 투여하는 단계를 더 포함한다. 다른 실시형태에서, 방법은 대상체가 적어도 하나의 표적을 조절함으로써 염증성 표현형을 감소시키는 것으로부터 혜택을 받지 않는다고 결정되는 경우, 단핵구 및/또는 대식세포를 표 1 및/또는 표 2에 열거된 하나 이상의 표적을 조절하는 작용제 또는 작용제들 이외의 암 요법과 접촉시키고, 이를 권장, 처방 또는 투여하는 단계를 더 포함한다. 여전히 다른 실시형태에서, 방법은 단핵구 및/또는 대식세포를 면역 반응을 감소시키는 적어도 하나의 추가적인 작용제와 접촉시키고/시키거나 이를 투여하는 단계를 더 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 대조군은 대상체가 속한 동일한 종의 구성원으로부터 유래된다. 다른 실시형태에서, 대조군은 세포를 포함하는 샘플이다. 여전히 다른 실시형태에서, 대상체는 암을 앓고 있다. 다른 실시형태에서, 대조군은 대상체로부터의 암 샘플이다. 여전히 다른 실시형태에서, 대조군은 대상체로부터의 비-암성 샘플이다.
다른 양태에서, 암에 걸린 대상체의 임상 결과를 예측하는 방법으로서, a) 대상체로부터 단핵구 및/또는 대식세포로부터의 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 결정하는 단계; b) 나쁜 임상 결과를 갖는 대조군으로부터 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 결정하는 단계; 및 c) 대상체 샘플 및 대조군 대상체로부터의 샘플에서 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 비교하는 단계를 포함하되; 대조군에서의 카피 수, 양 및/또는 활성과 비교하여 대상체의 단핵구 및/또는 대식세포로부터의 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성의 존재 또는 증가 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성의 부재 또는 감소는, 대상체가 나쁜 임상 결과를 나타내지 않음을 나타내는, 암에 걸린 대상체의 임상 결과를 예측하는 방법이 제공된다.
여전히 다른 실시형태에서, 대상체에서 단핵구 및/또는 대식세포의 염증성 표현형을 모니터링하는 방법이 제공되며, 방법은 a) 첫 번째 시점에서 첫 번째 대상체 샘플에서 대상체의 단핵구 및/또는 대식세포로부터 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 검출하는 단계; b) 이후의 시점에서 수득된 단핵구 및/또는 대식세포를 포함하는 후속 샘플을 사용하여 a) 단계를 반복하는 단계; 및 c) a) 및 b) 단계에서 검출된 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 양 또는 활성을 비교하는 단계를 포함하되, 첫 번째 샘플의 단핵구 및/또는 대식세포로부터의 카피 수, 양 및/또는 활성과 비교하여 후속 샘플의 단핵구 및/또는 대식세포로부터 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성의 부재 또는 감소 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성의 존재 또는 증가는, 대상체의 단핵구 및/또는 대식세포가 염증성 표현형을 상향조절함을 나타내거나; 또는 첫 번째 샘플의 단핵구 및/또는 대식세포로부터의 카피 수, 양 및/또는 활성과 비교하여 후속 샘플의 단핵구 및/또는 대식세포로부터의 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성의 존재 또는 증가 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성의 부재 또는 감소는, 대상체의 단핵구 및/또는 대식세포가 염증성 표현형을 하향조절함을 나타낸다.
위에 기재된 바와 같이, 본 발명의 임의의 양태에 적용될 수 있고/있거나 본 명세서에 기재된 임의의 다른 실시형태와 조합될 수 있는 다양한 실시형태가 더 제공된다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 첫 번째 및/또는 적어도 하나의 후속 샘플은 시험관내에서 배양된 단핵구 및/또는 대식세포를 포함한다. 다른 실시형태에서, 첫 번째 및/또는 적어도 하나의 후속 샘플은 시험관내에서 배양되지 않은 단핵구 및/또는 대식세포를 포함한다. 여전히 다른 실시형태에서, 첫 번째 및/또는 적어도 하나의 후속 샘플은 대상체로부터 수득된 단일 샘플 또는 혼주된(pooled) 샘플의 일부이다. 또 다른 실시형태에서, 샘플은 대상체로부터 수득된 혈액, 혈청, 종양 부근 조직 및/또는 종양내 조직을 포함한다.
또 다른 양태에서, 대상체에서 단핵구 및/또는 대식세포의 염증성 표현형을 증가시키는 작용제의 효능을 평가하는 방법으로서, a) 첫 번째 시점에서 단핵구 및/또는 대식세포를 포함하는 대상체 샘플의 i) 단핵구 및/또는 대식세포에서 또는 그 위에서 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성 및/또는 ii) 단핵구 및/또는 대식세포의 염증성 표현형을 검출하는 단계; b) 단핵구 및/또는 대식세포가 작용제와 접촉된 후 적어도 하나의 후속 시점 동안 a) 단계를 반복하는 단계; 및 c) a) 및 b) 단계에서 검출된 i) 및/또는 ii)의 값을 비교하는 단계를 포함하되, 첫 번째 시점에서 샘플의 카피 수, 양 및/또는 활성과 비교하여 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성의 부재 또는 감소 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성의 존재 또는 증가 및/또는 후속 샘플에서 ii)의 증가는, 작용제가 대상체에서 단핵구 및/또는 대식세포의 염증성 표현형을 증가시킴을 나타내는, 염증성 표현형을 증가시키는 작용제의 효능을 평가하는 방법이 제공된다.
위에 기재된 바와 같이, 본 발명의 임의의 양태에 적용될 수 있고/있거나 본 명세서에 기재된 임의의 다른 실시형태와 조합될 수 있는 다양한 실시형태가 더 제공된다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 작용제와 접촉시킨 단핵구 및/또는 대식세포는 세포의 집단에 포함되며, 작용제는 세포의 집단에서 제1형 및/또는 M1 대식세포의 수를 증가시킨다. 다른 실시형태에서, 작용제와 접촉시킨 단핵구 및/또는 대식세포는 세포의 집단에 포함되며, 작용제는 세포의 집단에서 제2형 및/또는 M2 대식세포의 수를 감소시킨다.
다른 양태에서, 단핵구 및/또는 대식세포의 염증성 표현형을 감소시키는 작용제의 효능을 평가하는 방법으로서, a) 첫 번째 시점에서 단핵구 및/또는 대식세포를 포함하는 대상체 샘플에서 i) 단핵구 및/또는 대식세포에서 또는 그 위에서 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성 및/또는 ii) 단핵구 및/또는 대식세포의 염증성 표현형을 검출하는 단계; b) 단핵구 및/또는 대식세포가 작용제와 접촉된 후 적어도 하나의 후속 시점 동안 a) 단계를 반복하는 단계; 및 c) a) 및 b) 단계에서 검출된 i) 및/또는 ii)의 값을 비교하는 단계를 포함하되, 첫 번째 시점에서 샘플의 카피 수, 양 및/또는 활성과 비교하여 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성의 존재 또는 증가 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성의 부재 또는 감소 및/또는 후속 샘플에서 ii)의 감소는, 작용제가 대상체에서 단핵구 및/또는 대식세포의 염증성 표현형을 감소시킴을 나타내는, 염증성 표현형을 감소시키는 작용제의 효능을 평가하는 방법이 제공된다.
위에 기재된 바와 같이, 본 발명의 임의의 양태에 적용될 수 있고/있거나 본 명세서에 기재된 임의의 다른 실시형태와 조합될 수 있는 다양한 실시형태가 더 제공된다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 작용제와 접촉시킨 단핵구 및/또는 대식세포는 세포의 집단에 포함되며, 작용제는 선택적으로 세포의 집단에서 제1형 및/또는 M1 대식세포의 수를 감소시킨다. 다른 실시형태에서, 작용제와 접촉시킨 단핵구 및/또는 대식세포는 세포의 집단에 포함되며, 작용제는 선택적으로 세포의 집단에서 제2형 및/또는 M2 대식세포의 수를 증가시킨다. 여전히 다른 실시형태에서, 단핵구 및/또는 대식세포는 시험관내 또는 생체외에서 접촉된다. 또 다른 실시형태에서, 단핵구 및/또는 대식세포는 일차 단핵구 및/또는 일차 대식세포이다. 다른 실시형태에서, 단핵구 및/또는 대식세포는 작용제와 접촉하기 전에 정제 및/또는 배양된다. 여전히 다른 실시형태에서, 단핵구 및/또는 대식세포는 생체내에서 접촉된다. 또 다른 실시형태에서, 단핵구 및/또는 대식세포는 전신, 종양 부근 또는 종양내 작용제의 투여에 의해 생체내에서 접촉된다. 다른 실시형태에서, 단핵구 및/또는 대식세포는 조직 미세환경에서 접촉된다. 여전히 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 단핵구 및/또는 대식세포를 염증성 표현형을 조절하는 적어도 하나의 면역치료제와 접촉시키는 단계를 더 포함하되, 선택적으로 면역치료제는 면역관문 저해제, 면역-자극성 효능제, 염증성 작용제, 세포, 암 백신 및/또는 바이러스를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 포유동물이다. 다른 실시형태에서, 포유동물은 비인간 동물 모델 또는 인간이다.
여전히 다른 실시형태에서, 대상체에서 암을 치료하기 위한 작용제의 효능을 평가하는 방법으로서, a) 첫 번째 시점에서 단핵구 및/또는 대식세포를 포함하는 대상체 샘플에서 i) 단핵구 및/또는 대식세포에서 또는 그 위에서 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성 및/또는 ii) 단핵구 및/또는 대식세포의 염증성 표현형을 검출하는 단계; b) 작용제의 투여 후 적어도 하나의 후속 시점 동안 a) 단계를 반복하는 단계; 및 c) a) 및 b) 단계에서 검출된 i) 및/또는 ii)의 값을 비교하는 단계를 포함하되, 첫 번째 시점에서 대상체 샘플의 단핵구 및/또는 대식세포에서 또는 그 위에서 카피 수, 양 및/또는 활성과 비교하여 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성의 부재 또는 감소 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성의 존재 또는 증가 및/또는 후속 시점에서 대상체 샘플의 단핵구 및/또는 대식세포에서 또는 그 위에서 ii)의 증가는, 작용제가 대상체에서 암을 치료함을 나타내는, 작용제의 효능을 평가하는 방법이 제공된다.
위에 기재된 바와 같이, 본 발명의 임의의 양태에 적용될 수 있고/있거나 본 명세서에 기재된 임의의 다른 실시형태와 조합될 수 있는 다양한 실시형태가 더 제공된다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 첫 번째 시점과 후속 시점 사이에서, 대상체는 치료를 받았거나, 치료를 완료하였고/하였거나 암에 대한 관해에 있다. 다른 실시형태에서, 첫 번째 및/또는 적어도 하나의 후속 샘플은 생체외 및 생체내 샘플로 이루어진 군으로부터 선택된다. 여전히 다른 실시형태에서, 첫 번째 및/또는 적어도 하나의 후속 샘플은 비인간 동물 모델의 암으로부터 수득된다.
또 다른 실시형태에서, 첫 번째 및/또는 적어도 하나의 후속 샘플은 대상체로부터 수득된 단일 샘플 또는 혼주된 샘플의 일부이다. 다른 실시형태에서, 샘플은 대상체로부터 수득된 세포, 혈청, 종양 부근 조직 및/또는 종양내 조직을 포함한다.
또 다른 양태에서, 세포독성 T 세포-매개성 살해 및/또는 면역관문 요법에 대해 암 세포를 감작시키는 작용제를 스크리닝하는 방법으로서, a) i) 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 감소시키는 적어도 하나의 작용제 및/또는 ii) 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 증가시키는 적어도 하나의 작용제와 접촉시킨 단핵구 및/또는 대식세포의 존재하에서 암 세포를 세포독성 T 세포 및/또는 면역관문 요법과 접촉시키는 단계; b) 적어도 하나의 작용제 또는 작용제들과 접촉시키지 않은 대조군 단핵구 및/또는 대식세포의 존재하에서 암 세포를 세포독성 T 세포 및/또는 면역관문 요법과 접촉시키는 단계; 및 c) b)와 비교하여 a)에서 세포독성 T 세포-매개성 살해 및/또는 면역관문 요법의 효능을 증가시키는 작용제를 확인함으로써 세포독성 T 세포-매개성 살해 및/또는 면역관문 요법에 대해 암 세포를 감작시키는 작용제를 확인하는 단계를 포함하는, 암 세포를 감작시키는 작용제를 스크리닝하는 방법이 제공된다.
다른 양태에서, 세포독성 T 세포-매개성 살해 및/또는 면역관문 요법에 대해 암 세포를 감작시키는 작용제를 스크리닝하는 방법으로서, a) i) 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 감소시키도록 조작되고/되거나 ii) 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 증가시키도록 조작된 단핵구 및/또는 대식세포의 존재하에서 암 세포를 세포독성 T 세포 및/또는 면역관문 요법과 접촉시키는 단계; b) 대조군 단핵구 및/또는 대식세포의 존재하에 암 세포를 세포독성 T 세포 및/또는 면역관문 요법과 접촉시키는 단계; 및 c) b)와 비교하여 a)에서 세포독성 T 세포-매개성 살해 및/또는 면역관문 요법의 효능을 증가시키는 작용제를 확인함으로써 세포독성 T 세포-매개성 살해 및/또는 면역관문 요법에 대해 암 세포를 감작화시키는 작용제를 확인하는 단계를 포함하는, 암 세포를 감작시키는 작용제를 스크리닝하는 방법이 제공된다.
위에 기재된 바와 같이, 본 발명의 임의의 양태에 적용될 수 있고/있거나 본 명세서에 기재된 임의의 다른 실시형태와 조합될 수 있는 다양한 실시형태가 더 제공된다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 접촉 단계는 생체내, 생체외 또는 시험관내에서 발생한다. 다른 실시형태에서, 방법은 i) 암에서 증식하는 세포의 수의 감소 및/또는 ii) 암 세포를 포함하는 종양의 부피 또는 크기의 감소를 결정하는 단계를 더 포함한다. 여전히 다른 실시형태에서, 방법은 i) CD8+ T 세포 수의 증가 및/또는 ii) 암 세포를 포함하는 종양을 침윤하는 제1형 및/또는 M1 대식세포 수의 증가를 결정하는 단계를 더 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 방법은 임상적 이득률, 사망할 때까지의 생존기간, 병리학적 완전 반응, 병리학적 반응의 반-정량적 측정값, 임상적 완전 관해, 임상적 부분 관해, 임상적 안정 질환, 무재발 생존기간, 무전이 생존기간, 무질환 생존기간, 순환 종양 세포 감소, 순환하는 마커 반응 및 RECIST 기준으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 기준에 의해 측정된 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적을 조절하는 작용제에 대한 반응을 결정하는 단계를 더 포함한다. 다른 실시형태에서, 방법은 암 세포를 적어도 하나의 추가적인 암 치료제 또는 양생법과 접촉시키는 단계를 더 포함한다. 여전히 다른 실시형태에서, 작용제 또는 작용제들은 리피드 또는 리피도이드를 더 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 리피도이드는 하기 화학식 (VI) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이다:
Figure pct00001
식 중, p는 1 내지 3의 정수를 포함하고; m은 1 내지 3의 정수를 포함하며; RA는 수소; 치환 또는 비치환된, 고리형 또는 비고리형의, 분지형 또는 비분지형 C1-20 지방족; 치환 또는 비치환된, 고리형 또는 비고리형의, 분지형 또는 비분지형 C1-20 헤테로지방족; 치환 또는 비치환된 아릴; 치환 또는 비치환된 헤테로아릴;
Figure pct00002
;
Figure pct00003
; 또는
Figure pct00004
이고;
RF는 수소; 치환 또는 비치환된, 고리형 또는 비고리형의, 분지형 또는 비분지형 C1-20 지방족; 치환 또는 비치환된, 고리형 또는 비고리형의, 분지형 또는 비분지형 C1-20 헤테로지방족; 치환 또는 비치환된 아릴; 치환 또는 비치환된 헤테로아릴;
Figure pct00005
;
Figure pct00006
; 또는
Figure pct00007
이며;
R5의 각각의 존재는 독립적으로 수소; 치환 또는 비치환된, 고리형 또는 비고리형의, 분지형 또는 비분지형 C1-20 지방족; 치환 또는 비치환된, 고리형 또는 비고리형의, 분지형 또는 비분지형 C1-20 헤테로지방족; 치환 또는 비치환된 아릴; 또는 치환 또는 비치환된 헤테로아릴이되;
RA, RF, RY 및 RZ 중 적어도 하나는
Figure pct00008
또는
Figure pct00009
이고;
x의 각각의 존재는 1 내지 10의 정수를 포함하고; y의 각각의 존재는 1 내지 10의 정수를 포함하며; RY의 각각의 존재는 수소; 치환 또는 비치환된, 고리형 또는 비고리형의, 분지형 또는 비분지형 C1-20 지방족; 치환 또는 비치환된, 고리형 또는 비고리형의, 분지형 또는 비분지형 C1-20 헤테로지방족; 치환 또는 비치환된 아릴; 치환 또는 비치환된 헤테로아릴;
Figure pct00010
또는
Figure pct00011
이고; RZ의 각각의 존재는 수소; 치환 또는 비치환된, 고리형 또는 비고리형의, 분지형 또는 비분지형 C1-20 지방족; 치환 또는 비치환된, 고리형 또는 비고리형의, 분지형 또는 비분지형 C1-20 헤테로지방족; 치환 또는 비치환된 아릴; 치환 또는 비치환된 헤테로아릴;
Figure pct00012
또는
Figure pct00013
이다. 다른 실시형태에서, p는 1이다. 여전히 다른 실시형태에서, m은 1이다. 또 다른 실시형태에서, 각각의 p 및 m은 1이다. 또 다른 실시형태에서, RF는
Figure pct00014
이다. 다른 실시형태에서, RA는
Figure pct00015
이다. 여전히 다른 실시형태에서, 화학식 (VI)의 화합물은 하기 화학식의 화합물 또는 이의 염이다:
Figure pct00016
. 또 다른 실시형태에서, 조성물은 지질 나노입자의 형태이다. 다른 실시형태에서, 지질 나노입자는 약 1.0% 내지 약 60.0 몰%의 C12-200을 포함한다. 여전히 다른 실시형태에서, 지질 나노입자는 하나 이상의 보조-지질(co-lipid)을 더 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 각각의 보조-지질는 다이스테로일포스파티딜 콜린(DSPC), 콜레스테롤 및 DMG-PEG로부터 선택된다. 다른 실시형태에서, DSPC의 농도는 약 1.0% 내지 약 20.0 몰%이다. 여전히 다른 실시형태에서, 콜레스테롤의 농도는 약 10.0% 내지 약 50.0 몰%이다. 또 다른 실시형태에서, DMG-PEG의 농도는 약 0.1% 내지 약 5.0 몰%이다. 다른 실시형태에서, DSPC는 약 1.0% 내지 약 20.0 몰%의 농도로 존재하고; 콜레스테롤은 약 10.0% 내지 약 50.0 몰%의 농도로 존재하며; DMG-PEG는 약 0.1% 내지 약 5.0 몰%의 농도로 존재한다. 여전히 다른 실시형태에서, 작용제는 약제학적으로 허용 가능한 제형으로 존재한다. 또 다른 실시형태에서, 조절된 염증성 표현형을 갖는 단핵구 및/또는 대식세포는 다음 중 하나 이상을 나타낸다: a) 분화 클러스터 80(CD80), CD86, MHCII, MHCI, 인터류킨 1-베타(IL-1β), IL-6, CCL3, CCL4, CXCL10, CXCL9, GM-CSF 및/또는 종양 괴사 인자 알파(TNF-α)의 조절된 발현; b) CD206, CD163, CD16, CD53, VSIG4, PSGL-1 및/또는 IL-10의 조절된 발현; c) IL-1β, TNF-α, IL-12, IL-18 및 IL-23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 사이토카인의 조절된 분비; d) IL-1β, IL-6 및/또는 TNF-α의 발현 대 IL-10의 발현의 조절된 비; e) 조절된 CD8+ 세포독성 T 세포 활성화; f) 조절된 CD4+ 헬퍼 T 세포 활성; g) 조절된 NK 세포 활성; h) 조절된 호중구 활성; i) 조절된 대식세포 활성; 및/또는 j) 현미경에 의해 평가되는 바와 같이 조절된 방추형 형태, 외관의 편평함 및/또는 수상돌기의 수. 다른 실시형태에서, 세포 및/또는 대식세포는 제1형 대식세포, M1 대식세포, 제2형 대식세포, M2 대식세포, M2c 대식세포, M2d 대식세포, 종양-관련 대식세포(TAM), CD11b+ 세포, CD14+ 세포 및/또는 CD11b+/CD14+ 세포를 포함하되, 선택적으로 세포 및/또는 대식세포는 표 1 및/또는 표 2에 열거된 표적으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 표적을 발현하거나 또는 발현하는 것으로 결정된다. 여전히 다른 실시형태에서, 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적은 인간 SIGLEC9, VSIG4, CD74, CD207, LRRC25, SELPLG, AIF1, CD84, IGSF6, CD48, CD33, LST1, TNFAIP8L2(TIPE2), SPI1(PU.1), LILRB2, CCR5, EVI2B, CLEC7A, TBXAS1, SIGLEC7 및 DOCK2 또는 이들의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시형태에서, 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적은 인간 CD53, FERMT3, CD37, CXorf21, CD48 및 CD84 또는 이들의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 실시형태에서, 암은 대식세포가 침윤된 고형 종양이되, 침윤성 대식세포는 종양 또는 종양 미세환경에서 질량, 부피 및/또는 세포 수의 적어도 약 5%를 나타내고/내거나 암은 중피종, 신장 투명세포형 신세포 암종, 교모세포종, 폐 선암종, 폐 편평세포 암종, 췌장 선암종, 유방 침습 암종, 급성 골수성 백혈병, 부신피질 암종, 방광 요로상피성 암종, 뇌 저등급 신경교종, 유방 침습 암종, 자궁경부 편평세포 암종 및 자궁경내 선암종, 담관암종, 결장 선암종, 식도 암종, 다발성 교모세포종, 두경부 편평세포 암종, 혐색소 신세포암, 신장 투명세포형 신세포 암종, 신장 신유두세포 암종, 간세포 암종, 림프구성 세포종양 미만성 거대 B-세포 림프종, 중피종, 난소 장액성 종양, 낭샘암종, 크롬 친화성 세포종, 부신경절종, 전립선 선암종, 직장 선암종, 육종, 피부 흑색종, 위 선암, 고환 생식세포 종양, 흉선종, 갑상선암종, 자궁 암육종, 자궁체부 내막 암종 및 포도막 흑색종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 여전히 다른 실시형태에서, 대식세포는 제1형 대식세포, M1 대식세포, 제2형 대식세포, M2 대식세포, M2c 대식세포, M2d 대식세포, 종양-관련 대식세포(TAM), CD11b+ 세포, CD14+ 세포 및/또는 CD11b+/CD14+ 세포를 포함하되, 선택적으로 대식세포는 TAM 및/또는 M2 대식세포이다. 또 다른 실시형태에서, 대식세포는 표 1 및/또는 표 2에 열거된 표적으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 표적을 발현하거나 또는 발현하는 것으로 결정된다. 다른 실시형태에서, 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적은 인간 SIGLEC9, VSIG4, CD74, CD207, LRRC25, SELPLG, AIF1, CD84, IGSF6, CD48, CD33, LST1, TNFAIP8L2(TIPE2), SPI1(PU.1), LILRB2, CCR5, EVI2B, CLEC7A, TBXAS1, SIGLEC7 및 DOCK2 또는 이들의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 여전히 다른 실시형태에서, 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적은 인간 CD53, FERMT3, CD37, CXorf21, CD48 및 CD84 또는 이들의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시형태에서, 단핵구 및/또는 대식세포는 일차 단핵구 및/또는 일차 대식세포이다. 다른 실시형태에서, 단핵구 및/또는 대식세포는 조직 미세환경에 포함된다. 여전히 다른 실시형태에서, 단핵구 및/또는 대식세포는 인간 종양 모델 또는 암의 동물 모델에 포함된다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 포유동물이다. 다른 실시형태에서, 포유동물은 인간이다. 여전히 다른 실시형태에서, 인간은 암을 앓고 있다.
도 1A 내지 도 1C는 상이한 분화 상태로 유도된 대식세포의 표현형 및 형태를 보여준다. 도 1A는 대식세포 분화 후 전형적인 M2 바이오마커의 발현을 보여준다. 도 1B는 대식세포 분화 후 새로운 M2 바이오마커의 발현을 보여준다. 도 1C는 M1- 및 M2c-분화된 대식세포의 형태학적 이미지를 보여준다.
도 2A 내지 도 2Y는 개별 대식세포-관련 표적에 대해 유도된 siRNA에 대한 IC50 곡선을 보여준다.
도 3A 내지 도 3E는 일차 인간 대식세포에서 대식세포-관련 표적의 넉다운 후 표면 표현형 및 형태의 특성화를 보여준다. 이들 도면은 표적 mRNA 넉다운(도 3A), 표적의 세포 표면 발현(도 3B), 전형적인 대식세포 표현형 마커(도 3C), 새로운 대식세포 표현형 마커(도 3D) 및 대식세포 형태(도 3E)에 대한 siRNA-매개성 표적 넉다운의 효과를 보여준다.
도 4A 내지 도 4G는 일차 인간 대식세포에서 대식세포-관련 표적의 저해 후 조절된 대식세포 표현형 및 기능의 특성화를 보여준다. 이들 도면은 M2-스큐잉(skewing) 조건의 존재하에서 전형적인 M2 마커의 감소(도 4A); M2-스큐잉 조건의 존재하에서 새로운 M2 마커(도 4B); M2-스큐잉 조건의 존재하에서 M1 전-염증성 사이토카인의 증가(도 4C); M2-스큐잉 조건 후에 첨가될 때 용량-의존적 방식으로 전형적인 M2 마커의 감소(도 4D); M2-스큐잉 조건 후 첨가될 때 용량-의존적 방식으로 새로운 M2 마커의 감소(도 4E); 및 M2-스큐잉 조건 후에 첨가될 때 M1 전-염증성 사이토카인 생성의 증가(도 4F 및 4G)에 대한 항체-매개성 표적 저해의 효과를 보여준다.
도 5A 내지 도 5C는 포도상구균 장독소 B(Staphylococcal enterotoxin B: SEB) 검정 실험의 결과를 보여준다. 도 5A는 4일 후 CD3+ T 세포의 세포내 사이토카인 염색 결과를 보여준다. 도 5B 및 도 5C는 4일 후 사이토카인 생성 결과를 보여준다.
도 6A 내지 도 6B는 일원(1-way) 혼합 림프구 반응(mixed lymphocyte reaction: MLR) 검정 실험의 결과를 보여준다. 도 6A는 CD8+ T 세포의 세포내 염색 결과를 보여준다. 데이터는 동형 대조군에 대한 배수-변화(fold-change)로 나타내었다. 도 6B는 사이토카인 생성의 결과를 보여준다. 데이터는 동형 대조군에 대한 배수-변화로 나타내었다.
도 7A 내지 도 7B는 다양한 암 유형으로부터의 종양 관련 대식세포(TAM)에 대한 대식세포-관련 표적 발현의 유세포 분석 결과를 보여준다.
도 8A 내지 도 8D는 개별 항체 또는 항체의 조합으로 처리된 6개의 상이한 종양 유형을 나타내는 해리된 종양 샘플 및 종양 슬라이스 샘플로부터의 사이토카인 생성을 보여준다.
도 9A 내지 도 9C는 종양 슬라이스 배양의 결과를 보여준다. 데이터는 폐 종양 슬라이스(도 9A), GI 종양 슬라이스(도 9B) 및 신장 종양 슬라이스(도 9C) 배양에 대한 대조군으로서 동형의 백그라운드에 대한 배수-변화로 나타내었다.
도 10A 내지 도 10C는 종양 내 면역 조성물의 분석 결과를 보여준다. 데이터는 GI 종양(도 10A), 신장 종양(도 10B) 및 항체-처리된 종양 슬라이스의 CD45+ 및 CD3+ 조성(도 10C)에 대해 나타내었다.
도 11은 TAM의 침윤을 나타내는 대식세포(CD11b) 시그니처를 함유하는 종양의 퍼센트를 보여준다.
막대 히스토그램, 곡선 또는 범례와 관련된 기타 데이터를 나타내는 도면의 경우, 각 표시에 대해 왼쪽에서 오른쪽으로 표시되는 막대, 곡선 또는 기타 데이터는 범례의 위에서 아래로의 상자 순서대로 직접 해당된다.
소정의 표적이 단핵구 및/또는 대식세포 염증성 표현형, 분극화, 활성화 및/또는 기능을 조절한다는 것이 본 명세서에서 결정되었다. 따라서, 본 발명은 부분적으로 본 명세서에 기재된 하나 이상의 바이오마커(예를 들어, 표 1, 표 2, 실시예 등에 열거된 표적)의 카피 수, 양 및/또는 활성을 조절하는 방법 및 아래에 더 기재되는 바와 같이 치료, 진단, 예후 예측 및 스크리닝 목적을 위한 바이오마커 및/또는 이의 조절성 작용제의 용도에 관한 것이다.
I. 정의
일부 실시형태에서 용어 "약"은 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 또는 10% 이내를 포함하는 값 또는 측정된 값 사이의 임의의 범위(예를 들어, 플러스 또는 마이너스 2% 내지 6%)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 용어 "약"은 방법, 검정 또는 측정된 값에서 오류의 내재적 변동, 예컨대 실험간에 존재하는 변동을 지칭한다.
용어 "활성화 수용체"는 항원, 복합체화된 항원(예를 들어, 주 조직적합성 복합체(major histocompatibility complex: MHC) 폴리펩타이드의 맥락에서)에 결합하거나 또는 항체에 결합하는 면역 세포 수용체를 포함한다. 이러한 활성화 수용체는 T 세포 수용체(T cell receptor: TCR), B 세포 수용체(B cell receptor: BCR), 사이토카인 수용체, LPS 수용체, 보체 수용체, Fc 수용체 및 다른 ITAM 함유 수용체를 포함한다. 예를 들어, T 세포 수용체는 T 세포 상에 존재하며, CD3 폴리펩타이드와 연관이 있다. T 세포 수용체는 MHC 폴리펩타이드의 맥락에서 항원에 의해(또한 다중클론 T 세포 활성화 시약에 의해) 자극된다. TCR을 통한 T 세포 활성화는 수많은 변화, 예를 들어, 단백질 인산화, 막 지질 변화, 이온 플럭스, 고리형 뉴클레오타이드 변화, RNA 전사 변화, 단백질 합성 변화 및 세포 부피 변화를 초래한다. 사이토카인 수용체 또는 패턴 관련 분자 패턴(pattern associated molecular pattern: PAMP) 수용체와 같은 활성화 수용체를 통한 대식세포의 T 세포 활성화와 유사하게, 단백질 인산화, 표면 수용체 표현형에 대한 변화, 단백질 합성 및 방출뿐만 아니라 형태적 변화와 같은 변화가 발생한다.
용어 "투여하는"은 숙주 및/또는 대상체와 같은 관심있는 생물학적 표적 내로 또는 위로(적절하게)의 작용제의 실제의 물리적 도입과 관련된다. 조성물은 시험관내 또는 생체내에서 세포에 투여(예를 들어, "접촉")될 수 있다. 조성물은 적절한 투여 경로를 통해 생체내에서 대상체에게 투여될 수 있다. 조성물을 숙주로 도입하는 임의의 및 모든 방법이 본 발명에 따라 상정된다. 방법은 임의의 특정 도입 수단에 의존하지 않으며, 그렇게 해석되어서는 안된다. 도입 수단은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 또한 본 명세서에 예시된다. 용어는 작용제가 의도된 기능을 수행할 수 있도록 하는 투여 경로를 포함한다. 사용될 수 있는 신체의 치료를 위한 투여 경로의 예는 주사(피하, 정맥내, 비경구, 복강내, 척추강내 등), 경구, 흡입 및 경피 경로를 포함한다. 주사는 볼루스 주사일 수 있거나, 또는 연속 주입일 수 있다. 투여 경로에 따라, 작용제는 의도된 기능을 수행하기 위한 능력에 해로운 영향을 미칠 수 있는 자연 조건으로부터 보호하기 위해 선택된 물질로 코팅되거나 처리될 수 있다. 작용제는 단독으로 또는 약제학적으로 허용 가능한 담체와 조합하여 투여될 수 있다. 작용제는 또한 생체내에서 활성인 형태로 전환되는 프로드러그로서 투여될 수 있다.
용어 "작용제(agent)"는 화합물, 초분자 복합체, 물질 및/또는 이들의 조합물 또는 혼합물을 지칭한다. 화합물(예를 들어, 분자)은 화학식, 화학 구조 또는 서열로 나타낼 수 있다. 작용제의 대표적인, 비-제한적 예는 예를 들어, 소분자, 폴리펩타이드, 단백질, 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, RNAi 작용제, siRNA, miRNA, piRNA, mRNA, 안티센스 폴리뉴클레오타이드, 압타머 등), 리피드 및 다당류를 포함한다. 일반적으로, 작용제는 당업계에 공지되어 있는 임의의 적합한 방법을 사용하여 얻어질 수 있다. 일부 실시형태에서, 작용제는 대상체(예를 들어, 인간)에서 질환 또는 장애(예를 들어, 암)을 치료하는데 사용하기 위한 "치료제"일 수 있다.
용어 "효능제(agonist)"는 표적(들)(예를 들어, 수용체)에 결합하여 표적(들)의 생물학적 활성을 활성화하거나 증가시키는 작용제를 지칭한다. 예를 들어, "효능제" 항체는 결합하는 항원(들)의 생물학적 활성을 활성화하거나 증가시키는 항체이다.
용어 "변경된 양" 또는 "변경된 수준"은 대조군 샘플에서의 카피 수 또는 발현 수준과 비교하여 바이오마커 핵산의 증가된 또는 감소된 카피 수(예를 들어, 생식세포 및/또는 신체) 또는 관심있는 샘플에서의 증가된 또는 감소된 발현 수준을 포함한다. 용어 바이오마커의 "변경된 양"은 또한 정상의, 대조군 샘플에서 상응하는 단백질 수준과 비교하여 샘플, 예를 들어 암 샘플에서 바이오마커 단백질의 증가된 또는 감소된 단백질 수준을 포함한다. 또한, 바이오마커 단백질의 변경된 양은 바이오마커 단백질의 발현 또는 활성에 영향을 미칠 수 있는 마커의 메틸화 상태와 같은 번역 후 변형을 검출함으로써 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, "변경된 양"은 참조 기준선이 각각 바이오마커의 부재 또는 존재일 수 있기 때문에 바이오마커의 존재 또는 부재를 지칭한다. 바이오마커의 부재 또는 존재는 바이오마커를 측정하기 위해 사용되는 주어진 검정의 민감성의 역치에 따라 결정될 수 있다.
대상체에서 바이오마커의 양은 바이오마커의 양이 양을 평가하기 위해 사용된 검정의 비정규 오차보다 큰 양 및 바람직하게는 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 300%, 350%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000% 이상의 양으로 정상 수준보다 각각 크거나 작은 경우, 바이오마커의 정상적인 양보다 "현저하게(significantly)" 높거나 낮다. 대안적으로, 대상체에서 바이오마커의 양은 그 양이 바이오마커의 정상적인 양보다 각각 적어도 약 2배 및 바람직하게는 적어도 약 3배, 4배 또는 5배 높거나 낮은 경우, 정상적인 양보다 "현저하게" 높거나 낮은 것으로 간주될 수 있다. 이러한 "유의성(significance)"은 또한 발현, 저해, 세포 독성, 세포 성장 등과 같은 본 명세서에 기재된 임의의 다른 측정된 매개변수에 적용될 수 있다.
용어 바이오마커의 "변경된 발현의 수준"은 발현 또는 카피 수를 평가하기 위해 사용된 검정의 비정규 오차보다 크거나 작은 테스트 샘플, 예를 들어, 암으로 고통받고 있는 환자로부터 유래된 샘플에서의 바이오마커의 발현 수준 또는 카피 수, 바람직하게는 대조군 샘플(예를 들어, 관련 질환을 가지지 않은 건강한 대상체로부터의 샘플)에서의 바이오마커의 적어도 2배 및 더욱 바람직하게는 3배, 4배, 5배 또는 10배 이상의 발현 수준 또는 카피 수, 바람직하게는 여러 대조군 샘플에서의 바이오마커의 평균 발현 수준 또는 카피 수를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 바이오마커의 수준은 바이오마커 수준 그 자체, 변형된 바이오마커(예를 들어, 인산화된 바이오마커)의 수준 또는 대조군과 같은 다른 측정된 변수에 대한 바이오마커의 수준(예를 들어, 비인산화된 바이오마커에 대한 인산화된 바이오마커)을 지칭한다. 용어 "발현"은 핵산(예를 들어, DNA)이 전사되어 RNA를 생성하는 과정을 포함하며, 또한 RNA 전사체가 가공되어 폴리펩타이드로 번역되는 과정을 지칭할 수 있다. 핵산 및 이들의 폴리펩타이드 대응물(있는 경우)의 발현의 합계는 표 1 및/또는 표 2에 열거된 하나 이상의 표적과 같은 바이오마커의 양에 기여한다.
용어 바이오마커의 "변경된 활성"은 정상의, 대조군 샘플에서의 바이오마커의 활성과 비교하여 질환 상태, 예를 들어 암 샘플, 또는 치료된 상태에서 증가되거나 감소된 바이오마커의 활성을 지칭한다. 바이오마커의 변경된 활성은 예를 들어, 바이오마커의 변경된 발현, 바이오마커의 변경된 단백질 수준, 바이오마커의 변경된 구조 또는 예를 들어, 바이오마커로서 동일하거나 상이한 경로에 연관된 다른 단백질과의 변경된 상호작용, 또는 전사 활성인자 또는 저해제와의 변경된 상호작용의 결과일 수 있다.
용어 바이오마커의 "변경된 구조"는 바이오마커 핵산 또는 단백질 내의 돌연변이 또는 대립유전자 변이체, 예를 들어 정상 또는 야생형 유전자 또는 단백질과 비교하여 바이오마커 핵산 또는 단백질의 발현 또는 활성에 영향을 미치는 돌연변이의 존재를 지칭한다. 예를 들어, 돌연변이는 치환, 결실 또는 부가 돌연변이를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 돌연변이는 바이오마커 핵산의 코딩 영역 또는 논-코딩 영역에 존재할 수 있다.
용어 바이오마커의 "변경된 세포내 국재화"는 세포 내에서, 예를 들어 건강한 및/또는 야생형 세포 내에서의 정상적인 국재화와 비교하여 세포 내에서의 바이오마커의 잘못된 국재화를 지칭한다. 마커의 정상적인 국재화의 표시는 바이오마커 폴리펩타이드가 속하는 분야에서 공지된 세포내 국재화 모티프의 분석을 통해 결정될 수 있다.
용어 "길항제(antagonist)" 또는 "차단제(blocking)"는 작용제 표적(들)(예를 들어, 수용체)에 결합하여 표적(들)의 생물학적 활성을 저해하거나 감소시키는 작용제를 지칭한다. 예를 들어, "길항제" 항체는 결합하는 항원(들)의 생물학적 활성을 현저하게 저해하거나 감소시키는 항체이다.
본 명세서 내에서 달리 명시되지 않는 한, 용어 "항체" 및 "항체들"은 광범위하게 항체의 자연 발생적 형태(예를 들어, IgG, IgA, IgM, IgE) 및 재조합 항체, 예컨대 단일-쇄 항체, 키메라 및 인간화된 항체 및 다중-특이성 항체뿐만 아니라 전술한 것들 모두의 단편, 융합 단백질 및 유도체를 포함하며, 단편 및 유도체는 적어도 항원성 결합 부위를 갖는다. 항체 유도체는 항체에 접합된 단백질 또는 화학 모이어티를 포함할 수 있다.
또한, "인트라바디(intrabody)"는 항체의 특성을 갖지만, 관심있는 세포내 표적에 결합하고/하거나 이를 저해하기 위해 세포 내에서 발현될 수 있는 잘 알려진 항원-결합 분자의 유형이다(문헌[Chen et al. (1994) Human Gene Ther. 5:595-601]). 단일-쇄 항체(scFv)의 사용, 초안정성을 위한 면역글로불린 VL 도메인의 변형, 감소하는 세포내 환경에 저항하기 위한 항체의 변형, 세포내 안정성을 증가시키고/시키거나 세포내 국재화를 조절하는 융합 단백질의 생성 등과 같은, 세포내 모이어티를 표적화(예를 들어, 저해)하기 위해 항체를 적응시키기 위한 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 세포내 항체는 예를 들어, 예방적 및/또는 치료적 목적(예를 들어, 유전자 요법으로서)을 위해, 다세포 유기체의 하나 이상의 세포, 조직 또는 장기로 도입되고 발현될 수 있다(적어도 PCT 공개 WO 08/020079, WO 94/02610, WO 95/22618 및 WO 03/014960; 미국 특허 제7,004,940호; 문헌[Cattaneo and Biocca (1997)　Intracellular Antibodies: Development and Applications (Landes and Springer-Verlag publs.); Kontermann (2004) Methods 34:163-170; Cohen et al. (1998) Oncogene 17:2445-2456; Auf der Maur et al. (2001) FEBS Lett. 508:407-412; Shaki-Loewenstein et al. (2005) J. Immunol. Meth. 303:19-39] 참조).
용어 "바이오마커"는 단핵구 및/또는 대식세포에서의 관심있는 표현형과 같은 관심있는 하나 이상의 표현형의 조절을 위한 표적인 유전자 또는 유전자 산물을 지칭한다. 이러한 맥락에서, 용어 "바이오마커"는 "표적"과 동의어이다. 일부 실시형태에서, 그러나, 이 용어는 관심있는 결과물, 예컨대 (예를 들어, 염증성 표현형, 암 상태 등을 조절하기 위한) 하나 이상의 진단적, 예후 예측적 및/또는 치료적 결과물을 나타내는 것으로 결정된 표적의 측정 가능한 독립체(entity)를 더 포함한다. 바이오마커는 제한 없이 핵산(예를 들어, 게놈 핵산 및/또는 전사된 핵산) 및 단백질, 특히 표 1 및 표 2에 열거된 것들을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 이러한 표적은 표 1에 나타낸 염증성 표현형, 면역 반응 및/또는 T 세포-매개성 세포 독성의 음성 조절인자 및/또는 표 2에 나타낸 염증성 표현형, 면역 반응 및/또는 T 세포-매개성 세포 독성의 양성 조절인자이다.
용어 "암" 또는 "종양" 또는 "과증식성"은 암-유발 세포의 전형적인 특징, 예컨대 제어되지 않는 증식, 불멸성, 침습 또는 전이 가능성, 빠른 성장 및 소정의 특징적인 형태학적 특징을 갖는 세포의 존재를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 이러한 세포는 면역관문 단백질, 예컨대 PD-1, PD-L1, PD-L2 및/또는 CTLA-4의 발현 및 활성으로 인해 부분적으로 또는 전체적으로 이러한 특성을 나타낸다.
암 세포는 종종 종양의 형태로 존재하지만, 이러한 세포는 동물 내에서 단독으로 존재할 수 있거나, 또는 백혈병 세포와 같은 비-종양성 암 세포일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "암"은 전암성뿐만 아니라 악성 암을 포함한다. 암은 다양한 암, 방광(가속화되고 전이성인 방광암을 포함), 유방, 결장(결장직장암을 포함), 신장, 간, 폐(소세포 및 비-소세포 폐암 및 폐 선암종을 포함), 난소, 전립선, 고환, 비뇨 생식기, 림프계, 직장, 후두, 췌장(외분비성 췌장 암종을 포함), 식도, 위, 담낭, 자궁경부, 갑상선 및 피부(편평세포 암종을 포함)의 것들을 포함하는 암종; 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병, B-세포 림프종, T-세포 림프종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 모발상 세포 림프종, 조직세포 림프종 및 버킷 림프종을 포함하는 림프성 계통의 혈액학적 종양; 급성 및 만성 골수성 백혈병, 골수이형성 증후군, 골수성 백혈병 및 전골수성 백혈병을 포함하는 골수성 계통의 혈액학적 종양; 성상세포종, 신경모세포종, 신경교종 및 신경초종을 포함하는 중추 및 말초 신경계의 종양; 섬유육종, 횡문근 육종 및 골육종을 포함하는 중간엽 기원의 종양; 흑색종, 색소성 건피증, 각화 상피 종양, 정상피종, 갑상선 여포암 및 기형암종을 포함하는 기타 종양; 흑색종, 절제 불가능한 III 또는 IV기의 악성 흑색종, 편평세포 암종, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 신경교종, 위장관암, 콩팥암, 난소암, 간암, 결장직장암, 자궁내막암, 신장암, 전립선암, 갑상선암, 신경모세포종, 췌장암, 다발성 교모세포종, 자궁경부암, 위암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장 암종 및 두경부암, 위장암, 생식세포 종양, 골암, 골 종양, 성인의 뼈의 악성 섬유성 조직구증; 유년기의 뼈의 악성 섬유성 조직구증, 육종, 소아 육종, 부비강 자연 살해, 신생물, 형질세포 신생물; 골수이형성 증후군; 신경모세포종; 고환 생식세포 종양, 안구내 흑색종, 골수이형성 증후군; 골수이형성/골수증식성 질환, 활액 육종, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병, 필라델피아 세포 주기 양성 급성 림프아구성 백혈병(Ph+ALL), 다발성 골수종, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 비만 세포증과 관련된 비만 세포증 및 임의의 증상 및 이들의 임의의 전이를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 또한, 장애는 다른 암 외에도 색소성 두드러기, 인간에서의 미만성 피부 비만 세포증, 고립성 비만세포종뿐만 아니라 개의 비만세포종 및 수포성, 홍피성 및 말초혈관 확장성 비만 세포증과 같은 일부 희귀한 아형, 골수증식성 또는 골수이형성 증후군 또는 급성 백혈병과 같은 혈액학적 장애와 관련된 비만 세포증과 같은 비만 세포증, 비만 세포증, 비만 세포 백혈병과 관련된 골수증식성 장애를 포함한다. 다른 암은 또한 다음을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 장애의 범위 내에 포함된다: 편평세포 암종을 포함하는, 방광, 요로상피 암종, 유방, 결장, 신장, 간, 폐, 난소, 췌장, 위, 자궁경부, 갑상선, 고환, 특히 고환 정상피종 및 피부의 것들을 포함하는 암종; 위장관 기질 종양("GIST(gastrointestinal stromal tumors)"); 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병, B-세포 림프종, T-세포 림프종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 모발상 세포 림프종 및 버킷 림프종을 포함하는 림프성 계통의 혈액학적 종양; 급성 및 만성 골수성 백혈병 및 전골수성 백혈병을 포함하는 골수성 계통의 혈액학적 종양; 섬유육종 및 횡문근 육종을 포함하는 중간엽 기원의 종양; 흑색종, 정상피종, 기형암종, 신경모세포종 및 신경교종을 포함하는 기타 종양; 성상세포종, 신경모세포종, 신경교종 및 신경초종을 포함하는 중추 및 말초 신경계의 종양; 섬유육종, 횡문근 육종 및 골육종을 포함하는 중간엽 기원의 종양; 및 흑색종, 색소성 건피증, 각화 상피 종양, 정상피종, 갑상선 여포암, 기형암종, 화학요법 불응성 비-정상피종성 생식세포 종양 및 카포시 육종을 포함하는 기타 종양 및 이들의 임의의 전이. 본 발명에 포함되는 방법을 적용할 수 있는 암의 유형의 다른 비-제한적 예는 인간 육종 및 암종, 예를 들어, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골원성 육종, 척삭종, 혈관육종, 내피육종, 림프관육종, 림프관 내피육종, 윤활막종, 중피종, 유잉 종양, 평활근육종, 횡문근 육종, 편평세포 암종, 기저세포 암종, 선암종, 땀샘 암종, 피지선 암종, 유두 암종, 유두 선암종, 낭샘암종, 수질 암종, 기관지 암종, 신세포 암종, 간세포암, 담관 암종, 융모막 암종, 정상피종, 배아 암종, 윌름스 종양, 골암, 뇌 종양, 폐 암종(폐 선암종을 포함), 소세포 폐 암종, 방광 암종, 상피 암종, 신경교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경 종양, 희소돌기 신경교종, 수막종, 흑색종, 신경모세포종, 망막모세포종; 백혈병, 예를 들어 급성 림프구성 백혈병 및 급성 골수성 백혈병(골수아구성, 전골수성, 골수단핵구성, 단핵구성 및 적백혈병); 만성 백혈병(만성 골수성(과립구성) 백혈병 및 만성 림프구성 백혈병); 및 진성다혈구증, 림프종(호지킨 질환 및 비-호지킨 질환), 다발성 골수종, 발덴스트롬 거대글로불린혈증 및 중쇄 질환을 포함한다. 일부 실시형태에서, 암은 사실상 상피이며, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장 암, 부인암, 콩팥암, 후두암, 폐암, 구강암, 두경부암, 난소암, 췌장암, 전립선암 또는 피부암을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 상피 암은 비-소세포 폐암, 비유두형 신세포 암종, 자궁경부 암종, 난소 암종(예를 들어, 장액성 난소 암종) 또는 유방암종이다. 상피 암은 장액성, 자궁내막성, 점액성, 투명 세포, 브렌너 또는 비분화를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다양한 다른 방식으로 특성화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 암은 (진행성) 비-소세포 폐암, 흑색종, 두경부 편평세포 암, (진행성) 요로상피 방광암, (진행성) 신장암(RCC), 현미부수체 불안정성 암, 전형적인 호지킨 림프종, (진행성) 위장암, (진행성) 자궁경부암, 일차 종격동 B-세포 림프종, (진행성) 간세포성 암종 및 (진행성) 메르켈 세포 암종으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
용어 "코딩 영역(coding region)"은 아미노산 잔기로 번역되는 코돈을 포함하는 뉴클레오타이드 서열의 영역을 지칭하는 반면, 용어 "논코딩 영역(noncoding reagion)"은 아미노산으로 번역되지 않는 뉴클레오타이드 서열의 영역(예를 들어, 5' 및 3' 비번역 영역)을 지칭한다.
용어 "상보성(complementary)"은 2개의 핵산 가닥의 영역 사이 또는 동일한 핵산 가닥의 2개의 영역 사이의 서열 상보성의 광범위한 개념을 지칭한다. 제1 핵산 영역의 아데닌 잔기는 잔기가 티민 또는 우라실인 경우, 제1 영역에 역평행인 제2 핵산 영역의 잔기와 특정 수소 결합("염기쌍 형성(base pairing)")을 형성할 수 있는 것으로 알려져 있다. 유사하게는, 제1 핵산 가닥의 사이토신 잔기는 잔기가 구아닌인 경우, 제1 가닥에 역평행인 제2 핵산 가닥의 잔기와 염기쌍을 형성할 수 있는 것으로 알려져 있다. 핵산의 제1 영역은 2개의 영역이 역평행 방식으로 배열될 때 제1 영역의 적어도 하나의 뉴클레오타이드 잔기가 제2 영역의 잔기와 염기쌍을 형성할 수 있는 경우, 동일하거나 상이한 핵산의 제2 영역에 상보적이다. 바람직하게는, 제1 영역은 제1 부분을 포함하고 제2 영역은 제2 부분을 포함하며, 이에 의해, 제1 부분 및 제2 부분이 역평행 방식으로 배열될 때, 적어도 약 50% 및 바람직하게는 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9% 이상의 제1 부분의 뉴클레오타이드 잔기는 제2 부분의 뉴클레오타이드 잔기와 염기쌍을 형성할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 제1 부분의 모든 뉴클레오타이드 잔기는 제2 부분의 뉴클레오타이드 잔기와 염기쌍을 형성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상보적 폴리뉴클레오타이드는 "충분히 상보적(sufficietly complementary)"일 수 있거나, 또는 "충분한 상보성(sufficient complementarity)", 즉, 듀플렉스(duplex)를 유지하고/하거나 목적하는 활성을 갖기에 충분한 상보성을 가질 수 있다. 예를 들어, RNAi 작용제의 경우에, 이러한 상보성은 mRNA의 번역을 부분적으로 또는 완전하게 방지하기에 충분한 작용제 및 표적 mRNA 사이의 상보성이다. 예를 들어, "표적-특이적 RNA 간섭(RNAi)를 지시하기 위해 표적 mRNA 서열에 충분히 상보적인 서열"을 갖는 siRNA는 siRNA가 RNAi 기구 또는 과정에 의해 표적 mRNA의 파괴를 촉발하기에 충분한 서열을 가짐을 의미한다.
용어 "실질적으로 상보적인(substantially compolementary)"은 2개의 핵산 사이의 염기쌍이 형성된 이중 가닥 영역에서의 상보성을 지칭하며, 2개의 이중 가닥 영역 사이의 말단 오버행 또는 갭 영역과 같은 임의의 단일 가닥 영역이 아니다. 상보성은 완벽할 필요는 없으며; 임의의 수의 염기쌍 불일치가 있을 수 있다. 일부 실시형태에서, 2개의 서열이 본 명세서에서 "실질적으로 상보적"이라고 지칭되는 경우, 이는 서열이 선택된 반응 조건하에서 혼성화하기에 충분히 서로 상보적임을 의미한다. 따라서, 실질적으로 상보적인 서열은 이중 가닥 영역에서 적어도 100%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94, 93%, 92%, 91%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60% 이상, 또는 임의의 수의 염기쌍 상보성을 갖는 서열을 지칭할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "연합 요법(conjoint therapy)" 및 "병용 요법(combination therapy)"은 2개 이상의 치료제, 예를 들어 표 1에 열거된 하나 이상의 표적의 조절인자의 조합, 표 2에 열거된 하나 이상의 표적의 조절인자의 조합, 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 적어도 하나의 조절인자와 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 적어도 하나의 조절인자의 조합, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 적어도 하나의 조절인자와 면역관문 요법 등과 같은 추가적인 치료제의 조합, 및 이들의 조합의 투여를 지칭한다. 병용 요법을 포함하는 상이한 작용제는 다른 작용제 또는 다른 작용제들의 투여와 함께, 그 이전에, 또는 그 이후에 투여될 수 있다. 병용 요법은 이러한 치료제의 공동 작용으로부터 유익한(추가적 또는 시너지) 효과를 제공하기 위한 것이다. 이들 치료제의 병용 투여는 정의된 기간(선택된 조합에 따라 일반적으로 분, 시간, 일 또는 주)에 걸쳐 수행될 수 있다. 병용 요법에서, 병용 치료제는 순차적 방식으로 또는 실질적으로 동시 적용에 의해 적용될 수 있다.
용어 "대조군"은 테스트 샘플에서 발현 산물과의 비교를 제공하기에 적합한 임의의 참조 비정규물질을 지칭한다. 일 실시형태에서, 대조군은 발현 산물 수준이 검출되고, 테스트 샘플로부터의 발현 산물 수준과 비교되는 "대조군 샘플"을 수득하는 것을 포함한다. 이러한 대조군 샘플은 단핵구 및/또는 대식세포를 갖는 대상체 및/또는 알려진 결과를 갖는 대조군 암 환자(보관된 샘플 또는 이전의 샘플 측정값일 수 있음)와 같은 대상체; 정상의 환자 또는 암 환자와 같은 대상체로부터 단리된 정상 조직 또는 세포, 정상의 대상체 또는 암 환자와 같은 대상체로부터 단리된 배양된 일차 세포/조직, 암 환자의 동일한 장기 또는 신체 위치로부터 수득된 인접 정상 세포/조직, 정상의 대상체로부터 단리된 조직 또는 세포 샘플 또는 기탁소로부터 얻은 일차 세포/조직으로부터의 샘플을 포함하지만 이로 제한되지 않는 임의의 적합한 샘플을 포함할 수 있다. 다른 바람직한 실시형태에서, 대조군은 하우스키핑 유전자, 정상 조직(또는 다른 이전에 분석된 대조군 샘플)으로부터의 발현 산물 수준 범위, 소정의 결과(예를 들어, 1년, 2년, 3년, 4년 등의 생존 기간 등)를 갖거나 소정의 치료(예를 들어, 비정규의 암 케어 요법)를 받고 있는 환자의 그룹 또는 일련의 환자로부터의 테스트 샘플 내의 이전에 결정된 발현 산물 수준 범위를 포함하지만 이로 제한되지 않는 임의의 적합한 공급원으로부터의 참조 비정규물질의 발현 산물 수준을 포함할 수 있다. 이러한 대조군 샘플 및 참조 비정규물질의 발현 산물 수준은 본 발명에 포함되는 방법에서 대조군으로서 조합하여 사용될 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다. 일 실시형태에서, 대조군은 정상적인 또는 비-암성 세포/조직 샘플을 포함할 수 있다. 다른 바람직한 실시형태에서, 대조군은 일련의 환자, 예컨대 일련의 암 환자 또는 소정의 치료를 받고 있는 일련의 암 환자 또는 하나의 결과 대 다른 결과를 갖는 일련의 환자에 대한 발현 수준을 포함할 수 있다. 전자의 경우에, 각각의 환자의 특정 발현 산물 수준은 발현의 백분위수(percentile) 수준으로 지정되거나 또는 참조 비정규물질의 발현 수준의 평균 또는 평균보다 높거나 낮게 표현될 수 있다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, 대조군은 정상적인 세포, 병용 화학요법으로 치료된 환자로부터의 세포 및 양성 암을 갖는 환자로부터의 세포를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 대조군은 또한 측정된 값, 예를 들어 동일한 집단에서의 하우스키핑 유전자의 발현 수준과 비교한 집단에서의 특정 유전자의 발현의 평균 수준을 포함할 수 있다. 이러한 집단은 정상적인 대상체, 임의의 치료를 받지 않은(즉, 치료 경험이 없는(treatment naive)) 암 환자, 비정규의 케어 요법을 받은 암 환자 또는 양성 암을 갖는 환자를 포함할 수 있다. 다른 바람직한 실시형태에서, 대조군은 테스트 샘플에서 2개의 유전자의 발현 산물 수준의 비를 결정하고, 이를 참조 표준물질에서 동일한 2개의 유전자의 임의의 적합한 비와 비교하는 것; 테스트 샘플에서 2개 이상의 유전자의 발현 산물 수준을 결정하고 임의의 적합한 대조군에서 발현 산물 수준의 차이를 결정하는 것; 및 테스트 샘플에서 2개 이상의 유전자의 발현 산물 수준을 결정하고, 테스트 샘플에서 하우스키핑 유전자의 발현에 대해 이들의 발현을 정규화하고, 임의의 적합한 대조군과 비교하는 것을 포함하지만 이로 제한되지 않는 발현 산물 수준의 비 변환(ratio transformation)을 포함한다. 특히 바람직한 실시형태에서, 대조군은 테스트 샘플과 동일한 계통 및/또는 유형의 대조군 샘플을 포함한다. 다른 실시형태에서, 대조군은 암을 가진 모든 환자와 같은 일련의 환자 샘플 내에서 또는 이에 기초하여 백분위수로 그룹화된 발현 산물 수준을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 예를 들어, 특정 백분위수에 비해 더 높거나 낮은 수준의 발현 산물이 결과 예측을 위한 기초로서 사용되는 대조군 발현 산물 수준이 확립된다. 다른 바람직한 실시형태에서, 대조군 발현 산물 수준은 공지된 결과를 갖는 암 대조군 환자로부터의 발현 산물 수준을 사용하여 확립되며, 테스트 샘플로부터의 발현 산물 수준은 결과를 예측하기 위한 기초로서 대조군 발현 산물 수준과 비교된다. 본 발명에 포함되는 방법은 테스트 샘플에서 발현 산물의 수준을 대조군과 비교할 때 특정 컷-오프 지점(cut-off point)의 사용으로 제한되지 않는다.
바이오마커 핵산의 "카피 수(copy number)"는 특정 유전자 산물을 암호화하는 세포(예를 들어, 생식세포 및/또는 신체)에서의 DNA 서열의 수를 지칭한다. 일반적으로, 주어진 유전자에 대해, 포유동물은 각 유전자의 두 카피를 갖는다. 그러나, 카피 수는 유전자 증폭 또는 복제에 의해 증가되거나 또는 결실에 의해 감소될 수 있다. 예를 들어, 생식세포 카피 수 변화는 하나 이상의 게놈 유전자좌에서의 변화를 포함할 수 있되, 상기 하나 이상의 게놈 유전자좌는 대조군에서 생식세포 카피의 정상 보체에서의 카피 수(예를 들어, 특정 생식세포 DNA 및 상응하는 카피 수가 결정된 것과 동일한 종에 대한 생식세포 DNA에서의 정상 카피 수)에 의해 설명되지 않는다. 체세포 카피 수 변화는 하나 이상의 게놈 유전자좌에서의 변화를 포함하되, 상기 하나 이상의 게놈 유전자좌는 대조군의 생식세포 DNA의 카피 수(예를 들어, 체세포 DNA 및 상응하는 카피 수가 결정된 것과 동일한 대상체에 대한 생식세포 DNA에서의 카피 수)에 의해 설명되지 않는다.
용어 "사이토카인"은 면역 체계의 소정의 세포에 의해 분비된 물질을 지칭하며, 다른 세포에 생물학적 효과가 있다. 사이토카인은 인터페론, 인터류킨 및 성장 인자와 같은 다수의 상이한 물질일 수 있다.
용어 "대상체에게 적합한 치료 양생법을 결정하는 것"은 본 발명에 포함되는 바이오마커-매개성 분석의 결과에 기초하거나 또는 본질적으로 기초하거나 또는 적어도 부분적으로 기초하여 시작, 수정 및/또는 종료된 대상체에 대한 치료 양생법(즉, 대상체에서 암의 예방 및/또는 치료를 위해 사용되는 단일 요법 또는 상이한 요법의 조합)의 결정을 의미하는 것으로 간주된다. 하나의 예는 하나 이상의 바이오마커를 조절하는 본 발명에 포함되는 작용제를 사용하는 요법을 제공하기 위해 암에 대한 표적화 요법을 제공할지 여부를 결정하는 것이다. 다른 예는 재발의 위험을 줄이는 것이 목적인 수술 후 보조 요법을 시작하는 것이다. 여전히 다른 예는 특정 화학요법의 용량을 수정하는 것이다. 결정은 본 발명에 따른 분석 결과에 추가하여, 치료될 대상체의 개인 특성에 기초할 수 있다. 대부분의 경우, 대상체에 대한 적합한 치료 양생법의 실제 결정은 주치의 또는 의사에 의해 수행될 것이다.
용어 "내독소가 없는(endotoxin-free)" 또는 "실질적으로 내독소가 없는(substantially endotoxin-free)"은 내독소를 가장 미량(예를 들어, 대상체에 대해 임상적으로 불리한 생리학적 효과를 갖지 않는 양)으로, 바람직하게는 내독소를 검출 불가능한 양으로 함유하는 조성물, 용매 및/또는 용기를 지칭한다. 내독소는 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes)와 같은 그람-양성 박테리아에서 발견될 수 있지만, 내독소는 소정의 박테리아, 전형적으로 그람-음성 박테리아와 관련된 독소이다. 가장 널리 퍼져 있는 내독소는 다양한 그람-음성 박테리아의 외막에서 발견되는 리포폴리사카라이드(LPS) 또는 리포-올리고-사카라이드(lipo-oligo-saccharide: LOS)이며, 이는 이러한 박테리아가 질환을 유발하는 능력의 중심이 되는 병원균성 특징을 나타낸다. 인간에서 소량의 내독소는 다른 불리한 생리학적 효과 중에서도 열, 혈압의 강하 및 염증과 응고의 활성화를 유발할 수 있다. 따라서, 의약품 생산에 있어서, 소량이라도 인간에게 부작용을 일으킬 수 있기 때문에, 의약품 및/또는 약물 용기로부터 대부분 또는 미량의 내독소를 제거하는 것이 종종 바람직하다. 대부분의 내독소를 분해하기 위해 전형적으로 300℃를 초과하는 온도가 필요하므로, 이러한 목적을 위해 발열원 제거 오븐(depyrogenation oven)이 사용될 수 있다. 예를 들어, 주사기 또는 바이알과 같은 일차 패키징 물질을 기준으로, 250℃의 유리 온도와 30분의 유지 시간의 조합은 종종 내독소 수준을 3 로그 감소시키기에 충분하다. 예를 들어, 본 명세서에 기재되고 당업계에 공지되어 있는 것과 같은 크로마토그래피 및 여과 방법을 포함하는 내독소를 제거하는 다른 방법이 상정된다. 내독소는 당업계에 공지되어 있는 일상적인 기법을 사용하여 검출될 수 있다. 예를 들어, 투구게로부터의 혈액을 활용하는 투구게 변형세포 용해물(Limulus amoebocyte lysate) 검정은 내독소의 존재를 검출하기에 매우 민감한 검정이다. 이러한 테스트에서, 매우 낮은 수준의 LPS는 이러한 반응을 증폭시키는 강력한 효소적 캐스케이드로 인해 투구게 용해물의 검출 가능한 응고를 유발할 수 있다. 내독소는 또한 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA)에 의해 정량화될 수 있다. 실질적으로 내독소가 없기 위해서, 내독소 수준은 약 0.001, 0.005, 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.08, 0.09, 0.1, 0.5, 1.0, 1.5, 2, 2.5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 EU/㎖ 미만 또는 0.05 내지 10 EU/㎖와 같은 범위를 포함하는 그 사이의 임의의 범위일 수 있다. 전형적으로, 1ng의 리포폴리사카라이드(LPS)는 약 1 내지 10 EU에 해당한다.
용어 "발현 시그니처(expression signature)" 또는 "시그니처(signature)"는 관심있는 상태를 나타내는 하나 이상의 발현된 바이오마커의 그룹을 지칭한다. 예를 들어, 이러한 시그니처를 구성하는 유전자, 단백질 등은 특정 세포 계통, 분화 단계에서 또는 특정 생물학적 반응 중에 발현될 수 있다. 바이오마커는 세포의 염증성 상태, 암의 기원 세포, 생검에서 비-악성 세포의 특성 및 암의 원인이 되는 종양발생 메커니즘과 같이 종양이 발현되는 생물학적 양태를 반영할 수 있다. 발현 데이터 및 유전자 발현 수준은 컴퓨터 판독 가능 매체, 예를 들어 마이크로어레이 또는 칩 판독 장치와 함께 사용되는 컴퓨터 판독 가능 매체에 저장될 수 있다. 이러한 발현 데이터는 발현 시그니처를 생성하기 위해 조작될 수 있다.
용어 "유전자"는 기능을 갖는 분자(예를 들어, RNA, 단백질 등)를 암호화하는 뉴클레오타이드(예를 들어, DNA) 서열을 포함한다. 유전자는 일반적으로 2개의 상보적 뉴클레오타이드 가닥(즉, dsDNA), 코딩 가닥 및 논-코딩 가닥을 포함한다. DNA 전사를 언급할 때, 코딩 가닥은 (티민은 우라실로 대체되지만) 염기 서열이 생성된 RNA 전사체의 염기 서열과 상응하는 DNA 가닥이다. 코딩 가닥은 코돈을 함유하는 반면, 논-코딩 가닥은 안티코돈을 함유한다. 전사하는 동안, RNA Pol II는 논-코딩 가닥에 결합하고, 안티-코돈을 읽고, 이들의 서열을 전사하여 상보적 염기를 갖는 RNA 전사체를 합성한다. 일부 실시형태에서, 열거된 유전자 서열(즉, DNA 서열)은 코딩 가닥의 서열이다.
용어 "유전자 산물"(본 명세서에서 "유전자 발현 산물" 또는 "발현 산물"로도 지칭됨)은 유전자의 발현으로부터 생성된 생성물, 예컨대 유전자로부터 전사된 핵산(예를 들어, mRNA) 및 이러한 mRNA의 번역으로부터 발생하는 폴리펩타이드 또는 단백질을 포함한다. 소정의 유전자 산물은 예를 들어, 세포에서 가공 또는 변형될 수 있음이 이해될 것이다. 예를 들어, mRNA 전사체는 번역 전에 스플라이싱, 폴리아데닐화 등을 겪고/겪거나 폴리펩타이드는 동시 번역 또는 번역 후 가공, 예컨대 분비 신호 서열의 제거, 세포 기관 표적화 서열의 제거 또는 인산화, 글리코실화, 메틸화, 지방 아실화 등과 같은 변형을 겪을 수 있다. 용어 "유전자 산물"은 이러한 가공된 또는 변형된 형태를 포함한다. 인간을 포함하는 다양한 종으로부터의 게놈 mRNA 및 폴리펩타이드 서열은 당업계에 공지되어 있으며, 미국 국립생물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information)(ncbi.nih.gov) 또는 보편적 단백질 자료(uniprot.org)로부터 이용할 수 있는 것들과 같이 공개적으로 접근할 수 있는 데이터베이스에서 이용할 수 있다. 다른 데이터베이스는 예를 들어, GenBank, RefSeq, Gene, UniProtKB/SwissProt, UniProtKB/Trembl 등을 포함한다. 일반적으로, NCBI 참조 서열 데이터베이스의 서열이 관심있는 유전자에 대한 유전자 산물 서열로 사용될 수 있다. 유전자의 다중 대립 유전자가 동일한 종의 개체 사이에 존재할 수 있음이 이해될 것이다. 예를 들어, 대안적 RNA 스플라이싱 또는 편집의 결과로서, 소정의 단백질의 여러 동형 단백질이 존재할 수 있다. 일반적으로, 본 개시내용의 양태가 유전자 또는 유전자 산물에 관련되는 경우, 달리 나타내지 않는 한, 적용 가능한 경우, 대립유전자 변이체 또는 동형 단백질과 관련된 실시형태가 포함된다. 소정의 실시형태는 특정 서열(들), 예를 들어, 특정 대립유전자(들) 또는 동형 단백질(들)에 대한 것일 수 있다.
용어 "생성하는"은 직접 또는 간접적인 작용에 의해서와 같이 목적하는 결과가 달성되는 임의의 방식을 포함한다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 조절된 표현형을 갖는 세포는 본 명세서에 기재된 하나 이상의 바이오마커를 조절하는 적어도 하나의 작용제와의 접촉과 같은 직접적인 작용에 의해 및/또는 목적하는 물리적, 유전적 및/또는 표현형 속성을 갖는 세포를 번식시키는 것과 같은 간접적인 작용에 의해 생성될 수 있다.
세포 바이오마커 발현과 관련하여 용어 "높은", "낮은", "중간" 및 "음성"은 하나 이상의 참조 세포에 의한 바이오마커의 세포 발현에 대해 발현된 바이오마커의 양을 지칭한다. 바이오마커 발현은 하나 이상의 바이오마커 게놈 핵산, 리보핵산 및/또는 폴리펩타이드의 세포 수준, 활성, 구조 등의 분석을 포함하지만 이에 제한되지 않는 본 명세서에 기재된 임의의 방법에 따라 결정될 수 있다. 일 실시형태에서, 이 용어는 각각 고도, 중간 또는 최저 수준으로 바이오마커를 발현하는 세포 집단의 정의된 퍼센트를 지칭한다. 이러한 퍼센트는 바이오마커를 고도로 발현하거나 약하게 발현하는 세포의 집단의 상위 0.1%, 0.5%, 1.0%, 1.5%, 2.0%, 2.5%, 3.0%, 3.5%, 4.0%, 4.5%, 5.0%, 5.5%, 6.0%, 6.5%, 7.0%, 7.5%, 8.0%, 8.5%, 9.0%, 9.5%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15% 이상 또는 그 사이의 임의의 범위까지로 정의될 수 있다. 용어 "낮은"은 이러한 세포가 바이오마커 발현에 대해 "음성"이기 때문에, 바이오마커를 검출 가능하게 발현하지 않는 세포를 제외한다. 용어 "중간"은 바이오마커를 발현하지만, "높은" 수준으로 이를 발현하는 집단보다 낮은 수준의 세포를 포함한다. 다른 실시형태에서, 용어는 또한 정성적 또는 통계학적 플롯 영역에 의해 확인된 바이오마커 발현의 세포 집단을 지칭할 수 있거나 대안적으로 지칭할 수 있다. 예를 들어, 유세포 분석을 사용하여 분류된 세포 집단은 당업계에 잘 알려진 방법에 따라 평균 형광 세기 등과 같은 검출 가능한 모이어티 분석에 기초하여 별개의 플롯을 확인함으로써 바이오마커 발현 수준에 기초하여 구별될 수 있다. 이러한 플롯 영역은 관심있는 바이오마커에 대해 당업계에 잘 알려진 방법에 기초하여 수, 모양, 중첩 등에 따라 개량될 수 있다. 여전히 다른 실시형태에서, 용어는 또한 추가적인 바이오마커에 대한 발현의 존재 또는 부재에 따라 결정될 수 있다.
용어 "실질적으로 동일한"은 예를 들어, 아래에 기재된 방법을 사용하여 최적으로 정렬될 때, 제2 핵산 또는 아미노산 서열과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 공유하는 핵산 또는 아미노산 서열을 지칭한다. "실질적 동일성"은 서열, 예컨대 전장 서열, 기능성 도메인, 코딩 및/또는 조절 서열, 엑손, 인트론, 프로모터 및 게놈 서열의 다양한 유형 및 길이를 지칭하기 위해 사용될 수 있다. 2개의 폴리펩타이드 또는 핵산 서열 간의 퍼센트 서열 동일성은 예를 들어, BLAST 프로그램(베이식 로컬 정렬 서치 툴(Basic Local Alignment Search Tool)); (문헌[Altschul et al.(1995) J. Mol. Biol. 215:403-410]), BLAST-2, BLAST-P, BLAST-N, BLAST-X, WU-BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2, CLUSTAL 또는 메갈리안(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 당해 분야의 기술 내에 있는 다양한 방식으로 결정된다. 또한, 당업자는 비교될 서열 길이에 걸쳐 최대의 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하는 정렬을 측정하기 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다.
서열 동일성을 결정하기 위한 목적을 위해 DNA 서열을 RNA 서열과 비교할 때, 티민 뉴클레오타이드는 우라실 뉴클레오타이드와 동등한 것으로 이해된다. 보존적 치환은 전형적으로 다음 그룹 내의 치환을 포함한다: 글리신, 알라닌; 발린, 아이소류신, 류신; 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 라이신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 타이로신.
용어 "면역 세포"는 면역 반응에 직접 또는 간접적으로 참여할 수 있는 세포를 지칭한다. 면역 세포는 T 세포, B 세포, 항원 제시 세포, 수지상 세포, 자연 살해(NK) 세포, 자연 살해 T(NK) 세포, 림포카인-할성화 살해(LAK) 세포, 단핵구, 대식세포, 호산구, 호염구, 호중구, 과립구, 비만 세포, 혈소판, 랑게르한스 세포, 줄기 세포, 말초 혈액 단핵 세포, 세포독성 T 세포, 종양 침윤 림프구(TIL) 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. "항원 제시 세포"(antigen presenting cell: APC)는 T 세포를 활성화할 수 있는 세포이며, 단핵구/대식세포, B 세포 및 수지상 세포(DC)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 용어 "수지상 세포(dendritic cell)" 또는 "DC"는 림프성 또는 비-림프성 조직에서 발견되는 형태학적으로 유사한 세포 유형의 다양한 집단의 임의의 구성원을 지칭한다. 이들 세포는 독특한 형태와 높은 수준의 표면 MHC-클래스 II 발현을 특징으로 한다. DC는 다수의 조직 공급원으로부터 단리될 수 있다. DC는 MHC-제한 T 세포를 감작시키는 높은 능력을 가지며, 항원을 현장에서 T 세포에 제시하는데 매우 효과적이다. 항원은 T 세포 발달 및 내성 동안 발현되는 자가-항원일 수 있으며, 정상적인 면역 과정 중에 존재하는 외래 항원일 수 있다. 용어 "호중구"는 일반적으로 선천성 면역 체계의 일부를 구성하는 백혈구를 지칭한다. 호중구는 전형적으로 약 2 내지 5개의 엽(lobe)을 함유하는 분절된 핵을 갖는다. 호중구는 외상 후 몇 분 이내에 손상 부위로 자주 이동한다. 호중구는 손상 또는 감염 부위에서 산화제, 프로테이스(protease) 및 사이토카인을 포함하는 세포독성 화합물을 방출함으로써 기능한다. 용어 "활성화된 DC"는 항원으로 펄스화되고, 면역 세포를 활성화할 수 있는 DC이다. 용어 "NK 세포"는 당업계에서 일반적인 의미를 가지며, 자연 살해(natural killer: NK) 세포를 지칭한다. 당업자는 예를 들어, 특정 표현형 마커(예를 들어, CD56)의 발현을 결정함으로써 NK 세포를 쉽게 확인할 수 있고, 예를 들어 상이한 종류의 사이토카인을 발현하는 능력 또는 세포 독성을 유도하는 능력에 기초하여 그 기능을 확인할 수 있다. 용어 "B 세포"는 골수 및/또는 비장으로부터 유래된 면역 세포를 지칭한다. B 세포는 항체를 생산하는 형질세포로 발달할 수 있다. 용어 "T 세포"는 CD8+ T 세포 및 CD4+ T 세포를 비롯한 다양한 세포-매개성 면역 반응에 참여하는 흉선-유래 면역 세포를 지칭한다. Tconv 또는 Teff로도 알려진 종래의 T 세포는 하나 이상의 T 세포 수용체의 발현에 의해 면역 반응을 증가시키기 위해 효과기 기능(예를 들어, 사이토카인 분비, 세포독성 활성, 항-자기-인식 등)을 갖는다. Tconv 또는 Teff는 일반적으로 Treg가 아닌 임의의 T 세포 집단으로 정의되며, 예를 들어 미경험 T 세포, 활성화된 T 세포, 메모리 T 세포, 휴지(resting) Tconv 또는 예를 들어, Th1 또는 Th2 계통으로 분화된 Tconv를 포함한다. 일부 실시형태에서, Teff는 비-조절성 T 세포(Treg)의 서브세트이다. 일부 실시형태에서, Teff는 CD4+ Teff 또는 CD8+ Teff, 예컨대 CD4+ 헬퍼 T 림프구(예를 들어, Th0, Th1, Tfh 또는 Th17) 및 CD8+ 세포독성 T 세포(림프구)이다. 본 명세서에서 더 기재되는 바와 같이, 세포독성 T 세포는 CD8+ T 림프구이다. "미경험 Tconv(naive Tconv)"는 골수에서 분화된 CD4+　T 세포이며, 흉선에서 양성 및 음성 과정을 연속적으로 겪었지만 아직 항원 노출에 의해 활성화되지 않았다. 미경험 Tconv는 일반적으로 L-셀렉틴(CD62L)의 표면 발현, CD25, CD44 또는 CD69와 같은 활성화 마커의 부재 및 CD45RO과 같은 메모리 마커의 부재를 특징으로 한다. 미경험 Tconv는 따라서 휴지 상태(quiescent)이고 분열되지 않으며, 항상성 생존을 위해 인터류킨-7(IL-7) 및 인터류킨-15(IL-15)이 필요하다(적어도 WO 2010/101870 참조). 이러한 세포의 존재 및 활성은 면역 반응을 억제하는 맥락에서 바람직하지 않다. Treg와 달리, Tconv는 무력성(anergic)이 아니며, 항원-기반 T 세포 수용체 활성화에 반응하여 증식할 수 있다(문헌[Lechler et al. (2001) Philos. Trans. R. Soc. Lond. Biol. Sci. 356:625-637]). 종양에서, 탈진된(exhausted) 세포는 무력성의 특징을 나타낼 수 있다.
용어 "면역조절인자"는 면역 반응을 조절하는 물질, 작용제, 신호전달 경로 또는 이의 성분을 지칭한다. 면역 반응과 관련하여 용어 "조절하는(regulating)", "변형하는(modifying)" 또는 "조절하는(modulating)"은 면역 체계의 세포 또는 이러한 세포의 활성의 임의의 변경을 지칭한다. 이러한 조절은 다양한 세포 유형의 수의 증가 또는 감소, 이러한 세포의 활성의 증가 또는 감소, 또는 면역 체계 내에서 일어날 수 있는 임의의 다른 변화에 의해 나타날 수 있는 면역 체계(또는 이의 별개의 부분)의 자극 또는 억제를 포함한다. 저해성 및 자극성 면역조절인자 모두 확인되었으며, 그 중 일부는 암 미세환경에서 기능을 향상시킬 수 있다.
용어 "면역 반응"은 제한 없이 체내에 자연적으로 존재하는 물질(예를 들어, 자가-항원에 대한 자가면역) 또는 형질전환된(예를 들어, 암) 세포에 대한 방어 반응을 포함하는, 신체가 박테리아, 바이러스 및 병원균과 같은 "외부물질"뿐만 아니라 반드시 신체 외부에서 유래하지 않을 수 있는 표적에 대해 발생시키는 방어 반응을 의미한다. 특히 면역 반응은 면역 체계 세포(예를 들어, T 림프구, B 림프구, 자연 살해(NK) 세포, 대식세포, 호산구, 비만 세포, 수지상 세포 및 호중구)의 활성화 및/또는 작용이며, 임의의 이러한 세포 또는 간(항체(체액 반응), 사이토카인 및 보체를 포함)에서 생성된 가용성 거대 분자는 침입 병원균, 병원균에 감염된 세포 또는 조직, 암성 또는 다른 비정상적인 세포, 또는 자가면역 또는 병리학적 염증의 경우, 정상적인 인간 세포 또는 조직의 척추동물의 신체로부터 선택적 표적화, 결합, 손상, 파괴 및/또는 제거를 초래한다. 항암 면역 반응은 신체가 비정상적인 종양 세포를 인식하고, 위험한 암 세포를 제거하기 위해 선천성 및 후천성 면역 체계를 개시하는 면역 감시 메커니즘을 지칭한다.
선천성 면역 체계는 다른 유기체에 의한 감염으로부터 숙주를 방어하는 세포(예를 들어, 자연 살해 세포, 비만 세포, 호산구, 호염구; 및 대식세포, 호중구 및 수지상 세포를 포함하는 포식세포) 및 메커니즘을 포함하는 비-특이적 면역 체계이다. 선천성 면역 반응은 사이토카인의 생성, 활성 보체 캐스케이드 및 후천성 면역 반응을 개시할 수 있다. 후천성 면역 체계는 항원 제시 세포에 의한 항원 제시와 같이 고도로 전문화된 전신 세포 활성화 및 과정; 항원 특이적 T 세포 활성화 및 세포독성 효과에 필요하며 이에 관여하는 특유의 면역 체계이다.
용어 "면역치료제"는 대상체에서 종양 또는 암에 대한 면역 반응을 생성하기 위해 숙주 면역 체계를 자극할 수 있는 임의의 분자, 펩타이드, 항체 또는 기타 작용제를 포함할 수 있다. 다양한 면역치료제가 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법에 유용하다.
용어 "저해하다(inhibit)" 또는 "하향조절하다(downregulate)"는 예를 들어, 특정 작용, 기능 또는 상호작용의 감소, 제한 또는 차단을 포함한다. 일부 실시형태에서, 암의 적어도 하나의 증상이 완화, 종결, 감속 또는 예방되는 경우, 암은 "저해된다". 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 암의 재발 또는 전이가 감소, 감속, 지연 또는 예방되는 경우, 암은 또한 "저해된다". 유사하게는, 단백질의 기능과 같은 생물학적 기능은 참조 상태, 예컨대 야생형 상태와 같은 대조군과 비교하여 감소되는 경우 저해된다. 이러한 저해 또는 결핍은 특정 시간 및/또는 장소에의 작용제의 적용에 의해서와 같이 유도될 수 있거나, 또는 유전 가능한 돌연변이에 의해서와 같이 구성적일 수 있다. 이러한 저해 또는 결핍은 또한 부분적이거나 완전(예를 들어, 참조 상태, 예컨대 야생형 상태와 같은 대조군과 비교하여 본질적으로 측정 가능한 활성이 없음)할 수 있다. 본질적으로 완전한 저해 또는 결핍은 차단이라고 지칭한다. 용어 "촉진하다(promote)" 또는 "상향조절하다(upregulate)"는 반대의 의미를 갖는다.
두 분자 사이의 상호작용을 지칭할 때, 용어 "상호작용"은 분자가 서로 물리적 접촉(예를 들어, 결합)하는 것을 지칭한다. 일반적으로, 이러한 상호작용은 상기 분자 중 하나 또는 둘 모두의 활성(생물학적 효과를 생성함)을 초래한다. 활성은 분자 중 하나 또는 둘 모두의 직접적인 활성(예를 들어, 신호 전달)일 수 있다. 대안적으로, 상호 작용에 있는 하나 또는 두 분자는 들의 리간드에 결합하는 것을 방지할 수 있고, 따라서 리간드 결합 활성(예를 들어, 리간드에 결합하고, 공동자극을 촉발하거나 저해함)과 관련하여 불활성으로 유지될 수 있다. 이러한 상호작용을 저해하는 것은 상호작용에 관여하는 하나 이상의 분자의 활성을 간섭하는 결과를 초래한다. 이러한 상호작용을 향상시키는 것은 상기 신체 접촉의 가능성을 연장 또는 증가시키고, 상기 활성의 가능성을 연장 또는 증가시키는 것이다.
"단리된 단백질"은 세포로부터 단리되거나 재조합 DNA 기법에 의해 생성될 때 다른 단백질, 세포 물질, 분리 배지 및 배양 배지 또는 화학적으로 합성될 때 화학 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없는 단백질을 지칭한다. "단리된" 또는 "정제된" 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분은 항체, 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 융합 단백질이 유래되는 세포 또는 조직 공급원으로부터의 세포 물질 또는 기타 오염 단백질이 실질적으로 없거나, 또는 화학적으로 합성될 때 화학 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없다. 표현 "세포 물질이 실질적으로 없는"은 단백질이 단리되거나 재조합적으로 생산되는 세포의 세포 성분으로부터 분리되는 바이오마커 폴리펩타이드 또는 이의 단편의 제제를 포함한다. 일 실시형태에서, 표현 "세포 물질이 실질적으로 없는"은 약 30%(건조 중량) 미만의 비-바이오마커 단백질(본 명세서에서 "오염 단백질"이라고도 칭함), 더욱 바람직하게는 약 20% 미만의 비-바이오마커 단백질, 훨씬 더욱 바람직하게는 약 10% 미만의 비-바이오마커 단백질, 가장 바람직하게는 약 5% 미만의 비-바이오마커 단백질을 갖는 바이오마커 단백질 또는 이의 단편의 제제를 포함한다. 항체, 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 융합 단백질 또는 이들의 단편, 예를 들어 이들의 생물학적으로 활성인 단편이 재조합적으로 생산될 때, 이는 또한 바람직하게는 배양 배지가 실질적으로 없다, 즉, 배양 배지는 단백질 제제의 부피의 약 20% 미만, 더욱 바람직하게는 약 10% 미만, 가장 바람직하게는 약 5% 미만을 나타낸다.
용어 "동형(isotype)"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 암호화되는 항체 클래스(예를 들어, IgM, IgG1, IgG2C 등)를 지칭한다.
용어 "KD"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 평형 상수를 지칭하는 것으로 의도된다. 본 발명에 개시된 항체의 결합 친화성은 표준 항체-항원 검정, 예를 들어 경쟁적 검정, 포화 검정 또는 표준 면역검정, 예컨대 ELISA 또는 RIA에 의해 측정 또는 결정될 수 있다.
용어 "미세환경"은 일반적으로 관심있는 조직 영역에서 국재화된 영역을 지칭하며, 예를 들어 "종양 미세환경"을 지칭할 수 있다. 용어 "종양 미세환경" 또는 "TME"는 종양 세포와 그 환경 간의 상호간섭(cross-talk)을 가능하게 하는데 도움이 되는 종양 세포와 지속적으로 상호작용하는 주변 미세환경을 지칭한다. 종양 미세환경은 종양의 세포 환경, 주변 혈관, 면역 세포, 섬유모세포, 골수 유래 염증성 세포, 림프구, 신호전달 분자 및 세포외 매트릭스를 포함할 수 있다. 종양 환경은 성장 및 생존을 보장하기 위해 종양 미세환경의 도움을 받고 이에 영향을 받는 종양 세포 또는 악성 세포를 포함할 수 있다. 종양 미세환경은 또한 항종양 면역 반응을 자극하거나 저해할 수 있는 림프성 및 골수성 세포와 같은 종양-침윤 면역 세포 및 기질 세포, 예컨대 종양-관련 섬유모세포 및 종양의 구조적 온전성에 기여하는 내피 세포를 포함할 수 있다. 기질 세포는 구조적 온전성에 기여하는 세포(섬유모세포)인 내피 세포 및 혈관주위세포와 같은 종양-관련 혈관을 구성하는 세포뿐만 아니라 단핵구, 호중구(PMN), 수지상 세포(DC), T 및 B 세포, 비만 세포 및 자연 살해(NK) 세포를 포함하는 종양-관련 대식세포(TAM) 및 침윤 면역 세포를 포함한다. 기질 세포는 종양 세포질의 대부분을 구성하는 반면, 고형 종양에서 우세한 세포 유형은 대식세포이다.
용어 "조절하는" 및 이의 문법적 동등어는 증가 또는 감소(예를 들어, 침묵), 즉 상향조절 또는 하향조절을 지칭한다.
바이오마커 발현의 "정상적인" 수준은 대상체, 예를 들어 암을 앓고 있지 않은 인간 환자의 세포에서의 바이오마커의 발현 수준이다.
바이오마커의 "과-발현" 또는 "현저하게 높은 수준의 발현"은 발현을 평가하기 위해 사용된 검정의 표준 오차보다 더 큰 테스트 샘플에서의 발현 수준을 지칭하며, 대조군 샘플(예를 들어, 바이오마커 관련 질환이 없는 건강한 대상체로부터의 샘플)에서의 바이오마커의 발현 활성 또는 수준 및 바람직하게는, 여러 대조군 샘플에서의 바이오마커의 평균 발현 수준보다 바람직하게는 적어도 10%, 더욱 바람직하게는 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2.0배, 2.1배, 2.1배, 2.2배, 2.3배, 2.4배, 2.5배, 2.6배, 2.7배, 2.8배, 2.9배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 5.5배, 6배, 6.5배, 7배, 7.5배, 8배, 8.5배, 9배, 9.5배, 10배, 10.5배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배, 19배, 20배 이상 더 높다. 바이오마커의 "현저하게 낮은 수준의 발현"은 대조군 샘플(예를 들어, 바이오마커 관련 질환이 없는 건강한 대상체로부터의 샘플)에서의 바이오마커의 발현 수준 및 바람직하게는, 여러 대조군 샘플에서의 바이오마커의 평균 발현 수준보다 적어도 10%, 더욱 바람직하게는 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2.0배, 2.1배, 2.1배, 2.2배, 2.3배, 2.4배, 2.5배, 2.6배, 2.7배, 2.8배, 2.9배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 5.5배, 6배, 6.5배, 7배, 7.5배, 8배, 8.5배, 9배, 9.5배, 10배, 10.5배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배, 19배, 20배 이상 더 낮은 테스트 샘플에서의 발현 수준을 지칭한다.
이러한 "유의성" 수준은 또한 발현, 저해, 세포 독성, 세포 성장 등과 같은 본 명세서에 기재된 임의의 다른 측정된 매개변수에 적용될 수 있다.
용어 "말초 혈액 세포 아형"은 호산구, 호중구, T 세포, 단핵구, 대식세포, NK 세포, 과립구 및 B 세포를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 말초 혈액에서 일반적으로 발견되는 세포 유형을 지칭한다.
용어 "미리 결정된" 바이오마커 양 및/또는 활성 측정값(들)은 단지 예로서, 특정 치료를 위해 선택될 수 있는 대상체를 평가, 본 명세서에 기재된 하나 이상의 바이오마커의 하나 이상의 조절인자와 같은 치료에 대한 반응을 평가 및/또는 질환 상태를 평가하기 위해 사용되는 바이오마커 양 및/또는 활성 측정값(들)일 수 있다. 미리 결정된 바이오마커 양 및/또는 활성 측정값(들)은 암이 있거나 없는 환자와 같은 환자의 집단에서 결정될 수 있다. 미리 결정된 바이오마커 양 및/또는 활성 측정값(들)은 모든 환자에게 동일하게 적용 가능한 단일 숫자일 수 있거나, 또는 미리 결정된 바이오마커 양 및/또는 활성 측정값(들)은 환자의 특정 하위집단에 따라 달라질 수 있다. 대상체의 연령, 체중, 키 및 기타 요인은 개체의 미리 결정된 바이오마커 양 및/또는 활성 측정값(들)에 영향을 미칠 수 있다. 또한, 미리 결정된 바이오마커 양 및/또는 활성은 각각의 대상체에 대해 개별적으로 결정될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에서 결정되고/되거나 비교된 양은 절대적 측정값에 기초한다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에서 결정되고/되거나 비교된 양은 상대적 측정값, 예컨대 비(예를 들어, 하우스키핑 또는 그렇지 않으면 일반적으로 일정한 바이오마커의 발현에 대해 정규화된 세포 비 또는 혈청 바이오마커)에 기초한다. 미리 결정된 바이오마커 양 및/또는 활성 측정값(들)은 임의의 적합한 표준일 수 있다. 예를 들어, 미리 결정된 바이오마커 양 및/또는 활성 측정값(들)은 환자 선택이 평가될 동일하거나 상이한 인간으로부터 얻어질 수 있다. 일 실시형태에서, 미리 결정된 바이오마커 양 및/또는 활성 측정값(들)은 동일한 환자의 이전의 평가로부터 얻어질 수 있다. 이러한 방식으로, 환자의 선택의 진행은 시간이 지남에 따라 모니터링될 수 있다. 또한, 대조군은 다른 인간 또는 여러 인간, 예를 들어, 대상체가 인간인 경우, 선택된 인간의 그룹의 평가로부터 수득될 수 있다. 이러한 방식으로, 선택이 평가될 인간의 선택의 범위는 적합한 다른 인간, 예를 들어, 유사하거나 동일한 병태(들)로 고통받고 있는 인간 및/또는 동일한 인종 그룹의 인간과 같은 관심있는 인간과 유사한 상황에 놓인 다른 인간과 비교될 수 있다.
용어 "예측적"은 목적하는 바의 가능성을 결정하기 위해 요법 이전, 도중 또는 이후에 바이오마커 핵산 및/또는 단백질 상태, 예를 들어, 종양의 과다-활성 또는 과소(under)-활성, 출현, 발현, 성장, 관해, 재발 또는 저항성의 사용을 포함한다. 바이오마커의 이러한 예측적 사용은 예를 들어, (1) 예를 들어 약 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% 이상의 검정된 인간암 유형 또는 암 샘플에서, 증가된 또는 감소된 카피 수(예를 들어, FISH, FISH와 SKY, 단일-분자 시퀀싱, 예를 들어 적어도 문헌[J. Biotechnol., 86:289-301]에 기재된 바와 같은 것 또는 qPCR에 의해), 바이오마커 핵산의 과발현 또는 과소발현(예를 들어, ISH, 노던 블롯 또는 qPCR에 의해), 증가된 또는 감소된 바이오마커 단백질(예를 들어, IHC에 의해), 또는 증가된 또는 감소된 활성; (2) 생물학적 샘플, 예를 들어 대상체, 예를 들어 암에 걸린 인간로부터의 조직, 전혈, 혈청, 혈장, 구강 채취물, 침, 뇌척수액, 소변, 대변 또는 골수를 함유하는 샘플에서의 절대적 또는 상대적으로 조절된 존재 또는 부재; (3) 암을 가진 환자의 임상적 서브세트(예를 들어, T-세포 매개성 세포 독성의 특정 조절인자 단독 또는 면역요법과의 조합에 반응하는 환자 또는 이에 대한 저항성을 발달시키는 환자)에서 절대적 또는 상대적으로 조절된 존재 또는 부재에 의해 확인될 수 있다.
용어 "예방하다", "예방하는", "예방", "예방적 치료" 등은 질환, 장애 또는 병태를 갖고 있지 않지만, 이의 위험이 있거나 이의 발병에 취약한 대상체에서 질환, 장애 또는 병태가 발생할 가능성을 감소시키는 것을 지칭한다.
용어 "프로브"는 특별히 의도된 표적 분자, 예를 들어 바이오마커 핵산에 의해 암호화되거나 또는 이에 상응하는 뉴클레오타이드 전사체 또는 단백질에 선택적으로 결합할 수 있는 임의의 분자를 지칭한다. 프로브는 당업자에 의해 합성되거나 또는 적절한 생물학적 제제로부터 유도될 수 있다. 표적 분자의 검출을 위해, 프로브는 본 명세서에 기재된 바와 같이 표지되도록 특별히 설계될 수 있다. 프로브로서 사용될 수 있는 분자의 예는 RNA, DNA, 단백질, 항체 및 유기 분자를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
용어 "비(ratio)"는 두 숫자(예를 들어, 점수, 합산 등) 사이의 관계를 지칭한다. 비록, 비는 특정 순서(예를 들어, a 대 b 또는 a:b)로 표현될 수 있지만, 당업자는 비에 기초한 경향의 관찰 및 상관관계가 역전될 수 있지만, 기본 관계의 중요성을 읽지 않고 숫자 사이의 기본 관계가 임의의 순서로 표현될 수 있음을 인식할 것이다.
용어 "수용체"는 일반적으로 표적 장기, 조직 또는 세포 유형의 세포 표면에 존재하는 자연 발생적 분자 또는 분자의 복합체를 지칭한다.
용어 "암 반응", "면역요법에 대한 반응" 또는 "T-세포 매개성 세포 독성의 조절인자/면역요법 병용 요법에 대한 반응"은 암 작용제, 예컨대 T-세포 매개성 세포 독성의 조절인자 및 면역요법에 대한 과증식성 장애(예를 들어, 암)의 임의의 반응, 바람직하게는 신보조제(neoadjuvant) 또는 보조제 요법의 개시 후 종양 질량 및/또는 부피의 변화에 관한 것이다. 과증식성 장애 반응은 예를 들어, 효능에 대해 또는 신보조제 또는 보조제 상황에서 평가될 수 있으며, 여기서 전신 개입 후 종양의 크기는 CT, PET, 유방 조영술, 초음파 또는 촉진으로 측정된 초기 크기 및 치수와 비교될 수 있다. 반응은 또한 생검 또는 수술적 절제 후 종양의 캘리퍼스 측정 또는 병리학적 검사로 평가될 수 있다. 반응은 종양 부피의 퍼센트 변화와 같은 정량적 방식, 또는 "병리학적 완전 반응"(pathological complete response: pCR), "임상적 완전 관해"(pathological complete response: cCR), "임상적 부분 관해"(clinical partial remission: cPR), "임상적 안정 질환"(clinical stable disease: cSD), "임상적 진행성 질환"(clinical progressive disease: cPD) 또는 다른 정성적 기준과 같은 정성적 방식으로 기록될 수 있다. 과증식성 장애 반응의 평가는 신보조제 또는 보조제 요법의 개시 후 초기에, 예를 들어 몇 시간, 며칠, 몇 수 또는 바람직하게는 몇 개월 후에 수행될 수 있다. 반응 평가에 대한 전형적 종점(endpoint)은 신보조제 화학요법의 종료시 또는 잔류 종양 세포 및/또는 종양 베드(bed)의 외과적 제거시이다. 이는 전형적으로 신보조제 요법 개시 후 3개월이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 치료적 치료의 임상적 효능은 임상적 이득률(clinical benefit rate: CBR)을 측정함으로써 결정될 수 있다. 임상적 이득률은 요법의 종료로부터 적어도 6개월 시점에서 완전 관해(CR)에 있는 환자의 퍼센트, 부분적 관해(PR)에 있는 환자의 수 및 안정 질환(SD)을 갖는 환자의 수의 합계를 결정함으로써 측정된다. 이러한 공식의 약칭은 6개월에 걸쳐 CBR=CR+PR+SD이다. 일부 실시형태에서, 특정 암 치료적 양생법에 대한 CBR은 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% 이상이다. 암 요법에 대한 반응을 평가하기 위한 추가적인 기준은 다음을 모두 포함하는 "생존"과 관련이 있다: 전체 생존기간이라고도 알려져 있는 사망할 때까지의 생존기간(상기 사망률은 원인과 무관하거나 종양과 관련이 있을 수 있음); "무재발 생존기간"(용어 재발은 국소 재발 및 원격 재발을 모두 포함하여야 함); 무전이 생존기간; 무질환 생존기간(용어 질환은 암 및 이와 관련된 질환을 포함하여야 함). 상기 생존의 기간은 정의된 시작 시점(예를 들어, 진단 또는 치료 시작의 시점) 및 종료 시점(예를 들어, 사망, 재발 또는 전이)을 참조하여 계산될 수 있다. 또한, 치료의 효능 기준은 화학요법에 대한 반응, 생존 가능성, 주어진 기간 내의 전이 가능성 및 종양 재발의 가능성을 포함하도록 확장될 수 있다. 예를 들어, 적절한 역치 값을 결정하기 위해, 특정 암 치료적 양생법이 대상체의 집단에 투여될 수 있고, 결과는 임의의 암 요법의 투여 전에 결정된 바이오마커 측정값과 관련이 있을 수 있다. 결과 측정값은 신보조제 환경(setting)에서 주어진 요법에 대한 병리적 반응일 수 있다. 대안적으로, 전체 생존기간 및 무질환 생존과 같은 결과 측정은 바이오마커 측정값이 알려진 암 요법 후 대상체에 대해 일정 기간 동안 모니터링될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 투여되는 용량은 암 치료제에 대해 당업계에 공지된 표준 용량이다. 대상체가 모니터링되는 기간은 다를 수 있다. 예를 들어, 대상체는 적어도 2개월, 4개월, 6개월, 8개월, 10개월, 12개월, 14개월, 16개월, 18개월, 20개월, 25개월, 30개월, 35개월, 40개월, 45개월, 50개월, 55개월 또는 60개월 동안 모니터링될 수 있다. 암 요법의 결과와 관련된 바이오마커 측정 역치값은 실시예 부문에 기재된 것들과 같은 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 결정될 수 있다.
용어 "저항성(resistance)"은 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% 이상, 예컨대 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 10-배, 15-배, 20-배 이상 또는 그 사이의 임의의 범위까지로 치료적 치료에 대해 감소된 반응을 갖는 것과 같이, 암 샘플 또는 포유동물이 암 요법에 대해 획득한 저항성 또는 천연의 저항성(즉, 치료적 치료에 대해 반응하지 않거나 또는 반응이 감소되거나 제한됨)을 지칭한다. 반응의 감소는 저항성이 획득되기 전에 동일한 암 샘플 또는 포유동물과 비교함으로써, 또는 다른 암 샘플 또는 치료적 치료에 대한 저항성이 없는 것으로 알려진 포유동물과 비교함으로써 측정될 수 있다. 화학요법에 대한 전형적인 후천적 저항성은 "다중약물 저항성(multidrug resistance)"이라 한다. 다중약물 저항성은 P-당단백질에 의해 매개될 수 있거나, 또는 다른 메커니즘에 의해 매개될 수 있거나, 또는 포유동물이 다중-약물-저항성 미생물 또는 미생물의 조합에 감염될 때 발생할 수 있다. 치료적 치료에 대한 저항성의 결정은 예를 들어 "감작시키는(sensitizing)" 것으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 세포 증식성 검정 및 세포 사멸 검정에 의해 측정될 수 있는 당업계에서 일상적이며 통상적으로 숙련된 임상의의 기술 내에서 이루어진다. 일부 실시형태에서, 용어 "역 저항성(reverses resistance)"은 1차 암 요법(예를 들어, 화학요법 또는 방사선 요법)만으로는 치료되지 않은 종양 부피와 비교하여 종양 부피의 통계학적으로 유의한 감소를 생성할 수 없는 상황에서 치료되지 않은 종양의 종양 부피와 비교할 때, 1차 암 요법(예를 들어, 화학요법 또는 방사선 요법)과 조합된 제2 작용제의 사용이 통계학적 유의성의 수준(예를 들어, p<0.05)으로 종양 부피의 유의한 감소를 생성할 수 있음을 의미한다. 이는 일반적으로 치료되지 않은 종양이 리드미컬하게 로그 성장할 때 시점에서 만들어진 종양 부피 측정값에 적용된다.
용어 "반응" 또는 "반응성"은 예를 들어, 종양 크기의 감소 또는 종양 성장 저해의 의미에서 암 반응을 지칭한다. 용어는 첫 번째 이벤트로서 두 번째 원발성 암에 대한 첫 번째 재발 검열 또는 재발의 증거가 없는 사망에 대한 기간인 재발까지의 시간의 증가, 또는 치료에서 임의의 원인으로 인한 사망까지의 기간인 전체 생존기간의 증가에 의해 반영되는 바와 같은 개선된 예후 예측을 지칭할 수 있다. 반응하거나 반응한다는 것은 자극에 노출되었을 때 얻을 수 있는 유익한 종말점이 있다는 것을 의미한다. 대안적으로, 자극에 노출되면 나쁜 또는 해로운 증상이 최소화, 완화 또는 약화된다. 종양 또는 대상체가 유리한 반응을 보일 가능성을 평가하는 것은 종양 또는 대상체가 유리한 반응을 나타내지 않을(즉, 반응의 결여를 나타내거나 무반응성일 수 있음) 가능성을 평가하는 것과 동일하다는 것이 이해될 것이다.
"RNA 간섭(RNAi)"는 표적 바이오마커 핵산과 동일하거나 매우 유사한 서열의 RNA의 발현 또는 도입이 그 표적화된 유전자로부터 전사된 메신저 RNA(mRNA)의 서열 특이적 분해 또는 특정 전사 후 유전자 침묵(post-transcriptional gene silencing: PTGS)(문헌[Coburn and Cullen (2002) J. Virol. 76:9225] 참조)을 초래하여, 표적 바이오마커 핵산의 발현을 저해하는 진화적으로 보존된 과정이다. 일 실시형태에서, RNA는 이중 가닥 RNA(dsRNA)이다. 이러한 과정은 식물, 무척추동물 및 포유동물 세포에서 설명되었다. 본질적으로, RNAi는 dsRNA-특이적 엔도뉴클레이스 다이서에 의해 개시되며, 이는 긴 dsRNA를 siRNA라고 하는 이중 가닥 단편으로의 가공적 절단을 촉진한다. siRNA는 표적 mRNA를 인식하고 절단하는 단백질 복합체에 통합된다. RNAi는 또한 표적 바이오마커 핵산의 저해 또는 침묵 발현을 위해, 핵산 분자, 예를 들어 합성 siRNA 또는 RNA 간섭 작용제를 도입함으로써 개시될 수 있다. 본 명세서에 사용되는, "표적 바이오마커 핵산 발현의 저해" 또는 "마커 유전자 발현의 저해"는 표적 바이오마커 핵산 또는 표적 바이오마커 핵산에 의해 암호화된 단백질의 발현 또는 단백질 활성 또는 수준의 임의의 감소를 포함한다. 감소는 표적 바이오마커 핵산의 발현 또는 RNA 간섭 작용제에 의해 표적화되지 않은 표적 바이오마커 핵산에 의해 암호화된 단백질의 활성 또는 수준에 비해 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상일 수 있다.
RNAi 외에도, 관심있는 바이오마커, 예컨대 관심있는 바이오마커의 구성적 또는 유도성 넉아웃 또는 돌연변이의 카피 수 또는 유전자 서열을 조절하기 위해 게놈 편집이 사용될 수 있다. 예를 들어, CRISPR-Cas 시스템이 게놈 핵산의 정확한 편집을 위해(예를 들어, 비-작용성 또는 널(null) 돌연변이를 생성하기 위해) 사용될 수 있다. 이러한 실시형태에서, CRISPR 가이드 RNA 및/또는 Cas 효소가 발현될 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA만을 함유하는 벡터가 Cas9 효소에 대해 형질전환된 동물 또는 세포에 투여될 수 있다. 유사한 전략이 사용될 수 있다(예를 들어, 아연 핑거 뉴클레이스(zinc finger nuclease, ZFN), 전사 활성인자-유사 효과기 뉴클레이스(transcription activator-like effector nuclease: TALEN) 또는 호밍 메가뉴클레이스(homing meganuclease: HE), 예컨대 MegaTAL, MegaTev, Tev-mTALEN, CPF1 등). 이러한 시스템은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, 미국 특허 제8,697,359호; 문헌[Sander and Joung (2014) Nat. Biotech. 32:347-355; Hale et al. (2009) Cell 139:945-956; Karginov and Hannon (2010) Mol. Cell 37:7]; 미국 공개 제2014/0087426호 및 제2012/0178169호; 문헌[Boch et al. (2011) Nat. Biotech. 29:135-136; Boch et al. (2009) Science 326:1509-1512; Moscou and Bogdanove (2009) Science 326:1501; Weber et al. (2011) PLoS One 6:e19722; Li et al. (2011) Nucl. Acids Res. 39:6315-6325; Zhang et al. (2011) Nat. Biotech. 29:149-153; Miller et al. (2011) Nat. Biotech. 29:143-148; Lin et al. (2014) Nucl. Acids Res. 42:e47] 참조). 이러한 유전적 전략은 당업계에 잘 알려진 방법에 따라 구성적 발현 시스템 또는 유도성 발현 시스템을 사용할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 "RNA 간섭 작용제"는 RNA 간섭(RNAi)에 의해 표적 바이오마커 유전자의 발현을 방해하거나 저해하는 임의의 작용제로 정의된다. 이러한 RNA 간섭 작용제는 RNA 분자를 포함하는 본 발명에 포함되는 표적 바이오마커 유전자에 상동성인 핵산 분자 또는 이의 단편, 짧은 간섭 RNA(siRNA) 및 RNA 간섭(RNAi)에 의해 표적 바이오마커 핵산의 발현을 방해하거나 저해하는 소분자를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
적어도 하나의 바이오마커의 존재 또는 수준을 검출하거나 결정하기 위해 사용되는 용어 "샘플"은 전형적으로 뇌 조직, 뇌척수액, 전혈, 혈장, 혈청, 침, 소변, 대변(예를 들어, 대변), 눈물 및 임의의 다른 체액(예를 들어, "체액"의 정의하에 위에 기재된 바와 같음) 또는 조직 샘플(예를 들어, 생검) 예컨대 소장, 결장 샘플 또는 외과적 절제 조직이다. 소정의 예에서, 본 발명에 포함되는 방법은 샘플에서 적어도 하나의 마커의 존재 또는 수준을 검출 또는 결정하기 전에 개체로부터 샘플을 수득하는 단계를 더 포함한다.
용어 "감작시키다"는 암 요법(예를 들어, 항-면역관문, 화학요법 및/또는 방사선 요법)으로 관련된 암의 보다 효과적인 치료를 가능하게 하는 방식으로 암 세포 또는 종양 세포를 변경하는 것을 의미한다. 일부 실시형태에서, 정상 세포는 요법에 의해 정상 세포가 과도하게 손상될 정도로 영향을 받지 않는다. 치료적 치료에 대해 증가된 감수성 또는 감소된 감수성은 세포 증식성 검정(문헌[Tanigawa et al. (1982) Cancer Res. 42:2159-2164]) 및 세포 사멸 검정(문헌[Weisenthal et al. (1984) Cancer Res. 94:161-173; Weisenthal et al. (1985) Cancer Treat Rep. 69:615-632; Weisenthal et al., In: Kaspers G J L, Pieters R, Twentyman P R, Weisenthal L M, Veerman A J P, eds. Drug Resistance in Leukemia and Lymphoma. Langhorne, P A: Harwood Academic Publishers, 1993:415-432; Weisenthal (1994) Contrib. Gynecol. Obstet. 19:82-90])을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 아래의 본 명세서에 기재된 특정 치료 및 방법에 대한 당업계에 공지된 방법에 따라 측정된다. 감수성 또는 저항성은 또한 일정 기간, 예를 들어 인간의 경우 6개월 및 마우스의 경우 4 내지 6주에 걸쳐 종양 크기 감소를 측정함으로써 동물에서 측정될 수 있다. 치료 감수성의 증가 또는 저항성의 감소가 이러한 조성물 또는 방법의 부재하에 치료 감수성 또는 저항성에 비해 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% 이상, 예컨대 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 10-배, 15-배, 20-배 또는 그 이상 또는 그 사이를 포함하는 임의의 범위인 경우, 조성물 또는 방법은 치료적 치료에 대한 반응을 감작시킨다. 치료적 치료에 대한 감수성 또는 저항성의 결정은 당업계에서 일상적이며, 통상적으로 숙련된 임상의의 기술 내에서 이루어진다. 암 요법의 효능을 향상시키기 위한 본 명세서에 기재된 임의의 방법은 암 요법에 대해 과증식성 또는 그렇지 않으면 암성인 세포(예를 들어, 저항성 세포)를 감작시키는 방법에 동일하게 적용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에서 "작은 간섭 RNA"로도 지칭되는 "짧은 간섭 RNA"(siRNA)는 예를 들어, RNAi에 의한 표적 바이오마커 핵산의 발현을 저해하는 기능을 하는 작용제로서 정의된다. siRNA는 화학적으로 합성될 수 있고, 시험관내 전사에 의해 생성될 수 있거나, 또는 숙주 세포 내에서 생성될 수 있다. 일 실시형태에서, siRNA는 약 15개 내지 약 40개의 뉴클레오타이드 길이, 바람직하게는 약 15개 내지 약 28개의 뉴클레오타이드 길이, 더욱 바람직하게는 약 19개 내지 약 25개의 뉴클레오타이드 길이, 더욱 바람직하게는 약 19개, 20개, 21개 또는 22개의 뉴클레오타이드 길이의 이중 가닥 RNA(dsRNA) 분자이며, 약 0개, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 뉴클레오타이드 길이를 갖는 각각의 가닥에 3' 및/또는 5' 오버행을 함유할 수 있다. 오버행의 길이는 두 가닥 사이에서 독립적이다, 즉, 하나의 가닥에서 오버행의 길이는 두 번째 가닥에서의 오버행의 길이에 의존하지 않는다. 바람직하게는, siRNA는 표적 메신저 RNA(mRNA)의 분해 또는 특정 전사 후 유전자 침묵(PTGS)을 통해 RNA 간섭을 촉진할 수 있다.
다른 실시형태에서, siRNA는 작은 헤어핀(스템 루프라고도 함) RNA(shRNA)이다. 일 실시형태에서, 이러한 shRNA는 짧은(예를 들어, 17개 내지 29개의 뉴클레오타이드, 19개 내지 25개의 뉴클레오타이드 등의 영역) 안티센스 가닥, 뒤이어 4개 내지 10개의 뉴클레오타이드 루프(예를 들어, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 염기 링커 영역) 및 유사한 센스 가닥으로 구성된다. 대안적으로, 센스 가닥은 뉴클레오타이드 루프 구조에 선행할 수 있고, 안티센스 가닥이 뒤따를 수 있다. 이러한 shRNA는 플라스미드, 레트로바이러스 및 렌티바이러스에 포함되고, 예를 들어 pol III U6 프로모터 또는 다른 프로모터(예를 들어, 본 명세서에서 참조에 의해 원용되어 있는 문헌[Stewart, et al. (2003) RNA Apr;9(4):493-501] 참조)에서 발현될 수 있다.
RNA 간섭 작용제, 예를 들어 siRNA 분자는 암에서 과발현되는 바이오마커 유전자의 발현을 저해하여 대상체에서 암을 치료, 예방 또는 저해하기 위해 암을 가지거나 암을 가질 위험이 있는 환자에게 투여될 수 있다.
생물학적으로 활성인 작용제에 적용되는 용어 "선택적 조절인자" 또는 "선택적으로 조절하다"는 직접 표적을 통해 또는 표적과의 상호작용을 통해 표적외 세포 집단, 신호전달 활성 등과 비교하여 세포 집단, 신호전달 활성 등과 같은 표적을 조절하는 작용제의 능력을 지칭한다. 예를 들어, 단백질과 다른 결합 파트너 사이의 다른 상호작용에 비해 단백질과 하나의 천연의 결합 파트너 사이의 상호작용 및/또는 관심있는 세포 집단에 대한 이러한 상호작용(들)을 선택적으로 작용하는 작용제는 상호작용을 적어도 하나의 다른 결합 파트너에 대해 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 2×(배), 3×, 4×, 5×, 6×, 7×, 8×, 9×, 10×, 15×, 20×, 25×, 30×, 35×, 40×, 45×, 50×, 55×, 60×, 65×, 70×, 75×, 80×, 85×, 90×, 95×, 100×, 105×, 110×, 120×, 125×, 150×, 200×, 250×, 300×, 350×, 400×, 450×, 500×, 600×, 700×, 800×, 900×, 1000×, 1500×, 2000×, 2500×, 3000×, 3500×, 4000×, 4500×, 5000×, 5500×, 6000×, 6500×, 7000×, 7500×, 8000×, 8500×, 9000×, 9500×, 10000× 이상 또는 그 사이의 임의의 범위까지로 저해한다. 이러한 메트릭스는 전형적으로 상호작용/활성을 절반으로 감소시키는데 필요한 작용제의 상대적인 양의 관점에서 표현된다. 이러한 메트릭스는 핵산 분자를 하나 이상의 표적 서열에 결합하는 것과 같은 다른 선택성 배열에 적용한다.
보다 일반적으로, 용어 "선택적"은 우선적 작용 또는 기능을 지칭한다. 용어 "선택적"은 다른 표적과 비교하여 관심있는 특정 표적에서의 우선적 효과의 관점에서 정량화될 수 있다. 예를 들어, 측정된 변수(예를 들어, 목적하는 세포 대 다른 세포에서 바이오마커 발현의 조절, 목적하는 세포 대 다른 세포의 농축 및/또는 결실 등)는 관심있는 표적 대 의도하지 않거나 원하지 않는 표적에 있어서 10%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 1-배, 1.5-배, 2-배, 2.5-배, 3-배, 3.5-배, 4-배, 4.5-배, 5-배, 5.5-배, 6-배, 6.5-배, 7-배, 7.5-배, 8-배, 8.5-배, 9-배, 9.5-배, 10-배, 11-배, 12-배, 13-배, 14-배, 15-배, 16-배, 17-배, 18-배, 19-배, 20-배, 25-배, 30-배, 35-배, 40-배, 45-배, 50-배, 55-배, 60-배, 70-배, 80-배, 90-배, 100-배 이상, 또는 그 사이를 포함하는 임의의 범위(예를 들어, 50% 내지 16-배)로 상이하다. 동일한 배수 분석이 주어진 조직, 세포 집단, 측정된 변수 및/또는 측정된 효과 등에서의 효과의 크기, 예컨대 세포 비, 과증식성 세포 성장률 또는 부피, 세포 증식률 등 세포 수 등을 확인하는데 사용될 수 있다.
대조적으로, 용어 "특이적"은 배타적인(exclusionary) 작용 또는 기능을 지칭한다. 예를 들어, 단백질과 하나의 결합 파트너 간의 상호작용의 특이적 조절은 그 상호작용의 배타적인 조절을 지칭하며, 단백질과 다른 결합 파트너 간의 상호작용의 임의의 현저한 조절을 지칭하지 않는다. 다른 예에서, 미리 결정된 항원에 대한 항체의 특이적 결합은 다른 항원에 결합하지 않고 관심있는 항원에 결합하는 항체의 능력을 지칭한다. 전형적으로, 항체는 분석물로서 관심있는 항원을 그리고 리간드로서 항체를 사용하여 BIACORE® 검정 기기에서 표면 플라스몬 공명(SPR) 기술에 의해 결정되었을 때, 대략 1×10-7M 미만, 예컨대 대략 10-8M 미만, 10-9M 미만, 10-10M 미만, 10-11M 미만 또는 그보다 낮은 친화성(KD)으로 결합하고, 미리 결정된 항원 또는 밀접하게 관련된 항원 이외의 비-특이적 항원(예를 들어, BSA, 카세인)에 대한 결합에 대한 친화성보다 적어도 1.1-배, 1.2-배, 1.3-배, 1.4-배, 1.5-배, 1.6-배, 1.7-배, 1.8-배, 1.9-배, 2.0-배, 2.5-배, 3.0-배, 3.5-배, 4.0-배, 4.5-배, 5.0-배, 6.0-배, 7.0-배, 8.0-배, 9.0-배 또는 10.0-배 또는 그보다 큰 친화성으로 미리 결정된 항원에 결합한다. 또한, KD는 KA의 역이다. 어구 "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 특이적인 항체"는 본 명세서에서 용어 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"와 상호교환적으로 사용된다.
용어 "소분자"는 당업계의 용어이며, 약 1000 분자량 미만 또는 약 500 분자량 미만인 분자를 포함한다. 일 실시형태에서, 소분자는 펩타이드 결합만을 포함하지 않는다. 다른 실시형태에서, 소분자는 올리고머가 아니다. 활성에 대해 스크리닝될 수 있는 예시적 소분자 화합물은 펩타이드, 펩타이도모방체, 핵산, 탄수화물, 작은 유기 분자(예를 들어, 폴리케타이드)(문헌[Cane et al. (1998) Science 282:63]) 및 천연물 추출 라이브러리를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 다른 실시형태에서, 화합물은 작은 유기 비-펩타이드성 화합물이다. 용어는 달리 명시되지 않는 한, 관심있는 화학 구조의 모든 입체이성질체, 기하이성질체, 호변이성질체 및 동위원소를 포함하는 것으로 의도된다.
용어 "대상체"는 동물, 척추동물, 포유동물 또는 인간을 지칭하며, 특히 그 중 하나에 예를 들어, 실험적, 진단적 및/또는 치료적 목적을 위해 작용제가 투여되거나, 또는 샘플이 투여되거나, 또는 절차가 수행된다. 일부 실시형태에서, 대상체는 포유동물, 예를 들어 인간, 비인간 영장류, 설치류(예를 들어, 마우스 또는 래트), 가축(예를 들어, 소, 양, 고양이, 개 및 말) 또는 다른 동물, 예컨대 라마 및 낙타이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 암을 가진 인간 대상체이다. 용어 "대상체"는 "환자"와 상호교환적으로 사용될 수 있다.
용어 "생존"은 다음을 모두 포함한다: 전체 생존기간이라고도 알려져 있는 사망할 때까지의 생존기간(상기 사망률은 원인과 무관하거나 종양과 관련이 있을 수 있음); "무재발 생존기간"(용어 재발은 국소 재발 및 원격 재발을 모두 포함하여야 함); 무전이 생존기간; 무질환 생존기간(용어 질환은 암 및 이와 관련된 질환을 포함하여야 함). 상기 생존의 기간은 정의된 시작 시점(예를 들어, 진단 또는 치료 시작의 시점) 및 종료 시점(예를 들어, 사망, 재발 또는 전이)을 참조하여 계산될 수 있다. 또한, 치료의 효능 기준은 화학요법에 대한 반응, 생존 가능성, 주어진 기간 내의 전이 가능성 및 종양 재발의 가능성을 포함하도록 확장될 수 있다.
용어 "시너지 효과"는 단독의 암 작용제/요법의 개별 효과의 합보다 큰 2개 이상의 작용제(예를 들어, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 바이오마커의 조절인자 및 면역요법 병용 요법)의 조합된 효과를 지칭한다.
용어 "표적"은 본 명세서에 기재된 작용제, 조성물 및/또는 제형에 의해 조절, 저해 또는 침묵되는 유전자 또는 유전자 산물을 지칭한다. 표적 유전자 또는 유전자 산물은 야생형 및 돌연변이체 형태를 포함한다. 본 발명에 포함되는 표적의 비-제한적인, 대표적인 리스트는 표 1 및 표 2에 제공된다. 유사하게는, 동사로 사용되는 용어 "표적", "표적들" 또는 "표적화" 표적 유전자 또는 유전자 산물의 활성을 조절하는 것을 지칭한다. 표적화는 표적 유전자 또는 유전자 산물의 활성을 상향조절 또는 하향조절하는 것을 지칭할 수 있다.
용어 "치료적 효과"는 약리학적으로 활성인 물질에 의해 유발되는 동물, 특히 포유동물 및 보다 특히 인간에서의 국소적 또는 전신적 효과를 포함한다. 따라서, 용어는 질환의 진단, 치유, 경감, 치료 또는 예방에 사용하거나 동물 또는 인간에서 바람직한 물리적 또는 정신적 발달 및 상태의 향상에 사용하기 위해 의도된 임의의 물질을 의미한다. 용어에 포함되는 예방적 효과는 질환 또는 병태의 출현을 지연 또는 제거, 질환 또는 병태의 증상의 개시를 지연 또는 제거, 질환 또는 병태의 진행을 감속, 중단 또는 역전시키는 것 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
용어 작용제(이러한 작용제를 포함하는 조성물 및/또는 제형을 포함)의 "유효량" 또는 "효과적인 용량"은 예를 들어, 선택된 투여 형태, 경로 및/또는 스케쥴에 따라 세포 또는 유기체에 전달될 때, 목적하는 생물학적 및/또는 약리학적 효과를 달성하기에 충분한 양을 지칭한다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 효과적인 특정 작용제 또는 조성물의 절대량은 목적하는 생물학적 또는 약리학적 종말점, 전달될 작용제, 표적 조직 등과 같은 이러한 인자에 따라 달라질 수 있다. 당업자는 "유효량"이 다양한 실시형태에서 단일 용량으로 또는 다중 용량의 사용을 통해 세포와 접촉되거나 대상체에게 투여될 수 있음을 추가로 이해할 것이다. 용어 "유효량"은 "치료적 유효량"일 수 있다.
용어 "치료적 유효량"은 임의의 의학적 치료에 적용할 수 있는 합리적인 이익/위험비로 동물에서 세포의 적어도 하위집단에서 일부 목적하는 치료 효과를 생성하는데 효과적인 작용제의 양을 지칭한다. 대상 화합물의 독성 및 치료적 효능은 세포 배양물 또는 실험적 동물에서 예를 들어, LD50 및 ED50을 결정하기 위한 표준 약제학적 절차에 의해 결정될 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 조성물이 바람직하다. 일부 실시형태에서, LD50(치명적 투여량)이 측정될 수 있으며, 작용제를 투여하지 않은 것과 비교하여 작용제에 대해 예를 들어, 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000% 이상 감소될 수 있다. 유사하게는, ED50(즉, 증상의 절반-최대 억제를 달성하는 농도)이 측정될 수 있으며, 작용제를 투여하지 않은 것과 비교하여 작용제에 대해 예를 들어, 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000% 이상 증가될 수 있다. 또한, 유사하게는, IC50(즉, 암 세포에 대해 절반-최대 세포독성 또는 세포증식 억제 효과를 달성하는 농도)이 측정될 수 있으며, 작용제를 투여하지 않는 것과 비교하여 작용제에 대해 예를 들어, 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000% 또는 그 이상 증가될 수 있다. 일부 실시형태에서, 검정에서 암 세포 성장은 적어도 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 심지어 100%로 저해될 수 있다. 다른 실시형태에서, 고형 악성종양의 적어도 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 심지어 100%의 감소가 달성될 수 있다.
용어 "내성" 또는 "무반응성"은 예를 들어, 활성화 수용체 또는 사이토 카인을 통한 자극에 대한 세포, 예컨대 면역 세포의 무반응 상태(refractivity)를 포함한다. 예를 들어 면역 억제제에 노출되거나 고용량 항원에 노출되어 무반응이 발생할 수 있다. 몇 가지 독립적인 방법이 내성을 유발할 수 있다. 하나의 메커니즘은 "무력성(anergy)"으로 지칭되며, 이는 세포가 효과기 기능을 갖는 세포로 분화하기보다는 무반응 세포로 생체내에서 지속되는 상태로 정의된다. 이러한 무반응상태는 일반적으로 항원-특이적이며, 내성 항원에 대한 노출이 중단된 후에도 지속된다. 예를 들어, T 세포의 무력성은 사이토카인, 예를 들어 IL-2의 생산의 결핍을 특징으로 한다. T 세포 무력성은 T 세포가 항원에 노출되고, 제2 신호(공동자극성 신호)의 부재하에 제1 신호(T 세포 수용체 또는 CD-3 매개성 신호)를 받을 때 발생한다. 이러한 조건하에서, 동일한 항원에 대한 세포의 재노출은(공동자극성 폴리펩타이드의 존재하에 재노출이 발생하더라도) 사이토카인 생산 실패를 초래하므로, 증식에 실패한다. 그러나, 무력성 T 세포는 사이토카인(예를 들어, IL-2)과 함께 배양하면 증식할 수 있다. 예를 들어, ELISA에 의해 또는 지표 세포주를 사용하는 증식 검정에 의해 측정된 T 림프구에 의한 IL-2 생산의 결핍에 의해 T 세포 무력성이 또한 관찰될 수 있다. 대안적으로, 리포터 유전자 작제물이 사용될 수 있다. 예를 들어, 무력성 T 세포는 5' IL-2 유전자 인핸서의 제어하에 이종성 프로모터 또는 인핸서 내에서 발견될 수 있는 AP1 서열의 멀티머에 의해 유도된 IL-2 유전자의 전사를 개시하지 못한다(문헌[Kang et al. (1992) Science 257:1134]). 또 다른 메커니즘은 "고갈(exhaustion)"로 지칭된다. T 세포 고갈은 많은 만성 감염 및 암 동안 발생하는 T 세포 기능장애 상태이다. 이는 불량한 효과기 기능, 저해성 수용체의 지속적인 발현 및 기능적 효과기 또는 메모리 T 세포와 구별되는 전사 상태로 정의된다.
"전사된 폴리뉴클레오타이드" 또는 "뉴클레오타이드 전사체"는 바이오마커 핵산의 전사 및 정상적인 전사 후 가공(예를 들어, 스플라이싱) 및 존재하는 경우, RNA 전사체 및 RNA 전사체의 역 전사에 의해 만들어진 성숙 mRNA의 전부 또는 일부에 상보적이거나 상동성인 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, mRNA, hnRNA, CDNA 또는 이러한 RNA 또는 cDNA의 유사체)이다.
용어 "치료하다"는 관심있는 병태(예를 들어, 질환 또는 장애)의 치료적 관리 또는 개선을 지칭한다. 치료는 대상체에게 작용제 또는 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)을 투여하는 것을 포함할 수 있지만 이로 제한되지 않는다. 치료는 전형적으로 대상체에게 유익한 방식으로 질환의 진행 과정을 변경하기 위한 노력의 일환으로 실시된다(이 용어는 임의의 질환, 장애, 증후군 또는 요법을 보장하거나 잠재적으로 보장할 수 있는 바람직하지 않은 병태를 나타내는 데 사용됨). 치료의 효과는 치료의 효과는 질환의 역전, 중증도 감소, 발병 지연, 치유, 진행 억제 및/또는 이의 발생 또는 재발 가능성 또는 질환의 하나 이상의 증상 또는 발현을 감소시키는 것을 포함할 수 있다. 치료의 바람직한 효과는 질환의 발생 또는 재발 예방, 증상 완화, 질환의 임의의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이 예방, 질환 진행의 속도 감소, 질환 상태의 개선 또는 일시적 완화(palliation) 및 관해 또는 개선된 예후를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 치료제는 질환이 있거나 일반 집단에 비해 질환이 발생할 위험이 높은 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 치료제는 질환이 있었지만 질환의 증거를 더 이상 나타내지 않는 대상체에게 투여될 수 있다. 작용제는 예를 들어, 분명한 질환의 재발 가능성을 감소시키기 위해 투여될 수 있다. 치료제는 예방적으로, 즉, 질환의 임의의 증상 또는 발현의 발생 전에 투여될 수 있다. "예방적 치료"는 질환이 발생할 가능성을 줄이거나 질환이 발생할 경우 그 중증도를 줄이기 위해, 질환이 발병되지 않았거나 질환의 증거를 보이지 않는 대상체에게 의료 및/또는 외과적 관리를 제공하는 것을 지칭한다. 대상체는 질환이 발병할 위험이 있는(예를 들어, 일반 집단에 비해 위험이 증가) 것으로 또는 질환이 발병할 가능성을 증가시키는 위험 인자를 가지는 것으로 확인될 수 있다.
용어 "무반응성"은 요법에 대한 암 세포의 무반응 상태 또는 자극, 예를 들어 활성화 수용체 또는 사이토카인을 통한 자극에 대한 면역 세포와 같은 치료용 세포의 무반응 상태를 포함한다. 무반응성은 예를 들어, 면역 억제제에의 노출 또는 고용량의 항원에의 노출 때문에 발생할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "무력성" 또는 "내성"은 활성화 수용체-매개성 자극에 대한 무반응성 상태를 포함한다. 이러한 무반응성 상태는 일반적으로 항원-특이적이며, 내성 항원에 대한 노출이 중단된 후에도 지속된다. 예를 들어, T 세포에서의 무력성은 (무반응성과는 대조적으로) 사이토카인, 예를 들어 IL-2 생산의 결핍을 특징으로 한다. T 세포 무력성은 T 세포가 항원에 노출되고, 제2 신호(공동자극성 신호)의 부재하에 제1 신호(T 세포 수용체 또는 CD-3 매개성 신호)를 받을 때 발생한다. 이러한 조건하에서, 동일한 항원에 대한 세포의 재노출은(공동자극성 폴리펩타이드의 존재하에 재노출이 발생하더라도) 사이토카인 생산 실패를 초래하므로, 증식에 실패한다. 그러나, 무력성 T 세포는 사이토카인(예를 들어, IL-2)과 함께 배양하면 증식할 수 있다. 예를 들어, ELISA에 의해 또는 지표 세포주를 사용하는 증식 검정에 의해 측정된 T 림프구에 의한 IL-2 생산의 결핍에 의해 T 세포 무력성이 또한 관찰될 수 있다. 대안적으로, 리포터 유전자 작제물이 사용될 수 있다. 예를 들어, 무력성 T 세포는 5' IL-2 유전자 인핸서의 제어하에 이종성 프로모터 또는 인핸서 내에서 발견될 수 있는 AP1 서열의 멀티머에 의해 유도된 IL-2 유전자의 전사를 개시하지 못한다(문헌[Kang et al. (1992) Science 257:1134]).
용어 "백신"은 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 면역력을 생성하기 위한 조성물을 지칭한다.
또한, 특정 단백질의 아미노산 서열과 유전자 코드(아래에 나타냄)에 의해 정의된 바와 같이 단백질을 코딩할 수 있는 뉴클레오타이드 서열 사이에는 알려져 있고 명확한 관련성이 있다. 마찬가지로, 특정 핵산의 뉴클레오타이드 서열과 유전자 코드에 의해 정의된 바와 같이 그 핵산에 의해 암호화되는 아미노산 서열 사이에는 알려져 있고 명확한 관련성이 있다.
Figure pct00017
Figure pct00018
유전자 코드의 중요하고 잘 알려진 특징은 불필요한 중복(redundancy)이다. 따라서, 단백질을 만드는 데 사용되는 대부분의 아미노산에 대해 하나 이상의 코딩 뉴클레오타이드 트리플릿이 사용될 수 있다(위에 예시됨). 따라서, 주어진 아미노산 서열에 대해 다수의 상이한 뉴클레오타이드 서열이 코딩될 수 있다. 이러한 뉴클레오타이드 서열은 모든 유기체에서 동일한 아미노산 서열을 생성하기 때문에 기능적으로 동등한 것으로 간주된다(소정의 유기체는 다른 것보다 일부 서열을 더 효율적으로 번역할 수 있음). 또한, 때대로, 퓨린 또는 피리미딘의 메틸화된 변이체가 주어진 뉴클레오타이드 서열에서 발견될 수 있다. 이러한 메틸화는 트라이뉴클레오타이드 코돈 및 상응하는 아미노산 사이의 코딩 관계에 영향을 미치지 않는다.
전술 한 관점에서, 바이오마커 핵산(또는 이들의 임의의 부분)을 암호화하는 DNA 또는 RNA의 뉴클레오타이드 서열은 DNA 또는 RNA를 아미노산으로 번역하는 유전자 코드를 사용하여 폴리펩타이드 아미노산 서열을 유도하는 데 사용될 수 있다. 마찬가지로, 폴리펩타이드 아미노산 서열의 경우, 폴리펩타이드를 암호화할 수 있는 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 유전자 코드로부터 추론될 수 있다(이는 중복성 때문에 임의의 주어진 아미노산 서열에 대해 다중 핵산 서열을 생성할 것이다). 따라서, 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 대한 본 명세서의 설명 및/또는 개시는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열의 설명 및/또는 개시를 포함하는 것으로 간주되어야 한다. 유사하게는, 본 명세서의 폴리펩타이드 아미노산 서열의 설명 및/또는 개시는 또한 아미노산 서열을 암호화할 수 있는 모든 가능한 뉴클레오타이드 서열의 설명 및/또는 개시를 포함하는 것으로 간주되어야 한다.
II. 단핵구 및 대식세포
단핵구는 혈액, 골수 및 비장에서 순환하며 정상 상태에서 제한된 증식을 보이는 골수성-유래 면역 효과기 세포이다. 　용어 "골수성 세포(myeloid cell)"는 골수 또는 척수의 과립구 또는 단핵구 전구체 세포, 또는 골수 또는 척수에서 발견되는 것과 유사한 것들을 지칭할 수 있다. 골수성 세포 계통은 말초 혈액에서 순환하는 단핵구성 세포 및 성숙, 분화 및/또는 활성화에 따라 생성되는 세포 집단을 포함한다. 이러한 집단은 비-말단성으로 분화된 골수성 세포, 골수 유래 억제 세포 및 분화된 대식세포를 포함한다. 분화된 대식세포는 비-분극화 및 분극화 대식세포, 휴지 및 활성화된 대식세포를 포함한다. 제한없이, 골수성 계통은 또한 과립구성 전구체, 다형핵 유래 억제 세포, 분화된 다형핵 백혈구 세포, 호중구, 과립구, 호염구, 호산구, 단핵구, 대식세포, 미세아교세포, 골수성 유래 억제 세포, 수지상 세포 및 적혈구를 포함할 수 있다. 단핵구는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 발견되며, 이는 또한 다른 조혈 및 면역 세포, 예컨대 B 세포, T 세포, NK 세포 등을 포함한다. 단핵구는 단핵모세포라 불리는 조혈 줄기 세포 전구체로부터의 골수에 의해 생성된다. 단핵구는 면역 체계에서 두 가지 주요 기능을 가진다: (1) 정상 상태하에서 상주 대식세포 및 수지상 세포(DC)를 보충하기 위해 혈류를 빠져나갈 수 있으며, (2) 조직의 감염 부위로 빠르게 이동하고, 대식세포 및 염증성 수지상 세포로 분열/분화하여 염증 신호에 대한 반응으로 면역 반응을 이끌어낸다. 단핵구는 일반적으로 이들의 큰 이엽의 핵(bilobate nucleus)에 의해 염색된 얼룩으로 확인된다. 단핵구는 또한 감염 중에 혈액에서 조직으로의 이동을 매개하는 케모카인 수용체 및 병원균 인식 수용체를 발현한다. 이들은 염증성 사이토카인과 및 포식작용 세포를 생산한다. 일부 실시형태에서, 관심있는 단핵구 및/또는 대식세포는 CD11b+ 발현 및/또는 CD14+ 발현에 따라 확인된다.
아래에 더 상세히 기재되는 바와 같이, 단핵구는 대식세포로 분화할 수 있다. 단핵구는 또한 예컨대, 사이토카인 과립구 대식세포 콜로니-자극 인자(granulocyte macrophage colony-stimulating factor: GM-CSF) 및 인터류킨 4(IL-4)의 작용을 통해 수지상 세포로 분화할 수 있다. 일반적으로, 용어 "단핵구"는 미분화된 단핵구뿐만 아니라 대식세포 및 수지상 세포를 포함하는 그로부터 분화된 세포 유형을 포함한다. 일부 실시형태에서, 용어 "단핵구"는 미분화된 단핵구를 지칭할 수 있다.
대식세포는 중요한 면역 효과기이며, 염증 및 선천성 면역 반응의 조절인자이다. 대식세포는 이종성이며, 조직에 상주하며, 말단-분화된 선천적 골수성 세포이며, 이는 현저한 가소성을 가지며, 미세환경으로부터의 국부적 신호(cue)에 반응하여 이들의 생리를 변화시킬 수 있고, 숙주 방어에서 조직 항상성에 이르기까지 다양한 기능적 요구사항을 맡을 수 있다(문헌[Ginhoux et al. (2016) Nat. Immunol. 17:34-40]). 대식세포는 신체의 거의 모든 조직에 존재한다. 이들은 조직 상주 대식세포, 예를 들어 간에 상주하는 쿠퍼 세포이거나, 또는 주로 골수 및 비장 저장소에서 유래하고, 정상 상태에서 또는 염증 또는 다른 자극 신호에 반응하여 조직으로 이동하는 순환하는 단핵구성 전구체(즉, 단핵구)로부터 유래된다. 예를 들어, 단핵구는 혈액에서 조직으로 동원되어 뼈, 폐포(폐), 중추 신경계, 결합 조직, 위장관, 간, 비장 및 복막의 조직 특이적 대식세포를 보충할 수 있다.
용어 "조직-상주 대식세포"는 조직 면역-감시, 감염에 대한 반응 및 염증의 분해와 같은 조직-특이적 및/또는 미세-해부학적 환경-특이적 기능 및 전용의 항상성 기능을 총족시키는 면역 세포의 이종성 집단을 지칭한다. 조직 상주 대식세포는 배아의 난황낭에서 유래하고, 발달중인 태아의 특정 조직에서 성숙하여, 조직-특이적 역할을 획득하고 이들의 유전자 발현 프로파일을 변경한다. 콜로니-형성 능력을 유지하는 조직 상주 대식세포의 국소 증식은 조직에서 성숙 대식세포의 집단을 직접 유발할 수 있다. 조직 상주 대식세포는 또한 그들이 점유하는 조직에 따라 확인되고 명명될 수 있다. 예를 들어, 지방 조직 대식세포는 지방 조직을 점유하고, 쿠퍼 세포는 간 조직을 점유하며, 부비강 조직세포는 림프절을 점유하고, 폐포낭 대식세포(먼지 세포)는 폐포를 점유하며, 랑게르한스 세포는 피부 및 점막 조직을 점유하고, 거대세포에 이르는 조직세포는 결합 조직을 점유하며, 미세아교세포는 중추 신경계(CNS) 조직을 점유하고, 호프바우어 세포는 태반 조직을 점유하며, 사구체 안 혈관사이세포는 신장 조직을 점유하고, 파골세포는 뼈 조직을 점유하며, 유상피 세포는 육아종을 점유하고, 적색 속질 대식세포(동양혈관 내막세포)는 비장 조직의 적색 속질을 점유하며, 복막강 대식세포는 복막강 조직을 점유하고, 라이소솜성 세포는 파이어판(Peyer's patch) 조직을 점유하며, 췌장 대식세포는 췌장 조직을 점유한다.
감염원 및 다른 염증 반응에 대한 숙주 방어 외에도, 대식세포는 발달, 상처 치유 및 조직 복구 및 면역 반응의 조절을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 다양한 항상성 기능을 수행할 수 있다. 식균 작용을 통해 감염을 방어하는 체내 식균 작용 세포로 처음 인식된 대식세포는 선천성 면역력의 필수 구성요소이다. 병원균 및 다른 염증 자극에 대한 반응에서, 활성화된 대식세포는 감염된 박테리아 및 다른 미생물을 삼키고; 염증을 자극하고, 이러한 세포내 미생물에 전-염증성 분자의 칵테일을 방출한다. 병원균을 삼킨 후, 대식세포는 T 세포에 병원성 항원을 제시하여 방어를 위한 후천성 면역 반응을 더 활성화한다. 예시적 전-염증성 분자는 사이토카인 IL-1β, IL-6 및 TNF-α, 케모카인 MCP-1, CXC-5 및 CXC-6 및 CD40L을 포함한다.
감염에 대한 숙주 방어에 기여하는 것 외에도, 대식세포는 면역 반응에 관여하는 것과 관계없이 중요한 항상성 역할을 한다. 대식세포는 적혈구를 제거하는 엄청난 식세포이며, 철과 헤모글로빈과 같은 방출된 물질은 숙주가 재사용할 수 있도록 재활용될 수 있다. 이러한 제거 과정은 이 과정 없이는 숙주가 생존할 수 없는 중요한 대사적 기여이다.
대식세포는 또한 조직 리모델링 중에 생성되는 세포 찌꺼기의 제거 및 아폽토시스를 겪은 세포를 빠르고 효과적으로 제거하는데 관여한다. 대식세포는 아폽토시스성 세포의 제거를 통해 정상-상태 조직 항상성에 관여하는 것으로 여겨진다. 이러한 항상성 제거 과정은 일반적으로 스캐빈저 수용체, 포스파티딜 세린 수용체, 트롬보스폰딘 수용체, 인테그린 및 보체 수용체를 포함하는 대식세포에서 표면 수용체에 의해 매개된다. 식균 작용을 매개하는 이러한 수용체는 사이토카인-유전자 전사를 유도하는 신호를 전달하지 못하거나, 또는 저해성 신호 및/또는 사이토카인을 적극적으로 생성한다. 대식세포의 항상성 기능은 다른 면역 세포와 무관하다.
대식세포는 외상 또는 기타 세포에 대한 손상으로 인한 세포 찌꺼기/괴사 세포를 제거할 수 있다. 대식세포는 톨-유사 수용체(TLR), 세포내 패턴-인식 수용체 및 인터류킨-1 수용체(IL-1R)를 통해 괴사 세포의 찌꺼기에 존재하는 내인성 위험 신호를 감지하며, 이들 대부분은 어댑터 분자 골수성 분화 일차-반응 유전자 88(MyD88)를 통해 신호를 보낸다. 세포 찌꺼기의 제거는 대식세포의 생리를 현저하게 바꿀 수 있다. 괴사를 제거하는 대식세포는 표면 단백질 발현의 변화 및 사이토카인 및 전-염증성 매개체의 생성을 포함하여, 이들의 생리에서 극적인 변화를 겪을 수 있다. 이러한 자극에 대한 반응으로 대식세포 표면-단백질 발현의 변경은 잠재적으로 이러한 변경된 세포에 고유한 생화학적 마커를 확인하는데 사용될 수 있다.
대식세포는 백색 지방 조직, 갈색 지방 조직, 간 및 췌장과 같은 많은 조직에서 항상성을 유지하는데 중요한 기능을 한다. 조직 대식세포는 조직 세포가 적응할 수 있도록 일련의 변화를 유발하는 세포 신호전달 분자를 방출함으로써 조직에서의 변화하는 조건에 빠르게 반응할 수 있다. 예를 들어, 지방 조직에서 대식세포는 식이의 변화(예를 들어, 백색 지방 조직에서의 대식세포) 또는 저온에의 노출(갈색 지방 조직에서의 대식세포)에 반응하여 새로운 지방 세포의 생성을 조절한다. 쿠퍼 세포로 알려진 간의 대식세포는 식이 변화에 반응하여 포도당과 기질의 분해를 조절한다. 췌장의 대식세포는 고지방 식이에 대한 반응으로 인슐린 생산을 조절할 수 있다.
대식세포는 또한 상처 치유 및 조직 복구에 기여할 수 있다. 예를 들어, 손상된 조직 및 세포로부터 유래된 신호에 대한 반응으로, 대식세포는 활성화되고, 손상된 조직을 복구하기 위해 조직-복구 반응을 유도할 수 있다(문헌[Minutti et al. (2017) Science 356:1076-1080]).
배아 발달 과정에서, 대식세포는 또한 조직 리모델링 및 장기 발달에도 중요한 역할을 한다. 예를 들어, 상주 대식세포는 신생아 마우스 심장의 혈관 발달을 적극적으로 형성한다(문헌[Leid et al.(2016) Circ. Res. 118:1498-1511]). 뇌의 미세아교세포는 배아 발달 동안 뇌 발달에 뉴런 및 혈관을 안내하는 성장 인자를 생성할 수 있다. 유사하게는, 대식세포-생산 단백질인 CD95L은 뉴런 표면의 CD95 수용체와 결합하여, 마우스 배아의 뇌에서 혈관을 발달시키고 뉴런 및 혈관 발달을 증가시킨다(문헌[Chen et al. (2017) Cell Rep. 19:1378-1393]). 리간드가 없으면, 뉴런의 분지 빈도가 줄어들고, 그 결과 성인 뇌는 전기적 활성을 적게 나타낸다. 파골세포로 알려진 단핵구-유래 세포는 뼈 발달에 관여하며, 이러한 세포가 없는 마우스는 조밀하고 딱딱한 뼈(골석화증으로 알려진 희귀한 병태)가 발생한다. 대식세포는 또한 유선의 발달을 조율하고, 출생 후 초기에 망막 발달을 돕는다(문헌[Wynn et al.(2013) Nature 496:445-455]).
위에 기재된 바와 같이, 대식세포는 면역 체계를 조절한다. 세포에 대한 항원 제시 외에도, 대식세포는 일부 조건에서 면역세포에 면역억제성/저해성 신호를 제공할 수 있다. 예를 들어, 고환에서, 대식세포는 정자가 면역 체계의 공격을 받지 않도록 보호 환경을 조성한다. 고환의 조직 상주 대식세포는 정자에 대한 면역 세포 반응을 방지하는 면역억제 분자를 생산한다(문헌[Mossadegh-Keller et al.(2017) J. Exp. Med. 214:10.1084/jem.20170829]).
상이한 환경 신호에 반응하고 및 이들의 기능적 요구사항과 일치하는 대식세포의 가소성은 연속체의 두 극단, 즉 "전형적으로 활성화된" M1 및 "대안적으로 활성화된" M2 대식세포를 포함하는 다양한 대식세포 활성화 상태를 초래하였다.
용어 "활성화"는 검출 가능한 세포 증식을 유도하기 위해 충분히 자극되고/되거나 효과기 기능, 예컨대 유도된 사이토카인 발현 및 분비, 식균 작용, 세포 신호전달, 항원 가공 및 제시, 표적 세포 살해 및 전-염증성 기능을 발휘하도록 자극된 단핵구 및/또는 대식세포의 상태를 지칭한다.
용어 "M1 대식세포" 또는 "전형적으로 활성화된 대식세포"는 전-염증성 표현형을 갖는 대식세포를 지칭한다. 용어 "대식세포 활성화"("전형적인 활성화"로도 지칭됨)는 병원균에 대한 이차 노출시 BCG(칼메트-게렝균(bacillus Calmette-Guerin)) 및 리스테리아에 대한 항원-의존적이지만 비-특이적으로 향상된, 대식세포의 살균 활성을 설명하기 위해 감염의 맥락에서 1960년대에 Mackaness에 의해 도입되었다(문헌[Mackaness (1962) J. Exp. Med. 116:381-406]).
향상은 나중에 항원-활성화 면역 세포에 의한 Th1 반응 및 IFN-γ 생성과 관련이 있으며(문헌[Nathan et al. (1983) J. Exp. Med. 158:670-689]), 세포독성 및 항종양 특성으로 확장되었다(문헌[Pace et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:3782-3786; Celada et al. (1984) J. Exp. Med. 160:55-74]). 따라서, 사이토카인 분비, 항원 제시, 식균 작용, 세포-세포 상호작용, 이동 등에 의해 염증을 향상시키는 임의의 대식세포 기능은 전-염증성으로 간주된다. 시험관내 및 생체내 검정은 다양한 종말점을 측정할 수 있고: 일반적인 시험관내 측정은 증식, 이동, 전-염증성 Th1 사이토카인/케모카인 분비 및/또는 이동에 의해 측정된 바와 같은 전-염증성 세포 자극을 포함하며, 일반적인 생체내 측정은 병원균 퇴치, 조직 손상 즉시 반응인자, 다른 세포 활성인자, 이동 유도제 등을 분석하는 것을 더 포함한다. 시험관내 및 생체내에 둘 다에 대해, 전-염증성 항원 제시가 평가될 수 있다. 리포폴리사카라이드(LPS), 소정의 톨-유사 수용체(TLR) 효능제, Th1 사이토카인 인터페론-감마(IFNγ)(예를 들어, 스트레스 및 감염에 대한 반응으로 NK 세포에 의해 생성된 IFNγ 및 지속적으로 생성되는 T 헬퍼 세포) 및 TNF와 같은 세균성 모이어티는 M1 경로에 따라 대식세포를 분극화시킨다. 활성화된 M1 대식세포가 포식하고, 미생물을 파괴하고, 손상된 세포(예를 들어, 종양 세포 및 아폽토시스성 세포)를 제거하고, 후천성 면역 반응을 증가시키기 위해 T 세포에 항원을 제시하고, 높은 수준의 전-염증성 사이토카인(예를 들어, IL-1, IL-6 및 IL-23), 반응성 산소 종(ROS) 및 산화질소(NO)를 생산할 뿐만 아니라, 다른 면역 및 비-면역 세포를 활성화한다. 유도성 산화질소 신테이스(iNOS), 반응성 산소 종(ROS)의 발현 및 Th1-관련 사이토카인 IL-12의 생성을 특징으로 하는, M1 대식세포는 강력한 면역 반응을 촉진하도록 잘 조정된다. M1 대식세포의 대사는 강화된 호기성 해당과정, 포도당을 젖당으로 전환, 5탄당 인산 경로(PPP), 지방산 합성 및 절단된 트라이카복실산(TCA) 사이클을 통한 플럭스의 증가, 석시네이트 및 시트레이트의 축적 유발을 특징으로 한다.
"제1형" 또는 "M1-유사" 단핵구 및/또는 대식세포는 다음 중 적어도 하나를 특징으로 하는 전-염증성 반응에 기여할 수 있는 단핵구 및/또는 대식세포이다: 적어도 하나의 전-염증성 사이토카인을 분비하여 염증성 자극을 생성하는 것, 적어도 하나의 세포 표면 활성화 분자/활성화 분자에 대한 리간드를 그 표면에 발현하는 것, 적어도 하나의 다른 세포(다른 대식세포 및/또는 T 세포를 포함)를 동원/지시/상호작용하여 전-염증성 반응을 자극하는 것, 전-염증성 맥락에서 항원을 제시하는 것, 전-염증성 반응 개시를 허용하는 부위로 이동하는 것 또는 전-염증성 기능으로 이어질 것으로 예상되는 적어도 하나의 유전자의 발현을 시작하는 것. 일부 실시형태에서, 용어는 세포독성 CD8+ T 세포를 활성화하는 것, 면역관문 요법과 같은 면역요법에 대해 암 세포의 증가된 감수성을 매개하고/하거나 저항성에 대한 암 세포의 역전을 매개하는 것을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 전-염증성 상태에 대한 이러한 조절은 다음 중 하나 이상을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 다수의 잘 알려진 방식으로 측정될 수 있다: a) 증가된 분화 클러스터 80(CD80), CD86, MHCII, MHCI, 인터류킨 1-베타(IL-1β, IL-6, CCL3, CCL4, CXCL10, CXCL9, GM-CSF 및/또는 종양 괴사 인자 알파(TNF-α); b) CD206, CD163, CD16, CD53, VSIG4, PSGL-1, TGFb 및/또는 IL-10의 감소된 발현 및/또는 분비; c) IL-1β, TNF-α, IL-12, IL-18, GM-CSF, CCL3, CCL4 및 IL-23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 사이토카인 또는 케모카인의 증가된 분비; d) IL-1β, IL-6 및/또는 TNF-α의 발현 대 IL-10의 발현의 증가된 비; e) 증가된 CD8+ 세포독성 T 세포 활성화; f) CD8+ 세포독성 T 세포 활성화의 증가된 동원; g) 증가된 CD4+ 헬퍼 T 세포 활성; h) CD4+ 헬퍼 T 세포 활성의 증가된 동원; i) 증가된 NK 세포 활성; j) NK 세포의 증가된 동원; k) 증가된 호중구 활성; l) 증가된 대식세포 활성; 및/또는 m) 현미경에 의해 평가되는 바와 같이 증가된 방추형 형태, 외관의 편평함 및/또는 수상돌기의 수.
이미 전-염증성인 세포에서, 증가된 염증성 표현형은 더 많은 전-염증성 상태를 지칭한다.
대조적으로, 용어 "M2 대식세포"는 항-염증성 표현형을 갖는 대식세포를 지칭한다. Th2-유래 및 종양-유래 사이토카인, 예컨대 IL-4, IL-10, IL-13, 전환 성장인자 베타(transforming growth factor beta: TGF-β) 또는 프로스타글란딘 E2(PGE2)는 M2 분극화를 전파할 수 있다. M2 대식세포의 대사 프로파일은 OXPHOS, FAO, 감소된 해당과정 및 PPP에 의해 정의된다. 만노스 수용체가 뮤린 대식세포에서 Th2 IL-4 및 IL-13에 의해 선택적으로 강화되고, 만노실화된 리간드의 높은 식작용성 제거를 유도하고, 주 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 II 항원 발현을 증가시키고, 전-염증성 사이토카인 분비를 감소시켰다는 발견은, Stein, Doyle 및 동료들이 IL-4 및 IL-13이 IFN-γ 활성화와는 완전히 다르지만 비활성화와는 거리가 먼 상태인 대안적 활성화 표현형을 유도하였다는 제안에 이르게 하였다(문헌[Martinez and Gordon (2014) F1000 Prime Reports 6:13]). 시험관내 및 생체내 정의/검정은 다양한 종말점을 측정할 수 있고: 일반적인 시험관내 종말점은 증식, 이동, 항-염증성 Th2 사이토카인/케모카인 분비 및/또는 이동에 의해 측정된 항-염증성 세포 자극을 포함하며, 일반적인 생체내 M2 종말점은 병원균 퇴치, 조직 손상이 지연된/전-섬유증성 반응, 다른 세포 Th2 분극화, 이동 유도제 등을 분석하는 것을 더 포함한다. 시험관내 및 생체내에 둘 다에 대해, 전-면역관용 항원 제시가 평가될 수 있다.
"제2형" 또는 "M2-유사" 단핵구 및/또는 대식세포는 다음 중 적어도 하나를 특징으로 하는 항-염증성 반응에 기여할 수 있는 단핵구 및/또는 대식세포이다: 적어도 하나의 항-염증성 사이토카인을 분비함으로써 항-염증성 자극을 생성하는 것, 적어도 하나의 세포 표면 저해 분자/저해성 분자에 대한 리간드를 그 표면에 발현하는 것, 적어도 하나의 다른 세포를 동원/지시/상호작용하여 항-염증성 반응을 자극하는 것, 전-면역관용의 맥락에서 항원을 제시하는 것, 전-면역관용 반응 개시를 허용하는 부위로 이동하는 것 또는 전-면역관용/항-염증성 기능으로 이어질 것으로 예상되는 적어도 하나의 유전자의 발현을 시작하는 것. 소정의 실시형태에서, 전-염증성 상태에 대한 이러한 조절은 제1형 전-염증성 상태 측정의 반대를 포함하지만 이로 제한되지 않는 다수의 잘 알려진 방식으로 측정될 수 있다.
"증가된 염증성 표현형"을 갖는 세포는 a) 제1형의 열거된 기준 중 하나 이상의 증가 및/또는 b) 본 발명 적어도 하나의 바이오마커(예를 들어, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적)를 조절하는 작용제에 접촉되는 것과 같은 본 발명의 적어도 하나의 바이오마커(예를 들어, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적)의 조절 후 제2형의 열거된 기준 중 하나 이상의 감소와 관련된 더 많은 전-염증성 반응 능력을 갖는 것이다.
"감소된 염증성 표현형"을 갖는 세포는 a) 제1형의 열거된 기준 중 하나 이상의 감소 및/또는 b) 본 발명 적어도 하나의 바이오마커(예를 들어, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적)을 조절하는 작용제에 접촉되는 것과 같은 본 발명 적어도 하나의 바이오마커(예를 들어, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적)의 조절 후 제2형의 열거된 기준 중 하나 이상의 증가와 관련된 더 많은 항-염증성 반응 능력을 갖는 것이다.
따라서, 대식세포는 제1형 및 제2형 상태 사이의 중간 표현형으로 대안적으로 활성화된 상태의 연속체를 취할 수 있으며(예를 들어, 문헌[Biswas et al. (2010) Nat. Immunol. 11: 889-896; Mosser and Edwards (2008) Nat. Rev. Immunol. 8:958-969; Mantovani et al. (2009) Hum. Immunol. 70:325-330] 참조), 이러한 증가되거나 감소된 염증성 표현형은 위에 기재된 바와 같이 결정될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "대안적으로 활성화된 대식세포" 또는 "대안적으로 활성화된 상태"는 전형적으로 활성화된 M1 전-염증성 대식세포 이외의 본질적으로 모든 유형의 대식세포 집단을 지칭한다. 원래, 대안적으로 활성화된 상태는 M2형 항-염증성 대식세포에 대해서만 지정되었다. 용어는 이들의 생화학, 생리학 및 기능에 극적인 차이를 가진 대식세포의 다른 모든 대안적 활성화 상태를 포함하도록 확장되었다.
예를 들어, 대안적으로 활성화된 대식세포의 한 유형은 상처 치유와 관련된 것이다. 조직 손상(예를 들어, 외과적 상처) 중에 방출된 선천적 및 후천적 신호에 대한 반응으로, 예컨대 호염구 및 비만 세포, 조직-상주 대식세포에 의해 생성된 IL-4는 상처 치유를 촉진하도록 활성화될 수 있다. 상처 치유 대식세포는 높은 수준의 전-염증성 사이토카인을 생성하는 대신 고발현의 세포외 매트릭스 성분, 예를 들어 키티네이스 및 키티네이스-유사 단백질 YM1/CHI3L3, YM2, AMCase 및 스태빌린을 분비하며, 이들 모두는 탄수화물 및 매트릭스-결합 활성을 나타내며 조직 복구에 관여한다.
대안적으로 활성화된 대식세포의 다른 예는 선천성 및 후천성 면역 반응에 의해 유도될 수 있는 조절성 대식세포를 포함한다. 조절성 대식세포는 면역-조절성 기능에 기여할 수 있다. 예를 들어, 대식세포는 시상하부-뇌하수체-부신(hypothalamic-pituitary-adrenal: HPA) 축(예를 들어, 글루코코르티코이드)로부터의 호르몬에 반응하여 전-염증성 사이토카인의 전사의 저해와 같은 숙주 방어 및 염증성 기능이 저해된 상태를 취할 수 있다. 조절성 대식세포는 조절성 사이토카인 TGF-β을 생성하여 소정의 조건에서, 예를 들어 후천성 면역 반응의 후기 단계에서 면역 반응을 약화시킬 수 있다. 많은 조절성 대식세포가 높은 수준의 공동-자극 분자(예를 들어, CD80 및 CD86)를 발현하므로 T 세포에 대한 항원 제시가 향상될 수 있다.
많은 자극/신호가 조절성 대식세포의 분극화를 유도할 수 있다. 신호는 TLR 효능제 및 면역 복합체의 조합, 아폽토시스성 세포, IL-10, 프로스타글란딘, GPcR 리간드, 아데노신, 도파민, 히스타민, 스핑고신1-포스페이트, 멜라노코르틴, 혈관작용성 장 펩타이드 및 Siglec-9를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 기생충, 바이러스 및 박테리아와 같은 일부 병원균은 특히 조절성 대식세포의 분화를 유도하여 결함이 있는 병원균 살해 및 감염된 미생물의 생존 및 확산을 향상시킬 수 있다.
조절성 대식세포 일부 공통적인 특징을 공유한다. 예를 들어, 조절성 대식세포는 이들의 항-염증성 활성을 유도하기 위해 두 가지의 자극을 필요로 한다. 상이한 자극/신호에 의해 유도되는 조절성 대식세포 하위집단 간의 차이 또한 관찰되어, 이들의 이종성을 반영한다.
조절성 대식세포는 또한 항상성 유지에서 발달 과정 중 대사에서 발견되는 다양한 하위집단을 포함하는 이종성 대식세포의 집단이다. 일 예에서, 대안적으로 활성화된 대식세포의 하위집단은 M-CSF/GM-CSF, CD16 리간드(예컨대, 면역글로불린) 및 IFN-γ의 존재하에 유도될 수 있는 고유의 면역조절성 특성을 갖는 면역조절성 대식세포이다(PCT 출원 공개 WO2017/153607).
조직에서 대식세포는 시간이 지남에 따라 생체내에서 활성화 상태를 변경할 수 있다. 이러한 동역학은 대식세포를 조직으로 이동시키는 지속적인 유입, 활성화된 대식세포의 동적 변화 및 휴지 상태를 되돌리는 대식세포를 반영한다. 일부 조건에서, 환경에서의 상이한 신호는 상이한 활성화 상태의 혼합으로 대식세포를 유도할 수 있다. 예를 들어, 만성의 상처가 있는 상태에서, 대식세포는 시간이 지남에 따라 전-염증성 활성화 하위집단인, 상처 치유를 유도하는 대식세포 및 일부 분해 활성 유도를 나타내는 대식세포를 포함할 수 있다. 비-병리적 조건하에서, 면역-자극성 및 면역-조절성 대식세포의 균형잡힌 집단이 면역 체계에 존재한다. 일부 질환 상태에서, 균형이 깨지며, 불균형으로 인해 많은 임상적 병태가 발생한다.
대식세포의 명백한 가소성은 또한 이들이 질환 상태에서 받는 환경 신호에 취약한 반응을 보이게 한다. 대식세포는 다양한 질환 상태에 반응하여 재분극화될 수 있으며, 뚜렷한 특징을 보여준다. 하나의 예는 종종 "종양 관련 대식세포"("TAM") 또는 "종양 침윤 대식세포"("TIM")로 불리는 말초 혈액 단핵구로부터 종양 조직으로 유인되고 여과되는 대식세포이다. 종양-관련 대식세포는 종양에서 가장 풍부한 염증성 세포 중 하나이며, 대부분의 암에 대해 높은 TAM 밀도와 더 나쁜 예후 사이에 중요한 상관관계가 발견되었다(문헌[Zhang et al. (2012) PloS One 7:e50946.10.1371/journal.pone.0050946]).
TAM은 M1-유사 전-염증성 및 M2-유사 항-염증성 하위집단 둘 다의 혼합된 집단이다. 종양형성의 초기 단계에서, 전-염증성 표현형을 갖는 전형적으로 활성화된 대식세포는 정상 산소성(normoxic) 종양 영역에 존재하며, 형질전환된 종양 세포의 조기 박멸에 기여하는 것으로 여겨진다. 그러나, 종양이 성장하고 진행됨에 따라, 말기 종양에서 대부분의 TAM은 종양의 저산소성 영역에 상주하는 M2-유사 조절성 대식세포이다. 대식세포의 이러한 표현형 변화는 종양 미세환경적 자극, 예컨대 종양 세포외 매트릭스, 무산소 환경 및 종양 세포에 의해 분비된 사이토카인에 의해 현저하게 영향을 받는다. M2-유사 TAM은 상처 치유 대식세포와 조절성 대식세포의 하이브리드 활성화 상태를 보여주며, 높은 수준의 IL-10의 생성, 그러나 IL-12의 생성은 거의 없거나 전혀 없음, 결함이 있는 TNF 생성, 항원 제시 세포의 억제 및 종양 혈관신생에 대한 기여를 포함하는 다양한 고유의 특징을 보여준다.
일반적으로, TAM은 M2 표현형을 특징으로 하며, IL-10 및 IL-1β 생산을 통해 M1 대식세포-매개성 염증을 억제한다. 따라서, TAM은 증식 및 침입을 위한 영양분과 성장 신호를 제공하며, 새로운 혈관(즉, 혈관신생)의 생성을 촉진하는 상처-치유(즉, 항-염증성) 경로의 활성화를 통해 종양 성장 및 전이를 촉진한다. 또한, TAM은 면역 체계의 다른 성분이 종양을 인식하고 공격하는 것을 방지하는 항-염증성 신호를 분비하여 면역-억제성 종양 미세환경에 기여한다. TAM은 많은 유형의 암(예를 들어, 유방암, 성상세포종, 두경부 편평세포 암, 유두 신세포 암종 유형 II, 폐암, 췌장암, 담낭암, 직장암, 신경교종, 전형적인 호지킨 림프종, 난소암 및 결장직장암)에서 암 성장, 증식 및 전이를 촉진하는데 핵심적인 역할을 하는 것으로 보고되었다. 일반적으로, 많은 TAM의 집단을 특징으로 하는 암은 좋지 않은 질환 예후 예측과 관련이 있다.
다양한 기능과 활성화 상태는 적절하게 규제되지 않으면 위험한 결과를 초래할 수 있다. 예를 들어, 전형적으로 활성화된 대식세포는 숙주 조직에 손상을 줄 수 있고, 과다 활성화되면 주변 조직을 취약하게 하며 및 글루코스 대사에 영향을 미칠 수 있다.
많은 질환 상태에서, 대식세포 활성화 상태의 균형잡힌 동역학이 중단되며, 불균형이 질환을 유발한다. 예를 들어, 종양은 대식세포로 풍부하게 구성되어 있다. 대식세포는 암의 75 퍼센트에서 발견될 수 있다. 공격적인 유형의 암은 종종 대식세포 및 다른 면역 세포의 더 높은 침투와 관련이 있다. 대부분의 악성 종양에서, TAM은 암 세포 생존의 촉진, 증식, 침입, 혈관외 유출 및 전이, 혈관신생의 자극, 세포외 매트릭스의 리모델링 및 항종양 면역력의 억제를 포함하는 여러 종양-촉진 기능을 발휘한다(문헌[Qian and Pollard, 2010, Cell, 141(1): 39-51]). 이들은 또한 성장-촉진 분자, 예컨대 오르니틴, VEGF, EGF 및 TGF-β를 생산할 수 있다.
TAM은 종양 미세환경에서 마주치는 CSF1 및 IL4/IL13에 대한 반응으로 종양 성장 및 생존을 자극한다. TAM은 또한 프로테이스, 예컨대 MMP, 카텝신 및 uPA 및 매트릭스 리모델링 효소(예를 들어, 라이실 옥시데이스 및 SPARC)의 발현을 통해 종양 미세환경을 리모델링할 수 있다.
TAM은 종양의 악성 상태의 전이에 필요한 종양 조직에서 혈관의 극적인 증가를 조절하는 종양 혈관신생에서 중요한 역할을 한다. 이러한 혈관 형성성 TAM은 안지오포이에틴 수용체, TIE2를 발현하고, VEGF 패밀리 구성원, TNFα, IL1β, IL8, PDGF 및 FGF를 포함하는 많은 혈관 형성성 분자를 분비한다.
대식세포의 다양한 하위집단은 이러한 개별적인 전-종양성 기능을 수행한다. 이러한 TAM은 대식세포 침윤의 정도가 다를 뿐만 아니라 종양 유형의 표현형이 다르다. 예를 들어, 인간 간세포성 암종의 상세한 프로파일링은 이들의 해부학적 위치 및 전-종양성과 항-종양성 특성의 측면에서 정의된 다양한 대식세포 하위-유형을 보여준다. M2-유사 대식세포가 TAM의 전-종양성 기능의 주요 자원인 것으로 나타났다. M2-유사 TAM은 항암 치료의 효능에 영향을 미치고, 요법 저항성에 기여하며, 종래의 암 요법 후 종양 재발을 매개하는 것으로 나타났다.
III. 단핵구 및/또는 대식세포 염증성 표현형을 조절하는데 유용한 표적 및 바이오마커
본 발명은 단핵구 및/또는 대식세포의 염증성 표현형을 조절하는데 유용한 바이오마커(예를 들어, 표 1 및 표 2에 열거된 표적)뿐만 아니라 상응하는 면역 반응(예를 들어, 항암 대식세포 면역요법을 증가시기 위해)을 포함한다.
표 1은 표적에 대한 유전자 정보를 제공하되, 항체, siRNA 등과 같은 본 명세서에 기재된 표적을 하향조절하는 작용제에 의한 것과 같은 이들의 하향조절은 증가된 염증성 표현형(예를 들어, 제1형 표현형)과 관련이 있으며 이를 초래한다.
표 2는 표적에 대한 유전자 정보를 제공하되, 항체, siRNA 등과 같은 본 명세서에 기재된 표적을 하향조절하는 작용제에 의해서와 같은 이들의 하향조절은 감소된 염증성 표현형(예를 들어, 제2형 표현형)과 관련이 있으며 이를 초래한다.
본 발명에 포함되는 유전자좌 및 바이오마커(예를 들어, 표 1 및 2에 열거된 바이오마커)에 대한 핵산 및 아미노산 서열 정보는 당업계에 잘 알려져 있으며, 미국 국립생물공학정보센터(NCBI)와 같은 공개적으로 이용 가능한 데이터베이스에서 쉽게 이용할 수 있다. 예를 들어, 공개적으로 이용 가능한 서열 데이터베이스로부터 유래된 예시적 핵산 및 아미노산 서열은 아래에 제공된다.
아래에서 더 논의되는 바와 같이, 단핵구 및/또는 대식세포에서 본 발명에 포함되는 바이오마커의 발현, 번역, 분해, 양, 세포내 국재화 및 다른 활성을 조절하는 작용제는 이러한 세포의 염증성 표현형을 조절할 뿐만 아니라 이러한 세포에 의해 매개된 면역 반응을 조절하는데에도 유용하다.
인간 서열에 대한 다수의 대표적인 오르토로그가 아래에 제공되지만, 일부 실시형태에서, 인간 바이오마커(이의 조절 및 조절성 작용제를 포함)가 바람직하다. 일부 바이오마커의 경우, 인간에서 이러한 바이오마커에 의해 매개된 면역 반응은 인간 면역 체계와 다른 척추동물의 면역 체계 간의 차이를 고려하여 특히 유용하다고 여겨진다.
용어 "SIGLEC9"는 세포에 대한 시알산 의존적 결합을 매개하는 추정 부착 분자인 렉틴 9와 같은 시알산 결합 Ig를 지칭한다. SIGLEC9는 알파-2,3- 또는 알파-2,6-결합 시알산에 우선적으로 결합한다. 시알산 인식 부위는 동일한 세포 표면에서 시알산과의 시스 상호작용에 의해 가려질 수 있다. 관련 경로 중에는 선천성 면역 체계 및 클래스 I MHC 매개된 항원 가공 및 제시가 있다. 일부 실시형태에서, 인간의 19q 염색체에 위치한 SIGLEC9 유전자는 12개의 엑손으로 구성된다. 오르토로그는 침팬지, 레서스 원숭이 및 마우스에서 알려져 있다. Siglectm1Croc라 불리는 넉아웃 마우스 계통이 생성되었다(문헌[McMillan et al. (2013) Blood 121(11):2084-2094]). 일부 실시형태에서, 인간 SIGLEC9 단백질은 463개의 아미노산을 갖고/갖거나 50082Da의 분자량을 갖는다. 일부 실시형태에서, SIGLEC9 단백질은 면역수용체 타이로신-기반 저해제 모티프(immunoreceptor tyrosine-based inhibitor motif: ITIM)로 칭해지는 세포질성 모티프의 1개의 카피를 함유한다. 이러한 모티프는 세포 반응의 조절에 관여한다. 인산화된 ITIM 모티프는 여러 SH2-함유 포스파테이스의 SH2 도메인에 결합할 수 있다.
용어 "SIGLEC9"는 이의 단편, 변이체(예를 들어, 대립유전자 변이체) 및 유도체를 포함하는 것으로 의도된다. 대표적인 인간 SIGLEC9 cDNA 및 인간 SIGLEC9 단백질 서열은 당업계에 잘 알려져 있으며, 미국 국립생물공학정보센터(NCBI)(예를 들어, ncbi.nlm.nih.gov/gene/27180 참조)로부터 공개적으로 이용 가능하다. 예를 들어, 적어도 2개의 상이한 인간 SIGLEC9 동형 단백질이 알려져 있다. 인간 SIGLEC9 동형 단백질 1(NP_001185487.1)은 전사체 변이체 1(NM_001198558.1)에 의해 암호화될 수 있으며, 이는 더 긴 전사체이다. 인간 SIGLEC9 동형 단백질 2(NP_055256.1)은 전사체 변이체 2(NM_014441.2)에 의해 암호화될 수 있으며, 이는 동형 단백질 1과 비교하여 3' UTR 및 3' 코딩 영역이 상이하다. 암호화된 동형 단백질 2는 동형 단백질 1과 비교하여 더 짧고, 별개의 C-말단을 갖는다. 인간 이외의 유기체에서 SIGLEC9 오르토로그의 핵산 및 폴리펩타이드 서열은 잘 알려져 있으며, 예를 들어 침팬지 SIGLEC9(XM_024351618.1 및 XP_024207386.1 및 XM_003316566.5 및 XP_003316614.2), 레서스 원숭이 SIGLEC9(XM_015124691.1 및 XP_014980177.1, XM_001114560.3 및 XP_001114560.2, XM_015124692.1 및 XP_014980178.1) 및 마우스 SIGLEC9(NM_031181.2 및 NP_112458.2)를 포함한다. SIGLEC9 오르토로그의 대표적인 서열은 아래 표 1에 나타나 있다.
SIGLEC9 단백질을 검출하기에 적합한 항-SIGLEC9 항체는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 항체 MAB1139 및 AF1139(알앤디 시스템즈(R&D systems), 미네소타주 미니애폴리스), 항체 MAB1139, NBP1-47969, AF1139, NBP2-27070 및 NBP1-85755(노부스 바이올로지컬즈(Novus Biologicals), 콜로라도주 리틀턴), 항체 ab89484, ab96545 및 ab197981(압캠(AbCam), 메사추세츠주 케임브리지), 항체 Cat #: CF500382 및 TA500382(오리젠(Origene), 메릴랜드주 록빌) 등을 포함한다. 다른 항-SIGLEC9 항체가 또한 알려져 있으며, 예를 들어 미국 공개 US20170306014, US20190085077, US20190023786 및 US20180244770에 기재된 것들을 포함한다. 또한, SIGLEC9 발현을 검출하기 위한 시약은 잘 알려져 있다. SIGLEC9의 여러 임상적 테스트는 NIH 유전자 검사 등록소(GTR(Genetic testing Registry)®)(예를 들어, GTR 테스트 ID: GTR000547533.2, 펄젠트 클리니칼 다이아그노스틱스 랩(Fulgent Clinical Diagnostics Lab), 캘리포니아주 템플 시티)에 의해 제공됨)에서 이용할 수 있다. 또한, SIGLEC9 발현을 감소시키기 위한 여러 siRNA, shRNA, CRISPR 작제물은 위에 언급된 회사들의 상업 제품 목록, 예컨대 오리젠 테크놀로지스(Origene 기술)(메릴랜드주 록빌)의 siRNA 제품 #SR309022, shRNA 제품 # TG309443, TL309443 및 CRISPR 제품 #KN206674, 산타 크루즈(Santa Cruz)의 CRISPR gRNA 제품(sc-406675 및 sc-406675-KO-2) 및 산타 크루즈의 RNAi 제품(Cat # sc-106550 및 sc-153462)에서 찾을 수 있다. 용어는 SIGLEC9 분자와 관련하여 본 명세서에 기재된 특징의 임의의 조합을 지칭하기 위해 추가로 사용될 수 있다는 점에 유의하여야 한다. 예를 들어, 서열 구성, 퍼센트 동일성, 서열 길이, 도메인 구조, 기능적 활성 등의 임의의 조합이 본 발명에 포함되는 SIGLEC9 분자를 설명하는데 사용될 수 있다.
용어 "VSIG4(V-Set And Immunoglobulin Domain Containing 4)"는 면역 조절성 단백질의 B7 패밀리와 구조적으로 관련된 v-세트 및 면역글로불린-도메인 함유 단백질인, V-세트 및 면역글로불린 도메인 함유 4를 지칭한다. VSIG4 단백질은 T-세포 반응의 음성 조절인자이다. 또한, 이는 보체 성분 3 단편 C3b 및 iC3b에 대한 수용체이다. VSIG4 단백질은 식세포성 수용체이며, T-세포 증식 및 IL2 생성의 강력한 음성 조절인자이다. 또한, 이는 대안적 보체 경로 컨버테이스의 강력한 저해제이다. VSIG4와 관련된 질환은 T-세포/조직세포 풍부 대형 B 세포 림프종 및 랑게르한스 세포 육종을 포함한다. 관련 경로 중에는 보체 및 응고 캐스케이드가 있다. 일부 실시형태에서, 인간의 Xq 염색체에 위치한 VSIG4 유전자는 8개의 엑손으로 구성된다. 오르토로그는 침팬지, 레서스 원숭이, 개, 마우스 및 래트에서 알려져 있다. Vsig4tm1Gne(문헌[Helmy et al. (2006) Cell 124:915-927]) 및 Vsig4tm1b(EUCOMM)Hmgu(문헌[Skarnes et al. (2011) Nature 474:337-342])를 포함하는 넉아웃 마우스 계통이 존재한다. 일부 실시형태에서, 인간 VSIG4 단백질은 399개의 아미노산을 갖고/갖거나 43987Da의 분자량을 갖는다.
용어 "VSIG4"는 이의 단편, 변이체(예를 들어, 대립유전자 변이체) 및 유도체를 포함하는 것으로 의도된다. 대표적인 인간 VSIG4 cDNA 및 인간 VSIG4 단백질 서열은 당업계에 잘 알려져 있으며, 미국 국립생물공학정보센터(NCBI)(예를 들어, ncbi.nlm.nih.gov/gene/11326 참조)로부터 공개적으로 이용 가능하다. 예를 들어, 적어도 5개의 상이한 인간 VSIG4 동형 단백질이 알려져 있다. 인간 VSIG4 동형 단백질 1(NP_009199.1)은 전사체 변이체 1(NM_007268.2)에 의해 암호화될 수 있으며, 이는 가장 긴 전사체이다. 인간 VSIG4 동형 단백질 2(NP_001093901.1)는 전사체 변이체 2(NM_001100431.1)에 의해 암호화될 수 있으며, 이는 변이체 1과 비교하여 대체 인-프레임(in-frame) 세그먼트가 결여되어 있다. 인간 VSIG4 동형 단백질 3(NP_001171760.1)은 전사체 변이체 3(NM_001184831.1)에 의해 암호화될 수 있으며, 이는 변이체 1과 비교하여 여러 차이점이 있다. 인간 VSIG4 동형 단백질 4(NP_001171759.1)는 전사체 변이체 4(NM_001184830.1)에 의해 암호화될 수 있으며, 이는 변이체 1과 비교하여 3' UTR 및 3' 코딩 영역에서 상이하다. 인간 VSIG4 동형 단백질 5(NP_001244332.1)는 전사체 변이체 5(NM_001257403.1)에 의해 암호화될 수 있으며, 이는 변이체 1과 비교하여 3' 코딩 영역에서 2개의 대체 인-프레임 엑손이 결여되어 있다. 인간 이외의 유기체에서 VSIG4 오르토로그의 핵산 및 폴리펩타이드 서열은 잘 알려져 있으며, 예를 들어 침팬지 VSIG4(NM_001279873.1 및 NP_001266802.1), 레서스 원숭이 VSIG4(XM_015127596.1 및 XP_014983082.1, XM_015127593.1 및 XP_014983079.1, XM_015127595.1 및 XP_014983081.1, XM_001099264.2 및 XP_001099264.2 및 XM_015127594.1 및 XP_014983080.1), 개 VSIG4(XM_005641424.3 및 XP_005641481.1; XM_005641423.3 및 XP_005641480.1; XM_022416007.1 및 XP_022271715.1; XM_005641421.3 및 XP_005641478.1; 및 XM_005641422.3 및 XP_005641479.1), 마우스 VSIG4(NM_177789.4 및 NP_808457.1) 및 래트 VSIG4(NM_001025004.1 및 NP_001020175.1)를 포함한다. VSIG4 오르토로그의 대표적인 서열은 아래 표 1에 나타나 있다.
VSIG4 단백질을 검출하기에 적합한 항-VSIG4 항체는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 항체 AF4646 및 AF4674(알앤디 시스템, 미네소타주 미니애폴리스), 항체 NBP1-86843, AF4646, AF4674 및 NBP1-69631(노부스 바이올로지컬즈, 콜로라도주 리틀턴), 항체 ab56037, ab197161 및 ab138594(압캠, 메사추세츠주 케임브리지), 항체 Cat #: TA346124(오리젠, 메릴랜드주 록빌), 항체 05 및 202(시노 바이올로지컬(Sino Biological), 중국 베이징) 등을 포함한다. 다른 항-VSIG4 항체가 또한 알려져 있으며, 예를 들어 미국 공개 US20090162356A1 및 US20180371095A1에 기재된 것을 포함한다. 또한, VSIG4 발현을 검출하기 위한 시약이 잘 알려져 있다. VSIG4의 여러 임상적 테스트는 NIH 유전자 검사 등록소(GTR®)(예를 들어, GTR 테스트 ID: GTR000544515.2, 펄젠트 클리니칼 다이아그노스틱스 랩(캘리포니아주 템플 시티)에 의해 제공됨)에서 이용할 수 있다. 또한, VSIG4 발현을 감소시키기 위한 여러 siRNA, shRNA, CRISPR 작제물은 위에 언급된 회사의 상업 제품 목록, 예컨대 오리젠 테크놀로지스(메릴랜드주 록빌)의 siRNA 제품 #SR323415, shRNA 제품 # TG308440, TL308440, TF308440 및 CRISPR 제품 #KN203751, 어플라이드 바이올로지컬 머티리얼즈(Applied Biological Materials)의 CRISPR gRNA(K7367508) 및 산타 크루즈의 CRISPR gRNA(sc-404067) 및 산타 크루즈의 RNAi 제품(Cat # sc-72190 및 sc-72196)에서 찾을 수 있다. 용어는 VSIG4 분자와 관련하여 본원에 기재된 특징의 임의의 조합을 지칭하기 위해 추가로 사용될 수 있다는 점에 유의해야 한다. 예를 들어, 서열 구성, 퍼센트 동일성, 서열 길이, 도메인 구조, 기능적 활성 등의 임의의 조합이 본 발명에 포함되는 VSIG4 분자를 설명하는데 사용될 수 있다.
용어 "CD74"는 CD74를 지칭한다. 이러한 유전자에 의해 암호화된 단백질은 클래스 II 주 조직적합성 복합체(MHC)와 관련이 있으며, 면역 반응을 위한 항원 제시를 조절하는 중요한 샤페론(chaperone)이다. 또한, 이는 암호화된 단백질에 결합될 때 생존 경로와 세포 증식을 개시하는, 사이토카인 대식세포 이동 저해성 인자(migration inhibitory factor: MIF)에 대한 세포 표면 수용체 역할을 한다. CD74 단백질은 또한 아밀로이드 전구체 단백질(amyloid precursor protein: APP)과 상호작용하며, 아밀로이드 베타(Abeta)의 생성을 억제한다. 또한, CD74 단백질은 이들의 합성 직후 복합체에서 펩타이드가 없는 클래스 II 알파/베타 이종이량체를 안정화하고, 소포체에서 항원 가공 및 MHC 클래스 II에 대한 항원성 펩타이드의 결합이 일어나는 엔도솜/라이소솜 시스템으로 복합체의 수송을 지시함으로써 MHC 클래스 II 항원 가공에서 중요한 역할을 한다. CD74 단백질은 사이토카인 MIF에 대한 세포 표면 수용체로 작용한다. CD74와 관련된 질환은 미분화된 다형성 육종 및 외투세포 림프종을 포함한다. 관련 경로 중에는 상승된 혈소판 세포질 Ca2+ 및 선천성 면역 체계에 대한 반응이 있다. 일부 실시형태에서, 인간의 5q 염색체에 위치한 CD74 유전자는 9개의 엑손으로 구성된다. 오르토로그는 침팬지, 레서스 원숭이, 개, 마우스, 래트, 닭 및 개구리에서 알려져 있다. CD74tm1Doi(문헌[Viville et al. (1993) Cell 72:635-648]), CD74tm1Liz(문헌[Bikoff et al. (1993) J Exp Med 177:1699-1712]), CD74tm1Eae(문헌[Elliott et al. (1994) J Exp Med 179:681-694]) 및 CD74tm1Anjm(문헌[Barlow et al. (2010) Nat Med 16:59-66]) 및 CD74tm2Liz(문헌[Takaesu et al. (1995) Immunity 3:385-396])를 포함하는 넉아웃 마우스 계통이 존재한다. 일부 실시형태에서, 인간 CD74 단백질은 296개의 아미노산을 갖고/갖거나 33516Da의 분자량을 갖는다. 일부 실시형태에서, CD74 단백질은 MHC2-상호작용 도메인, 클래스 II MHC-관련 불변 사슬 삼량체화 도메인 및 타이로글로불린 유형 I 반복체를 함유한다.
용어 "CD74"는 이의 단편, 변이체(예를 들어, 대립유전자 변이체) 및 유도체를 포함하는 것으로 의도된다. 대표적인 인간 CD74 cDNA 및 인간 CD74 단백질 서열은 당업계에 잘 알려져 있으며, 미국 국립생물공학정보센터(NCBI)(예를 들어, ncbi.nlm.nih.gov/gene/972 참조)로부터 공개적으로 이용 가능하다. 예를 들어, 적어도 3개의 상이한 인간 CD74 동형 단백질이 알려져 있다. 인간 CD74 동형 단백질 A(NP_001020330.1)은 전사체 변이체 1(NM_001025159.2)에 의해 암호화될 수 있으며, 이는 가장 긴 전사체이다. 인간 CD74 동형 단백질 B(NP_004346.1)는 전사체 변이체 2(NM_004355.3)에 의해 암호화될 수 있으며, 이는 변이체 1과 비교하여 3' 코딩 영역에서 인-프레임 엑손이 결여되어 있다. 인간 CD74 동형 단백질 C(NP_001020329.1)는 전사체 변이체 3(NM_001025158.2)에 의해 암호화될 수 있으며, 이는 변이체 1과 비교하여 프레임-시프트(frame-shift)를 초래하는 3' 코딩 영역에서의 3개의 연속적인 엑손이 결여되어 있다. 인간 이외의 유기체에서 CD74 오르토로그의 핵산 및 폴리펩타이드 서열은 잘 알려져 있으며, 예를 들어 침팬지 CD74(NM_001144836.1 및 NP_001138308.1), 레서스 원숭이 CD74(XM_015141237.1 및 XP_014996723.1 및 XM_015141236.1 및 XP_014996722.1), 개 CD74(XM_536468.7 및 XP_536468.5; 및 XM_005619298.3 및 XP_005619355.1), 마우스 CD74(NM_001042605.1 및 NP_001036070.1; 및 NM_010545.3 및 NP_034675.1), 래트 CD74(NM_013069.2 및 NP_037201.1), 닭 CD74(XM_015293754.2 및 XP_015149240.1) 및 개구리 CD74(NM_001197110.1 및 NP_001184039.1)를 포함한다. CD74 오르토로그의 대표적인 서열은 아래 표 1에 나타나 있다.
CD74 단백질을 검출하기에 적합한 항-CD74 항체는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 항체 AF3590 및 MAB35901(알앤디 시스템, 미네소타주 미니애폴리스), 항체 NBP2-29465, NBP2-66762, NBP1-33109 및 NBP1-85225(노부스 바이올로지컬즈, 콜로라도주 리틀턴), 항체 ab9514, ab22603 및 ab108393(압캠, 메사추세츠주 케임브리지), 항체 Cat #: CF507339 및 TA507339(오리젠, 메릴랜드주 록빌) 등을 포함한다. 다른 항-CD74 항체가 또한 알려져 있으며, 예를 들어, 미국 공개 US20140030273, US20170173151, US7312318 및 US20170253656에 기재된 것들을 포함한다. 또한, CD74 발현을 검출하기 위한 시약이 잘 알려져 있다. CD74의 여러 임상적 테스트는 NIH 유전자 검사 등록소(GTR®)(예를 들어, GTR 테스트 ID: GTR000532717.2, 펄젠트 클리니칼 다이아그노스틱스 랩(캘리포니아주 템플 시티)에 의해 제공됨)에서 이용할 수 있다. 또한, CD74 발현을 감소시키기 위한 여러 siRNA, shRNA, CRISPR 작제물은 위에 언급된 회사의 상업 제품 목록, 예컨대 오리젠 테크놀로지스(메릴랜드주 록빌)의 siRNA 제품 #SR300649, shRNA 제품 # TR314068, TL314068, TG314068 및 CRISPR 제품 #KN205824, 어플라이드 바이올로지컬 머티리얼즈의 CRISPR gRNA 제품(K6656308)과 산타 크루즈의 CRISPR gRNA 제품(sc-400279) 및 산타 크루즈의 RNAi 제품(Cat # sc-35023 및 sc-42802)에서 찾을 수 있다. 용어는 CD74 분자와 관련하여 본 명세서에 기재된 특징의 임의의 조합을 지칭하는데 더 사용될 수 있다는 것에 유의하여야 한다. 예를 들어, 서열 구성, 퍼센트 동일성, 서열 길이, 도메인 구조, 기능적 활성 등의 임의의 조합이 본 발명에 포함되는 CD74 분자를 설명하는데 사용될 수 있다.
용어 "CD207"은 CD207을 지칭한다. CD207 단백질은 표피 및 점막의 미성숙 수지상 세포인 랑게르한스 세포에서만 발현된다. 이는 랑게르한스 세포의 세포질에 존재하며 중첩되고 지퍼 형식의 막으로 구성된 세포기관인 버벡 과립(버벡 과립)에 국재되어 있다. 이는 만노스 결합 특이성을 갖는 C-유형 렉틴이며, CD207 단백질에 의한 만노스 결합은 항원을 버벡 과립으로 내재화시키고 비전형적인 항원-가공 경로에 대한 접근을 제공하는 것으로 제안되었다. CD207의 돌연변이는 버벡 과립 결핍 또는 당 결합 활성의 손실을 초래한다. 또한, CD207 단백질은 만노스-결합 특이성을 나타내는 칼슘-의존적 렉틴이다. CD207 단백질은 버벡 과립(BG)의 형성을 유도하며, 막 중첩 및 지퍼링(zippering)의 강력한 조절인자이다. CD207 단백질은 설페이트화뿐만 아니라 만노실화된 글리칸, 케라탄 설페이트(keratan sulfate: KS) 및 베타-글루칸에 결합하며, 항원의 활용(흡수)을 용이하게 하고, T 세포로의 제시를 위한 항원의 라우팅(routing) 및/또는 가공에 관여한다. CD207은 칸디다(Candida) 종, 사카로마이세스(Saccharomyces) 종 및 말라세지아 푸르푸르(Malassezia furfur)에 대한 일차 랑게르한스 세포의 주요 수용체이다. CD207은 인간 면역결핍 바이러스-1(HIV-1) 감염으로부터 보호한다. 이는 외피 당단백질 상에 존재하는 고-만노스 구조에 결합하고, 이어서 바이러스를 버벡 과립으로 표적화하여 빠른 분해를 유도한다. CD207과 관련된 질환은 버벡 과립 결핍 및 랑게르한스 세포 조직구증을 포함한다. 관련 경로 중에는 선천성 면역 체계 및 클래스 I MHC-매개성 항원 가공 및 제시가 있다. 일부 실시형태에서, 인간의 2p 염색체에 위치한 CD207 유전자는 10개의 엑손으로 구성된다. 오르토로그는 침팬지, 레서스 원숭이, 젖소, 마우스, 래트 및 개구리에서 알려져 있다. CD207tm1Mal(문헌[Kissenpfennig et al. (2005) Mol Cell boil 25:88-99]) 및 CD207tm1.1Cfg(문헌[Orr et al. (2013) Glycobiology 23:363-380])를 포함하는 넉아웃 마우스 계통이 존재한다. 일부 실시형태에서, 인간 CD207 단백질은 328개의 아미노산을 갖고/갖거나 36725Da의 분자량을 갖는다. 일부 실시형태에서, CD207 단백질은 Rad50 아연 후크 모티프 및 C-유형 렉틴-유사 도메인을 함유한다. C-유형 렉틴 도메인은 설페이트화된 글리칸 및 만노실화된 글리칸 둘 다의 이중 인식을 매개한다.
용어 "CD207"은 이의 단편, 변이체(예를 들어, 대립유전자 변이체) 및 유도체를 포함하는 것으로 의도된다. 대표적인 인간 CD207 cDNA 및 인간 CD207 단백질 서열은 당업계에 잘 알려져 있으며, 미국 국립생물공학정보센터(NCBI)(예를 들어, ncbi.nlm.nih.gov/gene/50489 참조)로부터 공개적으로 이용 가능하다. 예를 들어, 인간 CD207(NP_056532.4)은 전사체(NM_015717.4)에 의해 암호화될 수 있다. 인간 이외의 유기체에서 CD207 오르토로그의 핵산 및 폴리펩타이드 서열은 잘 알려져 있으며, 예를 들어 침팬지 CD207(XM_016945490.2 및 XP_016800979.1), 레서스 원숭이 CD207(XM_001100466.3 및 XP_001100466.2), 소 CD207(XM_015473414.2 및 XP_015328900.2) 및 마우스 CD207(NM_144943.3 및 NP_659192.2), 래트 CD207(NM_013069.2 및 NP_037201.1)을 포함한다. CD207 오르토로그의 대표적인 서열은 아래 표 1에 나타나 있다.
CD207 단백질을 검출하기에 적합한 항-CD207 항체는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 항체 AF2088, BAF2088 및 MAB2088(알앤디 시스템, 미네소타주 미니애폴리스), 항체 DDX0362P-100, DDX0363P-100, DDX0361P-100 및 NB100-56733(노부스 바이올로지컬즈, 콜로라도주 리틀턴), 항체 ab192027(압캠, 메사추세츠주 케임브리지), 항체 Cat #: TA336470 및 TA349377(오리젠, 메릴랜드주 록빌) 등을 포함한다. 또한, CD207 발현을 검출하기 위한 시약은 잘 알려져 있다. CD207의 여러 임상적 테스트는 NIH 유전자 검사 등록소(GTR®)(예를 들어, GTR 테스트 ID: GTR000516372.2, 펄젠트 클리니칼 다이아그노스틱스 랩(캘리포니아주 템플 시티)에 의해 제공됨)에서 이용할 수 있다. 또한, CD207 발현을 감소시키기 위한 여러 siRNA, shRNA, CRISPR 작제물은 위에 언급된 회사의 상업 제품 목록, 예컨대 오리젠 테크놀로지스(메릴랜드주 록빌)의 siRNA 제품 #SR309386, shRNA 제품 # TL305520V, TR305520, TG305520, TF305520, TL305520 및 CRISPR 제품 #KN204669, 어플라이드 바이올로지컬 머티리얼즈의 CRISPR gRNA 제품(K4909208)과 산타 크루즈의 CRISPR gRNA 제품(sc-401949) 및 산타 크루즈의 RNAi 제품(Cat # sc-43888 및 sc-43889)에서 찾을 수 있다. 용어는 CD207 분자와 관련하여 본 명세서에 기재된 특징의 임의의 조합을 지칭하기 위해 더 사용될 수 있음에 유의하여야 한다. 예를 들어, 서열 구성, 퍼센트 동일성, 서열 길이, 도메인 구조, 기능적 활성 등의 임의의 조합이 본 발명에 포함되는 CD207 분자를 설명하는데 사용될 수 있다.
용어 "LRRC25"는 류신 풍부 반복체 함유 25(Leucine Rich Repeat Containing 25)를 지칭한다. LRRC25 유전자는 비장 및 골수를 포함하는 조직에서 광범위하게 발현된다. LRRC25 단백질은 선천성 및 후천성 면역 세포의 활성화에 관여할 수 있다. 이는 CD40-활성화된 단핵구-유래 수지상 세포에서 하향조절된다. LRRC25와 관련된 질환은 일과성 완전 기억상실(transient global amnesia)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 인간의 19p 염색체에 위치한 LRRC25 유전자는 3개의 엑손으로 구성된다. 오르토로그는 침팬지, 레서스 원숭이, 개, 젖소, 마우스 및 래트에서 알려져 있다. 일부 실시형태에서, 인간 LRRC25 단백질은 305개의 아미노산을 갖고/갖거나 33179Da의 분자량을 갖는다. 일부 실시형태에서, LRRC25 단백질은 류신 풍부 반복체의 2개의 카피 및 GRB2-결합 어댑터를 함유한다.
용어 "LRRC25"는 이의 단편, 변이체(예를 들어, 대립유전자 변이체) 및 유도체를 포함하는 것으로 의도된다. 대표적인 인간 LRRC25 cDNA 및 인간 LRRC25 단백질 서열은 당업계에 잘 알려져 있으며, 미국 국립생물공학정보센터(NCBI)(예를 들어, ncbi.nlm.nih.gov/gene/126364 참조)로부터 공개적으로 이용 가능하다. 예를 들어, 인간 LRRC25(NP_660299.2)는 전사체(NM_145256.2)에 의해 암호화될 수 있다. 인간 이외의 유기체에서 LRRC25 오르토로그의 핵산 및 폴리펩타이드 서열은 잘 알려져 있으며, 예를 들어 침팬지 LRRC25(XM_009435028.3 및 XP_009433303.1; 및 XM_001173930.6 및 XP_001173930.1), 레서스 원숭이 LRRC25(XM_001114428.3 및 XP_001114428.1), 개 LRRC25(XM_847238.5 및 XP_852331.3; 및 XM_014122405.2 및 XP_013977880.1), 소 LRRC25(XM_005208421.4 및 XP_005208478.1), 마우스 LRRC25(NM_153074.3 및 NP_694714.1) 및 래트 LRRC25(XM_573882.6 및 XP_573882.1; XM_006252977.3 및 XP_006253039.1; XM_008771187.2 및 XP_008769409.1; XM_006252978.3 및 XP_006253040.1; 및 XM_008771188.2 및 XP_008769410.1)를 포함한다. LRRC25 오르토로그의 대표적인 서열은 아래 표 1에 나타나 있다.
LRRC25 단백질을 검출하기에 적합한 항-LRRC25 항체는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 항체 GTX45692(진텍스(GeneTex), 캘리포니아주 어바인), 항체 sc-514216(산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology)), 항체 NBP2-03747, NBP1-83476 및 NBP2-45673(노부스 바이올로지컬즈, 콜로라도주 리틀턴), 항체 ab84954(압캠, 메사추세츠주 케임브리지), 항체 Cat #: TA504941 및 CF504941(오리젠, 메릴랜드주 록빌) 등을 포함한다. 또한, LRRC25 발현을 검출하기 위한 시약은 잘 알려져 있다. LRRC25의 여러 임상적 테스트는 NIH 유전자 검사 등록소(GTR®)(예를 들어, GTR 테스트 ID: GTR000541158.2, 펄젠트 클리니칼 다이아그노스틱스 랩(캘리포니아주 템플 시티)에 의해 제공됨)에서 이용할 수 있다. 또한, LRRC25 발현을 감소시키기 위한 여러 siRNA, shRNA, CRISPR 작제물은 위에 언급된 회사의 상업 제품 목록, 예컨대 오리젠 테크놀로지스(메릴랜드주 록빌)의 siRNA 제품 #SR325688, shRNA 제품 # TL303467, TR303467, TG303467, TF303467, TL303467V 및 CRISPR 제품 #KN209911, 다수의 바이올로지컬 머티리얼즈의 CRISPR gRNA 제품(K3598208)과 산타 크루즈의 CRISPR gRNA 제품(sc-414270) 및 산타 크루즈의 RNAi 제품(Cat # sc-97675 및 sc-149064)에서 찾을 수 있다. 용어는 LRRC25 분자와 관련하여 본 명세서에 기재된 특징의 임의의 조합을 지칭하기 위해 더 사용될 수 있음에 유의하여야 한다. 예를 들어, 서열 구성, 퍼센트 동일성, 서열 길이, 도메인 구조, 기능적 활성 등의 임의의 조합은 본 발명에 포함되는 LRRC25 분자를 설명하는데 사용될 수 있다.
용어 "SELPLG" 또는 "PSGL1"은 골수성 세포 및 자극된 T 림프구에서 발현되는 P-, E- 및 L- 셀렉틴에 대한 고 친화성의 카운터-수용체로서 기능하는 당단백질인 셀렉틴 P 리간드(Selectin P Ligand)를 지칭한다. 따라서, SELPLG 단백질은 백혈구를 활성화된 혈소판 또는 셀렉틴을 발현하는 내피에 테더링함으로써 염증 동안 백혈구 수송에 중요한 역할을 한다. SELPLG 단백질은 두 가지 번역 후 변형, 타이로신 황산화 및 고-친화성 결합 활성을 위해 O-연결된 글리칸에 시알릴 루이스 x 테트라사카라이드(sialyl Lewis x tetrasaccharide: sLex)의 추가를 갖는다. SELPLG의 비정상적인 발현 및 SELPLG의 다형성은 선천성 및 후천성 면역 반응의 결함과 관련이 있다. SELPLG는 SLe(x)-유형 프로테오글리칸이며, 이는 E-, P- 및 L-셀렉틴과의 높은 친화성, 칼슘-의존적 상호작용을 통해 염증의 초기 단계 동안에 혈관 표면에 대한 백혈구의 빠른 롤링(rolling)을 매개한다. SELPLG는 초기 백혈구 포획에 중요하다. 일부 실시형태에서, 인간의 12q 염색체에 위치한 SELPLG 유전자는 3개의 엑손으로 구성된다. 오르토로그는 침팬지, 레서스 원숭이, 개, 젖소, 마우스 및 래트에서 알려져 있다. Selplgtm2Rpmc(문헌[Miner et al. (2008) Blood 112:2035-2045]), Selplgtm1Fur(문헌[Yang et al. (1999) J Exp Med 190:1769-1782]) 및 Selplgtm1Rpmc(문헌[Xia et al. (2002) J Clin Invest 109:939-950])를 포함하는 넉아웃 마우스 계통이 존재한다. 일부 실시형태에서, 인간 SELPLG 단백질은 412개의 아미노산을 갖고/갖거나 43201Da의 분자량을 갖는다. 일부 실시형태에서, SELPLG 단백질은 리보뉴클레이스 E/G 패밀리 도메인을 함유할 수 있고/있거나 미생물 감염 동안 엔테로바이러스 71에 대한 수용체로서 작용할 수 있다. SELPLG의 알려진 결합 파트너는 예를 들어, P-, E- 및 L-셀렉틴, SNX20, MSN 및 SYK를 포함한다.
용어 "SELPLG"는 이의 단편, 변이체(예를 들어, 대립유전자 변이체) 및 유도체를 포함하는 것으로 의도된다. 대표적인 인간 SELPLG cDNA 및 인간 SELPLG 단백질 서열은 당업계에 잘 알려져 있으며, 미국 국립생물공학정보센터(NCBI)(예를 들어, ncbi.nlm.nih.gov/gene/6404 참조)로부터 공개적으로 이용 가능하다. 예를 들어, 적어도 2개의 상이한 인간 SELPLG 동형 단백질이 알려져 있다. 인간 SELPLG 동형 단백질 1(NP_001193538.1)은 전사체 변이체 1(NM_001206609.1)에 의해 암호화될 수 있으며, 이는 더 긴 전사체이다. 인간 SELPLG 동형 단백질 2(NP_002997.2)는 전사체 변이체 2(NM_003006.4)에 의해 암호화될 수 있으며, 이는 변이체 1과 비교하여 5' UTR에서 상이하고, 5' 코딩 영역의 부분이 없으며, 하류 시작 코돈에서 번역을 개시한다. 암호화된 동형 단백질 2는 동형 단백질 1과 비교하여 더 짧은 N-말단을 갖는다. 인간 이외의 유기체에서 SELPLG 오르토로그의 핵산 및 폴리펩타이드 서열은 잘 알려져 있으며, 예를 들어 침팬지 SELPLG(XM_016924121.2 및 XP_016779610.1), 레서스 원숭이 SELPLG(XM_015152715.1 및 XP_015008201.1; 및 XM_015152716.1 및 XP_015008202.1), 개 SELPLG(NM_001242719.1 및 NP_001229648.1), 소 SELPLG(NM_001037628.2 및 NP_001032717.2; 및 NM_001271160.1 및 NP_001258089.1), 마우스 SELPLG(NM_009151.3 및 NP_033177.3) 및 래트 SELPLG(NM_001013230.1 및 NP_001013248.1)를 포함한다. SELPLG 오르토로그의 대표적인 서열은 아래 표 1에 나타나 있다.
SELPLG 단백질을 검출하기에 적합한 항-SELPLG 항체는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 항체 GTX19793, GTX54688 및 GTX34468(진텍스, 캘리포니아주 어바인), 항체 sc-365506 및 sc-398402(산타 크루즈 바이오테크놀로지), 항체 MAB9961, MAB996, NBP2-53344 및 AF3345(노부스 바이올로지컬즈, 콜로라도주 리틀턴), 항체 ab68143, ab66882 및 ab110096(압캠, 메사추세츠주 케임브리지), 항체 Cat #: TA349432 및 TA338245(오리젠, 메릴랜드주 록빌) 등을 포함한다. 다른 항-SELPLG 항체가 또한 알려져 있으며, 예를 들어 미국 공개 US20130209449, US20170190782A1 및 US20070160601A1 및 미국 특허 US7833530B2 및 US9487585B2에 기재된 것들을 포함한다. 또한, SELPLG 발현을 검출하기 위한 시약은 잘 알려져 있다. SELPLG의 여러 임상적 테스트는 NIH 유전자 검사 등록소(GTR®)(예를 들어, GTR 테스트 ID: GTR000547735.2, 펄젠트 클리니칼 다이아그노스틱스 랩(캘리포니아주 템플 시티)에 의해 제공됨)에서 이용할 수 있다. 또한, SELPLG 발현을 감소시키기 위한 여러 siRNA, shRNA, CRISPR 작제물은 위에 언급된 회사의 상업 제품 목록, 예컨대 오리젠 테크놀로지스(메릴랜드주 록빌)의 siRNA 제품 #SR321732, shRNA 제품 # TL309563, TR309563, TG309563, TF309563, TL309563V 및 CRISPR 제품 #KN206507, 어플라이드 바이올로지컬 머티리얼즈의 CRISPR gRNA 제품(K6134408)과 산타 크루즈의 CRISPR gRNA 제품(sc-401534) 및 산타 크루즈의 RNAi 제품(Cat # sc-36323 및 sc-42833)에서 찾을 수 있다. 용어는 SELPLG 분자와 관련하여 본 명세서에 기재된 특징의 임의의 조합을 지칭하기 위해 더 사용될 수 있음에 유의하여야 한다. 예를 들어, 서열 구성, 퍼센트 동일성, 서열 길이, 도메인 구조, 기능적 활성 등의 임의의 조합은 본 발명에 포함되는 SELPLG 분자를 설명하는데 사용될 수 있다.
용어 "AIF1(Allograft Inflammatory Factor 1)"은 액틴과 칼슘에 결합하는 단백질인 동종이식편 염증성 인자 1을 지칭한다. AIF1 유전자는 사이토카인 및 인터페론에 의해 유도되며, 대식세포 활성화와 혈관 평활근 세포 및 T-림프구의 성장을 촉진할 수 있다. AIF1의 다형성은 전신성 경화증과 관련이 있을 수 있다. AIF1은 막 러플링(membrane ruffling) 및 RAC 활성화를 향상시키는 액틴-결합 단백질이다. 이는 LCP1의 액틴-번들링(actin-bundling) 활성을 향상시키고, 칼슘과 결합하며, RAC 신호전달 및 식균 작용에서 역할을 한다. AIF1은 혈관 평활근 세포와 T-림프구의 증식을 촉진하고, 림프구 이동을 향상시키며, 혈관 염증에 역할을 한다. AIF1과 관련된 질환은 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증 및 급성 설사를 포함한다. 관련 경로 중에는 척수 손상이 있다. 일부 실시형태에서, 인간의 6p 염색체에 위치한 AIF1 유전자는 6개의 엑손으로 구성된다. Aif1tm1.1(KOMP)Wtsi(문헌[Dickinson et al. (2016) Nature 537:208-514]) 및 Aif1tm1Nsib(문헌[Casimiro et al. (2013) Genesis 51:734-740])을 포함하는 넉아웃 마우스 계통이 존재한다. 일부 실시형태에서, 인간 AIF1 단백질은 147개의 아미노산을 갖고/갖거나 16703Da의 분자량을 갖는다. 일부 실시형태에서, AIF1 단백질은 펜타-EF 핸드(PEF) 패밀리 도메인을 함유한다. AIF1의 알려진 결합 파트너는 예를 들어, LCP1을 포함한다.
용어 "AIF1"은 이의 단편, 변이체(예를 들어, 대립유전자 변이체) 및 유도체를 포함하는 것으로 의도된다. 대표적인 인간 AIF1 cDNA 및 인간 AIF1 단백질 서열은 당업계에 잘 알려져 있으며, 미국 국립생물공학정보센터(NCBI)(예를 들어, ncbi.nlm.nih.gov/gene/199 참조)로부터 공개적으로 이용 가능하다. 예를 들어, 적어도 2개의 상이한 인간 AIF1 동형 단백질이 알려져 있다. 인간 AIF1 동형 단백질 1(NP_001305899.1 및 NP_116573.1)은 전사체 변이체 1(NM_032955.2) 및 전사체 변이체 4(NM_001318970.1)에 의해 암호화될 수 있다. 인간 AIF1 동형 단백질 3(NP_001614.3)은 전사체 변이체 3(NM_001623.4)에 의해 암호화될 수 있으며, 이는 가장 긴 동형 단백질을 암호화한다. 전사체 변이체 1은 변이체 3과 비교하여 5' UTR에서 상이하고, 5' 코딩 영역의 부분이 없으며, 하류 시작 코돈에서 번역을 개시한다. 전사체 변이체 4는 5' 영역에서 대안적 스플라이스 부위를 사용하며, 하류 시작 코돈에서 번역을 개시한다. 변이체 1 및 변이체 4는 동일한 동형 단백질 1을 암호화하며, 이는 동형 단백질 3보다 더 짧은 N-말단을 갖는다. 인간 이외의 유기체에서 AIF1 오르토로그의 핵산 및 폴리펩타이드 서열은 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 침팬지 AIF1(XM_009450914.2 및 XP_009449189.2; XM_009450910.2 및 XP_009449185.2; XM_001154743.5 및 XP_001154743.1; XM_009450908.3 및 XP_009449183.1; 및 XM_024357095.1 및 XP_024212863.1), 레서스 원숭이 AIF1(NM_001047118.1 및 NP_001040583.1), 개 AIF1(XM_532072.6 및 XP_532072.2), 소 AIF1(NM_173985.2 및 NP_776410.1), 마우스 AIF1(NM_001361501.1 및 NP_001348430.1; NM_001361502.1 및 NP_001348431.1; NM_019467.3 및 NP_062340.1) 및 래트 AIF1(NM_017196.3 및 NP_058892.1)을 포함한다. AIF1 오르토로그의 대표적인 서열은 아래 표 1에 나타나 있다.
AIF1 단백질을 검출하기에 적합한 항-AIF1 항체는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 항체 GTX100042, GTX101495 및 GTX632426(진텍스, 캘리포니아주 어바인), 항체 sc-32725 및 sc-398406(산타 크루즈 바이오테크놀로지), 항체 NB100-1028, NBP2-19019, NBP2-16908 및 NB100-2833(노부스 바이올로지컬즈, 콜로라도주 리틀턴), 항체 ab5076, ab178847 및 ab48004(압캠, 메사추세츠주 케임브리지), 항체 Cat #: AP08793PU-N 및 AP08912PU-N(오리젠, 메릴랜드주 록빌) 등을 포함한다. 또한, AIF1 발현을 검출하기 위한 시약은 잘 알려져 있다. AIF1의 여러 임상적 테스트는 NIH 유전자 검사 등록소(GTR®)(예를 들어, GTR 테스트 ID: GTR000542089.2, 펄젠트 클리니칼 다이아그노스틱스 랩(캘리포니아주 템플 시티)에 의해 제공됨)에서 이용할 수 있다. 또한, AIF1 발현을 감소시키기 위한 여러 siRNA, shRNA, CRISPR 작제물은 위에 언급된 회사의 상업 제품 목록, 예컨대 오리젠 테크놀로지스(메릴랜드주 록빌)의 siRNA 제품 #SR300138, shRNA 제품 # TL314878, TR314878, TG314878, TF314878, TL314878V 및 CRISPR 제품 #KN203154, 어플라이드 바이올로지컬 머티리얼즈의 CRISPR gRNA 제품(K6902508)과 산타 크루즈의 CRISPR gRNA 제품(sc-400513) 및 산타 크루즈의 RNAi 제품(Cat # sc-36323 및 sc-42833)에서 찾을 수 있다. 용어는 AIF1 분자와 관련하여 본 명세서에 기재된 특징의 임의의 조합을 지칭하기 위해 더 사용될 수 있음에 유의하여야 한다. 예를 들어, 서열 구성, 퍼센트 동일성, 서열 길이, 도메인 구조, 기능적 활성 등의 임의의 조합은 본 발명에 포함되는 AIF1 분자를 설명하는데 사용될 수 있다.
용어 "CD84"는 신호전달 림프구 활성화 분자(signaling lymphocyte activation molecule: SLAM) 패밀리의 구성원인 막 당단백질인 CD84 분자를 지칭한다. 이러한 패밀리는 더 큰 CD2 세포-표면 수용체 Ig 슈퍼패밀리의 서브세트를 형성한다. 암호화된 단백질은 수많은 면역 세포 유형에서 발현되고, 이들 세포에서 수용체-매개성 신호전달을 조절하는데 관여하는 동종친화성(homophilic) 부착 분자이다. CD84와 관련된 질환은 백혈병, 만성 림프구성을 포함한다. 관련 경로 중에는 상승된 혈소판 세포질 ca2+ 및 혈관 벽에서의 세포 표면 상호작용에 대한 반응이 있다. 일부 실시형태에서, 인간의 1q 염색체에 위치한 CD84 유전자는 9개의 엑손으로 구성된다. Cd84tm1Beni(문헌[Hofmann et al. (2014) Plos One 9:e115306]), Cd84 tm1b(KOMP)Mbp(문헌[Dickinson et al. (2016) Nature 537:508-514]) 및 Cd84tm1Pls(문헌[Cannnons et al. (2010) Immunity 32:253-265])를 포함하는 넉아웃 마우스 계통이 존재한다. 일부 실시형태에서, 인간 CD84 단백질은 345개의 아미노산을 갖고/갖거나 38782Da의 분자량을 갖는다. 일부 실시형태에서, CD84 단백질은 N-말단 면역글로불린(Ig)-유사 도메인 및 면역글로불린 도메인을 함유한다. CD84는 신호전달 림프구성 활성화 분자(SLAM) 패밀리의 자가-리간드 수용체이다. 동형 또는 이형의 세포-세포 상호작용에 의해 촉발된 SLAM 수용체는 다양한 면역 세포의 활성화 및 분화를 조절하므로, 선천성 및 후천성 면역 반응 둘 다의 조절 및 상호연결에 관여한다. 활성은 소세포질성 어댑터 단백질, SH2D1A/SAP 및/또는 SH2D1B/EAT-2의 존재 또는 부재에 의해 제어된다. CD84는 SH2D1A 및 SH2D1B에 의존하는 자연 살해(NK) 세포 세포 독성을 매개할 수 있다. CD84는 활성화된 T-세포의 증식성 반응을 증가시키고, SH2D1A/SAP는 이러한 과정에 필요하지 않은 것으로 보인다. CD84의 동종친화성 상호작용은 림프구에서 인터페론 감마/IFNg 분비를 향상시키고, SH2D1A-의존적 경로를 통해 혈소판 자극을 유도한다. CD84는 조혈 선조 세포에 대한 마커 역할을 할 수 있다(문헌[Martin et al. (2001) J Immunol 167:3668-3676]). CD84는 연장된 T-세포:B-세포 접촉, 최적의 T 여포성 헬퍼 기능 및 배 중심(germinal center) 형성에 필요하다. 배 중심에서, CD84는 B-세포 내성을 유지하고 자가면역을 방지하는데 관여한다. 비만 세포에서, CD84는 고친화성 면역글로불린 엡실론 수용체 신호전달을 음성적으로 조절한다(문헌[Alvarez-Errico et al. (2011) J Immunol 187:5577-5586]).
용어 "CD84"는 이의 단편, 변이체(예를 들어, 대립유전자 변이체) 및 유도체를 포함하는 것으로 의도된다. 대표적인 인간 CD84 cDNA 및 인간 CD84 단백질 서열은 당업계에 잘 알려져 있으며, 미국 국립생물공학정보센터(NCBI)(예를 들어, ncbi.nlm.nih.gov/gene/8832 참조)로부터 공개적으로 이용 가능하다. 예를 들어, 적어도 5개의 상이한 인간 CD84 동형 단백질이 알려져 있다. 인간 CD84 동형 단백질 1(NP_001171808.1)은 전사체 변이체 1(NM_001184879.1)에 의해 암호화될 수 있으며, 이는 가장 긴 전사체이다. 인간 CD84 동형 단백질 2(NP_003865.1)는 전사체 변이체 2(NM_003874.3)에 의해 암호화될 수 있으며, 이는 변이체 1과 비교하여 대체의, 인-프레임 세그먼트가 결여되어 있다. 인간 CD84 동형 단백질 3(NP_001171810.1)은 전사체 변이체 3(NM_001184881.1)에 의해 암호화될 수 있으며, 이는 변이체 1과 비교하여 2개의 대체 세그먼트가 결여되어 있으며, 그 중 하나는 리딩 프레임을 이동시킨다. 인간 CD84 동형 단백질 4(NP_001171811.1)는 전사체 변이체 4(NM_001184882.1)에 의해 암호화될 수 있으며, 이는 변이체 1과 비교하여 2개의 대체 세그먼트가 결여되어 있다. 인간 CD84 동형 단백질 5(NP_001317671.1)는 전사체 변이체 5(NM_001330742.1)에 의해 암호화될 수 있으며, 이는 변이체 1과 비교하여 대체 인-프레임 스플라이스 연결부위를 사용한다. 인간 이외의 유기체에서 CD84 오르토로그의 핵산 및 폴리펩타이드 서열은 잘 알려져 있으며, 예를 들어 침팬지 CD84(XM_016930506.2 및 XP_016785995.1; 및 XM_001172059.4 및 XP_001172059.1), 레서스 원숭이 CD84(XM_001117595.3 및 XP_001117595.1, XM_015113569.1 및 XP_014969055.1 및 XM_015113561.1 및 XP_014969047.1), 개 CD84(XM_022415343.1 및 XP_022271051.1; 및 XM_005640884.3 및 XP_005640941), 소 CD84(XM_024989885.1 및 XP_024845653.1; XM_024989884.1 및 XP_024845652.1; XM_010802802.3 및 XP_010801104.1; XM_010802805.3 및 XP_010801107.1; XM_024989882.1 및 XP_024845650.1; XM_024989883.1 및 XP_024845651.1; 및 XM_024989886.1 및 XP_024845654.1), 마우스 CD84(NM_013489.3 및 NP_038517.1; NM_001252472.1 및 NP_001239401.1; 및 NM_001289470.1 및 NP_001276399.1) 및 래트 CD84(NM_001192006.1 및 NP_001178935.1)를 포함한다. CD84 오르토로그의 대표적인 서열은 본 명세서에서 입증된 바와 같이 CD84가 단핵구 및/또는 대식세포에 차별적으로 영향을 미쳐 문맥에 따라 더한 전-염증성 또는 더한 항-염증성이 될 수 있기 때문에 아래 표 1 및 표 2에 나타나 있다.
CD84 단백질을 검출하기에 적합한 항-CD84 항체는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 항체 GTX32506, GTX75849 및 GTX75851(진텍스, 캘리포니아주 어바인), 항체 sc-39821 및 sc-70810(산타 크루즈 바이오테크놀로지), 항체 MAB1855, AF1855, NBP2-49635 및 NB100-65929(노부스 바이올로지컬즈, 콜로라도주 리틀턴), 항체 ab131256, ab202841 및 ab176513(압캠, 메사추세츠주 케임브리지), 항체 Cat #: SM1845R 및 SM1845PT(오리젠, 메릴랜드주 록빌) 등을 포함한다. 다른 항-CD84 항체가 또한 알려져 있으며, 예를 들어 미국 공개 US20140147451A1, US20170260270A1 및 US20180327493에 기재된 것들을 포함한다. 또한, CD84 발현을 검출하기 위한 시약은 잘 알려져 있다. CD84의 여러 임상적 테스트는 NIH 유전자 검사 등록소(GTR®)(예를 들어, GTR 테스트 ID: GTR000532250.2, 펄젠트 클리니칼 다이아그노스틱스 랩(캘리포니아주 템플 시티)에 의해 제공됨)에서 이용할 수 있다. 또한, CD84 발현을 감소시키기 위한 여러 siRNA, shRNA, CRISPR 작제물은 위에 언급된 회사의 상업 제품 목록, 예컨대 오리젠 테크놀로지스(메릴랜드주 록빌)의 siRNA 제품 #SR322568, shRNA 제품 # TL314062, TR314062, TG314062, TF314062, TL314062V 및 CRISPR 제품 #KN204477, 어플라이드 바이올로지컬 머티리얼즈의 CRISPR gRNA 제품(K6196808)과 산타 크루즈의 CRISPR gRNA 제품(sc-416482) 및 산타 크루즈의 RNAi 제품(Cat # sc-42810 및 sc-42811)에서 찾을 수 있다. 용어는 CD84 분자와 관련하여 본 명세서에 기재된 특징의 임의의 조합을 지칭하기 위해 더 사용될 수 있음에 유의하여야 한다. 예를 들어, 서열 구성, 퍼센트 동일성, 서열 길이, 도메인 구조, 기능적 활성 등의 임의의 조합은 본 발명에 포함되는 CD84 분자를 설명하는데 사용될 수 있다.
용어 "IGSF6(Immunoglobulin Superfamily Member 6)"은 면역글로불린 슈퍼패밀리 구성원 6을 지칭한다. IGSF6과 관련된 질환은 이압성 골괴사 및 염증성 장질환을 포함한다. 일부 실시형태에서, 인간의 16p 염색체에 위치한 IgSF6 유전자는 6개의 엑손으로 구성된다. IGSF6은 DNA의 반대 가닥에서 전사되는 METTL9의 인트론 내에서 완전히 코딩된다. IGSF6은 염증성 장질환과 관련된 유전자좌에 국재되어 있다. 일부 실시형태에서, 인간 IGSF6 단백질은 241개의 아미노산을 갖고/갖거나 27013Da의 분자량을 갖는다. 일부 실시형태에서, IGSF6은 면역글로불린 도메인을 함유한다.
용어 "IGSF6"은 이의 단편, 변이체(예를 들어, 대립유전자 변이체) 및 유도체를 포함하는 것으로 의도된다. 대표적인 인간 IGSF6 cDNA 및 인간 IGSF6 단백질 서열은 당업계에 잘 알려져 있으며, 미국 국립생물공학정보센터(NCBI)(예를 들어, ncbi.nlm.nih.gov/gene/10261 참조)로부터 공개적으로 이용 가능하다. 예를 들어, 인간 IGSF6(NP_005840.2)은 전사체 변이체 1(NM_005849.3)에 의해 암호화될 수 있다. 인간 이외의 유기체에서 IGSF6 오르토로그의 핵산 및 폴리펩타이드 서열은 잘 알려져 있으며, 예를 들어 침팬지 IGSF6(XM_001160217.6 및 XP_001160217.1; 및 XM_016928690.2 및 XP_016784179.1), 레서스 원숭이 IGSF6(XM_001093144.3 및 XP_001093144.1), 개 IGSF6(XM_005621426.3 및 XP_005621483.1; XM_005621428.3 및 XP_005621485.1; 및 XM_022419960.1 및 XP_022275668.1), 소 IGSF6(XM_002697991.6 및 XP_002698037.1), 마우스 IGSF6(NM_030691.1 및 NP_109616.1), 래트 IGSF6(NM_133542.2 및 NP_598226.1); 및 닭 IGSF6(NM_001277599.1 및 NP_001264528.1)을 포함한다. IGSF6 오르토로그의 대표적인 서열은 아래 표 1에 나타나 있다.
IGSF6 단백질을 검출하기에 적합한 항-IGSF6 항체는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 항체 sc-377053(산타 크루즈 바이오테크놀로지), 항체 DDX0220P-100, NBP1-84061, H00010261-M02 및 H00010261-M01(노부스 바이올로지컬즈, 콜로라도주 리틀턴), 항체 ab197659(압캠, 메사추세츠주 케임브리지), 항체 Cat #: TA322553(오리젠, 메릴랜드주 록빌) 등을 포함한다. 또한, IGSF6 발현을 검출하기 위한 시약은 잘 알려져 있다. IGSF6의 여러 임상적 테스트는 NIH 유전자 검사 등록소(GTR®)(예를 들어, GTR 테스트 ID: GTR000542139.2, 펄젠트 클리니칼 다이아그노스틱스 랩(캘리포니아주 템플 시티)에 의해 제공됨)에서 이용할 수 있다. 또한, IGSF6 발현을 감소시키기 위한 여러 siRNA, shRNA, CRISPR 작제물은 위에 언급된 회사의 상업 제품 목록, 예컨대 오리젠 테크놀로지스(메릴랜드주 록빌)의 siRNA 제품 #SR323049, shRNA 제품 # TL312209, TR312209, TG312209, TF312209, TL312209V 및 CRISPR 제품 #KN204717, 어플라이드 바이올로지컬 머티리얼즈의 CRISPR gRNA 제품(K7017208)과 산타 크루즈의 CRISPR gRNA 제품(sc-411445) 및 산타 크루즈의 RNAi 제품(Cat # sc-93333 및 sc-146192)에서 찾을 수 있다. 용어는 IGSF6 분자와 관련하여 본 명세서에 기재된 특징의 임의의 조합을 지칭하기 위해 더 사용될 수 있음에 유의하여야 한다. 예를 들어, 서열 구성, 퍼센트 동일성, 서열 길이, 도메인 구조, 기능적 활성 등의 임의의 조합은 본 발명에 포함되는 IGSF6 분자를 설명하는데 사용될 수 있다.
용어 "CD48"은 SLAM(신호전달 림프구 활성화 분자) 단백질을 포함하는 면역글로불린-유사 수용체의 CD2 서브패밀리의 구성원인 CD48 분자를 지칭한다. CD48 단백질은 림프구 및 다른 면역 세포, 수지상 세포 및 내피 세포의 표면에서 발견되며, 이러한 세포의 활성화 및 분화 경로에 참여한다. CD48 단백질은 막관통 도메인을 갖지 않지만, 가용성 형태의 수용체를 생성하기 위해 절단될 수 있는 C-말단 도메인을 통해 GPI 앵커에 의해 세포 표면에 유지된다. 관련 경로 중에는 상승된 혈소판 세포질 Ca2+ 및 조혈 줄기 세포 분화 경로 및 계통-특이적 마커에 대한 반응이 있다. 일부 실시형태에서, 인간의 1q 염색체에 위치한 CD48 유전자는 5개의 엑손으로 구성된다. 일부 실시형태에서, 인간 CD48 단백질은 243개의 아미노산을 갖고/갖거나 27683Da의 분자량을 갖는다. CD48tm1Rsr(문헌[Gonazalez-Cabrero et al. (1999) Proc Natl Acad Sci 96:1019-1023])라 불리는 넉아웃 마우스 계통이 존재한다. CD48은 이종친화성 방식으로 CD244와 상호작용한다. 일부 실시형태에서, CD48 단백질은 하나 이상의 면역글로불린-유사 도메인을 함유한다.
용어 "CD48"은 이의 단편, 변이체(예를 들어, 대립유전자 변이체) 및 유도체를 포함하는 것으로 의도된다. 대표적인 인간 CD48 cDNA 및 인간 CD48 단백질 서열은 당업계에 잘 알려져 있으며, 미국 국립생물공학정보센터(NCBI)(예를 들어, ncbi.nlm.nih.gov/gene/962 참조)로부터 공개적으로 이용 가능하다. 예를 들어, 적어도 2개의 상이한 인간 CD48 동형 단백질이 알려져 있다. 인간 CD48 동형 단백질 1(NP_001769.2)은 전사체 변이체 1(NM_001778.3)에 의해 암호화될 수 있으며, 이는 더 짧은 전사체이다. 인간 CD48 동형 단백질 2(NP_001242959.1)는 전사체 변이체 2(NM_001256030.1)에 의해 암호화될 수 있으며, 이는 변이체 1과 비교하여 3' UTR 및 코딩 영역에서 상이하다. 암호화된 동형 단백질 2는 동형 단백질 1과 비교하여 더 길고, 별개의 C-말단을 갖는다. 인간 이외의 유기체에서 CD48 오르토로그의핵산 및 폴리펩타이드 서열은 잘 알려져 있으며, 예를 들어 침팬지 CD48(XM_009435717.1 및 XP_009433992.1; 및 XM_001172145.3 및 XP_001172145.2), 레서스 원숭이 CD48(XM_015113628.1 및 XP_014969114.1; XM_015113634.1 및 XP_014969120.1; 및 XM_015113619.1 및 XP_014969105.1), 개 CD48(XM_545759.6 및 XP_545759.2; 및 XM_022415374.1 및 XP_022271082.1), 소 CD48(NM_001046002.1 및 NP_001039467.1), 마우스 CD48(NM_007649.5 및 NP_031675.1; 및 NM_001360767.1 및 NP_001347696.1), 래트 CD48(NM_139103.1 및 NP_620803.1); 및 닭 CD48(NM_001277599.1 및 NP_001264528.1)을 포함한다. CD48 오르토로그의 대표적인 서열은 본 명세서에서 입증된 바와 같이 CD48이 단핵구 및/또는 대식세포에 차별적으로 영향을 미쳐 문맥에 따라 더한 전-염증성 또는 더한 항-염증성이 될 수 있기 때문에 아래 표 1 및 표 2에 나타나 있다.
CD48 단백질을 검출하기에 적합한 항-CD48 항체는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 항체 sc-70719, sc-70718(산타 크루즈 바이오테크놀로지), 항체 AF3327, AF3644, MAB36441 및 MAB-3644(노부스 바이올로지컬즈, 콜로라도주 리틀턴), 항체 ab9185, ab134049, ab119873 및 ab76904(압캠, 메사추세츠주 케임브리지), 항체 Cat #: TA351055, TA320283(오리젠, 메릴랜드주 록빌) 등을 포함한다. 다른 항-CD48 항체가 또한 알려져 있으며, 예를 들어 미국 특허 US9097717B2 및 미국 공개 US20120076790, US20130230533 및 US20180092984에 기재된 것들을 포함한다. 또한, CD48 발현을 검출하기 위한 시약은 잘 알려져 있다. CD48의 여러 임상적 테스트는 NIH 유전자 검사 등록소(GTR®)(예를 들어, GTR 테스트 ID: GTR000532164.2, 펄젠트 클리니칼 다이아그노스틱스 랩(캘리포니아주 템플 시티)에 의해 제공됨)에서 이용할 수 있다. 또한, CD48 발현을 감소시키기 위한 여러 siRNA, shRNA, CRISPR 작제물은 위에 언급된 회사의 상업 제품 목록, 예컨대 오리젠 테크놀로지스(메릴랜드주 록빌)의 siRNA 제품 #SR300685, shRNA 제품 # TL314079, TR314079, TG314079, TF314079, TL314079V 및 CRISPR 제품 #KN204849, 어플라이드 바이올로지컬 머티리얼즈의 CRISPR gRNA 제품(K7408008)과 산타 크루즈의 CRISPR gRNA 제품(sc-416692) 및 산타 크루즈의 RNAi 제품(Cat # sc-35008 및 sc-35009)에서 찾을 수 있다. 용어는 CD48 분자와 관련하여 본 명세서에 기재된 특징의 임의의 조합을 지칭하기 위해 더 사용될 수 있음에 유의하여야 한다. 예를 들어, 서열 구성, 퍼센트 동일성, 서열 길이, 도메인 구조, 기능적 활성 등의 임의의 조합은 본 발명에 포함되는 CD48 분자를 설명하는데 사용될 수 있다.
용어 "CD33"은 세포에 대한 시알산 의존적 결합을 매개하는 골수단핵구성-유래 세포의 추정 부착 분자인 CD33 분자를 지칭한다. CD33은 알파-2,6-연결된 시알산에 우선적으로 결합한다. 시알산 인식 부위는 동일한 세포 표면에서 시알산과의 시스 상호작용에 의해 가려질 수 있다. 면역 반응에서, CD33은 신호전달 분자의 탈인산화를 통해 신호 전달을 차단하는 이들의 SH2 도메인(들)을 통해 세포질성 포스파테이스(들)를 동원함으로써 리간드 유도성 타이로신 인산화시 저해성 수용체로서 작용할 수 있다. CD33은 시험관내 급성 골수성 백혈병에서 아폽토시스를 유도한다. CD33과 관련된 질환은 담낭 림프종 및 피부외 비만세포종을 포함한다. 관련 경로 중에는 조혈 줄기 세포 분화 경로 및 계통-특이적 마커 및 선천성 면역 체계가 있다. 일부 실시형태에서, 인간의 19q 염색체에 위치한 CD33 유전자는 14개의 엑손으로 구성된다. 일부 실시형태에서, 인간 CD33 단백질은 364개의 아미노산을 갖고/갖거나 39825Da의 분자량을 갖는다. CD33은 인산화시 PTPN6/SHP-1 및 PTPN11/SHP-2와 상호작용한다. 일부 실시형태에서, 인간 CD33 단백질은 면역수용체 타이로신-기반 저해제 모티프(ITIM)로서 지칭되는 세포질성 모티프의 2개의 카피를 함유한다. 이러한 모티프는 세포 반응의 조절에 관여한다. 인산화된 ITIM 모티프는 여러 SH2-함유 포스파테이스의 SH2 도메인에 결합할 수 있다.
용어 "CD33"은 이의 단편, 변이체(예를 들어, 대립유전자 변이체) 및 유도체를 포함하는 것으로 의도된다. 대표적인 인간 CD33 cDNA 및 인간 CD33 단백질 서열은 당업계에 잘 알려져 있으며, 미국 국립생물공학정보센터(NCBI)(예를 들어, ncbi.nlm.nih.gov/gene/945 참조)로부터 공개적으로 이용 가능하다. 예를 들어, 적어도 3개의 상이한 인간 CD33 동형 단백질이 알려져 있다. 인간 CD33 동형 단백질 1(NP_001763.3)은 전사체 변이체 1(NM_001772.3)에 의해 암호화될 수 있으며, 이는 더 긴 전사체이다. 인간 CD33 동형 단백질 2(NP_001076087.1)는 전사체 변이체 2(NM_001082618.1)에 의해 암호화될 수 있으며, 이는 변이체 1과 비교하여 5' 코딩 영역에서 대체 인-프레임 엑손이 결여되어 동형 단백질 1과 비교하여 더 짧은 단백질(동형 단백질 2, CD33m이라고도 알려짐)을 생성한다. 인간 CD33 동형 단백질 3(NP_001171079.1)은 전사체 변이체 3(NM_001177608.1)에 의해 암호화될 수 있으며, 이는 변이체 1과 비교하여 3' UTR 및 코딩 서열이 상이하다. 암호화된 동형 단백질 3은 동형 단백질 1과 비교하여 더 짧고, 별개의 C-말단을 갖는다. 인간 이외의 유기체에서 CD33 오르토로그의 핵산 및 폴리펩타이드 서열은 잘 알려져 있으며, 예를 들어 침팬지 CD33(XM_512850.7 및 XP_512850.3; XM_009436143.3 및 XP_009434418.1; 및 XM_016936702.2 및 XP_016792191.1), 레서스 원숭이 CD33(XM_015124693.1 및 XP_014980179.1; 및 XM_001114616.3 및 XP_001114616.2) 및 개 CD33(XM_005616249.2 및 XP_005616306.1)을 포함한다. CD33 오르토로그의 대표적인 서열은 아래 표 1에 나타나 있다.
CD33 단백질을 검출하기에 적합한 항-CD33 항체는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 항체 sc-514119, sc-376184(산타 크루즈 바이오테크놀로지), 항체 NBP2-22377, NBP2-29619, NBP2-37388 및 MAB1137(노부스 바이올로지컬즈, 콜로라도주 리틀턴), 항체 ab199432, ab134115, ab30371 및 ab11032(압캠, 메사추세츠주 케임브리지), 항체 Cat #: CF806758, TA806758(오리젠, 메릴랜드주 록빌) 등을 포함한다. 다른 항-CD33 항체가 또한 알려져 있으며, 예를 들어, 미국 공개 US20150125447A1, US20160362490A1, US20170002074A1 및 US20190002560A1 및 미국 특허 US7022500B1과 US9587019B2에 기재된 것들을 포함한다. 또한, CD33 발현을 검출하기 위한 시약은 잘 알려져 있다. CD33의 여러 임상적 테스트는 NIH 유전자 검사 등록소(GTR®)(예를 들어, GTR 테스트 ID: GTR000532386.2, 펄젠트 클리니칼 다이아그노스틱스 랩(캘리포니아주 템플 시티)에 의해 제공됨)에서 이용할 수 있다. 또한, CD33 발현을 감소시키기 위한 여러 siRNA, shRNA, CRISPR 작제물은 위에 언급된 회사의 상업 제품 목록, 예컨대 오리젠 테크놀로지스(메릴랜드주 록빌)의 siRNA 제품 #SR319607, shRNA 제품 # TL314092, TR314092, TG314092, TF314092, TL314092V 및 CRISPR 제품 #KN207023, 어플라이드 바이올로지컬 머티리얼즈의 CRISPR gRNA 제품(K3368408)과 산타 크루즈의 CRISPR gRNA 제품(sc-401011) 및 산타 크루즈의 RNAi 제품(Cat # sc-42782 및 sc-42783)에서 찾을 수 있다. 용어는 CD33 분자와 관련하여 본 명세서에 기재된 특징의 임의의 조합을 지칭하기 위해 더 사용될 수 있음에 유의하여야 한다. 예를 들어, 서열 구성, 퍼센트 동일성, 서열 길이, 도메인 구조, 기능적 활성 등의 임의의 조합은 본 발명에 포함되는 CD33 분자를 설명하는데 사용될 수 있다.
용어 "LST1(Leukocyte Specific Transcript 1)" 림프구의 증식을 저해할 수 있는 막 단백질인 백혈구 특이적 전사체 1이다. LST1의 발현은 리포폴리사카라이드, 인터페론-감마 및 박테리아에 의해 향상된다. LST1은 다양한 세포 유형에서 과발현될 때 사상 위족(filopodia) 및 미세스파이크(microspike)의 생성을 포함한 형태학적 변화를 유도하며, 수지상 세포 성숙에 관여할 수 있다. LST1의 동형 단백질 1 및 동형 단백질 2는 림프구 증식에 대해 저해성 효과를 갖는다. 일부 실시형태에서, 인간의 6p 염색체에 위치한 LST1 유전자는 6개의 엑손으로 구성된다. 일부 실시형태에서, 인간 LST1 단백질은 97개의 아미노산을 갖고/갖거나 10792Da의 분자량을 갖는다.
용어 "LST1"은 이의 단편, 변이체(예를 들어, 대립유전자 변이체) 및 유도체를 포함하는 것으로 의도된다. 대표적인 인간 LST1 cDNA 및 인간 LST1 단백질 서열은 당업계에 잘 알려져 있으며, 미국 국립생물공학정보센터(NCBI)(예를 들어, ncbi.nlm.nih.gov/gene/7940 참조)로부터 공개적으로 이용 가능하다. 예를 들어, 적어도 6개의 상이한 인간 LST1 동형 단백질이 알려져 있다. 인간 LST1 동형 단백질 1(NP_009092.3)은 전사체 변이체 1(NM_007161.3)에 의해 암호화될 수 있으며, 이는 가장 긴 전사체이다. 인간 LST1 동형 단백질 2(NP_995309.2)는 전사체 변이체 2(NM_205837.2)에 의해 암호화될 수 있으며, 이는 변이체 1과 비교하여 5' UTR에서 추가적인 엑손을 포함하며, 3' 코딩 영역에서 프레임시프트를 유발하는 내부 엑손이 결여되어 있다. 인간 LST1 동형 단백질 3(NP_995310.2)은 전사체 변이체 3(NM_205838.2)에 의해 암호화될 수 있으며, 이는 변이체 1과 비교하여 5' UTR에서 추가적인 엑손을 포함하고, 5' 코딩 영역에서 대체 인-프레임 엑손이 결여되어 있으며, 3' 코딩 영역에서 대체 인-프레임 스플라이스 부위를 사용한다. 인간 LST1 동형 단백질 4(NP_995311.2)는 전사체 변이체 4(NM_205839.2)의해 암호화될 수 있으며, 이는 변이체 1과 비교하여 5' UTR에서 추가적인 엑손을 포함하고, 및 3' 코딩 영역에서 대체 인-프레임 스플라이스 부위를 사용한다. 인간 LST1 동형 단백질 5(NP_995312.2)는 전사체 변이체 5(NM_205840.2)에 의해 암호화될 수 있으며, 이는 변이체 1과 비교하여 중심 코딩 영역에서 대체 엑손이 결여되어 있으며, 3' 코딩 영역에서 프레임시프트를 유발하는 대안적 스플라이스 부위를 사용한다. 인간 LST1 동형 단백질 6(NP_001160010.1)은 전사체 변이체 6(NM_001166538.1)에 의해 암호화될 수 있으며, 이는 변이체 1과 비교하여 5' 코딩 영역에서 대체 인-프레임 엑손이 결여되어 동형 단백질 1보다 더 짧은 동형 단백질 6을 생성한다. 인간 이외의 유기체에서 LST1 오르토로그의 핵산 및 폴리펩타이드 서열은 잘 알려져 있으며, 예를 들어 침팬지 LST1(XM_009450906.3 및 XP_009449181.1; XM_009450900.3 및 XP_009449175.1; XM_009450905.3 및 XP_009449180.1; XM_003950777.4 및 XP_003950826.1; XM_016955125.2 및 XP_016810614.1; XM_016955127.2 및 XP_016810616.1; XM_016955126.2 및 XP_016810615.1; XM_016955129.2 및 XP_016810618.1; XM_009450901.3 및 XP_009449176.1; 및 XM_009450902.3 및 XP_009449177.1)을 포함한다. LST1 오르토로그의 대표적인 서열은 아래 표 1에 나타나 있다.
LST1 단백질을 검출하기에 적합한 항-LST1 항체는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 항체 GTX16300(진텍스), 항체 NBP1-45072, NBP1-98482 및 H00007940-B01P(노부스 바이올로지컬즈, 콜로라도주 리틀턴), 항체 ab14557 및 ab172244(압캠, 메사추세츠주 케임브리지), 항체 Cat #: AM20987PU-N(오리젠, 메릴랜드주 록빌) 등을 포함한다. 또한, LST1 발현을 검출하기 위한 시약은 잘 알려져 있다. LST1의 여러 임상적 테스트는 NIH 유전자 검사 등록소(GTR®)(예를 들어, GTR 테스트 ID: GTR000541902.2, 펄젠트 클리니칼 다이아그노스틱스 랩(캘리포니아주 템플 시티)에 의해 제공됨)에서 이용할 수 있다. 또한, LST1 발현을 감소시키기 위한 여러 siRNA, shRNA, CRISPR 작제물은 위에 언급된 회사의 상업 제품 목록, 예컨대 오리젠 테크놀로지스(메릴랜드주 록빌)의 siRNA 제품 #SR305318, shRNA 제품 # TL311652, TR311652, TG311652, TF311652, TL311652V 및 CRISPR 제품 #KN213273, 어플라이드 바이올로지컬 머티리얼즈의 CRISPR gRNA 제품(K7098808)과 산타 크루즈의 CRISPR gRNA 제품(sc-407477) 및 산타 크루즈의 RNAi 제품(Cat # sc-95628 및 sc-149136)을 포함한다. 용어는 LST1 분자와 관련하여 본 명세서에 기재된 특징의 임의의 조합을 지칭하기 위해 더 사용될 수 있음에 유의하여야 한다. 예를 들어, 서열 구성, 퍼센트 동일성, 서열 길이, 도메인 구조, 기능적 활성 등의 임의의 조합은 본 발명에 포함되는 LST1 분자를 설명하는데 사용될 수 있다.
용어 "TNFAIP8L2(TNF Alpha Induced Protein 8 Like 2)"또는 "TIPE2"는 TNF 알파 유도성 단백질 8 유사 2를 지칭한다. TNFAIP8L2와 관련된 질환은 피부 편평세포 암종을 포함한다. 관련 경로 중에는 대사 및 글리세로포스포리피드 생합성이 있다. TNFAIP8L2는 면역 항상성을 유지함으로써 선천성 및 후천성 면역의 음성 조절인자의 역할을 한다. TNFAIP8L2는 톨-유사 수용체 및 T-세포 수용체 기능의 음성 조절인자의 역할을 한다. 이는 또한 면역 체계의 과민반응을 방지하고, 면역 항상성을 유지한다. TNFAIP8L2는 JUN/AP1 및 NF-카파-B 활성화를 저해하고, Fas-유도성 아폽토시스를 촉진한다. 일부 실시형태에서, 인간의 1q 염색체에 위치한 TNFAIP8L2 유전자는 14개의 엑손으로 구성된다. Tnfaip8l2tm1Yhcn(문헌[Sun et al. (2008) Cell 132:415-426])라 불리는 넉아웃 마우스 계통이 존재한다. 일부 실시형태에서, 인간 TNFAIP8L2 단백질은 184개의 아미노산을 갖고/갖거나 20556Da의 분자량을 갖는다. TNFAIP8L2 단백질의 중심 영역은 처음에 DED(사멸 효과기) 도메인을 구성하는 것으로 생각되었다. 그러나, 3D-구조 데이터는 DED(사멸 효과기) 도메인의 예측된 폴딩과는 다른 이전에 특성화되지 않은 폴딩을 나타낸다. TNFAIP8L2는 보조인자 결합을 위해 갖춰진 크고, 소수성인 중앙 공동으로 구성된다.
용어 "TNFAIP8L2" 또는 "TIPE2"는 이의 단편, 변이체(예를 들어, 대립유전자 변이체) 및 유도체를 포함하는 것으로 의도된다. 대표적인 인간 TNFAIP8L2 cDNA 및 인간 TNFAIP8L2 단백질 서열은 당업계에 잘 알려져 있으며, 미국 국립생물공학정보센터(NCBI)(예를 들어, ncbi.nlm.nih.gov/gene/79626 참조)로부터 공개적으로 이용 가능하다. 예를 들어, 인간 TNFAIP8L2(NP_078851.2)는 전사체(NM_024575.4)에 의해 암호화된다. 인간 이외의 유기체에서 TNFAIP8L2 오르토로그의 핵산 및 폴리펩타이드 서열은 잘 알려져 있으며, 예를 들어 침팬지 TNFAIP8L2(XM_009431068.3 및 XP_009429343.1; 및 XM_003308373.4 및 XP_003308421.1), 레서스 원숭이 TNFAIP8L2(NM_001257419.1 및 NP_001244348.1), 개 TNFAIP8L2(XM_005630793.3 및 XP_005630850.1; 및 XM_540310.6 및 XP_540310.2), 소 TNFAIP8L2(NM_001034389.1 및 NP_001029561.1), 마우스 TNFAIP8L2(NM_027206.2 및 NP_081482.1), 래트 TNFAIP8L2(NM_001014039.1 및 NP_001014061.1); 아프리카 발톱 개구리 TNFAIP8L2(XM_012969840.1 및 XP_012825294.1; XM_012969842.1 및 XP_012825296.1; XM_012969839.1 및 XP_012825293.1; 및 XM_012969841.1 및 XP_012825295.1); 및 제브라피시 TNFAIP8L2(NM_200374.1 및 NP_956668.1)를 포함한다. TNFAIP8L2 오르토로그의 대표적인 서열은 아래 표 1에 나타나 있다.
TNFAIP8L2 단백질을 검출하기에 적합한 항-TNFAIP8L2 항체는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 항체 H00079626-B01P 및 H00079626-D01P(노부스 바이올로지컬즈, 콜로라도주 리틀턴), 항체 Cat #: TA315795, AP54305PU-N(오리젠, 메릴랜드주 록빌) 등을 포함한다. 또한, TNFAIP8L2 발현을 검출하기 위한 시약은 잘 알려져 있다. TNFAIP8L2의 여러 임상적 테스트는 NIH 유전자 검사 등록소(GTR®)(예를 들어, GTR 테스트 ID: GTR000544194.2, 펄젠트 클리니칼 다이아그노스틱스 랩(캘리포니아주 템플 시티)에 의해 제공됨)에서 이용할 수 있다. 또한, TNFAIP8L2 발현을 감소시키기 위한 여러 siRNA, shRNA, CRISPR 작제물은 위에 언급된 회사의 상업 제품 목록, 예컨대 오리젠 테크놀로지스(메릴랜드주 록빌)의 siRNA 제품 #SR312471, shRNA 제품 # TL300917, TR300917, TG300917, TF300917, TL300917V 및 CRISPR 제품 #KN209504, 어플라이드 바이올로지컬 머티리얼즈의 CRISPR gRNA 제품(K6597108) 및 산타 크루즈의 RNAi 제품(Cat # sc-76702 및 sc-76702-PR)에서 찾을 수 있다. 용어는 TNFAIP8L2 분자와 관련하여 본 명세서에 기재된 특징의 임의의 조합을 지칭하기 위해 더 사용될 수 있음에 유의하여야 한다. 예를 들어, 서열 구성, 퍼센트 동일성, 서열 길이, 도메인 구조, 기능적 활성 등의 임의의 조합은 본 발명에 포함되는 TNFAIP8L2 분자를 설명하는데 사용될 수 있다.
용어 "SPI1" 또는 "PU.1"은 골수성 및 B-림프성 세포 발달 동안 유전자 발현을 활성화하는 ETS-도메인 전사 인자인 Spi-1 원종양형성 유전자(Proto-Oncogene)를 지칭한다. 핵 단백질 SPI1은 표적 유전자의 프로모터 근처에서 발견되는 PU-박스로 알려진 퓨린-풍부 서열에 결합하고, 다른 전사 인자 및 보조인자와 함께 이들의 발현을 조절한다. SPI1 단백질은 또한 표적 유전자의 대안적 스플라이싱을 조절할 수 있다. SPI1은 림프성-특이적 인핸서로서 작용할 수 있는 퓨린-풍부 DNA 서열(5-GAGGAA-3)인 PU-박스에 결합한다. SPI1 단백질은 대식세포 또는 B-세포의 분화 또는 활성화에 특별히 관여할 수 있는 전사 활성인자이다. SPI1은 또한 RNA에 결합하며, 전구-mRNA(본 발명에 포함되는 바이오마커 mRNA의) 스플라이싱을 조절할 수 있다. SPI1과 관련된 질환은 염증성 설사 및 호중구-특이적 과립 결핍을 포함한다. 관련 경로 중에는 파골세포 및 파골세포 분화에서의 RANK 신호전달이 있다. 일부 실시형태에서, 인간의 11p 염색체에 위치한 SPI1 유전자는 8개의 엑손으로 구성된다. Spi1tm1Ram(문헌[McKercher et al. (1996) EMBO J. 15:5647-5658]), Spi1tm2b(EUCOMM)Wtsi(국제 넉아웃 마우스 컨소시엄) 및 Spi1tm2.1Dgt인간SPI1(문헌[Iwasaki et al. (2005) Blood 106:1590-1600])을 포함하는 넉아웃 마우스 계통이 존재한다. 일부 실시형태에서, SPI1 단백질은 270개의 아미노산을 갖고/갖거나 31083Da의 분자량을 갖는다. SPI1은 ETS 패밀리에 속한다. SPI1의 알려진 결합 파트너는 예를 들어, CEBPD, NONO, RUNX1, SPIB, GFI1 및 CEBPE를 포함한다.
용어 "SPI1" 또는 "PU.1"은 이의 단편, 변이체(예를 들어, 대립유전자 변이체) 및 유도체를 포함하는 것으로 의도된다. 대표적인 인간 SPI1 cDNA 및 인간 SPI1 단백질 서열은 당업계에 잘 알려져 있으며, 미국 국립생물공학정보센터(NCBI)(예를 들어, ncbi.nlm.nih.gov/gene/6688 참조)로부터 공개적으로 이용 가능하다. 예를 들어, 적어도 2개의 상이한 인간 SPI1 동형 단백질이 알려져 있다. 인간 SPI1 동형 단백질 1(NP_001074016.1)은 전사체 변이체 1(NM_001080547.1)에 의해 암호화될 수 있으며, 이는 더 긴 전사체이다. 인간 SPI1 동형 단백질 2(NP_003111.2)는 전사체 변이체 2(NM_003120.2)에 의해 암호화될 수 있으며, 이는 변이체 1과 비교하여 5' 코딩 영역에서 대체 인-프레임 스플라이스 부위를 사용하여 더 짧은 단백질(동형 단백질 2)을 생성한다. 인간 이외의 유기체에서 SPI1 오르토로그의 핵산 및 폴리펩타이드 서열은 잘 알려져 있으며, 예를 들어 개 SPI1(XM_005631240.3 및 XP_005631297.1; 및 XM_848897.5 및 XP_853990.1), 소 SPI1(NM_001192133.2 및 NP_001179062.1), 마우스 SPI1(NM_011355.2 및 NP_035485.1), 래트 SPI1(NM_001005892.2 및 NP_001005892.1), 닭 SPI1(NM_205023.1 및 NP_990354.1), 아프리카 발톱 개구리 SPI1(NM_001145983.1 및 NP_001139455.1) 및 제브라피시 SPI1(NM_001328368.1 및 NP_001315297.1; NM_001328369.1 및 NP_001315298.1.; 및 NM_198062.2 및 NP_932328.2)을 포함한다. SPI1 오르토로그의 대표적인 서열은 아래 표 1에 나타나 있다.
SPI1 단백질을 검출하기에 적합한 항-SPI1 항체는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 항체 GTX128266, GTX101581 및 GTX60620(진텍스, 캘리포니아주 어바인), 항체 sc-390659(산타 크루즈 바이오테크놀로지), 항체 NBP2-27163, NBP1-00135, MAB7124 및 MAB5870(노부스 바이올로지컬즈, 콜로라도주 리틀턴), 항체 ab76543, ab88082 및 ab76542(압캠, 메사추세츠주 케임브리지), 항체 Cat #: CF808850 및 TA808850(오리젠, 메릴랜드주 록빌) 등을 포함한다. 또한, SPI1 발현을 검출하기 위한 시약은 잘 알려져 있다. SPI1의 여러 임상적 테스트는 NIH 유전자 검사 등록소(GTR®)(예를 들어, GTR 테스트 ID: GTR000546129.2, 펄젠트 클리니칼 다이아그노스틱스 랩(캘리포니아주 템플 시티)에 의해 제공됨)에서 이용할 수 있다. 또한, SPI1 발현을 감소시키기 위한 여러 siRNA, shRNA, CRISPR 작제물은 위에 언급된 회사의 상업 제품 목록, 예컨대 오리젠 테크놀로지스(메릴랜드주 록빌)의 siRNA 제품 #SR304549, shRNA 제품 # TL316738, TR 316738, TG 316738, TF 316738, TL316738V 및 CRISPR 제품 #KN212818, 어플라이드 바이올로지컬 머티리얼즈의 CRISPR gRNA 제품(K6488408)과 산타 크루즈의 CRISPR gRNA 제품(sc- 400547-KO-2) 및 산타 크루즈의 RNAi 제품(Cat # sc-36330 및 sc36331)에서 찾을 수 있다. 용어는 SPI1 분자와 관련하여 본 명세서에 기재된 특징의 임의의 조합을 지칭하기 위해 더 사용될 수 있음에 유의하여야 한다. 예를 들어, 서열 구성, 퍼센트 동일성, 서열 길이, 도메인 구조, 기능적 활성 등의 임의의 조합은 본 발명에 포함되는 SPI1 분자를 설명하는데 사용될 수 있다.
용어 "LILRB2(Leukocyte Immunoglobulin Like Receptor B2)"는 인간의 19q13.4의 염색체 영역의 유전자 클러스터에서 발견되는 백혈구 면역글로불린-유사 수용체(LIR) 패밀리의 구성원인 백혈구 면역글로불린 유사 수용체 B2를 지칭한다. 암호화된 단백질은 일반적으로 2개 또는 4개의 세포외 면역글로불린 도메인, 막관통 도메인 및 2개 내지 4개의 세포질성 면역수용체 타이로신-기반 저해성 모티프(ITIM)를 함유하는 LIR 수용체의 서브패밀리 B 클래스에 속한다. 수용체는 항원-제시 세포의 MHC 클래스 I 분자에 결합하고, 면역 반응의 자극을 저해하는 음성 신호를 전달하는 면역 세포에서 발현된다. 이는 면역 반응에 집중하는 것을 돕고 자가반응을 제한하기 위해 대조군 염증성 반응 및 세포 독성을 조절하는 것으로 생각된다. 관련 경로 중에는 선천성 면역 체계 및 파골세포 분화가 있다. LILRB2는 클래스 I MHC 항원에 대한 수용체이다. 이는 광범위한 HLA-A, HLA-B, HLA-C 및 HLA-G 대립 유전자를 인식한다. LILRB2는 면역 반응의 하향-조절 및 내성의 발달에 관여한다. LILRB2는 클래스 I MHC 항원에 대한 결합에 대해 CD8A와 경쟁한다. LILRB2는 세포 단백질의 FCGR1A-매개성 인산화 및 세포내 칼슘 이온의 동원(mobilization)을 저해한다. 일부 실시형태에서, 인간의 19q 염색체에 위치한 LILRB2 유전자는 15개의 엑손으로 구성된다. 일부 실시형태에서, 인간 LILRB2 단백질은 598개의 아미노산을 갖고/갖거나 65039Da의 분자량을 갖는다. 일부 실시형태에서, LILRB2는 면역수용체 타이로신-기반 저해제 모티프(ITIM)로 지칭되는 세포질성 모티프의 3개의 카피를 함유한다. 이러한 모티프는 세포 반응의 조절에 관여한다. 인산화된 ITIM 모티프는 여러 SH2-함유 포스파테이스의 SH2 도메인에 결합할 수 있다. LILRB2의 알려진 결합 파트너는 예를 들어, PTPN6 및 FCGR1A를 포함한다.
용어 "LILRB2"는 이의 단편, 변이체(예를 들어, 대립유전자 변이체) 및 유도체를 포함하는 것으로 의도된다. 대표적인 인간 LILRB2 cDNA 및 인간 LILRB2 단백질 서열은 당업계에 잘 알려져 있으며, 미국 국립생물공학정보센터(NCBI)(예를 들어, ncbi.nlm.nih.gov/gene/10288 참조)로부터 공개적으로 이용 가능하다. 예를 들어, 적어도 5개의 상이한 인간 LILRB2 동형 단백질이 알려져 있다. 인간 LILRB2 동형 단백질 1(NP_005865.3)은 전사체 변이체 1(NM_005874.4)에 의해 암호화될 수 있으며, 이는 가장 긴 전사체이다. 인간 LILRB2 동형 단백질 2(NP_001074447.2 및 NP_001265332.2)는 전사체 변이체 2(NM_001080978.3)에 의해 암호화될 수 있으며, 이는 변이체 1과 비교하여 중심 코딩 영역에서 대체 인-프레임 스플라이스 부위를 사용하고, 전사체 변이체 3(NM_001278403.2)에 의해 변이체 1과 비교하여 5' UTR에서 상이하며, 중심 코딩 영역에서 대체 인-프레임 스플라이스 부위를 사용한다. 암호화된 동형 단백질 2는 동형 단백질 1과 비교하여 더 짧다. 변이체 2 및 변이체 3 둘 다 동일한 동형 단백질을 암호화한다. 인간 LILRB2 동형 단백질 3(NP_001265333.2)은 전사체 변이체 4(NM_001278404.2)에 의해 암호화될 수 있으며, 이는 변이체 1과 비교하여 5' 코딩 영역의 부분이 결여되어 있고, 하류 인-프레임 시작 코돈을 사용한다. 암호화된 동형 단백질(3)은 동형 단백질 1과 비교하여 더 짧은 N-말단을 갖는다. 인간 LILRB2 동형 단백질 4(NP_001265334.2)는 전사체 변이체 5(NM_001278405.2)에 의해 암호화될 수 있으며, 이는 변이체 1과 비교하여 더 짧은 5' UTR을 가지고, 내부 엑손이 결여되어 프레임시프트 및 조기 종결 코돈을 초래한다. 암호화된 동형 단백질(4)는 동형 단백질 1과 비교하여 더 짧고 별개의 C-말단을 갖는다. 인간 LILRB2 동형 단백질 5(NP_001265335.2)는 전사체 변이체 6(NM_001278406.2)에 의해 암호화될 수 있으며, 이는 더 짧은 5' UTR를 갖고, 여러 엑손이 결여되어 있으며, 3'-말단 엑손이 변이체 1에서 사용된 스플라이스 부위를 지나 연장된다. 생성된 단백질(동형 단백질 5)은 동형 단백질 1과 비교하여 더 짧은 별개의 C-말단을 갖는다. LILRB2 오르토로그의 대표적인 서열은 아래 표 1에 나타나 있다.
LILRB2 단백질을 검출하기에 적합한 항-LILRB2 항체는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 항체 sc-515288 및 sc-390287(산타 크루즈 바이오테크놀로지), 항체 MAB2078, AF2078, H00010288-M01 및 NBP1-98554(노부스 바이올로지컬즈, 콜로라도주 리틀턴), 항체 ab128349, ab95819 및 ab95820(압캠, 메사추세츠주 케임브리지), 항체 Cat #: TA349368 및 TA323297(오리젠, 메릴랜드주 록빌) 등을 포함한다. 또한, LILRB2 발현을 검출하기 위한 시약은 잘 알려져 있다. LILRB2의 여러 임상적 테스트는 NIH 유전자 검사 등록소(GTR®)(예를 들어, GTR 테스트 ID: GTR000541153.2, 펄젠트 클리니칼 다이아그노스틱스 랩(캘리포니아주 템플 시티)에 의해 제공됨)에서 이용할 수 있다. 또한, LILRB2 발현을 감소시키기 위한 여러 siRNA, shRNA, CRISPR 작제물은 위에 언급된 회사의 상업 제품 목록, 예컨대 오리젠 테크놀로지스(메릴랜드주 록빌)의 siRNA 제품 #SR323061, shRNA 제품 # TL311729, TR311729, TG311729, TF311729, TL311729V 및 CRISPR 제품 #KN207770, 어플라이드 바이올로지컬 머티리얼즈의 CRISPR gRNA 제품(K1215408)과 산타 크루즈의 CRISPR gRNA 제품(sc-401944) 및 산타 크루즈의 RNAi 제품(Cat # sc-45200)에서 찾을 수 있다. 용어는 LILRB2 분자와 관련하여 본 명세서에 기재된 특징의 임의의 조합을 지칭하기 위해 더 사용될 수 있음에 유의하여야 한다. 예를 들어, 서열 구성, 퍼센트 동일성, 서열 길이, 도메인 구조, 기능적 활성 등의 임의의 조합은 본 발명에 포함되는 LILRB2 분자를 설명하는데 사용될 수 있다.
용어 "CCR5(C-C Motif Chemokine Receptor 5)"는 베타 케모카인 수용체 패밀리의 구성원인 C-C 모티프 케모카인 수용체 5를 지칭하며, 이는 G 단백질-결합 수용체와 유사한 7개의 막관통 단백질일 것으로 예측된다. CCR5는 T 세포 및 대식세포에 의해 발현되며, HIV를 포함하는 대식세포성(macrophage-tropic) 바이러스가 숙주 세포로 진입하기 위한 중요한 공동 수용체로 알려져 있다. CCR5 유전자의 결함이 있는 대립 유전자는 HIV 감염 저항성과 관련이 있다. CCR5 수용체의 리간드는 단핵구 화학주성 단백질 2(모노cyte chemoattractant protein 2: MCP-2), 대식세포 염증성 단백질 1 알파(macrophage inflammatory protein 1 alpha: MIP-1 알파), 대식세포 염증성 단백질 1 베타(macrophage inflammatory protein 1 beta: MIP-1 베타)를 포함하며, 활성화 정상 T 발현 및 분비 단백질(activation normal T expressed and secreted protein: RANTE)에 대해 조절된다. CCR5 유전자의 발현은 또한 전골수아구성 세포주에서도 검출되었으며, 이는 이러한 단백질이 과립구 계통 증식 및 분화에 역할을 할 수 있음을 나타낸다. CCR5 유전자는 케모카인 수용체 유전자 클러스터 영역에 위치한다. CCR5와 관련된 질환은 웨스트 나일 바이러스 및 인슐린-의존성 당뇨병을 포함한다. 관련 경로 중에는 면역 체계에서의 사이토카인 신호전달 및 akt 신호전달이 있다. 일부 실시형태에서, 인간의 3p 염색체에 위치한 CCR5 유전자는 3개의 엑손으로 구성된다. Ccr5tm1Kuz(문헌[Huffnagle et al. (1999) J Immunol. 163:4642-4646]), Ccr5tm1Blck(문헌[Luckow et al. (2004) Eur J Immunol 34:2568-2578]) 및 Ccr5tm1(CCR5)Pfi인간(문헌[Amsellem et al. (2014) Circulation 130:880-891])를 포함하는 넉아웃 마우스 계통이 존재한다. 일부 실시형태에서, CCR5 단백질은 352개의 아미노산을 갖고/갖거나 40524Da의 분자량을 갖는다. CCR5의 알려진 결합 파트너는 예를 들어, PRAF2, CCL4, GRK2, ARRB1, ARRB2 및 CNIH4를 포함한다.
용어 "CCR5"는 이의 단편, 변이체(예를 들어, 대립유전자 변이체) 및 유도체를 포함하는 것으로 의도된다. 대표적인 인간 CCR5 cDNA 및 인간 CCR5 단백질 서열은 당업계에 잘 알려져 있으며, 미국 국립생물공학정보센터(NCBI)(예를 들어, ncbi.nlm.nih.gov/gene/1234 참조)로부터 공개적으로 이용 가능하다. 예를 들어, 인간 CCR5(NP_000570.1 및 NP_001093638.1)는 전사체 변이체 A(NM_000579.3)에 의해 암호화될 수 있으며, 이는 더 긴 전사체이고, 전사체 변이체 B(NM_001100168.1)에 의해, 이는 변이체 A와 비교하여 5' UTR에서 상이하다. 두 변이체는 모두 동일한 단백질을 암호화한다. 인간 이외의 유기체에서 CCR5 오르토로그의 핵산 및 폴리펩타이드 서열은 잘 알려져 있으며, 예를 들어 침팬지 CCR5(NM_001009046.1 및 NP_001009046.1), 레서스 원숭이 CCR5(NM_001042773.3 및 NP_001036238.2; 및 NM_001309402.1 및 NP_001296331.1), 개 CCR5(NM_001012342.3 및 NP_001012342.2), 소 CCR5(NM_001011672.2 및 NP_001011672.2), 마우스 CCR5(NM_009917.5 및 NP_034047.2) 및 래트 CCR5(NM_053960.3 및 NP_446412.2)를 포함한다. CCR5 오르토로그의 대표적인 서열은 아래 표 1에 나타나 있다.
CCR5 단백질을 검출하기에 적합한 항-CCR5 항체는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 항체 GTX101330, GTX109635 및 GTX21673(진텍스, 캘리포니아주 어바인), 항체 sc-57072 및 sc-55484(산타 크루즈 바이오테크놀로지), 항체 MAB182, NBP2-31374, NBP1-41434 및 MAB181(노부스 바이올로지컬즈, 콜로라도주 리틀턴), 항체 ab65850, ab1673 및 ab7346(압캠, 메사추세츠주 케임브리지), 항체 Cat #: TA351039 및 TA348418(오리젠, 메릴랜드주 록빌) 등을 포함한다. 다른 항-CCR5 항체가 또한 알려져 있으며, 예를 들어 미국 공개 US20010000241, US20020099176A1, US20090110686A1 및 US20080107595에 기재된 것들을 포함한다. 또한, CCR5 발현을 검출하기 위한 시약은 잘 알려져 있다. CCR5의 여러 임상적 테스트는 NIH 유전자 검사 등록소(GTR®)(예를 들어, GTR 테스트 ID: GTR000516140.2, 펄젠트 클리니칼 다이아그노스틱스 랩(캘리포니아주 템플 시티)에 의해 제공됨)에서 이용할 수 있다. 또한, CCR5 발현을 감소시키기 위한 여러 siRNA, shRNA, CRISPR 작제물은 위에 언급된 회사의 상업 제품 목록, 예컨대 오리젠 테크놀로지스(메릴랜드주 록빌)의 siRNA 제품 #SR300873, shRNA 제품 # TL314126, TR314126, TG314126, TF314126, TL314126V 및 CRISPR 제품 #KN216008, 어플라이드 바이올로지컬 머티리얼즈의 CRISPR gRNA 제품(K6988308)과 산타 크루즈의 CRISPR gRNA 제품(sc-402548) 및 산타 크루즈의 RNAi 제품(Cat # sc-35062 및 sc-35063)에서 찾을 수 있다. 용어는 CCR5 분자와 관련하여 본 명세서에 기재된 특징의 임의의 조합을 지칭하기 위해 더 사용될 수 있음에 유의하여야 한다. 예를 들어, 서열 구성, 퍼센트 동일성, 서열 길이, 도메인 구조, 기능적 활성 등의 임의의 조합은 본 발명에 포함되는 CCR5 분자를 설명하는데 사용될 수 있다.
용어 "EVI2B(Ecotropic Viral Integration Site 2B)"는 동종숙주형 바이러스 통합 부위 2B를 지칭한다. EVI2B는 세포 주기 진행 및 조혈 선조 세포의 생존의 조절을 통한 조혈 선조 세포의 과립구 분화 및 기능성에 필요하다. 일부 실시형태에서, 17q 염색체에 위치한 유전자 EVI2B는 3개의 엑손으로 구성된다. 일부 실시형태에서, 인간 EVI2B 단백질은 448개의 아미노산을 갖고/갖거나 48666Da의 분자량을 갖는다.
용어 "EVI2B"는 이의 단편, 변이체(예를 들어, 대립유전자 변이체) 및 유도체를 포함하는 것으로 의도된다. 대표적인 인간 EVI2B cDNA 및 인간 EVI2B 단백질 서열은 당업계에 잘 알려져 있으며, 미국 국립생물공학정보센터(NCBI)(예를 들어, ncbi.nlm.nih.gov/gene/2124 참조)로부터 공개적으로 이용 가능하다. 예를 들어, 인간 EVI2B(NP_006486.3)는 전사체(NM_006495.3)에 의해 암호화된다. 인간 이외의 유기체에서 EVI2B 오르토로그의 핵산 및 폴리펩타이드 서열은 잘 알려져 있으며, 예를 들어 침팬지 EVI2B(XM_024350668.1 및 XP_024206436.1; 및 XM_001174747.4 및 XP_001174747.1), 레서스 원숭이 EVI2B(XM_001111968.3 및 XP_001111968.1; 및 XM_001111891.3 및 XP_001111891.1), 개 EVI2B(XM_022423331.1 및 XP_022279039.1; XM_022423330.1 및 XP_022279038.1; XM_005624837.3 및 XP_005624894.1; 및 XM_005624836.3 및 XP_005624893.1), 소 EVI2B(NM_001099166.2 및 NP_001092636.1), 마우스 EVI2B(NM_001077496.1 및 NP_001070964.1) 및 래트 EVI2B(NM_001271482.1 및 NP_001258411.1)를 포함한다. EVI2B 오르토로그의 대표적인 서열은 아래 표 1에 나타나 있다.
EVI2B 단백질을 검출하기에 적합한 항-EVI2B 항체는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 항체 GTX79980, GTX79981 및 GTX46414(진텍스, 캘리포니아주 어바인), 항체 NBP1-85342, NBP2-62207, NBP1-59952 및 H00002124-M02(노부스 바이올로지컬즈, 콜로라도주 리틀턴), 항체 ab101146, ab101040 및 ab173149(압캠, 메사추세츠주 케임브리지), 항체 Cat #: TA341843 및 AM12138RP-N(오리젠, 메릴랜드주 록빌) 등을 포함한다. 또한, EVI2B 발현을 검출하기 위한 시약은 잘 알려져 있다. EVI2B의 여러 임상적 테스트는 NIH 유전자 검사 등록소(GTR®)(예를 들어, GTR 테스트 ID: GTR000535142.2, 펄젠트 클리니칼 다이아그노스틱스 랩(캘리포니아주 템플 시티)에 의해 제공됨)에서 이용할 수 있다. 또한, EVI2B 발현을 감소시키기 위한 여러 siRNA, shRNA, CRISPR 작제물은 위에 언급된 회사의 상업 제품 목록, 예컨대 오리젠 테크놀로지스(메릴랜드주 록빌)의 siRNA 제품 #SR320090, shRNA 제품 # TL313146, TR313146, TG313146, TF313146, TL313146V 및 CRISPR 제품 #KN203253, 어플라이드 바이올로지컬 머티리얼즈의 CRISPR gRNA 제품(K4066808)과 산타 크루즈의 CRISPR gRNA 제품(sc-416696) 및 산타 크루즈의 RNAi 제품(Cat # sc-93673 및 sc-144963)에서 찾을 수 있다. 용어는 EVI2B 분자와 관련하여 본 명세서에 기재된 특징의 임의의 조합을 지칭하기 위해 더 사용될 수 있음에 유의하여야 한다. 예를 들어, 서열 구성, 퍼센트 동일성, 서열 길이, 도메인 구조, 기능적 활성 등의 임의의 조합은 본 발명에 포함되는 EVI2B 분자를 설명하는데 사용될 수 있다.
용어 "CLEC7A(C-Type Lectin Domain Containing 7A)"는 C-유형 렉틴/C-유형 렉틴-유사 도메인(CTL/CTLD) 슈퍼패밀리의 구성원인 C-유형 렉틴 도메인 함유 7A를 지칭한다. 암호화된 당단백질은 세포외 C-유형 렉틴-유사 도메인 폴딩과, 면역수용체 타이로신-기반 활성화 모티프를 갖는 세포질성 도메인을 갖는 작은 유형 II 막 수용체이다. 이는 곰팡이와 식물로부터의 다양한 베타-1,3-연결된 및 베타-1,6-연결된 글루칸을 인식하는 패턴-인식 수용체로서 기능하며, 이러한 방식으로 선천성 면역 반응에서 역할을 한다. 이러한 유전자는 자연 살해 유전자 복합체 영역에서 인간의 12p13 염색체에 있는 다른 CTL/CTLD 슈퍼패밀리 구성원에 밀접하게 연결되어 있다. CLEC7A와 관련된 질환은 아스페르길루스증 및 가족성 칸디다증을 포함한다. 관련 경로 중에는 CLEC7A(덱틴-1) 신호전달 및 선천성 면역 체계가 있다. 일부 실시형태에서, 12p 염색체에 위치한 유전자 CLEC7A는 8개의 엑손으로 구성된다. Clec7atm1Gdb(문헌[Taylor et al. (2007) Nat Immunol 8:31-38]) 및 Clec7atm1Yiw(문헌[Saijo et al. (2007) Nat Immunol. 8:39-46])를 포함하는 넉아웃 마우스 계통이 존재한다. 일부 실시형태에서, 인간 CLEC7A 단백질은 247개의 아미노산을 갖고/갖거나 27627Da의 분자량을 갖는다. CLEC7A 단백질은 SYK와 상호작용하고, CLEC7A의 동형 단백질 5는 RANBP9와 상호작용한다.
용어 "CLEC7A"는 이의 단편, 변이체(예를 들어, 대립유전자 변이체) 및 유도체를 포함하는 것으로 의도된다. 대표적인 인간 CLEC7CDNA 및 인간 CLEC7A 단백질 서열은 당업계에 잘 알려져 있으며, 미국 국립생물공학정보센터(NCBI)(예를 들어, ncbi.nlm.nih.gov/gene/64581 참조)로부터 공개적으로 이용 가능하다. 예를 들어, 적어도 6개의 상이한 인간 CLEC7동형 단백질이 알려져 있다. 인간 CLEC7동형 단백질 a(NP_922938.1)는 전사체 변이체 1(NM_197947.2)에 의해 암호화될 수 있으며, 이는 가장 긴 전사체이다. 인간 CLEC7동형 단백질 b(NP_072092.2)는 전사체 변이체 2(NM_022570.4)에 의해 암호화될 수 있으며, 변이체 1과 비교하여대체 인-프레임 엑손이 결여되어 동형 단백질 a와 비교하여 더 짧은 단백질(동형 단백질 b)을 생성한다. 인간 CLEC7동형 단백질 c(NP_922939.1)는 전사체 변이체 3(NM_197948.2)에 의해 암호화될 수 있으며, 이는 변이체 1과 비교하여 대체 액손이 결여되어 프레임시프트 및 조기 종결 코돈을 초래한다. 생성된 단백질(동형 단백질 c)은 동형 단백질 a와 비교하여 더 짧고 별개의 C-말단을 갖는다. 인간 CLEC7동형 단백질 d(NP_922940.1)는 전사체 변이체 4(NM_197949.2)에 의해 암호화될 수 있으며, 이는 2개의 대체 엑손이 결여되어 변이체 1과 비교하여 프레임시프트 및 조기 종결 코돈을 초래한다. 생성된 단백질(동형 단백질 d)은 동형 단백질 a와 비교하여 더 짧고, 별개의 C-말단을 함유한다. 인간 CLEC7동형 단백질 e(NP_922941.1)는 전사체 변이체 5(NM_197950.2)에 의해 암호화될 수 있으며, 이는 변이체 1과 비교하여 대체 인-프레임 엑손이 결여되어, 동형 단백질 a와 비교하여 더 짧은 단백질(동형 단백질 e)을 생성한다. 인간 CLEC7동형 단백질 f(NP_922945.1)는 전사체 변이체 6(NM_197954.2)에 의해 암호화될 수 있으며, 변이체 1과 비교하여 코딩 영역에 여러 차이가 있고, 그 중 하나는 조기 종결 코돈을 생성한다. 생성된 단백질(동형 단백질 f)은 별개의 C-말단을 가지며, 동형 단백질 a보다 훨씬 짧다. 인간 이외의 유기체에서 CLEC7A 오르토로그의 핵산 및 폴리펩타이드 서열은 잘 알려져 있으며, 예를 들어 침팬지 CLEC7A(XM_016922965.2 및 XP_016778454.1; XM_001144689.3 및 XP_001144689.1; XM_001144825.3 및 XP_001144825.1; XM_003313487.4 및 XP_003313535.1; XM_528732.4 및 XP_528732.2; 및 XM_001144313.4 및 XP_001144313.1), 레서스 원숭이 CLEC7A(NM_001032943.1 및 NP_001028115.1), 개 CLEC7A(XM_022411028.1 및 XP_022266736.1; XM_849050.3 및 XP_854143.1; 및 XM_005637163.2 및 XP_005637220.1), 소 CLEC7A(NM_001031852.1 및 NP_001027022.1), 마우스 CLEC7A(NM_001309637.1 및 NP_001296566.1; 및 NM_020008.3 및 NP_064392.2) 및 래트 CLEC7A(NM_001173386.1 및 NP_001166857.1)를 포함한다. CLEC7A 오르토로그의 대표적인 서열은 아래 표 1에 나타나 있다.
CLEC7A 단백질을 검출하기에 적합한 항-CLEC7항체는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 항체 GTX41467, GTX41471 및 GTX41466(진텍스, 캘리포니아주 어바인), 항체 MAB1859, AF1859, NBP1-45514 및 NBP2-41170(노부스 바이올로지컬즈, 콜로라도주 리틀턴), 항체 ab140039, ab82888 및 ab189968(압캠, 메사추세츠주 케임브리지), 항체 Cat #: TA322197 및 TA320003(오리젠, 메릴랜드주 록빌) 등을 포함한다. 다른 항-CLEC7항체가 또한 알려져 있으며, 예를 들어 미국 공개 US20140322214A1과 US20170095573A1 및 미국 특허 US7915041B2에 기재된 것들을 포함한다. 또한, CLEC7A 발현을 검출하기 위한 시약은 잘 알려져 있다. CLEC7A의 여러 임상적 테스트는 NIH 유전자 검사 등록소(GTR®)(예를 들어, GTR 테스트 ID: GTR000516241.2, 펄젠트 클리니칼 다이아그노스틱스 랩(캘리포니아주 템플 시티)에 의해 제공됨)에서 이용할 수 있다. 또한, CLEC7A 발현을 감소시키기 위한 여러 siRNA, shRNA, CRISPR 작제물은 위에 언급된 회사의 상업 제품 목록, 예컨대 오리젠 테크놀로지스(메릴랜드주 록빌)의 siRNA 제품 #SR312068, shRNA 제품 # TL305354, TR305354, TG305354, TF305354, TL305354V 및 CRISPR 제품 #KN214107, 어플라이드 바이올로지컬 머티리얼즈의 CRISPR gRNA 제품(K6685408)과 산타 크루즈의 CRISPR gRNA 제품(sc-417053) 및 산타 크루즈의 RNAi 제품(Cat # sc-63276 및 sc-63277)에서 찾을 수 있다. 용어는 CLEC7분자와 관련하여 본 명세서에 기재된 특징의 임의의 조합을 지칭하기 위해 더 사용될 수 있음에 유의하여야 한다. 예를 들어, 서열 구성, 퍼센트 동일성, 서열 길이, 도메인 구조, 기능적 활성 등의 임의의 조합은 본 발명에 포함되는 CLEC7분자를 설명하는데 사용될 수 있다.
용어 "TBXAS1(Thromb옥사ne A Synthase 1)"은 효소의 사이토크롬 P450 슈퍼패밀리의 구성원인 트롬복세인 A 신테이스 1을 지칭한다. 사이토크롬 P450 단백질은 약물 대사 및 콜레스테롤, 스테로이드 및 기타 리피드의 합성과 관련된 많은 반응을 촉매하는 모노옥시게네이스이다. 그러나, 이러한 단백질은 기능적 유사성보다는 서열 유사성을 기준으로 사이토크롬 P450 슈퍼패밀리의 구성원으로 간주된다. 이러한 소포체 막 단백질은 프로스타글란딘 H2의 강력한 혈관수축제 및 혈소판 응집의 유도제인 트롬복세인 A2로의 전환을 촉매한다. 효소는 울혈, 심혈관 질환 및 뇌졸중을 포함하는 여러 병태 생리학적 과정에서 역할을 한다. TBXAS1과 관련된 질환은 혈액골간 이형성증 및 출혈 장애, 혈소판-유형, 14를 포함한다. 관련 경로 중에는 혈소판 활성화 및 대사가 있다. 일부 실시형태에서, 7q 염색체에 위치한 유전자 TBXAS1은 23개의 엑손으로 구성된다. Tbxas1tm1Swl(문헌[Yu et al. (2004) Blood 104:135-142]) 및 Tbxas1tm1Okun인간(문헌[Matsunobu et al. (2013) J Lipid Res 54:2979-2987])포함하는 넉아웃 마우스 계통이 존재한다. 일부 실시형태에서, TBXAS1 단백질은 533개의 아미노산을 갖고/갖거나 60518Da의 분자량을 갖는다.
용어 "TBXAS1"은 이의 단편, 변이체(예를 들어, 대립유전자 변이체) 및 유도체를 포함하는 것으로 의도된다. 대표적인 인간 TBXAS1 cDNA 및 인간 TBXAS1 단백질 서열은 당업계에 잘 알려져 있으며, 미국 국립생물공학정보센터(NCBI)(예를 들어, ncbi.nlm.nih.gov/gene/6916 참조)로부터 공개적으로 이용 가능하다. 예를 들어, 적어도 5개의 상이한 인간 TBXAS1 동형 단백질이 알려져 있다. 인간 TBXAS1 동형 단백질 1(NP_001052.2 및 NP_001124438.1)은 전사체 변이체 1(NM_001061.4) 및 전사체 변이체 3(NM_001130966.2)에 의해 암호화될 수 있다. 이러한 변이체(3, TXS-III으로도 알려져 있음)는 변이체 1과 비교하여 5' UTR에서 상이하다. 변이체 1 및 변이체 3은 둘 다 동일한 동형 단백질(1, 동형 단백질 TXS-I로도 알려져 있음)을 암호화한다. 인간 TBXAS1 동형 단백질 2(NP_112246.2)는 전사체 변이체 2(NM_030984.3)에 의해 암호화될 수 있으며, 이는 전사체 변이체 1과 비교하여 헴 결합 부위를 암호화하는 3' 코딩 영역의 대체 엑손이 결여되어 있다. 암호화된 동형 단백질(2, 동형 단백질 TXS-II로도 알려져 있음)은 트롬복세인 A 신테이스 활성이 결여되어 있으며, 별개의 C-말단을 가지고, 동형 단백질 1보다 더 짧다. 인간 TBXAS1 동형 단백질 3(NP_001159725.1)은 전사체 변이체 4(NM_001166253.1)에 의해 암호화될 수 있으며, 이는 변이체 1과 비교하여 중심 코딩 영역에서 대체 인-프레임 엑손을 포함하여, 동형 단백질 1보다 더 긴 동형 단백질(3)을 생성한다. 인간 TBXAS1 동형 단백질 4(NP_001159726.1)는 전사체 변이체 5(NM_001166254.1)에 의해 암호화될 수 있으며, 이는 변이체 1과 비교하여 5' UTR에서 상이하고, 5' 코딩 영역의 부분이 결여되어 있으며, 하류 번역 시작 코돈을 사용한다. 암호화된 동형 단백질(4)은 동형 단백질 1과 비교하여 N-말단에서 더 짧다. 인간 TBXAS1 동형 단백질 5(NP_001300957.1)는 전사체 변이체 6(NM_001314028.1)에 의해 암호화될 수 있으며, 이는 변이체 1과 비교하여 내부 엑손에서 대안적 스플라이스 부위를 사용한다. 생성된 동형 단백질(5)은 동형 단백질 1과 비교하여 더 짧고 별개의 N-말단을 갖는다. 인간 이외의 유기체에서 TBXAS1 오르토로그의 핵산 및 폴리펩타이드 서열은 잘 알려져 있으며, 예를 들어 개 TBXAS1(XM_005629559.2 및 XP_005629616.1; XM_539887.5 및 XP_539887.2; XM_014119949.2 및 XP_013975424.1; 및 XM_022403739.1 및 XP_022259447.1), 소 TBXAS1(NM_001046027.2 및 NP_001039492.1), 마우스 TBXAS1(NM_011539.3 및 NP_035669.3), 래트 TBXAS1(NM_012687.1 및 NP_036819.1), 닭 TBXAS1(XM_416334.6 및 XP_416334.4; XM_004937846.3 및 XP_004937903.2; 및 XM_025155784.1 및 XP_025011552.1), 아프리카 발톱 개구리 TBXAS1(NM_001171526.1 및 NP_001164997.1) 및 제브라피시 TBXAS1(NM_205609.2 및 NP_991172.2)을 포함한다. TBXAS1 오르토로그의 대표적인 서열은 아래 표 1에 나타나 있다.
TBXAS1 단백질을 검출하기에 적합한 항-TBXAS1 항체는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 항체 GTX83523, GTX83521 및 GTX83522(진텍스, 캘리포니아주 어바인), 항체 NBP2-02710, NBP2-33948, NBP2-33946 및 NBP2-33947(노부스 바이올로지컬즈, 콜로라도주 리틀턴), 항체 ab39362, ab187176 및 ab157481(압캠, 메사추세츠주 케임브리지), 항체 Cat #: CF501380 및 AP51174PU-N(오리젠, 메릴랜드주 록빌) 등을 포함한다. 또한, TBXAS1 발현을 검출하기 위한 시약은 잘 알려져 있다. TBXAS1의 여러 임상적 테스트는 NIH 유전자 검사 등록소(GTR®)(예를 들어, GTR 테스트 ID: GTR000518496.2, 펄젠트 클리니칼 다이아그노스틱스 랩(캘리포니아주 템플 시티)에 의해 제공됨)에서 이용할 수 있다. 또한, TBXAS1 발현을 감소시키기 위한 여러 siRNA, shRNA, CRISPR 작제물은 위에 언급된 회사의 상업 제품 목록, 예컨대 오리젠 테크놀로지스(메릴랜드주 록빌)의 siRNA 제품 #SR304732, shRNA 제품 # TL301186, TR301186, TG301186, TF301186, TL301186V 및 CRISPR 제품 #KN208028, 어플라이드 바이올로지컬 머티리얼즈의 CRISPR gRNA 제품(K6806708)과 산타 크루즈의 CRISPR gRNA 제품(sc-418609) 및 산타 크루즈의 RNAi 제품(Cat # sc-62451 및 sc-76779)에서 찾을 수 있다. 용어는 TBXAS1 분자와 관련하여 본 명세서에 기재된 특징의 임의의 조합을 지칭하기 위해 더 사용될 수 있음에 유의하여야 한다. 예를 들어, 서열 구성, 퍼센트 동일성, 서열 길이, 도메인 구조, 기능적 활성 등의 임의의 조합은 본 발명에 포함되는 TBXAS1 분자를 설명하는데 사용될 수 있다.
용어 "SIGLEC7(Sialic Acid Binding Ig Like Lectin 7)"은 세포에 대한 시알산 의존적 결합을 매개하는 추정 부착 분자인 시알산 결합 Ig 유사 렉틴 7을 지칭한다. SIGLEC7은 알파-2,3- 및 알파-2,6-연결된 시알산에 우선적으로 결합한다. SIGLEC7 또한 다이시알로강글리오사이드(다이시알로갈락토실 글로보사이드, 다이시알릴 락토테트라오실세라마이드 및 다이시알릴 GalNAc 락토테트라오실일세라마이드)에 결합한다. SIGLEC7의 시알산 인식 부위는 동일한 세포 표면에서 시알산과의 시스 상호작용에 의해 가려질 수 있다. 면역 반응에서, SIGLEC7은 신호전달 분자의 탈인산화를 통해 신호 전달을 차단하는 이들의 SH2 도메인(들)을 통해 세포질성 포스파테이스(들)를 동원하는 것에 의한 리간드 유도성 타이로신 인산화시 저해성 수용체로서 작용할 수 있다. SIGLEC7은 자연 살해 세포 세포 독성의 저해를 매개한다. SIGLEC7은 적혈구 생성에서 역할을 할 수 있다. SIGLEC7은 골수단핵구성 세포 계통으로의 CD34+ 세포 전구체의 분화 및 시험관내 백혈병 골수성 세포의 증식을 저해한다. SIGLEC7과 관련된 질환은 크롬 친화성 세포종을 포함한다. 관련 경로 중에는 조혈 줄기 세포 분화 경로 및 계통-특이적 마커 및 선천성 면역 체계가 있다. 일부 실시형태에서, 19q 염색체에 위치한 유전자 SIGLEC7은 7개의 엑손으로 구성된다. 일부 실시형태에서, 인간 SIGLEC7 단백질은 467개의 아미노산을 갖고/갖거나 51143Da의 분자량을 갖는다. 일부 실시형태에서, SIGLEC7 단백질은 면역수용체 타이로신-기반 저해제 모티프(ITIM)로서 지칭되는 세포질성 모티프의 1개의 카피를 함유한다. 이러한 모티프는 세포 반응의 조절에 관여한다. 인산화된 ITIM 모티프는 여러 SH2-함유 포스파테이스의 SH2 도메인에 결합할 수 있다. SIGLEC7 단백질은 인산화시 PTPN6/SHP-1과 상호작용한다.
용어 "SIGLEC7"은 이의 단편, 변이체(예를 들어, 대립유전자 변이체) 및 유도체를 포함하는 것으로 의도된다. 대표적인 인간 SIGLEC7 cDNA 및 인간 SIGLEC7 단백질 서열은 당업계에 잘 알려져 있으며, 미국 국립생물공학정보센터(NCBI)(예를 들어, ncbi.nlm.nih.gov/gene/27036 참조)로부터 공개적으로 이용 가능하다. 예를 들어, 적어도 3개의 상이한 인간 SIGLEC7 동형 단백질이 알려져 있다. 가장 긴 동형 단백질인 인간 SIGLEC7 동형 단백질 1(NP_055200.1)은 전사체 변이체 1(NM_014385.3)에 의해 암호화될 수 있다. 인간 SIGLEC7 동형 단백질 2(NP_057627.2)는 전사체 변이체 2(NM_016543.3)에 의해 암호화될 수 있으며, 이는 변이체 1과 비교하여 인-프레임 코딩 엑손이 결여되어 있다. 생성된 동형 단백질(2)은 동형 단백질 1과 비교하여 내부 세그먼트가 결여되어 있다. 인간 SIGLEC7 동형 단백질 3(NP_001264130.1)은 전사체 변이체 3(NM_001277201.1)에 의해 암호화될 수 있으며, 이는 변이체 1과 비교하여 모든 내부 코딩 엑손이 결여되어 있다. 생성된 동형 단백질(3)은 동형 단백질 1과 비교하여 C-말단이 절단되어 있다. 인간 이외의 유기체에서 SIGLEC7 오르토로그의 핵산 및 폴리펩타이드 서열은 잘 알려져 있으며, 예를 들어 침팬지 SIGLEC7(XM_016936700.1 및 XP_016792189.1; 및 XM_016936701.1 및 XP_016792190.1)을 포함한다. SIGLEC7 오르토로그의 대표적인 서열은 아래 표 1에 나타나 있다.
SIGLEC7 단백질을 검출하기에 적합한 항-SIGLEC7 항체는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 항체 GTX107080, GTX116337 및 GTX53005(진텍스, 캘리포니아주 어바인), 항체 sc-398919 및 sc-398181(산타 크루즈 바이오테크놀로지), 항체 AF1138, MAB1138, MAB11381 및 NBP2-20360(노부스 바이올로지컬즈, 콜로라도주 리틀턴), 항체 ab38573, ab38574 및 ab111619(압캠, 메사추세츠주 케임브리지), 항체 Cat #: AM05592FC-N 및 AM05592PU-L(오리젠, 메릴랜드주 록빌) 등을 포함한다. 다른 항-SIGLEC7 항체가 또한 알려져 있으며, 예를 들어 미국 공개 US20170306014, US20190085077, US20190023786 및 US20180244770에 기재된 것들을 포함한다. 또한, SIGLEC7 발현을 검출하기 위한 시약은 잘 알려져 있다. SIGLEC7의 여러 임상적 테스트는 NIH 유전자 검사 등록소(GTR®)(예를 들어, GTR 테스트 ID: GTR000546879.2, 펄젠트 클리니칼 다이아그노스틱스 랩(캘리포니아주 템플 시티)에 의해 제공됨)에서 이용할 수 있다. 또한, SIGLEC7 발현을 감소시키기 위한 여러 siRNA, shRNA, CRISPR 작제물은 위에 언급된 회사의 상업 제품 목록, 예컨대 오리젠 테크놀로지스(메릴랜드주 록빌)의 siRNA 제품 #SR308944, shRNA 제품 # TL309445, TR309445, TG309445, TF309445, TL309445V 및 CRISPR 제품 #KN206995, 어플라이드 바이올로지컬 머티리얼즈의 CRISPR gRNA 제품(K2147608)과 산타 크루즈의 CRISPR gRNA 제품(sc-407464) 및 산타 크루즈의 RNAi 제품(Cat # sc-106757 및 sc-106757-SH)에서 찾을 수 있다. 용어는 SIGLEC7 분자와 관련하여 본 명세서에 기재된 특징의 임의의 조합을 지칭하기 위해 더 사용될 수 있음에 유의하여야 한다. 예를 들어, 서열 구성, 퍼센트 동일성, 서열 길이, 도메인 구조, 기능적 활성 등의 임의의 조합은 본 발명에 포함되는 SIGLEC7 분자를 설명하는데 사용될 수 있다.
용어 "DOCK2(Dedicator Of Cytokinesis 2)"는 세포질 분열의 데디케이터 2를 지칭한다. DOCK2는 CDM 단백질 패밀리에 속한다. 이는 조혈 세포에서 특별히 발현되며, 및 주로 말초 혈액 백혈구에서 발현된다. 단백질은 케모카인 신호전달에 대한 반응으로 림프구 이동에 필요한 액틴 세포 골격의 리모델링에 관여한다. 이는 구아닌 뉴클레오타이드 교환 인자(guanine nucleotide exchange factor: GEF)로 작용하여 결합된 GDP를 유리 GTP로 교환함으로써 GTPase의 Rho 패밀리의 구성원, 예를 들어 RAC1 및 RAC2를 활성화한다. DOCK2는 케모카인의 반응으로 림프구 이동에 필요한 세포 골격 재배열에 관여한다. DOCK2는 결합된 GDP를 유리 GTP로 교환하는 구아닌 뉴클레오타이드 교환 인자(GEF)로 작용하여 CDC42가 아닌 RAC1 및 RAC2를 활성화한다. DOCK2는 또한 RAC2의 활성화를 통해 IL2 전사 활성화에 참여한다. Dock2tm1Tsas(문헌[Fukui et al. (2001) Nature 412:826-831]) 및 Dock2tm1Ysfk(문헌[Kunisaki et al. (2006) J Cell Biol 174:647-652])라 불리는 넉아웃 마우스 계통이 존재한다. 일부 실시형태에서, 인간의 5q 염색체에 위치한 유전자 DOCK2는 59개의 엑손으로 구성된다. DOCK2 유전자는 침팬지, 개, 젖소, 마우스, 래트, 닭 및 개구리에서 보존된다. 일부 실시형태에서, 인간 DOCK2 단백질은 1830개의 아미노산을 갖고/갖거나 211948Da의 분자량을 갖는다. DOCK2의 알려진 결합 파트너는 예를 들어, RAC1, RAC2, CRKL, VAV 및 CD3Z를 포함한다.
용어 "DOCK2"는 이의 단편, 변이체(예를 들어, 대립유전자 변이체) 및 유도체를 포함하는 것으로 의도된다. 대표적인 인간 DOCK2 cDNA 및 인간 DOCK2 단백질 서열은 당업계에 잘 알려져 있으며, 미국 국립생물공학정보센터(NCBI)(예를 들어, ncbi.nlm.nih.gov/gene/80231 참조)로부터 공개적으로 이용 가능하다. 예를 들어, 인간 DOCK2(NP_004937.1)는 전사체(NM_004946.3)에 의해 암호화될 수 있다. 인간 이외의 유기체에서 DOCK2 오르토로그의 핵산 및 폴리펩타이드 서열은 잘 알려져 있으며, 예를 들어 침팬지 DOCK2(XM_016954161.2 및 XP_016809650.1; XM_016954163.2 및 XP_016809652.1; XM_016954162.2 및 XP_016809651.1; 및 XM_016954164.2 및 XP_016809653.1), 개 DOCK2(XM_546246.5 및 XP_546246.3), 소 DOCK2(XM_024981420.1 및 XP_024837188.1 및 XM_024981421.1 및 XP_024837189.1), 마우스 DOCK2(NM_033374.3 및 NP_203538.2), 래트 DOCK2(XM_008767630.2 및 XP_008765852.1), 닭 DOCK2(XM_425184.6 및 XP_425184.4) 및 아프리카 발톱 개구리 DOCK2(XM_018092631.1 및 XP_017948120.1)를 포함한다. DOCK2 오르토로그의 대표적인 서열은 아래 표 1에 나타나 있다.
DOCK2 단백질을 검출하기에 적합한 항-DOCK2 항체는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 항체 TA340057 및 TA802698(오리젠, 메릴랜드주 록빌), 항체 NBP2-46468 및 NBP2-38303(노부스 바이올로지컬즈, 콜로라도주 리틀턴), 항체 ab74659, ab226797 및 ab203068(압캠, 메사추세츠주 케임브리지) 등을 포함한다. 또한, DOCK2 발현을 검출하기 위한 시약은 잘 알려져 있다. DOCK2의 여러 임상적 테스트는 NIH 유전자 검사 등록소(GTR®)(예를 들어, GTR 테스트 ID: GTR000536814.1, 펄젠트 클리니칼 다이아그노스틱스 랩(캘리포니아주 템플 시티)에 의해 제공됨)에서 이용할 수 있다. 또한, DOCK2 발현을 감소시키기 위한 여러 siRNA, shRNA, CRISPR 작제물은 위에 언급된 회사의 상업 제품 목록, 예컨대 오리젠 테크놀로지스(메릴랜드주 록빌)의 siRNA 제품 #SR301250, shRNA 제품 # TL313396, TR313396, TG313396, TF313396, TL313396V 및 CRISPR 제품 #KN211198, 어플라이드 바이올로지컬 머티리얼즈의 CRISPR gRNA 제품(K3865908)과 산타 크루즈의 CRISPR gRNA 제품(sc-407692) 및 산타 크루즈의 RNAi 제품(Cat # sc-60545 및 sc-60546)에서 찾을 수 있다. 용어는 DOCK2 분자와 관련하여 본 명세서에 기재된 특징의 임의의 조합을 지칭하기 위해 더 사용될 수 있음에 유의하여야 한다. 예를 들어, 서열 구성, 퍼센트 동일성, 서열 길이, 도메인 구조, 기능적 활성 등의 임의의 조합은 본 발명에 포함되는 DOCK2 분자를 설명하는데 사용될 수 있다.
용어 "CD53"은 테트라스패닌(tetraspanin) 패밀리로도 알려져 있는 막관통 4 슈퍼패밀리의 구성원인 CD53 분자를 지칭한다. 이러한 구성원의 대부분은 4개의 소수성 도메인의 존재를 특징으로 하는 세포-표면 단백질이다. 단백질은 세포 발달, 활성화, 성장 및 운동성을 조절하는 역할을 하는 신호 전달 이벤트를 매개한다. 이러한 암호화된 단백질은 인테그린과의 복합체로 알려져 있는 세포 표면 당단백질이다. 이는 T 세포 및 자연 살해 세포에서 CD2-생성된 신호의 전달에 기여하며, 성장 조절에 역할을 하는 것으로 제안되었다. 이러한 유전자의 가족성 결핍은 박테리아, 곰팡이 및 바이러스에 의한 재발성 감염 질환과 관련된 면역결핍과 관련이 있다. CD53과 관련된 질환은 장 결핵 및 위장 결핵을 포함한다. 관련 경로 중에는 선천성 면역 체계가 있다. CD53은 세포 융합의 수준에서 근육 재생에 있어서 근섬유의 효율적인 형성을 위해 필요하다. CD53은 조혈 세포의 성장 조절에 관여할 수 있다. 일부 실시형태에서, 1p 염색체에 위치한 유전자 CD53은 9개의 엑손으로 구성된다. 일부 실시형태에서, 인간 CD53 단백질은 219개의 아미노산을 갖고/갖거나 24341Da의 분자량을 갖는다.
용어 "CD53"은 이의 단편, 변이체(예를 들어, 대립유전자 변이체) 및 유도체를 포함하는 것으로 의도된다. 대표적인 인간 CD53 cDNA 및 인간 CD53 단백질 서열은 당업계에 잘 알려져 있으며, 미국 국립생물공학정보센터(NCBI)(예를 들어, ncbi.nlm.nih.gov/gene/963 참조)로부터 공개적으로 이용 가능하다. 예를 들어, 적어도 2개의 상이한 인간 CD53 동형 단백질이 알려져 있다. 인간 CD53 동형 단백질 1(NP_000551.1 및 NP_001035122.1)은 전사체 변이체 1(NM_001040033.1)에 의해 암호화될 수 있으며, 이는 더 긴 전사체를 나타내고, 전사체 변이체 2(NM_000560.3)에 의해 이는 변이체 1과 비교하여 5' UTR에서 상이하다. 변이체 1 및 변이체 2는 동일한 단백질을 암호화한다. 인간 CD53 동형 단백질 2(NP_001307567.1)는 전사체 변이체 3(NM_001320638.1)에 의해 암호화될 수 있으며, 이는 변이체 1과 비교하여 5' UTR에서 상이하고 및 코딩 영역에서 엑손이 결여되어 있다. 암호화된 동형 단백질(2)은 동형 단백질 1과 비교하여 더 짧다. 인간 이외의 유기체에서 CD53 오르토로그의 핵산 및 폴리펩타이드 서열은 잘 알려져 있으며, 예를 들어 침팬지 CD53(XM_003308334.3 및 XP_003308382.1; XM_016925800.1 및 XP_016781289.1; 및 XM_009429624.2 및 XP_009427899.1), 레서스 원숭이 CD53(XM_015148031.1 및 XP_015003517.1, XM_001102190.3 및 XP_001102190.1 및 XM_015148036.1 및 XP_015003522.1), 개 CD53(XM_003639132.3 및 XP_003639180.1), 소 CD53(NM_001034232.2 및 NP_001029404.1), 마우스 CD53(NM_007651.3 및 NP_031677.1) 및 래트 CD53(NM_012523.2 및 NP_036655.1)을 포함한다. CD53 오르토로그의 대표적인 서열은 아래 표 2에 나타나 있다.
CD53 단백질을 검출하기에 적합한 항-CD53 항체는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 항체 GTX34220, GTX79940 및 GTX79942(진텍스, 캘리포니아주 어바인), 항체 sc-390185 및 sc-73365(산타 크루즈 바이오테크놀로지), 항체 MAB4624, NB500-393, NBP2-44609 및 NBP2-14464(노부스 바이올로지컬즈, 콜로라도주 리틀턴), 항체 ab134094, ab68565 및 ab213083(압캠, 메사추세츠주 케임브리지), 항체 Cat #: SM1137AS 및 SM1137LE(오리젠, 메릴랜드주 록빌) 등을 포함한다. 또한, CD53 발현을 검출하기 위한 시약은 잘 알려져 있다. CD53의 여러 임상적 테스트는 NIH 유전자 검사 등록소(GTR®)(예를 들어, GTR 테스트 ID: GTR000532965.2, 펄젠트 클리니칼 다이아그노스틱스 랩(캘리포니아주 템플 시티)에 의해 제공됨)에서 이용할 수 있다. 또한, CD53 발현을 감소시키기 위한 여러 siRNA, shRNA, CRISPR 작제물은 위에 언급된 회사의 상업 제품 목록, 예컨대 오리젠 테크놀로지스(메릴랜드주 록빌)의 siRNA 제품 #SR300686, shRNA 제품 # TL314077, TR314077, TG314077, TF314077, TL314077V 및 CRISPR 제품 #KN208095, 어플라이드 바이올로지컬 머티리얼즈의 CRISPR gRNA 제품(K6868708)과 산타 크루즈의 CRISPR gRNA 제품(sc-405861) 및 산타 크루즈의 RNAi 제품(Cat # sc-42796 및 sc-42797)에서 찾을 수 있다. 용어는 CD53 분자와 관련하여 본 명세서에 기재된 특징의 임의의 조합을 지칭하기 위해 더 사용될 수 있음에 유의하여야 한다. 예를 들어, 서열 구성, 퍼센트 동일성, 서열 길이, 도메인 구조, 기능적 활성 등의 임의의 조합은 본 발명에 포함되는 CD53 분자를 설명하는데 사용될 수 있다.
용어 "FERMT3(Fermitin Family Member 3)"은 퍼미틴 패밀리 구성원 3을 지칭하며, 인테그린 활성화에 관여하는 단백질-단백질 상호작용을 매개하여 세포 부착, 이동, 분화 및 증식에서 역할을 하는 단백질의 작은 패밀리에 속한다. FERMT3 단백질은 울혈 및 혈전증의 조절에 중요한 역할을 한다. 이는 또한 적혈구의 막 골격을 유지하는데 도움이 될 수 있다. FERMT3 유전자의 돌연변이는 상염색체 열성 백혈구 부착 결핍 증후군-III(leukocyte adhesion deficiency syndrome-III: LAD-III)을 유발한다. FERMT3은 조혈 세포에서 세포 부착에 중심 역할을 한다(문헌[Svensson et al. (2009) Nat Med 15:306-312; Suratannon et al. (2016) Pediatr Allergy Immunol 27:214-217]). FERMT3은 인테그린 베타-1-3(ITGB1, ITGB2 및 ITGB3)을 활성화함으로써 작용한다. FERMT3은 인테그린-매개성 혈소판 부착 및 내피 세포에 대한 백혈구 부착(문헌[Malinin et al. (2009) Nat Med 15:313-318]) 및 다형핵 과립구(PMN)에서 인테그린 베타-2(ITGB2)의 활성화에 필요하다. FERMT3의 인간 동형 단백질 2는 NF-카파-B 및 아폽토시스의 억제인자로 작용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 11q 염색체에 위치한 유전자 FERMT3은 16개의 엑손으로 구성된다. Fermt3 tm1Ref(문헌[Moser et al. (2008) Nat Med. 14:325-330]), Fermt3tm2.2Ref(문헌[Cohen et al. (2013) Blood 122:2609-2617]) 및 Fermt3tm1b(KOMP)Wtsi(국제 넉아웃 마우스 컨소시엄)를 포함하는 넉아웃 마우스 계통이 존재한다. 일부 실시형태에서, 인간 FERMT3 단백질은 667개의 아미노산을 갖고/갖거나 75953Da의 분자량을 갖는다. FERMT3은 ITGB1, ITGB2 및 ITGB3 세포질 꼬리(cytoplasmic tail)와 상호작용한다.
용어 "FERMT3"은 이의 단편, 변이체(예를 들어, 대립유전자 변이체) 및 유도체를 포함하는 것으로 의도된다. 대표적인 인간 FERMT3 cDNA 및 인간 FERMT3 단백질 서열은 당업계에 잘 알려져 있으며, 미국 국립생물공학정보센터(NCBI)(예를 들어, ncbi.nlm.nih.gov/gene/83706 참조)로부터 공개적으로 이용 가능하다. 예를 들어, 적어도 2개의 상이한 인간 FERMT3 동형 단백질이 알려져 있다. 인간 FERMT3 동형 단백질 1(NP_848537.1)은 전사체 변이체 1(NM_178443.2)에 의해 암호화될 수 있으며, 이는 더 긴 전사체를 나타낸다. 인간 FERMT3 동형 단백질 2(NP_113659.3)는 전사체 변이체 2(NM_031471.5)에 의해 암호화될 수 있으며, 이는 변이체 1과 비교하여 코딩 엑손의 5' 말단에서 대체 인-프레임 스플라이스 연결부위를 사용한다. 생성된 동형 단백질(2)은 동일한 N- 및 C-말단을 갖지만, 긴 동형 단백질(1)과 비교하여 더 짧다. 인간 이외의 유기체에서 FERMT3 오르토로그의 핵산 및 폴리펩타이드 서열은 잘 알려져 있으며, 예를 들어 침팬지 FERMT3(XM_009423350.3 및 XP_009421625.1; 및 XM_508522.6 및 XP_508522.3), 레서스 원숭이 FERMT3(XM_015113900.1 및 XP_014969386.1 및 XM_015113898.1 및 XP_014969384.1), 개 FERMT3(XM_003639655.3 및 XP_003639703.1), 마우스 FERMT3(NM_001362399.1 및 NP_001349328.1 및 NM_153795.2 및 NP_722490.1), 래트 FERMT3(NM_001127543.1 및 NP_001121015.1); 및 제브라피시 FERMT3(NM_200904.2 및 NP_957198.2)을 포함한다. FERMT3 오르토로그의 대표적인 서열은 아래 표 2에 나타나 있다.
FERMT3 단백질을 검출하기에 적합한 항-FERMT3 항체는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 항체 GTX116828, GTX85027 및 GTX88332(진텍스, 캘리포니아주 어바인), 항체 NBP2-45641, AF7004, NBP2-20821 및 H00083706-B01P(노부스 바이올로지컬즈, 콜로라도주 리틀턴), 항체 ab68040, ab126900 및 ab173416(압캠, 메사추세츠주 케임브리지), 항체 Cat #: CF807994 및 TA807994(오리젠, 메릴랜드주 록빌) 등을 포함한다. 또한, FERMT3 발현을 검출하기 위한 시약은 잘 알려져 있다. FERMT3의 여러 임상적 테스트는 NIH 유전자 검사 등록소(GTR®)(예를 들어, GTR 테스트 ID: GTR000516681.2, 펄젠트 클리니칼 다이아그노스틱스 랩(캘리포니아주 템플 시티)에 의해 제공됨)에서 이용할 수 있다. 또한, FERMT3 발현을 감소시키기 위한 여러 siRNA, shRNA, CRISPR 작제물은 위에 언급된 회사의 상업 제품 목록, 예컨대 오리젠 테크놀로지스(메릴랜드주 록빌)의 siRNA 제품 #SR313216, shRNA 제품 # TL307798, TR307798, TG307798, TF307798, TL307798V 및 CRISPR 제품 #KN202580, 어플라이드 바이올로지컬 머티리얼즈의 CRISPR gRNA 제품(K7584608)과 산타 크루즈의 CRISPR gRNA 제품(sc-408381) 및 산타 크루즈의 RNAi 제품(Cat # sc-96761 및 sc-146483)에서 찾을 수 있다. 용어는 FERMT3 분자와 관련하여 본 명세서에 기재된 특징의 임의의 조합을 지칭하기 위해 더 사용될 수 있음에 유의하여야 한다. 예를 들어, 서열 구성, 퍼센트 동일성, 서열 길이, 도메인 구조, 기능적 활성 등의 임의의 조합은 본 발명에 포함되는 FERMT3 분자를 설명하는데 사용될 수 있다.
용어 "CD37"은 테트라스패닌 패밀리로도 알려져 있는 막관통 4 슈퍼패밀리의 구성원인 CD37을 지칭한다. 이러한 구성원의 대부분은 4개의 소수성 도메인의 존재를 특징으로 하는 세포-표면 단백질이다. 단백질은 세포 발달, 활성화, 성장 및 운동성을 조절하는 역할을 하는 신호 전달 이벤트를 매개한다. CD37 단백질은 인테그린 및 다른 막관통 4 슈퍼패밀리 단백질과의 복합체로 알려져 있는 세포 표면 당단백질이다. CD37은 T-세포-B-세포 상호작용에서 역할을 할 수 있다. CD37 tm1Hor(문헌[Knobeloch et al. (2000) Mol Cell Biol 20:5363-5369])라 불리는 넉아웃 마우스 계통가 존재한다. 일부 실시형태에서, 19q 염색체에 위치한 유전자 CD37은 8개의 엑손으로 구성된다. 일부 실시형태에서, 인간 CD37 단백질은 281개의 아미노산을 갖고/갖거나 31703Da의 분자량을 갖는다. 일부 실시형태에서, CD37은 SCIMP와 상호작용한다.
용어 "CD37"은 이의 단편, 변이체(예를 들어, 대립유전자 변이체) 및 유도체를 포함하는 것으로 의도된다. 대표적인 인간 CD37 cDNA 및 인간 CD37 단백질 서열은 당업계에 잘 알려져 있으며, 미국 국립생물공학정보센터(NCBI)(예를 들어, ncbi.nlm.nih.gov/gene/951 참조)로부터 공개적으로 이용 가능하다. 예를 들어, 적어도 2개의 상이한 인간 CD37 동형 단백질이 알려져 있다. 인간 CD37 동형 단백질 A(NP_001765.1)는 전사체 변이체 1(NM_001774.2)에 의해 암호화될 수 있으며, 이는 더 긴 전사체를 나타낸다. 인간 CD37 동형 단백질 B(NP_001035120.1)는 전사체 변이체 2(NM_001040031.1)에 의해 암호화될 수 있으며, 이는 변이체 1과 비교하여 5' 코딩 영역에서 대체 인-프레임 세그먼트가 결여되어 있고, 하류 시작 코돈을 사용한다. 암호화된 동형 단백질(B)은 동형 단백질 A와 비교하여 더 짧은 N-말단을 갖는다. 인간 이외의 유기체에서 CD37 오르토로그의 핵산 및 폴리펩타이드 서열은 잘 알려져 있으며, 예를 들어 침팬지 CD37(XM_016947061.2 및 XP_016802550.1; XM_016947063.2 및 XP_016802552.1; XM_016947062.2 및 XP_016802551.1; 및 XM_016947064.2 및 XP_016802553.1), 레서스 원숭이 CD37(XM_015124560.1 및 XP_014980046.1; XM_001114865.3 및 XP_001114865.2; XM_015124562.1 및 XP_014980048.1; 및 XM_015124563.1 및 XP_014980049.1), 개 CD37(XM_014118925.2 및 XP_013974400.1; XM_541497.5 및 XP_541497.2; 및 XM_005616317.3 및 XP_005616374.1), 소 CD37(NM_001046011.2 및 NP_001039476.1), 마우스 CD37(NM_001290802.1 및 NP_001277731.1, NM_001290804.1 및 NP_001277733.1 및 NM_007645.4 및 NP_031671.1), 래트 CD37(NM_017124.1 및 NP_058820.1) 및 아프리카 발톱 개구리 CD37(NM_001015801.2 및 NP_001015801.2)를 포함한다. CD37 오르토로그의 대표적인 서열은 아래 표 2에 나타나 있다.
CD37 단백질을 검출하기에 적합한 항-CD37 항체는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 항체 GTX129598, GTX19701 및 GTX83137(진텍스, 캘리포니아주 어바인), 항체 sc-73364 및 sc-23924(산타 크루즈 바이오테크놀로지), 항체 NBP1-28869, NBP2-33969, NBP2-33970 및 MAB4625(노부스 바이올로지컬즈, 콜로라도주 리틀턴), 항체 ab170238, ab213068 및 ab227624(압캠, 메사추세츠주 케임브리지), 항체 Cat #: AM06314SU-N 및 AM32392PU-N(오리젠, 메릴랜드주 록빌) 등을 포함한다. 다른 항-CD37 항체가 또한 알려져 있으며, 예를 들어 미국 공개 US20160051694A1, US20100189722, US20180186876 및 US20140348745, 및 미국 특허 US8333966B2 및 US8765917B2에 기재된 것들을 포함한다. 또한, CD37 발현을 검출하기 위한 시약은 잘 알려져 있다. CD37의 여러 임상적 테스트는 NIH 유전자 검사 등록소(GTR®)(예를 들어, GTR 테스트 ID: GTR000532008.2, 펄젠트 클리니칼 다이아그노스틱스 랩(캘리포니아주 템플 시티)에 의해 제공됨)에서 이용할 수 있다. 또한, CD37 발현을 감소시키기 위한 여러 siRNA, shRNA, CRISPR 작제물은 위에 언급된 회사의 상업 제품 목록, 예컨대 오리젠 테크놀로지스(메릴랜드주 록빌)의 siRNA 제품 #SR300873, shRNA 제품 # TL314089, TR314089, TG314089, TF314089, TL314089V 및 CRISPR 제품 #KN210768, 어플라이드 바이올로지컬 머티리얼즈의 CRISPR gRNA 제품(K6910708)과 산타 크루즈의 CRISPR gRNA 제품(sc-404423) 및 산타 크루즈의 RNAi 제품(Cat # sc-42784 및 sc-44663)에서 찾을 수 있다. 용어는 CD37 분자와 관련하여 본 명세서에 기재된 특징의 임의의 조합을 지칭하기 위해 더 사용될 수 있음에 유의하여야 한다. 예를 들어, 서열 구성, 퍼센트 동일성, 서열 길이, 도메인 구조, 기능적 활성 등의 임의의 조합은 본 발명에 포함되는 CD37 분자를 설명하는데 사용될 수 있다.
용어 "CXorf21(Chromosome X Open Reading Frame 21)" 염색체 X 오픈 리딩 프레임 21을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 인간의 Xp 염색체에 위치한 유전자 CXorf21은 3개의 엑손으로 구성된다. CXorf21 유전자는 침팬지, 레서스 원숭이, 개, 젖소, 마우스, 래트, 닭, 제브라피시 및 개구리에서 보존된다. 일부 실시형태에서, 인간 CXorf21 단백질은 301개의 아미노산을 갖고/갖거나 33894Da의 분자량을 갖는다.
용어 "CXorf21"은 이의 단편, 변이체(예를 들어, 대립유전자 변이체) 및 유도체를 포함하는 것으로 의도된다. 대표적인 인간 CXorf21 cDNA 및 인간 CXorf21 단백질 서열은 당업계에 잘 알려져 있으며, 미국 국립생물공학정보센터(NCBI)(예를 들어, ncbi.nlm.nih.gov/gene/80231 참조)로부터 공개적으로 이용 가능하다. 예를 들어, 인간 CXorf21(NP_079435.1)은 전사체(NM_025159.2)에 의해 암호화될 수 있다. 인간 이외의 유기체에서 CXorf21 오르토로그의 핵산 및 폴리펩타이드 서열은 잘 알려져 있으며, 예를 들어 침팬지 CXorf21(XM_001134922.2 및 XP_001134922.1), 레서스 원숭이 CXorf21(NM_001194018.1 및 NP_001180947.1), 개 CXorf21(XM_005641222.3 및 XP_005641279.1; XM_005641223.3 및 XP_005641280.1; XM_022416085.1 및 XP_022271793.1; 및 XM_022416084.1 및 XP_022271792.1), 소 CXorf21(NM_001038537.2 및 NP_001033626.1), 마우스 CXorf21(NM_001163539.1 및 NP_001157011.1), 래트 CXorf21(NM_001109318.1 및 NP_001102788.1) 및 닭 CXorf21(XM_003640512.4 및 XP_003640560.1)을 포함한다. CXorf21 오르토로그의 대표적인 서열은 아래 표 2에 나타나 있다.
CXorf21 단백질을 검출하기에 적합한 항-CXorf21 항체는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 항체 NBP1-82317 및 H00080231-B01P(노부스 바이올로지컬즈, 콜로라도주 리틀턴), 항체 ab69152(압캠, 메사추세츠주 케임브리지) 등을 포함한다. 또한, CXorf21 발현을 검출하기 위한 시약은 잘 알려져 있다. CXorf21의 여러 임상적 테스트는 NIH 유전자 검사 등록소(GTR®)(예를 들어, GTR 테스트 ID: GTR000537724.2, 펄젠트 클리니칼 다이아그노스틱스 랩(캘리포니아주 템플 시티)에 의해 제공됨)에서 이용할 수 있다. 또한, CXorf21 발현을 감소시키기 위한 여러 siRNA, shRNA, CRISPR 작제물은 위에 언급된 회사의 상업 제품 목록, 예컨대 오리젠 테크놀로지스(메릴랜드주 록빌)의 siRNA 제품 #SR312858, shRNA 제품 # TL314126, TR305156, TG305156, TF305156, TL305156V 및 CRISPR 제품 #KN204618 및 KN300469, 어플라이드 바이올로지컬 머티리얼즈의 CRISPR gRNA 제품(K0537008)과 산타 크루즈의 CRISPR gRNA 제품(sc-413367) 및 산타 크루즈의 RNAi 제품(Cat # sc-91192 및 sc-140364)에서 찾을 수 있다. 용어는 CXorf21 분자와 관련하여 본 명세서에 기재된 특징의 임의의 조합을 지칭하기 위해 더 사용될 수 있음에 유의하여야 한다. 예를 들어, 서열 구성, 퍼센트 동일성, 서열 길이, 도메인 구조, 기능적 활성 등의 임의의 조합은 본 발명에 포함되는 CXorf21 분자를 설명하는데 사용될 수 있다.
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* 표 1에 열거된 본 발명에 포함되는 바이오마커의 핵산 및 폴리펩타이드 서열은 본 명세서에 제공된 고유 식별자로 GenBank에 제출되었으며, GenBank에 제출된 이러한 고유하게 확인된 각 서열은 그 전체가 본 명세서에 참조에 의해 포함된다.
* RNA 핵산 분자(예를 들어, 우리딘으로 대체된 티미딘), 암호화된 단백질의 오르토로그를 암호화하는 핵산 분자뿐만 아니라, 표 1에 열거된 임의의 공개적으로 이용 가능한 서열의 핵산 서열(예를 들어 하기를 참조) 또는 이들의 일부와 이들의 전체 길이에 걸쳐 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 이상의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 DNA 또는 RNA 핵산 서열이 표 1에 포함되어 있다. 이러한 핵산 분자는 본 명세서에서 더 기재되는 바와 같이 전장 핵산의 기능을 가질 수 있다.
* 단백질의 오르토로그뿐만 아니라, 표 1에 열거된 공개적으로 이용 가능한 서열의 핵산 서열(예를 들어 하기를 참조) 또는 이의 일부와 전체 길이에 걸쳐 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 분자가 표 1에 포함되어 있다. 이러한 폴리펩타이드는 본 명세서에서 더 기재되는 바와 같이 전장 폴리펩타이드의 기능을 가질 수 있다.
* 열거된 바이오마커에 대한 추가적인 알려진 핵산 및 아미노산 서열이 표 1에 포함되어 있다.
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* 표 2에 열거된 본 발명에 포함되는 바이오마커의 핵산 및 폴리펩타이드 서열은 본 명세서에 제공된 고유 식별자로 GenBank에 제출되었으며, GenBank에 제출된 이러한 고유하게 확인된 각 서열은 그 전체가 본 명세서에 참조에 의해 포함된다.
* RNA 핵산 분자(예를 들어, 우리딘으로 대체된 티미딘), 암호화된 단백질의 오르토로그를 암호화하는 핵산 분자뿐만 아니라, 표 2에 열거된 임의의 공개적으로 이용 가능한 서열의 핵산 서열 또는 이들의 일부와 이들의 전체 길이에 걸쳐 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 이상의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 DNA 또는 RNA 핵산 서열이 표 2에 포함되어 있다. 이러한 핵산 분자는 본 명세서에서 더 기재되는 바와 같이 전장 핵산의 기능을 가질 수 있다.
* 단백질의 오르토로그뿐만 아니라, 표 2에 열거된 공개적으로 이용 가능한 서열의 핵산 서열 또는 이의 일부와 전체 길이에 걸쳐 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 분자가 표 2에 포함되어 있다. 이러한 폴리펩타이드는 본 명세서에서 더 기재되는 바와 같이 전장 폴리펩타이드의 기능을 가질 수 있다.
* 열거된 바이오마커에 대한 추가적인 알려진 핵산 및 아미노산 서열이 표 2에 포함되어 있다.
IV. 표적 및 바이오마커를 조절하는데 유용한 작용제
단핵구 및/또는 대식세포의 염증성 표현형은 단독으로 또는 조합하여 소정의 바이오마커(예를 들어, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적)의 카피 수, 양 및/또는 활성을 조절함으로써 제어될 수 있으며, 염증성 표현형의 조절은 면역 반응을 조절할 수 있음이 본 명세서에서 입증된다. 따라서, 본 발명은 적어도 하나의 바이오마커(예를 들어, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적)의 카피 수, 양 및/또는 활성을 조절하고, 염증성 표현형을 상향조절하거나 하향조절하여 면역 반응을 각각 상향조절하거나 하향조절할 수 있는 조성물을 제공한다. 작용제는 적어도 하나의 바이오마커(예를 들어, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적)에 의해 매개되는 진단, 예후 예측 및 스크리닝 효과에 유용하므로, 적어도 하나의 바이오마커(예를 들어, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적)의 카피 수, 양 및/또는 활성을 검출할 수 있는 작용제가 또한 본 명세서에 기재된다.
항체, siRNA 등과 같은 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 표적을 하향조절하는 작용제에 의해서와 같이 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 하향조절하는 작용제는 단핵구 및/또는 대식세포의 염증성 표현형을 증가시킬 수 있다.
항체, siRNA 등과 같이 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 표적을 상향조절하는 작용제와 같이 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 하향조절하는 작용제는 단핵구 및/또는 대식세포의 염증성 표현형을 감소시킬 수 있다.
본 명세서에 기재된 적어도 하나의 바이오마커(예를 들어, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적)을 조절하는 임의의 작용제는 본 발명에 포함된다. 작용제는 적어도 하나의 바이오마커에 의해 매개되는 유전자 서열, 카피 수, 유전자 발현, 번역, 번역 후 변형, 세포내 국재화, 분해, 형태, 안정성, 분비, 효소적 활성, 전사 인자, 수용체 활성화, 신호 전달 및 기타 생화학적 기능을 조절할 수 있다.
작용제는 임의의 세포 모이어티, 예컨대 수용체, 세포 막, 항원 결정기기 또는 표적 분자 또는 표적 세포에 존재하는 다른 결합 부위에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 작용제는 세포 내에서 작용할 수 있는 세포로 확산되거나 또는 수송될 수 있다. 일부 실시형태에서, 작용제는는 세포-기반이다.
아래에 더 기재되는 바와 같은, 대표적인 작용제는 제한 없이 핵산(DNA 및 RNA), 올리고뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 펩타이드, 항체, 융합 단백질, 항생제, 소분자, 지질/지방, 당, 벡터, 접합체, 백신, 유전자 요법 작용제, 세포 요법 작용제 등, 예컨대 소분자, mRNA 암호화 폴리펩타이드, CRISPR 가이드 RNA(gRNA), RNA 간섭 작용제, 작은 간섭 RNA(siRNA), CRISPR RNA(crRNA 및 tracrRNA), 작은 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로RNA(miRNA), 피위-결합 RNA(piRNA), 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드 또는 펩타이도모방체 저해제, 압타머, 천연의 리간드 및 단독으로 또는 다른 작용제와 조합하여 단백질 바이오마커, 항체, 인트라바디 또는 세포에 결합하여 이를 활성화하거나 저해하는 이들의 유도체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 바이오마커(예를 들어, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적)과 천연의 결합 파트너 간의 상호작용을 조절하는 작용제는 본 발명에 따라 유용하다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 바이오마커와 하나 이상의 이의 천연의 결합 파트너(예를 들어, 차단 항체) 간의 상호작용(들)을 직접적으로 차단하는 작용제는 바이오마커 활성을 조절하여 염증성 표현형을 조절할 수 있다. 대안적으로, 상호작용(들)을 간접적으로 차단하는 작용제가 유용한하다. 예를 들어, 가용성 단백질은 바이오마커의 천연의 결합 파트너에 결합하거나 또는 대안적으로, 바이오마커의 천연의 결합 파트너를 모방함으로써 세포에서 각 단백질에 결합할 수 있는 바이오마커 및/또는 바이오마커 천연의 결합 파트너의 유효 농도를 간접적으로 감소시킨다. 예시적 작용제는 바이오마커와 천연의 결합 파트너(들) 간의 상호작용을 차단하는 바이오마커의 바이오마커 또는 천연의 결합 파트너(들)에 대한 항체; 바이오마커 및/또는 바이오마커(예를 들어, 우세한 음성 폴리펩타이드)의 천연의 결합 파트너(들)의 비-활성화 형태, 바이오마커와 이의 천연의 결합 파트너(들) 간의 상호작용을 차단하는 소분자 또는 펩타이드; 바이오마커 및 이의 천연의 결합 파트너(들) 간의 상호작용을 저해하는 융합 단백질(예를 들어, 항체 또는 면역글로불린의 Fc 부분에 융합된 바이오마커의 세포외 부분 및/또는 이의 천연의 결합 파트너(들)); 바이오마커 및/또는 이의 천연의 결합 파트너(들)의 전사 또는 번역을 차단하는 핵산 분자 및/또는 유전적 변형; 바이오마커 및/또는 이의 천연의 결합 파트너(들)의 비-활성화 형태를 포함한다.
다른 예시적 실시형태에서, 하나 이상의 천연의 결합 파트너에 대한 바이오마커(예를 들어, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 하나 이상의 표적)의 결합을 촉진하는 작용제는 본 발명에 포함된다. 이러한 상호작용을 조절하는 작용제는 직접적 또는 간접적으로 이를 수행할 수 있다. 따라서, 일 실시형태에서, 바이오마커와 바이오마커의 천연의 결합 파트너(들) 간의 상호작용을 직접적으로 향상시키는 작용제는 유용한 조절성 작용제이다. 대안적으로, 다른 결합 파트너에 대한 바이오마커 및/또는 바이오마커의 천연의 결합 파트너(들)의 결합을 차단하는 작용제는 서로 결합하는데 이용 가능한 두 성분의 유효 농도를 증가시킨다. 예시적 작용제는 바이오마커 및/또는 이의 천연의 결합 파트너(들)에 대한 항체, 바이오마커 및 이의 천연의 결합 파트너(들) 간의 상호작용을 활성화하거나 촉진하는 소분자 및 펩타이드를 포함한다.
본 발명에 포함되는 작용제는 임의의 수, 유형 및 양식을 포함할 수 있다. 예를 들어, 작용제는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 이상 또는 그 사이를 포함하는 임의의 범위, 바이오마커 또는 하나 이상의 바이오마커(예를 들어, 표 1 또는 표 2에 열거된 동일한 표적을 조절하는 2개의 작용제, 표 1에 열거된 표적을 조절하는 하나의 작용제와 표 2에 열거된 표적을 조절하는 제2 작용제, 표 2에 열거된 표적을 조절하는 siRNA 및 항체의 조합, 표 1에 열거된 단일 표적을 조절하는 2개의 siRNA와 표 2에 열거된 단일 표적을 조절하는 단일 siRNA의 조합 및 표 2에 열거된 상이한 표적을 조절하는 항체 작용제 등)를 조절하는 작용제의 수를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 조절성 작용제는 포식세포, 예를 들어 단핵구 및/또는 대식세포를 표적으로 하는 하나 이상의 추가적인 작용제를 더 포함한다. 이러한 단핵구/대식세포 표적화 작용제는 CD11b를 표적으로 하는 로벨리주맙, MNRP1685A(뉴로필린-1을 표적으로 함)를 포함하는 소분자, ANG2를 표적으로 하는 네스쿠맙, IL-4에 특이적인 파스콜리주맙, IL4Rα에 특이적인 두필루맙, IL-6R에 특이적인 토실리주맙과 사릴루맙, TNF-α에 특이적인 아달리무맙, 세르톨리주맙, 태너셉트, 골리무맙 및 인플릭시맙, 및 CD40을 표적화하는 CP-870과 CP-893을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
하기 및 본 명세서에 기재된 작용제 외에도, 본 발명에 포함되는 관심있는 바이오마커를 조절하는 예시적 작용제가 당업계에 기재되어 있다(예를 들어, (i) "Anti-PSGL-1 Compositions and Methods for Modulating Monocyte and Macrophage Inflammatory Phenotypes and Uses Thereof"라는 명칭의 U.S.S.N. 62/857,169로 2019년 6월 4일자로 Novobrantseva 등(버소 테라퓨틱스 인코포레이션(Verseau Therapeutics, Inc.))에 의해 출원된 동시 계류중인 출원; (ii) "Anti-PSGL-1 Compositions and Methods for Modulating Monocyte and Macrophage Inflammatory Phenotypes and Uses Thereof"라는 명칭의 U.S.S.N. 62/867,569로 2019년 6월 27자로 Novobrantseva 등(버소 테라퓨틱스 인코포레이션)에 의해 출원된 동시 계류중인 출원; (iii) "Anti-SIGLEC-9 Compositions and Methods for Modulating Monocyte and Macrophage Inflammatory Phenotypes and Uses Thereof"라는 명칭의 U.S.S.N. 62/857,194로 2019년 6월 4일자로 Novobrantseva 등(버소 테라퓨틱스 인코포레이션)에 의해 출원된 동시 계류중인 출원; (v) "Anti-LRRC25 Compositions and Methods for Modulating Monocyte and Macrophage Inflammatory Phenotypes and Uses Thereof"라는 명칭의 U.S.S.N. 62/867,593로 2019년 6월 27일자로 Novobrantseva 등(버소 테라퓨틱스 인코포레이션)에 의해 출원된 동시 계류중인 출원, 및 (vi) "Anti-CD53 Compositions and Methods for Modulating Monocyte and Macrophage Inflammatory Phenotypes and Uses Thereof"라는 명칭의 U.S.S.N. 62/867,602로 2019년 6월 27일자로 Novobrantseva 등(버소 테라퓨틱스 인코포레이션)에 의해 출원된 동시 계류중인 출원 참조, 상기 각각의 출원의 전체 내용은 이 참조에 의해 그 전문이 본 명세서에 원용된다).
1. 핵산 작용제
본 발명에 포함되는 일 양태는 핵산 분자의 사용을 포함한다. 핵산 분자는 데옥시리보핵산(DNA) 분자(예를 들어, cDNA, 게놈 DNA 등), 리보핵산(RNA) 분자(예를 들어, mRNA, 긴 논-코딩 RNA, 작은 RNA 종 등), DNA/RNA 하이브리드, 및 뉴클레오타이드 유사체를 사용하여 생성된 DNA 또는 RNA의 유사체일 수 있다. RNA 작용제는 RNAi(RNA 간섭) 작용제(예를 들어, 작은 간섭 RNA(siRNA)), 단일-가닥 RNA(ssRNA) 분자(예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오타이드) 또는 이중 가닥 RNA(dsRNA) 분자를 포함할 수 있다. dsRNA 분자는 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하되, 제2 가닥은 제1 가닥에 실질적으로 상보적이며, 제1 가닥 및 제2 가닥은 적어도 하나의 이중 가닥 듀플렉스 영역을 형성한다. dsRNA 분자는 둔단(blunt-ended)이거나 또는 적어도 하나의 말단 오버행을 가질 수 있다. 표적 핵산 서열에 결합하는 작용제로서 사용될 때, 본 발명에 포함되는 핵산 작용제는 인핸서 영역, 프로모터 영역, 전사 시작 및/또는 종결 영역, 스플라이스 부위, 코딩 영역, 3'-비번역 영역(3'-UTR), 5'-비번역 영역(5'-UTR), 5' 캡, 3' 폴리 아데닐일 꼬리 또는 이들의 임의의 조합을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 게놈 서열 및/또는 mRNA 서열과 같은 표적 서열의 임의의 영역에 혼성화할 수 있다.
"단리된" 핵산 분자는 핵산 분자의 천연 공급원에 존재하는 다른 핵산 분자와 분리된 것이다. 바람직하게는, "단리된" 핵산 분자는 핵산이 유래되는 유기체의 게놈 DNA에서 자연적으로 핵산(즉, 핵산의 5' 및 3' 말단에 위치한 서열)의 측면에 있는 서열(바람직하게는, 단백질-암호화 서열)이 없다. 예를 들어, 다양한 실시형태에서, 단리된 핵산 분자는 핵산이 유래되는 세포의 게놈 DNA에서 자연적으로 핵산 분자의 측면에 있는 약 5kB, 4kB, 3kB, 2kB, 1kB, 0.5 kB 또는 0.1 kB 미만의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 또한, "단리된" 핵산 분자, 예컨대 cDNA 분자는 재조합 기법에 의해 생산될 때 다른 세포 물질 또는 배양 배지가 실질적으로 없을 수 있거나 또는 화학적으로 합성될 때 화학 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다.
본 발명에 포함되는 핵산 분자는 표준 분자 생물학 기법 및 본 명세서에 기재된 데이터베이스 기록의 서열 정보를 사용하여 단리될 수 있다. 이러한 핵산 서열의 전부 또는 일부를 사용하여, 본 발명에 포함되는 핵산 분자는 표준 혼성화 및 클로닝 기법을 사용하여 단리될 수 있다(예를 들어, 문헌[Sambrook et al., ed., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2012]에 기재된 바와 같음).
본 발명에 포함되는 핵산 분자는 표준 PCR 증폭 기법에 따라 주형으로서 cDNA, mRNA 또는 게놈 DNA, 및 적절한 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 증폭될 수 있다. 이렇게 증폭된 핵산 분자는 적절한 벡터로 클로닝되고, DNA 서열 분석에 의해 특성화될 수 있다. 또한, 본 발명에 포함되는 핵산 분자의 전부 또는 일부에 상응하는 핵산 분자는 표준 합성 기법에 의해, 예를 들어 자동화된 핵산 합성기를 사용하여 제조될 수 있다. 대안적으로, 핵산 분자는 핵산이 서브 클로닝된 발현 벡터를 사용하여 생물학적으로 생산될 수 있다. 예를 들어, 안티센스 핵산 분자는 안티센스 배향으로 클로닝될 수 있다(즉, 삽입된 핵산으로부터 전사된 RNA는 아래에서 추가로 기재되는 바와 같이 관심있는 표적 핵산에 대한 안티센스 배향이 될 것임).
더욱이, 본 발명에 포함되는 핵산 분자는 핵산 서열의 일부만을 포함할 수 있되, 전장 핵산 서열은 본 발명에 포함되는 마커를 포함하거나, 또는 본 발명에 포함되는 마커에 상응하는 폴리펩타이드를 암호화한다. 이러한 핵산 분자는 예를 들어, 프로브 또는 프라이머로서 사용될 수 있다. 프로브/프라이머는 전형적으로 하나 이상의 실질적으로 정제된 올리고뉴클레오타이드로서 사용된다. 올리고뉴클레오타이드는 전형적으로 엄격한 조건하에서 적어도 약 7개, 바람직하게는 약 15개, 더욱 바람직하게는 약 25개, 50개, 75개, 100개, 125개, 150개, 175개, 200개, 250개, 300개, 350개 또는 400개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드의 바이오마커 핵산 서열과 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열의 영역을 포함한다. 바이오마커 핵산 분자의 서열에 기초한 프로브는 본 발명에 포함되는 하나 이상의 마커에 상응하는 전사체 또는 게놈 서열을 검출하는데 사용될 수 있다. 프로브는 그것에 부착되는 표지기, 예를 들어 방사성 동위원소, 형광 화합물, 효소 또는 효소 보조인자를 포함한다.
바이오마커 핵산 분자는 유전자 코드의 축퇴성으로 인해, 바이오마커에 상응하는 단백질을 암호화하는 핵산 분자의 뉴클레오타이드 서열과 다르므로, 동일한 단백질을 암호화하는 바이오마커 핵산 분자 또한 상정된다.
또한, 아미노산 서열의 변화를 유도하는 DNA 서열 다형성이 집단(예를 들어, 인간 집단) 내에 존재할 수 있다는 것이 당업자에 의해 인식될 것이다. 이러한 유전적 다형성은 천연의 대립유전자 변이로 인해 집단내 개체간에 존재할 수 있다. 대립 유전자는 주어진 유전자좌에서 교대로 발생하는 유전자 그룹 중 하나이다. 또한, RNA 발현 수준에 영향을 미치는 DNA 다형성이 또한 그 유전자의 전체 발현 수준에 영향을 미칠 수 있는 (예를 들어, 조절 또는 분해에 영향을 줌으로써) 존재할 수 있음이 이해될 것이다.
본 명세서에서 "대립유전자 변이체"와 상호교환적으로 사용되는 용어 "대립 유전자(allele)"는 유전자 또는 이의 일부의 대안적 형태를 지칭한다. 대립 유전자는 상동 염색체에서 동일한 유전자좌 또는 위치를 점유한다. 대상체가 유전자의 2개의 동일한 대립 유전자를 가지고 있는 경우, 대상체는 유전자 또는 대립 유전자에 대해 동형접합이라고 한다. 대상체가 유전자의 2개의 상이한 대립 유전자를 가지고 있는 경우, 대상체는 유전자 또는 대립 유전자에 대해 이형접합이라고 한다. 예를 들어, 바이오마커 대립 유전자는 단일 뉴클레오타이드 또는 여러 뉴클레오타이드에서 서로 다를 수 있으며, 뉴클레오타이드의 치환, 결실 및 삽입을 포함할 수 있다. 유전자의 대립 유전자는 또한 하나 이상의 돌연변이를 함유하는 유전자의 형태일 수 있다.
본 명세서에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "유전자의 다형성 영역의 대립유전자 변이체" 또는 "대립유전자 변이체"는 집단 내의 유전자의 해당 영역에서 발견되는 여러 가능한 뉴클레오타이드 서열 중 하나를 갖는 유전자의 대안적 형태를 지칭한다. 본 명세서에 사용되는, 대립유전자 변이체는 기능적 대립유전자 변이체, 비-기능적 대립유전자 변이체, SNP, 돌연변이 및 다형성을 포함하는 것을 의미한다.
용어 "단일 뉴클레오타이드 다형성"(single nucleotide polymorphism: SNP)은 대립 유전자 서열 간의 변이 부위인 단일 뉴클레오타이드가 차지하는 다형성 부위를 지칭한다. 부위는 일반적으로 대립 유전자의 고도로 보존된 서열(예를 들어, 집단의 1/100 또는 1/1000 구성원 미만으로 변하는 서열)이 선행되고 그 뒤를 따른다. SNP는 일반적으로 다형성 부위에서 하나의 뉴클레오타이드가 다른 뉴클레오타이드로 치환되어 발생할 수 있다. SNP는 또한 참조 대립 유전자와 비교하여 뉴클레오타이드의 결실 또는 뉴클레오타이드의 삽입으로부터 발생할 수 있다. 전형적으로 다형성 부위는 기준 염기 이외의 염기에 의해 점유된다. 예를 들어, 참조 대립 유전자가 다형성 부위에 염기 "T"(티미딘)를 함유하는 경우, 변경된 대립 유전자는 다형성 부위에 "C"(사이티딘), "G"(구아닌) 또는 "A"(아데닌)를 함유할 수 있다. SNP는 단백질-코딩 핵산 서열에서 발생할 수 있으며, 이 경우 결함이 있거나 그렇지 않으면 변이체 단백질 또는 유전적 질환을 일으킬 수 있다. 이러한 SNP는 유전자의 코딩 서열을 변경할 수 있으므로 다른 아미노산("미스센스(missense)" SNP)을 지정하거나, 또는 SNP는 정지 코돈("넌센스(nonsense)" SNP)을 도입할 수 있다. SNP가 단백질의 아미노산 서열을 변경하지 않는 경우, SNP는 "침묵(slient)"이라 한다. SNP는 또한 뉴클레오타이드 서열의 논코딩 영역에서도 발생할 수 있다. 이는 예를 들어, 대안적 스플라이싱의 결과로 결함이 있는 단백질 발현을 초래하거나, 또는 이는 단백질의 기능에 영향을 미치지 않을 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "유전자" 및 "재조합 유전자"는 본 발명에 포함되는 마커에 상응하는 폴리펩타이드를 암호화하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 핵산 분자를 지칭한다. 이러한 천연의 대립유전자 변이는 전형적으로 주어진 유전자의 뉴클레오타이드 서열에서 1% 내지 5%의 변이를 초래할 수 있다. 대안적인 대립 유전자는 여러 다른 개체에서 관심있는 유전자를 시퀀싱함으로써 확인될 수 있다. 이는 다양한 개체에서 동일한 유전자좌를 확인하기 위해 혼성화 프로브를 사용하여 쉽게 수행될 수 있다. 천연의 대립유전자 변이의 결과이며 기능적 활성을 변경하지 않는 임의의 그리고 모든 이러한 뉴클레오타이드 변이 및 생성된 아미노산 다형성 또는 변이는 본 발명에 포함되는 범위 내에 있는 것으로 의도된다.
다른 실시형태에서, 바이오마커 핵산 분자는 적어도 7개, 15개, 20개, 25개, 30개, 40개, 60개, 80개, 100개, 150개, 200개, 250개, 300개, 350개, 400개, 450개, 550개, 650개, 700개, 800개, 900개, 1000개, 1100개, 1200개, 1300개, 1400개, 1500개, 1600개, 1700개, 1800개, 1900개, 2000개, 2200개, 2400개, 2600개, 2800개, 3000개, 3500개, 4000개, 4500개 이상의 뉴클레오타이드 길이일 수 있고, 엄격한 조건하에서 본 발명에 포함되는 마커에 상응하는 핵산 분자 또는 본 발명에 포함되는 마커에 상응하는 단백질을 암호화하는 핵산 분자와 혼성화할 수 있다. 용어 "엄격한 조건하에서 혼성화하다"는 서로 적어도 60%(65%, 70%, 75%, 80%, 바람직하게는 85%) 동일한 뉴클레오타이드 서열이 전형적으로 서로 혼성화를 유지하는 혼성화 및 세척을 위한 조건을 설명하는 것으로 의도된다. 이러한 엄격한 조건은 당업자에게 공지되어 있으며, 문헌[Current Protocol in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989)]의 6.3.1 내지 6.3.6 부문에서 찾을 수 있다. 엄격한 혼성화 조건의 바람직한, 비-제한적 예는 약 45℃에서 6×소듐 클로라이드/소듐 시트레이트(SSC)에서 혼성화한 다음, 50℃ 내지 65℃에서 0.2×SSC, 0.1% SDS로 1회 이상 세척하는 것이다.
집단에 존재할 수 있는 본 발명에 포함되는 핵산 분자의 자연 발생적 대립유전자 변이체 외에도, 당업자는 서열 변화가 돌연변이에 의해 도입될 수 있고, 이에 따라 암호화된 단백질의 생물학적 활성을 변경하지 않고 암호화된 단백질의 아미노산 서열의 변화를 초래할 수 있음을 더 이해할 할 것이다. 예를 들어, "비-필수" 아미노산 잔기에서 아미노산 치환으로 이어지는 뉴클레오타이드 치환이 만들어질 수 있다. "비-필수" 아미노산 잔기는 생물학적 활성을 변경하지 않고 야생형 서열로부터 변경될 수 있는 잔기인 반면, "필수" 아미노산 잔기는 생물학적 활성에 필수적이다. 예를 들어, 보존되지 않은 아미노산 잔기 또는 다양한 종의 상동체 중에 반-보존된 아미노산 잔기는 활성에 필수적이지 않을 수 있으므로 변경의 표적이 될 수 있다. 대안적으로, 다양한 종(예를 들어, 뮤린 및 인간)의 상동체 사이에 보존된 아미노산 잔기는 활성에 필수적일 수 있으므로 변경의 표적이 될 가능성이 없다.
따라서, 본 발명에 포함되는 다른 양태는 활성에 필수적이지 않은 아미노산 잔기의 변화를 포함하는 본 발명에 포함되는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 이러한 폴리펩타이드는 본 발명에 포함되는 마커에 상응하는 자연 발생적 단백과 아미노산 서열이 다르지만 생물학적 활성을 유지한다. 일 실시형태에서, 바이오마커 단백질은 본 명세서에 기재된 바이오마커 단백질의 아미노산 서열과 적어도 약 40% 동일한, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 83%, 85%, 87.5%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
변이체 단백질을 암호화하는 단리된 핵산 분자는 하나 이상의 뉴클레오타이드 치환, 추가 또는 결실을 핵산 본 발명에 포함되는 뉴클레오타이드 서열로 도입함으로써 생성될 수 있으며, 따라서 하나 이상의 아미노산 잔기 치환, 추가 또는 결실이 암호화된 단백질 내로 도입된다. 돌연변이는 표준 기법, 예컨대 부위-지정 돌연변이 유발 및 PCR-매개성 돌연변이 유발에 의해 도입될 수 있다. 바람직하게는, 보존적 아미노산 치환은 하나 이상의 예측된 비-필수 아미노산 잔기에서 이루어진다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 가진 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산의 패밀리가 당업계에 정의되어 있다. 이러한 패밀리는 염기성 측쇄(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 타이로신, 시스테인), 비-극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 아이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다. 대안적으로, 돌연변이는 포화 돌연변이 유발에 의해 코딩 서열의 전부 또는 일부를 따라 무작위로 도입될 수 있고, 생성된 돌연변이는 활성을 유지하는 돌연변이를 확인하기 위해 생물학적 활성에 대해 스크리닝될 수 있다. 돌연변이 유발 후, 암호화된 단백질은 발현된 재조합적으로 발현될 수 있고, 단백질의 활성이 결정될 수 있다.
아래에 추가로 기재되는 바와 같이, 본 발명에 따라 유용한 일부 형태의 핵산은 생물학적 표적의 기능을 저해하는 작용제를 지칭하는 저해제로서 작용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 저해제는 유전자 또는 유전자 산물의 발현을 방지하는 유전자 침묵 작용제이다. "유전자 침묵"은 종종 "유전자 넉다운"이라고도 지칭된다. 유전자 침묵은 전사 수준에서 발생할 수 있으며, 즉 DNA의 RNA로의 전사를 방지하거나 또는 번역 수준에서, 즉 전사 후 침묵, 즉 mRNA의 단백질로의 번역을 방지한다. 전사 유전자 침묵의 유형은 예를 들어 게놈 각인, 모의 돌연변이, 트랜스포존 침묵, 히스톤 변형, 이식유전자 침묵, 위치 효과 및 RNA-지정 DNA 메틸화를 포함한다. 전사 후 유전자 침묵의 예는 RNA 간섭(RNAi), RNA 침묵 및 넌센스 매개성 붕괴를 포함한다. 유전자 침묵 작용제는 특정 유전자를 침묵(예를 들어, 발현의 저해)시키도록 또는 여러 유전자를 동시에 침묵시키도록 설계될 수 있다. 유전자 침묵 작용제는 유전자 및/또는 유전자 산물의 발현을 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 적어도 약 100%로 감소시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 유전자 침묵 작용제는 유전자 및/또는 유전자 산물의 발현을 적어도 약 70%로 감소시킨다.
일부 실시형태에서, 게놈 내의 핵산이 유용하며, 표적 및/또는 작용제로 사용될 수 있다. 예를 들어, 게놈 내의 표적 DNA는 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 조작될 수 있다. 게놈 내의 표적 DNA는 결실, 삽입 및/또는 돌연변이, 예컨대 레트로바이러스 삽입, 인공 염색체 기법, 유전자 삽입, 조직 특이적 프로모터의 무작위 삽입, 유전자 표적화, 전이 인자 및/또는 외래 DNA를 도입하거나 변형된 DNA/변형된 핵 DNA를 생성하는 임의의 다른 방법에 의해 조작될 수 있다. 다른 변형 기법은 게놈에서 DNA 서열을 결실시키고/시키거나 핵 DNA 서열을 변경시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 핵 DNA 서열은 부위-지정 돌연변이 유발에 의해 변경될 수 있다.
a. 메신저 RNA(mRNA) 및 cDNA
일부 실시형태에서, 표적 단백질 및 이의 변이체를 암호화하는 mRNA 및/또는 cDNA는 관심있는 표적 단백질 양 및/또는 활성을 조절하기 위한 작용제로서 사용될 수 있다. mRNA 및 cDNA는 안정성 및/또는 면역원성을 증가시키기 위해 변형, 예를 들어 코돈 최적화될 수 있다.
b. 작은 간섭 RNA(siRNA)
일부 실시형태에서, 핵산 작용제는 RNAi(RNA 간섭) 작용제일 수 있다. RNAi 작용제는 단일 가닥 RNA 분자 또는 이중 가닥 RNA 분자, 예컨대 작은(또는 짧은) 간섭 RNA(siRNA) 분자일 수 있다. SiRNA 분자는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 갖는 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드 또는 RNA 분자이되, 안티센스 가닥은 표적 mRNA 분자의 서열에 실질적으로 상보적이다. 세포 전달시 SiRNA 분자는 RNA 간섭(RNAi)을 유도할 것이다. RNAi는 염색질 리모델링, 단백질 번역의 저해 또는 직접 mRNA 분해를 통한 유전자 침묵의 전사 후 메커니즘이다. RNAi 과정 동안, siRNA와 같은 작은 RNA 분자는 RNA-유도성 침묵 복합체(RNA-induced silencing complex: RISC)에 동원된다. 이러한 복합체는 siRNA 분자를 통해 실질적으로 상보적인 서열(즉, 전사된 유전자의 mRNA)에 결합하여, 엔도뉴클레이스 활성에 의해 이들을 분해할 수 있다. 이는 궁극적으로 siRNA 분자에 상보적인 mRNA를 암호화하는 상응하는 유전자의 발현을 저해하게 한다(예를 들어, 문헌[McManus and Sharp (2002) Nat. Rev. Genet. 3: 737-747]).
용어 "이중 가닥 RNA", "듀플렉스 RNA" 또는 "RNA 듀플렉스"는 적어도 하나의 이중 가닥 영역을 갖는 두 가닥의 RNA를 지칭하며, 이중-가닥 영역 내에 또는 2개의 인접하는 이중-가닥 영역 사이에 적어도 하나의 갭, 틈, 돌출, 루프 및/또는 버블을 갖는 RNA 분자를 포함한다. 하나의 가닥이 2개의 이중 가닥 영역 사이에 일치하지 않는 뉴클레오타이드의 갭 또는 단일 가닥의 영역을 갖는 경우, 그 가닥은 다중 단편을 갖는 것으로 간주된다. 본 명세서에서 사용되는 이중 가닥 RNA는 말단 중 하나 또는 양쪽 말단에 말단 오버행을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 듀플렉스 RNA의 두 가닥은 소정의 화학적 링커를 통해 연결될 수 있다.
용어 "안티센스 가닥"은 표적 메신저 RNA에 대해 실질적인 서열 상보성을 갖는 RNA 가닥을 지칭한다. 안티센스 가닥은 siRNA 분자의 일부, miRNA/miRNA 듀플렉스의 일부 또는 단일-가닥 성숙 miRNA일 수 있다.
siRNA 분자의 센스 및 안티센스 가닥은 각각 약 10 내지 50개의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체를 포함할 수 있다. 바람직하게는, siRNA 분자의 센스 및 안티센스 가닥은 각각 약 15 내지 45의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 더 바람직하게는, siRNA 분자의 안티센스 및 센스 가닥은 각각 18 내지 30개의 뉴클레오타이드 길이 또는 21 내지 23개의 뉴클레오타이드 길이, 예를 들어 약 18개의 뉴클레오타이드 길이, 약 19개의 뉴클레오타이드 길이, 약 20개의 뉴클레오타이드 길이, 약 21개의 뉴클레오타이드 길이, 약 22개의 뉴클레오타이드 길이, 약 23개의 뉴클레오타이드 길이, 약 24개의 뉴클레오타이드 길이, 약 25개의 뉴클레오타이드 길이, 약 26개의 뉴클레오타이드 길이, 약 27개의 뉴클레오타이드 길이, 약 28개의 뉴클레오타이드 길이, 약 29개의 뉴클레오타이드 길이 또는 약 30개의 뉴클레오타이드 길이이다.
siRNA 분자의 센스 및 안티센스 가닥은 듀플렉스 영역을 형성한다. 안티센스 가닥은 RNAi를 매개하기 위해 표적에 실질적으로 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다(또는 대안적으로, 본질적으로 이루어지거나 또는 구성된다).
용어 "실질적으로 상보적"은 siRNA 분자의 염기쌍 및 이중 가닥 영역에서의 상보성을 지칭한다. 상보성은 완벽할 필요는 없다; 가장 엄격한 혼성화 조건하에서도 혼성화에 영향을 주지 않는 임의의 수의 염기쌍 불일치가 있을 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 포함되는 siRNA 분자의 안티센스 영역은 표적 mRNA 분자의 핵산 서열에 대해 적어도 약 70% 이상의 상보성, 적어도 약 75% 이상의 상보성, 적어도 약 80% 이상의 상보성 또는 적어도 약 85% 이상의 상보성 또는 적어도 약 90% 이상의 상보성 또는 적어도 약 91% 이상의 상보성 또는 적어도 약 92% 이상의 상보성 또는 적어도 약 93% 이상의 상보성 또는 적어도 약 94% 이상의 상보성 또는 적어도 약 95% 이상의 상보성 또는 적어도 약 96% 이상의 상보성 또는 적어도 약 97% 이상의 상보성 또는 적어도 약 98% 이상의 상보성 또는 적어도 약 99% 이상의 상보성을 포함할 수 있다.
siRNA 분자는 적어도 하나의 오버행 영역을 더 포함할 수 있되, 각각의 오버행 영역은 6개 이하의 뉴클레오타이드를 갖는다. 예를 들어, siRNA 분자의 안티센스 및 센스 가닥이 정렬될 때, 정렬되지 않은 가닥의 말단에 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의뉴클레오타이드가 있다(즉, 반대측 가닥에 상보적 염기가 없음). 일부 예에서, 오버행은 센스 및 안티센스 가닥이 어닐링될 때 듀플렉스의 한쪽 또는 양쪽 말단에서 발생할 수 있다.
일부 예에서, siRNA 분자의 안티센스 영역 및 센스 영역은 길이, 서열 및 이에 대한 화학적 변형의 특성이 다양할 수 있다.
c. 마이크로RNA(miRNA) 및 피위-상호작용 RNA(piRNA)
일부 실시형태에서, 핵산 분자는 miRNA, miRN모방체 또는 miRNA 저해제일 수 있다. miRNA는 전사 후 유전자 발현을 조절하며 세포의 RNAi 메커니즘의 일부를 조절하는, 21 내지 25개의 뉴클레오타이드 길이의 자연 발생적인 작은 논코딩 RNA 분자의 클래스이다. miRNA는 메신저 RNA(mRNA) 분자에 부분적으로 상보적이며, 이들의 주요 기능은 번역 억제, mRNA 절단 및 데아데닐화를 통한 유전자 발현의 하향-조절이다.
마이크로RNA 저해제는 내인성 miRNA의 침묵에 사용될 수 있는 안타고미르(antagomir)이다. miRN모방체 또는 모의체는 miRNA 효능제이며, 기능적 -결합로서 내인성 miRNA를 대체하여 이러한 내인성 miRNA에 의해 영향을 받는 경로를 상향조절하는데 사용될 수 있다.
"피위-상호작용 RNA(piRNA)"은 가장 큰 클래스의 작은 논-코딩 RNA 분자이다. piRNA는 피위 단백질과의 상호작용을 통해 RNA-단백질 복합체를 형성한다. 이러한 piRNA 복합체는 생식계열 세포, 특히 정자 형성에서 레트로트랜스포존 및 다른 유전적 요소의 후성적 또는 전사 후 유전자 침묵 모두에 연결되어 있다. 이들은 크기(21 내지 24개의 nt가 아닌 26 내지 31개의 nt), 서열 보존의 부족 및 증가된 복잡성에 있어서 마이크로RNA(miRNA)와 구별된다. 그러나, 다른 작은 RNA와 마찬가지로, piRNA는 유전자 침묵, 특히 트랜스포존의 침묵에 관여하는 것으로 생각된다. 대부분의 piRNA는 트랜스포존 서열에 대해 안티센스이며, 이는 트랜스포존이 piRNA 표적임을 시사한다. 포유동물에서, 트랜스포존 침묵에서 piRNA의 활성은 배아 발달 중에 가장 중요하고, 씨. 엘레간스(C. elegans) 및 인간에서 piRNA는 정자형성에 필요한 것으로 보인다. piRNA는 RNA-유도성 침묵 복합체(RISC)의 형성을 통해 RNA 침묵에서 역할을 한다.
d. 안티센스 핵산 및 올리고뉴클레오타이드
일부 실시형태에서, 핵산 분자는 안티센스 핵산 분자, 예컨대 표적 mRNA에 상보적이고/이거나 이중 가닥 cDNA의 코딩 가닥에 상보적인 서열을 갖는 것들을 포함할 수 있다. 본 발명에 포함되는 안티센스 핵산 분자는 전체 코딩 가닥 또는 이들의 일부에만, 예를 들어 단백질 코딩 영역의 전부 또는 일부(또는 오픈 리딩 프레임)에 수소 결합(즉, 어닐링)될 수 있으며, 이에 상보적일 수 있다. 안티센스 핵산 분자는 또한 관심있는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 코딩 가닥의 논-코딩 영역의 전부 또는 일부에 대해 안티센스일 수 있다. 논-코딩 영역("5' 및 3' 비번역 영역")은 코딩 영역의 측면에 있으며 아미노산으로 번역되지 않는 5' 및 3' 서열이다.
일부 실시형태에서, 핵산 분자는 안티센스 및 센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 세포 흡수시 표적 단백질의 발현 및 기능을 선택적으로 저해할 수 있는 짧은 단일-가닥 핵산 분자이다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 표적 mRNA에 대해 상보적이고/이거나 이중 가닥 cDNA의 코딩 가닥에 상보적이며, 전형적으로 10 내지 50개의 뉴클레오타이드 길이, 바람직하게는 15 내지 30개의 뉴클레오타이드 길이, 더욱 바람직하게는 18 내지 20개의 뉴클레오타이드 길이를 갖는다. 예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 18개의 뉴클레오타이드, 또는 19개의 뉴클레오타이드, 또는 20개의 뉴클레오타이드, 또는 21개의 뉴클레오타이드, 또는 22개의 뉴클레오타이드, 또는 23개의 뉴클레오타이드, 또는 24개의 뉴클레오타이드 또는 25개의 뉴클레오타이드, 또는 26개의 뉴클레오타이드, 또는 27개의 뉴클레오타이드, 또는 28개의 뉴클레오타이드, 또는 29개의 뉴클레오타이드 또는 30개의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 표적 mRNA와 듀플렉스를 형성하고, 이의 번역 또는 가공을 저해하여 결과적으로 단백질 생합성을 저해할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 개시 코돈, 표적화된 유전자의 전사 시작 부위 또는 인트론-엑손 연결부위를 표적화하도록 설계된다. 치료적 목적을 위해, 올리고뉴클레오타이드는 질환에 연루되어 있는 대식세포와 관련된 표적 단백질의 발현을 선택적으로 차단하기 위해 사용될 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드는 다음의 다양한 메커니즘을 통해 유전자 발현을 저해할 수 있다: (1) RNase H에 의한 표적 RNA/DNA 올리고뉴클레오타이드 간의 복합체의 분해. 후자는 DNA 합성에 필요한 보편적인 핵 효소이며, 이는 듀플렉스에서 RNA를 인식하고 절단하는 엔도뉴클레이스로서 기능한다. RNase H에 의한 절단을 지시하는 mRNA와의 복합체로부터의 대부분의 유형의 올리고뉴클레오타이드(모두는 아님); (2) 리보솜 복합체에 의한 번역의 저해; (3) 올리고뉴클레오타이드가 인트론-엑손 연결부위에 대해 설계된 경우, mRNA 스플라이싱에 대한 경쟁.
e. 리보자임 및 DNA자임
일부 실시형태에서, 핵산 분자는 리보자임 및 DNA자임일 수 있다. 리보자임은 RNA 분자의 서열 특이적 절단을 가능하게 하는 촉매적 활성을 보유하는 단일 가닥 RNA 분자이다(예를 들어, 문헌[Haselhoff and Gerlach (1988) Nature 334:585-591] 참조). 이들은 안티센스 서열 특이 적 혼성화를 통해 표적에 결합하고, 특정 부위에서 포스포다이에스터 골격을 절단하여 비활성화함으로써 기능한다. 이들의 구조는 자연 발생적인 부위-특이적, 자가-절단성 RNA 분자에 기초한다. 다섯 가지 클래스의 리보자임이 이들의 고유의 특성에 기초하여 기재되었다, 즉, 테트라하이메나 그룹 I 인트론, RNase P, 해머헤드 리보자임, 헤어핀 리보자임 및 D형 간염 바이러스 리보자임. 해머헤드 리보자임은 3'-5' 포스포다이에스터 결합인 경우, 가수분해에 의해 뉴클레오타이드 서열 U-H(H=A, C 또는 U)에서 RNA를 절단한다. 헤어핀 리보자임은 이들의 절단 부위로서 뉴클레오타이드 서열 C-U-G를 이용한다. 일부 실시형태에서, 리보자임은 관심있는 세포에서 과발현된 유전자를 표적화함으로써 요법을 넉아웃시키기 위해 사용될 수 있다. 본 발명에 포함되는 마커에 상응하는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자에 대한 특이성을 갖는 리보자임은 마커에 상응하는 cDNA의 뉴클레오타이드 서열을 기반으로 설계될 수 있다. 예를 들어, 활성 부위의 뉴클레오타이드 서열이 절단될 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 테트라하이메나 L-19 IVS RNA의 유도체는가 구축될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제4,987,071호 및 제5,116,742호 참조). 대안적으로, 관심있는 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA는 RNA 분자의 혼주로부터 특정 리보뉴클레이스 활성을 갖는 촉매적 RNA를 선택하는데 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Bartel and Szostak (1993) Science 261:1411-1418] 참조).
DNA자임은 향상된 생물학적 안정성을 부여하는 DN모티프로 대체되는 생물학적 안정성이 더 큰 리보자임의 유사체이다.
f. 압타머
일부 실시형태에서, 핵산 분자는 압타머일 수 있다. DNA 또는 RNA 압타머는 표적 단백질과 직접 상호작용하고 이들의 활성을 방해할 수 있는 이중 가닥(즉, DNA 압타머) 또는 단일 가닥(즉, RNA 압타머) 핵산 세그먼트이다. 일반적으로, "압타머"는 특정 표적 분자에 결합하는 올리고뉴클레오타이드 또는 펩타이드 분자이다. "핵산 압타머"는 반복적인 라운드의 시험관내 선택 또는 동등하게는, SELEX(지수적 농축에 의한 리간드의 체계적 진화)를 통해 조작되어 소분자, 단백질, 핵산 및 심지어 세포, 조직 및 유기체에 결합하는 핵산 종류이다. "펩타이드 압타머"는 특정 표적 분자에 결합하도록 선택되거나 조작된 인공 단백질이다. 이러한 단백질은 단백질 스캐폴드에 의해 표출되는 가변 서열의 하나 이상의 펩타이드 루프로 구성된다. 이들은 전형적으로 조합 라이브러리로부터 단리되고, 종종 이후에 직접 돌연변이 또는 가변 영역 돌연변이 유발 및 선택의 라운드에 의해 개선된다. 펩타이드 압타머의 진화인 "아피머 단백질"은 특정 표적 단백질에 대한 높은 친화성 결합 표면을 제공하는 펩타이드 루프를 표출하도록 조작된 작고 매우 안정적인 단백질이다. 이는 시스타틴의 시스테인 프로테이스 저해제 패밀리로부터 유래된 저분자량의 12 내지 14kDa의 단백질이다. 압타머는 일반적으로 사용되는 생체 분자인 항체에 필적하는 분자 인식 특성을 제공하므로 생명공학 및 치료적 응용 분야에 유용하다. 차별화된 인식 외에도, 압타머는 테스트 튜브에서 완벽하게 조작될 수 있고, 화학적 합성에 의해 쉽게 생산되며, 바람직한 저장 특성을 보유하고, 치료 적용에서 면역원성을 거의 또는 전혀 유발하지 않기 때문에 항체보다 이점을 제공한다. 일부 실시형태에서, 압타머는 질환에 연루되어 있는 대식세포와 관련된 표적 단백질의 분자 기능을 조절하기 위해 사용될 수 있다. 일부 예에서, 압타머는 표적 단백질에 대한 특이성 및 친화성, 비-면역원성 및 약제학적 제형의 안정성으로 인해 단백질 저해에서 항체보다 선호된다.
g. 핵산 유인물
일부 실시형태에서, 핵산 분자는 유인물(decoy) DNA 또는 유인물 RNA일 수 있다. 핵산 유인물은 전사 인자를 표적화하는데 특히 유용하다. RNA 유인물은 번역 활성인자 또는 mRNA 안정화 요소로 작용하는 단백질에 대한 대체의, 경쟁 결합 부위를 제공하기 위해 특별히 설계된 작은 RNA 분자이다. RNA 유인물은 번역을 방지하거나 또는 불안정성을 유도하고, 궁극적으로 mRNA 분자를 파괴하는 데 사용될 수 있다. 일부 예에서, 중요한 시스-작용 조절 요소에 상응하는 과발현된 짧은 RNA 분자는 트랜스-활성화 단백질을 위한 유인물로서 사용될 수 있으므로, 이러한 트랜스-활성인자가 이들의 상응하는 시스-작용 요소에 결합하는 것을 방지할 수 있다.
다른 예에서, 유인물은 표적화된 단백질, 특히 대식세포에서 하나 이상의 특정 유전자의 전사 속도를 조절(증가 또는 감소)하는 서열-특이적 이중 가닥 DNA 결합 단백질인 전사 인자에 대해 높은 결합 친화성을 갖는 이중-가닥 핵산 분자(예를 들어, DNA)일 수 있다.
h. 핵산 키메라
일부 실시형태에서, 핵산 분자는 핵산 키메라일 수 있다. 핵산 키메라는 대 식세포 관련 표적 단백질을 조절하도록 설계된 다양한 유형의 핵산 분자의 접합체이다. 예를 들어, 담체 및 표적 단백질에 특이적인 siRNA 분자(또는 miRNA)로서 세포 표면 수용체에 결합하는 세포 내재화 DNA 또는 RNA 압타머의 접합체는 대식세포 조절을 위한 접근법으로 사용될 수 있다. 압타머-siRNA 키메라는 전달 및 치료적 효과를 향상시킬 수 있다.
i. 삼중 나선 구조
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 핵산 분자는 삼중 나선 구조를 형성할 수 있다. 예를 들어, 관심있는 단백질의 발현은 표적 세포에서 유전자의 전사를 방지하는 삼중 나선 구조를 형성하기 위해 폴리펩타이드(예를 들어, 프로모터 및/또는 인핸서)를 암호화하는 유전자의 조절 영역에 상보적인 뉴클레오타이드를 표적화함으로써 억제될 수 있다(예를 들어, 문헌[Helene (1991) Anticancer Drug Des. 6:569-584; Helene (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:27-36; Maher (1992) Bioassays 14:807-815] 참조). 이러한 핵산은 이중 나선의 주요 홈에서 특정 상호작용을 통해 DNA 듀플렉스에 결합할 수 있다.
j. 핵산 변형 및 변이체
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 핵산 분자는 하나 이상의 화학적 변형을 함유할 수 있다. 변형은 핵산 분자의 활성을 손상시키지 않을 것이다. 당업계에 잘 알려진 화학적 변형은 핵산 분자의 안정성, 유용성 및/또는 세포 흡수를 증가시킬 수 있다. 일 실시형태에서, 변형은 (뉴클레이스에 의한) 분해에 대한 개선된 저항성 또는 세포에 의한 핵산 분자의 개선된 흡수를 제공하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 변형된 핵산 분자는 상응하는 비-변형된 핵산 분자와 비교하여 향상된 표적 효율을 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 핵산 분자는 발현의 증가, 표적 유전자를 침묵시키는데 사용하기 위한 유전자 침묵의 유효성 개선 등과 같이 최적화될 수 있다. 다른 실시형태에서, 변형은 표적 mRNA 및/또는 상보적 siRNA 가닥에서 상보적 뉴클레오타이드에 대한 친화성을 증가시키거나 감소시키는데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 siRNA는 세포, 조직 또는 유기체에서 면역 반응을 회피하거나 조절하는 능력을 증가시키도록 변형될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 핵산 분자는 표적 장기, 조직 및 세포에 대한 막 투과성 및/또는 전달을 증가시키도록 더 변형될 수 있다. 일 예에서, 핵산 분자는 골수성 세포, 단핵구 및 대식세포에 대한 전달을 증가시키도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 핵산 분자는 예를 들어, 안티센스 핵산 분자를 세포 표면 수용체 또는 항원에 결합하는 펩타이드 또는 항체에 연결함으로써 선택된 세포 표면에서 발현된 수용체 또는 항원에 특이적으로 결합할 수 있도록 변형될 수 있다. 핵산 분자는 관심있는 세포를 표적으로 하고/하거나 관심있는 세포 내에서 선택적으로 발현하는 벡터의 일부로서 변형될 수 있다.
본 발명에 포함되는 듀플렉스 분자, 예컨대 siRNA 분자는 변형된 센스 가닥, 변형된 안티-센스 가닥 또는 변형된 센스 및 안티센스 가닥을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 핵산 분자는 α-아노머성(anomeric) 핵산 분자일 수 있다. α-아노머성 핵산 분자는 상보적 RNA와 특정 이중 가닥 하이브리드를 형성하며, 일반적인 α- 단위와 달리 가닥이 서로 평행하게 연결된다(문헌[Gaultier et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:6625-6641]). 안티센스 핵산 분자는 또한 2'-o-메틸리보뉴클레오타이드(문헌[Inoue et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:6131-6148]) 또는 키메라 RNA-DN유사체(문헌[Inoue et al. (1987) FEBS Lett. 215:327-330])를 포함할 수 있다.
본 발명에 포함되는 핵산 분자는 5' 말단, 3' 말단, 5' 및 3' 말단 및/또는 내부 잔기 또는 이들의 임의의 조합에서 변형될 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 반복되는 뉴클레오타이드 잔기를 갖는 자연 발생적 핵산은 당과 포스포다이에스터로 구성된 골격 및 질소 염기(종종 핵 염기 또는 간단히 염기라고도 함)를 갖는다. 따라서 화학적으로 변형된 뉴클레오타이드는 변형된 핵 염기, 변형된 당 및/또는 비-포스포다이에스터 결합(즉, 골격 변형)을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형은 비잠금 핵단량체 작용제(unlocked nucleomonomer agent: UNA), 변형된 캡 구조, 변형된 뉴클레오사이드간 결합 및/또는 핵 염기 변형의 조합과 같은 본 명세서에 기재된 상이한 종류의 변형의 혼합물이다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 핵산 분자는 적어도 하나의 말단 변형 또는 "캡"을 더 포함할 수 있다.
예를 들어, 캡은 5' 및/또는 3'-캡 구조일 수 있다. 용어 "캡" 및 "말단-캡"은 핵산 분자의 각 가닥의 말단에서의 화학적 변형(말단 리보뉴클레오타이드에 대해) 및/또는 5' 말단에서 마지막 2개의 뉴클레오타이드 및/또는 3' 말단에서 마지막 2개의 뉴클레오타이드 사이의 결합의 변형을 포함한다. 캡 구조는 표적 mRNA와의 분자 상호작용 또는 세포 기구를 손상시키지 않으면서 엑소뉴클리에이스에 대한 핵산 분자의 저항성을 증가시킬 수 있다. 이러한 변형은 시험관내 또는 생체내에서 이들의 증가된 효능을 기준으로 선택될 수 있다.
캡은 5'-말단(5'-캡) 또는 3'-말단(3'-캡)에 존재할 수 있거나, 또는 양쪽 말단에 존재할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 5'- 및/또는 3'-캡은 포스포로티오에이트 모노포스페이트, 비염기성 잔기(모이어티), 포스포로티오에이트 연결, 4'-티오 뉴클레오타이드, 탄소고리형 뉴클레오타이드, 포스포로다이티오에이트 연결, 역 뉴클레오타이드 또는 역 비염기성 모이어티(2'-3' 또는 3'-3')(예를 들어, Invabasic X, 비염기성 II, r스페이서(rSpacer)/RNA 비염기성) 및 d스페이서(dSpacer)), 포스포로다이티오에이트 모노포스페이트 및 메틸포스포네이트 모이어티로부터 독립적으로 선택된다. 캡 구조의 일부인 경우, 포스포로티오에이트 또는 포스포로다이티오에이트 연결(들)은 일반적으로 5' 말단에 있는 2개의 말단 뉴클레오타이드와 3' 말단에 있는 2개의 말단 뉴클레오타이드 사이에 위치한다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 핵산 분자는 적어도 하나의 말단 포스포로티오에이트 모노포스페이트를 갖는다. 포스포로티오에이트 모노포스페이트는 핵산 분자의 각 가닥의 5' 및/또는 3' 말단에 있을 수 있다. 다른 실시형태에서, 핵산 분자는 센스 및/또는 안티센스 가닥의 5' 및 3' 말단 둘 다에 말단 포스포로티오에이트 모노포스페이트를 갖는다. 포스포로티오에이트 모노포스페이트는 엑소뉴클리에이스의 작용을 저해함으로써 더 높은 효능을 지원할 수 있다.
일부 실시형태에서, 5' 말단에서의 변형은 센스 가닥에서 바람직하고, 예를 들어 5'-프로필아민기를 포함한다. 3' OH 말단에서의 변형은 센스 가닥, 안티센스 가닥 또는 센스 및 안티센스 가닥에 있다. 3' 말단 변형은 예를 들어, 3'-퓨로마이신, 3'-바이오틴 등을 포함한다.
말단 변형은 또한 분포를 모니터링하는데 유용할 수 있으며, 이러한 경우 추가되는 바람직한 기는 형광단, 예를 들어 플루오레세인 또는 Alexa 염료, 예를 들어 Alexa 488을 포함한다. 말단 변형은 또한 흡수를 향상시키는데 유용할 수 있으며, 이를 위한 유용한 변형은 표적화 리간드를 포함한다. 말단 변형은 또한 올리고뉴클레오타이드를 다른 모이어티에 가교결합하는데 유용할 수 있으며; 이를 위한 유용한 변형은 미토마이신 C, 소랄렌 및 이들의 유도체를 포함한다. 예시적 5'-변형은 5'-모노포스페이트((HO)2(O)P―O-5'); 5'-다이포스페이트((HO)2(O)P―O―P(HO)(O)―O-5'); 5'-트라이포스페이트((HO)2(O)P―O―(HO)(O)P―O―P(HO)(O)―O-5'); 5'-모노티오포스페이트(포스포로티오에이트; (HO)2(S)P―O-5'); 5'-모노다이티오포스페이트(포스포로다이티오에이트; (HO)(HS)(S)P―O-5'), 5'-포스포로티올레이트((HO)2(O)P―S-5'); 5'-알파-티오트라이포스페이트; 5'-베타-티오트라이포스페이트; 5'-감마-티오트라이포스페이트; 5'-포스포라미데이트((HO)2(O)P―NH-5', (HO)(NH2)(O)P―O-5')를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 다른 5'-변형은 5'-알킬포스포네이트(R(OH)(O)P―O-5', R=알킬, 예를 들어, 메틸, 에틸, 아이소프로필, 프로필 등), 5'-알킬에터포스포네이트(R(OH)(O)P―O-5', R=알킬에터, 예를 들어 메톡시메틸(CH2OMe), 에톡시메틸 등)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 핵산 분자의 말단에 있는 캡은 접합체, 예를 들어 5' 접합체일 수 있다. 5' 말단 접합체는 5'에서 3'로의 핵산말단분해성 절단(예를 들어, 나프록센; 이부프로펜; 작은 알킬 사슬; 아릴기; 헤테로고리형 접합체; 변형된 당(D-리보스, 데옥시리보스, 글루코스 등))을 저해할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 핵산 분자는 천연 핵 염기의 염기 변형 및/또는 치환을 포함할 수 있다.
용어 "비변형된" 또는 "천연의" 핵 염기는 퓨린 염기 아데닌(A) 및 구아닌(G) 및 피리미딘 염기 티민(T), 사이토신(C) 및 우라실(U)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 분자는 하나 이상의 핵 염기-변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 이는 약 1개, 약 2개, 약 3개, 약 4개, 약 5개, 약 6개, 약 7개, 약 8개, 약 9개, 약 10개, 약 11개, 약 12개, 약 13개, 약 14개, 약 15개, 약 16개, 약 17개, 약 18개, 약 19개, 약 20개, 약 21개, 약 22개, 약 23개, 약 24개, 약 25개, 약 26개, 약 27개, 약 28개, 약 29개 이상의 핵 염기-변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 핵산 분자는 약 1% 내지 10% 변형된 뉴클레오타이드 또는 약 10% 내지 50% 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 변형된 염기는 예를 들어, 하나 이상의 원자 또는 기의 대체 또는 추가에 의해 변형된 아데닌(A), 구아닌(G), 사이토신(C), 티민(T), 우라실(U), 잔틴, 이노신 및 큐에오신과 같은 뉴클레오타이드 염기를 지칭한다. 염기 모이어티와 관련하여 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있는 변형의 유형의 일부 예는 개별적으로 또는 조합으로 알킬화된, 할로겐화된, 티올화된, 아민화된, 아마이드화된 또는 아세틸화된 염기를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 보다 구체적인 예는 예를 들어, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-아이오도우라실, 하이포잔틴, 잔틴, 4-아세틸사이토신, 5-(카복시하이드록실메틸) 우라실, 5-카복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카복시메틸아미노메틸우라실, 다이하이드로우라실, 베타-D-갈락토실큐에오신, 이노신, N6-아이소펜텐일아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-다이메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸사이토신, 5-메틸사이토신, N6-아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실큐에오신, 5'-메톡시카복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-아이소펜텐일아데닌, 우라실-5-옥시아세트산(v), 와이뷰톡소신, 슈도우라실, 큐에오신, 2-티오사이토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스터, 우라실-5-옥시아세트산(v), 5-메틸-2-티오우라실, 3-(3-아미노-3-N-2-카복시프로필) 우라실, (acp3)w 및 2,6-다이아미노퓨린, 5-프로핀일우리딘, 5-프로핀일사이티딘, 6-메틸아데닌, 6-메틸구아닌, N,N,-다이메틸아데닌, 2-프로필아데닌, 2-프로필구아닌, 2-아미노아데닌, 3-메틸우리딘, 5-메틸사이티딘, 5-메틸우리딘 및 5번 위치에 변형을 갖는 다른 뉴클레오타이드, 5-(2-아미노)프로필 우리딘, 5-할로사이티딘, 5-할로우리딘, 4-아세틸사이티딘, 1-메틸아데노신, 2-메틸아데노신, 3-메틸사이티딘, 6-메틸우리딘, 2-메틸구아노신, 7-메틸구아노신, 2,2-다이메틸구아노신, 5-메틸아미노에틸우리딘, 5-메틸옥시우리딘, 데아자뉴클레오타이드, 예컨대 7-데아자-아데노신, 6-아조우리딘, 6-아조사이티딘, 6-아조티미딘, 5-메틸-2-티오우리딘, 다른 티오 염기, 예컨대 2-티오우리딘 및 4-티오우리딘 및 2-티오사이티딘, 다이하이드로우리딘, 슈도우리딘, 큐에오신, 아케오신, 나프틸 및 치환된 나프틸기, 임의의 O- 및 N-알킬화된 퓨린 및 피리미딘, 예컨대 N6-메틸아데노신, 5-메틸카보닐메틸우리딘, 우리딘 5-옥시아세트산, 피리딘-4-온, 피리딘-2-온, 페닐 및 변형된 페닐기, 예컨대 아미노페놀 또는 2,4,6-트라이메톡시 벤젠, G-클램프 뉴클레오타이드로서 작용하는 변형된 사이토신, 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-치환된 우라실 및 티민, 아자피리미딘, 카복시하이드록시알킬 뉴클레오타이드, 카복시알킬아미노알킬 뉴클레오타이드 및 알킬카보닐알킬화된 뉴클레오타이드를 포함한다. 변형된 뉴클레오타이드는 또한 당 모이어티와 관련하여 변형된 뉴클레오타이드뿐만 아니라 리보실이 아닌, 당 또는 이의 유사체를 갖는 뉴클레오타이드를 포함한다. 예를 들어, 당 모이어티는 만노스, 아라비노스, 글루코피라노스, 갈락토피라노스, 4'-티오리보스 및 다른 당, 헤테로사이클 또는 카보사이클일 수 있거나, 또는 이에 기초할 수 있다.
예시적 변형된 핵 염기는 다른 합성 및 자연적으로 변형된 핵 염기, 예컨대 5-메틸사이토신(5-me-C), 5-하이드록시메틸 사이토신, 잔틴, 하이포잔틴, 2-아미노아데닌, 아데닌과 구아닌의 6-메틸 및 다른 알킬 유도체, 아데닌과 구아닌의 2-프로필 및 다른 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오사이토신, 5-할로우라실 및 사이토신, 5-프로핀일 우라실 및 사이토신, 6-아조 우라실, 사이토신 및 티민, 5-우라실(슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-하이드록실 및 다른 8-치환된 아데닌과 구아닌, 5-할로, 특히 5-브로모, 5-트라이플루오로메틸 및 다른 5-치환된 우라실 및 사이토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 특정 실시형태에서, 본 발명에 유용한 핵 염기-변형된 뉴클레오타이드는 5-브로모-우리딘, 5-아이오도-우리딘, 5-메틸-사이티딘, 리보-티미딘, 2-아미노퓨린, 5-플루오로-사이티딘 및 5-플루오로-우리딘, 2,6-다이아미노퓨린, 4-티오-우리딘; 및 5-아미노-알릴-우리딘 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 핵산 분자는 또한 염기 유사체를 갖는 뉴클레오타이드를 함유할 수 있다.
핵 염기는 자연 발생적 비 표준(non canon) 염기, 예컨대 CpG 섬(island), C, U 또는 A와 염기 쌍을 형성할 수 있는 이노신, 티오우리딘, 다이하이드로우리딘, 큐에오신, 잔틴, 하이포잔틴, 누불라린, 아이소구아니신, 투베르시딘 및 와이오신일 수 있다. 다른 유사체는 형광단(예를 들어, 로다민, 플루오레세인) 및 다른 형광 염기 유사체, 예컨대 2-AP(2-aminopurine), 3-MI, 6-MI, 6-MAP, 피롤로-dC, 피롤로-dC의 변형된 및 개선된 유도체, 퓨란-변형된 염기 및 삼중고리형 사이토신 패밀리(예를 들어, 1,3-다이아자-2-옥소페노티아진, tC; tC의 옥소-상동체, tCO; 1,3-다이아자-2-옥소페녹사진)을 포함할 수 있다. 핵 염기 변형된 뉴클레오타이드는 또한 보편적인 염기를 포함할 수 있다. 예로서, 보편적인 염기는 3-나이트로피롤, 5-나이트로인돌 또는 네뷸라린을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 용어 "뉴클레오타이드"는 또한 리보실 3' 산소가 아민기로 치환된 결과인 N3'에서 P5' 포스포라미데이트를 포함하는 것을 의미한다. 본 명세서에 사용되는 보편적인 핵 염기는 용융 거동, 세포내 효소에 의한 인식 또는 올리고뉴클레오타이드 듀플렉스의 활성에 실질적으로 영향을 주지 않는 4개의 자연 발생적 핵 염기 모두와 염기 쌍을 형성할 수 있는 임의의 변형된 핵 염기이다. 일부 예시적 보편적인 핵 염기는 2,4-다이플루오로톨루엔, 나이트로피롤일, 나이트로인돌일, 8-아자-7-데아자아데닌, 4-플루오로-6-메틸벤즈이미다졸, 4-메틸벤즈이미다졸, 3-메틸 아이소카보스티릴일, 5-메틸 아이소카보스티릴일, 3-메틸-7-프로핀일 아이소카보스티릴일, 7-아자인돌일, 6-메틸-7-아자인돌일, 이미디조피리딘일, 9-메틸-이미디조피리딘일, 피롤로피리진일, 아이소카보스티릴일, 7-프로핀일 아이소카보스티릴일, 프로핀일-7-아자인돌일, 2,4,5-트라이메틸페닐, 4-메틸리놀일, 4,6-다이메틸인돌일, 페닐, 나프탈렌일, 안트라센일, 페난트라센일, 피렌일, 스틸벤질, 테트라센일, 펜타센일 및 이들의 구조적 유도체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 핵산 분자의 뉴클레오타이드는 미국 특허 제6,008,334호; 제6,107,039호; 제6,664,058호; 제7,678,894호; 제7,786,292호; 및 제7,956,171호; 미국 공개 제2013/122,506호 및 제2013/0296402호에 기재된 염기 유사체 및 변형된 염기; PCT 특허 공개 WO 2012/061810에 기재된 바와 같은 카복사미도-변형된 염기를 포함할 수 있다).
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 변형된 핵산 분자는 인공 핵산 유사체를 포함할 수 있다.
용어 "인공 핵산 유사체" 또는 간단히 "핵산 유사체"는 자연 발생적 DNA 또는 RNA와 구조적으로 유사한 화합물을 지칭한다. 유사체는 변경된 임의의 포스페이트 골격, 당 또는 핵 염기(즉, G, C, T, U 및 A)를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 뉴클레오타이드는 비잠금 뉴클레오모노머 작용제(unlocked nucleomonomer agent: UNA)일 수 있다. UNA는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드와 같은 올리고머성 또는 중합체성 조성물에 포함하기에 적합하고, 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드와 관련하여 비잠금 또는 비고리형 당 모이어티를 갖는 임의의 모노머 단위를 포함한다. 이러한 UNA가 대형 올리고머 또는 중합체, 예컨대 대형 올리고머 또는 중합체, 예를 들어 올리고뉴클레오타이드에 포함되는 경우, 이는 또한 UNA 올리고머 또는 UNA 중합체 또는 UNA 올리고뉴클레오타이드로 지칭될 수 있다. UNA가 표준 뉴클레오타이드에 포함되는 경우, 이러한 변이체 뉴클레오타이드는 UNA 뉴클레오타이드로 지칭된다. UNA가 표준 뉴클레오사이드에 포함되는 경우, 이러한 변이체 뉴클레오사이드는 UNA 뉴클레오사이드로 지칭된다. UNA는 올리고뉴클레오타이드에서 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드에 대한 대체물로서 사용될 수 있다. 이러한 경우에, UNA는, 모노머 또는 모노머를 함유하는 올리고머에 관계없이, 당업계에서 종종 "비잠금 핵산"으로 지칭되었다. 본 명세서에서 비잠금 핵산으로 언급될 때, 당업자는 본 발명자들이 UNA를 언급하고 있음을 이해할 것이다. 본 발명에 따르면, UNA는 자연 발생적 핵단량체 작용제가 아니다. 일 실시형태에서, 핵산 분자에서 하나 이상의 뉴클레오타이드는 예를 들어, PCT 공개 WO 2015/148580에 기재된 것들을 포함하는, 하나 이상의 비잠금 핵산/핵단량체 작용제(UNA) 모이어티로 대체될 수 있다. UNA 올리고머는 UN모노머로 구성된 사슬뿐만 아니라 자연 발생적 뉴클레오사이드 또는 변형된 뉴클레오타이드를 기반으로 할 수 있는 다양한 뉴클레오타이드일 수 있다. UNA 올리고머는 변형이 없는 대응(counterpart) 올리고뉴클레오타이드와 비교하여 표적 외 효과가 감소된 것으로 보고되었다. 본 발명에 따라 이용될 수 있는 다른 UNA 수정 및 사용은 임의의 미국 공개 US20150232851, 미국 특허 US9051570, 미국 공개 US20150232849, 유럽 공개 EP2162538, 미국 공개 US20150239926, 미국 공개 US20150239834, 미국 공개 US20150141678, 국제 공개 WO2015074085 및/또는 유럽 공개 EP2370577에 개시된 것들을 포함한다.
일부 실시형태에서, 골격 유사체를 갖는 인공 핵산 유사체는 이중고리형 뉴클레오타이드 유사체, 예컨대 잠금핵산(LNA), 브리지된 핵산(BNA), 글리콜 핵산(GNA), 트레오스 핵산(TNA) 및 모폴리노를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 이러한 골격 유사체를 포함하는 변형된 올리고뉴클레오타이드는, 비록 상이한 골격 당을 갖지만, 또는 PNA의 경우 리보스 포스페이트 대신 아미노산 잔기가 왓슨과 크릭 염기쌍에 따라 여전히 RNA 또는 DNA에 결합하지만, 뉴클레이스 활성에 대한 면역성이 있다. LNA는 예를 들어, 미국 특허 제6,268,490호; 제6,316,198호; 제6,403,566호; 제6,770,748호; 제6,998,484호; 제6,670,461호; 및 제7,034,133호; PCT 공개 제99/14226호에 기재되어 있다. 본 발명에 포함되는 핵산 분자에 혼입될 수 있는 다른 적합한 잠금 뉴클레오타이드는 미국 특허 제6,403,566호; 제6,833,361호; 및 제7,060,809호에 기재된 것들을 포함한다. 다른 잠금핵산 유도체, 예컨대 D-옥시-LNA, α-L-옥시-LNA, β-D-아미노-LNA, α-L-아미노-LNA, 티오-LNA, α-L-티오-LNA, 셀레노-LNA, 메틸렌-LNA 및 β-D-엔A가 본 발명에 포함되는 핵산 분자에 혼입될 수 있다. 미국 특허 제7,569,575호; 제8,084,458호; 및 제8,429,390호에 기재된 이들 LN유도체는 또한 핵산 분자 내로 혼입될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 핵산 분자는 하나 이상의 당-변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
이는 약 1개, 약 2개, 약 3개, 약 4개, 약 5개, 약 6개, 약 7개, 약 8개, 약 9개, 약 10개 이상의 당-변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 본 발명에 유용한 당-변형된 뉴클레오타이드는 2'-플루오로 변형된 리보뉴클레오타이드, 2'-OMe 변형된 리보뉴클레오타이드, 2'-데옥시 리보뉴클레오타이드, 2'-아미노 변형된 리보뉴클레오타이드 및 2'-티오 변형된 리보뉴클레오타이드를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 당-변형된 뉴클레오타이드는 예를 들어, 2'-플루오로-사이티딘, 2'-플루오로-우리딘, 2'-플루오로-아데노신, 2'-플루오로-구아노신, 2'-아미노-사이티딘, 2'-아미노-우리딘, 2'-아미노-아데노신, 2'-아미노-구아노신 또는 2'-아미노-뷰티릴-피렌-우리딘일 수 있다. 골격 당의 2' 변형 외에도, 당 기는 다른 위치에서 변형될 수 있다. 당 기는 당의 동일한 탄소에서 두 가지 상이한 변형을 포함할 수 있다. 당 기는 또한 리보스에서 상응하는 탄소의 것과 반대되는 입체화학적 배열을 갖는 하나 이상의 탄소를 함유할 수 있다. 따라서, 핵산 분자는 당으로서 예를 들어, 아라비노스를 함유하는 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드는 당의 1' 위치에 알파 결합, 예를 들어 알파-뉴클레오사이드를 가질 수 있다. 뉴클레오타이드는 또한 4'-위치에 반대편 배열, 예를 들어 C5' 및 H4'를 가질 수 있거나, 또는 이들을 대체하는 치환기는 서로 교환된다. C5' 및 H4' 또는 이들을 대체하는 치환기가 서로 교환되는 경우, 당은 4' 위치에서 변형된다고 한다.
본 발명에 포함되는 핵산 분자는 또한 C-1'에서 핵 염기가 결여되어 있거나 또는 C1'에서 핵 염기 대신 다른 화학기를 갖는 비염기성 당을 포함할 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,998,203호 참조). 이러한 비염기성 당은 또한 구성 당 원자 중 하나 이상에서 변형을 추가로 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 핵산 분자는 또한 L 이성질체인 하나 이상의 당을 함유할 수 있다. 일 양태에서, 당 기에 대한 변형은 또한 4'-O를 황, 선택적으로 치환된 질소 또는 CH2 기로 대체하는 것을 포함할 수 있다. 다른 양태에서, 당 기에 대한 변형은 또한 비고리형 뉴클레오타이드를 포함할 수 있되, 리보스 탄소 사이의 C-C 결합은 부재(즉, 존재하지 않음)하고/하거나 리보스 탄소 또는 산소 중 적어도 하나는 독립적으로 또는 조합하여 뉴클레오타이드에 존재하지 않는다. 이러한 비고리형 뉴클레오타이드는 미국 특허 제5,047,533호 및 제7,737,273호 및 미국 공개 제20130130378호에 개시되어 있다. 특정 뉴클레오타이드가 2'-위치를 통해 다음 뉴클레오타이드에 연결될 때, 본 명세서에 기재된 당 변형은 특정 뉴클레오타이드, 예를 들어 2'-위치를 통해 연결된 뉴클레오타이드에 대한 당의 3'-위치에 배치될 수 있음을 이해해야 한다. 3' 위치에서의 변형은 자일로스 배열에 존재할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 용어 "자일로스 배열(xylose configuration)"은 3'-OH가 자일로스 당에 있는 것과 같은 동일한 배열로 리보스의 C3'상에 치환기의 배치를 지칭한다. 당 기의 C4' 및/또는 C1'에 부착된 수소는 2' 변형에 대해 기재된 것과 같은 대체물로 대체될 수 있다. 일 예에서, 본 발명에 포함되는 핵산 분자는 2'-플루오로 변형된 리보뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 2'-플루오로 리보뉴클레오타이드는 센스 및 안티센스 가닥이다. 더욱 바람직하게는, 2'-플루오로 리보뉴클레오타이드는 모든 우리딘 및 사이티딘이다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 핵산 분자의 뉴클레오사이드간 연결기는 변형된다.
뉴클레오사이드간 연결 변형은 센스 가닥, 안티센스 가닥 내 또는 센스 및 안티센스 가닥 내에 있을 수 있다. 용어 "뉴클레오사이드간 연결기(internucleoside linkage group)"는 예컨대 DNA 잔기 사이, RNA 잔기 사이, DNA와 RNA 잔기 및 뉴클레오타이드 유사체 사이, 2개의 비-LNA 잔기 사이, 비-LNA 잔기와 LNA 잔기 사이 및 2개의 LNA 잔기 사이 등에서 2개의 핵 염기를 함께 공유 결합할 수 있는 기를 의미하는 것으로 의도된다. 자연적 표준 연결은 -O-P(O)2―O-(5'에서 3' 말단)으로 이루어지는 포스포다이에스터 연결(PO 연결)이되, 데옥시리보스/리보스 당은 3'-하이드록실 및 5'-하이드록실기 모두에서 "포스포다이에스터" 결합/링커로도 알려진 에스터 연결에서 포스페이트기에 연결된다. 링커는 연결 산소(즉, 포스페이트를 뉴클레오사이드에 연결하는 산소), 질소(브리지된 포스포로아미데이트), 황(브리지된 포스포로티오에이트) 및 탄소(브리지된 메틸렌포스포네이트)로 하나 또는 둘 모두의 대체에 의해 변형될 수 있다. 일부 실시형태에서, 포스페이트 링커 모이어티는 비인계 함유 링커, 예를 들어 데포스포-링커에 의해 대체될 수 있다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 하전된 포스포다이에스터기는 핵산분해성 분해에서 반응의 중심이기 때문에, 중성 구조적 모의체로의 대체는 향상된 뉴클레이스 안정성을 부여해야 한다고 여겨진다. 포스페이트 링커를 대체할 수 있는 모이어티의 예는 아마이드(예를 들어 아마이드-3(3'-CH2―C(-O)―N(H)-5') 및 아마이드-4(3'-CH2―N(H)―C(-O)-5')), 하이드록실아미노, 실록산(다이알킬실록산), 카복사미드, 카보네이트, 카복시메틸, 카바메이트, 카복실레이트 에스터, 티오에터, 에틸렌 옥사이드 링커, 설파이드, 설포네이트, 설폰아마이드, 설포네이트 에스터, 티오폼아세탈(3'-S―CH2―O-5'), 폼아세탈(3'-O―CH2―O-5'), 옥심, 메틸렌이미노, 메틸렌카보닐아미노, 메틸렌메틸이미노(MMI, 3'-CH2―N(CH3)―O-5'), 메틸렌하이드라조, 메틸렌다이메틸하이드라조, 메틸렌옥시메틸이미노, 에터(C3'-O―C5'), 티오에터(C3'-S―C5'), 티오아세트아미도(C3'-N(H)―C(-O)―CH2―S―C5', C3'-O―P(O)―O―SS―C5', C3'-CH2―NH―NH―C5', 3'―NHP(O)(OCH3)―O-5' 및 3'―NHP(O)(OCH3)―O-5' 및 혼합된 N, O, S 및 CH2 성분 부분을 함유하는 비이온성 연결을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 연결의 변형은 대체되거나 변형된 하나의 포스페이트의 산소 원자 중 적어도 하나를 더 포함한다. 일부 양태에서, 포스페이트 링커 상의 비-연결 포스페이트 산소 중 하나 또는 둘 다가 변형되거나 대체될 수 있다. 변형된 포스페이트는 포스포노카복실레이트(비-연결 산소 원자 중 하나가 카복실산으로 대체/변형됨)(예를 들어, 포스포아세테이트, 포스포노폼산, 포스포라미데이트); 포스포로티오에이트(―O―P(O,S)―O―, ―O―P(S)2―O―); 메틸포스포네이트(―O―P(OCH3)―O―) 및 알킬 또는 아릴 포스포네이트를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 본 명세서에서 논의된 바와 같이, 본 발명에 포함되는 siRNA 분자에서 2개의 연속적인 모노머 사이의 하나 이상의 연결 원자가 변형된다. 이러한 연결의 예시적 예는 ―CH2―CH2―CH2―, ―CH2―CO―CH2―, ―CH2―CHOH―CH2―, ―O―CH2―O―, ―O―CH2―CH2―, ―O―CH2―CH-, ―CH2―CH2―O―, ―NRH―CH2―CH2―, ―CH2―CH2―NRH―, ―CH2―NRH―CH2―, ―O―CH2―CH2―NRH―, ―NRH―CO―O―, ―NRH―CO―NRH―, ―NRH―CS―NRH―, ―NRH C(-NRH)―NRH―, ―NRH―CO―CH2―NRH―, ―O―CO―O―, ―O―CO―CH2―O―, ―O―CH2―CO―O―, ―CH2―CO―NRH―, ―O―CO―NRH―, ―NRH―CO―CH2―, ―O―CH2―CO―NRH―, ―O―CH2―CH2―NRH―, ―CH-N―O―, ―CH2―NRH O―, ―CH2―O―N-, ―S―P(O)2―O―, ―S―P(O,S)―O―, ―S―P(S)2―O―, ―O―P(O)2―S―, ―O―P(O,S)―S―, ―S―P(O)2―S―, ―O―PO(RH)―O―, ―O―PO(NRH)―O―, ―O―PO(OCH2CH2S―R)―O―, ―O―PO(BH3)―O―, ―O―PO(NHRH)―O―, ―O―P(O)2―NRH―, ―NRH―P(O)2―O―, ―NR"―O―, ―NRH―CO―NRH―, ―O―CO―O―, ―O―CO―NRH―, ―NRH―CO―CH2―, ―O―CH2―CO―NRH―, ―O―CH2―CH2―NRH―, ―CO―NRH―CH2―, ―CH2―NRH―CO―, ―O―CH2―CH2―S―, ―S―CH2―CH2―O―, ―S―CH2―CH2―S―, ―CH2―SO2―CH2―, ―CH2―CO―NRH―, ―O―CH2―CH2―NRH―CO―, ―CH2―NCH3―O―CH2―, ―S―CH2―CH-, ―O―PO(OCH2CH3)―O―, ―O―PO(OCH2CH2S―R)―O―, ―O―PO(BH3)―O―, ―CH2―S―CH2―, ―CH2―SO―CH2―, ―CH2―SO2―CH2―, ―O―SO―O―, ―O―S(O)2―O―, ―O―S(O)2―CH2―, ―O―S(O)2―NRH―, ―NRH―S(O)2―CH2―, ―O―S(O)2―CH2―, ―O―P(O)2―O―, ―O―P(O,S)―O―, ―O―P(S)2―O―, ―O―P(O,NRH)―O―, ―O―PO(R")―O―, ―O―PO(CH3)―O― 및 ―O―PO(NHRN)―O―이되, RH는 수소 및 C1-4-알킬로부터 선택된다.
본 발명에 포함되는 맥락에서, 바람직한 예는 포스페이트, 포스포다이에스터(PO) 연결 및 포스포로티오에이트(PS) 연결을 포함한다. 포스포로다이티오에이트는 황으로 대체된 비-브리징 산소를 모두 가지고 있다. 포스포로다이티오에이트에서 인 중심은 올리고뉴클레오타이드 부분입체이성질체의 형성을 배제하는 아카이랄이다. 따라서, 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 카이랄 중심을 제거하는 두 비-연결 산소에 대한 변형, 예를 들어 포스포로다이티오에이트 형성은 부분입체이성질체 혼합물을 생성할 수 없다는 점에서 바람직할 수 있다. 따라서, 비-연결 산소는 독립적으로 O, S, Se, B, C, H, N 또는 OR(R은 알킬 또는 아릴임) 중 임의의 하나일 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 핵산 분자는 하나 이상의 포스포로티오에이트 연결을 함유할 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드는 부분적으로 포스포로티오에이트-연결될 수 있으며, 예를 들어 포스포로티오에이트 연결은 포스포다이에스터 연결로 대체될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 완전히 포스포로티오에이트-연결된다. 다른 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 1 내지 7개, 1 내지 5개 또는 1 내지 3개의 포스포다이에스터 결합을 갖는다. 포스포로티오에이트 연결은 올리고뉴클레오타이드가 뉴클레이스 절단에 더 저항성을 갖도록 하기 위해 사용되었다. 정상적인 5'-3' 연결 외에도, 변형된 올리고뉴클레오타이드는 5'-2' 연결을 가질 수 있으며, 인접하는 뉴클레오사이드 단위의 쌍이 3'-5'에서 5'-3' 또는 2'-5'에서 5'-2'로 연결된 역 극성을 가진다. 뉴클레오사이드간 연결기의 변형을 교시하는 대표적인 미국 특허는 미국 특허 제5,519,126호; 제5,536,821호; 제5,541,306호; 제5,550,111호; 제5,563,253호; 제5,571,799호; 제5,587,361호; 제5,625,050호; 제5,378,825호; 제5,697,248호 및 제7,368,439호를 포함한다. 뉴클레오사이드간 연결 변형을 교시하는 다른 참조는 문헌[Mesmaeker et al. (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5:343-355; Freier and Altmann (1997) Nucl. Acids Res. 25:4429-4443; 및 Micklefield (2001) Curr. Med. Chem. 8:1157-1179]을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 핵산 분자는 하나 이상의 골격-변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
골격-변형된 뉴클레오타이드는 센스 가닥, 안티센스 가닥 내에 또는 센스 및 안티센스 가닥 내에 있다. 본 명세서에 사용되는 정상의 "골격"은 DNA 또는 RNA 분자에서 반복되는 교대 당-포스페이트 서열을 지칭한다. 자연 발생적 DNA 및 RNA 분자에서, 핵산 분자의 골격은 3'-하이드록실 및 5'-하이드록실기 모두에서 에스터 연결(즉, PO 연결)의 포스페이트기에 연결된 데옥시리보스/리보스 당을 포함한다. 천연의 포스포다이에스터 결합은 아마이드 결합으로 대체될 수 있지만, 두 당 단위 사이에 있는 4개의 원자는 유지된다. 이러한 아마이드 변형은 miRNA 보체로 형성된 듀플렉스의 열역학적 안정성을 증가시킬 수 있다(예를 들어, 문헌[Mesmaeker et al. (1997) Pure Appl. Chem. 3:437-440] 참조). 일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 핵산 분자는 서열에서 비-잠금 뉴클레오타이드에 대한 화학적 변형, 예컨대 2'하이드록실에 대한 2' 변형을 함유할 수 있다. 예를 들어, siRNA 분자에 2'-위치 변형된 뉴클레오타이드의 혼입은 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레이스에 대한 저항성과 상보적 표적에 대한 이들의 열적 안정성을 모두 증가시킬 수 있다. 2' 위치에서의 다양한 변형은 표적과의 분자 상호작용 또는 세포 기구를 손상시키지 않고 증가된 뉴클레이스 저항성을 제공하는 것들로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 이러한 변형은 시험관내 또는 생체내에서 이들의 증가된 효능을 기준으로 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 2' 변형은 다수의 상이한 "옥시" 또는 "데옥시" 치환기로부터 독립적으로 선택될 수 있다. "옥시"-2' 하이드록실기 변형의 예는 알콕시 또는 아릴옥시(예를 들어, O메틸, R-H, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴 또는 당; 폴리에틸렌글리콜(PEG), O(CH2CH2O)nCH2CH2OR(n=1 내지 50); O-아민 또는 O―(CH2)n아민(n=1 내지 10), 아민=NH2; 알킬아미노, 다이알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 다이아릴 아미노, 헤테로아릴 아미노, 다이헤테로아릴 아미노, 에틸렌 다이아민또는 폴리아미노; 및 O―CH2CH2(NCH2CH2NMe2)2)를 포함한다. "데옥시" 변형은 수소(즉, 단일-가닥 오버행과 특히 관련이 있는 데옥시리보스 당); 할로(예를 들어, 플루오로); 아미노(예를 들어, NH2; 알킬아미노, 다이알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 다이아릴 아미노, 헤테로아릴 아미노, 다이헤테로아릴 아미노 또는 아미노산; NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-아민(아민=NH2; 알킬아미노, 다이알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 다이아릴 아미노, 헤테로아릴 아미노 또는 다이헤테로아릴 아미노; ―NHC(O)R(R=알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴 또는 당); 사이아노; 머캅토; 알킬-티오-알킬; 티오알콕시; 티오알킬; 알킬; 사이클로알킬; 아릴; 알켄일 및 알킨일을 포함한다.
실질적으로 모든, 또는 모든, 비-잠금 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 2' 위치가 변형된 소정의 실시형태에서 변형될 수 있다. 예를 들어, 2' 변형은 각각 O-메틸 및 플루오로로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 예시적 실시형태에서, 퓨린 뉴클레오타이드는 각각 2' O-메틸을 갖고, 피롤리딘 뉴클레오타이드는 각각 2'-F를 갖는다. 본 발명에 따르면, 2' 위치 변형은 또한 작은 탄화수소 치환기를 포함할 수 있다. 탄화수소 치환기는 알킬, 알켄일, 알킨일 및 알콕시알킬을 포함하되, 알킬(알콕시의 알킬 부분을 포함함), 알킬 및 알킬은 치환 또는 비치환될 수 있다. 알킬, 알켄일 및 알킨일은 C1 내지 C10 알킬, 알켄일 또는 알킨일, 예컨대 C1, C2 또는 C3일 수 있다. 탄화수소 치환기는 1개 또는 2개 또는 3개의 비-탄소 원자를 포함할 수 있으며, 이는 N, O 및/또는 S로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 2' 변형은 O-알킬, O-알켄일 및 O-알킨일로서 알킬, 알켄일 및 알킨일을 더 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 예시적 2' 변형은 2'-H, 2'-O-알킬(C1-3알킬, 예컨대 2'O-메틸 또는 2'OEt), 2'-O-메톡시에틸(2'-O-MOE), 2'-O-아미노프로필(2'-O-AP), 2'-O-다이메틸아미노에틸(2'-O-DMAOE), 2'-O-다이메틸아미노프로필(2'-O-DMAP), 2'-O-다이메틸아미노에틸옥시에틸(2'-O-DMAEOE), 2'-O-N-메틸아세트아미도(2'-O-NMA) 또는 같은 자리(gem) 2'-OMe/2'F 치환을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 핵산 분자는 비-잠금 뉴클레오타이드에서 2'O-메톡시(2'-OMe)로 변형된 적어도 하나의 2' 위치를 함유한다. 올리고뉴클레오타이드는 1 내지 약 5개의 2'-O-메톡시(2'-OMe) 변형된 뉴클레오타이드, 또는 1 내지 약 3개의 2'-O-메톡시(2'-OMe) 변형된 뉴클레오타이드를 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, miR-124 모의체의 모든 뉴클레오타이드는 2'-O-메톡시(2'-OMe) 변형을 함유한다. 상이한 유형의 2' 위치 변형의 다른 예시적 조합은 적어도 하나의 2'-할로 변형(예를 들어, 2' 하이드록실 대신), 예컨대 2'-플루오로, 2'-클로로, 2'-브로모 및 2'-아이오도를 함유할 수 있다.
일부 실시형태에서, 포스페이트 링커 및 리보스 당이 뉴클레이스 저항성 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드 대용물로 대체된 가닥 또는 핵산 분자의 가닥의 골격이 구축될 수 있다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 반복적으로 하전된 골격의 부재는 다가 음이온(예를 들어, 뉴클레이스)을 인식하는 단백질에 대한 결합을 감소시키는 것으로 여겨진다. 비-제한적 예로서, 이러한 뉴클레오타이드 대용물은 모폴리노, 사이클로뷰틸, 피롤리딘, 펩타이드 핵산(PNA), 아미노에틸글리실 PNA(Aegina) 및 골격-확장된 피리미딘 PNA(bepPNA) 뉴클레오사이드 대용물(예를 들어, 미국 특허 제5,359,044호; 제5,519,134호; 제5,142,047호 및 제5,235,033호; 문헌[Bioorganic & Medicinal Chemistry (1996), 4:5-23])을 포함한다. 당-포스페이트 골격의 대체를 위한 대용물은 PNA 대용물(펩타이드 핵산)을 포함한다. 용어 "펩타이드 핵산(PNA)"은 골격이 펩타이드 결합에 의해 연결된 반복되는 N-(2-아미노에틸)-글리신(AEG) 단위로 구성되는, DNA 및 RNA와 유사한 화학적으로 합성된 중합체이다(문헌[Nielsen et al. (1991) Science 254:1497-1500]). PNA를 갖는 합성 올리고뉴클레오타이드는 상보적 DNA 또는 RNA에 대한 결합에서 높은 결합 강도 및 더 큰 특이성을 가지며, 유사한 DNA/RNA 듀플렉스보다 PNA/DNA 염기 불일치가 더 바람직하다. PNA는 뉴클레이스 또는 프로테이스에 의해 쉽게 인식되지 않으므로, 효소 분해에 저항성이 있이 있다. PNA는 또한 넓은 pH 범위에서도 안정적이다. PNA는 여러 연구에서 안티센스 및 항-유전자 요법에 사용하도록 제안되었다. PNA는 DNase 및 프로테이스에 저항성이 있으며, 증가된 세포 투과성 등을 위해 더 변형될 수 있다.
PNA는 예를 들어, 전사 또는 번역 중지를 유도하거나 또는 복제를 저해함으로써 유전자 발현의 서열-특이적 조절을 위한 안티센스 또는 항유전자 작용제로서 사용될 수 있다. PNA는 또한 예를 들어, PNA 지정 PCR 클램핑에 의한 유전자에서의 단일 염기쌍 돌연변이의 분석에서; 다른 효소, 예를 들어 S1 뉴클레이스와 조합하여 사용될 때 인공 제한 효소로서(문헌[Hyrup et al. (1996) Bioorg. Med. Chem. 4:5-23]); DNA 서열 및 혼성화를 위한 프로브 또는 프라이머로서(문헌[Perry-O'Keefe et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:14670-14675]) 사용될 수 있다.
다른 실시형태에서, PNA는 예를 들어, 이들의 안정성 또는 세포 흡수를 향상시키기 위해, 친유성 또는 다른 헬퍼기를 PNA에 부착함으로써, PNA-DNA 키메라의 형성에 의해, 또는 리포솜 또는 당업계에 공지되어 있는 약물 전달의 다른 기법의 사용에 의해 변형될 수 있다. 예를 들어, PNA 및 DNA의 유리한 특성을 조합할 수 있는 PNA-DNA 키메라가 생성될 수 있다. 이러한 키메라는 DNA 인식 효소, 예를 들어, RNASE H 및 DNA 폴리머레이스가 DNA 부분과 상호작용하도록 허용하는 반면, PNA 부분은 높은 결합 친화성 및 특이성을 제공할 수 있다. PNA-DNA 키메라는 염기 스태킹, 핵 염기 사이의 결합의 수 및 배향의 측면에서 선택된 적절한 길이의 링커를 사용하여 연결될 수 있다(문헌[Hyrup et al. (1996) Bioorg. Med. Chem. 4:5-23]). PNA-DNA 키메라의 합성은 문헌[Hyrup et al. (1996) Bioorg. Med. Chem. 4:5-23 및 Finn et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24:3357-3363]에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 예를 들어, DN사슬은 표준 포스포아미다이트 커플링 화학 및 변형된 뉴클레오사이드 유사체를 사용하여 고체 지지체에서 합성될 수 있다. 5'-(4-메톡시트라이틸)아미노-5'-데옥시-티미딘 포스포아미다이트와 같은 화합물은 PNA와 DNA의 5' 말단 사이의 연결로서 사용될 수 있다(문헌[Mag et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:5973-5988]). 그런 다음, PN모노머는 단계적인 방식으로 커플링되어 5' PNA 세그먼트 및 3' DNA 세그먼트를 갖는 키메라 분자를 생성한다(문헌[Finn et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24:3357-3363]). 대안적으로, 키메라 분자는 5' DNA 세그먼트 및 3' PNA 세그먼트로 합성될 수 있다(문헌[Peterser et al. (1975) Bioorganic Med. Chem. Lett. 5:1119-11124]).
본 발명에 포함되는 핵산 분자는 또한 추가적인 변형, 예컨대 불일치, 돌출 또는 가교결합을 함유할 수 있다. 유사하게는, 이들은 또한 다른 접합체, 예컨대 링커, 헤테로기능적 가교 링커, 덴드리머, 나노-입자, 펩타이드 유기 화합물(예를 들어, 형광 염료) 및/또는 광절단성 화합물을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 핵산 분자는 본 명세서에 기재된 바와 같은 2개 이상의 변형의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 핵산 서열은 독립적으로 하나 이상의 당 모이어티, 하나 이상의 뉴클레오사이드간 연결 및/또는 하나 이상의 핵 염기에 대한 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 본 명세서에 개시된 바와 같이, 이러한 서열은 화학적 변형의 임의의 조합으로 변형될 수 있다.
일부 실시형태에서, 핵산 분자는 핵산 서열을 포함하는 siRNA이되, 센스 가닥 및 안티-센스 가닥은 하나 이상의 불일치, 예를 들어 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의 불일치를 포함한다. 용어 "불일치"는 예를 들어, 정상적인 상보적 G:C, A:T 또는 A:U 염기쌍이 아닌 비-상보적 염기로 이루어진 염기쌍을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 siRNA 분자의 안티센스 가닥 및 표적 mRNA 서열은 하나 이상의 불일치, 예를 들어 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의 불일치를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 불일치는 안티센스 가닥을 참조하는 절단 부위의 하류일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 불일치는 안티센스 가닥의 3' 말단으로부터 1 내지 6개의 뉴클레오타이드 내에 존재할 수 있다. 다른 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 siRNA 분자는 돌출(bulge), 예를 들어, 듀플렉스 siRNA에서 하나 이상의, 예를 들어 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의 쌍을 형성하지 않은 염기를 포함한다. 바람직하게는, 돌출은 센스 가닥에 있을 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 siRNA 분자는 하나 이상의(예를 들어, 약 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상) 가교결합, 예를 들어 센스 가닥이 siRNA 듀플렉스의 안티센스 가닥에 가교결합되는 가교결합을 포함한다. 본 발명에 유용한 가교 링커는 소랄렌, 미토마이신 C, 시스플라틴, 클로로에틸나이트로소우레아 등을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 당업계에 통상적으로 공지된 것들이다. 바람직하게는, 가교결합은 안티센스 가닥을 참조하는 절단 부위의 하류에 존재하며, 더욱 바람직하게는, 가교결합은 센스 가닥의 5' 말단에 존재한다. 본 발명에 따르면, 단일 가교결합을 갖는 siRN유도체(예를 들어, 소랄렌 가교결합), 광절단성 바이오틴을 갖는 siRNA(예를 들어, 광절단성 바이오틴), 펩타이드(예를 들어, Tat 펩타이드), 나노입자, 펩타이도모방체 유기 화합물(예를 들어, 형광 염료와 같은 염료) 또는 덴드리머와 같은 siRN유도체 또한 포함된다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 핵산 분자는 다른 추가된 그룹, 예컨대 펩타이드(예를 들어, 생체내에서 숙주 세포 수용체를 표적화 하기 위한 것) 또는 세포 막(예를 들어, 문헌[Letsinger et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:6553-6556; Lemaitre et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:648-652]; PCT 특허 공개 WO 88/09810 참조) 또는 혈액-뇌 장벽(예를 들어, PCT 공개 WO 89/10134 참조)을 통한 수송을 촉진하는 작용제를 포함할 수 있다. 또한, 핵산 분자는 혼성화-촉발성 절단 작용제(예를 들어, 문헌[Krol et al. (1988) BioTechniques 6:958-976] 참조) 또는 삽입성 작용제(예를 들어, 문헌[Zon (1988) Pharm. Res. 5:539-549] 참조)로 변형될 수 있다.
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k. 벡터 및 다른 핵산 비히클
본 발명에 따르면, 핵산 분자 및 이의 변이체는 직접 합성 및 유전자 재조합 기법과 같은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 생산될 수 있다. 핵산 분자는 순수한 핵산 분자, 플라스미드, DNA 벡터, RNA 벡터, 바이러스 벡터 및 입자와 같은 임의의 형태로 존재할 수 있다. 용어 "벡터"는 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 본 발명에 포함되는 벡터는 또한 패키징된 폴리뉴클레오타이드를 세포, 국소 조직 부위 또는 대상체에 전달하는데 사용될 수 있다.
벡터의 한 유형은 추가적인 핵산 세그먼트가 결찰될 수 있는 원형의 이중 가닥 DNA 루프를 지칭하는 "플라스미드"이다. 벡터의 다른 유형은 추가적인 DNA 세그먼트가 바이러스 게놈에 결찰될 수 있는 "바이러스 벡터"이다. 바이러스 핵산 전달 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 단순 포진 바이러스 및 이들의 변이체를 포함하는 임의의 종류일 수 있다. 바이러스 벡터 기술은 잘 알려져 있으며, 문헌[Sambrook et al. (2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (4th Ed.), New York)]에 기재되어 있다.
소정의 벡터는 도입된 숙주 세포에서 자율 복제할 수 있다(예를 들어, 세균성 복제 기점을 갖는 세균성 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터(예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포로 도입시 숙주 세포의 게놈에 혼입되고, 이에 따라 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 소정의 벡터, 즉 발현 벡터는 이들이 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 일반적으로, 재조합 DNA 기법에 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드(벡터)의 형태이다. 그러나, 본 발명은 동등한 기능을 수행하는 바이러스 벡터(예를 들어, 복제 결함이 있는 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)와 같은 이러한 다른 형태의 발현 벡터를 포함하는 것으로 의도된다.
본 발명에 포함되는 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 핵산의 발현에 적합한 형태로 본 발명에 포함되는 핵산을 포함한다. 이는 재조합 발현 벡터가 발현에 사용되는 숙주 세포를 기준으로 선택된 하나 이상의 조절 서열을 포함하고, 발현될 핵산 서열에 작동 가능하게 연결됨을 의미한다. 재조합 발현 벡터 내에서, "작동 가능하게 연결된"은 관심있는 뉴클레오타이드 서열이 뉴클레오타이드 서열의 발현을 가능하게 하는 방식으로 조절 서열(들)에 연결되어 있음을 의미하는 것으로 의도된다(예를 들어, 벡터가 숙주 세포로 도입될 때 시험관내 전사/번역 시스템 또는 숙주 세포에서). 용어 "조절 서열"은 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 대조군 요소(예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 조절 서열은 예를 들어, 문헌[Goeddel, Methods in Enzymology: Gene Expression Technology vol.185, Academic Press, 캘리포니아주 샌디에고 (1991)]에 기재되어 있다. 조절 서열은 많은 유형의 숙주 세포에서 뉴클레오타이드 서열의 구성적 발현을 지시하는 것과 소정의 숙주 세포에서만 뉴클레오타이드 서열의 발현을 지시하는 것(예를 들어, 조직-특이적 조절 서열)을 포함한다. 발현 벡터의 설계는 형질전환될 숙주 세포의 선택, 목적하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 이러한 인자에 의존할 수 있음은 당업자에 의해 이해될 것이다. 본 발명에 포함되는 발현 벡터는 본 명세서에 기재된 핵산에 의해 암호화된 융합 단백질 또는 펩타이드를 포함하는 단백질 또는 펩타이드를 생산하기 위해 숙주 세포에 도입될 수 있다. 예를 들어, 일반적으로, 벡터는 적어도 하나의 유기체에서 기능하는 복제 기점, 프로모터 서열 및 편리한 제한 엔도뉴클레이스 부위, 및 하나 이상의 선별 마커, 예를 들어 약물 저항성 유전자를 함유한다. 벡터는 본 발명에 포함되는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 천연형 또는 비-천연형 프로모터를 포함할 수 있다. 선택된 프로모터는 강한, 약한, 구성적, 유도성, 조직 특이적, 발달 단계-특이적 및/또는 유기체 특이적일 수 있다. 일부 실시형태에서, 벡터는 벡터가 도입될 숙주 세포의 유형에 특이적인 조절 서열, 예컨대 인핸서, 전사 및 번역 개시 및 종결 코돈을 포함할 수 있다.
본 발명에 따라 사용하기위한 재조합 발현 벡터는 원핵세포(예를 들어, 대장균) 또는 진핵세포(예를 들어, 곤충 세포, 예컨대 바큘로바이러스 발현 벡터를 사용, 효모 세포 또는 포유동물 세포)에서 본 발명에 포함되는 바이오마커에 상응하는 폴리펩타이드의 발현을 위해 설계될 수 있다. 적합한 숙주 세포는 위의 문헌[Goeddel]에서 추가로 논의된다. 대안적으로, 재조합 발현 벡터는 예를 들어 T7 프로모터 조절 서열 및 T7 폴리머레이스를 사용하여 시험관내에서 전사되고 번역될 수 있다.
원핵생물에서 단백질의 발현은 융합 또는 비-융합 단백질의 발현을 지시하는 구성적 또는 유도성 프로모터를 함유하는 벡터를 사용하여 대장균에서 가장 자주 수행된다. 융합 벡터는 일반적으로 재조합 단백질의 아미노 말단에 암호화된 단백질에 여러 아미노산을 추가한다. 이러한 융합 벡터는 전형적으로 다음의 세 가지 목적을 수행한다: 1) 재조합 단백질의 발현 증가; 2) 재조합 단백질의 용해도 증가; 및 3) 친화성 정제에서 리간드로 작용하여 재조합 단백질의 정제를 도움. 종종, 융합 발현 벡터에서, 융합 단백질의 정제 후에 융합 모이어티로부터 재조합 단백질의 분리를 가능하게 하기 위해 융합 모이어티 및 재조합 단백질의 연결지점에 단백질 가수분해성 절단 부위가 도입된다. 이러한 효소 및 이들의 동족 인식 서열은 인자 Xa, 트롬빈 및 엔테로카이네이스를 포함한다. 전형적 융합 발현 벡터는 pGEX(파마시아 바이오테크 인코포레이션(Pharmacia Biotech Inc); 문헌[Smith and Johnson (1988) Gene 67:31-40]), pMAL(뉴 잉글랜드 바이오랩(New England Biolabs), 매사추세츠주 비벌리) 및 pRIT5(파마시아(Pharmacia), 뉴저지주 피스카타웨이)를 포함하며, 이들은 글루타티온 S-트랜스퍼레이스(GST), 말토스E 결합 단백질 또는 단백질 A를 각각 표적 재조합 단백질로 융합한다.
대표적인, 적합한 유도성 비-융합 대장균 발현 벡터의 비-제한적 예는 pTrc(문헌[Amann et al. (1988) Gene 69:301-315]) 및 pET 11d(문헌[Studier et al. (1991) Meth. Enzymol. 185:60-89])를 포함한다. pTrc 벡터로부터의 표적 바이오마커 핵산 발현은 하이브리드 trp-lac 융합 프로모터로부터의 숙주 RNA 폴리머레이스 전사에 의존한다. pET 11d 벡터 로부터의 표적 바이오마커 핵산 발현은 공동 발현된 바이러스 RNA 폴리머레이스(T7 gn1)에 의해 매개되는 T7 gn10-lac 융합 프로모터의 전사에 의존한다. 이러한 바이러스 폴리머레이스는 lacUV 5 프로모터의 전사 제어하에 T7 gn1 유전자를 보유하는 상주 프로파지로부터 숙주 균주 BL21(DE3) 또는 HMS174(DE3)에 의해 공급된다.
대장균에서 재조합 단백질 발현을 최대화시키기 위한 한 가지 전략은 재조합 단백질을 단백질 가수분해성으로 절단하는 능력이 손상된 숙주 박테리아에서 단백질을 발현하는 것이다(문헌[Gottesman (1990) Meth. Enzymol. 185:119-128]). 또 다른 전략은 발현 벡터에 삽입될 핵산의 핵산 서열을 변경하여 각각의 아미노산에 대한 개별 코돈이 대장균에서 우선적으로 사용되는 코돈이 되도록 하는 것이다(문헌[Wada et al., (1992) Nucleic Acids Res. 20:2111-2118]). 본 발명에 포함되는 핵산 서열의 이러한 변경은 표준 DNA 합성 기법에 의해 수행될 수 있다.
일부 실시형태에서, 발현 벡터는 효모 발현 벡터이다. 효모 에스. 세레비지애(S. cerevisiae)에서의 발현을 위한 벡터의 예는 pYepSec1(문헌[Baldari et al. (1987) EMBO J. 6:229-234]), pMFa(문헌[Kurjan and Herskowitz (1982) Cell 30:933-943]), pJRY88(문헌[Schultz et al. (1987) Gene 54:113-123]), pYES2(인비트로젠 코포레이션(Invitrogen Corporation), 캘리포니아주 샌디에고) 및 pPicZ(인비트로젠 코포레이션, 캘리포니아주 샌디에고)를 포함한다.
대안적으로, 발현 벡터는 바큘로바이러스 발현 벡터이다. 배양된 곤충 세포(예를 들어, Sf 9 세포)에서의 단백질의 발현에 이용 가능한 바큘로바이러스 벡터는 pAc 시리즈(문헌[Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165]) 및 pVL 시리즈(문헌[Lucklow and Summers (1989) Virology 170:31-39])를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 핵산은 포유동물 발현 벡터를 사용하여 포유동물 세포에서 발현된다. 포유동물 발현 벡터의 예는 pCDM8(문헌[Seed (1987) Nature 329:840]) 및 pMT2PC(문헌[Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6:187-195])를 포함한다. 포유동물 세포에서 사용되는 경우, 발현 벡터의 제어 기능은 종종 바이러스 조절 요소에 의해 제공된다. 예를 들어, 일반적으로 사용되는 프로모터는 폴리오마, 아데노바이러스 2, 사이토메갈로바이러스 및 시미안 바이러스 40으로부터 유래된다. 원핵세포 및 진핵세포 둘 다에 적합한 다른 적합한 발현 시스템의 경우, 위의 문헌[Sambrook et al]의 챕터 16과 17을 참조.
일부 실시형태에서, 재조합 포유동물 발현 벡터는 특정 세포 유형에 우선적으로 핵산의 발현을 지시할 수 있다(예를 들어, 조직-특이적 조절 요소가 핵산을 발현하는데 사용됨). 조직-특이적 조절 요소는 당업계에 공지되어 있다. 적합한 조직-특이적 프로모터의 비-제한적 예는 알부민 프로모터(간-특이적; 문헌[Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1:268-277]), 림프성-특이적 프로모터(문헌[Calame and Eaton (1988) Adv. Immunol. 43:235-275]), T 세포 수용체의 특정 프로모터(문헌[Winoto and Baltimore (1989) EMBO J. 8:729-733]) 및 면역글로불린(문헌[Banerji et al. (1983) Cell 33:729-740; Queen and Baltimore (1983) Cell 33:741-748]), 뉴런-특이적 프로모터(예를 들어, 뉴로필라멘트 프로모터; 문헌[Byrne and Ruddle (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:5473-5477]), 췌장-특이적 프로모터(문헌[Edlund et al. (1985) Science 230:912-916]) 및 유선-특이적 프로모터(예를 들어, 우유 유장 프로모터; 미국 특허 제4,873,316호 및 유럽 출원 공개 제264,166호)를 포함한다. 발달적으로-조절된 프로모터, 예를 들어 뮤린 혹스 프로모터(문헌[Kessel and Gruss (1990) Science 249:374-379]) 및 α-태아단백질 프로모터(문헌[Camper and Tilghman (1989) Genes Dev. 3:537-546]) 또한 포함된다.
본 발명은 또한 아래에 추가로 기재되는 바와 같이 안티센스 핵산을 발현하기 위한 재조합 발현 벡터를 제공한다. 예를 들어, DNA 분자는 본 발명에 포함되는 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA에 대한 안티센스인 RNA 분자의 발현(DNA 분자의 전사에 의해)을 허용하는 방식으로 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 다양한 세포 유형, 예를 들어 바이러스 프로모터 및/또는 인핸서에서 안티센스 RNA 분자의 연속적 발현을 지시하는 안티센스 배향으로 클로닝된 핵산에 작동 가능하게 연결된 조절 서열이 선택될 수 있거나, 또는 안티센스 RNA의 구성적, 조직-특이적 또는 세포 유형 특이적 발현을 지시하는 조절 서열이 선택될 수 있다. 안티센스 발현 벡터는 안티센스 핵산이 고효율 조절성 영역의 제어하에 생산되며, 그 활성이 벡터가 도입되는 세포 유형에 의해 결정될 수 있는, 재조합 플라스미드, 파지미드 또는 약독화된 바이러스의 형태일 수 있다. 안티센스 유전자를 사용하는 유전자 발현의 조절에 대한 논의의 경우 (문헌[Weintraub et al. (1986) Trends Genet. 1(1)] 참조).
일부 실시형태에서, 레트로바이러스 벡터는 본 발명에 따라 유용하다. 레트로바이러스는 숙주 세포 게놈에 통합되기 전에 바이러스 RNA 게놈의 DNA로의 역전사해야하기 때문에 유명하다. 따라서, 레트로바이러스 벡터의 가장 중요한 특징은 유전 물질을 표적/숙주 세포의 게놈에 영구적으로 통합하는 것이다. 핵산 전달을 위해 가장 일반적으로 사용되는 레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스 비히클/입자이다. 렌티바이러스의 일부 예는 인간 면역결핍 바이러스: HIV-1 및 HIV-2, 시미안 면역결핍 바이러스(Simian Immunodeficiency Virus: SIV), 고양잇과 면역결핍 바이러스(feline immunodeficiency virus: FIV), 소 면역결핍 바이러스(bovine immunodeficiency virus: BIV), 젬브라나병 바이러스(Jembrana Disease Virus: JDV), 말 감염성 빈혈바이러스(equine infectious anemia virus: EIAV), 말 감염성 빈혈바이러스, 비스나/매디 및 산양 관절염 뇌염 바이러스(caprine arthritis encephalitis virus: CAEV)를 포함한다.
전형적으로, 유전자 전달 비히클을 구성하는 렌티바이러스 입자는 자체적으로 복제 결함이 있어서 숙주 세포에서 복제할 수 없고 단 하나의 세포만을 감염시킬 수 있다(또한 "자가-비활성화"라고도 지칭됨). 렌티바이러스는 온전한 숙주 핵 외피를 통한 진입 메커니즘으로 인해 분열 및 비-분열 세포 모두를 감염시킬 수 있다(문헌[Naldini et al. (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9:457-463]). 재조합 렌티바이러스 비히클/입자는 HIV 독성 유전자를 다중으로 약독화시킴으로써 생성되었고, 예를 들어 유전자 Env, Vif, Vpr, Vpu, Nef 및 Tat가 결실되어 벡터가 생물학적으로 안전하다. 상대적으로, 예를 들어 HIV-1/HIV-2로부터 유래된 렌티바이러스 비히클은 이식유전자의 비-분열 세포로의 효율적인 전달, 통합 및 장기 발현을 매개할 수 있다. 용어 "재조합"은 렌티바이러스 서열 및 비-렌티바이러스 레트로바이러스 서열 둘 다를 함유하는 벡터 또는 다른 핵산을 지칭한다. 렌티바이러스 입자는 바이러스 패키징 요소 및 벡터 게놈 자체를 HEK293T 세포, 293G 세포, STAR 세포 및 다른 바이러스 발현 세포주와 같은 생산 세포에서 공동 발현시킴으로써 생성될 수 있다. 이러한 요소는 일반적으로 3개(2세대 렌티바이러스 시스템에서) 또는 4개의 개별 플라스미드(3세대 렌티바이러스 시스템에서)로 제공된다. 생산 세포는 바이러스의 코어(즉, 구조적 단백질)와 효소적 성분을 포함하는 렌티바이러스 성분을 암호화하는 플라스미드, 및 외피 단백질(들)(패키징 시스템으로도 지칭됨) 및 비히클 자체(전달 벡터라고도 지칭됨)인 표적세포로 전달되는 외래 이식유전자를 포함하는 게놈을 암호화하는 플라스미드로 공동 형질감염된다.
재조합 렌티바이러스 벡터의 외피 단백질은 다른 바이러스로부터의 이종성 외피 단백질, 예컨대 수포성 구내염 바이러스의 G 단백질(VSV G) 또는 바큘로바이러스 gp64 외피 단백질일 수 있다. VSV-G 당단백질은 특히 수포성 바이러스 속으로 분류되는 종: 카라자스 바이러스(Carajas virus: CJSV), 찬디푸라 바이러스(Chandipura virus: CHPV), 코칼 바이러스(Chandipura virus: COCV), 이스파한 바이러스(Isfahan virus: ISFV), 마라바 바이러스(Maraba virus: MARAV), 피리 바이러스(Piry virus: PIRYV), 수포성 구내염 알라고아스 바이러스(Vesicular stomatitis Alagoas virus: VSAV), 수포성 구내염 인디안 바이러스(Vesicular stomatitis Indiana virus: VSIV) 및 수포성 구내염 뉴 저지 바이러스(Vesicular stomatitis New Jersey virus: VSNJV) 및/또는 초어 라브도바이러스, BeAn 157575 바이러스(BeAn 157575), 보테케 바이러스(Boteke virus: BTKV), 칼차키 바이러스(Calchaqui virus: CQIV), 엘 바이러스 아메리칸(Eel virus American: EVA), 그레이 로지 바이러스(Gray Lodge virus: GLOV), 쥬론 바이러스(Jurona virus: JURY), 클래머스 바이러스(Klamath virus: KLAV), 콰타 바이러스(Kwatta virus: KWAV), 라 호야 바이러스(La Joya virus: LJV), 말파이스 봄 바이러스(Malpais Spring virus: MSPV), 마운트 엘곤 배트 바이러스(Mount Elgon bat virus: MEBV), 페리넷 바이러스(Perinet virus: PERV), 파이크 플라이 라브도바이러스(Pike fry rhabdovirus: PFRV), 포톤 바이러스(Porton virus: PORV), 라디 바이러스(Radi virus: RADIV), 잉어의 봄 바이러스(Spring viremia of carp virus: SVCV), 투파이아 바이러스(Tupaia virus: TUPV), 궤양성 질환 라브도바이러스(Ulcerative disease rhabdovirus: UDRV) 및 유그 보그다노박 바이러스(Yug Bogdanovac virus: YBV)와 같은 수포성 바이러스 속으로 잠정적으로 분류되는 계통 중에서 선택될 수 있다. gp64 또는 다른 바큘로바이러스 외피 단백질은 오토그라파 캘리포니카 핵다각체병 바이러스(Autographa californica nucleopolyhedrovirus: AcMNPV), 아나그라파 팔시페라 핵다각체병 바이러스, 봄빅스 모리 핵다각체병 바이러스, 코리스토네우라 푸미페라나 핵다각체병 바이러스, 오르기아 슈도추가타 단일 캡시드 핵다각체병 바이러스, 에피피아스 포스트비타나 핵다각체병 바이러스, 하이판트리아 쿠네아 핵다각체병 바이러스, 갈레리아 멜로넬라 핵다각체병 바이러스, 도리 바이러스, 토고토 바이러스, 안테라에아 페미 핵다각체병 바이러스 또는 바트켄 바이러스로부터 유래될 수 있다.
재조합 렌티바이러스 입자를 생성하는 방법은 당업계, 예를 들어 미국 특허 제8,846,385호; 제7,745,179호; 제7,629,153호; 제7,575,924호; 제7,179,903; 및 제6,808,905호에서 논의된다.
사용되는 렌티바이러스 벡터는 pLVX, pLenti, pLenti6, pLJM1, FUGW, pWPXL, pWPI, pLenti CMV puro DEST, pLJM1-EGFP, pULTRA, pInducer20, pHIV-EGFP, pCW57.1, pTRPE, pELPS, pRRL 및 pLionII로부터 선택될 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 당업계에 공지된 렌티바이러스 비히클도 또한 사용될 수 있다(미국 특허 제9,260,725호; 제9,068,199호; 제9,023,646호; 제8,900,858호; 제8,748,169호; 제8,709,799호; 제8,420,104호; 제8,329,462호; 제8,076,106호; 제6,013,516호; 및 제5,994,136호; PCT 공개 WO 2012079000 참조).
5' 또는 3' 말단에 레트로바이러스 LTR(긴-말단 반복체), 레트로바이러스 유출 요소, 선택적으로 렌티바이러스 역 반응 요소(RRE), 프로모터 또는 이의 활성 부분, 및 유전자좌 대조군 영역(locus control region: LCR) 또는 이의 활성 부분을 포함하는 추가적인 요소가 재조합 렌티바이러스 입자에 포함될 수 있다. 다른 요소는 비-분열 세포에서 형질도입 효율을 향상시키는 중앙 폴리퓨린 관(polypurine tract: cPPT) 서열, 이식유전자의 발현을 향상시키고 역가를 증가시키는 우드척 간염 바이러스(Woodchuck Hepatitis: WHP) 전사후 조절 요소(Posttranscriptional Regulatory Element: WPRE)를 포함한다. 효과기 모듈은 벡터에 연결된다. 복합체 HIV-1/2에 기초한 렌티바이러스 벡터 외에도, 단순 감마-레트로바이러스에 기초한 레트로바이러스 벡터가 치료용 핵산을 전달하는데 널리 사용되었으며, 광범위한 세포 유형을 형질도입할 수 있는 임상적으로 가장 효율적이고 및 강력한 핵산 전달 시스템 중 하나로 입증되었다. 감마 레트로바이러스의 예시적 종은 뮤린 백혈병 바이러스(murine leukemia virus: MLV) 및 고양잇과 백혈병 바이러스(feline leukemia virus: FeLV)를 포함한다. 뮤린 백혈병 바이러스(MLV)와 같은 포유동물 감마-레트로바이러스로부터 유래된 감마-레트로바이러스 벡터는 재조합될 수 있다. 감마 레트로바이러스의 MLV 패밀리는 동종숙주형, 양종향성, 이종향성 및 다방향성 서브패밀리를 포함한다. 동종숙주형 바이러스는 mCAT-1 수용체를 사용하는 뮤린 세포만을 감염시킬 수 있다. 동종숙주형 바이러스의 예는 몰로니(Moloney) MLV 및 AKV이다. 양종향성 바이러스는 Pit-2 수용체를 통해 뮤린, 인간 및 다른 종을 감염시킨다. 양종향성 바이러스의 한 예는 4070A 바이러스이다. 이종향성 및 다방향성 바이러스는 동일한(Xpr1) 수용체를 이용하지만, 이들의 종 향성은 상이하다. NZB-9-1과 같은 이종향성 바이러스는 인간과 다른 종을 감염시키지만 뮤린 종은 감염시키지 않는 반면, 초점-형성 바이러스(다방향성 바이러스: MCF)와 같은 다방향성 바이러스는 뮤린, 인간 및 다른 종을 감염시킨다.
감마-레트로바이러스 벡터는 레트로바이러스 구조적 및 효소적(gag-pol) 폴리단백질을 암호화하는 것, 외피(env) 단백질을 암호화하는 것 및 새로 형성된 바이러스 입자에 패키징될 본 발명에 포함되는 조성물을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 mRNA를 암호화하는 것을 포함하는 여러 플라스미드로 공동 형질감염시킴으로써 패키징 세포에서 생산될 수 있다. 재조합 감마-레트로바이러스 벡터는 다른 바이러스로부터의 외피 단백질로 가성형태화(pseudotyped)될 수 있다. 외피 당단백질은 바이러스 입자의 외부 지질층에 통합되어 세포 향성을 증가/변경할 수 있다. 예시적 외피 단백질은 긴팔 원숭이 백혈병 바이러스 외피 단백질(gibbon ape leukemia virus envelope protein: GALV) 또는 수포성 구내염 바이러스 G 단백질(VSV-G) 또는 시미안 내인성 레트로바이러스 외피 단백질 또는 홍역 바이러스 H 및 F 단백질 또는 인간 면역결핍 바이러스 gp120 외피 단백질 또는 코칼 수포성 바이러스 외피 단백질을 포함한다(예를 들어, 미국 공개 제2012/164118호 참조). 다른 실시형태에서, 외피 당단백질은 표적화/결합 리간드를 감마-레트로바이러스 벡터, 펩타이드 리간드, 단일 사슬 항체 및 성장 인자(문헌[Waehler et al. (2007) Nat. Rev. Genet. 8:573-587])를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 결합 리간드로 통합하도록 유전적으로 변형될 수 있다. 이러한 조작된 당단백질은 벡터를 이들의 상응하는 표적 모이어티를 발현하는 세포로 목표 재설정(retarget)할 수 있다. 다른 양태에서, "분자 브리지"는 벡터를 특정 세포로 유도하기 위해 도입될 수 있다. 분자 브리지는 이중 특이성을 가지고 있다: 한쪽 말단은 바이러스 당단백질을 인식할 수 있고, 다른 말단은 표적 세포의 분자 결정기에 결합할 수 있다. 이러한 분자 브리지, 예컨대 리간드-수용체, 아비딘-바이오틴, 화학적 접합, 단일클론 항체 및 조작된 융해성 단백질은 바이러스 벡터를 형질도입을 위해 표적 세포에 부착하도록 지시할 수 있다(문헌[Yang et al. (2008) Biotechnol. Bioeng. 101:357-368; Maetzig et al. (2011) Viruses 3:677-713]). 재조합 감마-레트로바이러스 벡터는 자가-비활성화(자가-불활성화: SIN) 감마레트로바이러스 벡터일 수 있다. 벡터는 복제 기능이 없다. SIN 벡터는 초기에 인핸서/프로모터 활성을 포함하는 3' U3 영역 내에 결실을 보유할 수 있다. 또한, 5' U3 영역은 사이토메갈로바이러스 또는 RSV로부터 유래된 강력한 프로모터(패키징 세포주에 필요함) 또는 선택된 내부 프로모터 및/또는 인핸서 요소로 대체될 수 있다. 내부 프로모터의 선택은 본 발명에 포함되는 특정 목적에 필요한 유전자 발현의 특정 요구를 따라 이루어질 수 있다.
유사하게는, 재조합 아데노-관련 바이러스(recombinant adeno-associated viral: rAAV) 벡터는 본 발명에 포함되는 핵산 분자를 패키징하고 전달하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 벡터 또는 바이러스 입자는 임의의 공지된 혈청형 캡시드 또는 혈청형 캡시드의 조합을 이용하도록 설계될 수 있다. 혈청형 캡시드는 임의의 확인된 AAV 혈청형 및 이의 변이체, 예를 들어 AAV1, AAV2, AAV2G9, AAV3, AAV4, AAV4-4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12 및 AAVrh10(예를 들어, 미국 공개 제20030138772호 참조) 또는 이들의 변이체로부터의 캡시드를 포함할 수 있다. AAV 벡터는 단일 가닥 벡터뿐만 아니라 자가-상보적 AAV 벡터(self-complementary AAV vector: scAAV)를 포함한다. scAAV 벡터는 함께 어닐링하여 이중 가닥 벡터 게놈을 형성하는 DNA를 포함한다. 두 번째 가닥 합성을 생략함으로써, scAAV는 세포에서 빠른 발현을 가능하게 한다. rAAV 벡터는 sf9 곤충 세포에서 또는 HEK293 세포와 같은 인간 세포의 현탁 세포 배양물에서 삼중 형질감염에 의해서와 같은 당업계의 표준 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명에 포함되는 핵산 분자는 AAV 캡시드에 패키징될 하나 이상의 바이러스 게놈에서 암호화될 수 있다. 이러한 벡터 또는 바이러스 게놈은 또한 적어도 1개 또는 2개의 ITR(역 말단 반복체) 외에도, 벡터 또는 바이러스 게놈으로부터의 발현에 필요한 소정의 조절 요소를 포함할 수 있다. 이러한 조절 요소는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 프로모터, 인트론, 스페이서, 스터퍼 서열 등을 포함한다.
또한, 핵산 분자의 비-바이러스성 전달 시스템은 당업계에 잘 알려져 있다. 용어 "비-바이러스성 벡터"는 바이러스 입자를 사용하지 않고 본 발명에 포함되는 핵산 분자를 관심있는 세포로 전달하는 임의의 비히클을 총괄하여 지칭한다. 이러한 비-바이러스성 전달 벡터의 대표적인 예는 벡터 상의 양이온성 부위와 유전자를 구성하는 음으로 하전된 핵산 상의 음이온성 부위 사이의 전기적 상호작용에 기초하여 핵산을 코딩하는 벡터이다. 전달을 위한 일부 예시적 비-바이러스성 벡터는 네이키드(naked) 핵산 전달 시스템, 중합체성 전달 시스템 및 리포솜 전달 시스템을 포함할 수 있다. 양이온성 중합체 및 양이온성 지질은 음이온성 뉴클레오타이드와 쉽게 복합체화될 수 있기 때문에 핵산 전달에 사용된다. 일반적으로 사용되는 중합체는 폴리에틸렌이민, 폴리-L-라이신, 키토산 및 덴드리머를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 양이온성 지질은 1가 양이온성 지질, 다가 양이온성 지질, 구아니딘 함유 지질, 콜레스테롤 유도체 화합물, 양이온성 중합체: 폴리(에틸렌이민)(PEI), 폴리-l-라이신(PLL), 프로타민, 다른 양이온성 중합체 및 지질-중합체 하이브리드를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
벡터 DNA는 종래의 형질전환 또는 형질감염 기법을 통해 원핵세포 또는 진핵세포에 도입될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "형질전환" 및 "형질감염"은 칼슘 포스페이트 또는 칼슘 클로라이드 공침, DEAE-덱스트란-매개성 형질감염, 리포펙션 또는 전기천공을 포함하는, 외래 핵산을 숙주 세포로 도입하기 위한 다양한 당업계에서 인정된 기법을 지칭하는 것으로 의도된다. 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시키는데 적합한 방법은 문헌[Sambrook, et al.](상기) 및 기타 실험실 매뉴얼에서 찾을 수 있다.
포유동물 세포의 안정적인 형질감염을 위해, 사용된 발현 벡터 및 형질감염 기법에 따라, 세포의 작은 분획만이 외래 DNA를 이들의 게놈에 통합할 수 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 통합체를 확인하고 선택하기 위해, 선별 마커(예를 들어, neo, DHFR, Gln 신테테이스, ADA 등과 같은 항생제에 대한 저항성에 대한 것)를 암호화하는 유전자는 일반적으로 관심있는 유전자와 함께 숙주 세포로 도입된다. 바람직한 선별 마커는 G418, 하이그로마이신 및 메토트렉세이트와 같은 약물에 대한 저항성을 부여하는 것들을 포함한다. 도입된 핵산으로 안정적으로 형질 감염된 세포는 약물 선택에 의해 확인될 수 있다(예를 들어, 선별 마커 유전자가 혼입된 세포는 생존하는 반면 다른 세포는 죽을 것임).
따라서, 본 발명은 본 발명에 포함되는 재조합 발현 벡터가 도입된 숙주 세포를 포함한다. 용어 "숙주 세포" 및 "재조합 숙주 세포"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 이러한 용어는 특정 대상체 세포뿐만 아니라 이러한 세포의 자손 또는 잠재적 자손을 지칭하는 것으로 이해된다. 소정의 변형이 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 다음 세대에서 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은 실제로 모세포와 동일할 수 없지만 여전히 본 명세서에서 사용되는 용어의 범위 내에 포함된다. 숙주 세포는 임의의 원핵세포(예를 들어, 대장균) 또는 진핵세포(예를 들어, 곤충 세포, 효모 또는 포유동물 세포)일 수 있다.
2. 단백질 작용제
본 발명에 포함되는 다른 양태는 아미노산-기반 작용제의 사용을 포함한다. 작용제는 항체, 융합 단백질, 합성 폴리펩타이드 및 펩타이드뿐만 아니라 이의 단편(예를 들어, 생물학적으로 활성인 단편)을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 이러한 아미노산을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드이 또한 제공된다.
본 발명의 아미노산-기반 작용제(예를 들어, 항체 및 재조합 단백질)는 독립적으로 하나 이상의 핵산, 복수의 핵산, 핵산의 단편 또는 전술한 임의의 변이체에 의해 암호화될 수 있는 전체 폴리펩타이드, 복수의 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드의 단편으로 존재할 수 있다.
용어 "폴리펩타이드"는 펩타이드 결합에 의해 가장 자주 함께 연결되는 아미노산 잔기(천연의 또는 비천연)의 중합체를 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 용어는 임의의 크기, 구조 또는 기능의 단백질, 폴리펩타이드 및 펩타이드를 지칭한다. 따라서, 용어 폴리펩타이드는 용어 "펩타이드" 및 "단백질"을 상호 포함한다. 용어 "융합 단백질"은 상이한 자원으로부터의 적어도 2개의 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩타이드 분자를 지칭하되, 성분 아미노산 서열은 직접 또는 하나 이상의 펩타이드 링커를 통해 펩타이드-결합에 의해 서로 연결된다. 일부 예에서, 암호화된 폴리펩타이드는 약 50개의 아미노산보다 작으며, 이후 폴리펩타이드는 "펩타이드"로 불린다. 폴리펩타이드가 펩타이드이면, 이는 적어도 약 2개, 3개, 4개 또는 적어도 5개의 아미노산 잔기 길이가 될 것이다. 따라서, 폴리펩타이드는 유전자 산물, 자연 발생적 폴리펩타이드, 합성 폴리펩타이드, 상동체, 오르토로그, 파라로그, 단편 및 다른 등가물, 변이체 및 전술한 유사체를 포함한다. 폴리펩타이드는 단일 분자일 수 있거나, 또는 이량체, 삼량체 또는 사량체와 같은 다중-분자 복합체일 수 있다. 이들은 또한 단일 사슬 또는 다중 사슬 폴리펩타이드를 포함할 수 있고, 결합되거나 연결될 수 있다. 용어 폴리펩타이드는 또한 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생적 아미노산의 인공 화학적 유사체인 아미노산 중합체에 적용될 수 있다.
"단리된" 또는 "정제된" 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분은 단백질이 유래되는 세포 또는 조직 공급원으로부터의 세포 물질 또는 기타 오염 단백질이 실질적으로 없거나, 화학적으로 합성될 때 화학 전구체 또는 기타 화학물질이 실질적으로 없다. 용어 "세포 물질이 실질적으로 없는"은 단백질이 단리되거나 재조합적으로 생산되는 세포의 세포 성분으로부터 단백질이 분리된 단백질의 제제를 포함한다. 따라서, 세포 물질이 실질적으로 없는 단백질은 약 30%, 20%, 10% 또는 5%(건조 중량 기준) 미만의 이종성 단백질(본 명세서에서 "오염 단백질"로도 지칭됨)을 갖는 단백질의 제제를 포함한다. 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분이 재조합적으로 생산되는 경우, 이는 또한 바람직하게는 배양 배지가 실질적으로 없으며, 즉, 배양 배지는 단백질 제제 부피의 약 20%, 10% 또는 5% 미만을 나타낸다. 단백질이 화학적 합성에 의해 생산되는 경우, 이는 바람직하게는 화학 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없으며, 즉, 이는 단백질 합성에 관여하는 화학적 전구체 또는 기타 화학 물질로부터 분리된다. 따라서, 이러한 단백질의 제제는 약 30%, 20%, 10%, 5%(건조 중량 기준) 미만의 관심있는 폴리펩타이드 이외의 화학 전구체 또는 화합물을 갖는다.
일부 실시형태에서, 마커에 상응하는 천연형 폴리펩타이드는 표준 단백질 정제 기법을 사용하여 적절한 정제 계획에 의해 세포 또는 조직 공급원으로부터 단리될 수 있다. 다른 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 마커에 상응하는 폴리펩타이드는 재조합 DNA 기법에 의해 생산될 수 있다. 재조합 발현에 대한 대안으로, 본 발명에 포함되는 마커에 상응하는 폴리펩타이드는 표준 펩타이드 합성 기법을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다.
폴리펩타이드 단편은 관심있는 아미노산 서열과 충분히 동일하거나 또는 이로부터 유래되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하지만, 전장 단백질보다 더 적은 아미노산을 포함한다. 이들은 또한 상응하는 전장 단백질의 적어도 하나의 활성을 나타낼 수 있다. 전형적으로, 생물학적 활성 부분은 상응하는 단백질의 적어도 하나의 활성을 갖는 도메인 또는 모티프를 포함한다. 본 발명에 포함되는 단백질의 생물학적 활성 부분은 예를 들어, 10개, 25개, 50개, 100개 이상의 아미노산 길이인 폴리펩타이드일 수 있다. 또한, 단백질의 다른 영역이 결실된 다른 생물학적 활성 부분은 재조합 기법에 의해 제조될 수 있으며, 본 발명에 포함되는 폴리펩타이드의 천연 형태의 기능적 활성 중 하나 이상에 대해 평가될 수 있다.
바람직한 폴리펩타이드는 본 명세서에 기재된 핵산 분자에 의해 암호화된 폴리펩타이드와 같은 관심있는 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 갖는다. 다른 유용한 단백질은 이러한 서열 중 하나와 실질적으로 동일한(예를 들어, 적어도 약 40%, 바람직하게는 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 83%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%)하며, 상응하는 자연 발생적 단백질의 단백질 기능적 활성은 유지하지만, 천연의 대립유전자 변이 또는 돌연변이 유발로 인해 아미노산 서열은 다르다.
아미노산 서열에 적용되는 용어 "동일성"은 필요한 경우 최대 퍼센트 동일성을 달성하기 위해, 서열을 정렬하고 갭을 도입한 후 제2 서열의 아미노산 서열에 있는 잔기와 동일한 후보 아미노산 서열의 잔기의 퍼센트로 정의된다. 정렬을 위한 방법 및 컴퓨터 프로그램은 당업계에 잘 알려져 있다. 상동성은 퍼센트 동일성의 계산에 의존하지만, 계산에 도입된 갭과 패널티로 인해 가치가 다를 수 있음이 이해된다.
두 아미노산 서열 또는 두 핵산의 퍼센트 동일성을 결정하기 위해, 서열은 최적의 비교 목적을 위해 정렬된다(예를 들어, 제2 아미노 또는 핵산 서열과의 최적의 정렬을 위해, 제1 아미노산의 서열 또는 핵산 서열에 갭이 도입될 수 있음). 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오타이드 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드가 비교된다. 제1 서열의 위치가 제2 서열에서 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드에 의해 점유되면, 분자는 그 위치에서 동일하다. 두 서열 간의 퍼센트 동일성은 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다(즉, % 동일성=동일한 위치의 수/위치의 총 수(예를 들어, 중첩 위치)×100). 일 실시형태에서, 두 서열은 동일한 길이이다.
두 서열 간의 퍼센트 동일성의 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 수행될 수 있다. 두 서열의 비교에 사용되는 수학적 알고리즘의 바람직한, 비-제한적 예는 문헌[Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:2264-2268]의 알고리즘 및 문헌[Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873-5877]에서와 같이 수정된 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 문헌[Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873-5877]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램에 통합된다. BLAST 뉴클레오타이드 검색은 본 발명에 포함되는 핵산 분자에 상동성인 뉴클레오타이드 서열을 얻기 위해 NBLAST 프로그램(점수=100, 단어 길이=12)으로 수행될 수 있다. BLAST 단백질 검색은 본 발명에 포함되는 단백질 분자에 상동성인 아미노산 서열을 얻기 위해 XBLAST 프로그램(점수=50, 단어 길이=3)으로 수행될 수 있다. 비교 목적으로 갭 정렬을 얻기 위해, 문헌[Altschul et al. (1997) Nucl. Acids Res. 25:3389-3402]에 기재된 바와 같이 Gapped BLAST가 이용될 수 있다. 대안적으로, PSI-Blast가 분자 간의 먼 관계를 검출하는 반복 검색을 수행을 수행하는데 사용될 수 있다. BLAST, Gapped BLAST 및 PSI-Blast 프로그램을 이용할 때, 각 프로그램(예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 매개변수가 사용될 수 있다(예를 들어, ncbi.nlm.nih.gov 참조). 서열의 비교를 위해 이용되는 수학적 알고리즘의 다른 바람직한, 비-제한적 예는 문헌[Myers and Miller (1988) Comput. Appl. Biosci. 4:11-17]의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 GCG 서열 정렬 소프트웨어 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 포함된다. 아미노산 서열을 비교하기 위해 ALIGN 프로그램을 이용할 때, PAM120 가중치 잔기 표, 12의 갭 길이 패널티 및 4의 갭 패널티가 사용될 수 있다. 국소 서열 유사성 및 정렬 영역을 확인하기 위한 또 다른 유용한 알고리즘은 문헌[Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444-2448]에 기재된 바와 같은 FASTA 알고리즘이다. 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열을 비교하기 위해 FASTA 알고리즘을 사용할 때, PAM120 가중치 잔기 표는 예를 들어, 2의 k-튜플 값(tuple value)으로 사용될 수 있다. 두 서열 사이의 퍼센트 동일성은 갭을 허용하거나 허용하지 않고 위에 기재된 바와 같은 것들과 유사한 기법을 사용하여 결정될 수 있다. 퍼센트 동일성을 계산하는 데 있어서, 정확히 일치하는 항목만 계산된다.
용어 "폴리펩타이드 변이체" 또는 "아미노산 서열 변이체"는 천연형 또는 참조 서열과 아미노산 서열이 다른 분자를 지칭한다. 아미노산 서열 변이체는 천연형 또는 참조 서열과 비교하여 아미노산 서열 내의 소정의 위치에 치환, 결실 및/또는 삽입을 가질 수 있다. 서열을 언급할 때 용어 "천연형" 또는 "참조"는 비교가 이루어질 수 있는 원래의 분자를 지칭하는 상대적인 용어이다. 천연형 또는 참조 서열은 야생형 서열과 혼동해서는 안된다. 천연형 서열 또는 분자는 야생형(자연에서 발견되는 서열)을 나타낼 수 있지만, 야생형 서열과 동일할 필요는 없다. 변이체는 천연형 또는 참조 서열에 대해 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 적어도 약 99.5% 또는 적어도 약 99.9%의 아미노산 서열 동일성(상동성)을 가질 수 있다.
폴리펩타이드 변이체는 변경된 아미노산 서열을 가지며, 일부 실시형태에서, 효능제 또는 길항제로서 기능할 수 있다. 변이체는 돌연변이 유발, 예를 들어 불연속 점 돌연변이 또는 절단에 의해 생성될 수 있다. 효능제는 자연 발생적 형태의 단백질의 생물학적 활성과 실질적으로 동일하거나 또는 이의 서브세트를 유지할 수 있다. 단백질의 길항제는 예를 들어, 관심있는 단백질을 포함하는 세포 신호전달 캐스케이드의 하류 또는 상류 구성원에 경쟁적으로 결합함으로써 자연 발생적 형태의 단백질의 활성 중 하나 이상을 저해할 수 있다. 따라서, 특정 생물학적 효과는 제한된 기능의 변이체로 처리하여 유도될 수 있다. 자연 발생적 형태의 단백질의 생물학적 활성의 서브세트를 갖는 변이체로 대상체를 처리하는 것은 자연 발생적 형태의 단백질로의 처리에 비해 대상체에서 더 적은 부작용을 가질 수 있다.
효능제 또는 길항제로서 기능하는 바이오마커 단백질의 변이체는 돌연변이체, 예를 들어 효능제 또는 길항제 활성에 대해 본 발명에 포함되는 단백질의 절단 돌연변이체의 조합 라이브러리를 스크리닝함으로써 확인될 수 있다. 일 실시형태에서, 다양한 종류로 이루어진 변이체의 라이브러리는 핵산 수준에서 조합 돌연변이 유발에 의해 생성되며, 다양한 종류로 이루어진 유전자 라이브러리에 의해 암호화된다. 다양한 종류로 이루어진 변이체의 라이브러리는 예를 들어, 합성 올리고뉴클레오타이드의 혼합물을 유전자 서열로 효소적으로 결찰함으로써 생성될 수 있으므로, 잠재적인 단백질 서열의 축퇴된 세트가 개별 폴리펩타이드로 또는 대안적으로, 일련의 더 큰 융합 단백질(예를 들어, 파지 디스플레이용)로 발현될 수 있다. 축퇴성 올리고뉴클레오타이드 서열로부터 본 발명에 포함되는 폴리펩타이드의 잠재적인 변이체의 라이브러리를 생산하는데 사용될 수 있는 다양한 방법이 있다. 축퇴성 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Narang (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al. (1984) Science 198:1056; 및 Ike et al. (1983) Nucleic Acid Res. 11:477] 참조).
또한, 본 발명에 포함되는 마커에 상응하는 폴리펩타이드의 코딩 서열 단편의 라이브러리는 스크리닝 및 후속 변이체의 선별을 위한 폴리펩타이드의 다양한 종류로 이루어진 집단을 생성하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 코딩 서열 단편의 라이브러리는 닉킹이 분자당 약 한 번만 발생하는 조건하에서 관심있는 코딩 서열의 이중 가닥 PCR 단편을 뉴클레이스로 처리하고, 이중 가닥 DNA를 변성시키고, DNA를 복원하여 다른 닉킹된 생성물로부터 센스/안티센스 쌍을 포함할 수 있는 이중 가닥 DNA를 형성하고, S1 뉴클레이스로 처리하여 재형성된 듀플렉스로부터 단일 가닥 부분을 제거하고, 생성된 단편 라이브러리를 발현 벡터로 결찰함으로써 생성될 수 있다. 이 방법에 의해, 다양한 크기의 관심있는 단백질의 아미노 말단 및 내부 단편을 암호화하는 발현 라이브러리가 유도될 수 있다.
점 돌연변이 또는 절단에 의해 만들어진 조합 라이브러리의 유전자 산물을 스크리닝하고, 선택된 특성을 갖는 유전자 산물에 대한 cDNA 라이브러리를 스크리닝하기 위한 여러 기법이 당업계에 공지되어 있다. 대용량 유전자 라이브러리를 스크리닝하기 위해 고 처리량 분석이 가능한 가장 널리 사용되는 기법은 전형적으로 유전자 라이브러리를 복제 가능한 발현 벡터로 클로닝하고, 생성된 벡터 라이브러리로 적절한 세포를 형질전환하고, 원하는 활성의 검출이 산물이 검출되는 유전자를 암호화하는 벡터의 단리를 용이하게 하는 조건하에서 조합 유전자를 발현하는 것을 포함한다. 라이브러리에서 기능적 돌연변이체의 빈도를 향상시키는 기법인 반복 앙상블 돌연변이 유발(Recursive ensemble mutagenesis: REM)은 본 발명에 포함되는 단백질의 변이체를 확인하기 위해 스크리닝 검정과 함께 사용될 수 있다(문헌[Arkin and Yourvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:7811-7815 및 Delgrave et al. (1993) Prot. Engin. 6:327- 331]).
일부 실시형태에서, "변이 모의체(variant mimic)"가 제공된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "변이 모의체"는 활성화된 서열을 모의할 수 있는 하나 이상의 아미노산을 함유하는 변이체를 지칭한다. 예를 들어, 글루타메이트는 포스포-트레오닌 및/또는 포스포-세린에 대한 모의체 역할을 할 수 있다. 대안적으로, 변이 모의체는 비활성화를 초래하거나 또는 모의체를 함유하는 불활성화된 생성물을 초래할 수 있으며, 예를 들어 페닐알라닌은 타이로신에 대한 불활성화 치환으로서 작용할 수 있고; 또는 알라닌은 세린에 대한 불활성화 치환으로 작용할 수 있다. 아미노산 서열은 자연 발생적 아미노산을 포함할 수 있으므로, 단백질, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 이의 단편으로 간주될 수 있다. 대안적으로, 본 발명에 포함되는 작용제는 자연적 발생적 및 비-자연 발생적 아미노산 둘 다를 포함할 수 있다. 비-자연 발생적 아미노산은 카보닐기 또는 아미노옥시기 또는 하이드라자이드기 또는 세미카바자이드기 또는 아자이드기를 포함하는 아미노산을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
아미노산 서열에 적용되는 용어 "상동체"는 제2 종의 제2 서열과 실질적인 동일성을 갖는 다른 종의 상응하는 서열을 의미한다.
용어 "유사체" 하나 이상의 아미노산 변경, 예를 들어 모 폴리펩타이드의 특성을 여전히 유지하는 아미노산 잔기의 치환, 추가 또는 결실에 의해 상이한 폴리펩타이드 변이체를 포함하는 것을 의미한다.
용어 "유도체"는 용어 "변이체"와 동의어로 사용되며, 참조 분자 또는 출발 분자와 관련하여 임의의 방식으로 변형 또는 변화된 분자를 지칭한다. 본 발명은 변이체 및 유도체를 포함하는 아미노산 기반인 여러 유형의 화합물 및/또는 조성물을 상정한다. 이는 치환, 삽입, 결실 및 공유 변이체 및 유도체를 포함한다. 따라서, 치환, 삽입, 추가, 결실 및/또는 공유 변형을 포함하는 작용제가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 펩타이드 또는 단백질의 아미노산 서열의 카복시- 및 아미노-말단 영역에 위치한 아미노산 잔기는 선택적으로 결실되어 절단된 서열을 제공할 수 있다. 소정의 아미노산(예를 들어, C-말단 또는 N-말단 잔기)은 대안적으로 가용성이거나 또는 고체 지지체에 연결된 더 큰 서열의 일부로서 서열의 발현과 같이 서열의 사용에 따라 결실될 수 있다.
단백질에 대해 언급할 때 "치환 변이체"는 천연형 또는 참조 서열에서 적어도 하나의 아미노산 잔기가 제거되고, 동일한 위치에서 그 자리에 다른 아미노산이 삽입된 것이다. 치환은 분자에서 단 하나의 아미노산만이 치환된 단일일 수 있거나, 또는 2개 이상의 아미노산이 동일한 분자에서 치환된 다중일 수 있다. 일 예에서, 본 발명에 포함되는 폴리펩타이드에서 아미노산은 유사한 구조적 및/또는 화학적 특성, 예를 들어 보존적 아미노산 치환을 갖는 다른 아미노산으로 치환된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "보존적 아미노산 치환"은 서열에 정상적으로 존재하는 아미노산을 유사한 크기, 전하, 극성, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 관련 잔기의 양친매성 성질의 다른 아미노산으로 치환하는 것을 지칭한다. 보존적 치환의 예는 다른 비-극성 잔기에 대한 알라닌, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 아이소류신, 발린, 류신 및 메티오닌과 같은 비-극성(소수성) 잔기의 치환을 포함한다. 마찬가지로, 보존적 치환의 예는 아르기닌과 라이신간, 글루타민과 아스파라긴간 및 글리신과 세린간과 같이 하나의 극성(친수성) 잔기를 다른 것으로 치환하는 것을 포함한다. 추가적으로, 라이신, 아르기닌 또는 히스티딘과 같은 염기성 잔기를 다른 것으로 치환하거나, 또는 아스파르트산 또는 글루탐산과 같은 하나의 산성 잔기를 다른 산성 잔기로 치환하는 것은 보존적 치환의 추가적인 예이다. "비-보존적 치환"은 이러한 클래스 중 하나의 구성원을 다른 클래스로 교환하는 것을 수반한다. 비-보존적 치환의 예는 시스테인, 글루타민, 글루탐산 또는 라이신와 같은 극성(친수성) 잔기에 대한 아이소류신, 발린, 류신, 알라닌, 메티오닌과 같은 비-극성(소수성) 아미노산 잔기의 치환 및/또는 비-극성 잔기에 대한 극성 잔기의 치환을 포함한다. 아미노산 치환은 당업계에 잘 알려져 있는 유전적 또는 화학적 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 유전적 방법은 부위-지정 돌연변이 유발, PCR, 유전자 합성 등을 포함할 수 있다. 화학적 변형과 같은 유전 공학 이외의 방법에 의해 아미노산의 측쇄기를 변경하는 방법이 또한 유용할 수 있는 것으로 상정된다.
단백질을 언급할 때 용어 "삽입 변이체"는 천연형 또는 시작 서열의 특정 위치에서 아미노산에 바로 인접하여 삽입된 하나 이상의 아미노산을 갖는 것들이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "바로 인접한"은 시작 또는 참조 아미노산의 알파-카복시 또는 알파-아미노 작용기에 연결된 인접 아미노산을 지칭한다. 대조적으로, 단백질을 언급할 때 용어 "결실 변이체"는 천연형 또는 시작 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 제거된 것들이다. 일반적으로, 결실 변이체는 분자의 특정 영역에서 하나 이상의 아미노산이 결실될 것이다.
용어 "유도체"는 유기 단백질성 또는 비-단백질성 유도체화제를 이용한 하나 이상의 변형 및 번역 후 변형을 포함하는 천연형 또는 참조 단백질의 변이체를 포함한다. 공유 변형은 전통적으로 단백질의 표적화된 아미노산 잔기를 선택된 측쇄 또는 말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 반응시키거나 또는 선택된 재조합 숙주 세포에서 기능하는 번역 후 변형의 메커니즘을 활용하여 도입된다. 생성된 공유 유도체는 생물학적 활성, 면역검정 또는 재조합 당단백질의 면역친화성 정제를 위한 항-단백질 항체의 제조에 중요한 잔기를 확인하기 위한 프로그램에 유용하다. 이러한 변형은 당해 기술 분야의 통상의 기술 내에 있으며, 과도한 실험없이 수행된다.
소정의 번역 후 변형은 발현된 폴리펩타이드에 대한 재조합 숙주 세포의 작용의 결과이다. 글루타민일 및 아스파라긴일 잔기는 종종 상응하는 글루타밀 및 아스파틸 잔기로 번역 후 탈아마이드화된다. 대안적으로, 이러한 잔기는 약산성 조건에서 탈아미드화된다. 이러한 잔기의 어느 형태든 본 발명에 따라 사용되는 단백질에 존재할 수 있다. 다른 번역 후 변형은 프롤린 및 라이신의 하이드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 하이드록실기의 인산화, 라이신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 알파-아미노기의 메틸화를 포함한다(문헌[T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)]).
일부 실시형태에서, 이종성 폴리펩타이드 및/또는 비-폴리펩타이드 변형으로 변형된 폴리펩타이드와 같은 공유적으로 변형된 폴리펩타이드(예를 들어, 융합 단백질)가 제공된다. 예를 들어, 공유 유도체는 구체적으로 본 발명에 포함되는 단백질이 비-단백질성 중합체에 공유 결합된 융합 분자를 포함한다. 비-단백질성 중합체는 일반적으로 친수성 합성 중합체(즉, 자연에서 달리 발견되지 않는 중합체)이다. 그러나, 자연으로부터 단리된 중합체와 마찬가지로, 자연에 존재하며 재조합 또는 시험관내 방법에 의해 생산되는 중합체가 유용하다. 친수성 폴리바이닐 중합체, 예를 들어 폴리바이닐알코올 및 폴리바이닐피롤리돈이 본 발명의 범위 내에 포함된다. 특히 유용한 것은 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜(PEG)과 같은 폴리바이닐알킬렌 에터이다. 단백질은 미국 특허 제4,640,835호; 제4,496,689호; 제4,301,144호; 제4,670,417호; 제4,791,192호 또는 제4,179,337호에 제시된 방식으로 다양한 비-단백질성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌에 연결될 수 있다. 융합 분자는 다른 생물학적으로 활성인 분자 또는 링커에 공유 결합된 본 발명에 포함되는 단백질을 더 포함할 수 있다.
용어 "키메라 단백질" 또는 "융합 단백질"은 이종성 폴리펩타이드(예를 들어, 바이오마커 폴리펩타이드 이외의 폴리펩타이드)에 작동 가능하게 연결된 본 발명에 포함되는 폴리펩타이드에 상응하는 폴리펩타이드의 전부 또는 일부(바람직하게는 생물학적 활성 부분)을 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다. 융합 단백질 내에서, 용어 "작동 가능하게 연결"은 본 발명에 포함되는 폴리펩타이드 및 이종성 폴리펩타이드가 서로 인-프레임으로 융합되는 것을 나타내는 것으로 의도된다. 이종성 폴리펩타이드는 본 발명에 포함되는 폴리펩타이드의 아미노-말단 또는 카복실-말단에 융합될 수 있다.
하나의 유용한 융합 단백질은 본 발명에 포함되는 마커에 상응하는 폴리펩타이드가 GST 서열의 카복실 말단에 융합된 GST 융합 단백질이다. 이러한 융합 단백질은 본 발명에 포함되는 재조합 폴리펩타이드의 정제를 용이하게 할 수 있다. 다른 실시형태에서, 융합 단백질은 이종성 신호 서열, 면역글로불린 융합 단백질, 독소 또는 다른 유용한 단백질 서열을 함유한다. 본 발명에 포함되는 키메라 및 융합 단백질은 표준 재조합 DNA 기법에 의해 생산될 수 있다. 다른 실시형태에서, 융합 유전자는 자동화된 DNA 합성기를 포함하는 종래의 기법에 의해 합성될 수 있다. 대안적으로, 유전자 단편의 PCR 증폭은 이어서 키메라 유전자 서열(예를 들어, 위의 문헌[Ausubel et al.] 참조)을 생성하기 위해 어닐링되고 재증폭될 수 있는 2개의 연속적인 유전자 단편 사이에 상보적 오버행을 발생시키는 앵커 프라이머를 사용하여 수행될 수 있다. 또한, 이미 융합 모이어티(예를 들어, GST 폴리펩타이드)를 암호화하는 많은 발현 벡터가 상업적으로 이용 가능하다. 본 발명에 포함되는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 융합 모이어티가 본 발명에 포함되는 폴리펩타이드에 인-프레임으로 연결되도록 이러한 발현 벡터로 클로닝될 수 있다.
신호 서열은 관심있는 분비된 단백질 또는 다른 단백질의 분비 및 단리를 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다. 신호 서열은 전형적으로 하나 이상의 절단 이벤트에서 분비 동안 성숙 단백질로부터 일반적으로 절단되는 소수성 아미노산의 코어를 특징으로 한다. 이러한 신호 펩타이드는 분비 경로를 통과할 때 성숙 단백질로부터 신호 서열을 절단할 수 있는 가공 부위를 함유한다. 따라서, 본 발명은 신호 서열을 갖는 기재된 폴리펩타이드뿐만 아니라 신호 서열이 단백질 가수분해성으로 절단된 폴리펩타이드(즉, 절단 생성물)를 포함한다. 일 실시형태에서, 신호 서열을 암호화하는 핵산 서열은 관심있는 단백질, 예컨대 통상적으로 분비되지 않거나 또는 그렇지 않으면 단리하기 어려운 단백질의 발현 벡터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 신호 서열은 발현 벡터가 형질전환되는 진핵 숙주로부터와 같이 단백질의 분비를 지시하며, 신호 서열은 후속적으로 또는 동시에 절단된다. 그런 다음, 단백질은 당업계에서 인정된 방법에 의해 세포외 배지로부터 쉽게 정제될 수 있다. 대안적으로, 신호 서열은 정제를 용이하게 하는 서열을 사용하여, 예컨대 GST 도메인을 사용하여 관심있는 단백질에 연결될 수 있다.
단백질을 언급할 때 용어 "기능"은 분자의 별개의 아미노산 서열-기반 성분으로서 정의된다. 본 발명에 포함되는 단백질의 특징은 표면 발현, 국소 입체 형태, 폴드, 루프, 하프-루프, 도메인, 하프-도메인, 부위, 말단 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 예를 들어, 단백질을 언급할 때 용어 "표면 발현"은 최외각 표면에 나타나는 단백질의 폴리펩타이드에 기초한 성분을 지칭한다. 단백질을 언급할 때 용어 "국소 입체 형태"는 단백질의 정의 가능한 공간 내에 위치되는 단백질의 구조적 발현에 기초한 폴리펩타이드를 지칭한다. 단백질을 언급할 때 용어 "폴드"는 에너지 최소화시 아미노산 서열의 결과적 형태를 지칭한다. 폴드는 폴딩 과정의 2차 또는 3차 수준에서 발생할 수 있다. 2차 수준 폴드의 예는 베타 시트 및 알파 헬릭스를 포함한다. 3차 폴드의 예는 에너지 힘의 응집 또는 분리로 인해 형성된 도메인 및 영역을 포함한다. 이러한 방식으로 형성된 영역은 소수성 및 친수성 포켓 등을 포함한다. 단백질 형태와 관련하여 용어 "턴"은 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 골격의 방향을 변경하고, 1개, 2개, 3개 이상의 아미노산 잔기를 포함할 수 있는 굴곡부(bend)를 지칭한다. 단백질과 관련하여 용어 "루프"는 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 골격의 방향을 역전시키고 및 4개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 구조적 특징을 지칭한다(문헌[Oliva et al. (1997) J. Mol. Biol. 266:814-830]). 단백질을 언급할 때 용어 "하프-루프"는 아미노산 잔기의 수의 적어도 절반이 그것이 유래되는 루프로서 존재하는 확인된 루프의 부분을 지칭한다. 루프가 항상 짝수의 아미노산 잔기를 함유하는 것은 아니라는 것이 이해된다. 따라서, 따라서 루프가 홀수 개의 아미노산을 포함하거나 포함하는 것으로 확인되는 경우, 홀수 루프의 하프-루프는 루프의 정수 부분 또는 다음 정수 부분(루프의 아미노산의 수/2+/-0.5 아미노산)을 포함할 것이다. 예를 들어, 7개의 아미노산 루프로 확인된 루프는 3개의 아미노산 또는 4개의 아미노산의 하프-루프를 생성할 수 있다 (7/2=3.5+/-0.5는 3 또는 4임). 단백질을 언급할 때 용어 "도메인"은 하나 이상의 확인 가능한 구조적 또는 기능적 특징 또는 특성(예를 들어, 결합 능력 및/또는 단백질-단백질 상호작용을 위한 부위로서의 역할)을 갖는 폴리펩타이드의 모티프를 지칭한다. 단백질을 언급할 때 용어 "하프-도메인"은 아미노산 잔기 수의 적어도 절반이 그것이 유래하는 도메인으로 존재하는 확인된 도메인의 부분을 지칭한다. 도메인이 항상 짝수의 아미노산 잔기를 포함하는 것은 아니라는 것이 이해된다. 따라서, 도메인이 홀수 개의 아미노산을 포함하거나 포함하는 것으로 확인된 경우, 홀수 도메인의 하프-도메인은 도메인의 정수 부분 또는 다음 정수 부분(도메인의 아미노산의 수/2+/-0.5 아미노산)을 포함할 것이다. 예를 들어, 7개의 아미노산 도메인으로 확인된 도메인은 3개의 아미노산 또는 4개의 아미노산의 하프-도메인을 생성할 수 있다(7/2=3.5+/-0.5는 3 또는 4임). 하위-도메인은 도메인 또는 하프-도메인 내에서 확인될 수 있으며, 이들 하위 도메인은 이들이 유래되는 도메인 또는 하프 도메인에서 확인된 모든 구조적 또는 기능적 특성보다 적다는 것이 또한 이해된다. 본 명세서에서 임의의 도메인 유형을 포함하는 아미노산은 폴리펩타이드의 골격을 따라 인접할 필요가 없다는 것이 또한 이해된다(즉, 비인접 아미노산은 도메인, 하프-도메인 또는 하위 도메인을 생성하도록 구조적으로 폴딩될 수 있음). 아미노산-기반 실시형태에 속하는 용어 "부위"는 "아미노산 잔기" 및 "아미노산 측쇄"와 동의어로 사용된다. 부위는 본 발명에 포함되는 아미노산 기반 분자 내에서 변형, 조작, 변경, 유도체화 또는 변화될 수 있는 펩타이드 또는 폴리펩타이드 내의 위치를 나타낸다. 단백질을 언급할 때 용어 "말단(termini)" 또는 "말단(terminus)"은 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 맨 끝을 지칭한다. 이러한 맨 끝은 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 첫 번째 또는 최종 부위로만 제한되지 않고, 말단 영역에 추가적인 아미노산을 포함할 수 있다. 본 발명에 포함되는 분자에 기반한 폴리펩타이드는 N-말단(즉, 유리 아미노기(NH2)를 갖는 아미노산에 의해 종결됨) 및 C-말단(즉, 유리 카복실기(COOH)를 갖는 아미노산에 의해 종결됨) 둘 다를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 포함되는 단백질은 일부 경우에 이황화 결합 또는 고발현체 또는 올리고머와 같은 비-공유적 힘에 의해 결합된 다중 폴리펩타이드 사슬을 구성한다. 이러한 단백질은 여러 개의 N- 및 C-말단을 갖는다. 대안적으로, 폴리펩타이드의 말단은 경우에 따라 유기 접합체와 같은 비-폴리펩타이드 기반 모이어티로 시작 또는 종료되도록 변형될 수 있다.
임의의 특징이 본 발명에 포함되는 분자의 성분으로 확인되거나 정의되면, 이러한 특징의 임의의 여러 조작 및/또는 변형은 이동, 교환, 반전, 결실, 무작위화 또는 복제에 의해 수행될 수 있다. 또한, 특징의 조작은 본 발명에 포함된 분자에 대한 변형과 동일한 결과를 초래할 수 있음이 이해된다. 예를 들어, 도메인 결실을 수반하는 조작은 전장 분자보다 적게 암호화하는 핵산의 변형과 마찬가지로 분자 길이의 변경을 초래할 것이다. 변형 및 조작은 부위 지정 돌연변이 유발과 같은 당업계에 공지된 방법에 의해 달성될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 작용제는 동위원소인 하나 이상의 원자를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "동위원소"는 중수소 동위원소와 같은 하나 이상의 추가적인 중성자를 갖는 화학 원소를 지칭한다.
3. 항체 작용제
다른 양태에서, 항체 작용제 및 변이체 및/또는 이의 항원 결합 단편이 본 발명에 포함된다.
a. 항체 조성물
용어 "항체" 또는 "Ab"는 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로 제한없이, 전체 항체, 단일클론 항체, 다중클론 항체, 다중특이성 항체(예를 들어, 적어도 2개의 온전한 항체로부터 형성된 이중특이성 항체, 삼중특이성 또는 더 큰 다중특이성의 항체), 항체 단편, 다이어바디, 항체 변이체 및 다른 펩타이드의 일부이거나 이와 관련된 항체-유래 결합 도메인을 포함한다. 항체는 주로 아미노산 기반 분자이지만, 또한 하나 이상의 변형(당 모이어티, 형광 모이어티, 화학적 태그 등의 추가를 포함하지만 이들로 제한되지 않음)을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 항체는 비-아미노산-기반 분자를 포함할 수 있다. 본 발명에 포함되는 항체는 자연 발생적이거나 또는 생물 공학에 의해 생성될 수 있다.
일부 실시형태에서, 항체는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인뿐만 아니라 Fc 영역을 포함할 수 있다. 용어 "천연형 항체"는 일반적으로 2개의 동일한 경쇄(L) 및 2개의 동일한 중쇄(H)로 구성된 약 150,000 달톤의 헤테로테트라머 당단백질을 지칭한다. 각각의 경쇄는 하나의 공유 이황화 결합에 의해 중쇄애 연결되는 반면, 이황화 결합의 수는 상이한 면역글로불린 동형 단백질(예를 들어, IgG, IgA, IgE 및 IgM)의 중쇄에 따라 다르다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 또한 규칙적으로 이격된 사슬내 이황화 브리지를 갖는다. 각각의 중쇄는 하나의 말단에 가변 도메인(VH)이 있고, 그 뒤에 여러 불변 도메인이 있다. 각각의 경쇄는 하나의 말단(VL)에 가변 도메인이 있고, 및 다른 말단에 불변 도메인이 있으며; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 첫 번째 불변 도메인과 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 항체의 두 중쇄 중 중쇄의 나머지 불변 도메인은 항체의 단편 결정화 가능(fragment crystallizable: Fc) 영역으로 구성된다. 항체의 꼬리 영역에 있는 Fc 영역은 Fc 수용체라고 하는 세포 표면 수용체 및 보체 시스템의 일부 단백질과 상호작용한다.
용어 "경쇄"는 불변 도메인의 아미노산 서열을 기반으로 하여 카파 및 람다라고하는 두 가지의 분명하게 구별되는 유형 중 하나에 할당된 임의의 척추동물 종의 항체 성분을 지칭한다. 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체는 상이한 클래스에 할당될 수 있다. 온전한 항체에는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 다섯 가지 주요 클래스가 있으며, 이들 중 일부는 하위클래스(동형 단백질), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2로 더 나뉠 수 있다.
용어 "가변 도메인"은 항체 사이에서 서열이 광범위하게 다르며 특정 항원에 대한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에 사용되는, 항체 중쇄 및 경쇄 둘 다의 특정 항체 도메인을 지칭한다. 예를 들어, 용어 "VH"는 "중쇄 가변 도메인"을 지칭하고, 용어 "VL"은 "경쇄 가변 사슬"을 지칭한다. 가변 도메인은 초가변 영역을 포함한다. 용어 "초가변 영역"은 항원 결합을 담당하는 아미노산 잔기를 포함하는 가변 도메인 내의 영역을 지칭한다. 이러한 영역은 서열에서 초가변적이고/이거나 구조적으로 정의된 루프를 형성한다. 초 가변 영역 내에 존재하는 아미노산은 항체의 항원-결합 부위의 일부가 되는 상보성 결정 영역(complementarity determining region: CDR)의 구조를 결정한다. 일반적으로, 항체는 6개의 HVR; VH(H1, H2, H3)에 3개 그리고 VL(L1, L2, L3)에 3개를 포함한다. 천연형 항체에서, H3 및 L3은 6개의 HVR 중에서 가장 다양성을 나타내며, 특히 H3은 항체에 우수한 특이성을 부여하는데 고유의 역할을 하는 것으로 여겨진다(예를 들어, 문헌[Xu et al. (2000) Immunity 13, 37-45; Johnson and Wu (2003) Meth. Mol. Biol. 248:1-25] 참조). 용어 "CDR"은 표적 항원 또는 에피토프에 상보적인 구조를 포함하는 항체의 영역을 지칭한다. 항원과 상호 작용하지 않는 가변 도메인의 다른 부분은 프레임워크(framework: FW) 영역으로 지칭된다. 항원-결합 부위(항원 결합 부위(antigen combining site) 또는 파라토프라고도 알려져 있음)는 특정 항원과 상호작용하는데 필요한 아미노산 잔기를 포함한다. 항원-결합 부위를 구성하는 정확한 잔기는 전형적으로 결합된 항원을 사용하는 공동 결정학에 의해 설명되지만, 다른 항체와의 비교에 기초한 계산적 평가 또한 사용될 수 있다(문헌[Strohl, W.R. Therapeutic Antibody Engineering. Woodhead Publishing, Philadelphia PA. 2012. Ch. 3, p47-54]). CDR을 구성하는 잔기를 결정하는 것은 Kabat(Wu et al. (1970) JEM 132:211-250; Kabat et al. (1992) in "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Edition, U.S. Department of Health and Human Services; Johnson et al. (2000) Nucl. Acids Res. 28:214-218), Chothia(Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901; Chothia et al. (1989) Nature 342:877; Al-Lazikani et al. (1997) J. Mol. Biol. 273:927-948), Lefranc(Lefranc et al. (1995) Immunome Res. 1:3), Honegger (Honegger and Pluckthun (2001) J. Mol. Biol. 309: 657-670), 및 MacCallum(MacCallum et al. (1996) J. Mol. Biol. 262:732)에 의해 교시된 것들을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 넘버링 체계의 사용을 포함할 수 있다.
VH 및 VL 도메인은 각각 3개의 CDR을 갖는다. VL CDR은 가변 도메인 폴리펩타이드를 따라 N-말단에서 C-말단으로 이동할 때 발생하는 순서대로 본 명세서에서 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3으로 지칭된다. VH CDR은 가변 도메인 폴리펩타이드를 따라 N-말단에서 C-말단으로 이동할 때 발생하는 순서대로 본 명세서에서 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3으로 지칭된다. 각각의 CDR은 항원-결합 도메인에서 다양한 3차원 구조를 생성하는 항체 사이의 서열 및 길이가 매우 가변적일 수 있는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 제외하고는 표준 구조를 선호한다(문헌[Nikoloudis et al. (2014) Peer J. 2:e456]). 일부 경우에서, CDR-H3은 항체 다양성을 평가하기 위해 관련된 항체의 패널 중에서 분석될 수 있다. CDR 서열을 결정하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있으며, 공지된 항체 서열에 적용될 수 있다(문헌[Strohl, W.R. Therapeutic Antibody Engineering. Woodhead Publishing, Philadelphia PA. 2012. Ch. 3, p47-54]).
일부 실시형태에서, 항체 단편 및 변이체는 온전한 항체의 임의의 부분을 포함할 수 있다. 용어 "항체 단편" 및 "항체 변이체"는 또한 복합체를 형성하기 위해 특정 항원에 결합함으로써 항체처럼 작용하는 임의의 합성 또는 유전자 조작 단백질/폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체 단편 및 변이체는 온전한 항체로부터의 항원 결합 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; Fd, 다이어바디; 인트라바디, 선형 항체; 단일 사슬 가변 단편(single chain variable fragment: scFv)과 같은 단일-쇄 항체 분자; 항체 단편으로부터 형성된 다중-특이성 항체 등을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 구조에 관계없이, 항체 단편 또는 변이체는 모 전장 항체에 의해 인식되는 동일한 항원과 결합한다.
야생형 항체의 제한된 단백질 가수분해에 의해 생성된 항체 단편은 단백질 가수분해성 항체 단편이라 불린다. 이는 Fab 단편, Fab' 단편 및 F(ab')2 단편을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 항체의 파파인 분해는 각각 단일 항원-결합 부위를 갖는 "Fab" 단편이라 불리는 2개의 동일한 항원-결합 단편을 생성한다. 또한 잔류 "Fc" 단편이 생성되며, 그 명칭은 쉽게 결정화할 수 있는 능력을 반영한다. 펩신 또는 피신 처리는 2개의 항원-결합 부위를 가지며 여전히 항원을 가교결합시킬 수 있는 F(ab')2 단편을 생성한다. 일반적으로, F(ab')2 단편은 2개의 "암(arm)"을 포함하며, 이들 각각은 공통 항원에 대해 지시되며 이에 특이적으로 결합하는 가변 영역을 포함한다. 2개의 Fab' 분자는 중쇄의 힌지 영역에서 사슬간 이황화 결합에 의해 연결되고; Fab' 분자는 동일한(2가) 또는 상이한(이중특이성) 에피토프에 대해 지시될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 "Fab' 단편"은 Fab 및 힌지 영역을 통한 중쇄의 추가적인 부분을 포함하는 단일 항-결합 도메인을 함유한다. 본 발명에 포함되는 화합물 및/또는 조성물은 이러한 단편 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
용어 "Fv"는 완전한 항원-인식 및 항원-결합 부위를 포함하는 항체 단편을 지칭한다. 이러한 영역은 단단한, 비-공유 결합으로 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 구성된다. Fv 단편은 단백질 가수분해성 절단에 의해 생성될 수 있지만, 대체로 불안정하다. 전형적으로 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 사이에 가요성 링커의 삽입을 통해(단일 사슬 Fv(scFv)을 형성하기 위해) 또는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 사이에 이황화 브리지의 도입을 통해 안정한 Fv 단편을 생성하기 위한 재조합 방법이 당업계에 공지되어 있다(문헌[Strohl, W.R. Therapeutic Antibody Engineering. Woodhead Publishing, Philadelphia PA. 2012. Ch. 3, p46-47]).
용어 "단일-쇄 Fv" 또는 "scFv"는 VH 및 VL 항체 도메인의 융합 단백질을 지칭하되, 이러한 도메인은 가요성 펩타이드 링커에 의해 단일 폴리펩타이드 사슬로 함께 연결된다. 일부 실시형태에서, Fv 폴리펩타이드 링커는 scFv가 항원 결합을 위해 목적하는 구조를 형성할 수 있게 한다. 일부 실시형태에서, VH 및 VL 도메인은 10 내지 30개의 아미노산 잔기의 펩타이드에 의해 연결될 수 있다. 일부 실시형태에서, scFv는 파지 디스플레이, 효모 디스플레이 또는 다른 디스플레이 방법과 함께 이용되며, 여기서 이들은 표면 구성원(예를 들어, 파지 외피 단백질)과 함께 발현될 수 있고, 주어진 항원에 대한 고친화성 펩타이드의 확인에 사용된다. 일부 실시형태에서, 용어 "단일-쇄 항체"는 2개의 단일-쇄 항체(이들 각각은 상이한 에피토프로 향할 수 있음)가 이황화 결합에 의해 함께 연결된 이황화-연결된 Fv(dsFv)를 더 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 분자 유전학을 사용하여, 2개의 scFv는 "탠덤 scFv"(tascFv)라 불리는 링커 도메인에 의해 분리된 단일 폴리펩타이드로 나란히(in tandem) 조작될 수 있다. 2개의 상이한 scFv에 대한 유전자로 tascFv를 구축하면 "이중특이성 단일-쇄 가변 단편"(bis-scFv)이 생성된다(문헌[Nelson (2010) Mabs 2:77-83]). IgG의 맥시바디(Fc(CH2-CH3 도메인의 아미노 말단에 융합된 2가 scFv) 또한 포함될 수 있다.
일부 실시형태에서, 항체는 변형된 Fc 영역을 포함할 수 있다. 비-제한적 예로서, 변형된 Fc 영역은 미국 공개 US 2015-0065690에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있거나 또는 이에 기재된 임의의 영역일 수 있다.
용어 "다중클론 항체"는 많은 에피토프를 갖는 단백질에 대한 면역원성 반응으로 생성된 항체를 포함한다. 따라서, 다중클론 항체의 조성물(예를 들어, 혈청)은 단백질 내의 동일하거나 상이한 에피토프에 대한 다양한 상이한 항체를 포함한다. 다중클론 항체를 생산하는 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Cooper et al., Section III of Chapter 11 in: Short Protocols in Molecular Biology, 2nd Ed., Ausubel et al., eds., John Wiley and Sons, New York, 1992, pages 11-37 to 11-41] 참조).
대조적으로, 용어 "단일클론 항체"는 실질적으로 균질한 세포(또는 클론)의 집단으로부터 얻어진 항체를 지칭하며, 즉, 집단을 포함하는 개별 항체는 단일클론 항체의 생성 중에 발생할 수 있는 가능한 변이체를 제외하고는 동일하고/하거나 항원의 동일한 특정 에피토프에 결합하며, 이러한 변이체 일반적으로 소량으로 존재한다. 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 대해 상이한 항체를 포함하는 다중클론 항체 제제와는 대조적으로, 각각의 단일클론 항체는 항원에 있는 단일 결정인자에 대해 지시된다. 변형인자(modifier) "단일클론"은 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 얻어지는 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생성을 요구하는 것으로 해석되어서는 안된다. 단일클론 항체는, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 클래스 또는 하위클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 이에 상동성이며, 사슬(들)의 나머지는 다른 종으로부터 유래되거나 다른 항체 클래스 또는 하위클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 이에 상동성인, "키메라" 항체(면역글로불린)뿐만 아니라 이러한 항체의 단편을 포함한다.
용어 "항체 변이체"는 변형된 항체(천연형 또는 출발 항체와 관련하여) 또는 천연형 또는 출발 항체(예를 들어, 항체 모방체)와 비교하여 이들의 아미노산 서열, 조성 또는 구조의 일부 차이를 포함하는 구조 및/또는 기능에서 천연형 또는 출발 항체와 유사한 생체 분자를 지칭한다. 항체 변이체는 천연형 항체와 비교하여 이들의 아미노산 서열, 조성 또는 구조가 변경될 수 있다. 항체 변이체는 변경된 동형 단백질(예를 들어, IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 IgM)을 갖는 항체, 인간화된 변이체, 최적화된 변이체, 다중특이성 항체 변이체(예를 들어, 이중특이성 변이체) 및 항체 단편을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 항체는 항체 융합 단백질을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "항체 융합 단백질"은 동일하거나 상이한 특이성을 갖는 2개 이상의 동일하거나 상이한 천연의 항체, 단일-쇄 항체 또는 항체 단편 세그먼트가 연결된 재조합적으로 생성된 항원-결합 분자이다. 융합 단백질의 원자가는 융합 단백질이 항원 또는 에피토프에 대해 갖는 결합 암 또는 부위의 총 수를 나타낸다; 즉, 1가, 2가, 3가 또는 다가. 항체 융합 단백질의 다중 원자가는 항원에 대한 결합에서 다중 상호작용의 이점을 취할 수 있음을 의미하며, 따라서 항원에 대한 결합력을 증가시킨다. 특이성은 항체 융합 단백질이 결합할 수 있는 상이한 항원 또는 에피토프의 수, 즉, 단일특이성, 이중특이성, 삼중특이성, 다중특이성 등을 나타낸다. 이러한 정의를 사용하면, 천연의 항체, 예를 들어, IgG는 2개의 결합 암이 있기 때문에 2가이지만, 하나의 항원에 결합하기 때문에 단일특이성이다. 단일특이성의, 다가 융합 단백질은 에피토프에 대해 하나 이상의 결합 부위를 갖지만, 동일한 항원, 예를 들어 동일한 항원과 반응하는 2개의 결합 부위를 갖는 다이어바디에서 동일한 에피토프와만 결합한다. 융합 단백질은 상이한 항체 성분의 다가 또는 다중특이성 조합 또는 동일한 항체 성분의 다중 카피를 포함할 수 있다. 융합 단백질은 치료제를 추가적으로 포함할 수 있다. 이러한 융합 단백질에 적합한 치료제의 예는 면역조절인자("항체-면역조절인자 융합 단백질") 및 독소("항체-독소 융합 단백질")을 포함한다. 하나의 바람직한 독소는 리보뉴클레이스(RNase), 바람직하게는 재조합 RNase를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 항체는 다중특이성 항체를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "다중특이성 항체"는 하나 이상의 에피토프에 결합하는 항체를 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "멀티바디" 또는 "다중특이성 항체"는 2개 이상의 가변 영역의 상이한 에피토프에 결합하는 항체를 지칭한다. 에피토프는 동일하거나 상이한 표적에 있을 수 있다. 일 실시형태에서, 다중특이성 항체는 PCT 공개 WO 2011/109726 및 미국 공개 제2015-0252119호에 기재된 방법에 의해 생성되고 최적화될 수 있다. 이러한 항체는 높은 특이성 및 고친화성을 갖는 다중 항원에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 다중특이성 항체는 "이중특이성 항체"이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "이중특이성 항체"는 동일하거나 상이한 항원에 있는 2개의 상이한 에피토프와 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 일 양태에서, 이중특이성 항체는 2개의 상이한 항원과 결합할 수 있다. 이러한 항체 전형적으로 적어도 2개의 상이한 항체로부터의 항원-결합 영역을 포함한다. 예를 들어, 이중특이성 단일클론 항체(BsMAb, BsAb)는 2개의 상이한 단일클론 항체의 단편으로 구성된 인공 단백질이므로, 따라서 BsAb가 2개의 상이한 유형의 항원에 결합할 수 있게 한다. 이중특이성 항체는 문헌[Riethmuller (2012) Cancer Immun. 12:12-18, Marvin et al. (2005) Acta Pharmacol. Sinica 26:649-658, 및 Schaefer et al. (2011) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108:11187-11192]에 기재된 임의의 것들을 포함할 수 있다. "3작용성 이중특이성" 항체라 불리는 새로운 세대의 BsMAb가 개발되었다. 이는 2개의 상이한 항체로부터 각각 하나씩 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄로 구성되며, 여기서 2개의 Fab 영역(암)은 2개의 항원에 대해 지시되고, Fc 영역(발)은 2개의 중쇄를 포함하며, 세 번째 결합 부위를 형성한다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 조성물은 항-펩타이드 항체를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "항-펩타이드 항체"는 그것이 유래되는 단백질(예를 들어, 본 발명에 포함되는 표적 단백질)의 단리된 몇몇(바람직하게는, 하나) 에피토프에 상응하는 짧은(전형적으로, 5 내지 20개의 아미노산) 면역원성 폴리펩타이드에 대한 체액 반응에서 생성되는 "단일특이성 항체"를 지칭한다. 복수의 항펩타이드 항체는 단백질의 특정 부분, 즉, 적어도 하나의, 바람직하게는 하나의 에피토프만을 함유하는 아미노산 서열에 대해 지시되는 다양한 상이한 항체를 포함한다. 항펩타이드 항체를 생산하는 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Cooper et al., Section III of Chapter 11 in: Short Protocols in Molecular Biology, 2nd Ed., Ausubel et al., eds., John Wiley and Sons, New York, 1992, pages 11-42 to 11-46] 참조).
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 항체는 다이어바디를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "다이어바디"는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 지칭한다. 다이어바디는 동일한 폴리펩타이드 사슬에서 경쇄 가변 도메인 VL에 연결된 중쇄 가변 도메인 VH를 포함한다. 아주 짧은 링커를 사용하여 동일한 사슬에 있는 2개의 도메인 사이에 쌍을 형성하게 함으로써, 도메인은 다른 사슬의 상보적 도메인과 쌍을 이루어 2개의 항원-결합 부위를 생성한다. 다이어바디는 예를 들어, EP 제404,097호; WO 93/11161; 및 문헌[Hollinger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448]에 더 충분히 기재되어 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 항체는 인트라바디를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "인트라바디"는 그것이 생산되는 세포로부터 분비되지 않고 대신 하나 이상의 세포내 단백질을 표적으로 하는 항체의 형태를 지칭한다. 인트라바디는 세포 과정 세포내 수송, 전사, 번역, 대사 과정, 증식성 신호전달 및 세포 분열을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다수의 세포 과정에 영향을 미치기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 방법은 인트라바디-기반 요법을 포함할 수 있다. 일부 이러한 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 가변 도메인 서열 및/또는 CDR 서열은 인트라바디-기반 요법을 위해 하나 이상의 작제물에 통합될 수 있다. 예를 들어, 인트라바디는 표적 하나 이상의 당화된 세포내 단백질을 표적으로 할 수 있거나 또는 하나 이상의 당화된 세포내 단백질과 대안적 단백질 간의 상호작용을 조절할 수 있다. 포유동물 세포의 상이한 구획에서 인트라바디의 세포내 발현은 기능을 차단하거나 조절할 수 있게 한다(문헌[Biocca et al. (1990) EMBO J. 9:101-108; Colby et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101: 17616-17621]). 인트라바디는 단백질 폴딩, 단백질-단백질, 단백질-DNA, 단백질-RNA 상호작용 및 단백질 변형을 변경할 수 있다. 이들은 표현형 넉아웃을 유도하고, 표적 항원에 직접 결합하거나, 세포내 수송을 우회하거나 또는 결합 파트너와의 결합을 저해함으로써 중화 작용제로 작용할 수 있다. 표적 항원에 대한 높은 특이성과 친화성으로, 인트라바디는 특정 표적 분자의 소정의 결합 상호작용을 차단하는 동시에 다른 것들을 절약하는 이점이 있다. 공여체 항체로부터의 서열은 인트라바디를 개발하는데 사용될 수 있다. 인트라바디는 종종 단리된 VH 및 VL 도메인과 같은 단일 도메인 단편 또는 세포 내의 단일 사슬 가변 단편(scFv) 항체로 재조합적으로 발현된다. 예를 들어, 인트라바디는 종종 가요성 링커 폴리펩타이드에 의해 연결된 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인을 포함하는 단일 사슬 항체를 형성하기 위해 단일 폴리펩타이드로서 발현된다. 인트라바디는 전형적으로 이황화 결합이 결여되어 있으며, 이들의 특이적 결합 활성을 통해 표적 유전자의 발현 또는 활성을 조절할 수 있다. 단일 사슬 인트라바디는 종종 재조합 핵산 분자로부터 발현되고, 세포내에서 유지되도록 조작된다(예를 들어, 세포질, 소포체 또는 주변 세포질에 유지됨). 인트라바디는 예를 들어, 문헌[Marasco et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:7889-7893; Chen et al. (1994) Hum. Gene Ther. 5:595-601; Chen et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:5932-5936; Maciejewski et al. (1995) Nat. Med. 1:667-673; Marasco (1995) Immunotech. 1: 1-19; Mhashilkar et al. (1995) EMBO J. 14: 542-1451; Chen et al. (1996) Hum. Gene Therap. 7:1515-1525; Marasco (1997) Gene Ther. 4:11-15; Rondon and Marasco (1997) Annu. Rev. Microbiol. 51:257-283; Cohen et al. (1998) Oncogene 17:2445-2456; Proba et al. (1998) J. Mol. Biol. 275:245-253; Cohen et al. (1998) Oncogene 17:2445-2456; Hassanzadeh et al. (1998) FEBS Lett. 437:81-86; Richardson et al. (1998) Gene Ther. 5:635-644; Ohage and Steipe (1999) J. Mol. Biol. 291:1119-1128; Ohage et al. (1999) J. Mol. Biol. 291:1129-1134; Wirtz and Steipe (1999) Protein Sci. 8:2245-2250; Zhu et al. (1999) J. Immunol. Methods 231:207-222; Arafat et al. (2000) Cancer Gene Ther. 7:1250-1256; der Maur et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:45075-45085; Mhashilkar et al. (2002) Gene Ther. 9:307-319; 및 Wheeler et al. (2003) FASEB J. 17:1733-1735)]에 기재되고 검토된 것과 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 생산될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 항체는 키메라 항체를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "키메라 항체"는 중쇄 및 경쇄의 일부는 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 클래스 또는 하위클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 이에 상동성이며, 사슬(들)의 나머지는 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 클래스 또는 하위클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 이에 상동성인 재조합 항체를 지칭한다(예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호; 문헌[Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6851-6855] 참조). 예를 들어, 본 명세서에서 관심있는 키메라 항체는 비인간 영장류(예를 들어, 구대륙 원숭이, 예컨대 개코 원숭이, 레서스 또는 사이노몰구스 원숭이)로부터 유래된 가변 도메인 항원-결합 서열 및 인간 불변 영역 서열을 포함하는 "영장류화된" 항체를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 항체는 인간화된 항체일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "인간화된 항체"는 하나 이상의 비인간(예를 들어, 뮤린) 항체 공급원으로부터의 최소 부분과 하나 이상의 인간 면역글로불린 공급원으로부터 유래된 나머지를 포함하는 키메라 항체를 지칭한다. 대부분의 경우, 인간화된 항체는 수여체의 항체로부터의 초 가변 영역의 잔기가 목적하는 특이성, 친화성 및/또는 능력을 갖는 비인간 종(공여체 항체), 예컨대 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류의 항체로부터의 초 가변 영역의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린(수여체 항체)이다. 일 실시형태에서, 항체는 인간화된 전장 항체일 수 있다. 인간화된 항체는 단백질 공학 기법(예를 들어, 문헌[Gussow and Seemann (1991) Meth. Enzymol. 203:99-121])을 사용하여 생성될 수 있다. 비-제한적 예로서, 항체는 미국 공개 제2013/0303399호에 교시된 방법을 사용하여 인간화되었을 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 항체는 시스테인-변형된 항체를 포함할 수 있다. "시스테인-변형된 항체에서," 시스테인 아미노산은 유전적 조작에 의해 항체의 표면에 삽입되거나 치환되고, 예를 들어 이황화 브리지를 통해 항체를 다른 분자에 접합시키는데 사용된다. 항체에 대한 시스테인 치환 또는 삽입은 기재되어 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,219,996호 참조). 항체의 부위-특이적 접합에 사용하기 위해 IgG 항체의 불변 영역에 시스테인 잔기를 도입하는 방법은 문헌[Stimmel et al. (2000) J. Biol. Chem. 275:330445-30450]에 의해 기재되어 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 항체 변이체 항체 모방체일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "항체 모방체(antibody mimetic)"는 항체의 기능 또는 효과를 모의하고, 이들의 분자 표적에 특이적으로 특이적으로 높은 친화성으로 결합하는 임의의 분자를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 항체 모방체는 단백질 스캐폴드로서 피브로넥틴 유형 III 도메인(Fn3)을 통합하도록 설계된 모노바디일 수 있다(미국 특허 제6,673,901호 및 제6,348,584호 참조). 일부 실시형태에서, 항체 모방체는 어피바디 분자, 아필린, 아피틴, 안티칼린, 아비머, 센타이린, DARPINS™, 파이노머 및 쿠니츠 및 도메인 펩타이드를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 것들을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 항체 모방체는 하나 이상의 비-펩타이드 영역을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 항체는 단일 항원-결합 도메인을 포함할 수 있다. 이러한 분자는 극도로 작고, 분자량이 전체 크기의 mAb에서 관찰된 것의 대략 1/10이다. 또한, 항체는 경쇄가 결여되어 있는 낙타 및 라마에서 발견되는 중쇄 항체의 항원-결합 가변 중쇄 영역(VHH)으로부터 유래된 "나노바디"를 포함할 수 있다(예를 들어, 문헌[Nelson (2010) Mabs 2:77-83] 참조).
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 항체는 "소형화"될 수 있다. mAb 소형화의 하나의 예는 작은 모듈형 면역의약품(small modular immunopharmaceutical: SMIP)이다. 1가 또는 2가일 수 있는 이러한 분자는 모두 링커 도메인에 의해 연결된 하나의 VL, 하나의 VH 항원-결합 도메인 및 1개 또는 2개의 불변 "효과기" 도메인을 함유하는 재조합 단일-쇄 분자이다(예를 들어, 문헌[Nelson (2010) Mabs 2:77-83] 참조). 이러한 분자는 불변 도메인에 의해 부여된 면역 효과기 기능을 유지하면서 단편에 의해 얻어진 증가된 조직 또는 종양 투과성의 이점을 제공하는 것으로 여겨진다. 소형화된 항체의 다른 예는 힌지 영역이 IgG4 분자로부터 제거된 "유니바디"라 한다. IgG4 분자는 불안정하며 경쇄-중쇄 이종이량체를 서로 교환할 수 있지만, 힌지 영역의 결실은 중쇄-중쇄 쌍을 완전히 방지하여 매우 특이적인 1가의 경쇄/중쇄 이종이량체를 남기고, Fc 영역을 유지하여 안정성 및 생체내 반감기를 보장한다. 이러한 구성은 IgG4가 FcR과 제대로 상호작용하지 않고 1가의 유니바디가 세포내 신호전달 복합체 형성을 촉진하지 못하기 때문에, 면역 활성화 또는 종양성 성장의 위험을 최소화할 수 있다(예를 들어, 문헌[Nelson (2010) Mabs 2:77-83] 참조).
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 항체 변이체는 단일-도메인 항체(sdAb 또는 나노바디)일 수 있다. 본 명세서에 사용되는 용어 "sdAb" 또는 "나노바디"는 단일 모노머성 가변 항체 도메인으로 이루어진 항체 단편을 지칭한다. 전체 항체와 마찬가지로, 이는 특정 항원에 선택적으로 결합할 수 있다. 일 양태에서, sdAb는 "낙타 Ig" 또는 "낙타 VHH"일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "낙타 Ig"는 중쇄 항체의 알려진 가장 작은 항원-결합 단위를 지칭한다(문헌[Koch-No lte et al (2007) FASEB J. 21:3490-3498]). "중쇄 항체" 또는 "낙타 항체"는 2개의 VH 도메인을 함유하고 경쇄가 없는 항체를 지칭한다(문헌[Hamers-Casterman et al. (1993) Nature 363:446-448 (1993); Sheriff et al. (1996) Nat. Struct. Biol. 3:733-736; Riechmann et al (1999) J. Immunol. Meth. 231:25-38]; PCT 공개 WO 1994/04678 및 WO 1994/025591; 및 미국 특허 제6,005,079호). 다른 양태에서, sdAb는 "면역글로불린 신규 항원 수용체"(immunoglobulin new antigen receptor: IgNAR)일 수 있다. 용어 "면역글로불린 신규 항원 수용체"는 1개의 가변 신규 항원 수용체(variable new antigen receptor: VNAR) 도메인과 5개의 불변 신규 항원 수용체(constant new antigen receptor: CNAR) 도메인의 동종이량체로 구성된 상어 면역 레퍼토리로부터의 항체의 클래스를 지칭한다. IgNAR은 알려진 가장 작은 면역 글로불린-기반 단백질 스캐폴드 중 일부를 나타내며, 매우 안정적이며 효율적인 결합 특징을 가지고 있다. 내재된 안정성은 (i) 뮤린 항체에서 발견되는 종래의 항체 VH 및 VL 도메인에 비해 상당한 수의 하전되고 친수성 표면 노출 잔기를 제공하는 기본 Ig 스캐폴드; 및 (ii) 루프간 이황화 브리지 및 루프내 수소 결합의 패턴을 포함하는 상보성 결정 역(CDR) 루프에서 구조적 특징의 안정화 둘 다에 기인할 수 있다. 다른 소형화된 항체 단편은 "상보성 결정 영역 펩타이드" 또는 "CDR 펩타이드"를 포함할 수 있다. CDR 펩타이드("최소 인식 단위"로도 알려짐)는 단일 상보성-결정 영역(complementarity-determining region: CDR)에 상응하는 펩타이드이며, 관심있는 항체의 CDR을 암호화하는 유전자를 구성함으로써 제조될 수 있다. 이러한 유전자는 예를 들어, 항체-생산 세포의 RNA로부터 가변 영역을 합성하기 위해 중합 효소 연쇄 반응을 사용하여 제조된다(예를 들어, 문헌[Larrick et al (1991) Methods Enzymol. 2:106] 참조).
항체의 항원-결합 단편을 포함하는 다른 변이체는 이황화-연결된 Fvs(sdFv), VL, VH, 낙타 Ig, V-NAR, VHH, 삼중특이성(Fab3), 이중특이성(Fab2), 트라이어바디(3가), 테트라바디(4가), 미니바디((scFv-CH3)2), 이중특이성 단일-쇄 Fv(Bis-scFv), IgG델타CH2, scFv-Fc, (scFv)2-Fc, 어피바디, 펩타이드 압타머, 아비머 또는 나노바디 또는 온전한 면역글로불린의 다른 항원 결합 서브서열을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 항체는 미국 특허 제5,091,513호에 기재된 것과 같은 항체일 수 있다. 이러한 항체는 생합성 항체 결합 부위(biosynthetic antibody binding site: BABS)로 거동하는 영역을 구성하는 아미노산의 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다. 부위는 1) 비-공유적으로 결합되거나 이황화 결합된 합성 VH 및 VL 이량체, 2) VH 및 VL이 폴리펩타이드 링커에 의해 부착된 VH-VL 또는 VL-VH 단일 사슬 또는 3) 개별 VH 또는 VL 도메인을 포함한다. 결합 도메인은 별도의 면역글로불린으로부터 유래될 수 있는 연결된 CDR 및 FR 영역을 포함한다. 생합성 항체는 또한 예를 들어, 효소, 독소, 고정화 매질 또는 방사성 원자에 대한 결합 부위 또는 부착 부위로 기능하는 다른 폴리펩타이드 서열을 포함할 수 있다. 생합성 항체를 생산하고, 항체의 생체내 생성에 의해 유도될 수 있는 임의의 특이성을 갖는 BABS를 설계하고, 이의 유사체를 생산하는 방법이 개시되어 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 항체는 미국 특허 제8,399,625호에 교시된 항체 수용체 프레임워크를 갖는 항체일 수 있다. 이러한 항체 수용체 프레임워크는 관심있는 항체로부터 CDR을 수용하는데 특히 적합할 수 있다.
일 실시형태에서, 항체는 조건부 활성 생물학적 단백질일 수 있다. 항체는 야생형의 정상적인 생리학적 조건에서 가역적 또는 비가역적으로 불활성화되는 조건부 활성 생물학적 단백질을 생성하는데 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 이러한 조건부 활성 생물학적 단백질 및 이러한 조건부 활성 생물학적 단백질의 용도가 제공된다. 이러한 방법 및 조건부 활성 단백질은 예를 들어, PCT 공개 WO 2015/175375 및 WO 2016/036916 및 미국 공개 제2014/0378660호에 교시되어 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 항체뿐만 아니라 변이체 및/또는 이의 단편은 재조합 폴리뉴클레오타이드를 사용하여 생산될 수 있다. 일 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 항체, 단편 또는 이의 변이체 중 적어도 하나를 암호화하기 위해 모듈형 디자인을 갖는다. 비-제한적 예로서, 폴리뉴클레오타이드 작제물은 임의의 다음의 디자인을 암호화할 수 있다: (1) 항체의 중쇄, (2) 항체의 경쇄, (3) 항체의 중쇄 및 경쇄, (4) 링커에 의해 분리된 중쇄 및 경쇄, (5) VH1, CH1, CH2, CH3 도메인, 링커 및 경쇄 또는 (6) VH1, CH1, CH2, CH3 도메인, VL 영역 및 경쇄. 임의의 이러한 디자인은 또한 임의의 도메인 및/또는 영역 사이에 선택적 링커를 포함할 수 있다. 본 발명에 포함되는 폴리뉴클레오타이드는 본 명세서에 기재된 항체 또는 임의의 성분 부분을 출발 분자로 사용하여 임의의 표준 클래스의 면역글로불린을 생산하도록 조작될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 항체는 치료적 항체이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "치료적 항체"는 질환 또는 장애가 있거나 이에 대한 소인이 있는 포유동물에서 질환 또는 장애를 치료하는데 효과적인 항체를 의미한다. 항체는 세포 침투 항체, 중화 항체, 효능제 항체, 부분적 효능제, 역 효능제, 부분적 길항제 또는 길항제 항체일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 항체는 네이키드 항체일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "네이키드 항체"는 독소, 또는 방사성 핵종에 결합하기 위한 킬레이트와의 접합과 같은 추가 변형을 함유하지 않는 온전한 항체 분자이다. 네이키드 항체의 Fc 부분은 보체 고정 및 ADCC(항체 의존성 세포 세포 독성(antibody dependent cell cytotoxicity))과 같은 효과기 기능을 제공할 수 있으며, 이는 세포 용해를 초래할 수 있는 작용으로 메커니즘을 설정한다(예를 들어, 문헌[Markrides (1998) Pharmacol. Rev. 50:59-87] 참조).
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 항체는 관심있는 바이오마커(예를 들어, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 바이오마커)를 발현하는 세포에 대한 ADCC 활성을 갖지 않는다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 항체는 관심있는 바이오마커(예를 들어, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 바이오마커)를 발현하는 세포에 대한 CDC 활성을 갖지 않는다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 항체는 다른 치료적 모이어티(예를 들어, 세포독성 작용제)에 접합되지 않는다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 항체는 세포에 결합시 및/또는 세포에 의한 내재화시 관심있는 바이오마커(예를 들어, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 바이오마커)를 발현하는 세포를 죽이지 않는다.
b. 항체 생성
본 발명에 포함되는 항체는 자연 발생적이거나, 또는 종래의 하이브리도마 기술, 재조합 기술, 돌연변이 또는 공지의 항체의 최적화, 항체 라이브러리 또는 항체 단편 라이브러리로부터의 선별 및 면역화에 의해 생성된 단일클론 항체(mAb)와 같이 당업계에 공지된 임의의 방법을 통해 인공적으로 제조된 것일 수 있다. 단일클론이든 다중클론이든 항체의 생성은 당업계에 잘 알려져 있다. 항체의 생산을 위한 기법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 문헌[Harlow and Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; Harlow and Lane "Using Antibodies: A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999 및 "Therapeutic Antibody Engineering: Current and Future Advances Driving the Strongest Growth Area in the Pharmaceutical Industry" Woodhead Publishing, 2012]에 기재되어 있다.
항체 개발의 방법은 전형적으로 항체 친화성 및/또는 특이성의 선택, 면역화 및/또는 확인을 위한 표적 분자의 사용에 의존한다. 본 발명에 따라 사용되는 표적 분자는 표적 항원을 포함한다. 표적 항원은 아미노산-기반 분자, 비-아미노산 기반 분자 또는 아미노산-기반 분자와 비-아미노산-기반 분자로 구성된 화합물일 수 있다. 용어 "아미노산" 및 "아미노산"은 모든 자연 발생적 L-알파-아미노산뿐만 아니라 비-자연 발생적 아미노산을 지칭한다. 아미노산은 다음과 같이 1문자 또는 3문자 지정에 의해 식별된다: 아스파르트산(Asp: D), 아이소류신(Ile: I), 트레오닌(Thr: T), 류신(Leu: L), 세린(Ser: S), 타이로신(Tyr: Y), 글루탐산(Glu: E), 페닐알라닌(Phe: F), 프롤린(Pro: P), 히스티딘(His: H), 글리신(Gly: G), 라이신(Lys: K), 알라닌(Ala: A), 아르기닌(Arg: R), 시스테인(Cys: C), 트립토판(Trp: W), 발린(Val: V), 글루타민(Gln: Q) 메티오닌(Met: M) 및 아스파라긴(Asn: N), 여기서 아미노산이 먼저 열거되고 괄호 안에 각각 3문자 코드 및 1문자 코드가 표시된다. 아미노산-기반 표적 항원은 단백질 또는 펩타이드일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "펩타이드"는 2 내지 50개 이상의 아미노산을 갖는 아미노산 기반 분자를 지칭한다. 특정 지시기호는 2개의 아미노산 분자를 나타내는 "다이펩타이드"와 3개의 아미노산 분자를 나타내는 "트라이펩타이드"를 갖는 작은 펩타이드에 적용한다. 50개 이상의 인접 아미노산을 갖는 아미노산 기반 분자는 폴리펩타이드 또는 단백질로 간주된다.
일부 실시형태에서, 항체는 면역학적 반응을 유도하는 면역원으로서 작용하는 하나 이상의 표적 항원으로 숙주의 면역화를 통해 제조될 수 있다. 일부 경우에서, 주어진 항원의 일부 또는 영역만이 사용될 수 있다. 아미노산-기반 항원의 경우, 하나 이상의 항원-유래 폴리펩타이드 또는 펩타이드(본 명세서에서 "항원 펩타이드"로도 지칭됨)가 사용될 수 있다. 항체를 생성하기에 적합한 항원 펩타이드는 바람직하게는 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 약 5 내지 약 50개의 아미노산, 약 10 내지 약 30개의 아미노산, 약 10 내지 약 20개의 아미노산, 약 40 내지 약 200개의 아미노산 또는 적어도 200개의 아미노산 길이의 서열을 함유한다. 대형 폴리펩타이드 또는 단백질이 항체를 생성하기 위해 사용되는 본 발명에 포함되는 소정의 실시형태에서, 이는 바람직하게는 적어도 50개, 적어도 55개, 적어도 60개, 적어도 70개, 적어도 80개, 적어도 90개 이상의 아미노산 길이이다.
면역화에 의한 항체 생성은 전형적으로 본 명세서에서 "면역원성 숙주"로 지칭되는 면역화를 위한 대상체로서 비인간 동물 숙주의 사용을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역원성 숙주는 임의의 척추동물로부터 선택된다. 추가의 실시형태에서, 면역원성 숙주는 모든 포유동물로부터 선택된다. 추가의 실시형태에서, 면역원성 숙주는 형질전환 또는 넉아웃 마우스를 포함하는 마우스이다. 다른 면역원성 숙주는 래트, 토끼, 고양이, 개, 염소, 양, 햄스터, 기니피그, 소, 말, 돼지, 라마, 낙타 및 닭을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에 기재된 표적 항원을 사용한 면역원성 숙주의 면역화는 하나 이상의 보조제(adjuvant)의 사용을 포함할 수 있다. 이러한 면역원성 숙주에서 더 높은 면역 반응을 유도하기 위해 보조제가 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따라 사용되는 보조제는 항체 역가에 영향을 미치는 능력에 기초하여 선택될 수 있다. 보조제는 프로인트(완전 및 불완전), 미네랄 겔, 예컨대 알루미늄 하이드록사이드, 표면 활성 물질, 예컨대 라이소레시틴, 플루로닉 폴리올, 다가 음이온, 펩타이드, 오일 에멀션, 키홀 림펫 헤모시아닌, 다이나이트로페놀 및 기타 유용한 인간 보조제, 예컨대 BCG(바실러스 칼메트-게린(Bacillus Calmette-Guerin)) 및 코리네박테리움 파리움(Corynebacterium parvum)을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 이러한 보조제는 또한 당업계에 잘 알려져 있다. 일부 실시형태에서, 유중수 에멀션은 보조제로서 유용할 수 있다. 유중수 에멀션은 이동성 항원 데포를 형성하고, 느린 항원 방출을 가능하게 하고, 면역 성분에 대한 항원 제시를 향상시킴으로서 작용할 수 있다. 프로인트 보조제는 건조 및 불활성화된 마이코박테리아성 입자를 포함하는 완전 프로인트 보조제(complete Freund's adjuvant: CFA) 또는 이러한 입자가 결여되어 있는 불완전 프로인트 보조제(incomplete Freund's adjuvant: IFA)로 사용될 수 있다. 다른 유중수-기반 보조제는 EMULSIGEN®(엠브이피 테크로로지스(MVP 기술), 네브래스카주 오마하)을 포함한다. EMULSIGEN®은 동물-기반 성분을 포함하지 않은 마이크론-크기의 오일 액적을 포함한다. 이는 단독으로 또는 알루미늄 하이드록사이드 및 CARBIGENTM(엠브이피 테크로로지스, 네브래스카주 오마하)를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 다른 보조제와 조합하여 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, TITERMAX® 보조제가 사용될 수 있다. TITERMAX®는 스쿠알렌뿐만 아니라 소르비탄 모노올리에이트 80(유화제로서) 및 기타 성분을 포함하는 또 다른 유중수 에멀션이다. 일부 경우에서, TITERMAX®는 더 높은 면역 반응을 제공할 수 있지만, 면역원성 숙주에 대한 독성은 감소된다. 면역자극성 올리고뉴클레오타이드 또한 보조제로서 사용될 수 있다. 이러한 보조제는 예를 들어, CpG 올리고데옥시뉴클레오타이드(ODN)(문헌[Chu et al. (2000) Infect. Immunity 68:1450-1456]; ODN은 임의의 상업적으로 입수 가능한 것들, 예컨대 ODN-1585, ODN-1668, ODN-1826, ODN-2006, ODN-2007, ODN-2216, ODN-2336, ODN-2395 및/또는 ODN-M362를 포함할 수 있으며, 이들 각각은 예를 들어, 인비보젠(InvivoGen)(캘리포니아주 샌디에고)으로부터 구입할 수 있음), 또는 특정 화학량론하에서 콜레스테롤, 포스포리피드 및 퀼라자 사포닌(Quillaia saponin)을 함께 혼합할 때 자발적으로 형성되는 구형의 개방 케이지형 구조(전형적으로 직경 40㎚)인 면역 자극 복합체(immune stimulating complex: ISCOM)(예를 들어, AbISCO-100, 이스코노바(Isconova), 스웨덴 웁살라 참조)를 포함할 수 있다. 본 발명에 포함되는 실시형태에 따르면, 면역화 용액의 보조제 성분은 목적하는 결과를 얻기 위해 달라질 수 있다. 이러한 결과는 면역원성 숙주에서 전체 면역 반응 수준 및/또는 독성 수준을 조절하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명에 포함되는 단일클론 항체는 당업자에게 공지된 잘 확립된 방법에 의해 제조될 수 있다. 일 실시형태에서, 단일클론 항체는 하이브리도마 기술(문헌[Kohler et al. (1975) Nature 256:495-497])을 사용하여 제조된다. 하이브리도마 방법에서, 마우스, 햄스터 또는 다른 적절한 면역원성 숙주 동물은 전형적으로 면역화제에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유도하기 위해 면역화제(예를 들어, 표적 항원)로 면역화된다. 대안적으로, 림프구는 시험관내에서 면역화될 수 있다. 그런 다음, 림프구는 하이브리도마 세포를 형성하기 위해 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적합한 융합제를 사용하여 불멸화된 세포주와 융합된다(문헌[Goding, J.W., Monoclonal Antibodies: Principles and Practice. Academic Press. 1986; 59-1031]). 불멸화된 세포주는 일반적으로 형질전환된 포유동물 세포, 특히 설치류, 토끼, 소 및 인간 기원의 골수종 세포이다. 일반적으로, 래트 또는 마우스 골수종 세포주가 사용된다. 하이브리도마 세포는 바람직하게는 비융합되고 불멸화된 세포의 성장 또는 생존을 저해하는 하나 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지에서 배양될 수 있다. 예를 들어, 모 세포가 효소 하이포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼레이스(HGPRT 또는 HPRT)가 결여되어 있는 경우, 하이브리도마를 위한 배양 배지는 전형적으로 하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘("HAT 배지")을 포함할 것이며, 이 물질은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 방지한다.
일부 실시형태에서, 불멸화된 세포주는 효율적으로 융합되고, 선택된 항체-생산 세포에 의한 항체의 안정한 고수준 발현을 지원하고, HAT 배지와 같은 배지에 민감한 것들이다. 이러한 세포주는 예를 들어, 살크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터(Salk Institute Cell Distribution Center; 캘리포니아주 샌디에고) 및 아메리칸 타입 컬처 컬렉션(American Type Culture Collection; 버지니아주 머내서스)로부터 얻을 수 있는 뮤린 골수종 세포주일 수 있다. 인간 골수종 및 마우스-인간 헤테로골수종 세포주 또한 인간 단일클론 항체의 생성에 대해 기술되었다(문헌[Kozbor et al. (1984) J. Immunol. 133:3001-3005; Brodeur, B. et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications. Marcel Dekker, Inc., New York. 1987; 33:51-63]). 그 후, 하이브리도마 세포가 배양된 배양 배지는 단일클론 항체의 존재에 대해 검정될 수 있다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생성된 단일클론 항체의 결합 특이성(즉, 특이적 면역반응성)은 면역침강 또는 시험관내 결합 검정, 예컨대 방사성 면역검정(RIA) 또는 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA)에 의해 결정된다. 이러한 기법 및 검정은 당업자에게 알려져 있다. 단일클론 항체의 결합 특이성은 예를 들어, 스케챠드 분석(Scatchard analysis)에 의해 결정될 수 있다(문헌[Munson (1980) Anal. Biochem. 107:220-239]). 목적하는 하이브리도마 세포가 확인된 후, 희석 절차를 제한하여 클론을 서브 클로닝하고 표준 방법으로 성장시킬 수 있다. 이러한 목적에 적합한 배양 배지는 예를 들어, 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 대안적으로, 하이브리도마 세포는 포유동물에서 복수(ascite)로서 생체내에서 성장될 수 있다. 서브 클론에 의해 분비되는 단일 클론 항체는 예를 들어, 단백질 A-세파로스, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 종래의 면역글로불린 정제 절차에 의해 배양 배지 또는 복수액으로부터 단리된 또는 정제될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 단일클론 항체는 또한 미국 특허 제4,816,567호에 기재된 것들과 같은 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명에 포함되는 단일클론 항체를 암호화하는 DNA는 종래의 절차를 사용하여(예를 들어, 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용함으로써) 쉽게 단리되고 시퀀싱될 수 있다. 본 발명에 포함되는 하이브리도마 세포는 바람직한 DNA 공급원의 역할을 한다. 일단 단리되면, DNA는 재조합 숙주 세포에서 단일클론 항체의 합성을 위해, 발현 벡터에 배치된 다음 시미안 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소(Chinese hamster ovary: CHO) 세포 또는 달리 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 골수종 세포와 같은 숙주 세포로 형질감염될 수 있다. DNA는 또한 예를 들어, 상동 뮤린 서열 대신 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열로 치환함으로써 또는 면역글로불린 코딩 서열을 비-면역글로불린 폴리펩타이드에 대한 코딩 서열의 전부 또는 일부와 공유적으로 연결시킴으로써 변형될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호 참조). 이러한 비-면역글로불린 폴리펩타이드는 본 발명에 포함되는 항체의 불변 도메인으로 치환될 수 있거나 또는 키메라 2가 항체를 생성하기 위해 본 발명에 포함되는 항체의 가변 도메인으로 치환될 수 있다.
본 발명에 포함되는 항체는 또한 다중클론 항체의 생산을 위해 당업계에 잘 알려져 있는 다양한 절차에 의해 생산될 수 있다. 다중클론 항체의 생산은 전형적으로 유리 또는 담체-결합 면역원(예를 들어, 표적 항원)을 사용, 예를 들어 복강내 및/또는 피내 주사에 의한 면역원성 숙주 동물, 예컨대 토끼, 래트, 마우스, 양 또는 염소의 면역화를 포함한다. 주사 물질은 전형적으로 약 100㎍의 면역원 또는 담체 단백질을 함유하는 에멀션이다. 예를 들어, 고체 표면에 흡착된 유리 펩타이드를 사용하는 ELISA 검정에 의해 검출될 수 있는 유용한 항체의 역가를 제공하기 위해, 예를 들어 약 2주 간격으로 여러 부스터 주사가 필요할 수 있다. 면역화된 동물의 혈청 내 항체 역가는 항체의 선택에 의해 증가될 수 있으며, 예를 들어 고체 지지체에의 펩타이드의 흡착 및 당업계에 잘 알려진 방법에 따라 선택된 항체의 용리에 의해 증가될 수 있다.
c. 항체 선택
원하는 항체는 표적 항원 및/또는 이의 에피토프에 대한 친화성 및/또는 특이성에 기초하여 2개 이상의 후보 항체의 더 큰 혼주(pool)로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체 선택은 항체 결합 검정을 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 검정은 표면 플라스몬 공명(SPR)-기반 검정, ELISA 및 유세포 분석-기반 검정을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 검정은 표적 항원을 사용하여 원하는 항체에 결합한 다음 결합을 검출하기 위해 하나 이상의 검출 방법을 사용할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 항체는 고 처리량(high throughput)의 발견 방법을 사용하여 선택 및 생산될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 항체는 디스플레이 라이브러리의 사용을 통해 생산된다. 용어 "디스플레이"는 주어진 디스플레이 숙주의 표면에 있는 단백질 또는 펩타이드의 발현 또는 "디스플레이"를 지칭한다. 용어 "라이브러리"는 고유한 cDNA 서열의 집단을 지칭한다. 라이브러리는 최소 2개의 고유한 cDNA에서 수 천억개의 고유한 cDNA까지 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 합성 항체를 포함하는 검출제는 항체 디스플레이 라이브러리 또는 항체 단편 디스플레이 라이브러리를 사용하여 생산된다. 용어 "항체 단편 디스플레이 라이브러리"는 각각의 구성원이 항체의 적어도 하나의 가변 영역을 함유하는 항체 단편을 암호화하는 디스플레이 라이브러리를 지칭한다. 이러한 항체 단편은 바람직하게는 Fab 단편이지만, 단일-쇄 가변 단편(scFv)과 같은 다른 항체 단편도 또한 상정된다. Fab 항체 단편 라이브러리에서, 암호화된 각각의 Fab는 Fab 단편의 상보성 결정 영역(CDR)의 가변 루프 내에 포함된 아미노산 서열을 제외하고 동일할 수 있다. 대안적 또는 추가적인 실시형태에서, 개별 VH 및/또는 VL 영역 내의 아미노산 서열은 또한 다를 수 있다.
디스플레이 라이브러리는 효모, 박테리오파지(본 명세서에서 "파지" 또는 "파지 입자"로도 지칭됨), 박테리아 및 레트로바이러스를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 다수의 가능한 숙주(본 명세서에서 "디스플레이 숙주"로도 지칭됨)에서 발현될 수 있다. 사용될 수 있는 추가적인 디스플레이 기술은 리보솜-디스플레이, 마이크로비드-디스플레이 및 단백질-DNA 결합 기법을 포함한다. 발현될 때, Fab는 주어진 표적 항원과 상호작용할 수 있는 숙주(예를 들어, 파지 또는 효모)의 표면을 장식한다. 임의의 표적 항원이 그 표적에 대해 가장 높은 친화성을 갖는 항체 단편을 발현하는 디스플레이 숙주를 선택하기 위해 사용될 수 있다. 그런 다음, 결합된 항체 단편의 가변 도메인을 암호화하는 DNA 서열이 결합된 입자 또는 세포를 사용하는 시퀀싱을 통해 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 양성 선택은 항체의 개발에 사용된다. 용어 "양성 선택"은 항체 및/또는 이의 단편이 바람직한 표적 부위를 함유하는 표적 항원에 대한 친화성에 기초하여 디스플레이 라이브러리로부터 선택되는 과정을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 음성 선택은 항체의 개발에 이용된다. 용어 "음성 선택"은 항체 개발 동안 주어진 디스플레이 라이브러리로부터의 항체 및/또는 이의 단편을 배제하기 위해 비-표적 작용제가 사용되는 과정을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 양성 및 음성 선택 과정 둘 다 디스플레이 라이브러리를 사용하는 항체의 개발에서 여러 라운드의 선택 동안 이용된다.
효모 디스플레이에서, 상이한 항체 단편을 암호화하는 cDNA는 이들이 발현되는 효모 세포에 도입되며, 항체 단편은 문헌[Chao et al. (2006) Nat. Protoc. 1:755-768]에 기재된 바와 같이 세포 표면에 "디스플레이된다". 효모 표면 디스플레이에서, 발현된 항체 단편은 효모 어글루티닌 단백질, Aga2p를 포함하는 추가적인 도메인을 함유한다. 이러한 도메인은 항체 단편 융합 단백질이 표면-발현된 Aga1p와의 이황화 결합의 형성을 통해 효모 세포의 외부 표면에 부착되도록 한다. 결과는 특정 항체 단편으로 코팅된 효모 세포이다. 이러한 항체 단편을 암호화하는 cDNA의 디스플레이 라이브러리는 항체 단편이 각각 고유의 서열을 갖는 초기에 이용된다. 이러한 융합 단백질은 원하는 표적과 상호작용할 수 있는 수백만 개의 효모 세포의 세포 표면에서 발현되고, 세포와 함께 항온처리된다. 표적 펩타이드는 적합한 항체 단편과의 성공적인 결합이 일어난 후 효율적인 세포 분류를 가능하게 하기 위해 화학적 또는 자성기로 공유적으로 또는 달리 변형될 수 있다. 회수는 자성-활성화 세포 분류(magnetic-activated cell sorting: MACS), 형광-활성화 세포 분류(fluorescence-activated cell sorting: FACS) 또는 당업계에 공지되어 있는 다른 세포 분류 방법에 의해 이루어질 수 있다. 일단 효모 세포의 하위 집단이 선택되면, 상응하는 플라스미드는 디스플레이된 항체 단편의 서열을 결정하기 위해 분석될 수 있다.
박테리오파지 디스플레이 방법은 전형적으로 fd, F1 및 M13 비리온을 포함하는 섬유상 파지를 이용한다. 이러한 균주는 비-용해성이며, 숙주의 지속적인 증가와 바이러스 역가의 증가를 허용한다. 본 발명에 포함되는 항체를 제조하기 위해 사용될 수 있는 파지 디스플레이 방법의 예는 문헌[Miersch et al. (2012) Methods. 57:486-498; Bradbury et al. (2011) Nat. Biotechnol. 29:245-254; Brinkman et al. (1995) J. Immunol. Meth. 182:41-50; Ames et al. (1995) J. Immunol. Meth. 184:177-186; Kettleborough et al. (1994) Eur. J. Immunol. 24:952-958); Persic et al. (1997) Gene 187:9-18)]; PCT 공개 PCT/GB91/01134, WO 90/02809, WO 91/10737, WO 92/01047, WO 92/18619, WO 93/11236, WO 95/15982 및 WO 95/20401; 및 미국 특허 제5,698,426호; 제5,223,409호; 제5,403,484호; 제5,580,717호; 제5,427,908호; 제5,750,753호; 제5,821,047호; 제5,571,698호; 제5,427,908호; 제5,516,637호; 제5,780,225호; 제5,658,727호; 제5,733,743호 및 제5,969,108호에 개시된 것들을 포함한다.
박테리오파지상에서의 항체 단편 발현은 단편을 암호화하는 cDNA를 바이러스 외피 단백질을 발현하는 유전자에 삽입함으로써 수행될 수 있다. 섬유상 박테리오파지의 바이러스 외피는 단일 가닥의 게놈에 의해 암호화된 5개의 외피 단백질로 구성된다. 외피 단백질 pIII은 전형적으로 N-말단에서 항체 단편 발현에 바람직한 단백질이다. 항체 단편 발현이 pIII의 기능을 훼손하는 경우, 바이러스 기능은 야생형 pIII의 공동발현을 통해 복구될 수 있으며, 이러한 발현은 바이러스 외피에서 발현되는 항체 단편의 수를 감소시킬 것이지만, 표적에 의한 항체 단편에 대한 접근을 향상시킬 수 있다. 바이러스뿐만 아니라 항체 단편 단백질의 발현은 대안적으로 다중 플라스미드상에서 암호화될 수 있다. 이러한 방법은 감염성 플라스미드의 전체 크기를 줄이고 형질전환 효율을 향상시키는 데 사용될 수 있다. 파지 디스플레이 라이브러리는 수백만에서 수십억 개의 파지 입자를 포함할 수 있으며, 각각은 이들의 바이러스 외피상에서 고유의 항체 단편을 발현한다. 이러한 라이브러리는 하나 이상의 표적에 대해 다양한 수준의 친화성을 갖는 잠재적으로 수백 개의 항체 단편을 선택하는데 사용될 수 있는 매우 다양한 자원을 제공할 수 있다(문헌[McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-554; Edwards et al. (2003) JMB 334:103-118; Schofield et al. (2007) Genome Biol. 8:R254; 및 Pershad et al. (2010) Prot. Engin. Design Select.. 23:279-288]). 종종, 이러한 라이브러리에 존재하는 항체 단편은 가요성 링커(예를 들어, Ser/Gly-풍부 링커)에 의해 연결된 VH 및 VL 항체 도메인의 융합 단백질을 포함하는 scFv 항체 단편을 포함한다. 이러한 단편은 전형적으로 먼저 VH 도메인을 포함하지만, VL-링커-VH 단편도 또한 본 명세서에서 상정된다. 일부 경우에서, scFv는 상보성 결정 영역(CDR)의 가변 루프를 암호화하는 고유의 서열을 제외하고 동일한 서열을 함유할 수 있다. 일부 경우에서, scFv는 바이러스 외피 단백질(예를 들어, 바이러스 pIII 외피 단백질의 N-말단)에 연결된 융합 단백질로서 발현된다. VL 사슬은 바이러스 외피로의 복잡한 혼입 이전에 주변 세포질에서 VH 사슬과의 조립을 위해 별도로 발현될 수 있다.
일부 실시형태에서, 파지 농축은 표적 항원이 파지 용액과 조합된 용액에 존재하는 용액-상(solution-phase) 파지 농축을 포함한다. 이러한 방법에 따르면, 표적 항원은 용액으로부터의 회수 및 결합된 파지의 회수를 용이하게 하기 위해 검출 가능한 표지(예를 들어, 바이오틴 표지)를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 용액-상 파지 농축은 비드(예를 들어, 스트렙타비딘 비드)에 결합된 표적의 사용을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 이러한 비드는 침전을 용이하게 하기 위해 자성 비드일 수 있다. 다른 실시형태에서, 파지 농축은 표적 항원이 고체 표면에 고정되는 고체-상 농축을 포함할 수 있다. 이러한 방법에 따르면, 파지 용액은 고정된 표적을 이용한 농축을 위해 고체 표면에 접촉하는데 사용될 수 있다. 고체 표면은 표적을 유지할 수 있는 임의의 표면을 포함할 수 있으며, 디쉬, 플레이트, 플라스크, 막 및 튜브를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 경우에서, 이러한 튜브의 내부 표면이 표적 항원으로 코팅된(예를 들어, 바이오티닐화된 표적을 스트렙타비딘 또는 뉴트라비딘-코팅된 튜브를 통해 통과시킴으로써) 면역 튜브가 사용될 수 있다. 면역 튜브를 사용한 파지 농축은 결합된 표적을 농축하기 위해 튜브를 통한 파지 용액의 통과에 의해 수행될 수 있다.
선택 후, 결합된 파지는 다음 라운드의 농축을 위해 증폭된 결과물 라이브러리를 생성하기 위해 헬퍼 파지로 공동 감염된 대장균 배양물을 감염시키는데 사용될 수 있다. 이러한 과정은 점점 범위가 좁아지는 클론 세트를 생성하기 위해 반복될 수 있다. 일부 실시형태에서, 농축의 라운드는 선택된 파지의 다양성을 개선하기 위해 제한된다. 침전된 라이브러리 구성원은 목적하는 scFv를 암호화하는 cDNA를 얻기 위해 결합된 파지로부터 시퀀싱될 수 있다. 이러한 서열은 재조합 항체 생성을 위해 항체 서열에 직접 혼입되거나 또는 돌연변이되고, 시험관내 친화성 성숙을 통해 추가의 최적화를 위해 이용될 수 있다. 선택된 scFv로부터의 하나 이상의 가변 도메인을 포함하는 IgG 항체가 추가 테스트 및/또는 제품 개발을 위해 합성될 수 있다. 이러한 항체는 하나 이상의 scFv cDNA 세그먼트를 IgG 생산에 적합한 발현 벡터에 삽입하여 생산될 수 있다.
d. 항체 공학
위에 기재된 바와 같이, 항체 및 항체 단편, 예컨대 Fabs 및 scFv를 생산하는 데 사용될 수 있는 기법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 미국 특허 제4,946,778호 및 제5,258, 498호; 문헌[Miersch et al. (2012) Methods 57:486-498; Chao et al. (2006) Nat. Protoc. 1:755-768), Huston et al. (1991) Methods Enzymol. 203:46-88; Shu et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:7995-7999; 및 Skerra et al. (1988) Science 240:1038-1041]에 기재된 것을 포함한다.
표적 항원-특이적 항체의 단리 또는 선택 후, 항체 서열이 이러한 항체의 재조합 생성 및/또는 최적화를 위해 사용될 수 있다. 디스플레이 라이브러리로부터의 항체 단편 단리의 경우, 단리된 단편으로부터의 코딩 영역은 인간 항체를 포함하는 전체 항체 또는 임의의 다른 목적하는 표적 결합 단편을 생성하고, 예를 들어 아래에 더 상세히 기재되는 바와 같이 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모 및 박테리아를 포함하는 임의의 목적하는 숙주에서 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 원한다면, IgG 항체(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)는 본 명세서에 기재된 방법에 따라 생산되거나 선택된 가변 도메인 단편으로부터 추가의 테스트 및/또는 제품 개발을 위해 합성될 수 있다. 이러한 항체는 목적하는 아미노산 서열을 암호화하는 cDNA의 하나 이상의 세그먼트를 IgG 생성에 적합한 발현 벡터에 삽입함으로써 생산될 수 있다. 발현 벡터는 포유동물 세포에서 IgG 발현에 적합한 포유동물 발현 벡터를 포함할 수 있다. IgG의 포유동물 발현은 생산된 항체가 포유동물 단백질의 특징인 변형(예를 들어, 글리코실화)을 포함하고/하거나 항체 제제에 내독소 및/또는 세균성 발현 시스템의 단백질 제제에 존재할 수 있는 기타 오염물질이 없음을 보장하도록 수행될 수 있다.
일부 실시형태에서, 친화성 성숙이 수행된다. 용어 "친화성 성숙"은 항체- 또는 항체 단편-암호화 cDNA 서열의 연속적인 라운드의 돌연변이 및 선택을 통해 주어진 표적에 대한 친화성을 증가시켜 항체를 생산하는 방법을 지칭한다. 일부 경우에서, 이러한 과정은 시험관내에서 수행된다. 이를 달성하기 위해, 가변 도메인 서열(일부 경우, CDR 코딩 서열로 제한됨)의 증폭은 점 돌연변이, 영역 돌연변이, 삽입 돌연변이 및 결실 돌연변이를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 돌연변이를 함유하는 수백만 개의 카피를 생성하기 위해 오류가 발생하기 쉬운 PCR(error-prone PCR)을 사용하여 수행될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "점 돌연변이"는 뉴클레오타이드 서열 내의 하나의 뉴클레오타이드가 상이한 뉴클레오타이드로 변경되는 핵산 돌연변이를 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "영역 돌연변이"는 2개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드가 상이한 뉴클레오타이드로 변경되는 핵산 돌연변이를 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "삽입 돌연변이"는 하나 이상의 뉴클레오타이드가 뉴클레오타이드 서열에 삽입된 핵산 돌연변이를 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "결실 돌연변이"는 하나 이상의 뉴클레오타이드가 뉴클레오타이드 서열로부터 제거된 핵산 돌연변이를 지칭한다. 삽입 또는 결실 돌연변이는 전체 코돈의 완전한 대체 또는 시작 코돈의 하나 또는 두개의 뉴클레오타이드를 변경함으로써 하나의 코돈을 다른 코돈으로 변경하는 것을 포함할 수 있다.
중쇄 및 경쇄 CDR 영역에 단일 돌연변이를 갖는 수백만 개의 돌연변이체를 생성하기 위해 CDR-암호화 cDNA 서열에서 돌연변이 유발이 수행될 수 있다. 다른 접근법에서, 무작위 돌연변이는 친화성을 향상시킬 가능성이 가장 높은 CDR 잔기에만 도입된다. 이러한 새로 생성된 돌연변이 유발 라이브러리는 표적 펩타이드에 대해 훨씬 더 높은 친화성을 갖는 항체 단편을 암호화하는 클론을 스크리닝하기 위한 과정을 반복하는데 사용될 수 있다. 계속되는 라운드의 돌연변이 및 선택은 더 크고 더 큰 친화성으로 클론의 합성을 촉진한다(예를 들어, 문헌[Chao et al. (2006) Nat. Protoc. 1:755-768] 참조).
친화성 성숙된 클론은 결합 검정(예를 들어, FACS, ELISA, 표면 플라스몬 공명 등)에 의해 결정되는 바와 같이 친화성에 기초하여 선택될 수 있다. 그런 다음, 선택된 클론은 IgG로 전환되고, 친화성 및 기능적 활성에 대해 추가로 테스트될 수 있다. 일부 경우에, 친화성 최적화의 목표는 원래의 항체의 친화성과 비교하여 친화성을 적어도 2-배, 적어도 3-배, 적어도 4-배, 적어도 5-배, 적어도 6-배, 적어도 7-배, 적어도 8-배, 적어도 9-배, 적어도 10-배, 적어도 20-배, 적어도 30-배, 적어도 40-배, 적어도 50-배, 적어도 100-배, 적어도 500-배 또는 적어도 1,000-배 이상 증가시키는 것이다. 최적화된 친화성이 목적하는 것보다 작은 경우, 과정은 반복될 수 있다.
일부 실시형태에서, 키메라 및/또는 인간화된 항체를 생성하는 것이 유용하다. 예를 들어, 인간에서 항체의 생체내 사용 및 시험관내 검출 검정을 포함하는 일부 사용의 경우, 키메라, 인간화된 또는 인간 항체를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 키메라 항체는 뮤린 단일클론 면역글로불린 및 인간 면역글로불린 불변 영역으로부터 유래되는 가변 영역을 갖는 항체와 같이 항체의 상이한 부분이 상이한 동물 종으로부터 유래된 분자이다. 키메라 항체를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Morrison (1985) Science 229:1202-1207; Gillies et al. (1989) J. Immunol. Meth. 125:191-202]; 및 미국 특허 제5,807,715호; 제4,816,567호; 및 제4,816,397호 참조).
인간화된 항체는 목적하는 표적에 결합하고, 비인간 종으로부터의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR) 및 인간 면역글로불린 분자로부터의 프레임워크 영역을 갖는 비인간 종으로부터의 항체 분자이며이다. 종종, 인간 프레임워크 영역에서 프레임워크 잔기는 표적 결합을 변경, 바람직하게는 개선시키기 위해 공여체 항체의 CDR 및 프레임워크 영역으로부터의 상응하는 잔기로 치환된다. 이러한 프레임워크 치환은 당업계에 잘 알려져 있는 방법에 의해, 예를 들어 표적 결합에 중요한 프레임워크 잔기를 확인하기 위해 CDR 및 프레임워크 잔기의 상호작용을 모델링하고, 특정 위치에서 비정상적인 프레임워크 잔기를 확인하기 위해 서열 비교함으로써 확인된다(예를 들어, 미국 특허 제5,693,762호 및 제5,585,089호; 문헌[Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327] 참조).
항체는 예를 들어, CDR-이식(예를 들어, 유럽 공개 제239,400호; PCT 공개 WO 91/09967; 미국 특허 제5,225,539호; 제5,530,101호; 및 제5,585,089호 참조); 베니어링 또는 리서페이싱(예를 들어, 유럽 공개 제592,106호; 유럽 공개 제519,596호; 문헌[Padlan (1991) Mol. Immunol. 28:489-498; Studnicka et al. (1994) Protein Eng. 7:805-814; Roguska et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:969-973] 참조); 및 사슬 셔플링(예를 들어, 미국 특허 제5,565,332호 참조)을 포함하는 당업계에 공지된 다양한 기법을 사용하여 인간화될 수 있다.
완전 인간 항체는 외래 단백질에 대한 면역 반응을 피하거나 완화시키기 위해 인간 환자의 치료적 치료에 특히 바람직하다. 인간 항체는 인간 면역글로불린 서열로부터 유래된 항체 라이브러리를 사용하여, 위에 기재된 바와 같은 항체 디스플레이 방법을 포함하는 다양한 당업계에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제4,444,887호 및 제4,716,111호; 및 PCT 공개 WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 및 WO 91/10741 참조). 인간 항체는 기능적 내인성 면역글로불린은 발현할 수 없지만 인간 면역글로불린 폴리뉴클레오타이드를 발현할 수 있는 형질전환 마우스를 사용하여 생산될 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 폴리뉴클레오타이드 복합체는 마우스 배아 줄기 세포에 무작위로 또는 상동 재조합으로 도입될 수 있다. 대안적으로, 인간 중쇄 및 경쇄 폴리뉴클레오타이드에 더하여 인간 가변 영역, 불변 영역 및 다양성 영역이 마우스 배아 줄기 세포에 도입될 수 있다. 마우스 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 폴리뉴클레오타이드는 상동 재조합에 의해 인간 면역글로불린 유전자좌의 도입과는 별도로 또는 동시에 비기능적으로 만들어질 수 있다. 특히, JH 영역의 동형접합성 결실은 내인성 항체 생성을 방지한다. 변형된 배아 줄기 세포는 증식되고, 키메라 마우스를 생성하기 위해 배반포에 미세주입된다. 그런 다음, 키메라 마우스는 인간 항체를 발현하는 동형접합성 자손을 생성하기 위해 사육된다. 형질전환 마우스는 선택된 면역원(예를 들어, 표적 항원)으로 정상적인 방식으로 면역화된다. 이러한 기법을 사용하여, 유용한 인간 IgG, IgA, IgM, IgD 및 IgE 항체를 생성할 수 있다. 위에 예시한 바와 같이, 인간 항체 및 인간 단일클론 항체를 생상하는 방법 및 이러한 항체를 생산하기 위한 프로토콜은 당업계에 잘 알려져 있다(또한, 예를 들어, PCT 공개 WO 98/24893, WO 92/01047, WO 96/34096 및 WO 96/33735; 및 미국 특허 제5,413,923호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 제5,569,825호; 제5,661,016호; 제5,545,806호; 제5,814,318호; 제5,885,793호; 제5,916,771호; 제5,939,598호; 제6,075,181호; 및 제6,114,598호 참조).
일단 본 발명에 포함되는 항체 분자가 동물, 세포주에 의해 생산되거나, 화학적으로 합성 또는 재조합적으로 발현되면, 이는 면역글로불린 또는 폴리펩타이드 분자의 정제를 위한 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해, 예를 들어 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환, 친화성, 특히 특정 표적에 대한 친화성, 단백질 A 및 사이징 칼럼 크로마토그래피), 원심분리, 용해도 차이 또는 단백질 정제를 위한 임의의 다른 표준 기법에 의해 정제(즉, 단리)될 수 있다. 또한, 본 발명에 포함되는 항체 또는 이의 단편은 정제를 용이하게 하기 위해 본 명세서에 기재된 또는 그렇지 않으면 당업계에 공지된 이종성 폴리펩타이드 서열에 융합될 수 있다.
본 발명에 따르면, 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 용액에 존재하거나 또는 기질에 결합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체는 셀룰로스 나노비드에 결합되며, 검출 장치의 기질의 하나 이상의 검출 영역에 제한된다.
e. 항체 특성화
본 발명에 포함되는 항체는 구조, 동형 단백질, 결합(예를 들어, 친화성 및 특이성), 접합, 글리코실화 및 다른 구별되는 특징으로 이루어진 군으로부터 선택되는 특징 중 하나 이상을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 포함되는 항체는 조류 및 포유동물을 포함하는 임의의 동물 기원으로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 항체는 인간, 뮤린(예를 들어, 마우스 및 래트), 당나귀, 양, 토끼, 염소, 기니피그, 낙타, 말 또는 닭 기원의 항체이다. 본 발명에 포함되는 항체는 단일특이성 또는 다중특이성일 수 있다. 다중특이성 항체는 본 발명에 포함되는 펩타이드의 상이한 에피토프에 대해 특이적일 수 있거나, 또는 본 발명에 포함되는 펩타이드 및 이종성 펩타이드 또는 고체 지지체 물질과 같은 이종성 에피토프 둘 다에 특이적일 수 있다(예를 들어, PCT 공개 WO 93/17715, WO 92/08802, WO 91/00360 및 WO 92/05793; 문헌[Tutt et al. (1991) J. Immunol. 147:60-69]; 미국 특허 제4,474,893호; 제4,714,681호; 제4,925,648호; 제5,573,920호; 및 제5,601,819호; 및 문헌[Kostelny et al. (1992) J. Immunol. 148:1547-1553] 참조). 예를 들어, 항체는 본 발명에 포함되는 펩타이드 서열의 반복된 단위를 포함하는 펩타이드에 대해 생성될 수 있거나, 본 발명에 포함되는 2개 이상의 펩타이드 서열을 포함하는 펩타이드 또는 이들의 조합에 대해 생성될 수 있다. 비-제한적 예로서, 비만 세포 결합 IgE 항체에 대한 항원 결합을 경쟁적으로 저해하여 비만 세포 탈과립을 저해하는 헤테로2가 리간드(heterobivalent ligand: HBL) 시스템이 설계되었다(문헌[Handlogten et al. (2011) Chem. Biol. 18:1179-1188]).
항체 특징은 시험관내 또는 생체내에서 정상적인 생리학적 조건하에서 표준과 관련하여 결정될 수 있다. 항체의 존재 또는 부재에 대해 측정될 수 있다. 이러한 측정 방법은 웨스턴 블롯, 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA), 활성 검정, 리포터 검정, 루시퍼레이스 검정, 중합 효소 연쇄 반응(PCR) 어레이, 유전자 어레이, 실시간 역전사효소(RT) PCR 등과 같은 혈청 또는 혈액과 같은 조직 또는 체액에서의 표준 측정을 포함한다.
항체는 표적 단백질상의 또는 이를 따라 임의의 수의 위치와 결합하거나 상호작용할 수 있다. 상정되는 항체 표적 부위는 표적 단백질상의 임의의 그리고 모든 가능한 부위를 포함한다. 항체는 특정 표적상의 하나 이상의 에피토프에 결합(가역적 또는 비가역적)하는 능력에 대해 선택될 수 있다. 표적상의 에피토프는 하나 이상의 특징, 영역, 도메인, 화학적기, 기능적기 또는 모이어티를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 이러한 에피토프는 하나 이상의 원자, 원자 그룹, 원자 구조, 분자 구조, 고리형 구조, 소수성 구조, 친수성 구조, 당, 지질, 아미노산, 펩타이드, 글리코펩타이드, 핵산 분자 또는 임의의 다른 항원 구조로 구성될 수 있다.
f. 항체 접합체
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 항체는 당업계에 잘 알려져 있는 방법에 따라 검출 목적을 위해 하나 이상의 검출 가능한 표지와 접합될 수 있다. 표지는 방사성 동위원소, 형광 화합물, 화학발광 화합물, 효소 또는 효소 보조인자 또는 당업계에 공지되어 있는 임의의 다른 표지일 수 있다. 일부 실시형태에서, 목적하는 표적(본 명세서에서 "일차 항체"로도 지칭됨)에 결합하는 항체는 표지되지 않지만, 일차 항체에 특이적으로 결합하는 제2 항체(본 명세서에서 "이차 항체"로 지칭됨)의 결합에 의해 검출될 수 있다. 이러한 방법에 따르면, 2차 항체는 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 항체에 부착될 수 있는 효소는 서양고추냉이 퍼옥시데이스(horseradish peroxidase: HRP), 알칼리성 포스파테이스 및 글루코스 옥시데이스(glucose oxidase: GOx)를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 형광 화합물은 에티듐 브로마이드; 플루오레세인 및 이의 유도체(예를 들어, FITC); 사이아닌 및 이의 유도체(예를 들어, 인도카보사이아닌, 옥사카보사이아닌, 티아카보사이아닌 및 메로사이아닌); 로다민; 오레곤 그린; 에오신; 텍사스 레드; 나일 레드; 나일 블루; 크리스탈 바이올렛; 옥사진 170; 프로플라빈; 아크리딘 오렌지; 아크리딘 옐로우; 아우라민; 크리스탈 바이올렛; 말라카이트 그린; 포핀; 프탈로사이아닌; 빌리루빈; 알로피코시아닌(allophycocyanin: APC); 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein: GFP) 및 이의 변이체(예를 들어, 황색 형광 단백질 YFP, 청색 형광 단백질 BFP 및 시안 형광 단백질 CFP); ALEXIFLOUR® 화합물(써모 피셔 사이언티픽(써모 피셔 Scientific), 매사추세츠주 월섬); 및 양자점을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 표지 항체를 표지하는데 사용될 수 있는 다른 접합체는 바이오틴, 아비딘 및 스트렙타비딘을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 항체-약물 접합체(다른 접합체: ADC) 작용제를 포함한다. ADC는 작용제가 항체에 의해 부여된 표적화 능력과 모이어티에 의해 부여된 추가적인 효과를 갖도록 하는 다른 모이어티와 항체의 접합체이다. 예를 들어, 세포독성 약물은 질환 진행(예를 들어, 종양 진행)에 기여하는 관심있는 세포에 대한 약물을 표적화하는 단일클론 항체에 연결되며, 내재화시 독성 페이로드(payload)를 세포로 방출할 수 있다. 위에 기재된 바와 같이 접합된 모이어티에 기초하여 상이한 효과가 달성된다.
4. 소분자 작용제
다른 양태에서, 소분자 작용제는 본 발명에 포함된다. 소분자는 본 명세서에 기재된 바이오마커(예를 들어, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 하나 이상의 표적)의 저해제, 활성인자 또는 조절인자일 수 있다. 용어 "소분자"는 생물학적 과정을 조절하는데 도움이 될 수 있는, 크기가 대략 10-9m인 저분자량(즉, 약 900달톤 미만) 유기 화합물을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 소분자는 효소의 저해제(예를 들어, 카이네이스 및 전사 인자)일 수 있다.
소분자는 또한 예를 들어, 다형체, 슈도다형체, 용매화물, 수화물, 비용매화된 다형체(무수화물 포함), 입체 다형체 및 비정질 형태의 화합물뿐만 아니라 이들의 혼합물을 포함하는 이러한 화합물의 결정질 및 비정질 형태를 포함할 수 있다. 용어 "결정질 형태" 및 "다형체"는 특정 결정질 또는 비정질 형태가 달리 의도되지 않는 한, 예를 들어 다형체, 슈도다형체, 용매화물, 수화물, 비용매화된 다형체(무수화물 포함), 입체 다형체 및 비정질 형태뿐만 아니라 이들의 혼합물을 포함하는 화합물의 모든 결정질 및 비정질 형태를 포함하는 것으로 의도된다.
표적 유전자 및/또는 유전자 산물에 결합하며 이를 조절하는 알려진 소분자뿐만 아니라 영향을 받은 생물학적 활성 및 경로에 관한 정보는 공개적으로 이용 가능한 데이터베이스, 예컨대 Drugbank, PharmGKB, MedChemExpress 및 Selleckchem으로부터 쉽게 결정될 수 있다.
5. 세포-기반 작용제
다른 양태에서, 세포-기반 작용제가 상정된다. 일부 실시형태에서, 단핵구 및/또는 대식세포는 하나 이상의 작용제와 접촉되어 본 발명에 포함되는 하나 이상의 바이오마커(예를 들어, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 하나 이상의 표적)을 조절하는 것과 같이 조작된다. 예를 들어, 배양된 세포 및/또는 일차 세포는 작용제와 접촉되고, 처리되고, 검정, 대상체 등에 도입될 수 있다. 이러한 세포의 자손은 본 명세서에 기재된 세포-기반 작용제에 포함된다.
일부 실시형태에서, 단핵구 및/또는 대식세포는 본 발명에 포함되는 하나 이상의 바이오마커(예를 들어, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 하나 이상의 표적)를 조절하기 위해 재조합적으로 조작된다. 예를 들어, 위에 기재된 바와 같이, 관심있는 바이오마커의 구성적 또는 유도된 넉아웃 또는 돌연변이와 같은 게놈 편집이 관심있는 바이오마커의 카피 수 또는 유전자 서열의 조절을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, CRISPR-Cas 시스템은 게놈 핵산의 정확한 편집을 위해(예를 들어, 비-기능적 또는 널(null) 돌연변이를 생성하기 위해) 사용될 수 있다. 이러한 실시형태에서, CRISPR 가이드 RNA 및/또는 Cas 효소가 발현될 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA만을 함유하는 벡터는 Cas9 효소에 대해 형질전환된 동물 또는 세포에 투여될 수 있다. 유사한 전략이 사용될 수 있다(예를 들어, 아연 핑거 뉴클레이스(zinc finger nuclease: ZFN), 전사 활성인자-유사 효과기 뉴클레이스(transcription activator-like effector nuclease: TALEN) 또는 호밍 메가뉴클레이스(homing meganuclease: HE), 예컨대 MegaTAL, MegaTev, Tev-mTALEN, CPF1 등). 이러한 시스템은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, 미국 특허 제8,697,359호; 문헌[Sander and Joung (2014) Nat. Biotech. 32:347-355; Hale et al. (2009) Cell 139:945-956; Karginov and Hannon (2010) Mol. Cell 37:7]; 미국 공개 제2014/0087426호 및 제2012/0178169호; 문헌[Boch et al. (2011) Nat. Biotech. 29:135-136; Boch et al. (2009) Science 326:1509-1512; Moscou and Bogdanove (2009) Science 326:1501; Weber et al. (2011) PLoS One 6:e19722; Li et al. (2011) Nucl. Acids Res. 39:6315-6325; Zhang et al. (2011) Nat. Biotech. 29:149-153; Miller et al. (2011) Nat. Biotech. 29:143-148; Lin et al. (2014) Nucl. Acids Res. 42:e47]). 이러한 유전적 전략은 당업계에 잘 알려진 방법에 따라 구성적 발현 시스템 또는 유도성 발현 시스템을 사용할 수 있다.
세포-기반 작용제는 대상 숙주에 대한 면역적합성 관계를 가지며, 임의의 이러한 관계는 본 발명에 따라 사용하기 위해 상정된다. 예를 들어, 입양 단핵구 및/또는 대식세포, T 세포 등과 같은 세포는 동계일 수 있다. 용어 "동계(syngeneic)"는 특히 항원 또는 면역적 반응과 관련하여 유전적으로 동일한 동일한 종으로부터 유래, 기원하는 또는 이의 구성원인 상태를 지칭할 수 있다. 이는 일치하는 MHC 유형을 가진 일란성 쌍둥이를 포함한다. 따라서, "동계 이식"은 공여체와 유전적으로 동일하거나 또는 바람직하지 않은 불리한 면역원성 반응(예를 들어, 명세서에 기재된 면역학적 스크리닝 결과의 해석에 불리할 수 있는 것과 같은 것) 없이 이식이 가능하도록 충분히 면역학적으로 적합한 수여체에게 세포를 전달하는 것을 지칭한다.
동계 이식은 전달된 세포가 동일한 대상체로부터 얻어지고 이식되는 경우 "자가(autologous)"일 수 있다. "자가 이식"은 대상체 자신의 세포 또는 장기의 수확 및 재주입 또는 이식을 지칭한다. 자가 세포의 배타적 또는 보충적 사용은 세포를 숙주로 다시 투여하는 많은 부작용, 특히 이식편대 숙주 반응을 제거하거나 감소시킬 수 있다.
동계 이식은 전달된 세포가 동일한 종의 다른 구성원으로부터 얻어지고 이식되지만 주 조직적합성 복합체(MHC) 항원과 충분히 일치하여 불리한 면역 원성 반응을 피하는 경우 "일치 동종이계(matched allogeneic)"일 수 있다. MHC 불일치 정도를 결정하는 것은 당업계에 공지되고 사용되는 표준 테스트에 따라 달성될 수 있다. 예를 들어, 인간의 MHC 유전자에는 이식 생물학에서 중요한 것으로 확인된 적어도 6개의 주요 범주가 있다. HLA-A, HLA-B, HLA-C는 HLA 클래스 I 단백질을 암호화하는 반면, HLA-DR, HLA-DQ 및 HLA-DP는 HLA 클래스 II 단백질을 암호화한다. 이러한 각 그룹 내의 유전자는 인간 집단에서 발견되는 수많은 HLA 대립 유전자 또는 변이체에 반영된 대로 고도로 다형성이며, 이러한 그룹간의 차이는 이식된 세포에 대한 면역 반응의 강도와 관련이 있다. MHC 일치 정도를 결정하기위한 표준 방법은 HLA-B 및 HLA-DR 또는 HLA-A, HLA-B 및 HLA-DR 그룹 내의 대립 유전자를 검사한다. 따라서, 테스트는 각각 2개 또는 3개의 HLA 그룹 내에서 적어도 4 및 심지어 5개 또는 6개의 MHC 항원으로 이루어질 수 있다. 혈청학적 MHC 테스트에서, 각각의 HLA 항원 유형에 대한 항체는 항체와 반응하는 소정의 MHC 항원의 존재 또는 부재를 결정하기 위해 한 대상체(예를 들어, 공여체)로부터의 세포와 반응된다. 이는 다른 대상체(예를 들어, 수여체)의 반응성 프로파일과 비교된다. 항체와 MHC 항원의 반응은 전형적으로 항체를 세포와 항온처리한 다음 보체를 추가하여 세포 용해(즉, 림프구 독성 테스트)를 유도함으로써 결정된다. 반응은 반응에서 용해된 세포의 양에 따라 조사되고 등급이 매겨진다(예를 들어, 문헌[Mickelson and Petersdorf (1999)　Hematopoietic Cell Transplantation, Thomas, E. D. et al. eds., pg 28-37, Blackwell Scientific, Malden, Mass] 참조). 다른 세포-기반 검정은 표지된 항체 또는 효소 연결 면역검정(ELISA)을 사용하는 유세포 분석을 포함한다. MHC 유형을 결정하는 분자 방법은 잘 알려져 있으며, 일반적으로 HLA 단백질을 암호화하는 특정 유전자 서열을 검출하기 위해 합성 프로브 및/또는 프라이머를 사용한다. 합성 올리고뉴클레오타이드는 특정 HLA 유형과 관련된 제한 단편 길이 다형성을 검출하기 위해 혼성화 프로브로서 사용될 수 있다(문헌[Vaughn (2002)　방법. Mol. Biol. MHC Protocol.　210:45-60]). 대안적으로, 프라이머는 HLA 서열을 증폭하는데 사용될 수 있으며(예를 들어, 중합 효소 연쇄 반응 또는 결찰 연쇄 반응에 의해), 그 생성물은 직접 DNA 시퀀싱, 제한 단편 다형성 분석(restriction fragment polymorphism analysis: RFLP) 또는 일련의 서열 특이적 올리고뉴클레오타이드 프라이머와의 혼성화(series of sequence specific oligonucleotide primer: SSOP)에 의해 더 검사될 수 있다(문헌[Petersdorf et al. (1998)　Blood　92:3515-3520; Morishima et al. (2002)　Blood 99:4200-4206; 및　Middleton and　Williams (2002)　Method. Mol. Biol. MHC Protocol.　210:67-112]).
동계 이식은 전형적으로 근친교배에 의해 정의된 유전자좌, 예컨대 단일 유전자좌가 상이할 경우 "유사유전자형(congenic)"일 수 있다. 용어 "유사유전자형"은 동일한 종으로부터 유래, 기원하는 또는 이의 구성원인 것을 지칭하며, 여기서 구성원은 작은 유전적 영역, 전형적으로 단일 유전자좌(즉, 단일 유전자)를 제외하고는 유전적으로 동일하다. "유사유전자형 이식"은 공여체로부터 수여체에게 세포 또는 장기를 전달하는 것을 지칭하며, 여기서 수여체는 단일 유전자좌를 제외하고는 공여체에 대해 유전적으로 동일하다. 예를 들어, CD45는 여러 대립유전자 형태로 존재하며, CD45.1 또는 CD45.2 대립유전자 버전이 발현되는지에 따라 마우스 계통이 다른 유사유전자형 마우스 계통이 존재한다.
대조적으로, "불일치 동종이계(mismatched allogeneic)"는 전형적으로 불리한 면역원성 반응을 이끌어내기에 충분한 정의된 수의 MHC 항원의 혈청학적 또는 분자 분석과 같은 당업계에서 사용되는 표준 검정에 의해 결정되는 바와 같이 비-동일한 주 조직적합성 복합체(MHC) 항원(즉, 단백질)을 갖는 동일한 종으로부터 유래, 기원하는 또는 이의 구성원인 것을 지칭한다. "부분적 불일치"는 구성원 간에, 전형적으로 공여체와 수여체 간에 테스트된 MHC 항원의 부분적 일치를 지칭한다. 예를 들어, "절반 불일치"는 두 구성원 간에 상이한 MHC 항원 유형을 보여주는 것으로 테스트된 MHC 항원의 50%를 지칭한다. “완전(full or complete)” 미스매치는 테스트된 모든 MHC 항원이 두 구성원 간에 상이한 것을 지칭한다.
유사하게는, 대조적으로, "이종(xenogeneic)"은 상이한 종, 예를 들어 인간 및 설치류, 인간 및 돼지, 인간 및 침팬지 등으로부터 유래, 기원하는 또는 이의 구성원인 것을 지칭한다. "이종 이식"은 세포 또는 장기를 공여체로부터 수여체에게 전달하는 것을 지칭하며, 여기서 수여체는 공여체와는 상이한 형태의 종이다.
또한, 세포는 단일 공급원 또는 다수의 공급원(예를 들어, 단일 대상체 또는 다수의 대상체)로부터 수득될 수 있다. 복수는 적어도 2개(예를 들어, 하나 이상)을 지칭한다. 여전히 다른 실시형태에서, 비인간 포유동물은 마우스이다. 관심있는 세포 유형이 수득될 수 있는 동물은 성체, 신생아(예를 들어, 생후 48시간 미만), 미성숙일 수 있거나 또는 자궁 내(in utero)에 있을 수 있다. 관심있는 세포 유형은 일차 암 세포, 암 줄기 세포, 확립된 암 세포주, 불멸화된 일차 암 세포 등일 수 있다. 소정의 실시형태에서, 숙주 대상체의 면역 체계는 이식된 암 세포와 면역학적으로 적합하도록 조작되거나 또는 그렇지 않으면 선택될 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 대상체는 인간 세포와 양립하기 위해 "인간화"될 수 있다. 용어 "인간화된 면역 체계"는 숙주 동물로부터 거부되지 않고 생존하여 인간 조혈과 후천성 및 선천성 면역력 둘 다를 숙주 동물에서 재구성되도록 하는 인간 HSC 계통 세포 및 인간 후천성 및 선천성 면역 세포를 포함하는 마우스와 같은 동물을 지칭한다. 후천성 면역 세포는 T 세포 및 B 세포를 포함한다. 선천성 면역 세포는 대식세포, 과립구(호염구, 호산구, 호중구), DC, NK 세포 및 비만 세포를 포함한다. 대표적인, 비-제한적 예는 SCID-hu, Hu-PBL-SCID, Hu-SRC-SCID, NSG(NOD-SCID IL2r-감마(널)은 선천성 면역 체계, B 세포, T 세포 및 사이토카인 신호전달이 결여됨), NOG(NOD-SCID IL2r-감마(절단됨)), BRG(BALB/c-Rag2(널)IL2r-감마(널)) 및 H2dRG(Stock-H2d-Rag2(널)IL2r-감마(널)) 마우스(예를 들어, 문헌[Shultz et al. (2007) Nat. Rev. Immunol. 7:118; Pearson et al. (2008) Curr. Protocol. Immunol. 15:21; Brehm et al. (2010) Clin. Immunol. 135:84-98; McCune et al. (1988) Science 241:1632-1639], 미국 특허 제7,960,175호 및 미국 공개 제2006/0161996호 참조), 또한 Rag1(B 세포 및 T 세포가 결여됨), Rag2(B 세포 및 T 세포가 결여됨), TCR 알파(T 세포가 결여됨), 퍼포린(cD8+ T 세포는 세포독성 기능이 결여됨), FoxP3(기능성 CD4+ T 조절성 세포가 결여됨), IL2rg 또는 Prfl과 같은 면역-관련 유전자의 관련 널 돌연변이체, 또한 인간 면역 세포의 효율적인 생착을 허용하고/하거나 마우스와 같은 면역 손상 동물의 구획-특이적 모델을 제공하는 PD-1, PD-L1, Tim3 및/또는 2B4의 돌연변이체 또는 넉아웃(예를 들어, PCT 공개 WO 2013/062134 참조)을 포함한다. 또한, NSG-CD34+(NOD-SCID IL2r-감마(널) CD34+) 인간화된 마우스는 마우스와 같은 동물 모델에서 인간 유전자 및 종양 활성을 연구하는데 유용하다.
본 명세서에 사용되는, 생물학적 물질 공급원으로부터 "수득된"은 공여체로부터 생물학적 물질의 공급원을 채취하거나 분할하는 임의의 종래의 방법을 의미한다. 예를 들어, 생물학적 물질은 고형 종양, 말초혈액 또는 제대혈 샘플과 같은 혈액 샘플로부터 수득되거나 또는 골수 또는 양수와 같은 다른 체액으로부터 채취될 수 있다. 이러한 샘플을 얻는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 본 발명에서, 샘플은 신선할 수 있다(즉, 동결없이 공여체로부터 수득됨). 또한, 샘플은 확장 전에 외부의 또는 원치않는 성분을 제거하기 위해 더 조작될 수 있다. 샘플은 또한 보존된 스톡으로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 세포주 또는 말초혈액 또는 제대혈과 같은 체액의 경우에, 샘플은 이러한 세포주 또는 체액의 극저온 또는 그렇지 않으면 보존된 은행에서 회수될 수 있다. 이러한 샘플은 임의의 적합한 공여체로부터 수득될 수 있다.
수득된 세포의 집단은 직접 사용되거나 또는 나중에 사용하기 위해 냉동될 수 있다. 냉동 보존을 위한 다양한 배지 및 프로토콜이 당업계에 공지되어 있다. 일반적으로, 동결 배지는 약 5% 내지 10%의 DMSO, 10% 내지 90%의 혈청 알부민 및 50% 내지 90%의 배양 배지를 포함할 것이다. 세포 보존에 유용한 다른 첨가제는 예로서 제한없이, 트레할로스(문헌[Scheinkoniget al. (2004) Bone Marrow Transplant.　34:531-536])와 같은 이당류 또는 헤타전분(hetastarch)(즉, 하이드록시에틸 전분)과 같은 혈장 부피 확장제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 포스페이트-완충 식염수와 같은 등장성 완충액 용액이 사용될 수 있다. 예시적 동결보존 조성물은 4% HSA, 7.5% 다이메틸 설폭사이드(DMSO) 및 2% 헤타전분을 함유하는 세포-배양 배지를 갖는다. 동결보존을 위한 다른 조성물 및 방법은 잘 알려져 있으며, 당업계에 기재되어 있다(예를 들어, 문헌[Broxmeyer et al. (2003)　Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.　100:645-650] 참조). 세포는 약 -135℃ 미만의 최종 온도에서 보존된다.
일부 실시형태에서, 면역요법은 CAR(chimeric antigen receptor(키메라 항원 수용체))-T 요법일 수 있으며, 여기서 T 세포는 관심있는 종양 세포상의 항원에 특이적인 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR을 발현하도록 조작된다. 용어 "키메라 항원 수용체" 또는 "CAR"은 항원 결합시 세포내 신호를 전파하기 위해 목적하는 항원 특이성 및 신호전달 도메인을 갖는 수용체를 지칭한다. 예를 들어, T 림프구는 주 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 I 또는 II 분자에 의해 제시된 짧은 펩타이드를 갖는 T 세포 수용체(TCR)의 상호작용을 통해 특정 항원을 인식한다. 초기 활성화 및 클론 확장을 위해, 미경험 T 세포는 추가적인 공동-자극성 신호를 제공하는 전문 항원-제시 세포(antigen-presenting cell: APC)에 의존한다. 공동-자극의 부재하에 TCR 활성화는 무반응성 및 클론성 무력성을 초래할 수 있다. 면역화를 우회하기 위해, 이식된 인식 특이성을 갖는 세포독성 효과기 세포의 유도를 위한 상이한 접근법이 개발되었다. TCR-관련 CD3 복합체의 세포-표면 성분에 특이적인 천연의 리간드 또는 항체로부터 유래된 결합 도메인으로 구성된 CAR이 구축되었다. 항원 결합시, 이러한 키메라 항원 수용체는 효과기 세포의 내인성 신호 전달 경로에 연결되어 TCR 복합체에 의해 시작된 것과 유사한 활성화 신호를 생성한다. 키메라 항원 수용체에 대한 첫 번째보고 이후, 이러한 개념은 꾸준히 개선되었고, 키메라 수용체의 분자 설계가 최적화되었으며, scFV, Fav 및 단편 본 명세서에 기재된 다른 단백질 결합과 같은 임의의 수의 잘 알려진 결합 도메인을 일상적으로 사용하고 있다.
일부 실시형태에서, 단핵구 및 대식세포는 예를 들어, 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 조작될 수 있다. 변형된 세포는 종양에 침투하여 표적 암 세포를 죽임으로써 강력한 면역 효과기로서 작용하는 종양 미세환경에 동원될 수 있다. CAR은 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 도메인을 포함한다. 항원 결합 도메인은 표적 세포상의 항원에 결합한다. CAR의 항원 결합 도메인에 결합하는 항원으로 작용할 수 있는 세포 표면 마커의 예는 바이러스, 박테리아, 기생충 감염, 자가면역 질환 및 암 세포(예를 들어, 종양 항원)와 관련된 것들을 포함한다.
일 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 관심있는 종양 또는 암에 특이적인 항원과 같은 종양 항원에 결합한다. 종양 관련 항원의 비-제한적 예는 BCMA, CD19, CD24, CD33, CD38; CD44v6, CD123, CD22, CD30, CD117, CD171, CEA, CS-1, CLL-1, EGFR, ERBB2, EGFRvIII, FLT3, GD2, NY-BR-1, NY- ESO-1, p53, PRSS21, PSMA, ROR1, TAG72, Tn Ag, VEGFR2를 포함한다.
일 실시형태에서, 막관통 도메인은 CAR에서 하나 이상의 도메인과 자연적으로 결합된다. 막관통 도메인은 천연 또는 합성 공급원으로부터 유래될 수 있다. 본 발명에서 특별히 사용되는 막관통 영역은 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 사슬, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, 톨-유사 수용체 1(TLR1), TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8 및 TLR9로부터 유래될 수 있다(즉, 적어도 이들의 막관통 영역(들)을 포함함). 일부 예에서, 인간 Ig(면역글로불린) 힌지를 포함하는 다양한 인간 힌지도 사용될 수 있다.
일 실시형태에서, CAR의 세포 내 도메인은 신호 활성화 및/또는 형질도입을 담당하는 도메인을 포함한다. 세포내 도메인의 예는 TCR, CD3 제타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD86, 공통 FcR 감마, FcR 베타(Fc 엡실론 Rib), CD79a, CD79b, Fc감마 RIIa, DAP10, DAP 12, T 세포 수용체(TCR), CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM(LIGHTR), SLAMF7, NKp80(KLRF1), CD127, CD160, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD l id, ITGAE, CD103, ITGAL, CDl la, LFA-1, ITGAM, CDl lb, ITGAX, CDl lc, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(택타일), CEACAMl, CRTAM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGLl, CD100(SEMA4D), CD69, SLAMF6(NTB-A, Lyl08), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD 162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, 톨-유사 수용체 1(TLR1), TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, 본 명세서에 기재된 다른 공동-자극성 분자, 이의 임의의 유도체, 변이체 또는 단편, 동일한 기능적 능력을 갖는 공동 자극성 분자의 임의의 합성 서열 및 이들의 임의의 조합을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 하나 이상의 분자 또는 수용체로부터의 단편 또는 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 작용제, 조성물 및 방법은 다른 면역 효과기 세포, 예를 들어 T 세포에 항원을 제시하는 능력을 증가시키기 위해 단핵구 및 대식세포를 재조작하는데 사용될 수 있다. 항원 제시 세포(APC)로서 조작된 단핵구 및 대식세포는 종양 항원을 가공하고, T 세포에 항원성 에피토프를 제시하여 종양 세포 공격에 대한 후천성 면역 반응을 자극할 것이다.
V. 용도 및 방법
본 명세서에 기재된 조성물 및 작용제는 본 명세서에 기재된 바이오마커(예를 들어, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 하나 이상의 표적)에 관한 다양한 조절, 치료법, 스크리닝, 진단, 예후 예측 및 치료적 적용에 사용될 수 있다. 조절 방법, 치료 방법, 스크리닝 방법, 진단 방법, 예후 예측 방법 또는 이들의 조합과 같은 본 명세서에 기재된 임의의 방법에서, 방법의 모든 단계는 단일 행위자에 의해 또는 대안적으로 한 명 이상의 행위자에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 진단은 치료적 치료를 제공하는 행위자에 의해 직접 수행될 수 있다. 대안적으로, 치료제를 제공하는 사람은 진단 검정이 수행되도록 요청할 수 있다. 진단자 및/또는 치료 중재자는 치료 전략을 결정하기 위해 진단 검정 결과를 해석할 수 있다. 유사하게는, 이러한 대안적 과정은 예후 예측 검정과 같은 다른 검정에 적용될 수 있다.
또한, 본 명세서에 기재된 본 발명의 임의의 양태는 단독으로 또는 하나, 둘 이상의 또는 이들의 모든 실시형태를 포함하는 본 발명의 임의의 다른 양태와 조합하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 진단 및/또는 스크리닝 방법은 단독으로 또는 적절한 진단 및/또는 스크리닝 결과를 결정할 때 적절한 요법을 제공하는 것과 같이 치료 단계와 조합하여 수행될 수 있다.
1. 조절 및 치료 방법
본 발명에 포함되는 일 양태는 치료적 목적을 위해서와 같이 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 바이오마커(예를 들어, 표 1, 표 2에 열거된 하나 이상의 표적, 실시예 등)의 카피 수, 양(예를 들어, 발현) 및/또는 활성(예를 들어, 세포내 국재화 조절)을 조절하는 방법에 관한 것이다. 이러한 작용제는 단핵구 및/또는 대식세포의 특정 하위집단을 조작하고, 생리학적 조건에서 이들의 수 및/또는 활성을 조절하는데 사용될 수 있으며, 대식세포 관련 질환 및 다른 임상적 병태를 치료하기 위한 용도로 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 포함되는 조성물 및 약제학적 제형을 포함하는 작용제는 바이오마커(예를 들어, 표 1, 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적, 실시예 등)의 카피 수, 양 및/또는 활성을 조절할 수 있으며, 이에 의해 단핵구 및/또는 대식세포의 염증성 표현형을 조절하고, 면역 반응을 추가로 조절한다. 일부 실시형태에서, 면역 반응 자체를 조절하기보다는 세포 활성(예를 들어, 사이토카인 분비, 세포 집단 비 등)이 조절된다. 본 명세서에 기재된 작용제, 조성물 및 제형을 사용하여 단핵구 및 대식세포 염증성 표현형을 조절하는 방법이 제공된다. 따라서, 작용제, 조성물 및 방법은 바이오마커(예를 들어, 표 1, 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적, 실시예 등)의 카피 수, 양 및/또는 활성을 조절함으로써 면역 반응을 조절하는데 사용될 수 있고, 소정의 유형의 세포를 고갈 또는 농축시키고/시키거나 세포 유형의 비를 조절한다. 예를 들어, 소정의 표 1 및/또는 표 2에 열거된 표적은 세포 생존에 필요하며, 이러한 표적을 저해하는 것은 세포 사멸로 이어진다. 면역 반응을 매개하는 세포 유형(예를 들어, 전-염증성 대 항-염증성 세포)의 비가 조절되기 때문에, 이러한 조절은 면역 반응을 조절하는데 유용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 작용제는 암을 앓고 있는 대상체에서 암을 치료하는데 사용된다.
본 개시내용은 대식세포에서 이러한 유전자의 발현의 하향조절이 대식세포를 재분극화(예를 들어, 표현형을 변화시킴)할 수 있음을 보여준다. 일부 실시형태에서, M2 대식세포의 표현형은 제1형(M2-유사) 또는 M1 표현형을 갖는 대식세포를 생성하도록 변경되거나, 또는 M1 대식세포 및 제2형(M2-유사) 또는 M2 표현형과 관련하여 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 작용제는 M2 표현형을 갖는 단핵구 및 대식세포의 조절(예를 들어, 저해) 수송, 분극화 및/또는 활성화에 사용되거나, 또는 제1형 및 M1 대식세포와 관련하여 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 본 발명은 M1 대식세포, M2 대식세포(예를 들어, 종양에서의 TAM) 등과 같은 관심있는 단핵구 및/또는 대식세포의 집단을 감소시키는 방법을 더 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 전-종양성 대식세포 및 항-종양성 대식세포와 같은 이들의 하위유형을 포함하는 단핵구 및/또는 대식세포의 분포를 변화시키는 방법을 제공한다. 일 예에서, 본 발명은 항-염증성 면역 반응으로부터 전-염증성 면역 반응으로 대식세포를 유도하는 방법을 제공하며 및 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 세포 유형은 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 이상, 또는 그 사이를 포함하는 임의의 범위, 예컨대 45% 내지 55%까지 고갈 및/또는 농축될 수 있다.
일부 실시형태에서, 조절은 세포, 예컨대 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포와 같은 다른 포식세포에서 일어난다. 일부 실시형태에서, 세포는 본 명세서에 기재된 대식세포 하위유형과 같은 대식세포 하위유형이다. 예를 들어, 대식세포는 혈류에서 순환하는 단핵구로부터 유래된 조직 상주 대식세포(TAM) 또는 대식세포일 수 있다.
일부 실시형태에서, 단핵구 및/또는 대식세포 염증성 표현형을 조절하는 것은 목적하는 조절된 면역 반응, 예컨대 비정상적인 단핵구 이동 및 증식의 조절, 조직 상주 대식세포의 조절되지 않은 증식, 조절되지 않은 전-염증성 대식세포, 조절되지 않은 항-염증성 대식세포, 조직에서 전-염증성 및 항-염증성 대식세포 하위집단의 불균형한 분포, 질환 병태에서 단핵구 및 대식세포의 비정상적으로 채택된 활성화 상태, 조절된 세포독성 T-세포 활성화 및 기능, 요법에 대한 암 세포의 저항성 및 면역관문 요법과 같은 요법에 대한 암 세포의 감수성의 극복이 발생한다. 일부 실시형태에서, 이러한 표현형은 역전된다.
단핵구 및 대식세포와 관련된 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법은 세포를 시험관내, 생체외 또는 생체내(예를 들어, 대상체에게 투여)에서 본 발명에 포함되는 작용제 및 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하되, 작용제 및 조성물은 단핵구 및 대식세포의 이동, 동원, 분화 및 분극화, 활성화, 기능 및/또는 생존을 조절한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 바이오마커의 조절(예를 들어, 저해 또는 고갈)은 종양 조직과 같은 조직 미세환경에서 단핵구 및 대식세포의 증식, 동원, 분극화 및/또는 활성화를 조절하기 위해 사용된다.
본 발명에 포함되는 일 양태에서, 단핵구 및/또는 대식세포의 항-염증성 활성을 감소시키는 방법이 제공된다.
본 발명에 포함되는 다른 양태에서, 단핵구 및/또는 대식세포의 전-염증성 활성을 증가시키 방법이 제공된다.
본 발명에 포함되는 다른 양태에서, 조직에서 전-염증성 단핵구 및 대식세포 및 항-염증성 단핵구 및 대식세포의 균형을 맞추는 방법이 제공된다.
본 발명에 포함되는 조절 방법은 세포를 본 발명에 포함되는 적어도 하나의 바이오마커(예를 들어, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적)를 포함하고, 표 1, 표 2 및 실시예에 열거된 적어도 하나의 바이오마커(예를 들어, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적) 또는 이의 단편 또는 세포와 관련된 바이오마커 활성 중 하나 이상의 활성을 조절하는 작용제를 포함하는 본 발명에 포함되는 바이오마커의 하나 이상의 조절인자와 접촉시키는 단계를 포함한다. 바이오마커 활성을 조절하는 작용제는 본 명세서에 기재된 작용제, 예컨대 핵산 또는 폴리펩타이드, 바이오마커의 자연 발생적 결합 파트너, 바이오마커에 대한 항체, 바이오마커에 대한 항체의 조합 및 다른 면역 관련 표적에 대한 항체, 적어도 하나의 바이오마커(예를 들어, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적) 효능제 또는 길항제, 적어도 하나의 바이오마커(예를 들어, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적) 효능제 또는 길항제의 펩타이도모방체, 적어도 하나의 바이오마커(예를 들어, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적) 펩타이도모방체, 다른 소분자, 또는 적어도 하나의 바이오마커(예를 들어, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적) 핵산 유전자 발현 산물에 대해 지시되거나 이를 모의하는 작은 RNA일 수 있다.
본 발명에 포함되는 적어도 하나의 바이오마커(예를 들어, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적)를 포함하고, 표 1, 표 2 및 실시예에 열거된 적어도 하나의 바이오마커(예를 들어, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적) 또는 이들의 단편을 포함하는 본 발명에 포함되는 적어도 하나의 바이오마커(예를 들어, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적)의 발현을 조절하는 작용제는 예를 들어, 안티센스 핵산 분자, RNAi 분자, shRNA, 성숙 miRNA, 전구-miRNA, 초기-miRNA, miRNA*, 항-miRNA 또는 miRNA 결합 부위 또는 이들의 변이체 또는 다른 작은 RNA 분자, 삼중사슬 올리고뉴클레오타이드, 리보자임 또는 적어도 하나의 바이오마커(예를 들어, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적) 폴리펩타이드의 발현을 위한 재조합 벡터이다. 예를 들어, 적어도 하나의 바이오마커(예를 들어, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적) 폴리펩타이드 번역 개시 부위 주변 영역에 상보적인 올리고뉴클레오타이드가 합성될 수 있다. 하나 이상의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 전형적으로 200 ㎍/㎖로 세포 배지에 첨가되거나 또는 적어도 하나의 바이오마커(예를 들어, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적) 폴리펩타이드의 합성을 방지하기 위해 환자에게 투여될 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 세포에 흡수되고, 번역을 방지하기 위해 적어도 하나의 바이오마커(예를 들어, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적) mRNA와 혼성화한다. 대안적으로, DNA 풀림 및 전사를 방지하기 위해 이중 가닥 DNA와 결합하여 삼중사슬 구조를 형성하는 올리고뉴클레오타이드가 사용될 수 있다. 그 결과, 바이오마커 폴리펩타이드의 합성이 차단된다. 바이오마커 발현이 조절되는 경우, 이러한 조절은 바이오마커 유전자를 넉아웃하는 것 이외의 수단에 의해 일어날 수 있다.
세포에서 바이오마커의 양을 조절한다는 사실로 인해, 발현을 조절하는 작용제는 또한 세포에서 바이오마커 활성의 총량을 조절한다.
일 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 적어도 하나의 바이오마커(예를 들어, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적)의 하나 이상의 활성을 조절하는 작용제는 표 1 및 실시예에 열거된 적어도 하나의 바이오마커(예를 들어, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적) 또는 이의 단편을 포함한다. 이러한 자극성 작용제의 예는 활성 바이오마커 폴리펩타이드 또는 이의 단편, 및 세포 내로 도입된 바이오마커를 암호화하는 핵산 분자 또는 이의 단편(예를 들어, cDNA, mRNA, shRNA, siRNA, 작은 RNA, 성숙 miRNA, 전구-miRNA, 초기-miRNA, miRNA*, 항-miRNA 또는 miRNA 결합 부위 또는 이들의 변이체 또는 당업자에게 알려진 다른 기능적으로 동등한 분자)을 포함한다. 다른 실시형태에서, 작용제는 하나 이상의 바이오마커 활성을 저해한다. 일 실시형태에서, 작용제는 천연의 결합 파트너(들)과 바이오마커의 상호작용을 저해하거나 향상시킨다. 이러한 저해성 작용제의 예는 안티센스 핵산 분자, 항-바이오마커 항체, 바이오마커 저해제 및 본 명세서에 기재된 스크리닝 검정에서 확인된 화합물을 포함한다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 바이오마커는 본 명세서에 기재된 모든 바이오마커 및 표 1 및/또는 표 2에 열거된 2개 내지 4개의 표적과 같은 그 사이의 임의의 범위까지를 포함하여 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상 등까지이다.
이러한 조절 방법은 시험관내(예를 들어, 세포를 작용제와 접촉시킴으로써)에서 또는 대안적으로, 작용제를 생체내(예를 들어, 대상체에게 작용제를 투여함으로써)에서 세포와 접촉시킴으로써 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 작용제, 조성물 및 방법은 백신 접종 동안 단핵구 및/또는 대식세포를 조절하는데 사용될 수 있다. 백신 보호는 종종 전-염증성 사이토카인의 유도가 필요하다. 하나의 잠재적인 치료적 개입은 예를 들어, 조절성 대식세포의 유도를 최소화하기 위해, 백신 접종 동안 단핵구 및/또는 대식세포 집단을 조작하기 위한 것일 수 있다.
a. 대상체
본 발명은 표 1 및/또는 표 2 및 실시예에 열거된 본 발명에 포함되는 적어도 하나의 바이오마커(예를 들어, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적) 또는 이의 단편의 상향- 또는 하향-조절로부터 혜택을 얻을 수 있는 병태 또는 장애, 예를 들어, 바이오마커 또는 이의 단편의 원치않는, 불충분한 또는 비정상적인 발현 또는 활성을 특징으로 하는 장애를 앓고 있는 개체를 치료하는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 방법은 바이오마커 발현 또는 활성을 조절(예를 들어, 상향조절 또는 하향조절)하는 작용제(예를 들어, 본 명세서에 기재된 스크리닝 검정에 의해 확인된 작용제) 또는 작용제의 조합을 투여하는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에서, 방법은 감소된, 비정상적인 또는 원치않는 바이오마커 발현 또는 활성을 보충하기 위해, 요법으로서 적어도 하나의 바이오마커(예를 들어, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적) 폴리펩타이드 또는 핵산 분자를 투여하는 단계를 포함한다. 요법을 필요로 하는 대상체는 본 명세서에 기재된 방법에 따라 치료될 수 있으며, 본 명세서에 또한 기재된 것들과 같은 추가적인 방법은 진단, 예후 예측, 관찰 등을 위한 방법(예를 들어, 관심있는 바이오마커의 발현이 확인된 단핵구 및/또는 대식세포의 집단 및 이러한 단핵구 및/또는 대식세포를 포함하는 대상체의 조절)과 같은 이러한 치료 방법과 조합될 수 있다.
바이오마커 활성의 자극은 바이오마커가 비정상적으로 하향조절되고/되거나 증가된 바이오마커 활성이 유익한 효과를 가질 가능성이 있는 상황에서 바람직하다. 마찬가지로, 바이오마커 활성의 저해는 바이오마커가 비정상적으로 상향조절되고/되거나 감소된 바이오마커 활성이 유익한 효과를 가질 가능성이 있는 상황에서 바람직하다.
일부 실시형태에서, 대상체는 동물이다. 동물은 어느 하나의 성별일 수 있으며, 임의의 발달 단계에 있을 수 있다. 일부 실시형태에서, 동물은 포유동물과 같은 척추동물이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 비인간 포유동물이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 가축, 예컨대 개, 고양이, 젖소, 돼지, 말, 양 또는 염소이다. 일부 실시형태에서, 대상체는는 반려 동물, 예컨대 개 또는 고양이이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 가축, 예컨대 젖소, 돼지, 말, 양 또는 염소이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 동물원의 동물이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 연구 동물, 예컨대 설치류(예를 들어, 마우스 또는 래트), 개, 돼지 또는 비인간 영장류이다. 일부 실시형태에서, 동물은 유전자 조작 동물이다. 일부 실시형태에서, 동물은 형질전환 동물(예를 들어, 형질전환 마우스 및 형질전환 돼지)이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 물고기 또는 파충류이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 암의 동물 모델이다. 예를 들어, 동물 모델은 인간-유래 암의 동소 이종 이식 동물 모델일 수 있다.
본 발명에 포함되는 방법의 일부 실시형태에서, 대상체는 치료, 예컨대 화학요법, 방사선 요법, 표적화 요법 및/또는 면역요법을 받지 않았다. 일부 실시형태에서, 대상체는 치료, 예컨대 화학요법, 방사선 요법, 표적화 요법 및/또는 면역요법을 받았다.
일부 실시형태에서, 대상체는 암성 또는 전암성 조직을 제거하기 위해 수술을 받았다. 일부 실시형태에서, 암성 조직은 제거되지 않았으며, 예를 들어 암성 조직은 신체의 수술 불가능한 영역, 예컨대 생명에 필수적인 조직 또는 외과적 절차가 환자에게 상당한 위험을 초래할 수 있는 영역에 위치할 수 있다.
일부 실시형태에서, 대상체 또는 이의 세포는 면역관문 저해제 요법에 대한 저항성과 같은 관련 요법에 저항성이 있다. 예를 들어, 본 발명에 포함되는 하나 이상의 바이오마커를 조절하는 것은 면역관문 저해제 요법에 대한 저항성을 극복할 수 있다.
일부 실시형태에서, 대상체는 본 명세서에 기재된 하나 이상의 바이오마커의 원치않는 부재, 존재 또는 비정상적인 발현 및/또는 활성을 갖는 것으로 확인되는 바와 같이, 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법에 따른 조절을 필요로 한다.
일부 실시형태에서, 대상체는 종양 또는 종양 미세환경에서 질량, 부피 및/또는 세포의 수의 적어도 약 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60% 이상 또는 임의의 범위까지, 예컨대 적어도 약 5% 내지 적어도 약 20%를 나타내는 대식세포가 침윤된 고형 종양을 갖는다. 이러한 세포는 본 명세서의 다른 실시형태에서 유용한 것으로 기재된 임의의 것, 예컨대 제1형 대식세포, M1 대식세포, TAM, CD11b 또는 CD14 또는 CD11과 CD14 둘 다를 발현하는 단핵구 및/또는 대식세포 등일 수 있다.
본 발명에 포함되는 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 대상체에서 많은 상이한 암의 암 요법(예를 들어, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 바이오마커의 적어도 하나의 조절인자)에 대한 반응성을 결정하는데 사용될 수 있다.
또한, 이러한 조절성 작용제는 또한 목적하는 활성을 더 조절하기 위해 병용 요법으로 투여될 수 있다. 예를 들어, IL-4, IL-4Rα, IL-13 및 CD40을 표적으로 하는 작용제 및 조성물은 단핵구 및/또는 대식세포 분화 및/또는 분극화를 조절하기 위해 사용될 수 있다. CD11b, CSF-1R, CCL2, 뉴로필린-1 및 ANG-2를 표적으로 하는 작용제 및 조성물은 조직에 대한 대식세포 동원을 조절하기 위해 사용될 수 있다. IL-6, IL-6R 및 TNF-α를 표적으로 하는 작용제 및 조성물은 대식세포 기능을 조절하기 위해 사용될 수 있다. 추가적인 작용제는 제한 없이 화학치료제, 호르몬, 항혈관신생제, 방사성 표지, 화합물, 또는 수술, 저온요법 및/또는 방사선 요법을 포함한다. 선행 치료 방법은 종래의 요법과 연속하여, 이의 이전 또는 이후에 다른 형태의 종래의 요법(예를 들어, 당업자에게 잘 알려진 암에 대한 표준(standard-of-care) 치료)과 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, 이러한 조절성 작용제는 치료적 유효량의 화학치료제와 함께 투여될 수 있다. 다른 실시형태에서, 이러한 조절성 작용제는 화학치료제의 활성 및 효능을 향상시키기 위한 화학요법과 함께 투여된다. 의사 처방 참고서(Physicians' Desk Reference: PDR)는 다양한 암의 치료에 사용된 화학치료제의 용량을 개시하고 있다. 치료적으로 효과적인 이러한 전술된 화학요법 약물의 투여 양생법 및 투여량은 치료되는 특정 흑색종, 질환의 정도 및 숙련된 의사에게 친숙한 기타 요인에 따라 달라질 것이며, 의사에 의해 결정될 수 있다.
b. 암 요법
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 작용제는 암을 치료하는데 사용된다. 예를 들어, 본 발명은 단핵구 및/또는 대식세포(즉, 종양 형성)의 전-종양성 기능을 감소시키고/시키거나 단핵구 및/또는 대식세포의 항-종양성 기능을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 특정 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 방법은 1) 종양 관련 대식세포(TAM)의 동원 및 분극화, 2) 종양 혈관신생, 3) 종양 성장, 4) 종양 세포 분화, 5) 종양 세포 생존, 6) 종양 침입 및 전이, 7) 면역 저해 및 8) 면역억제성 종양 미세환경을 포함하는, 대식세포의 전-종양성 기능 중 적어도 하나를 감소시킬 수 있다.
암 요법(예를 들어, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 하나 이상의 표적의 적어도 하나의 조절인자) 또는 요법의 조합(예를 들어, 적어도 하나의 면역요법과 조합하여, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 하나 이상의 표적의 적어도 하나의 조절인자)은 접촉 암 세포와 접촉하는데 사용되고/되거나 원하는 대상체, 예컨대 대상체 암 요법(예를 들어, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 하나 이상의 표적의 적어도 하나의 조절인자)에 반응할 가능성이 있는 것으로 나타난 대상체에게 투여될 수 있다. 다른 실시형태에서, 이러한 암 요법(예를 들어, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 하나 이상의 표적의 적어도 하나의 조절인자)은 대상체가 암 요법(예를 들어, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 하나 이상의 표적의 적어도 하나의 조절인자)에 대해 반응할 가능성이 없는 것으로 나타나면 회피될 수 있으며, 대안적 치료 양생법, 표적화 및/또는 비표적화 암 요법이 투여될 수 있다. 병용 요법이 또한 상정되며, 예를 들어, 하나 이상의 화학치료제 및 방사선, 하나 이상의 화학치료제 및 면역요법 또는 하나 이상의 화학치료제, 방사선 및 화학요법을 포함할 수 있고, 이들 각각의 조합은 암 요법(예를 들어, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 하나 이상의 표적의 적어도 하나의 조절인자)과 함께이거나 이것이 없을 수 있다.
본 발명에 포함되는 바이오마커(예를 들어, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 하나 이상의 표적)를 조절하는데 유용한 대표적인 예시적 작용제는 위에 기재된 바와 같다. 아래에 더 기재되는 바와 같이, 항암제는 바이오 치료적 항암제(예를 들어, 인터페론, 사이토카인(예를 들어, 종양 괴사 인자, 인터페론 α, 인터페론 γ 등), 백신, 조혈 성장 인자, 단일클론 혈청 요법, 면역자극제 및/또는 면역조절성 작용제(예를 들어, IL-1, 2, 4, 6 및/또는 12), 면역 세포 성장 인자(예를 들어, GM-CSF) 및 항체(예를 들어, 트라스투주맙, T-DM1, 베바시주맙, 세툭시맙, 파니투무맙, 리툭시맙, 토시투모맙 등)뿐만 아니라 화학치료제를 포함한다.
용어 "표적화 요법"은 선택된 생체 분자와 선택적으로 상호작용하여 암을 치료하는 작용제의 투여를 지칭한다. 예를 들어, 면역관문 저해제의 저해에 관한 표적화 요법은 본 발명에 포함되는 방법과 조합하여 유용하다.
용어 "면역요법" 또는 "면역요법들"은 일반적으로 유익한 방식으로 면역 반응을 조절하기 위한 임의의 전략을 지칭하며, 면역 반응을 유도, 향상, 억제 또는 그렇지 않으면 변형시키는 것을 포함하는 방법에 의해 질환에 걸린 또는 질환에 걸리거나 재발의 위험이 있는 대상체의 치료뿐만 아니라, 암과 같은 질환과 싸우기 위해 대상체의 면역 체계의 특정 부분을 사용하는 임의의 치료를 포함한다. 대상체 자신의 면역 체계는 그 목적을 위해 하나 이상의 작용제를 투여하거나 투여하지 않고 자극(또는 억제)된다. 면역 반응을 유도하거나 증폭하도록 설계된 면역 요법은 "활성화 면역요법"으로 지칭된다. 면역 반응을 감소시키거나 억제하도록 설계된 면역요법은 "억제 면역요법"으로 지칭된다. 일부 실시형태에서, 면역요법은 암 세포와 같은 관심있는 세포에 특이적이다. 일부 실시형태에서, 면역요법은 "비표적화"될 수 있으며, 이는 면역계 세포와 선택적으로 상호작용하지 않지만 면역 체계 기능을 조절하는 작용제의 투여를 지칭한다. 비표적화된 요법의 대표적인 예는 제한 없이 화학요법, 유전자 요법 및 방사선 요법을 포함한다.
면역요법의 일부 형태는 예를 들어, 암 백신 및/또는 감작된 항원 제시 세포의 사용을 포함할 수 있는 표적화된 요법이다. 예를 들어, 종양용해성 바이러스는 암 세포를 감염시키고 용해시킬 수 있는 바이러스로, 정상 세포는 손상되지 않게 하여 암 요법에 잠재적으로 유용하다. 종양용해성 바이러스의 복제는 종양 세포 파괴를 촉진하고 종양 부위에서 용량 증폭을 일으킨다. 이들은 또한 항암 유전자의 벡터 역할을 하여, 종양 부위에 특이적으로 전달될 수 있다. 면역요법은 암 항원 또는 질환 항원에 대해 지시된 미리 형성된 항체의 투여(예를 들어, 종양 항원에 화학치료제 또는 독소에 선택적으로 연결된 단일클론 항체의 투여)에 의해 달성된 숙주의 단기 보호를 위한 수동 면역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항-VEGF 및 mTOR 저해제는 신세포 암종을 치료하는데 효과적인 것으로 알려져 있다. 면역요법은 또한 암 세포주의 세포독성 림프구-인식 에피토프를 사용하는 데 초점을 맞출 수 있다. 대안적으로, 안티센스 폴리뉴클레오타이드, 리보자임, RNA 간섭 분자, 삼중 나선 폴리뉴클레오타이드 등이 종양 또는 암의 개시, 진행 및/또는 병리에 연계된 생체 분자를 선택적으로 조절하는데 사용될 수 있다. 유사하게는, 면역요법은 세포-기반 요법의 형태를 취할 수 있다. 예를 들어, 입양 세포 면역요법은 T 세포와 같은 면역 세포를 사용하는 면역요법의 한 유형으로, 환자의 암에 대해 천연의 또는 유전자 조작 반응성이 생성된 다음 암 환자에게 다시 전달될 수 있다. 다수의 활성화된 종양-특이적 T 세포의 주사는 완전하고 지속적인 암의 퇴행을 유도할 수 있다.
면역요법은 암 항원 또는 질환 항원에 대해 지시된 사전 형성된 항체의 투여(예를 들어, 종양 항원에 화학치료제 또는 독소에 선택적으로 연결된 단일클론 항체의 투여)에 의해 달성된 숙주의 단기 보호를 위한 수동 면역을 포함할 수 있다. 면역요법은 또한 암 세포주의 세포독성 림프구-인식 에피토프를 사용하는 데 초점을 맞출 수 있다. 대안적으로, 안티센스 폴리뉴클레오타이드, 리보자임, RNA 간섭 분자, 삼중 나선 폴리뉴클레오타이드 등이 종양 또는 암의 개시, 진행 및/또는 병리에 연계된 생체 분자를 선택적으로 조절하는데 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 면역치료제는 면역-자극성 분자의 효능제; 면역-저해성 분자의 길항제; 케모카인의 길항제; T 세포 활성화를 자극하는 사이토카인의 효능제; T 세포 활성화를 저해하 사이토 카인을 길항하거나 저해하는 작용제; 및/또는 B7 패밀리의 막 결합 단백질에 결합하는 작용제이다. 일부 실시형태에서, 면역치료제는 면역-저해성 분자의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 면역치료제는 사이토카인, 케모카인 및 성장 인자에 대한 작용제, 예를 들어 종양 관련 사이토카인, 케모카인, 성장 인자, 및 IL-10, TGF-β 및 VEGF을 포함하는 기타 가용성 인자의 저해 효과를 중화시키는 중화 항체일 수 있다.
일부 실시형태에서, 면역요법 하나 이상의 면역 체크 포인트의 저해제를 포함한다. 용어 "면역관문"는 항-종양 면역 반응을 하향조절하거나 저해하는 것과 같이 항암 면역 반응을 조절함으로써 면역 반응을 미세 조정하는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 세포 표면상의 분자 그룹을 지칭한다. 면역관문 단백질은 당업계에 잘 알려져 있으며, 제한 없이 CTLA-4, PD-1, VISTA, B7-H2, B7-H3, PD-L1, B7-H4, B7-H6, ICOS, HVEM, PD-L2, CD200R, CD160, gp49B, PIR-B, KRLG-1, KIR 패밀리 수용체, TIM-1, TIM-3, TIM-4, LAG-3(CD223), IDO, GITR, 4-IBB, OX-40, BTLA, SIRP알파(CD47), CD48, 2B4(CD244), B7.1, B7.2, ILT-2, ILT-4, TIGIT, HHLA2, 뷰티로필린 및 A2aR을 포함한다(예를 들어, WO 2012/177624 참조).
일부 면역관문은 면역 체계의 기능(예를 들어, 면역 반응)을 저해, 하향조절 또는 억제하는 분자(예를 들어, 단백질)를 포함하는 "면역-저해성 면역관문"이다. 예를 들어, CD274 또는 B7-H1로도 알려진 PD-L1(프로그래밍된 사멸-리간드 1)은 면역 체계를 억제하기 위해 T 세포의 증식을 감소시키는 저해성 신호를 전달하는 단백질이다. CD152로도 알려진 CTLA-4(세포독성 T-림프구-관련 단백질 4)는 면역 반응을 하향조절하는 면역관문("오프" 스위치) 역할을 하는 항원-제시 세포 표면상의 단백질 수용체이다. HAVCR2로도 알려진 TIM-3(T-세포 면역글로불린 및 뮤신-도메인 함유-3)은 대식세포 활성화를 조절하기 위해 면역관문 역할을 하는 세포 표면 단백질이다. VISTA(T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제인자)는 T 세포 효과기 기능을 저해하고 말초 내성을 유지하는 면역관문 역할을 하는 유형 I 막관통 단백질이다. LAG-3(lymphocyte-activation gene 3(림프구-활성화 유전자 3))은 T 세포의 증식, 활성화 및 항상성을 음성적으로 조절하는 면역관문 수용체이다. BTLA(B- and T-lymphocyte attenuator(B- 및 T-림프구 감쇠인자))는 종양 괴사 패밀리 수용체(TNF-R)와의 상호 작용을 통해 T 세포 저해를 나타내는 단백질이다. KIR(killer-cell immunoglobulin-like receptor(살해-세포 면역글로불린-유사 수용체))은 NK 세포상에서 발현되는 단백질의 패밀리로, NK 세포의 세포독성 활성을 억제하는 소수의 T 세포이다. 일부 실시형태에서, 면역치료제는 T 세포와 NK 세포를 억제하는 면역관문 단백질인 아르기네이스(ARG)와 인돌아민 2,3-다이옥시게네이스(indoleamine 2,3-dioxygenase: IDO)의 활성을 차단할 수 있고, 면역억제성 종양 미세환경에서 아미노산 아르기닌 및 트립토판의 이화작용을 변화시키는 저해제와 같은 면역억제성 효소에 특이적인 작용제일 수 있다. 저해제는 ARG-발현 M2 대식세포를 표적화하는 N-하이드록시-L-Arg(NOHA), ARG 및 산화질소 신테이스(NOS)를 동시에 차단하는 나이트로아스피린 또는 실데나필(Viagra®); 및 1-메틸-트립토판과 같은 IDO 저해제를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 용어는 생물학적으로 활성인 단백질 단편뿐만 아니라 전장 면역관문 단백질을 암호화하는 핵산 및 이의 생물학적으로 활성인 단백질 단편을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 용어는 본 명세서에 제공된 상동성 설명에 따른 임의의 단편을 더 포함한다.
대조적으로, 다른 면역관문은 면역 체계의 기능(예를 들어, 면역 반응)을 활성화, 자극 또는 촉진하는 분자(예를 들어, 단백질)를 포함하는 "면역-자극성"을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역-자극성 분자는 CD28, CD80(B7.1), CD86(B7.2), 4-1BB(CD137), 4-1BBL(CD137L), CD27, CD70, CD40, CD40L, CD122, CD226, CD30, CD30L, OX40, OX40L, HVEM, BTLA, GITR 및 이의 리간드 GITRL, LIGHT, LTβR, LTαβ, ICOS(CD278), ICOSL(B7-H2) 및 NKG2D이다. CD40(분화 클러스터 40)은 활성화에 필요한 항원 제시 세포에서 발견되는 공동자극성 단백질이다. 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 구성원 4(TNFRSF4) 또는 CD134로도 알려진 OX40은 T 세포 사멸을 방지하고 이후 사이토카인 생성을 증가시킴으로써 활성화 후 면역 반응을 유지하는데 관여한다. CD137은 활성화된 T 세포를 공동 자극하여 증식 및 T 세포 생존을 향상시키는 종양 괴사 인자 수용체(tumor necrosis factor receptor: TNF-R) 패밀리의 구성원이다. CD122는 인터류킨-2 수용체(IL-2) 단백질의 서브유닛이며, 이는 미성숙 T 세포의 조절성, 효과기 또는 메모리 T 세포로의 분화를 촉진한다. CD27은 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리의 구성원이며, 공동-자극성 면역관문 분자 역할을 한다. CD28(분화 클러스터 28)은 T 세포 활성화 및 생존에 필요한 공동-자극성 신호를 제공하는 T 세포에서 발현되는 단백질이다. TNFRSF18 및 AITR로도 알려진 GITR(glucocorticoid-induced TNFR-related protein(글루코코르티코이드-유도성 TNFR-관련 단백질))은 조절성 T 세포에 의해 유지되는 우세한 면역학적 자가-내성에서 핵심적인 역할을 하는 단백질이다. CD278로도 알려진 ICOS(inducible T-cell co-stimulator(유도성 T-세포 공동자극인자))는 활성화된 T 세포에서 발현되며 T 세포 신호전달 및 면역 반응에서 역할을 하는 CD28-슈퍼패밀리 공동자극성 분자이다.
면역관문 및 이들의 서열은 당업계에 잘 알려져 있으며, 대표적인 실시형태가 아래에 더 기재된다. 면역관문은 일반적으로 저해성 수용체의 쌍과 천연의 결합 파트너(예를 들어, 리간드)와 관련된다. 예를 들어, PD-1 폴리펩타이드는 저해성 신호를 면역 세포에 전달하여 면역 세포 효과기 기능을 저해할 수 있거나 또는 예를 들어, 가용성의 모노머 형태로 존재할 때 면역 세포의 공동자극(예를 들어, 경쟁적 저해에 의해)을 촉진할 수 있는 저해성 수용체이다. 바람직한 PD-1 패밀리 구성원은 PD-1과 서열 동일성을 공유하며, 하나 이상의 B7 패밀리 구성원, 예를 들어 B7-1, B7-2, PD-1 리간드 및/또는 항원 제시 세포상의 다른 폴리펩타이드에 결합한다. 용어 "PD-1 활성"은 예를 들어, 항원 제시 세포에 천연의 PD-1 리간드를 결합시킴으로써, 활성화된 면역 세포에서 저해성 신호를 조절하기 위한 PD-1 폴리펩타이드의 능력을 포함한다. 면역 세포에서 저해성 신호의 조절은 면역 세포의 증식 및/또는 사이토카인 분비를 조절한다. 따라서, 용어 "PD-1 활성"은 천연의 리간드(들)에 결합하는 PD-1 폴리펩타이드의 능력, 면역 세포 저해성 신호를 조절하는 능력 및 능력 면역 반응을 조절하는 능력을 포함한다. 용어 "PD-1 리간드"는 PD-1 수용체의 결합 파트너를 지칭하며, PD-L1(문헌[Freeman et al. (2000) J. Exp. Med. 192:1027-1034]) 및 PD-L2(문헌[Latchman et al. (2001) Nat. Immunol. 2:261]) 둘 다를 포함한다. 용어 "PD-1 리간드 활성"은 천연의 수용체(들)(예를 들어, PD-1 또는 B7-1)에 결합하는 PD-1 리간드 폴리펩타이드의 능력, 면역 세포 저해성 신호를 조절하는 능력 및 면역 반응을 조절하는 능력을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "면역관문 요법"은 이들의 핵산 및/또는 단백질을 저해하는 것과 같이 면역-저해성 면역관문를 저해하는 작용제의 사용을 지칭한다. 하나 이상의 이러한 면역관문의 저해는 저해성 신호를 차단하거나 그렇지 않으면 중화시켜 암을 보다 효과적으로 치료하기 위해 면역 반응을 상향조절할 수 있다. 면역관문를 억제하는데 유용한 예시적 작용제는 면역관문 단백질에 결합하고/하거나 이를 불활성화 또는 저해할 수 있는 항체, 소분자, 펩타이드, 펩타이도모방체, 천연의 리간드 및 천연의 리간드의 유도체, 또는 이들의 단편뿐만 아니라; 면역관문 핵산 또는 이의 단편의 발현 및/또는 활성을 하향조절할 수 있는 RNA 간섭, 안티센스, 핵산 압타머 등을 포함한다. 면역 반응을 상향 조절하기 위한 예시적 작용제는 단백질과 이의 천연의 수용체(들) 간의 상호작용을 차단하는 하나 이상의 면역관문 단백질; 비-활성화 형태의 하나 이상의 면역관문 단백질(예를 들어, 우세한 음성 폴리펩타이드); 하나 이상의 면역관문 단백질과 이의 천연의 수용체(들) 간의 상호작용을 차단하는 소분자 또는 펩타이드; 천연의 수용체(들)에 결합하는 융합 단백질(예를 들어, 항체 또는 면역글로불린의 Fc 부분에 융합된 면역관문 저해 단백질의 세포외 부분); 면역관문 핵산 전사 또는 번역을 차단하는 핵산 분자 등에 대한 항체를 포함한다. 이러한 작용제는 저해성 신호를 방지하고 면역 반응을 상향조절하기 위해 하나 이상의 면역관문와 이의 천연의 수용체(들)(예를 들어, 항체) 간의 상호작용을 직접 차단할 수 있다. 대안적으로, 작용제는 저해성 신호를 방지하고 면역 반응을 상향조절하기 위해 하나 이상의 면역관문 단백질과 이의 천연의 수용체(들) 간의 상호작용을 간접적으로 차단할 수 있다. 예를 들어, 안정화된 세포외 도메인과 같은 면역관문 단백질 리간드의 가용성 버전은 적절한 리간드에 결합하는 수용체의 유효 농도를 간접적으로 감소시키기 위해 이의 수용체에 결합할 수 있다. 일 실시형태에서, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체 및/또는 항-PD-L2 항체는 단독으로 또는 조합하여 면역관문를 저해하는데 사용된다. PD-1 경로를 차단하는 데 사용되는 치료제는 길항 항체 및 가용성 PD-L1 리간드를 포함한다. PD-1 및 PD-L1/2 저해성 경로에 대한 길항 작용제는 미국 특허 제8,008,449호에 개시된 PD-1 또는 PD-L1/2에 대한 길항 항체(예를 들어, 17D8, 2D3, 4H1, 5C4(니볼루맙 또는 BMS-936558로도 알려져 있음), 4A11, 7D3 및 5F4; 미국 특허 제8,779,105호; 제8,552,154호; 제8,217,149호; 제8,168,757호; 제8,008,449호; 제7,488,802호; 제7,943,743호; 제7,635,757호; 및 제6,808,710호에 개시된 AMP-224, 피디리주맙(CT-011), 펨브롤리주맙 및 항체를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 유사하게는, 추가적인 대표적인 관문 저해제는 미국 특허 제8,748,815호; 제8,529,902호; 제8,318,916호; 제8,017,114호; 제7,744,875호; 제7,605,238호; 제7,465,446호; 제7,109,003호; 제7,132,281호; 제6,984,720호; 제6,682,736호; 제6,207,156호; 및 제5,977,318호뿐만 아니라 유럽 특허 제1212422호, 미국 공개 제2002/0039581호 및 제2002/086014호 및 문헌[Hurwitz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:10067-10071]에 개시된 것들과 같이, 저해성 조절인자 CTLA-4(항-세포독성 T-림프구 항원 4 항-세포독성 T-림프구 항원 4), 예컨대 이필리무맙, 트레멜리무맙(완전히 인간화됨), 항-CD28 항체, 항-CTLA-4 애드넥틴, 항-CTLA-4 도메인 항체, 단일 사슬 항-CTLA-4 항체 단편, 중쇄 항-CTLA-4 단편, 경쇄 항-CTLA-4 단편에 대한 항체 및 기타 항체일 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
PD-1, PD-L1, PD-L2 및 CTLA-4에 대해 예시된 면역관문 활성, 리간드, 차단 등의 대표적인 정의는 일반적으로 다른 면역관문에 적용된다.
용어 "비표적 요법"은 선택된 생체 분자와 선택적으로 상호작용하지 않지만 암을 치료하는 작용제의 투여를 지칭한다. 비표적 요법의 대표적인 예는 제한 없이 화학요법, 유전자 요법 및 방사선 요법을 포함한다.
일 실시형태에서, 화학요법이 사용된다. 화학요법은 화학치료제의 투여를 포함한다. 이러한 화학치료제는 다음 화합물의 군 중에서 선택되는 것들일 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다: 백금 화합물, 세포독성 항생제, 대사 길항물질, 항-유사분열 작용제, 알킬화제, 비소 화합물, DNA 토모아이소머레이스 저해제, 탁세인, 뉴클레오사이드 유사체, 식물 알칼로이드 및 독소; 및 이들의 합성 유도체. 예시적 작용제는 알킬화제: 질소 머스타드(예를 들어, 사이클로포스파마이드, 아이포스파마이드, 트로포스파마이드, 클로람부실, 에스트라무스틴 및 멜팔란), 나이트로소우레아(예를 들어, 카무스틴(BCNU) 및 로무스틴(CCNU)), 알킬설포네이트(예를 들어, 뷰설판 및 트레오설판), 트라이아젠(예를 들어, 다카바진, 테모졸로마이드), 시스플라틴, 트레오설판 및 트로포스파마이드; 식물 알칼로이드: 빈블라스틴, 파클리탁셀, 도세탁솔; DNA 토모아이소머레이스 저해제: 테니포사이드, 크리스나톨 및 미토마이신; 항-폴레이트: 메토트렉세이트, 마이코페놀산 및 하이드록시우레아; 피리미딘 유사체: 5-플루오로우라실, 독시플루리딘 및 사이토신 아라비노사이드; 퓨린 유사체: 머캅토퓨린 및 티오구아닌; DNA 대사 길항물질: 2'-데옥시-5-플루오로우리딘, 아피디콜린 글리시네이트 및 피라졸로이미다졸; 및 항유사분열 작용제: 할리콘드린, 콜히친 및 리족신을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 유사하게는, 추가적인 예시적 작용제는 백금-함유 화합물(예를 들어, 시스플라틴, 카보플라틴, 옥살리플라틴), 빈카 알칼로이드(예를 들어, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신 및 비노렐빈), 탁소이드(예를 들어, 파클리탁셀 또는 파클리탁셀 등가물, 예컨대 나노입자 알부민-결합 파클리탁셀(ABRAXANE), 도코사헥사엔산 결합-파클리탁셀(DHA-파클리탁셀, 탁소프렉신), 폴리글루타메이트 결합-파클리탁셀(PG-파클리탁셀, 파클리탁셀 폴리글루멕스, CT-2103, XYOTAX), 종양-활성화된 전구약물(TAP) ANG1005(3개의 분자의 파클리탁셀에 결합된 안지오페프-2), 파클리탁셀-EC-1(ErbB2-인식 펩타이드 EC-1에 결합된 파클리탁셀) 및 글루코스-접합된 파클리탁셀, 예를 들어, 2'-파클리탁셀 메틸 2-글루코피라노실 석시네이트; 도세탁셀, 탁솔), 에피포도필린(예를 들어, 에토포사이드, 에토포사이드 포스페이트, 테니포사이드, 토포테칸, 9-아미노캄토테신, 캄토이리노테칸, 이리노테칸, 크리스나톨, 마이토마이신 C), 대사 길항물질, DHFR 저해제(예를 들어, 메토트렉세이트, 다이클로로메토트렉세이트, 트라이메트렉세이트, 에다트렉세이트), IMP 데하이드로게네이스 저해제(예를 들어, 마이코페놀산, 티아조퓨린, 리바비린 및 EICAR), 리보뉴클레오타이드 리덕테이스 저해제(예를 들어, 하이드록시우레아 및 데페록사민), 우라실 유사체(예를 들어, 5-플루오로우라실(5-FU), 플록사우리딘, 독시플루리딘, 라티트렉세드, 테가퓨르-우라실, 카페시타빈), 사이토신 유사체(예를 들어, 시타라빈(아라 C), 사이토신 아라비노사이드 및 플루다라빈), 퓨린 유사체(예를 들어, 머캅토퓨린 및 티오구아닌), 바이타민 D3 유사체(예를 들어, EB 1089, CB 1093 및 KH 1060), 아이소프레닐화 저해제(예를 들어, 로바스타틴), 도파민성 신경독소(예를 들어, 1-메틸-4-페닐피리디늄 이온), 세포 주기 저해제(예를 들어, 스타우로스포린), 악티노마이신(예를 들어, 악티노마이신 D, 닥티노마이신), 블레오마이신(예를 들어, 블레오마이신 A2, 블레오마이신 B2, 페플로마이신), 안트라사이클린(예를 들어, 다우노루비신, 독소루비신, 페길화된 리포솜 독소루비신, 이다루비신, 에피루비신, 피라루비신, 조루비신, 미톡산트론), MDR 저해제(예를 들어, 베라파밀), Ca2+ ATPase 저해제(예를 들어, 탑시가긴), 이마티닙, 탈리도마이드, 레날리도마이드, 타이로신 카이네이스 저해제(예를 들어, 악시티닙(AG013736), 보수티닙(SKI-606), 세디라닙(RECENTIN™, AZD2171), 다사티닙(SPRYCEL®, BMS-354825), 에를로티닙(TARCEVA®), 게피티닙(IRESSA®), 이마티닙(Gleevec®, CGP57148B, STI-571), 라파티닙(TYKERB®, TYVERB®), 레스타우르티닙(CEP-701), 네라티닙(HKI-272), 닐로티닙(TASIGNA®), 세막사닙(세막시닙, SU5416), 수니티닙(SUTENT®, SU11248), 토세라닙(PALLADIA®), 반데타닙(ZACTIMA®, ZD6474), 바탈라닙(PTK787, PTK/ZK), 트라스투주맙(HERCEPTIN®), 베바시주맙(AVASTIN®), 리툭시맙(RITUXAN®), 세툭시맙(ERBITUX®), 파니투무맙(VECTIBIX®), 라니비주맙(Lucentis®), 닐로티닙(TASIGNA®), 소라페닙(NEXAVAR®), 에벨로리무스(AFINITOR®), 알렘투주맙(CAMPATH®), 겜투주맙 오조가미신(MYLOTARG®), 템시롤리무스(TORISEL®), ENMD-2076, PCI-32765, AC220, 도비티닙 락테이트(TKI258, CHIR-258), BIBW 2992(TOVOK™), SGX523, PF-04217903, PF-02341066, PF-299804, BMS-777607, ABT-869, MP470, BIBF 1120(VARGATEF®), AP24534, JNJ-26483327, MGCD265, DCC-2036, BMS-690154, CEP-11981, 티보자닙(AV-951), OSI-930, MM-121, XL-184, XL-647 및/또는 XL228), 프로테아솜 저해제(예를 들어, 보르테조밉(Velcade)), mTOR 저해제(예를 들어, 라파마이신, 템시롤리무스(CCI-779), 에벨로리무스(RAD-001), 리다포롤리무스, AP23573(아리아드(Ariad)), AZD8055(아스트라제네카(AstraZeneca)), BEZ235(노바티스(Novartis)), BGT226(노바티스), XL765(사노피 아벤티스(Sanofi Aventis)), PF-4691502(화이자(Pfizer), GDC0980(제넨테크(Genentech)), SF1126(Semafoe) 및 OSI-027(OSI)), 오블리메센, 겜시타빈, 카미노마이신, 류코보린, 페메트렉세드, 사이클로포스파마이드, 다카바진, 프로카비진, 프레드니솔론, 덱사메타손, 캄파테신, 플리카마이신, 아스파라기네이스, 아미노프테린, 메토프테린, 포르피로마이신, 멜팔란, 류로시딘, 류로신, 클로람부실, 트라벡테딘, 프로카바진, 다이스코데몰라이드, 카미노마이신, 아미노프테린 및 헥사메틸 멜라민을 포함한다. 하나 이상의 화학치료제(예를 들어, FLAG, CHOP)를 포함하는 조성물이 또한 사용될 수 있다. FLAG는 플루다라빈, 사이토신 아라비노사이드(아라-C) 및 G-CSF를 포함한다. CHOP는 사이클로포스파마이드, 빈크리스틴, 독소루비신 및 프레드니손을 포함한다. 다른 실시형태에서, PARP(예를 들어, PARP-1 및/또는 PARP-2) 저해제가 사용되며, 이러한 저해제는 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, 올라파립, ABT-888, BSI-201, BGP-15(리엔-진 리서치 래버러토리스 인코포레이션(N-Gene Research Laboratories, Inc.)); INO-1001(이노텍 파마슈티칼스 인코포레이션(Inotek Pharmaceuticals Inc.)); PJ34(문헌[Soriano et al., 2001; Pacher et al., 2002b]); 3-아미노벤즈아마이드(트레비겐(Trevigen)); 4-아미노-1,8-나프탈리마이드(트레비겐); 6(5H)-페난트리다이논(트레비겐); 벤즈아마이드(미국 특허 Re. 36,397); 및 NU1025(문헌[Bowman et al.]). 작용 메커니즘은 일반적으로 PARP 저해제가 PARP에 결합하여 이의 활성을 감소시키는 능력과 관련이 있다. PARP는 베타-나이코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD+)의 나이코틴아마이드 및 폴리-ADP-리보스(PAR)로의 전환을 촉매한다. 폴리(ADP-리보스) 및 PARP는 둘 다 전사, 세포 증식, 게놈 안정성 및 발암성의 조절과 관련이 있다(문헌[Bouchard et.al. (2003) Exp. Hematol. 31:446-454); Herceg (2001) Mut. Res. 477:97-110]). 폴리(ADP-리보스) 폴리머레이스 1(PARP1)는 DNA 단일-가닥 절단(DNA single-strand break: SSB)의 복구에서 핵심 분자이다(문헌[de Murcia J. et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:7303-7307; Schreiber et al. (2006) Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7:517-528; Wang et al. (1997) Genes Dev. 11:2347-2358]). PARP1 기능의 저해에 의한 SSB 복구의 넉아웃은 결함이 있는 상동성-지정 DSB 복구로 암 세포에서 합성 치사를 촉발할 수 있는 DNA 이중-가닥 절단(DNA double-strand break: DSB)을 유도한다(문헌[Bryant et al. (2005) Nature 434:913-917; Farmer et al. (2005) Nature 434:917-921]). 화학치료제의 전술한 예는 예시적이며 제한하려는 의도가 아니다.
다른 실시형태에서, 방사선 요법이 사용된다. 방사선 요법에 사용되는 방사선은 전리 방사선일 수 있다. 방사선 요법은 또한 감마선, X-선 또는 양성자 빔일 수 있다. 방사선 요법의 예는 외부-빔 방사선 요법, 방사성 동위원소(I-125, 팔라듐, 이리듐)의 간질 이식, 스트론튬-89와 같은 방사성 동위원소, 흉부 방사선 요법, 복강내 P-32 방사선 요법 및/또는 전체 복부 및 골반 방사선 요법을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 방사선 요법에 대한 일반적인 개요는 문헌[Hellman, Chapter 16: Principles of Cancer Management: Radiation Therapy, 6th edition, 2001, DeVita et al., eds., J. B. Lippencott Company, Philadelphia]을 참조. 방사선 요법은 외부 빔 방사선 또는 원격 요법으로서 투여될 수 있되, 방사선은 원격 공급원으로부터 유도된다. 방사선 치료는 또한 내부 요법 또는 근접 요법으로서 투여될 수 있되, 방사성 공급원은 암 세포 또는 종양 덩어리에 가까운 체내에 배치된다. 또한, 광감작제, 예컨대 헤마토포르피린 및 이의 유도체, 베토포르피린(BPD-MA), 프탈로사이아닌, 광감작제 Pc4, 데메톡시-하이포크렐린 A; 및 2BA-2-DMHA의 투여를 포함하는 광역학 요법의 사용이 포함된다.
다른 실시형태에서, 호르몬 요법이 사용된다. 호르몬 치료적 치료는 예를 들어, 호르몬 효능제, 호르몬 길항제(예를 들어, 플루타마이드, 바이칼루타마이드, 타목시펜, 랄록시펜, 류프롤리드 아세테이트(LUPRON), LH-RH 길항제), 호르몬 생합성 및 가공 저해제, 및 스테로이드(예를 들어, 덱사메타손, 레티노이드, 델토이드, 베타메타손, 코르티솔, 코르티손, 프레드니손, 데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 미네랄코르티코이드, 에스트로겐, 테스토스테론, 프로게스틴), 바이타민 유도체(예를 들어, 올-트랜스 레티노산(all-trans retinoic acid: ATRA)); 바이타민 D3 유사체; 항프로게스테론(예를 들어, 미페프리스톤, 오나프리스톤) 또는 항안드로겐(예를 들어, 사이프로테론 아세테이트)을 포함할 수 있다.
다른 실시형태에서, 신체 조직이 고온(최대 106℉)에 노출되는 절차인 온열요법(hyperthermia)이 사용된다. 열은 세포를 손상시키거나 생존에 필요한 물질을 박탈함으로써 종양을 축소하는 데 도움이 될 수 있다. 온열요법 요법은 외부 및 내부 가열 장치를 사용하는 국소(local), 국부(regional) 및 전신(whole-body) 온열요법일 수 있다. 온열요법은 효과를 높이기 위해 거의 항상 다른 형태의 요법(예를 들어, 방사선 요법, 화학요법 및 생물학적 요법)과 함께 사용된다. 국소 온열요법은 종양과 같은 매우 작은 부위에 가해지는 열을 지칭한다. 부위는 신체 외부 장치에서 종양을 겨냥한 고주파로 외부에서 가열될 수 있다. 내부 가열을 달성하기 위해, 얇고 가열된 와이어 또는 따뜻한 물로 채워진 속이 빈 튜브; 이식된 마이크로파 안테나; 및 고주파 전극을 포함하는 여러 유형의 멸균 프로브 중 하나가 사용될 수 있다. 국부 온열요법에서는, 장기 또는 사지가 가열된다. 높은 에너지를 생성하는 자석 및 장치는 가열될 부위 위에 배치된다. 관류(perfusion)이라 불리는 또 다른 접근 방식에서, 환자의 혈액 일부가 제거되고 가열된 다음 내부에서 가열될 부위로 펌핑(관류)된다. 전신 가열은 몸 전체에 퍼진 전이성 암을 치료하는 데 사용된다. 이는 따뜻한 물 담요, 뜨거운 왁스, 유도 코일(전기 담요에 있는 것과 같음) 또는 열 챔버 (대형 인큐베이터와 유사함)를 사용하여 달성될 수 있다. 온열요법은 방사선 부작용이나 합병증의 임의의 현저한 증가를 일으키지 않는다. 그러나 피부에 직접 가해지는 열은 치료받은 환자의 약 절반에서 불편함 또는 심지어 상당한 국소 통증을 유발할 수 있다. 이는 또한 일반적으로 빠르게 치유되는 물집을 일으킬 수 있다.
여전히 다른 실시형태에서, 광역학 요법(PDT, 광방사선 요법, 광요법 또는 광화학요법이라고도 함)이 일부 유형의 암의 치료에 사용된다. 이는 광감작제로도 알려진 소정의 화학물질이 유기체가 특정 유형의 광선에 노출될 때 단세포 유기체를 죽일 수 있다는 발견을 기반으로 한다. PDT는 광감작제와 함께 고정 주파수 레이저 광선의 사용을 통해 암 세포를 파괴한다. PDT에서, 광감작제는 혈류에 주입되어 몸 전체의 세포에 의해 흡수된다. 작용제는 정상 세포보다 더 오래 암 세포에 남아 있다. 처리된 암 세포가 레이저 광선에 노출될 때, 광감작제는 광선을 흡수하여 처리된 암 세포를 파괴하는 활성 형태의 산소를 생성한다. 광선 노출은 대부분의 광감작제가 건강한 세포에서 사라졌지만 여전히 암 세포에 존재할 때 발생하도록 신중하게 시간을 맞춰야 한다. PDT에 사용되는 레이저 광선은 광섬유(매우 얇은 유리 가닥)를 통해 전달될 수 있다. 광섬유는 적절한 양의 광선을 전달하기 위해 암 가까이에 배치된다. 광섬유는 폐암의 치료를 위해 기관지경을 통해 폐로, 식도암의 치료를 위해 내시경을 통해 식도로 향할 수 있다. PDT의 이점은 건강한 조직에 최소한의 손상을 유발할 수 있다는 것이다. 그러나, 현재 사용중인 레이저 광선은 조직의 약 3cm(1인치 및 8인치 이상)를 통과할 수 없기 때문에, PDT는 주로 피부 위나 바로 아래 또는 내부 장기의 내벽에 있는 종양을 치료하는데 사용된다. 광역학 요법은 치료 후 6주 이상 동안 피부와 눈을 빛에 민감하게 만든다. 환자는 적어도 6주 동안 직사광선과 밝은 실내 조명을 피하는 것이 좋다. 환자가 야외로 나가야하는 경우, 선글라스를 포함한 보호복을 착용해야 한다. PDT의 다른 일시적인 부작용은 특정 부위의 치료와 관련이 있으며, 기침, 연하 곤란, 복통, 힘든 호흡 또는 숨가쁨을 포함할 수 있다. 1995년 12월, 미국 식품의약국(Food and Drug Administration: FDA)은 폐색을 유발하는 식도암의 증상을 완화하고 레이저만으로는 만족스럽게 치료할 수 없는 식도암에 대해 포피머 소듐 또는 Photofrin®이라는 광감작제를 승인하였다. 1998년 1월, FDA는 일반적인 폐암 치료가 적절하지 않은 환자의 초기 비소세포 폐암 치료용으로 포피머 소듐을 승인하였다. 국립 암 연구소 및 기타 기관은 방광암, 뇌암, 후두암 및 구강암을 포함하는 여러 유형의 암에 대한 광역학 요법의 사용을 평가하기 위한 임상 시험(리서치 연구)을 지원하고 있다.
또 다른 실시형태에서, 레이저 요법은 암 세포를 파괴하기 위해 고강도 광선을 이용하기 위해 사용된다. 이러한 기법은 특히 다른 치료법으로 암을 치료할 수 없는 경우, 출혈이나 폐색과 같은 암의 증상을 완화하는데 종종 사용된다. 이는 또한 종양을 축소하거나 파괴하여 암을 치료하는데 사용될 수 있다. 용어 "레이저"는 방사선의 자극 방출에 의한 광선 증폭을 의미한다. 전구에서 나오는 것과 같은 일반 광선은 파장이 많고 모든 방향으로 퍼진다. 반면에 레이저 광선은 특정 파장을 가지며 좁은 빔에 집중된다. 이러한 유형의 고강도 광선은 많은 에너지를 포함한다. 레이저는 매우 강력하며, 강철을 자르거나 다이아몬드 모양을 만드는데 사용될 수 있다. 레이저는 또한 눈의 손상된 망막을 복구하거나 조직을 절단(메스 대신)하는 것과 같은 매우 정밀한 수술 작업에 사용될 수 있다. 여러 종류의 레이저가 있지만, 의학에서 널리 사용되는 것은 세 종류뿐이다: 이산화탄소(CO2) 레이저--이 유형의 레이저는 더 깊은 층을 투과하지 않고 피부 표면에서 얇은 층을 제거할 수 있다. 이러한 기법은 피부 깊숙이 퍼지지 않은 종양과 소정의 전암성 병태를 치료하는데 특히 유용하다. 전통적인 메스 수술의 대안으로 CO2 레이저는 피부를 절단할 수도 있다. 레이저는 이러한 방식으로 피부암을 제거하는 데 사용된다. 네오디뮴:이트륨-알루미늄-가넷(Nd:YAG) 레이저--이러한 레이저로부터의 광선은 다른 유형의 레이저로부터의 광선보다 조직 깊숙이 침투할 수 있으며, 혈액 응고를 빠르게 유발할 수 있다. 광섬유를 통해 신체의 접근하기 어려운 부분으로 이동할 수 있다. 이러한 유형의 레이저는 때때로 인후암 치료에 사용된다. 아르곤 레이저--이러한 레이저는 조직의 표면층만을 통과할 수 있으므로, 피부과 및 눈 수술에 유용하다. 이는 또한 광역학 요법(PDT)으로 알려진 절차에서 종양을 치료하기 위해 빛-민감성 염료와 함께 사용된다. 레이저는 메스보다 더 정확하다는 것을 포함하여 표준 수술 도구에 비해 몇 가지 장점이 있다. 주변 피부 또는 다른 조직과 거의 접촉하지 않기 때문에, 절개부 근처의 조직이 보호된다. 레이저에 의해 발생하는 열은 수술 부위를 살균하여 감염 위험을 줄인다. 레이저의 정밀도는 더 작은 절개를 가능하게 하기 때문에 더 적은 작동 시간이 필요할 수 있다. 치유 시간은 종종 단축되며; 레이저 열은 혈관을 밀봉하기 때문에 출혈, 부기 또는 흉터가 적다. 레이저 수술은 덜 복잡할 수 있다. 예를 들어, 광섬유를 사용하면, 레이저 광선은 크게 절개하지 않고도 신체 부위에 비춰질 수 있다. 외래 환자를 대상으로 더 많은 절차가 수행될 수 있다. 레이저는 암을 치료하기 위해 다음의 두 가지 방식으로 사용될 수 있다: 열로 종양을 축소하거나 파괴시키는 것 또는 암세포를 파괴하는 화학 물질(광감작제로 알려짐)을 활성화하는 것. PDT에서, 광감작제는 암세포에 남아 있으며, 빛에 의해 자극되어 암세포를 죽이는 반응을 일으킬 수 있다. CO2 및 Nd:YAG 레이저는 종양을 축소하거나 파괴하는데 사용된다. 이는 의사가 방광과 같은 신체의 소정의 부위를 볼 수 있는 튜브인 내시경과 함께 사용될 수 있다. 일부 레이저의 광선은 광섬유가 장착된 가요성 내시경을 통해 전송될 수 있다. 이는 의사가 수술을 제외하고는 도달할 수 없는 신체 부위에서 보고 작업할 수 있게 하며, 따라서 레이저 빔을 매우 정밀하게 조준할 수 있다. 레이저는 또한 저출력 현미경과 함께 사용될 수 있으므로, 의사가 치료중인 부위를 명확하게 볼 수 있다. 다른 기기와 함께 사용되는 레이저 시스템은 매우 가는 나사의 너비보다 작은 직경 200 마이크론의 절단 부위를 생성할 수 있다. 레이저는 여러 유형의 암을 치료하는 데 사용된다. 레이저 수술은 성문 (성대), 자궁 경부암, 피부암, 폐암, 질암, 외음부암 및 음경암의 소정의 단계에 대한 표준 치료이다. 암을 파괴하는데 사용하는 것 외에도, 레이저 수술은 암으로 인한 증상의 완화를 돕는데에도 사용된다(완화 치료관리). 예를 들어, 레이저는 환자의 기도(기관)을 막고 있는 종양을 축소하거나 파괴하여 호흡을 더 쉽게 하기 위해 사용될 수 있다. 이는 또한 때때로 결장직장암 및 항문암의 완화를 위해 사용된다. 레이저-유도성 간질 열요법(Laser-induced interstitial thermotherapy: LITT)은 레이저 요법의 가장 최근 개발 중 하나이다. LITT는 열이 세포를 손상시키거나 생존에 필요한 물질을 박탈함으로써 종양을 축소하는데 도움이 될 수 있는 온열요법이라고 하는 암 치료와 동일한 아이디어를 사용한다. 이러한 치료에서, 레이저는 신체의 간질 영역(장기 사이 영역)으로 향한다. 레이저 광선은 종양의 온도를 높여 암세포를 손상시키거나 파괴한다.
암 요법(예를 들어, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 바이오마커의 적어도 하나의 조절인자)을 이용한 치료 기간 및/또는 용량은 표 1 및/또는 표 2에 열거된 바이오마커의 특정 조절인자 또는 이들의 조합에 따라 달라질 수 있다. 특정 암 치료제에 대한 적절한 치료 시간은 당업자에 의해 인식될 것이다. 본 발명은 각각의 암 치료제에 대한 최적의 치료 스케쥴의 지속적인 평가를 상정하며, 여기서, 본 발명에 포함되는 방법에 의해 결정된 대상체의 암의 표현형은 최적의 치료 용량 및 스케쥴을 결정하는 요소이다.
2. 스크리닝 방법
본 발명에 포함되는 다른 양태는 스크리닝 검정을 포함한다.
일부 실시형태에서, 단핵구 및/또는 대식세포에서 본 발명에 포함되는 하나 이상의 바이오마커(예를 들어, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 하나 이상의 표적)의 카피 수, 양 및/또는 활성을 조절하는 작용제(예를 들어, 항체, 융합 단백질, 펩타이드 또는 소분자)를 선택하기 위한 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 선택된 작용제는 또한 이러한 단핵구 및/또는 대식세포에 의해 매개되는 면역 반응을 조절한다(예를 들어, CD8+ 세포독성 T 세포 살해를 조절함; 면역관문 요법에 대한 암 세포의 감수성을 조절함; 면역관문 요법과 같은 항암 요법에 대한 저항성을 조절함; 암 요법을 조절을 조절함; NK, 호중구 및 대식세포 세포와 같은 면역 세포 이동, 동원, 분화 및/또는 생존을 조절함; 등). 따라서, 본 명세서에 기재된 임의의 진단, 예후 예측 또는 스크리닝 방법은 하나 이상의 바이오마커의 조절을 확인하고/하거나 조절된 면역 반응, 면역관문 차단 등에 대한 감수성 등과 같은 목적하는 표현형의 판독물에서 작용제의 효과를 확인하기 위해, 조절된 면역 표현형과 같은 목적하는 표현형의 판독물뿐만 아니라 본 명세서에 기재된 하나 이상의 바이오마커의 카피 수, 양 및/또는 활성을 조절하는 작용제로서 본 명세서에 기재된 바이오마커를 사용할 수 있다. 이러한 방법은 세포-기반 및 비-세포 기반 검정을 포함하는 스크리닝 검정을 이용할 수 있다.
예를 들어, 세포독성 T 세포-매개성 살해 및/또는 면역관문 요법에 대해 암 세포를 감작시키는 작용제를 스크리닝하는 방법으로서, a) i) 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 감소시키는 적어도 하나의 작용제 및/또는 ii) 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 증가시키는 적어도 하나의 작용제와 접촉시킨 단핵구 및/또는 대식세포의 존재하에, 암 세포와 세포독성 T 세포 및/또는 면역관문 요법을 접촉시키는 단계; b) 적어도 하나의 작용제 또는 작용제와 접촉시키지 않은 대조군 단핵구 및/또는 대식세포의 존재하에, 암 세포를 세포독성 T 세포 및/또는 면역관문 요법을 접촉시키는 단계; 및 c) b)와 비교하여 a)에서 세포독성 T 세포-매개성 살해 및/또는 면역관문 요법 효능(예컨대, 세포 살해)을 증가시키는 작용제를 확인함으로써 세포독성 T 세포-매개성 살해 및/또는 면역관문 요법에 대해 암 세포를 감작시키는 작용제를 확인하는 단계를 포함하는, 암 세포를 감작시키는 작용제를 스크리닝하는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에서, 검정은 하나 이상의 바이오마커의 반대 조절 효과를 검정함으로써 면역 세포 증식 및/또는 효과기 기능을 저해하거나 또는 무력성 클론 결실 및/또는 고갈을 유도하는 작용제를 확인하는 것에 관한 것이다. 본 발명은 면역 세포 증식 및/또는 효과기 기능을 저해하거나 또는 이러한 조절을 통해 무력성, 클론 결실 및/또는 고갈을 유도하는 방법을 더 포함한다.
다른 예에서, 세포독성 T 세포-매개성 살해 및/또는 면역관문 요법에 대해 암 세포를 감작시키는 작용제를 스크리닝하는 방법으로서, a) 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 감소시키도록 조작되고/되거나 ii) 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 증가시키도록 조작된 단핵구 및/또는 대식세포의 존재하에, 암 세포를 세포독성 T 세포 및/또는 면역관문 요법과 접촉시키는 단계; b) 대조군 단핵구 및/또는 대식세포의 존재하에, 암 세포를 세포독성 T 세포 및/또는 면역관문 요법과 접촉시키는 단계; 및 c) b)와 비교하여 a)에서 세포독성 T 세포-매개성 살해 및/또는 면역관문 요법 효능(예컨대, 세포 살해)에 대해 암 세포를 감작시키는 작용제를 확인하는 단계를 포함하는 암 세포를 감작시키는 작용제를 스크리닝하는 방법이 제공된다.
일반적으로, 본 발명은 본 발명에 포함되는 하나 이상의 바이오마커(예를 들어, 표 1, 표 2, 실시예 등에 열거된 표적)에 결합하거나 또는 이의 활성을 조절하는 테스트 화합물과 같은 스크리닝 작용제에 대한 검정을 포함한다. 일 실시형태에서, 면역 반응을 조절하는 작용제를 확인하는 방법은 표 1 및/또는 표 2에 열거된 하나 이상의 표적을 조절, 예를 들어 향상 또는 저해하기 위한 작용제의 능력을 결정하는 단계를 수반한다. 이러한 작용제 제한없이, 항체, 단백질, 융합 단백질, 소분자 및 핵산을 포함한다.
일부 실시형태에서, 면역 반응을 향상시키는 작용제를 확인하는 방법은 하나 이상의 바이오마커를 조절하고, 관심있는 면역 반응, 예컨대 조절된 염증성 표현형, 세포독성 T 세포 활성화 및/또는 활성, 면역관문 요법에 대한 암 세포의 감수성 등을 추가로 조절하기 위한 후보 작용제의 능력을 결정하는 단계를 수반한다.
일부 실시형태에서, 검정은 하나 이상의 바이오마커(예를 들어, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 하나 이상의 표적)를 테스트 작용제와 접촉시키는 단계, 및 예를 들어 아래 기재된 바와 같이 직접 또는 간접 매개변수를 측정함으로써 바이오마커의 카피 수, 양 및/또는 활성을 조절(예를 들어, 상향조절 또는 하향조절)하는 테스트 작용제의 능력을 결정하는 단계를 포함하는, 무세포 또는 세포-기반 검정이다.
일부 실시형태에서, 검정은 예를 들어, (a) 관심있는 세포(예를 들어, 단핵구 및/또는 대식세포)를 테스트 작용제와 접촉시키는 단계 및 하나 이상의 바이오마커와 하나 이상의 천연의 결합 파트너 사이의 결합과 같은 하나 이상의 바이오마커의 카피 수, 양 및/또는 활성을 조절(예를 들어 상향조절 또는 하향조절)하는 테스트 작용제의 능력을 결정하는 단계를 포함하는 것과 같은 세포-기반 검정이다. 폴리펩타이드가 서로 결합하거나 상호작용하는 능력을 결정하는 것은 예를 들어, 직접 결합을 측정하거나 면역 세포 활성화의 매개변수를 측정함으로써 달성될 수 있다.
다른 실시형태에서, 검정은 암 세포를 세포독성 T 세포, 단핵구 및/또는 대식세포 및 테스트 작용제와 접촉시키는 단계, 및 예를 들어, 아래 기재되는 바와 같이 직접 또는 간접적으로 측정함으로써 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 조절하는 테스트 작용제의 능력 및/또는 조절된 면역 반응을 결정하는 단계를 포함하는 세포-기반 검정이다.
상기 및 위에 기재된 바와 같은 방법은 또한 하나 이상의 바이오마커의 조절을 확인하고/하거나 조절된 면역 반응, 면역관문 차단에 대한 감수성 등과 같은 원하는 표현형의 판돈에 대한 작용제의 효과를 확인하기 위해, 본 명세서에 기재된 하나 이상의 바이오마커의 카피 수, 양 및/또는 활성을 조절하는 것으로 이미 공지된 하나 이상의 작용제를 테스트하기 위해 적합화될 수 있다.
직접 결합 검정에서, 바이오마커 단백질(또는 이들 각각의 표적 폴리펩타이드 또는 분자)은 결합이 복합체에서 표지된 단백질 또는 분자를 검출함으로써 결정될 수 있도록 방사성 동위원소 또는 효소적 표지와 결합될 수 있다. 예를 들어, 표적은 직접 또는 간접적으로 125I, 35S, 14C 또는 3H로 표지될 수 있으며, 방사성 동위원소는 방사성 방출의 직접 계수 또는 섬광 계수에 의해 검출된다. 대안적으로, 표적은 예를 들어, 서양고추냉이 퍼옥시데이스, 알칼리성 포스파테이스 또는 루시퍼레이스로 효소적으로 표지될 수 있으며, 효소적 표지는 적절한 기질에서 생성물로의 전환의 결정에 의해 검출된다. 바이오마커와 기질 간의 상호 작용을 결정하는 것은 또한 표준 결합 또는 효소적 분석 검정을 사용하여 달성될 수 있다. 위에 기재된 검정 방법의 하나 이상의 실시형태에서, 단백질 또는 분자 중 하나 또는 둘 다의 비복합체화된 형태로부터 복합체의 분리를 용이하게 할 뿐만 아니라 검정의 자동화를 도모하기 위해 폴리펩타이드 또는 분자를 고정화시키는 것이 바람직할 수 있다.
표적에 대한 테스트 작용제의 결합은 반응물을 포함하기에 적합한 임의의 용기에서 달성될 수 있다. 이러한 용기의 비-제한적 예는 미세역가 플레이트, 테스트 튜브 및 마이크로-원심분리 튜브를 포함한다. 본 발명에 포함되는 항체의 고정된 형태는 또한 다공성, 미세 다공성(평균 기공 직경이 약 1 마이크론 미만) 또는 거대 다공성(평균 기공 직경이 약 10 마이크론 초과) 물질, 예컨대 막, 셀룰로스, 나이트로셀룰로스 또는 유리 섬유; 아가로스 또는 폴리아크릴아마이드 또는 라텍스로 만들어진 것과 같은 비드; 또는 폴리스타이렌으로 만들어진 것과 같은 디쉬, 플레이트 또는 웰의 표면과 같은 고체 상(solid phase)에 결합된 항체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 직접 결합 검정에서, 폴리펩타이드는 폴리펩타이드 상호작용 및/또는 결합 이벤트와 같은 활성이 복합체에서 표지된 단백질을 검출함으로써 결정될 수 있도록 방사성 동위원소 또는 효소적 표지와 결합될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 직접 또는 간접적으로 125I, 35S, 14C 또는 3H으로 표지될 수 있으며, 방사성 동위원소는 방사성 방출의 직접 계수 또는 섬광 계수에 의해 검출된다. 대안적으로, 폴리펩타이드는 예를 들어, 서양고추냉이 퍼옥시데이스, 알칼리성 포스파테이스 또는 루시퍼레이스로 효소적으로 표지될 수 있으며, 효소적 표지는 적절한 기질에서 생성물로의 전환의 결정에 의해 검출된다.
임의의 상호작용 물질의 표지 없이 관심있는 매개변수를 조절하는 작용제의 능력을 결정하는 것 또한 본 발명의 범위 내에 있다. 예를 들어, 마이크로피지오미터는 모니터링될 폴리펩타이드의 표지없이 폴리펩타이드 간의 상호작용을 검출하는데 사용될 수 있다(문헌[McConnell et al. (1992) Science 257:1906-1912]). 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "마이크로피지오미터(microphysiometer)"(예를 들어, 사이토센서(Cytosensor))는 광-지시형 전위차계 센서(light-addressable potentiometric sensor: LAPS)를 사용하여 세포가 환경을 산성화하는 속도를 측정하는 분석 도구이다. 이러한 산성화 속도의 변화는 화합물과 수용체 간의 상호작용의 지표로 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 주어진 폴리펩타이드 세트 간의 상호작용을 길항하는 차단 작용제(예를 들어 항체, 융합 단백질, 펩타이드 또는 소분자)의 능력을 결정하는 것은 폴리펩타이드 세트의 하나 이상의 구성원의 활성을 결정함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 단백질 및/또는 하나 이상의 천연의 결합 파트너의 활성은 세포의 제2 메신저(예를 들어, 세포내 신호전달)의 유도를 검출하거나, 적절한 기질의 촉매적/효소적 활성을 검출하거나, 리포터 유전자(검출 가능한 마커, 예를 들어 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼레이스를 암호화하는 핵산에 작동 가능하게 연결된 표적-반응성 조절 요소를 포함함)의 유도를 검출하거나 또는 단백질 및/또는 하나 이상의 천연의 결합 파트너에 의해 조절된 세포 반응을 검출함으로써 결정될 수 있다. 상기 폴리펩타이드에 결합하거나 이와 상호작용하는 차단 작용제의 능력을 결정하는 것은 예를 들어, 증식 검정에서 면역 세포 공동자극 또는 저해를 조절하는 화합물의 능력을 측정하거나 또는 이의 일부를 인식하는 항체에 결합하는 상기 폴리펩타이드의 능력을 방해함으로써 달성될 수 있다.
하나 이상의 천연의 결합 파트너와의 상호작용과 같은 바이오마커 양 및/또는 활성을 조절하는 작용제는 면역 세포 증식 및/또는 효과기 기능을 저해하거나 또는 시험관내 검정에 첨가될 때 무력성의 클론 결실 및/또는 고갈을 유도하는 이들의 능력에 의해 확인될 수 있다. 예를 들어, 세포는 활성화 수용체를 통해 신호 전달을 자극하는 작용제의 존재하에 배양될 수 있다. 세포 활성화에 대한 다수의 인식된 판독은 활성화제의 존재하에 세포 증식 또는 효과기 기능(예를 들어, 항체 생성, 사이토카인 생성, 식균 작용)을 측정하는데 사용될 수 있다. 이러한 활성화를 차단하는 테스트 작용제의 능력은 당업계에 공지되어 있는 기법을 사용하여 측정되는 증식 또는 효과기 기능의 감소에 영향을 미치는 작용제의 능력을 측정함으로써 쉽게 결정될 수 있다.
예를 들어, 본 발명에 포함되는 작용제는 문헌[Freeman et al. (2000) J. Exp. Med. 192:1027 and Latchman et al. (2001) Nat. Immunol. 2:261]에 기재된 바와 같이 T 세포 검정에서 공동자극을 저해하거나 향상시키는 능력에 대해 테스트될 수 있다. CD4+ T 세포는 인간 PBMC로부터 단리되고, 활성화 항-CD3 항체로 자극될 수 있다. T 세포의 증식은 3H 티미딘 혼입에 의해 측정될 수 있다. 검정은 검정에서 CD28 공동자극을 사용하거나 사용하지 않고 수행될 수 있다. 유사한 검정이 주캇(Jurkat) T 세포 및 PBMC로부터의 PHA-아세포를 사용하여 수행될 수 있다.
대안적으로, 본 발명에 포함되는 작용제는 하나 이상의 바이오마커의 조절에 반응하여 면역 세포에서 생성되거나 또는 그 생성이 향상되거나 저해되는 사이토카인의 세포 생성을 조절하는 능력에 대해 테스트될 수 있다. 관심있는 면역 세포에 의해 방출된 지시(indicative) 사이토카인은 ELISA 또는 사이토카인에 의해 유도되는 면역 세포 증식 또는 다른 세포 유형의 증식을 저해하는 사이토카인을 차단하는 항체의 능력에 의해 확인될 수 있다. 예를 들어, IL-4 ELISA 키트는 IL-7 차단 항체와 마찬가지로 젠자임(Genzyme)(메사추세츠주 케임브리지)에서 구입할 수 있다. IL-9 및 IL-12에 대한 차단 항체는 제네틱스 인스티튜트(Genetics Institute)(메사추세츠주 케임브리지)에서 구입할 수 있다. 시험관내 면역 세포 공동자극 검정은 또한 하나 이상의 바이오마커의 조절에 의해 조절될 수 있는 사이토카인을 확인하기 위한 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 공동자극시 유도된 특정 활성, 예를 들어 면역 세포 증식이 공지된 사이토카인에 대한 차단 항체의 첨가에 의해 저해될 수 없는 경우, 활성은 미지의 사이토카인의 작용에 기인할 수 있다. 공동자극 후, 이러한 사이토카인은 종래의 방법에 의해 배지로부터 정제될 수 있으며, 이의 활성은 면역 세포 증식을 유도하는 능력에 의해 측정된다. 내성 유도의 역할을 할 수 있는 사이토카인을 확인하기 위해, 위에 기재된 바와 같이 시험관내 T 세포 공동자극 검정이 사용될 수 있다. 이러한 경우에, T 세포는 활성화 신호를 받고 선택된 사이토카인과 접촉될 것이지만, 공동자극성 신호는 제공되지 않을 것이다. 면역 세포의 세척 및 휴지 후, 세포는 1차 활성화 신호 및 공동자극성 신호 둘 다로 재자극될 것이다. 면역 세포가 반응하지 않는다면(예를 들어, 사이토카인을 증식시키거나 생산함), 이들은 내성을 가지게 되며, 사이토카인은 내성의 유도를 방지하지 못했다. 그러나, 면역 세포가 반응하면, 내성의 유도는 사이토카인에 의해 방지된다. 내성의 유도를 방지할 수 있는 사이토카인은 이식 수여체 또는 자가면역 질환을 갖는 대상체에서 내성을 유도하는 보다 효율적인 수단으로서 B 림프구 항원을 차단하는 시약과 함께 생체내 차단을 위해 표적화될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 검정은 바이오마커 및/또는 하나 이상의 천연의 결합 파트너 간의 상호작용을 조절하는 작용제에 대한 스크리닝을 위한 무세포 검정으로서, 폴리펩타이드 및 하나 이상의 천연의 결합 파트너 또는 이의 생물학적 활성 부분을 테스트 작용제와 접촉시키는 단계 및 폴리펩타이드 및 하나 이상의 천연의 결합 파트너 또는 이의 생물학적 활성 부분 간의 상호작용을 조절하는 테스트 화합물의 능력을 결정하는 단계를 포함하는, 작용제에 대한 스크리닝을 위한 무세포 검정이다. 테스트 화합물의 결합은 위에 기재된 바와 같이 직접 또는 간접적으로 결정될 수 있다. 일 실시형태에서, 검정은 폴리펩타이드 또는 이의 생물학적 활성 부분을 이의 결합 파트너와 접촉시켜 검정 혼합물을 형성하는 단계, 검정 혼합물과 테스트 화합물을 접촉시키는 단계 및 검정 혼합물에서 폴리펩타이드와 상호작용하는 테스트 화합물의 능력을 결정하는 단계를 포함하되, 폴리펩타이드와 상호작용하는 테스트 화합물의 능력을 결정하는 것은 결합 파트너와 비교하여 폴리펩타이드 또는 이의 생물학적 활성 부분에 우선적으로 결합하는 테스트 화합물의 능력을 결정하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 세포-기반 또는 무세포 검정에 관계없이, 테스트 작용제는 다른 결합 파트너를 사용하여, 폴리펩타이드와 하나 이상의 천연의 결합 파트너 간의 상호작용의 결합 및/또는 활성에 영향을 미치는지 여부를 결정하기 위해 더 검정될 수 있다. 다른 유용한 결합 분석 방법은 실시간 생체 분자 상호작용 분석(real-time Biomolecular Interaction Analysis: BIA)(문헌[Sjolander and Urbaniczky (1991) Anal. Chem. 63:2338-2345 and Szabo et al. (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705])의 사용을 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "BIA"는 임의의 상호작용 물질(예를 들어, BIA코어)을 표지하지 않고 실시간으로 생체특이적 상호작용을 연구하는 위한 기술이다. 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance: SPR)의 광학 현상의 변화는 생물학적 폴리펩타이드 간의 실시간 반응의 지표로 사용될 수 있다. 관심있는 폴리펩타이드는 BIA코어 칩에 고정될 수 있으며, 여러 작용제(차단 항체, 융합 단백질, 펩타이드 또는 소분자)가 관심있는 폴리펩타이드의 결합에 대해 테스트될 수 있다. BIA 기술 사용의 예는 문헌[Fitz et al. (1997) Oncogene 15:613]에 기재되어 있다.
본 발명에 포함되는 무세포 검정은 가용성 및/또는 막-결합 형태의 단백질을 모두 사용할 수 있다. 막-결합 형태 단백질이 사용되는 무세포 검정의 경우, 막-결합 형태의 단백질이 용액에서 유지되도록 가용화제를 이용하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 가용화제의 예는 비-이온성 세제, 예컨대 n-옥틸글루코사이드, n-도데실글루코사이드, n-도데실말토사이드, 옥타노일-N-메틸글루카마이드, 데카노일-N-메틸글루카마이드, Triton® X-100, Triton® X-114, Thesit®, 아이소트라이데시폴리(에틸렌 글리콜 에터)n, 3-[(3-콜라미도프로필)다이메틸암미니오]-1-프로페인 설포네이트(CHAPS), 3-[(3-콜라미도프로필)다이메틸암미니오]-2-하이드록시-1-프로페인 설포네이트(CHAPSO) 또는 N-도데실=N,N-다이메틸-3-암모니오-1-프로페인 설포네이트를 포함한다.
위에 기재된 검정 방법의 하나 이상의 실시형태에서, 단백질 중 하나 또는 둘 다의 비복합체화된 형태로부터 복합체의 분리를 용이하게 할 뿐만 아니라 검정의 자동화를 도모하기 위해 어느 하나의 폴리펩타이드를 고정하는 것이 바람직할 수 있다. 폴리펩타이드에 대한 테스트 화합물의 결합은 반응물을 포함하기에 적합한 임의의 용기에서 달성될 수 있다. 이러한 용기의 예는 미세역가 플레이트, 테스트 튜브 및 마이크로-원심분리 튜브를 포함한다. 일 실시형태에서, 단백질 중 하나 또는 둘 다가 매트릭스에 결합되도록 하는 도메인을 추가하는 융합 단백질이 제공될 수 있다. 예를 들어, 글루타티온-S-트랜스퍼레이스-기반 폴리펩타이드 융합 단백질 또는 글루타티온-S-트랜스퍼레이스/표적 융합 단백질이은 글루타티온 세파로스 비드(시그마 케미칼(Sigma Chemical), 미주리주 세인트루이스) 또는 글루타티온 유도체화된 미세역가 플레이트에 흡착되고, 그런 다음 테스트 화합물과 배합되고, 혼합물은 복합체 형성(예를 들어, 염 및 pH에 대한 생리학적 조건에서)에 도움이 되는 조건하에 항온처리될 수 있다. 항온처리 후, 비드 또는 미세역가 플레이트 웰은 임의의 비결합 성분, 비드의 경우 고정화된 매트릭스를 제거하기 위해 세척되며, 복합체는 위에 기재된 바와 같이 직접 또는 간접적으로 결정된다. 대안적으로, 복합체는 매트릭스로부터 해리될 수 있으며, 폴리펩타이드 결합 또는 활성의 수준은 표준 기법을 사용하여 결정된다.
대안적 실시형태에서, 관심있는 바이오마커(예를 들어, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 하나 이상의 표적)의 활성을 조절하는 테스트 화합물의 능력을 결정하는 것은 예를 들어, 폴리펩타이드 하류에서 기능하는 폴리펩타이드의 활성을 조절하는 테스트 화합물의 능력을 결정함으로써, 세포-기반 검정에 대해 위에 기재된 바와 같이 달성될 수 있다. 예를 들어, 제2 메신저의 수준이 결정될 수 있고, 적절한 표적에 대한 상호작용인자 폴리펩타이드의 활성이 결정될 수 있거나 또한 적절한 표적에 대한 상호작용인자의 결합이 전술된 바와 같이 결정될 수 있다.
본 발명은 추가로 위에 기재된 스크리닝 검정에 의해 확인된 신규한 작용제에 관한 것이다. 따라서, 적절한 동물 모델에서 본 명세서에 기재된 바와 같이 확인된 작용제를 추가로 사용하는 것은 본 발명의 범위 내에 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이 확인된 작용제는 이러한 작용제를 사용한 치료의 효능, 독성 또는 부작용을 결정하기 위해 동물 모델에서 사용될 수 있다. 대안적으로, 본 명세서에 기재된 바와 같이 확인된 작용제는 이러한 작용제의 작용의 메커니즘을 결정하기 위해 동물 모델에서 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 치료를 위한 상기 기재된 스크리닝 검정에 의해 확인된 신규한 작용제에 관한 것이다.
3. 진단적 용도 및 검정
본 발명은 부분적으로, 관심있는 산출물(output), 예컨대 본 명세서에 기재된 하나 이상의 바이오마커, 암 요법(예를 들어, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 하나 이상의 표적의 적어도 하나의 조절인자) 등에 반응할 가능성이 있는 암 등의 조절에 따라 조절된 표현형을 가질 수 있는 단핵구 및/또는 대식세포와 관련이 있는지 여부를 정확하게 분류하기 위한 방법, 시스템 및 코드를 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은은 통계학적 알고리즘 및/또는 경험적 데이터(예를 들어, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 양 또는 활성)를 사용하여 샘플(예를 들어, 대상체 유래)을 암 요법(예를 들어, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 바이오마커의 적어도 하나의 조절인자)과 관련이 있거나 또는 이에 반응하거나 반응하지 않을 위험이 있는 것으로 분류하는데 유용하다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 표 1, 표 2, 실시예 등에 열거된 것(예를 들어, CD53, PSGL1 및/또는 VSIG4)과 같은 본 명세서에 기재된 바이오마커의 존재, 부재 및/또는 조절된 발현의 검출에 기초하여 단핵구 및/또는 대식세포(예를 들어, M1, 제1형, M2, 제2형 등)의 면역 표현형 상태를 검출하는 방법을 포함한다.
바이오마커(예를 들어, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 하나 이상의 표적)의 양 또는 활성을 검출하고, 따라서 샘플이 염증성 표현형, 암 요법 등의 조절에 반응할 가능성이 있거나 또는 없는지 여부를 분류하는데 유용한 예시적 방법은 생물학적 샘플을 작용제, 예컨대 생물학적 샘플에서 바이오마커의 양 또는 활성을 검출할 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 같은 단백질-결합제 또는 올리고뉴클레오타이드와 같은 핵산-결합제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 테스트 대상체로부터 유래되는 것과 같은 생물학적 샘플을 수득하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 작용제가 사용되되, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 이상의 이러한 작용제가 조합하여(예를 들어, 샌드위치 ELISA에서) 또는 연속적으로 사용될 수 있다. 소정의 예에서, 통계학적 알고리즘은 단일 학습 통계 분류자 시스템이다. 예를 들어, 단일 학습 통계 분류자 시스템은 예측값 또는 확률값 및 바이오마커의 존재 또는 수준에 기초하여 샘플을 분류하는데 사용될 수 있다. 단일 학습 통계 분류자 시스템의 사용은 전형적으로 적어도 약 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 민감성, 특이성, 양성 예측값, 음성 예측값 및/또는 전체 정확도를 갖는 샘플을 분류한다.
다른 적합한 통계학적 알고리즘은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 학습 통계 분류자 시스템은 복합 데이터 세트(예를 들어, 관심있는 마커의 패널)에 대해 적합화되며, 이러한 데이터 세트에 기초하여 판단할 수 있는 기계 학습 알고리즘 기법을 포함한다. 일부 실시형태에서, 분류 트리(예를 들어, 무작위 포레스트)와 같은 단일 학습 통계 분류자 시스템이 사용된다. 다른 실시형태에서, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의 학습 통계 분류자 시스템의 조합이, 바람직하게는 동시에, 사용된다. 학습 통계 분류자 시스템의 예는 귀납적 학습을 이용하는 것들(예를 들어, 무작위 포레스트, 분류 및 회귀 트리(C&RT), 부스티드 트리(boosted tree) 등과 같은 판단/분류 트리), 확률적 근사 정확(Probably Approximately Correct: PAC) 학습, 연결주의 학습(예를 들어, 신경 네트워크(neural network: NN), 인공 신경 네트워크(artificial neural network: ANN), 뉴로 퍼지 네트워크(neuro fuzzy network: NFN), 네트워크 구조, 퍼셉트론(perceptron), 예컨대 다층 퍼셉트론, 다층 피드-포워드 네트워크, 신경 네트워크의 적용, 신뢰 네트워크에서 베이시안 학습 등), 강화 학습(예를 들어, 알려진 환경에서의 수동 학습, 예컨대 미경험 학습, 맞춤 동적 학습 및 시간차 학습, 알려지지 않은 환경에서의 수동 학습, 능동적 학습, 학습 작용-가치 함수, 강화 학습의 적용 등) 및 유전 알고리즘 및 진화 프로그래밍을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 다른 학습 통계 분류자 시스템은 서포트 벡터 머신(예를 들어, 커넬법), 다변량 적응 회귀 스플라인(multivariate adaptive regression spline: MARS), 르벤버그-마쿼트((Levenberg-Marquardt) 알고리즘, 가우스-뉴턴 알고리즘, 가우시안의 혼합, 구배 하강 알고리즘 및 학습 벡터 양자화(learning vector quantization: LVQ)을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 방법은 샘플 분류 결과를 임상의, 예를 들어 종양학자에게 보내는 단계를 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 대상체의 진단에 이어 진단에 기초하여 치료적 유효량의 정의된 치료제를 개체에게 투여한다.
일부 실시형태에서, 방법은 대조군 생물학적 샘플(예를 들어, 암에 걸리지 않았거나 암 요법에 취약한 대상체로부터의 생물학적 샘플, 관해 중에 있는 대상체로부터의 생물학적 샘플 또는 암 요법에도 불구하고 진행중인 암 발병에 대한 치료중인 대상체로부터의 생물학적 샘플)을 수득하는 단계를 더 포함한다.
4. 예측 의학
본 발명 또한 진단 검정, 예후 예측 검정 및 모니터링 임상 시험이 예후 예측(예측) 목적으로 사용되어 개체를 예방적으로 치료하는 예측 의학 분야에 관한 것이다. 따라서, 본 발명에 포함되는 일 양태는 본 명세서에 기재된 바이오마커, 예컨대 생물학적 샘플(예를 들어, 혈액, 혈청, 세포 또는 조직)의 맥락에서 표 1 및/또는 표 2에 열거된 것들의 존재, 부재, 카피 수, 양 및/또는 활성 수준을 결정(예를 들어, 검출)하여 원래의 암 또는 재발 암에 관계없이 암을 앓고 있는 개체가 암 요법(예를 들어, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 바이오마커의 적어도 하나의 조절인자)에 반응할 가능성이 있는지 여부를 결정하기 위한 진단 검정을 포함한다. 이러한 검정은 예후 예측 또는 예측 목적으로 사용되어 바이오마커 폴리펩타이드, 핵산 발현 또는 활성을 특징으로 하거나 또는 이와 관련된 장애의 발병 이전 또는 재발 후 개체를 예방적으로 치료할 수 있다. 당업자는 임의의 방법은 본 명세서에 기재된 바이오마커, 예컨대 표 1 및/또는 표 2에 열거된 것들 중 하나 이상(예를 들어, 조합)을 사용할 수 있음을 이해할 것이다. 임의의 예측 의학 분석을 위해, 관심있는 바이오마커, 관심있는 분류 지표(예를 들어, CD11b+ 상태, CD14+ 상태 등) 또는 이들의 임의의 조합이 분석될 수 있다.
본 발명에 포함되는 다른 양태는 관심있는 세포의 표 1 및/또는 표 2에 열거된 표적 및/또는 염증성 표현형의 발현 또는 활성에 대한 작용제(예를 들어, 약물, 화합물 및 작은 핵산-기반 분자)의 영향을 모니터링하는 것을 포함한다. 이러한 및 기타 작용제는 다음 부문에서 더 상세히 기재된다.
당업자는 또한 소정의 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 방법이 컴퓨터 프로그램 및 컴퓨터 시스템을 구현함을 이해할 것이다. 예를 들어, 컴퓨터 프로그램은 본 명세서에 기재된 알고리즘을 수행하는데 사용될 수 있다. 컴퓨터 시스템은 본 발명의 방법을 구현하는데 컴퓨터 시스템에 의해 사용될 수 있는 복수의 바이오마커 신호 변화/프로파일을 포함하는 본 발명에 포함되는 방법에 의해 생성된 데이터를 저장하고 조작할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 컴퓨터 시스템은 바이오마커 발현 데이터를 수신하고; (ii) 데이터를 저장하고; 및 (iii) 암성 또는 전암성 조직으로부터 유익한 바이오마커의 상태를 결정하기 위해 본 명세서에 기재된 임의의 수의 방식(예를 들어, 적절한 대조군에 대한 분석)으로 데이터를 비교한다. 다른 실시형태에서, 컴퓨터 시스템은 (i) 결정된 발현 바이오마커 수준을 역치 값과 비교하고; 및 (ii) 상기 바이오마커 수준이 역치 값을 현저하게 조절(예를 들어, 초과 또는 미만)하는지 여부의 표시 또는 상기 표시에 기초한 표현형을 출력한다.
소정의 실시형태에서, 이러한 컴퓨터 시스템은 또한 본 발명에 포함되는 부분으로 간주된다. 생물 정보학 및/또는 컴퓨터 기술 분야의 당업자가 보유한 지식에 따라 본 발명의 분석 방법을 구현하기 위해 다양한 유형의 컴퓨터 시스템이 사용될 수 있다. 이러한 컴퓨터 시스템이 작동하는 동안 여러 소프트웨어 구성요소를 메모리에 로딩할 수 있다. 소프트웨어 구성요소는 당업계에서 표준인 소프트웨어 구성요소와 본 발명에 특별한 구성요소(예를 들어, 문헌[Lin et al. (2004) Bioinformatics 20, 1233-1240]에 기재된 dCHIP 소프트웨어; 당업계에 공지된 방사형 기반 기계 학습 알고리즘(radial basis machine learning algorithm: RBM)) 둘 다를 포함할 수 있다.
본 발명에 포함되는 방법은 또한 사용될 특정 알고리즘을 포함하여 방정식의 기호 입력 및 높은 수준의 처리 사양을 허용하는 수학적 소프트웨어 패키지로 프로그래밍되거나 모델링될 수 있으므로, 사용자는 개별 방정식을 절차적으로 프로그래밍할 필요가 없다. 이러한 패키지는 예를 들어, 매스웍스(Mathworks)(매사추세츠주 나티크)의 Matlab, 볼프람 리서치(Wolfram Research)(일리노이주 섐페인)의 Mathematica 또는 매스소프트(MathSoft)(워싱턴주 시애틀)의 S-Plus를 포함한다.
소정의 실시형태에서, 컴퓨터는 바이오마커 데이터를 저장하기 위한 데이터베이스를 포함한다. 이러한 저장된 프로파일이 액세스되고, 나중에 관심있는 비교를 수행하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 대상체의 비-암성 조직으로부터 유래된 샘플의 바이오마커 발현 프로파일 및/또는 동일한 종의 관련 집단에서 관심있는 정보 유전자좌의 집단-기반 분포에서 생성된 프로파일이 저장되고, 나중에 대상체의 암성 조직 또는 대상체의 암성으로 의심되는 조직으로부터 유래된 샘플의 것과 비교될 수 있다.
본 명세서에 기재된 예시적 프로그램 구조 및 컴퓨터 시스템에 추가하여, 다른 대안적인 프로그램 구조 및 컴퓨터 시스템이 당업자에게 쉽게 명백할 것이다. 따라서, 사상 또는 범위 내에서 위에 기재된 컴퓨터 시스템 및 프로그램 구조로부터 벗어나지 않는 이러한 대체 시스템은 첨부된 청구범위 내에서 이해되도록 의도된다.
또한, 본 명세서에 기재된 예후 예측 검정은 비정상적인 바이오마커 발현 또는 활성과 관련된 질환 또는 장애를 치료하기 위해 작용제(예를 들어, 효능제, 길항제, 펩타이도모방체, 폴리펩타이드, 펩타이드, 핵산, 소분자 또는 다른 약물 후보)가 투여될 수 있는지 여부를 결정하는데 사용될 수 있다.
5. 임상적 효능
임상적 효능은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 암 요법(예를 들어, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 바이오마커의 적어도 하나의 조절인자)에 대한 반응은 요법에 대한 암, 예를 들어 종양의 임의의 반응, 바람직하게는 신보조제 또는 보조제 화학요법의 개시 후와 같은 암 세포의 수, 종양 질량 및/또는 종양 부피의 변화에 관한 것이다. 종양 반응은 전신적 개입 후 종양의 크기가 CT, PET, 유방조영술, 초음파 또는 촉진에 의해 측정된 초기 크기 및 치수와 비교될 수 있고, 종양의 세포질이 조직학적으로 평가되고, 치료 개시 전에 수행된 종양 생검의 세포질과 비교될 수 있는 신보조제 또는 보조제 상황에서 평가될 수 있다. 반응은 또한 생검 또는 외과적 절제 후 종양의 캘리퍼 측정 또는 병리학적 검사에 의해 평가될 수 있다. 반응은 종양 부피 또는 세포질의 퍼센트 변화와 같은 정량적 방식으로, 또는 잔류 암 부담과 같은 반정량적 점수 시스템(문헌[Symmans et al., J. Clin. Oncol. (2007) 25:4414-4422]) 또는 "병리학적 완전 반응"(pathological complete response: pCR), "임상적 완전 관해"(clinical complete remission: cCR), "임상적 부분 관해"(clinical partial remission: cPR), "임상적 안정 질환"(clinical 안정한 disease: cSD), "임상적 진행성 질환"(clinical progressive disease: cPD) 또는 다른 정성적 기준과 같은 정성적 방식에서 밀러-페인 점수(문헌[Ogston et al., (2003) Breast (Edinburgh, Scotland) 12:320-327])를 사용하여 기록될 수 있다. 종양 반응의 평가는 신보조제 또는 보조제 요법의 개시 후 초기에, 예를 들어 몇 시간, 며칠, 몇 주 후 또는 바람직하게는 몇 개월 후에 수행될 수 있다. 반응 평가를 위한 전형적 평가 종점은 신보조제 화학요법의 종료 후 또는 잔류 종양 세포 및/또는 종양 베드의 외과적 제거시이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 치료적 치료의 임상적 효능은 임상적 이득률(clinical benefit rate: CBR)을 측정함으로써 결정될 수 있다. 임상적 이득률은 요법의 종료 후 적어도 6개월의 시점에서 완전 관해(CR)에 있는 환자의 백분율, 부분적 관해(PR)에 있는 환자의 수 및 안정 질환(SD)을 갖는 환자의 수의 합을 결정함으로써 측정된다. 이러한 식의 약칭은 6개월에 걸쳐 CBR=CR+PR+SD이다. 일부 실시형태에서, 바이오마커 표 1 및/또는 표 2에 열거된 치료적 양생법의 특정 조절인자에 대한 CBR은 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% 이상이다.
암 요법(예를 들어, 예를 들어, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 바이오마커의 적어도 하나의 조절인자)에 대한 반응을 평가하기 위한 추가적인 기준은 다음을 모두 포함하는 "생존"에 관한 것이다: 전체 생존기간으로도 알려진 사망할 때까지의 생존기간(상기 사망률은 원인 또는 종양과 무관할 수 있음); "무재발 생존기간"(용어 재발은 국소 재발 및 원격 재발을 모두 포함해야 함); 무전이 생존기간; 무질환 생존기간(용어 질환은 암 및 이와 관련된 질환을 포함해야 함). 상기 생존 기간은 정의된 시작 지점(예를 들어, 진단 또는 치료 시작 시간) 및 종료 지점(예를 들어, 사망, 재발 또는 전이)을 참조하여 계산될 수 있다. 또한, 치료의 효능의 기준은 화학요법에 대한 반응, 생존 가능성, 주어진 기간 내의 전이 가능성 및 종양 재발의 가능성을 포함하도록 확장될 수 있다.
예를 들어, 적절한 역치 값을 결정하기 위하여, 하나 이상의 바이오마커(예를 들어, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 표적)의 특정 조절인자는 대상체의 집단에 투여될 수 있으며, 결과는 임의의 암 요법(예를 들어, 예를 들어, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 바이오마커의 적어도 하나의 조절인자)의 투여 전 결정된 바이오마커 측정값과 관련이 있을 수 있다. 결과 측정값은 신보조제 환경에서 주어진 요법에 대한 병리학적 반응일 수 있다. 대안적으로, 전체 생존기간 및 무질환 생존과 같은 결과 측정값은 바이오마커 측정값이 알려져 있는 암 요법(예를 들어, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 바이오마커의 적어도 하나의 조절인자) 후 대상체에 대해 일정 기간에 걸쳐 모니터링될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 바이오마커를 조절하는 작용제의 동일한 용량이 각 대상체에게 투여된다. 관련 실시형태에서, 투여되는 용량은 본 발명에 포함되는 적어도 하나의 바이오마커(예를 들어, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 하나 이상의 표적)를 조절하는 작용제에 대해 당업계에 공지된 표준 용량이다. 대상체가 모니터링되는 기간은 다를 수 있다. 예를 들어, 대상체는 적어도 2개월, 4개월, 6개월, 8개월, 10개월, 12개월, 14개월, 16개월, 18개월, 20개월, 25개월, 30개월, 35개월, 40개월, 45개월, 50개월, 55개월 또는 60개월 동안 모니터링될 수 있다. 암 요법(예를 들어, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 바이오마커의 적어도 하나의 조절인자)의 결과와 관련이 있는 바이오마커 측정값 역치 값은 실시예 부문에 기재된 것과 같은 방법을 사용하여 결정될 수 있다.
6. 바이오마커 핵산 및 폴리펩타이드의 분석
a. 샘플 수집 및 제조
일부 실시형태에서, 대상체로부터의 샘플에서의 바이오마커 양 및/또는 활성 측정값(들)은 미리 결정된 대조군(표준) 샘플과 비교된다. 대상체로부터의 샘플은 전형적으로 암 세포 또는 조직과 같은 병든 조직으로부터 유래된다. 대조군 샘플은 동일한 대상체 또는 상이한 대상체로부터 유래될 수 있다. 대조군 샘플은 전형적으로 정상의, 병들지 않은 샘플이다. 그러나, 일부 실시형태에서, 예컨대 질환의 병기 결정 또는 치료 효능의 평가를 위해, 대조군 샘플은 병든 조직으로부터 유래될 수 있다. 대조군 샘플은 여러 상이한 대상체로부터의 샘플의 조합일 수 있다. 일부 실시형태에서, 대상체로부터의 바이오마커 양 및/또는 활성 측정값(들)은 미리 결정된 수준과 비교된다. 이러한 미리 결정된 수준은 전형적으로 정상적인 샘플로부터 얻어진다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, "미리 결정된" 바이오마커 양 및/또는 활성 측정값(들)은 예로서 치료, 암 요법(예를 들어, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 하나 이상의 바이오마커의 적어도 하나의 조절인자)에 대한 반응을 평가 및/또는 암 요법(예를 들어, 적어도 하나의 면역요법의 조합에서 표 1 및/또는 표 2에 열거된 하나 이상의 바이오마커의 적어도 하나의 조절인자)에 대한 반응을 평가하기 위해 선택될 수 있는 대상체를 평가하기 위해서만 사용되는 바이오마커 양 및/또는 활성 측정값(들)일 수 있다. 미리 결정된 바이오마커 양 및/또는 활성 측정값(들)은 암이 있거나 없는 환자 집단에서 결정될 수 있다. 미리 결정된 바이오마커 양 및/또는 활성 측정값(들)은 모든 환자에게 동일하게 적용 가능한 단일 숫자일 수 있거나, 또는 미리 결정된 바이오마커 양 및/또는 활성 측정값(들)은 환자의 특정 하위집단에 따라 달라질 수 있다. 대상체의 연령, 체중, 키 및 기타 인자는 개체의 미리 결정된 바이오마커 양 및/또는 활성 측정값(들)에 영향을 미칠 수 있다. 또한, 미리 결정된 바이오마커 양 및/또는 활성은 각 대상체에 대해 개별적으로 결정될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에서 결정되고/되거나 비교되는 양은 절대적 측정값에 기초한다.
다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에서 결정되고/되거나 비교되는 양은 상대적 측정값, 예컨대 비(예를 들어, 바이오마커 카피 수, 수준 및/또는 치료 전 대 치료 후 활성, 표준물질 첨가(spiked) 대조군 또는 인공(man-made) 대조군에 대한 바이오마커 측정값, 하우스키핑 유전자의 발현에 대한 바이오마커 측정값 등)에 기초한다. 예를 들어, 상대적 분석은 치료 후 바이오마커 측정값과 비교하여 치료 전 바이오마커 측정값의 비에 기초할 수 있다. 치료 전 바이오마커 측정은 암 요법의 개시 전 임의의 시점에서 수행될 수 있다. 치료 후 바이오마커 측정은 암 요법의 개시 후 임의의 시점에서 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 치료 후 바이오마커 측정은 암 요법의 개시 후 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 11주, 12주, 13주, 14주, 15주, 16주, 17주, 18주, 19주, 20주 이상, 지속적인 모니터링을 위해 무기한으로 더 오래 수행된다. 치료는 암 요법, 예컨대 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 하나 이상의 조절인자를 포함하는 치료적 양생법을 단독으로 또는 면역관문 저해제와 같은 다른 암 작용제와 조합하여 포함할 수 있다.
미리 결정된 바이오마커 양 및/또는 활성 측정값(들)은 임의의 적합한 표준일 수 있다. 예를 들어, 미리 결정된 바이오마커 양 및/또는 활성 측정값(들)은 환자 선택이 평가되는 동일하거나 상이한 인간으로부터 얻어질 수 있다. 일 실시형태에서, 미리 결정된 바이오마커 양 및/또는 활성 측정값(들)은 동일한 환자의 이전의 평가로부터 얻어질 수 있다. 이러한 방식으로, 환자 선택의 진행 상황은 시간이 지남에 따라 모니터링될 수 있다. 또한, 대조군은 다른 인간 또는 여러 인간, 예를 들어 대상체가 인간인 경우, 선택된 인간의 그룹의 평가로부터 얻어질 수 있다. 이러한 방식으로, 선택이 평가될 인간의 선택의 범위는 적합한 다른 인간, 예를 들어 관심있는 인간, 예컨대 유사하거나 동일한 병태(들)로 고통받고 있는 인간 및/또는 동일한 인종 그룹과 유사한 상황에 있는 다른 인간과 비교될 수 있다.
본 발명에 포함되는 일부 실시형태에서, 미리 결정된 수준으로부터의 바이오마커 양 및/또는 활성 측정값(들)의 변화는 약 0.1배, 0.2배, 0.3배, 0.4배, 0.5배, 0.6배, 0.7배, 0.8배, 0.9배, 1.0배, 1.5배, 2.0배, 2.5배, 3.0배, 3.5배, 4.0배, 4.5배 또는 5.0배 또는 그 이상 또는 그 사이의 임의의 범위까지이다. 측정값이 상대적 변화에 기초, 예컨대 치료 후 바이오마커 측정값과 비교하여 치료 전 바이오마커 측정값의 비에 기초할 때, 이러한 컷-오프(cut-off) 값은 동일하게 적용된다.
생물학적 샘플은 핵산 및/또는 단백질을 포함하는 체액 샘플, 세포 샘플 또는 조직 샘플을 포함하는 환자로부터의 다양한 공급원으로부터 수집될 수 있다. "체액"은 신체로부터 배출되거나 분비되는 액체뿐만 아니라 일반적으로 그렇지 않은 액체(예를 들어, 양수, 수양액, 담즙, 혈액 및 혈액 혈장, 뇌척수액, 이구(cerumen) 및 귀지(earwax), 쿠퍼액 또는 사정 전액, 유미(chyle), 미즙(chyme), 대변, 여성 사정액, 간질액, 세포내액, 림프, 월경, 모유, 점액, 흉막액, 고름, 침, 피지, 정액, 혈청, 땀, 활액, 눈물, 소변, 질 윤활액, 유리액, 구토)를 지칭한다. 바람직한 실시형태에서, 대상체 및/또는 대조군 샘플은 세포, 세포주, 조직학적 슬라이드, 파라핀 포매 조직, 생검, 전혈, 유두 흡인물, 혈청, 혈장, 구강 채취물, 침, 뇌척수액, 소변, 대변 및 골수로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 샘플은 혈청, 혈장 또는 소변이다. 다른 실시형태에서, 샘플은 혈청이다.
샘플은 장기(예를 들어, 일, 주, 월, 연간, 2년 등의 단위로 1회 이상)에 걸쳐 반복적으로 개체로부터 수집될 수 있다. 일정 기간에 걸쳐 개체로부터 수많은 샘플을 수득하는 것은 조기 검출로부터 결과를 확인하고/하거나 예를 들어, 질환 진행, 약물 치료 등의 결과로서 생물학적 패턴의 변화를 확인하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 대상체 샘플은 본 발명에 따라 매월, 매 2개월 또는 1개월, 2개월 또는 3개월 간격의 조합으로 채취 및 모니터링될 수 있다. 또한, 시간 경과에 따라 수득된 대상체의 바이오마커 양 및/또는 활성 측정값은 모니터링 기간 동안 정상적인 대조군의 측정값과는 물론 서로 편리하게 비교되어 대상체 자신의 값을 장기 모니터링을 위한 내부 또는 개인 대조군으로 제공할 수 있다.
샘플 제조 및 분리는 수집된 샘플의 유형 및/또는 바이오마커 측정값(들)의 분석에 따라 임의의 절차를 포함할 수 있다. 이러한 절차는 단지 예로서 농도, 희석, pH의 조정, 고발현(high abundance) 폴리펩타이드(예를 들어, 알부민, 감마 글로불린 및 트랜스페린 등)의 제거, 방부제 및 교정제(calibrant)의 첨가, 프로테이스 저해제의 첨가, 변성제의 첨가, 샘플의 탈염, 샘플 단백질의 농축, 지질의 추출 및 정제를 포함한다.
샘플 제조는 다른 단백질(예를 들어, 담체 단백질)에 비-공유 복합체로 결합된 분자를 단리할 수 있다. 이러한 과정은 특정 담체 단백질(예를 들어, 알부민)에 결합된 이러한 분자를 단리하거나 또는 단백질 변성을 통해, 예를 들어 산을 사용하여 모든 담체 단백질로부터 결합된 분자를 방출시킨 후 담체 단백질을 제거하는 것과 같은 보다 일반적인 과정을 사용할 수 있다.
샘플로부터 원치않는 단백질(예를 들어, 고발현의, 유익하지 않은 또는 검출 불가능한 단백질)의 제거는 고친화성 시약, 고분자량 필터, 초원심분리 및/또는 전기투석을 사용하여 달성될 수 있다. 고친화성 시약은 고발현 단백질에 선택적으로 결합하는 항체 또는 다른 시약(예를 들어, 압타머)을 포함한다. 샘플 제조는 또한 이온 교환 크로마토그래피, 금속 이온 친화성 크로마토그래피, 겔 여과, 소수성 크로마토그래피, 크로마토포커싱, 흡착 크로마토그래피, 등전 포커싱 및 관련 기법을 포함할 수 있다. 분자량 필터는 크기와 분자량에 기초하여 분자를 분리하는 막을 포함한다. 이러한 필터는 역 삼투, 나노여과, 한외여과 및 정밀여과를 추가로 사용할 수 있다.
초원심분리는 샘플에서 원치않는 폴리펩타이드를 제거하는 방법이다. 초원심분리는 입자의 침전(또는 이의 부족)을 광학 시스템으로 모니터링하면서 약 15,000rpm 내지 60,000rpm에서 샘플을 원심분리하는 것이다. 전기투석은 전위 구배의 영향하에 반투과성 막을 통해 한 용액에서 다른 용액으로 이온이 이동하는 과정에서 전기막 또는 반투과성 막을 사용하는 절차이다. 전기 투석에 사용되는 막은 양전하 또는 음전하를 갖는 이온을 선택적으로 수송하거나, 반대 전하의 이온을 거부하거나, 크기와 전하에 따라 종(species)이 반투과성 막을 통해 이동하도록 허용하는 능력을 가질 수 있기 때문에, 전해액의 농도, 제거 또는 분리에 유용한 전기 투석을 제공한다.
본 발명에서 분리 및 정제는 당업계에 공지된 임의의 절차, 예컨대 모세관 전기영동(예를 들어, 모세관 또는 단일 칩(on-chip)에서) 또는 크로마토그래피(예를 들어, 모세관, 칼럼 또는 단일 칩에서)을 포함할 수 있다. 전기영동은 전기장의 영향하에 이온 분자를 분리하는데 사용할 수 있는 방법이다. 전기영동은 겔, 모세관 또는 마이크로채널 단일 칩에서 수행될 수 있다. 전기영동을 위해 사용되는 겔의 예는 전분, 아크릴아마이드, 폴리에틸렌 옥사이드, 아가로스 또는 이들의 조합을 포함한다. 겔은 가교-결합, 세제 또는 변성제의 첨가, 효소 또는 항체(친화성 전기영동) 또는 기질(자이모그래피)의 고정화 및 pH 구배의 혼입에 의해 변형될 수 있다. 전기영동에 사용되는 모세관의 예는 전기분무와 접속하는 모세관을 포함한다.
모세관 전기영동(Capillary electrophoresis: CE)은 복잡한 친수성 분자와 고하전 용질을 분리하는데 바람직하다. CE 기술은 또한 미세유체 칩에서 구현될 수 있다. 사용되는 모세관 및 완충액의 유형에 따라, CE는 모세관 구역 전기영동(capillary zone electrophoresis: CZE), 모세관 등전 포커싱(capillary isoelectric focusing: CIEF), 모세관 등속전기영동(capillary isotachophoresis: cITP) 및 모세관 전기크로마토그래피(capillary electrochromatography: CEC)와 같은 분리 기법으로 더 세분화될 수 있다. CE 기법을 전기분무 이온화에 결합시키는 실시형태는 휘발성 용액, 예를 들어, 휘발성 산 및/또는 염기 및 유기물, 예컨대 알코올 또는 아세토나이트릴을 함유하는 수성 혼합물의 사용을 포함한다.
모세관 등속전기영동(cITP)은 분석물이 일정한 속도로 모세관을 통해 이동하지만 그럼에도 불구하고 각각의 이동성에 의해 분리되는 기법이다. 유리-용액 CE(free-solution CE: FSCE)로도 알려진 모세관 구역 전기영동(CZE)은 분자의 전하에 의해 결정되는 종의 전기영동 이동성과 이동 중에 분자가 만나는 마찰 저항의 차이를 기반으로 한다. 모세관 등전 포커싱(CIEF)은 약한 이온화가능한 양쪽성 분자를 pH 구배에서 전기영동에 의해 분리될 수 있게 한다. CEC는 전통적인 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 및 CE 간의 하이브리드기법이다.
본 발명에 사용되는 분리 및 정제 기법은 당업계에 공지되어 있는 임의의 크로마토그래피 절차를 포함한다. 크로마토그래피는 소정의 분석물의 차등 흡착 및 용리 또는 이동상과 고정상 사이의 분석물의 분할을 기반으로 할 수 있다. 크로마토그래피의 다른 예는 액체 크로마토그래피(LC), 가스 크로마토그래피(GC), 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
b. 바이오마커 핵산 및 폴리펩타이드의 분석
바이오마커 핵산 및/또는 바이오마커 폴리펩타이드는 본 발명에 유용한 1) 바이오마커 전사체 또는 폴리펩타이드의 수준의 변화, 2) 바이오마커 유전자로부터의 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실 또는 추가, 4) 바이오마커 유전자의 하나 이상의 뉴클레오타이드의 치환, 5) 발현 조절 영역과 같은 바이오마커 유전자의 비정상적인 변형을 포함하지만 이들로 제한되지 않는, 이러한 유전적 또는 발현 변화를 확인하기 위해 본 명세서에 기재된 방법 및 당업자에게 공지된 기법에 따라 분석될 수 있다.
c. 카피 수 및/또는 게놈 핵산 돌연변이의 검출 방법
바이오마커 핵산의 카피 수 및/또는 게놈 핵산 상태(예를 들어, 돌연변이)를 평가하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 염색체 획득 또는 소실의 존재 또는 부재는 본 명세서에서 확인된 영역 또는 마커의 카피 수를 결정함으로써 간단하게 평가될 수 있다.
일 실시형태에서, 생물학적 샘플은 게놈 마커를 함유하는 게놈 유전자좌에서의 카피 수 변화의 존재에 대해 테스트된다. 일부 실시형태에서, 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 증가된 카피 수 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 감소된 카피 수는 암 요법(예를 들어, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 바이오마커의 적어도 하나의 조절인자)의 나쁜 결과의 예측이다. 적어도 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개의 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수는 암 요법(예를 들어, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 바이오마커의 적어도 하나의 조절인자)에 대한 반응 가능성의 예측이다.
바이오마커 유전자좌의 카피 수를 평가하는 방법은 혼성화-기반 검정을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 혼성화-기반 검정은 전통적인 "직접 프로브" 방법, 예컨대 서던 블롯, 인 시투 혼성화(예를 들어, FISH, 및 FISH와 SKY) 방법 및 "비교 프로브" 방법, 예컨대 비교 게놈 혼성화(comparative genomic hybridization: CGH), 예를 들어, cDNA-기반 또는 올리고뉴클레오타이드-기반 CGH를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 방법은 기판(예를 들어, 막 또는 유리) 결합 방법 또는 어레이-기반 접근법을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 다양한 형식으로 사용될 수 있다.
일 실시형태에서, 샘플에서 바이오마커 유전자 카피 수를 평가하는 것은 서던 블롯을 포함한다. 서던 블롯에서, 게놈 DNA(전형적으로 전기영동 겔에서 단편화되고 분리됨)는 표적 영역에 특이적인 프로브에 혼성화된다. 정상적인 게놈 DNA(예를 들어, 동일거나 관련된 세포, 조직, 장기 등의 비증폭 부분)의 분석으로부터 대조군 프로브 신호와 표적 영역에 대한 프로브로부터의 혼성화의 신호 강도의 비교는 표적 핵산의 상대적 카피 수의 추정치를 제공한다. 대안적으로, 노던 블롯은 샘플에서 암호화 핵산의 카피 수를 평가하기 위해 이용될 수 있다. 노던 블롯에서, mRNA는 표적 영역에 특이적인 프로브에 혼성화된다. 표적 영역에 대한 프로브로부터의 혼성화 신호의 강도와 정상 RNA(예를 들어, 동일하거나 관련된 세포, 조직, 장기 등의 비증폭 부분)의 분석으로부터의 대조군 프로브 신호의 비교는 표적 핵산의 상대적 카피 수의 추정치를 제공한다. 대안적으로, 적절한 대조군(예를 들어, 동일한 또는 관련된 세포, 조직, 장기 등의 비증폭 부분)에 비해 높거나 낮은 발현이 표적 핵산의 상대적 카피수의 추정치를 제공하는, RNA를 검출하기 위해 당업계에 잘 알려진 다른 방법이 사용될 수 있다.
게놈 카피 수를 결정하기 위한 대안적인 수단은 인 시투 혼성화(예를 들어, 문헌[Angerer (1987) Meth. Enzymol 152: 649])이다. 일반적으로, 인 시투 혼성화는 다음의 단계를 포함한다: (1) 분석될 조직 또는 생물학적 구조의 고정; (2) 표적 DNA의 접근성을 높이고 비특이적 결합을 감소시키기 위한 생물학적 구조의 전혼성화 처리; (3) 생물학적 구조 또는 조직에서 핵산에 대한 핵산 혼합물의 혼성화; (4) 혼성화에서 결합되지 않은 핵산 단편을 제거하기 위한 혼성화 후 세척 및 (5) 혼성화된 핵산 단편의 검출. 각각의 이러한 단계에서 사용되는 시약 및 사용 조건은 특정 적용에 따라 달라진다. 전형적 인 시투 혼성화 검정에서, 세포는 고체 지지체, 전형적으로 유리 슬라이드에 고정된다. 핵산이 조사되는 경우, 세포는 열 또는 알칼리로 변성된다. 그런 다음, 세포는 단백질을 암호화하는 핵산 서열에 특이적인 표지된 프로브의 어닐링을 위해 중간 온도에서 혼성화 용액과 접촉된다. 그런 다음, 표적(예를 들어, 세포)은 전형적으로 적절한 신호 대 잡음비가 얻어질 때까지 미리 결정된 엄격성에서 또는 증가하는 엄격성에서 세척된다. 프로브는 전형적으로 예를 들어, 방사성 동위원소 또는 형광 리포터로 표지된다. 일 실시형태에서, 프로브는 엄격한 조건하에서 표적 핵산(들)과 특이적으로 혼성화하기에 충분히 길다. 프로브는 일반적으로 약 200개의 염기 내지 약 1000개의 염기 길이이다. 일부 적용에서는, 반복적인 서열의 혼성화 능력을 차단할 필요가 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, tRNA, 인간 게놈 DNA 또는 Cot-I DNA가 비-특이적 혼성화를 차단하는데 사용된다.
게놈 카피 수를 결정하기 위한 대안적인 수단은 비교 게놈 혼성화이다. 일반적으로, 게놈 DNA는 정상적인 참조 세포뿐만 아니라 테스트 세포(예를 들어, 종양 세포)로부터 단리되며, 필요할 경우 증폭된다. 2개의 핵산이 차별적으로 표지된 다음, 참조 세포의 중기 염색체에 인 시투 혼성화된다. 참조 DNA 및 테스트 DNA 둘 다에서의 반복적인 서열은 제거되거나, 또는 예를 들어, 적절한 차단 핵산을 사용한 전혼성화 및/또는 상기 혼성화 동안 상기 반복적인 서열에 대해 이러한 차단 핵산 서열을 포함시킴으로써 일부 수단에 의해 이들의 혼성화 능력이 감소된다. 그런 다음, 결합되고 표지된 DNA 서열은 필요한 경우 시각화 가능한 형태로 렌더링된다. 카피 수가 증가되거나 감소된 테스트 세포의 염색체 영역은 두 DNA로부터의 신호비가 변경되는 영역을 검출함으로써 확인될 수 있다. 예를 들어, 테스트 세포에서 카피 수가 감소된 영역은 게놈의 다른 영역과 비교하여 참조보다 테스트 DNA로부터 상대적으로 더 낮은 신호를 보일 것이다. 테스트 세포에서 카피 수가 증가된 영역은 테스트 DNA로부터 상대적으로 더 높은 신호를 보일 것이다. 염색체 결실 또는 증식이 있는 경우, 2개의 표지로부터의 신호비의 차이가 검출될 것이며, 비는 카피 수의 척도를 제공할 것이다. CGH, 어레이 CGH(aCGH)의 다른 실시형태에서, 고정된 염색체 요소는 어레이상의 고체 지지체에 결합된 표적 핵산의 집합으로 대체되어, 고체 지지체에 결합된 표적의 집합에서 게놈의 크거나 완전한 백분율을 나타낼 수 있다. 표적 핵산은 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오타이드(예를 들어, 단일 뉴클레오타이드 다형성을 검출하기 위해) 등을 포함할 수 있다. 어레이-기반 CGH는 또한 단일-색상 표지로 수행될 수 있다(대조군 및 가능한 종양 샘플을 2개의 상이한 염료로 표지하고 혼성화 전에 이들을 혼합하는 것과 달리, 이는 어레이 상에서 프로브의 경쟁적 혼성화로 인한 비를 산출할 것임). 단일 색상 CGH에서, 대조군은 표지되고, 하나의 어레이에 혼성화며, 절대 신호가 판독되고, 가능한 종양 샘플이 표지되고, 제2 어레이(동일한 함량으로)에 혼성화되며, 절대 신호가 판독된다. 카피 수 차이는 2개의 어레이로부터의 절대 신호를 기반으로 계산된다. 고정된 염색체 또는 어레이를 제조하고 비교 게놈 혼성화를 수행하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, 미국 특허 제6,335,167호; 제6,197,501호; 제5,830,645호; 및 제5,665,549호 및 문헌[Albertson (1984) EMBO J. 3:1227-1234; Pinkel (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:9138-9142]; 유럽 공개 제430,402호; 문헌[Methods in Molecular Biology, Vol. 33: In situ Hybridization Protocols, Choo, ed., Humana Press, Totowa, N.J. (1994)] 등 참조). 다른 실시형태에서, 문헌[Pinkel, et al. (1998) Nat. Genet. 20:207-211] 또는 문헌[Kallioniemi (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:5321-5325 (1992)]의 혼성화 프로토콜이 사용된다.
여전히 다른 실시형태에서, 증폭-기반 검정은 카피 수를 측정하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 증폭-기반 검정에서, 핵산 서열은 증폭 반응(예를 들어, 중합 효소 연쇄 반응(PCR))에서 주형으로서 작용한다. 정량적 증폭에서, 증폭 산물의 양은 원래 샘플에서의 주형의 양에 비례할 것이다. 적절한 대조군과 비교하여, 예를 들어 건강한 조직은 꽤 많은 카피 수를 제공한다.
"정량적" 증폭 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 정량적 PCR은 동일 프라이머를 사용하여 공지된 양의 대조군 서열을 동시에 공동 증폭시키는 것을 포함한다. 이는 PCR 반응을 교정하는데 사용될 수 있는 내부 표준을 제공한다. 정량적 PCR에 대한 상세한 프로토콜은 문헌[Innis, et al. (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. N.Y.]에 제공된다. 정량적 PCR 분석을 이용한 현미부수체 유전자좌에서의 DNA 카피수의 측정은 문헌[Ginzonger et al. (2000) Cancer Res. 60:5405-5409]에 기재되어 있다. 유전자에 대한 공지된 핵산 서열은 당업자가 유전자의 임의의 부분을 증폭시키기 위해 프라이머를 통상적으로 선택하는 것을 가능케 하기에 충분하다. 본 발명에 포함되는 방법에서, 플루오로게닉(Fluorogenic) 정량적 PCR이 또한 사용될 수 있다. 플루오로게닉 정량적 PCR에서, 정량은 형광 신호, 예를 들어 TaqMan 및 SYBR 그린의 양을 기초로 한다.
다른 적합한 증폭 방법은 리가제 연쇄반응(ligase chain reaction: LCR)(문헌[Wu and Wallace (1989) Genomics 4:560, Landegren, et al. (1988) Science 241:1077 및 Barringer et al. (1990) Gene 89:117] 참조), 전사 증폭(문헌[Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:1173]), 자가-유지 염기서열 복제반응(문헌[Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:1874]), 도트 PCR, 및 링커 어댑터 PCR 등을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
이형접합 상실(Loss of heterozygosity: LOH) 및 주요 카피 비율(major copy proportion: MCP) 맵핑(문헌[Wang et al. (2004) Cancer Res. 64:64-71; Seymour et al. (1994) Cancer Res. 54:2761-2764; Hahn et al. (1995) Cancer Res. 55:4670-4675; Kimura et al. (1996) Genes Chromosomes Cancer 17:88-93; Li et al. (2008) MBC Bioinform. 9:204-219])이 또한 증폭 또는 결실의 영역을 확인하는데 사용될 수 있다.
d. 바이오마커 핵산 발현의 검출 방법
바이오마커 발현은 전사된 분자 또는 단백질의 발현을 검출하기 위해 잘 알려진 임의의 다양한 방법에 의해 평가될 수 있다. 이러한 방법의 비-제한적 예는 분비된, 세포-표면, 세포질성 또는 핵 단백질의 검출을 위한 면역학적방법, 단백질 정제 방법, 단백질 기능 또는 활성 검정, 핵산 혼성화 방법, 핵산 역 전사 방법 및 핵산 증폭 방법을 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 특정 유전자의 활성은 유전자 전사체(예를 들어, mRNA)의 측정, 번역된 단백질의 양의 측정 또는 유전자 산물 활성의 측정에 의해 특성화된다. 마커 발현은 mRNA 수준, 단백질 수준 또는 단백질 활성을 검출하는 것을 포함하는 다양한 방식으로 모니터링될 수 있으며, 이들 중 임의의 것은 표준 기법을 사용하여 측정될 수 있다. 검출은 유전자 발현(예를 들어, 게놈 DNA, cDNA, mRNA, 단백질 또는 효소 활성) 수준의 정량화를 포함할 수 있거나, 또는 대안적으로, 특히 대조군 수준과 비교하여 유전자 발현 수준의 정성적 평가일 수 있다. 검출되는 수준의 유형은 내용으로부터 명확할 것이다.
다른 실시형태에서, 바이오마커 및 이의 단편 또는 유전적 변경(예를 들어, 이의 조절 또는 프로모터 영역에)을 포함하는 이의 기능적으로 유사한 상동체의 발현 수준을 검출 또는 결정하는 것은 관심있는 마커에 대한 RNA 수준을 검출 또는 결정하는 것을 포함한다. 일 실시형태에서, 테스트될 대상체로부터 하나 이상의 세포가 수득되고, RNA가 세포로부터 단리된다. 바람직한 실시형태에서, 유방 조직 세포의 샘플은 대상체로부터 수득된다.
일 실시형태에서, RNA는 단일 세포로부터 수득된다. 예를 들어, 세포는 레이저 포획 현미해부(laser capture microdissection: LCM)에 의해 조직 샘플로부터 단리될 수 있다. 이러한 기법을 사용하여, 세포는 염색된 조직 절편을 포함하는 조직 절편으로부터 단리되어 목적하는 세포가 단리되는 것을 보장할 수 있다(예를 들어, 문헌[Bonner et al. (1997) Science 278:1481; Emmert-Buck et al. (1996) Science 274:998; Fend et al. (1999) Am. J. Path. 154: 61 및 Murakami et al. (2000) Kidney Int. 58:1346] 참조). 예를 들어, 상기 문헌[Murakami et al.]은 이전에 면역염색된 조직 절편으로부터의 세포의 단리를 기술하고 있다.
RNA가 추출될 수 있는 더 많은 세포 집단을 얻기 위해 대상체로부터 세포를 얻고 시험관내에서 세포를 배양하는 것 또한 가능하다. 형질전환되지 않은 세포의 배양물, 즉, 1차 세포 배양물을 확립하는 방법은 당업계에 공지되어 있다.
조직 샘플 또는 개체로부터의 세포에서 RNA를 단리할 때, 조직 또는 세포가 대상체로부터 제거된 후 유전자 발현에서 임의의 추가 변화를 방지하는 것이 중요할 수 있다. 발현 수준의 변화는 섭동, 예를 들어 열 충격, 또는 리포폴리사카라이드(LPS) 또는 다른 시약을 사용한 활성화 후 빠르게 변화하는 것으로 알려져 있다. 또한, 조직 및 세포에서 RNA는 빠르게 분해될 수 있다. 따라서, 바람직한 실시형태에서, 대상체로부터 수득된 조직 또는 세포는 가능한 빨리 급속 냉동된다.
RNA는 다양한 방법, 예를 들어 구아니듐 티오사이아네이트 용해 후 CsCl 원심분리에 의해 조직 샘플로부터 추출될 수 있다(문헌[Chirgwin et al.(1979) Biochem. 18:5294-5299]). 단일 세포로부터의 RNA는 문헌[Dulac (1998) Curr. Top. Dev. Biol. 36:245 and Jena et al. (1996) J. Immunol. Methods 190:199]에 기재된 것들과 같은 단일 세포로부터 cDNA 라이브러리를 제조하는 방법에 기재된 바와 같이 수득될 수 있다. 예를 들어, RNAsin의 포함에 의한 RNA 분해를 방지하기 위해 주의를 기울여야 한다.
RNA 샘플은 특정 종에서 농축될 수 있다. 일 실시형태에서, 폴리(A)+ RNA는 RNA 샘플로부터 단리된다. 일반적으로, 이러한 정제는 mRNA의 폴리-A 꼬리를 이용한다. 특히 위에서 언급된 바와 같이, 폴리-T 올리고뉴클레오타이드는 mRNA에 대한 친화성 리간드로서 작용하기 위해 고체 지지체 내에 고정될 수 있다. 이러한 목적을 위한 키트는 예를 들어, 메세지마커(MessageMaker) 키트(라이프 테크놀로지스(Life Technologies)(뉴욕주 그랜드 아일랜드)와 같이 상업적으로 이용 가능하다.
바람직한 실시형태에서, RNA 집단은 마커 서열이 풍부하다. 농축은 예를 들어, 프라이머-특이적 cDNA 합성 또는 cDNA 합성에 기초한 다수의 라운드의 선형 증폭 및 주형-지정 시험관내 전사에 의해 수행될 수 있다(예를 들어, 문헌[Wang et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 9717; 상기 Dulac et al. 및 상기 Jena et al.] 참조).
농축되거나 특정 종 또는 서열이 아닌 RNA의 집단은 더 증폭될 수 있다. 본 명세서에 정의된 바와 같이, "증폭 과정"은 RNA 내의 분자를 강화, 증가 또는 증대시키도록 설계된다. 예를 들어, RNA가 mRNA인 경우, RT-PCR과 같은 증폭 과정은 신호가 검출 가능하거나 검출이 향상되도록 mRNA를 증폭하기 위해 이용될 수 있다. 이러한 증폭 과정은 특히 생물학적, 조직 또는 종양 샘플이 작은 크기 또는 부피일 때 유용하다.
다양한 증폭 및 검출 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, mRNA를 cDNA로 역전사한 후 중합 효소 연쇄반응(RT-PCR)을 수행하는 것; 또는 미국 특허 제5,322,770호에 기재된 바와 같은 두 단계를 위해 단일 효소를 사용하는 것, 또는 문헌[Marshall et al. (1994) PCR Methods Appls. 4:80-84]에 의해 기재된 바와 같이 mRNA를 cDNA로 역전사한 후 대칭 갭 라이게이스 연쇄반응(RT-AGLCR)을 수행하는 것이 본 발명에 포함되는 범위 내에 있다. 실시간 PCR 또한 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용될 수 있는 다른 알려진 증폭 방법은 문헌[Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:1874-1878] 및 또한 문헌[Compton et al. (1991) Nature 350:91-92]에 기재된 소위 "NASBA" 또는 "3SR" 기법; 유럽 공개 제4544610호에 기재된 바와 같은 Q-베타 증폭; 문헌[Walker et al. (1996) Clin. Chem. 42:9-13] 및 유럽 공개 제684315호에 기재된 바와 같은 가닥 치환 증폭; PCT 공개 WO 93/22461에 기재된 바와 같은 표적 매개성 증폭; PCR; 라이게이스 연쇄 반응(LCR)(예를 들어, 문헌[Wu and Wallace (1989) Genomics 4:560, Landegren et al. (1988) Science 241:1077] 참조); 자가-지속성 서열 복제(SSR)(예를 들어, 문헌[Guatelli et al. (1990) Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 87:1874] 참조); 및 전사 증폭(예를 들어, 문헌[Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:1173] 참조)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
유전자 발현의 절대적 및 상대적 수준을 결정하기 위한 많은 기법이당 업계에 공지되어 있으며, 본 발명에 사용하기에 적합한 일반적으로 사용되는 기법은 노던 분석, RNase 보호 검정(RNase protection assay: RPA), 마이크로어레이 및 PCR-기반 기법, 예컨대 정량적 PCR 및 분별 디스플레이 PCR을 포함한다. 예를 들어, 노던 블로팅은 변성 아가로스 겔에서 RNA 준비를 실행하고, 활성화된 셀룰로스, 나이트로셀룰로스 또는 유리 또는 나일론 막과 같은 적합한 지지체로 옮기는 것을 포함한다. 그런 다음, 방사성 표지된 cDNA 또는 RNA는 제제에 혼성화되고, 세척되고, 방사선 촬영에 의해 분석된다.
방사성 표지된 안티센스 RNA 프로브가 생검 샘플의 얇은 절편과 혼성화되고, 세척되고, RNase로 절단되고, 방사선 촬영을 위해 민감성 에멀션에 노출되는 인 시투 혼성화 시각화가 또한 사용될 수 있다. 샘플은 샘플의 조직학적 구성을 입증하기 위해 헤마톡실린으로 염색될 수 있으며, 적절한 광 필터를 사용한 암 시야 이미징은 현상된 에멀션을 보여준다. 다이곡시게닌과 같은 비-방사성 표지가 또한 사용될 수 있다.
대안적으로, mRNA 발현은 DNA 어레이, 칩 또는 마이크로어레이에서 검출될 수 있다. 대상체로부터 수득된 테스트 샘플의 표지된 핵산은 바이오마커 DNA를 포함하는 고체 표면에 혼성화될 수 있다. 양성 혼성화 신호는 바이오마커 전사체를 함유하는 샘플로 얻어진다. DNA 어레이의 제조 방법 및 그 용도는 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, 미국 특허 제6,618,6796호; 제6,379,897호; 제6,664,377호; 제6,451,536호; 및 제6,548,257호; 미국 공개 제2003/0157485호; 및 문헌[Schena et al. (1995) Science 20:467-470; Gerhold et al. (1999) Trends Biochem. Sci. 24:168-173; 및 Lennon et al. (2000) Drug Discovery Today 5:59-65] 참조). 유전자 발현의 연속 분석(Serial Analysis of Gene Expression: SAGE)이 또한 수행될 수 있다(예를 들어, 미국 공개 제2003/0215858호 참조).
mRNA 수준을 모니터링하기 위해, mRNA는 테스트될 생물학적 샘플에서 추출되고, 역전사되고, 형광 표지된 cDNA 프로브가 생성된다. 그런 다음, 마커 cDNA에 혼성화할 수 있는 마이크로어레이는 표지된 cDNA 프로브로 프로빙되고, 슬라이드가 스캔되며, 형광 강도가 측정된다. 이러한 강도는 혼성화 강도 및 발현 수준과 관련이 있다.
본 명세서에 기재된 방법에 사용될 수 있는 프로브의 유형은 cDNA, 리보프로브, 합성 올리고뉴클레오타이드 및 게놈 프로브를 포함한다. 사용되는 프로브의 유형은 일반적으로 예를 들어, 인 시투 혼성화를 위한 리보프로브 및 노던 블로팅을 위한 cDNA와 같은 특정 상황에 의해 결정될 것이다. 일 실시형태에서, 프로브는 RNA에 고유한 뉴클레오타이드 영역으로 향한다. 프로브는 마커 mRNA 전 사체를 차별적으로 인식하는데 필요한 만큼 짧을 수 있으며, 예를 들어 15개의 염기만큼 짧을 수 있다; 그러나, 적어도 17개, 18개, 19개 또는 20개 이상의 염기의 프로브가 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 프라이머 및 프로브는 엄격한 조건하에서 마커에 상응하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 단편에 특이적으로 혼성화한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "엄격한 조건"은 뉴클레오타이드 서열에서 적어도 95% 동일성이 있는 경우에만 혼성화가 발생하는 것을 의미한다. 다른 실시형태에서, "엄격한 조건" 하에서의 혼성화는 서열 간에 적어도 97% 동일성이 있을 때 발생한다.
프로브의 표지의 형태는 방사성 동위원소, 예를 들어 32P 및 35S의 사용과 같이 적절한 임의의 것일 수 있다. 방사성 동위원소를 사용한 표지는 적합하게 표지된 염기를 사용하여 프로브가 화학적으로 또는 생물학적으로 합성되는지 여부에 관계없이 달성될 수 있다.
일 실시형태에서, 생물학적 샘플은 테스트 대상체로부터의 폴리펩타이드 분자를 함유한다. 대안적으로, 생물학적 샘플은 테스트 대상체로부터의 mRNA 분자 또는 테스트 대상체로부터의 게놈 DNA 분자를 함유할 수 있다.
다른 실시형태에서, 방법은 대조군 대상체로부터 대조군 생물학적 샘플을 수득하는 단계, 마커 폴리펩타이드, mRNA, 게놈 DNA 또는 이의 단편의 존재가 생물학적 샘플에서 검출되도록 대조군 샘플을 마커 폴리펩타이드, mRNA, 게놈 DNA 또는 이의 단편을 검출할 수 있는 화합물 또는 작용제와 접촉시키는 단계, 및 대조군 샘플에서 마커 폴리펩타이드, mRNA, 게놈 DNA 또는 이의 단편의 존재와 테스트 샘플에서 마커 폴리펩타이드, mRNA, 게놈 DNA 또는 이의 단편의 존재를 비교하는 단계를 더 포함한다.
e. 바이오마커 단백질 발현의 검출 방법
바이오마커 단백질의 활성 또는 수준은 발현된 폴리펩타이드를 검출 또는 정량함으로써 검출 및/또는 정량화될 수 있다. 폴리펩타이드는 당업자에게 잘 알려진 임의의 여러 수단에 의해 검출 및 정량화될 수 있다. 바이오마커 핵산에 의해 암호화된 폴리펩타이드 및 이의 단편 또는 유전적 변경(예를 들어, 이의 조절 또는 프로모터 영역에서)을 포함하는 이의 기능적으로 유사한 상동체의 비정상적인 수준의 폴리펩타이드 발현은 단독 또는 면역요법 치료와의 병용에서 T 세포 매개성 세포 독성의 조절인자에 대한 암의 반응 가능성과 관련이 있다. 폴리펩타이드를 검출하기 위한 당업계에 공지된 임의의 방법이 사용될 수 있다. 이러한 방법은 면역확산, 면역전기영동, 방사성 면역검정(RIA), 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA), 면역형광 검정, 웨스턴 블로팅, 결합제-리간드 검정, 면역조직화학적 기법, 응집, 보체 검정, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 박층 크로마토그래피(TLC), 고확산 크로마토그래피 등(예를 들어, 문헌[Basic and Clinical Immunology, Sites and Terr, eds., Appleton and Lange, Norwalk, Conn. pp 217-262, 1991])을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 항체를 에피토프 또는 에피토프들과 반응시키고, 표지된 폴리펩타이드 또는 이의 유도체를 경쟁적으로 대체하는 것을 포함하는 결합제-리간드 면역검정 방법이 바람직하다.
예를 들어, ELISA 및 RIA 절차는 원하는 바이오마커 단백질 표준이 표지(125I 또는 35S와 같은 방사성 동위원소 또는 서양고추냉이 퍼옥시데이스 또는 알칼리성 포스파테이스와 같은 검정 가능한 효소로)되고, 그리고 표지되지 않은 샘플과 함께 상응하는 항체와 접촉하고(여기서 제2 항체는 제1 항체에 결합하기 위해 사용됨), 방사능 또는 고정된 효소가 검정(경쟁적 검정)되도록 수행될 수 있다. 대안적으로, 샘플에서 바이오마커 단백질은 상응하는 고정된 항체와 반응하도록 허용되고, 방사성 동위원소-표지된 또는 효소-표지된 항-바이오마커 단백질 항체는 시스템과 반응하도록 허용되며, 방사능 또는 효소는 검정(ELISA-샌드위치 검정)된다. 다른 종래의 방법이 또한 적합하게 사용될 수 있다.
위의 기법은 본질적으로 "1-단계" 또는 "2-단계" 검정으로 수행될 수 있다. "1-단계" 검정은 항원과 고정된 항체를 접촉시키고, 세척하지 않고 혼합물을 표지된 항체와 접촉시키는 것을 포함한다. "2-단계" 검정은 혼합물을 표지된 항체와 접촉시키기 전에 세척하는 것을 포함한다. 다른 종래의 방법이 또한 적합하게 사용될 수 있다.
일 실시형태에서, 바이오마커 단백질 수준을 측정하는 방법은 다음의 단계를 포함한다: 생물학적 표본을 항체 또는 바이오마커 단백질에 선택적으로 결합하는 이의 변이체(예를 들어, 단편)와 접촉시키는 단계, 및 상기 항체 또는 이의 변이체가 상기 샘플에 결합되는지 여부를 검출하는 단계 및 이에 의해 바이오마커 단백질의 수준을 측정하는 단계.
바이오마커 단백질 및/또는 항체의 효소적 및 방사성 표지는 종래의 수단에 의해 수행될 수 있다. 이러한 수단은 일반적으로 효소를 글루타알데하이드와 같은 문제의 항원 또는 항체에 공유 결합하여 특히 효소의 활성에 악영향을 미치지 않도록 하는 것을 포함할 것이며, 이는 효소가 여전히 이의 기질과 상호작용할 수 있어야 함을 의미하지만, 모든 효소가 활성화될 필요는 없지만 검정이 수행될 수 있도록 충분히 활성 상태로 남아 있으면 된다. 실제로, 결합 효소에 대한 일부 기법은 비-특이적이며(예컨대, 폼알데하이드 사용), 활성 효소의 일부만을 생성할 것이다.
일반적으로 검정 시스템의 한 성분을 지지체에 고정하여 시스템의 다른 성분을 성분과 접촉시키고, 힘들고 시간-소모적인 노동없이 쉽게 제거할 수 있도록 하는 것이 바람직하다. 제2 상이 제1 상에서 멀리 고정될 수 있지만, 하나의 상이 일반적으로 충분하다.
효소 자체를 지지체에 고정하는 것이 가능하지만, 고체-상 효소가 필요하다면, 이는 일반적으로 항체에 결합하고 항체를 당업계에 잘 알려진 지지체, 모델 및 시스템에 부착하여 가장 잘 달성된다. 간단한 폴리에틸렌은 적합한 지지체를 제공할 수 있다.
표지에 사용할 수 있는 효소는 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 옥시데이스기의 구성원으로부터 선택될 수 있다. 이들은 기질과의 반응에 의해 과산화수소의 생산을 촉매하며, 글루코스 옥시데이스는 종종 좋은 안정성, 가용성 및 저렴함뿐만 아니라 기질(글루코스)의 가용성을 위해 사용된다. 옥시데이스의 활성은 당업계에 잘 알려진 제어된 조건하에서 효소-표지된 항체와 기질의 반응 후에 형성된 과산화수소의 농도를 측정함으로써 분석될 수 있다.
본 개시내용을 기반으로 의사의 선호도에 따라 바이오마커 단백질을 검출하기 위해 다른 기법이 사용될 수 있다. 이러한 기술 중 하나는 적절하게 처리된 샘플이 나이트로셀룰로스 필터와 같은 고체 지지체로 옮겨지기 전에 SDS-PAGE 겔에서 실행되는 웨스턴 블로팅(문헌[Towbin et al. (1979) Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 76:4350])이다. 그런 다음, 항-바이오마커 단백질 항체(표지되지 않음)는 지지체와 접촉시키고, 표지된 단백질 A 또는 항-면역글로불린(125I, 서양고추냉이 퍼옥시데이스 및 알칼리성 포스파테이스를 포함하는 적합한 표지)과 같은 2차 면역학적시약에 의해 검정된다. 크로마토그래피 검출이 또한 사용할 수 있다.
면역조직화학은 예를 들어, 생검 샘플에서 바이오마커 단백질의 발현을 검출하는데 사용될 수 있다. 적합한 항체는 예를 들어, "얇은 세포층과 접촉시키고, 세척한 다음 제2의 표지된 항체와 접촉시킨다. 표지는 형광 마커, 효소, 예컨대 퍼옥시데이스, 아비딘 또는 방사성 표지에 의해 수행될 수 있다. 검정은 현미경을 사용하여 시각적으로 채점된다.
인트라바디와 같은 항-바이오마커 단백질 항체는 또한 예를 들어, 대상체의 세포 및 조직에서 바이오마커 단백질의 존재를 검출하기 위해 이미징 목적으로 사용될 수 있다. 적합한 표지는 방사성 동위원소, 아이오딘(125I, 121I), 탄소(14C), 황(35S), 트라이튬(3H), 인듐(112In) 및 테크네튬(99mTc), 형광 표지, 예컨대 플루오레세인 및 로다민 및 바이오틴을 포함한다.
생체내 이미징 목적을 위해, 항체는 신체 외부에서 검출할 수 없으므로 검출을 가능하게 하기 위해 표지 또는 그렇지 않으면 변형되어야 한다. 이러한 목적을 위한 마커는 항체 결합을 실질적으로 방해하지 않지만 외부 검출을 허용하는 임의의 것일 수 있다. 적합한 마커는 X-방사선 촬영, NMR 또는 MRI에 의해 검출될 수 있는 것들을 포함할 수 있다. X-방사선 촬영 기법의 경우, 적합한 마커는 검출 가능한 방사선을 방출하지만, 예를 들어 바륨 또는 세슘과 같이 대상체에게 명백히 해롭지 않은 임의의 방사성 동위원소를 포함한다. NMR 및 MRI에 적합한 마커는 일반적으로 예를 들어, 관련 하이브리도마에 대한 영양소의 적합한 표지에 의해 항체에 혼입될 수 있는 중수소와 같은 검출 가능한 특징적 스핀을 갖는 것들을 포함한다.
대상체의 크기와 사용되는 이미징 시스템은 진단 이미지를 생성하는 데 필요한 이미징 모이어티의 양을 결정할 것이다. 방사성 동위원소 모이어 티의 경우에, 인간 대상체의 경우 주입되는 방사능의 양은 일반적으로 약 5 내지 20 밀리큐리의 테크네튬-99일 것이다. 표지된 항체 또는 항체 단편은 바이오마커 단백질을 함유하는 세포의 위치에 우선적으로 축적될 것이다. 표지된 항체 또는 항체 단편은 공지된 기법을 사용하여 검출될 수 있다.
바이오마커 단백질을 검출하기 위해 사용될 수 있는 항체는 검출될 바이오마커 단백질에 충분히 강하고 특이적으로 결합하는 천연의 또는 합성, 전장 또는 이의 단편, 단일클론 또는 다중클론 여부에 관계없이 임의의 항체를 포함한다. 항체는 최대 약 10-6M, 10-7M, 10-8M, 10-9M, 10-10M, 10-11M 또는 10-12M의 Kd를 가질 수 있다. 문구 "특이적으로 결합하다"는 예를 들어, 결합이 동일하거나 유사한 에피토프, 항원 또는 항원 결정기의 제2 제제와 대체되거나 경쟁될 수 있는 방식으로 항체가 에피토프 또는 항원 또는 항원 결정기에 결합하는 것을 지칭한다. 항체는 관련 단백질과 같은 다른 단백질에 비해 바이오마커 단백질에 우선적으로 결합할 수 있다.
항체는 상업적으로 입수 가능하거나, 또는 당업계에 공지되어 있는 방법에 따라 제조될 수 있다.
일부 실시형태에서, 펩타이드와 같은 항체 이외의 바이오마커 단백질에 특이적으로 결합하는 작용제가 사용된다. 바이오마커 단백질에 특이적으로 결합하는 펩타이드는 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 확인될 수 있다. 예를 들어, 바이오마커 단백질의 특정 펩타이드 결합제는 펩타이드 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하기 위해 스크리닝될 수 있다.
f. 바이오마커 구조적 변경의 검출 방법
예를 들어, 암세포의 T 세포 매개성 살해에 영향을 미치는 서열 또는 작용제를 확인하기 위해, 다음의 예시적인 방법을 사용하여 바이오마커 핵산 및/또는 바이오마커 폴리펩타이드 분자에서 구조적 변경의 존재를 확인할 수 있다.
소정의 실시형태에서, 변경의 검출은 중합 효소 연쇄 반응(PCR)(예를 들어, 미국 특허 제4,683,195호 및 제4,683,202호 참조), 예컨대 앵커 PCR 또는 RACE PCR에서 또는 대안적으로, 결찰 연쇄 반응(LCR)에서 프로브/프라이머를 사용하는 것을 포함하며(예를 들어, 문헌[Landegran et al. (1988) Science 241:1077-1080; 및 Nakazawa et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:360-364] 참조), 후자는 바이오마커 유전자와 같은 바이오마커 핵산에서 점 돌연변이를 검출하는데 특히 유용할 수 있다(문헌[Abravaya et al. (1995) Nucl. Acids Res. 23:675-682] 참조). 이러한 방법은 대상체로부터 세포의 샘플을 수집하는 단계, 샘플의 세포로부터 핵산(예를 들어, 게놈, mRNA 또는 둘 다)을 단리하는 단계, 핵산 샘플을 바이오마커 유전자(존재한다면)의 혼성화 및 증폭이 발생하도록 하는 조건하에서 바이오마커 유전자에 특이적으로 혼성화하는 하나 이상의 프라이머와 접촉시키는 단계 및 증폭 산물의 존재 또는 부재를 검출하거나 또는 증폭 산물의 크기를 검출하는 단계 및 길이를 대조군 샘플과 비교하는 단계를 포함할 수 있다. PCR 및/또는 LCR은 본 명세서에 기재된 돌연변이를 검출하기 위해 사용되는 임의의 기법과 함께 예비 증폭 단계로서 사용하는 것이 바람직할 수 있을 것으로 예상된다.
대안적 증폭 방법은 자가-지속성 서열 복제(문헌[Guatelliet al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:1874-1878]), 전사 증폭 시스템(문헌[Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:1173-1177]), Q-베타 레플리케이스(문헌[Lizardi et al. (1988) Biotechnol. 6:1197]) 또는 임의의 다른 핵산 증폭 방법을 포함하며, 이어서 당업자에게 잘 알려진 기법을 사용하여 증폭된 분자를 검출한다. 이러한 검출 체계는 그러한 분자가 매우 적은 수로 존재하는 경우 핵산 분자의 검출에 특히 유용하다.
대안적 실시형태에서, 샘플 세포로부터의 바이오마커 핵산의 돌연변이는 제한 효소 절단 패턴의 변경에 의해 확인될 수 있다. 예를 들어, 샘플 및 대조군 DNA는 단리되고, 증폭되고(선택적으로), 하나 이상의 제한 엔도뉴클레이스로 분해되고, 단편 길이 크기는 겔 전기영동에 의해 결정되고 비교된다. 샘플과 대조군 DNA 간의 단편 길이 크기의 차이는 샘플 DNA의 돌연변이를 나타낸다. 또한, 서열 특이 적 리보자임(예를 들어, 미국 특허 제5,498,531호 참조)의 사용은 리보자임 절단 부위의 발달 또는 손실에 의해 특정 돌연변이의 존재에 대해 점수를 매기는데 사용될 수 있다.
다른 실시형태에서, 바이오마커 핵산의 유전적 돌연변이는 수백 또는 수천 개의 올리고뉴클레오타이드 프로브를 함유하는 고밀도 어레이에 샘플 및 대조군 핵산, 예를 들어, DNA 또는 RNA를 혼성화함으로써 확인될 수 있다(문헌[Cronin et al. (1996) Hum. Mutat. 7:244-255; Kozal et al. (1996) Nat. Med. 2:753-759]). 예를 들어, 바이오마커 유전적 돌연변이는 상기 문헌[Cronin et al. (1996)]에 기재된 바와 같은 광-생성된 DNA 프로브를 함유하는 2차원 어레이에서 확인될 수 있다. 간략하게는, 프로브의 제1 혼성화 어레이는 샘플에서 DNA의 긴 신전부(stretch)를 스캔하고, 순차적이며 겹치는 프로브의 선형 어레이를 만들어 서열 간의 염기 변화를 확인하도록 제어하는데 사용될 수 있다. 이러한 단계는 점 돌연변이를 확인할 수 있게 한다. 이러한 단계 이후에 검출된 모든 변이체 또는 돌연변이에 상보적인 더 작고 특수한 프로브 어레이를 사용하여 특정 돌연변이의 특성화를 허용하는 제2 혼성화 어레이가 이어진다. 각각의 돌연변이 어레이는 병렬 프로브 세트로 구성되며, 하나는 야생형 유전자에 상보적이고 다른 하나는 돌연변이 유전자에 상보적이다. 이러한 바이오마커 유전적 돌연변이는 예를 들어, 생식세포 및 체세포 돌연변이를 포함하는 다양한 맥락에서 확인될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 당업계에 공지된 임의의 다양한 시퀀싱 반응이 바이오마커 유전자를 직접 시퀀싱하고, 샘플 바이오마커의 서열을 상응하는 야생형(대조군) 서열과 비교함으로써 돌연변이를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 시퀀싱 반응의 예는 문헌[Maxam and Gilbert (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74:560 or Sanger (1977) Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 74:5463]에 의해 개발된 기법에 기반한 것들을 포함한다. 또한, 진단 검정을 수행할 때(문헌[Naeve (1995) Biotechniques 19:448-53]), 질량 분석법에 의한 시퀀싱을 포함하는 임의의 다양한 자동화된 시퀀싱 절차가 사용될 수 있는 것으로 상정된다(예를 들어, PCT 공개 WO 94/16101; 문헌[Cohen et al. (1996) Adv. Chromatogr. 36:127-162; 및 Griffin et al. (1993) Appl. Biochem. Biotechnol. 38:147-159] 참조).
바이오마커 유전자에서 돌연변이를 검출하기 위한 다른 방법은 RNA/RNA 또는 RNA/DNA 헤테로듀플렉스에서 불일치 염기를 검출하기 위해 사용되는 절단 작용제로부터 보호하는 방법이 사용된다(문헌[Myers et al. (1985) Science 230:1242]). 일반적으로, "불일치 절단"의 기법은 조직 샘플로부터 수득된 잠재적 돌연변이체 RNA 또는 DNA를 갖는 야생형 바이오마커 서열을 함유하는 (표지된) RNA 또는 DNA를 혼성화하여 형성된 헤테로듀플렉스를 제공함으로써 시작된다. 이중 가닥 듀플렉스는 대조 가닥과 샘플 가닥 사이의 염기쌍 불일치로 인해 존재할 수 있는 것과 같은 듀플렉스의 단일 가닥의 영역을 절단하는 작용제로 처리된다. 예를 들어, RNA/DNA 듀플렉스는 불일치된 영역을 효소적으로 분해하기 위해 RNase 및 SI 뉴클레이스로 처리된DNA/DNA 하이브리드로 처리될 수 있다. 다른 실시형태에서, DNA/DNA 또는 RNA/DNA 듀플렉스는 불일치된 영역을 분해하기 위해 하이드록실아민 또는 사산화오스뮴 및 피페리딘으로 처리될 수 있다. 불일치 영역의 분해 후, 생성된 물질은 그 후 돌연변이 부위를 결정하기 위해 변성 폴리아크릴아마이드 겔에서 크기별로 분리된다. 예를 들어, 문헌[Cotton et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:4397 및 Saleeba et al. (1992) Methods Enzymol. 217:286-295] 참조. 바람직한 실시형태에서, 대조군 DNA 또는 RNA는 검출을 위해 표지될 수 있다.
여전히 다른 실시형태에서, 불일치 절단 반응은 세포의 샘플로부터 수득된 바이오마커 cDNA에서 점 돌연변이를 검출하고 매핑하기 위해 정의된 시스템에서 이중 가닥 DNA(소위 "DNA 불일치 복구" 효소)에서의 불일치 염기쌍을 인식하는 하나 이상의 단백질을 사용한다. 예를 들어, 대장균의 mutY 효소는 G/A 불일치에서 A를 절단하고, HeLa 세포로부터의 티미딘 DNA 글리코실레이스는 G/T 불일치에서 T를 절단한다(문헌[Hsu et al. (1994) Carcinogenesis 15:1657-1662]). 예시적 실시형태에 따르면, 바이오마커 서열에 기초한 프로브, 예를 들어 DNA 불일치 복구 효소로 처리된 야생형 바이오마커 및 절단 생성물(존재하는 경우)은 전기영동 프로토콜 등으로부터 검출될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,459,039호).
다른 실시형태에서, 전기영동 이동성의 변경은 바이오마커 유전자에서 돌연변이를 확인하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 단일 가닥 형태 다형성(single strand conformation polymorphism: SSCP)은 돌연변이체와 야생형 핵산 간의 전기영동 이동성의 차이를 검출하는데 사용될 수 있다(문헌[Orita et al. (1989) Proc Natl. Acad. Sci U.S.A. 86:2766; Cotton (1993) Mutat. Res. 285:125-144; Hayashi (1992) Genet. Anal. Tech. Appl. 9:73-79]). 샘플 및 대조군 바이오마커 핵산의 단일 가닥 DNA 단편은 변성되고 재생될 수 있다. 단일-가닥 핵산의 2 차 구조는 서열에 따라 다르며, 결과적으로 전기영동 이동성이 변경되어 단일 염기 변화도 검출할 수 있다. DNA 단편은 표지된 프로브로 표지되거나 검출될 수 있다. 검정의 민감도는 (DNA보다는) RNA를 사용하여 향상될 수 있으며, 2차 구조는 서열 변화에 더 민감하다. 바람직한 실시형태에서, 본 방법은 전기영동 이동성의 변화에 기초하여 이중 가닥 헤테로듀플렉스 분자를 분리하기 위해 헤테로듀플렉스 분석을 사용한다(문헌[Keen et al. (1991) Trends Genet. 7:5]).
또 다른 실시형태에서, 변성제의 구배를 함유하는 폴리아크릴아마이드 겔에서 돌연변이체 또는 야생형 단편의 이동은 변성 구배 겔 전기영동(DGGE)을 사용하여 검정된다(문헌[Myers et al.(1985) Nature 313:495]). DGGE가 분석 방법으로 사용되는 경우, DNA는 예를 들어, PCR에 의해 약 40bp의 고-융점 GC-풍부 DNA의 GC 클램프를 추가함으로써 완전히 변성되지 않도록 변형될 것이다. 추가의 실시형태에서, 온도 구배는 대조군 및 샘플 DNA의 이동성 차이를 확인하기 위해 변성 구배 대신 사용된다(문헌[Rosenbaum and Reissner (1987) Biophys. Chem. 265:12753]).
점 돌연변이를 검출하기 위한 다른 기법의 예는 선택적 올리고뉴클레오타이드 혼성화, 선택적 증폭 또는 선택적 프라이머 연장을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 예를 들어, 알려진 돌연변이가 중앙에 배치된 후 완벽한 일치가 발견되는 경우에만 혼성화를 허용하는 조건하에서 표적 DNA에 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드 프라이머가 제조될 수 있다(문헌[Saiki et al. (1986) Nature 324:163; Saiki et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:6230]). 이러한 대립 유전자 특이적 올리고뉴클레오타이드는 올리고뉴클레오타이드가 혼성화 막에 부착되고 표지된 표적 DNA와 혼성화될 때, PCR 증폭된 표적 DNA 또는 다수의 상이한 돌연변이에 혼성화된다.
대안적으로, 선택적 PCR 증폭에 의존하는 대립 유전자 특이적 증폭 기술이 본 발명과 함께 사용될 수 있다. 특정 증폭을 위한 프라이머로 사용되는 올리고뉴클레오타이드는 (증폭이 차등 혼성화에 의존하도록) 분자의 중심(문헌[Gibbs et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:2437-2448]) 또는 적절한 조건하에서 불일치가 폴리머레이스 확장을 방지하거나 감소시킬 수 있는 한 프라이머의 3' 말단(문헌[Prossner (1993) Tibtech. 11:238])에서 관심있는 돌연변이를 운반할 수 있다. 또한, 절단- 기반 검출을 생성하기 위해 돌연변이 영역에 새로운 제한 부위를 도입하는 것이 바람직할 수 있다(문헌[Gasparini et al. (1992) Mol. Cell Probes 6:1]). 소정의 실시형태에서, 증폭은 또한 증폭을 위해 Taq 라이게이스를 사용하여 수행될 수 있다고 예상된다(문헌[Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 88:189]). 이러한 경우, 5' 서열의 3' 말단에 완벽하게 일치하는 경우에만 결찰이 발생하여 증폭의 존재 또는 부재를 찾아 특정 부위에서 알려진 돌연변이의 존재를 검출할 수 있다.
VI. 제형 및 약제학적 조성물을 포함하는, 조성물
본 발명에 포함되는 작용제를 포함하는 조성물은 제한 없이 상정된다. 예를 들어, 핵산-기반 조성물(예를 들어, 메신저 RNA(mRNA), cDNA, siRNA, 안티센스 핵산, 올리고뉴클레오타이드, 리보자임, DNA자임, 압타머, 핵산 유인물, 핵산 키메라, 삼중 나선 구조 등), 단백질-기반 조성물, 세포-기반 조성물뿐만 아니라 이들의 변이체, 변형 및 조작된 버전은 본 명세서에 기재된 방법에서뿐만 아니라 조성물 그 자체로 사용하기 위해 상정된다. 일부 실시형태에서, 각각 본 명세서에 기재된 서열로부터 선택된 센스 가닥 핵산 서열 및 안티센스 가닥 핵산 서열을 갖는 siRNA 분자뿐만 아니라 서열 변이체 및/또는 이의 화학적으로 변형된 버전은 본 발명에 포함되며, 위에 상세하게 기재되어 있다. 일부 실시형태에서, 조절된 염증성 표현형을 갖는 단핵구 및/또는 대식세포와 같은 세포는 본 명세서에 기재된 바와 같이 변형된다.
이러한 조성물은 약제학적 조성물 및/또는 제형 내에 포함될 수 있다. 이러한 조성물은 공지되거나 또는 이후 약리학 분야에서 개발되는 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 이러한 제조 방법은 활성 성분과 같은 작용제를 부형제 및/또는 하나 이상의 다른 보조 성분과 결합시키는 단계, 및 그 후 필요 및/또는 바람직하다면 목적하는 단일- 또는 다중-용량 단위로 분할, 성형 및/또는 패키징하는 단계를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "활성 성분"은 노출될 때 인간 또는 동물에서 생리학적 효과를 갖는 임의의 화학적 및 생물학적 물질을 지칭한다. 본 발명에 포함되는 맥락에서, 제형 내의 활성 성분은 본 발명에 포함되는 바이오마커(예를 들어, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적)를 조절하는 임의의 작용제일 수 있다.
1. 조성물 제조
본 발명에 따른 조성물은 단일 단위 용량 및/또는 복수의 단일 단위 용량으로 대량으로 제조, 패키징 및/또는 판매될 수 있다. 본 명세서에 사용되는, "단위 용량"은 미리 결정된 양의 활성 성분을 포함하는 약제학적 조성물의 별개의 양이다. 활성 성분의 양은 일반적으로 대상체에게 투여될 활성 성분의 용량 및/또는 그러한 용량의 편리한 분획, 예를 들어 이러한 용량의 1/2 또는 1/3과 동일하다.
용어 "약제학적으로 허용 가능한"은 합리적인 이익/위험비에 상응하는 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 기타 문제 또는 합병증없이 인간과 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 의학적 판단의 범위 내에 있는 작용제, 물질, 조성물 및/또는 투여 형태를 지칭한다.
본 발명에 포함되는 약제학적 조성물은 무수 약제학적 제형 및 투여 형태, 액체 약제학적 제형, 고체 약제학적 제형, 백신 등으로 제공될 수 있다. 적합한 액체 제제는 선택된 pH로 완충되는 등장성 수성 용액, 현탁액, 에멀션 또는 점성 조성물을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
아래에 더 상세히 기재되는 바와 같이, 본 발명에 포함되는 작용제 및 다른 조성물은 (1) 경구 투여, 예를 들어, 드렌치(수성 또는 비-수성 용액 또는 현탁액), 정제, 볼루스, 분말, 과립, 페이스트; (2) 예를 들어, 멸균 용액 또는 현탁액과 같은 예를 들어, 피하, 근육내 또는 정맥내 주사에 의한 비경구 투여; (3) 예를 들어, 피부에 적용되는(즉, 도포되는) 크림, 연고 또는 스프레이와 같은 국소 적용; (4) 예를 들어, 페서리, 크림 또는 폼과 같은 질내 또는 직장내; 또는 (5) 예를 들어, 화합물을 함유하는 수성 에어로졸, 리포솜 제제 또는 고체 입자와 같은 에어로졸과 같은 다양한 투여 경로에 적합한 것을 포함하는 고체 또는 액체 형태로 투여하기 위해 특별히 제형화될 수 있다. 정제, 캡슐, 액체 시럽, 연질 겔, 좌약 및 관장제와 같지만 이들로 제한되지 않는 본 명세서에 기재된 작용제 또는 조성물에 대한 임의의 적절한 형태 인자가 상정된다.
본 발명에 포함되는 약제학적 조성물은 개별 투여 형태, 예컨대 캡슐, 사셰 또는 정제, 또는 각각 미리 결정된 양의 활성 성분을 분말 또는 과립으로 함유하는 액체 또는 에어로졸 스프레이, 용액, 또는 수성 또는 비수성 액체 중 현탁액, 수중유 에멀션, 유중수 액상 에멀션, 재구성용 분말, 경구 섭취용 분말, 병(병에 들어있는 분말 또는 액체 포함), 경구 용해 필름, 로젠지, 페이스트, 튜브, 검 및 팩으로 제공될 수 있다. 이러한 투여 형태는 임의의 약학적 방법에 의해 제조될 수 있다.
정제는 선택적으로 하나 이상의 보조 성분으로 압축 또는 성형하여 제조될 수 있다. 압축된 정제는 결합제(예를 들어, 젤라틴 또는 하이드록시프로필메틸 셀룰로스), 윤활제, 불활성 희석제, 방부제, 붕해제(예를 들어, 소듐 전분 글리콜레이트 또는 가교결합된 소듐 카복시메틸 셀룰로스), 표면-활성제 또는 분산제를 사용하여 제조될 수 있다. 성형된 정제는 불활성 액체 희석제로 적신 분말화된 펩타이드 또는 펩타이도모방체의 혼합물을 적합한 기계에서 성형함으로써 제조될 수 있다.
정제, 및 당의정, 캡슐, 알약 및 과립과 같은 다른 고체 투여 형태는 선택적으로 스코어링되거나 또는 장용 코팅 및 제약 제제 분야에 잘 알려진 기타 코팅과 같은 코팅 및 쉘로 제조될 수 있다. 이들은 또한 예를 들어, 목적하는 방출 프로파일, 다른 중합체 매트릭스, 리포솜 및/또는 마이크로스피어를 제공하기 위해 다양한 비율로 예를 들어, 하이드록시프로필메틸 셀룰로스를 사용하여 활성 성분의 느린 또는 제어된 방출을 제공하도록 제형화될 수 있다. 이들은 또한 예를 들어, 박테리아 보유 필터를 통한 여과 또는 사용 직전에 멸균수 또는 일부 다른 멸균 주사용 매질에 용해될 수 있는 멸균 고체 조성물의 형태로 멸균제를 혼입시킴으로써 멸균될 수 있다. 이러한 조성물은 또한 선택적으로 불투명화제를 함유할 수 있으며, 활성 성분(들)만을 방출하거나, 우선적으로 위장관의 소정의 부분에서, 선택적으로 지연된 방식으로 방출하는 조성물일 수 있다. 사용될 수 있는 포매 조성물의 예는 중합체 물질 및 왁스를 포함한다. 활성 성분은 또한 적절한 경우 하나 이상의 부형제와 함께 마이크로캡슐화된 형태일 수 있다.
경구 투여를 위한 고체 투여 형태(캡슐, 정제, 알약, 당의정, 분말, 과립 등)에서, 활성 성분은 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 담체, 예컨대 소듐 시트레이트 또는 다이칼슘 포스페이트 및/또는 임의의 다음의 것과 혼합된다: (1) 전분, 락토스, 수크로스, 글루코스, 만니톨 및/또는 규산과 같은 충전제 또는 증량제; (2) 예를 들어, 카복시메틸셀룰로스, 알기네이트, 젤라틴, 폴리바이닐 피롤리돈, 수크로스 및/또는 아카시아와 같은 결합제; (3) 글리세롤과 같은 보습제; (4) 한천, 칼슘 카보네이트, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 소정의 실리케이트 및 소듐 카보네이트와 같은 붕해제; (5) 파라핀과 같은 용액 지연제; (6) 4차 암모늄 화합물과 같은 흡수 촉진제; (7) 예를 들어, 아세틸 알코올 및 글리세롤 모노스테아레이트와 같은 습윤제; (8) 카올린 및 벤토나이트 점토와 같은 흡수제; (9) 활석, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 고체 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 라우릴 설페이트 및 이들의 혼합물과 같은 윤활제; 및 (10) 착색제. 캡슐, 정제 및 알약의 경우, 약제학적 조성물은 또한 완충제를 포함할 수 있다. 유사한 유형의 고체 조성물은 락토스 또는 유당뿐만 아니라 고분자량 폴리에틸렌 글리콜 등과 같은 부형제를 사용하여 연질 및 경질 충전 젤라틴 캡슐의 충전제로서 사용될 수 있다.
경구 투여를위한 액체 투여 형태는 약제학적으로 허용 가능한 에멀션, 마이크로에멀션, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭서를 포함한다. 활성 성분에 더하여, 액체 투여 형태는 예를 들어, 물 또는 다른 용매, 가용화제 및 유화제, 예컨대 에틸 알코올, 아이소프로필 알코올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-뷰틸렌 글리콜, 오일(특히, 면실유, 땅콩유, 옥수수유, 배아유, 올리브유, 피마자유 및 참기름), 글리세롤, 테트라하이드로퓨릴 알코올, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스터 및 이들의 혼합물과 같은 당업계에서 일반적으로 사용되는 불활성 희석제를 함유할 수 있다. 불활성 희석제 이외에, 경구 조성물은 또한 습윤제, 유화제 및 현탁제, 감미제, 향미제, 착색제, 방향제 및 방부제와 같은 보조제를 포함한다. 활성제 이외에 현탁액은 예를 들어, 에톡실화된 아이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 및 소르비탄 에스터, 미세결정질 셀룰로스, 알루미늄 메타하이드록사이드, 벤토나이트, 한천 및 트래거캔스 및 이들의 혼합물과 같은 현탁제를 함유할 수 있다.
직장 또는 질 투여용 제형은 좌약으로 제공될 수 있으며, 이는 하나 이상의 작용제를 하나 이상의 적합한 비자극성 부형제 또는 예를 들어, 코코아 버터, 폴리에틸렌 글리콜, 좌약 왁스 또는 살리실레이트를 포함하는 담체와 혼합함으로써 제조될 수 있고, 이는 상온에서는 고체이지만 체온에서는 액체이므로 직장이나 질강에서 녹아 활성제를 방출한다.
질 투여에 적합한 제형은 또한 당업계에서 적절한 것으로 알려진 이러한 담체를 함유하는 페서리, 탐폰, 크림, 겔, 페이스트, 폼 또는 스프레이 제형을 포함한다.
바이오마커 발현 및/또는 활성을 조절(예를 들어, 저해)하는 작용제의 국소 또는 경피 투여를 위한 투여 형태는 분말, 스프레이, 연고, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 용액, 패치 및 흡입제를 포함한다. 활성 성분은 멸균 조건하에서 약제학적으로 허용 가능한 담체 및 필요할 수 있는 임의의 방부제, 완충액 또는 추진제와 혼합될 수 있다.
연고, 페이스트, 크림 및 겔은 작용제 이외에, 부형제, 예컨대 동물성 및 식물성 지방, 오일, 왁스, 파라핀, 전분, 트래거캔스, 셀룰로스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 규산, 활석 및 아연 옥사이드 또는 이들의 혼합물을 함유할 수 있다.
분말 및 스프레이는 바이오마커 발현 및/또는 활성을 조절(예를 들어, 저해)하는 작용제 외에도, 부형제, 예컨대 락토스, 활석, 규산, 알루미늄 하이드록사이드, 칼슘 실리케이트 및 폴리아마이드 분말 또는 이러한 물질의 혼합물을 함유할 수 있다. 스프레이는 클로로플루오로탄화수소와 같은 통상적인 추진제 및 뷰테인 및 프로페인과 같은 휘발성 비치환 탄화수소를 추가로 함유할 수 있다.
작용제는 에어로졸에 의해 투여될 수 있다. 이는 화합물을 함유하는 수성 에어로졸, 리포솜 제제 또는 고체 입자를 제조함으로써 달성된다. 비수성(예를 들어, 플루오로카본 추진제) 현탁액이 사용될 수 있다. 음파 분무기는 화합물의 분해를 초래할 수 있는 전단(shear)에 작용제가 노출되는 것을 최소화기 때문에 바람직하다.
일반적으로, 수성 에어로졸은 종래의 약제학적으로 허용 가능한 담체 및 안정화제와 함께 작용제의 수용액 또는 현탁액을 제형화함으로써 제조된다. 담체 및 안정화제는 특정 화합물의 요건에 따라 다르지만 일반적으로 비이온성 계면활성제(트윈, 플루로닉 또는 폴리에틸렌 글리콜), 혈청 알부민과 같은 무해한 단백질, 소르비탄 에스터, 올레산, 레시틴, 글리신과 같은 아미노산, 완충액, 염, 당 또는 당 알코올을 포함한다. 에어로졸은 일반적으로 등장성 용액으로 제조된다.
경피 패치는 신체에 작용제의 제어된 전달을 제공하는 추가 이점이 있다. 이러한 투여 형태는 적절한 매질에 작용제를 용해 또는 분산시킴으로써 제조될 수 있다. 흡수 강화제는 또한 피부를 통한 펩타이도모방체의 플럭스를 증가시키는데 사용될 수 있다. 이러한 플럭스의 속도는 속도 제어막을 제공하거나 중합체 매트릭스 또는 겔에 펩타이도모방체를 분산시킴으로써 제어될 수 있다.
안과용 제형, 눈 연고, 분말, 용액 등도 또한 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 상정된다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 약제학적 조성물은 비경구 투여 형태로 제형화된다. 비경구 제형은 담체 또는 부형제, 예컨대 염, 탄수화물 및 완충제(예를 들어, pH 3 내지 9)를 함유하는 수성 용액 또는 멸균 비-수성 용액 또는 멸균된, 발열원이 없는 물과 같은 적합한 비히클과 함께 사용될 수 있는 건조된 형태일 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 포함되는 치료제의 수성 용액은 mprises 등장성 식염수, 5% 글루코스 또는 예를 들어, 미국 특허 제7,910,594호에 개시된 것과 같은 기타 약제학적으로 허용 가능한 액체 담체, 예컨대 액체 알코올, 글리콜, 에스터 및 아마이드를 포함한다. 다른 예에서, 본 발명에 포함되는 치료제의 수성 용액은 PCT 공개 WO 2011/014821에 개시된 바와 같은 정맥내 투여를 위한 포스페이트 완충 제형(pH 7.4)을 포함한다. 비경구 투여 형태는 본 발명에 포함되는 치료제의 용량을 포함하는 재구성 가능한 동결 건조물의 형태일 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제4,713,249호; 제5,266,333호; 및 제5,417,982호에 기재된 생분해성 탄수화물 매트릭스와 같은 당업계에 공지된 임의의 연장 방출 투여 형태가 이용될 수 있거나, 또는 대안적으로, 느린 펌프(예를 들어, 삼투 펌프)가 사용될 수 있다. 예를 들어, 멸균 조건하에서 동결건조에 의한 멸균 조건하에서 비경구 제형의 제조는 당업자에게 잘 알려진 표준 약제학적 기법을 사용하여 쉽게 달성될 수 있다. 비경구 제형의 제조에 사용되는 본 발명에 포함되는 치료제의 용해도는 용해도 향상제의 혼입과 같은 적절한 제형 기법을 사용하여 증가될 수 있다. 비경구 투여용 제형은 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 멸균 등장성 수성 또는 비 수성 용액, 분산액, 현탁액 또는 에멀션, 또는 사용 직전에 멸균 주사용 용액 또는 분산액으로 재구성될 수 있는 멸균 분말과 조합된 하나 이상의 작용제를 포함할 수 있으며, 이는 항산화제, 완충액, 세균발육 저지제, 제형을 의도된 수여체의 혈액과 등장성으로 만드는 용질 등장성 또는 현탁제 또는 증점제를 함유할 수 있다.
이러한 조성물은 또한 방부제, 습윤제, 유화제 및 분산제와 같은 보조제를 함유할 수 있다. 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로뷰탄올, 페놀 소르브산 등을 포함시킴으로써 미생물 작용을 방지할 수 있다. 당, 소듐 클로라이드 등과 같은 등장성 작용제를 조성물에 포함시키는 것이 또한 바람직할 수 있다. 또한, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수를 지연시키는 작용제를 포함시킴으로써 주사 가능한 약제학적 형태의 흡수를 연장시킬 수 있다.
일부 경우에서, 약물의 효과를 연장하기 위해 피하 또는 근육내 주사로 약물의 흡수를 늦추는 것이 바람직하다. 이는 수용해도가 좋지 않은 결정질 또는 비정질 물질의 액체 현탁액을 사용함으로써 달성될 수 있다. 약물의 흡수 속도는 용해 속도에 따라 달라지며, 이는 결정 크기와 결정 형태에 따라 달라질 수 있다. 대안적으로, 비경구 투여된 약물 형태의 지연된 흡수는 약물을 오일 비히클에 용해시키거나 현탁시킴으로써 달성된다.
주사용 데포 형태는 폴리락타이드-폴리글리콜라이드와 같은 생분해성 중합체에서 바이오마커 발현 및/또는 활성을 조절(예를 들어, 저해)하는 작용제의 마이크로캡슐 매트릭스를 형성함으로써 제조된다. 약물 대 중합체의 비와 사용되는 특정 중합체의 특성에 따라 약물 방출 속도가 제어될 수 있다. 다른 생분해성 중합체의 예는 폴리(오르토에스터) 및 폴리(무수물)을 포함한다. 데포 주사용 제형은 또한 약물을 신체 조직과 상용성인 리포솜 또는 마이크로에멀션에 포획함으로써 제조될 수 있다.
본 발명에 포함되는 작용제가 약제로서 인간 및 동물에게 투여되는 경우, 이들은 그 자체로 또는 약제학적으로 허용 가능한 담체와 조합하여 예를 들어, 0.1% 내지 99.5%(더욱 바람직하게는, 0.5% 내지 90%)의 활성 성분을 함유하는 약제학적 조성물로서 제공될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물에서 활성 성분의 실제 투여량 수준은 대상체에게 독성이 없이 특정 대상체, 조성물 및 투여 방식에 대한 목적하는 치료 반응을 달성하는데 효과적인 활성 성분의 양을 얻기 위해 본 발명에 포함되는 방법에 의해 결정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 약제학적 조성물은 제어된 방출 및/또는 표적화된 전달을 위해 제형화될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 "제어된 방출"은 치료 결과에 영향을 미치기 위해 특정 방출 패턴을 따르는 약제학적 조성물 또는 화합물 방출 프로파일을 지칭한다. 일 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 조성물은 본 명세서에 기재되고/되거나 제어된 방출 및/또는 표적화된 전달을 위해 당업계에 공지된 전달제 내로 캡슐화될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "캡슐화하다"는 동봉하거나(enclose) 둘러싸거나(surround) 감싸는(encase) 것을 의미한다. 본 발명에 포함되는 제형과 관련하여, 캡슐화는 실질적, 완전적 또는 부분적일 수 있다. 용어 "실질적으로 캡슐화된"은 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9%, 99.9% 초과 또는 99.999% 초과의 본 발명에 포함되는 치료제가 입자 내에 동봉되거나, 둘러싸이거나 감싸질 수 있음을 의미한다. 용어 "부분적 캡슐화"는 10, 10, 20, 30, 40, 50 미만의 본 발명에 포함되는 접합체가 입자 내에 동봉되거나, 둘러싸이거나 감싸질 수 있음을 의미한다. 예를 들어, 적어도 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.9, 99.99 또는 99.99% 초과의 본 발명에 포함되는 약제학적 조성물 또는 화합물이 제형에 캡슐화된다.
일부 실시형태에서, 이러한 제형이 또한 구성될 수 있거나, 또는 조성물은 단핵구, 대식세포 및 다른 면역 세포(예를 들어, 수지상 세포, 항원 제시 세포, T 림프구, B 림프구 및 자연 살해 세포), 암 세포 등을 포함하지만 이로 제한되지 않는 생체내 상이한 세포 유형으로 수동적으로 또는 능동적으로 지시되도록 변경된다. 제형은 폴레이트, 트랜스페린, N-아세틸갈락토사민(N-acetylgalactosamine: GalNAc) 및 항체 표적화된 접근법에 의해 예시되지만 이들로 제한되지 않는 바와 같이 표면상의 상이한 리간드의 발현을 통해 선택적으로 표적화될 수 있다.
2. 부형제
본 발명에 포함되는 약제학적 조성물은 (1) 안정성을 증가시키고; (2) (예를 들어, 데포 제형으로부터) 지속 또는 지연 방출을 허용하며; (3) 체내 분포(예를 들어, 특정 조직 또는 세포 유형에 대한 작용제의 표적화)를 변경하고; (4) 생체내에서 작용제의 방출 프로파일을 변경하기 위해 하나 이상의 부형제를 사용하여 제형화될 수 있다. 부형제의 비-제한적 예는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 희석제 또는 다른 액체 비히클, 분산 또는 현탁 보조제, 표면 활성제, 등장성 작용제, 증점제 또는 유화제 및 방부제를 포함한다. 본 발명에 포함되는 부형제는 또한 제한 없이, 리피도이드, 리포솜, 지질 나노입자, 중합체, 리포플렉스, 코어-쉘 나노입자, 펩타이드, 단백질, 하이아루로니데이스, 나노입자 모의체 및 이들의 조합을 포함한다.
용어 "약제학적으로 허용 가능한 담체" 또는 "약제학적으로 허용 가능한 부형제"는 목적하는 특정 투여 형태에 적합하게 하는 것과 같은 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 희석제 또는 다른 액체 비히클, 분산 또는 현탁액 작용제, 표면 활성제, 등장성 작용제, 증점제 또는 유화제, 붕해제, 방부제, 완충제, 고체 결합제, 윤활제, 오일, 코팅, 항균제 및 항진균제, 흡수 지연제 등을 포함하는 것으로 의도된다. 문헌[Remington's The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro (Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006)]은 약제학적 조성물의 제형화에 사용되는 다양한 부형제 및 이의 제조를 위한 공지된 기술을 개시하고 있다. 임의의 바람직하지 않은 생물학적 효과를 생성하거나 그렇지 않으면 약제학적 조성물의 임의의 다른 성분(들)과 유해한 방식으로 상호작용함으로써 임의의 통상적인 부형제 매질이 물질 또는 이의 유도체와 양립할 수 없는 경우를 제외하고, 그 사용은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 상정된다. 보충 활성 성분이 또한 기재된 조성물에 혼입될 수 있다.
일부 실시형태에서, 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 적어도 99.9% 또는 100% 순수하다. 일부 실시형태에서, 부형제는 인간 및 수의학 용도로 승인된다. 일부 실시형태에서, 부형제는 미국 식품의약국에 의해 승인된다. 일부 실시형태에서, 부형제는 약제학적 등급이다. 일부 실시형태에서, 부형제는 미국 약전(USP), 유럽 약전(EP), 영국 약전 및/또는 국제 약전의 표준을 충족한다.
예시적 희석제는 칼슘 카보네이트, 소듐 카보네이트, 칼슘 포스페이트, 다이칼슘 포스페이트, 칼슘 설페이트, 칼슘 수소 포스페이트, 소듐 포스페이트 락토스, 수크로스, 셀룰로스, 미세결정질 셀룰로스, 카올린, 만니톨, 소르비톨, 이노시톨, 소듐 클로라이드, 건조 전분, 옥수수 전분, 분말화된 당 등 및/또는 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
예시적 과립화제 및/또는 분산제는 감자 전분, 옥수수 전분, 타피오카 전분, 소듐 전분 글리콜레이트, 점토, 알긴산, 구아 검, 시트러스 펄프, 아가, 벤토나이트, 셀룰로스 및 목재 제품, 천연의 스폰지, 양이온 교환 수지, 칼슘 카보네이트, 실리케이트, 소듐 카보네이트, 가교 폴리(바이닐-피롤리돈)(크로스포비돈), 소듐 카복시메틸 전분(소듐 전분 글리콜레이트), 카복시메틸 셀룰로스, 가교 소듐 카복시메틸 셀룰로스(크로스카멜로스), 메틸셀룰로스, 전호화 전분(전분 1500), 미세결정질 전분, 수불용성 전분, 칼슘 카복시메틸 셀룰로스, 마그네슘 알루미늄 실리케이트(VEEGUM®), 소듐 라우릴 설페이트, 4차 암모늄 화합물 등 및/또는 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
예시적 표면 활성제 및/또는 유화제는 천연의 유화제(예를 들어, 아카시아, 아가, 알긴산, 소듐 알기네이트, 트래거캔스, 콘드럭스, 콜레스테롤, 잔탄, 펙틴, 젤라틴, 난황, 카세인, 양모지, 콜레스테롤, 왁스 및 레시틴), 콜로이드성 점토(예를 들어, 벤토나이트[알루미늄 실리케이트] 및 VEEGUM®[마그네슘 알루미늄 실리케이트]), 긴 사슬 아미노산 유도체, 고분자량 알코올(예를 들어, 스테아릴 알코올, 세틸 알코올, 올레일 알코올, 트라이아세틴 모노스테아레이트, 에틸렌 글리콜 다이스테아레이트, 글리세릴 모노스테아레이트 및 프로필렌 글리콜 모노스테아레이트, 폴리바이닐 알코올), 카보머(예를 들어, 카복시 폴리메틸렌, 폴리아크릴산, 아크릴산 중합체 및 카복시바이닐 중합체), 카라기난, 셀룰로스 유도체(예를 들어, 카복시메틸셀룰로스 소듐, 분말화된 셀룰로스, 하이드록시메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필 셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스), 소르비탄 지방산 에스터(예를 들어, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트[TWEEN®20], 폴리옥시에틸렌 소르비탄[TWEEN®60], 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올리에이트[TWEEN®80], 소르비탄 모노팔미테이트[SPAN®40], 소르비탄 모노스테아레이트[SPAN®60], 소르비탄 트라이스테아레이트[SPAN®65], 글리세릴 모노올리에이트, 소르비탄 모노올리에이트[SPAN®80]), 폴리옥시에틸렌 에스터(예를 들어, 폴리옥시에틸렌 모노스테아레이트[MYRJ®45], 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유, 폴리에톡실화 피마자유, 폴리옥시메틸렌 스테아레이트 및 SOLUTOL®), 수크로스 지방산 에스터, 폴리에틸렌 글리콜 지방산 에스터(예를 들어, CREMOPHOR®), 폴리옥시에틸렌 에터(예를 들어, 폴리옥시에틸렌 라우릴 에터[BRIJ®30]), 폴리(바이닐-피롤리돈), 다이에틸렌 글리콜 모노라우레이트, 트라이에탄올아민 올리에이트, 소듐 올리에이트, 포타슘 올리에이트, 에틸 올리에이트, 올레산, 에틸 라우레이트, 소듐 라우릴 설페이트, PLUORINC®F 68, POLOXAMER®188, 세트리모늄 브로마이드, 세틸피리디늄 클로라이드, 벤잘코늄 클로라이드, 도큐세이트 소듐 등 및/또는 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
예시적 결합제는 전분(예를 들어, 옥수수 전분 및 전분 페이스트); 젤라틴; 당(예를 들어, 수크로스, 글루코스, 덱스트로스, 덱스트린, 당밀, 락토스, 락티톨, 만니톨,); 천연의 및 합성 검(예를 들어, 아카시아, 소듐 알기네이트, 아일랜드 이끼의 추출물, 판와 검, 가티 검, 이사폴 겉껍질의 점액, 카복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 에틸셀룰로스, 하이드록시에틸셀룰로스, 하이드록시프로필 셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 미세결정질 셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트, 폴리(바이닐-피롤리돈), 마그네슘 알루미늄 실리케이트(Veegum®) 및 낙엽송 아라비노갈락탄); 알기네이트; 폴리에틸렌 옥사이드; 폴리에틸렌 글리콜; 무기 칼슘 염; 규산; 폴리메타크릴레이트; 왁스; 물; 알코올; 등; 및 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
예시적 방부제는 항산화제, 킬레이트제, 항균 방부제, 항진균 방부제, 알코올 방부제, 산성 방부제 및/또는 다른 방부제를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 예시적 항산화제는 알파 토코페롤, 아스코르브산, 아스코빌 팔미테이트, 뷰틸화 하이드록시아니솔, 뷰틸화 하이드록시톨루엔, 모노티오글리세롤, 포타슘 메타바이설파이트, 프로피온산, 프로필 갈레이트, 소듐 아스코르베이트, 소듐 바이설파이트, 소듐 메타바이설파이트 및/또는 소듐 설파이트를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 예시적 킬레이트제는 에틸렌다이아민테트라아세트산(EDTA), 시트르산 모노하이드레이트, 다이소듐 에데테이트, 다이포타슘 에데테이트, 에데트산, 퓨마르산, 말산, 인산, 소듐 에데테이트, 타타르산 및/또는 트라이소듐 에데테이트를 포함한다. 예시적 항균 방부제는 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드, 벤질 알코올, 브로노폴, 세트라이마이드, 세틸피리디늄 클로라이드, 클로르헥시딘, 클로로뷰탄올, 클로로크레솔, 클로로자일렌올, 크레솔, 에틸 알코올, 글리세린, 헥세티딘, 이미드우레아, 페놀, 페녹시에탄올, 페닐에틸 알코올, 페닐머큐릭나이트레이트, 프로필렌 글리콜 및/또는 티메로살을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 예시적 항진균 방부제는 뷰틸 파라벤, 메틸 파라벤, 에틸 파라벤, 프로필 파라벤, 벤조산, 하이드록시벤조산, 포타슘 벤조에이트, 포타슘 소르베이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 프로피오네이트 및/또는 소르브산을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 예시적 알코올 방부제는 에탄올, 폴리에틸렌 글리콜, 페놀, 페놀성 화합물, 비스페놀, 클로로뷰탄올, 하이드록시벤조에이트 및/또는 페닐에틸 알코올을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 예시적 산성 방부제는 바이타민 A, 바이타민 C, 바이타민 E, 베타-카로틴, 시트르산, 아세트산, 데하이드로아세트산, 아스코르브산, 소르브산 및/또는 피트산을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 다른 방부제는 토코페롤, 토코페롤 아세테이트, 데테록심 메실레이트, 세트라이마이드, 뷰틸화 하이드록시아니솔(BHA), 뷰틸화 하이드록시톨루엔(BHT), 에틸렌다이아민, 소듐 라우릴 설페이트(SLS), 소듐 라우릴 에터 설페이트(SLES), 소듐 바이설파이트, 소듐 메타바이설파이트, 포타슘 설파이트, 포타슘 메타바이설파이트, GLYDANT PLUS®, PHENONIP®, 메틸파라벤, GERMALL®115, GERMABEN®II, NEOLONE™, KATHON™ 및/또는 EUXYL®을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
예시적 완충제는 시트레이트 완충액 용액, 아세테이트 완충액 용액, 포스페이트 완충액 용액, 암모늄클로라이드, 칼슘 카보네이트, 칼슘 클로라이드, 칼슘 시트레이트, 칼슘 글루비오네이트, 칼슘 글루셉테이트, 칼슘 글루코네이트, D-글루콘산, 칼슘 글리세로포스페이트, 칼슘 락테이트, 프로파논산, 칼슘 레불리네이트, 펜탄산, 이염기성 칼슘 포스페이트, 인산, 삼염기성 칼슘 포스페이트, 칼슘 하이드록사이드 포스페이트, 포타슘 아세테이트, 포타슘 클로라이드, 포타슘 글루코네이트, 포타슘 혼합물, 이염기성 포타슘 포스페이트, 일염기성 포타슘 포스페이트, 포타슘 포스페이트 혼합물, 소듐 아세테이트, 소듐 바이카보네이트, 소듐 클로라이드, 소듐 시트레이트, 소듐 락테이트, 이염기성 소듐 포스페이트, 일염기성 소듐 포스페이트, 소듐 포스페이트 혼합물, 트로메타민, 마그네슘 하이드록사이드, 알루미늄 하이드록사이드, 알긴산, 발열원이 없는 물, 등장성 식염수, 링거 용액, 에틸 알코올 등 및/또는 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
예시적 윤활제는 마그네슘 스테아레이트, 칼슘 스테아레이트, 스테아르산, 실리카, 활석, 엿기름, 글리세릴 베헤네이트, 수소화 식물성 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드, 류신, 마그네슘 라우릴 설페이트, 소듐 라우릴 설페이트 등 및 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
예시적 오일은 아몬드, 아프리코트 커넬, 아보카도, 바바수, 베르가못, 블랙 커런트씨, 보리지, 케이드, 캐모마일, 카놀라, 캐러웨이, 카나우바, 피마자, 시나몬, 코코아 버터, 코코넛, 대구 간, 커피, 옥수수, 목화씨, 에뮤, 유칼립투스, 달맞이꽃, 물고기, 아마씨, 제라니올, 박, 포도씨, 개암, 우슬초, 아이소프로필 미리스테이트, 호호바, 쿠쿠이 너트, 라반딘, 라벤더, 레몬, 릿치아 쿠베바, 마카데미아 너트, 아욱, 망고씨, 메도우폼씨, 밍크, 육두구, 올리브, 오렌지, 오렌지 러피, 야자, 야자 커넬, 복숭아 커넬, 땅콩, 양귀비씨, 호박씨, 유채, 쌀겨, 로즈마리, 홍화, 백단, 새스콰나, 세이보리, 산자나무, 참깨, 시어 버터, 실리콘, 대두, 해바라기, 티트리, 엉겅퀴, 동백, 베티버, 호두 및 밀 배아 오일을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 예시적 오일은 뷰틸 스테아레이트, 카프릴릭 트라이글리세라이드, 카프릭 트라이글리세라이드, 사이클로메티콘, 다이에틸 세바케이트, 다이메티콘 360, 아이소프로필 미리스테이트, 미네랄 오일, 옥틸도데칸올, 올레일 알코올, 실리콘 오일 및/또는 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
코코아 버터 및 좌약 왁스, 착색제, 코팅제, 감미제, 향미제 및/또는 방향제 작용제와 같은 부형제는 제조자의 판단에 따라 조성물에 존재할 수 있다.
약제학적 제형은 또한 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함할 수 있다. 용어 "약제학적으로 허용 가능한 염"은 당업계에 공지되어 있는 다양한 유기 및 무기 반대 이온으로부터 유래되는 염을 지칭한다 (예를 들어, 문헌[Berge et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19] 참조). 이러한 염은 작용제의 최종 단리 및 정제 동안 현장에서 제조되거나 또는 유리 염기 형태의 정제된 작용제를 적합한 유기 또는 무기산과 개별적으로 반응시키고 이렇게 형성된 염을 단리함으로써 제조될 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 산 부가염은 무기산 및 유기산으로 형성될 수 있다. 염이 유래될 수 있는 무기산은 예를 들어, 하이드로클로르산, 하이드로브롬산, 황산, 질산 및 인산을 포함한다. 염이 유래될 수 있는 유기산은 예를 들어, 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 옥살산, 말레산, 말론산, 석신산, 퓨마르산, 타타르산, 시트르산, 벤조산, 신남산, 만델산, 메테인설폰산, 에테인설폰산, p-톨루엔설폰산 및 살리실산을 포함한다. 약제학적으로 허용 가능한 염기 부가염은 무기 및 유기 염기로 형성될 수 있다. 염이 유래될 수 있는 무기 염기는 예를 들어, 소듐, 포타슘, 리튬, 암모늄, 칼슘, 마그네슘, 철, 아연, 구리, 망간 및 알루미늄을 포함한다. 염기 유래될 수 있는 유기 염기는 예를 들어, 일차, 이차 및 삼차 아민, 자연 발생적으로 치환된 아민을 포함하는 치환된 아민, 고리형 아민 및 염기성 이온 교환 수지를 포함한다. 특정 예는 아이소프로필아민, 트라이메틸아민, 다이에틸아민, 트라이에틸아민, 트라이프로필아민 및 에탄올아민을 포함한다. 일부 실시형태에서, 약제학적으로 허용 가능한 염기 부가염은 암모늄, 포타슘, 소듐, 칼슘 및 마그네슘 염으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 작용제는 하나 이상의 산성 작용기를 함유할 수 있고, 따라서 약제학적으로 허용 가능한 염기와 약제학적으로 허용 가능한 염을 형성할 수 있다. 이러한 예에서 용어 "약제학적으로 허용 가능한 염"은 바이오마커 발현을 조절(예를 들어, 저해)하는 작용제의 비교적 무독성의, 무기 및 유기 염기 부가염을 지칭한다. 이러한 염은 마찬가지로 작용제의 최종 단리 및 정제 동안 현장에서 제조되거나 또는 암모니아 또는 약제학적으로 허용 가능한 유기 일차, 이차 또는 삼차 아민과 함께 유리 산 형태의 정제된 작용제를 약제학적으로 허용 가능한 금속 양이온의 하이드록사이드, 카보네이트 또는 바이카보네이트와 같은 적합한 염기와 별도로 반응시켜 제조될 수 있다. 대표적인 알칼리 또는 알칼리성 토류염은 리튬, 소듐, 포타슘, 칼슘, 마그네슘 및 알루미늄 염 등을 포함한다. 염기 부가염의 형성에 유용한 대표적인 유기 아민은 에틸아민, 다이에틸아민, 에틸렌다이아민, 에탄올아민, 다이에탄올아민, 피페라진 등을 포함한다(예를 들어, 상기 문헌[Berge et al.] 참조).
용어 "공-결정"은 당업계에 공지되어 있는 다수의 공-결정 형성제로부터 유래되는 분자 복합체를 지칭한다. 염과 달리, 공-결정은 전형적으로 공-결정과 약물 사이의 수소 전달을 포함하지 않으며, 대신 공-결정 형성제와 결정 구조 내의 약물 사이의 분자간 수소 결합, 방향족 고리 스태킹 또는 분산력과 같은 분자간 상호작용을 포함한다.
본 발명에 포함되는 약제학적 조성물 및 투여 형태를 형성하는데 사용될 수 있는 예시적 계면활성제는 친수성 계면활성제, 친유성 계면활성제 및 이들의 혼합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 즉, 친수성 계면활성제의 혼합물이 사용될 수 있거나, 친유성 계면활성제의 혼합물이 사용될 수 있거나 또는 적어도 하나의 친수성 계면활성제와 적어도 하나의 친유성 계면활성제의 혼합물이 사용될 수 있다. 친수성 계면활성제는 이온성이거나 또는 비-이온성일 수 있다. 적합한 이온성 계면활성제는 알킬암모늄염; 푸시드산염; 아미노산, 올리고펩타이드 및 폴리펩타이드의 지방산 유도체; 아미노산, 올리고펩타이드 및 폴리펩타이드의 글리세라이드 유도체; 레시틴 및 수소화 레시틴; 라이소레시틴 및 수소화 라이소레시틴; 포스포리피드 및 이의 유도체; 라이소포스포리피드 및 이의 유도체; 카르니틴 지방산 에스터염; 알킬설페이트의 염; 지방산염; 소듐 도큐세이트; 아실악틸레이트; 모노- 및 다이-글리세라이드의 모노- 및 다이-아세틸화된 타타르산 에스터; 석시닐화된 모노- 및 다이-글리세라이드; 모노- 및 다이-글리세라이드의 시트르산 에스터; 및 이들의 혼합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 이온성 계면활성제는 예로서: 레시틴, 라이소레시틴, 포스포리피드, 라이소포스포리피드 및 이들의 유도체; 카르니틴 지방산 에스터염; 알킬설페이트의 염; 지방산염; 소듐 도큐세이트; 아실악틸레이트; 모노- 및 다이-글리세라이드의 모노- 및 다이-아세틸화된 타타르산 에스터; 석시닐화된 모노- 및 다이- 글리세라이드; 모노- 및 다이-글리세라이드의 시트르산 에스터; 및 이들의 혼합물을 포함할 수 있다.
이온성 계면활성제는 레시틴, 라이소레시틴, 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜글리세롤, 포스파티드산, 포스파티딜세린, 라이소포스파티딜콜린, 라이소포스파티딜에탄올아민, 라이소포스파티딜글리세롤, 라이소포스파티드산, 라이소포스파티딜세린, PEG-포스파티딜에탄올아민, PVP-포스파티딜에탄올아민, 지방산의 락틸릭 에스터, 스테아로일-2-락틸레이트, 스테아로일 락틸레이트, 석시닐화된 모노글리세라이드, 모노/다이글리세라이드의 모노/다이아세틸화된 타타르산 에스터, 모노/다이글리세라이드의 시트르산 에스터, 코릴사코신, 카프로에이트, 카프릴레이트, 카프레이트, 라우레이트, 미리스테이트, 팔미테이트, 올리에이트, 리신올리에이트, 리놀리에이트, 리놀렌에이트, 스테아레이트, 라우릴 설페이트, 테라세실 설페이트, 도큐세이트, 라우로일 카르니틴, 팔미토일 카르니틴, 미리스토일 카르니틴 및 염 및 이들의 혼합물의 이온화된 형태일 수 있다.
친수성 비-이온성 계면활성제는 알킬글루코사이드; 알킬말토사이드; 알킬티오글루코사이드; 라우릴 마크로골글리세라이드; 폴리옥시알킬렌 알킬 에터, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 알킬 에터; 폴리옥시알킬렌 알킬페놀, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 알킬 페놀; 폴리옥시알킬렌 알킬 페놀 지방산 에스터, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 지방산 모노에스터 및 폴리에틸렌 글리콜 지방산 다이에스터; 폴리에틸렌 글리콜 글리세롤 지방산 에스터; 폴리글리세롤 지방산 에스터; 폴리옥시알킬렌 소르비탄 지방산 에스터, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 소르비탄 지방산 에스터; 글리세라이드, 식물성 오일, 수소화 식물성 오일, 지방산 및 스테롤로 이루어진 군의 적어도 하나의 구성원과 폴리올의 친수성 에스터교환 생성물; 폴리옥시에틸렌 스테롤, 유도체 및 이의 유사체; 폴리옥시에틸화된 바이타민 및 이의 유도체; 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체; 및 이들의 혼합물; 폴리에틸렌 글리콜 소르비탄 지방산 에스터, 및 트라이글리세라이드, 식물성 오일 및 수소화 식물성 오일로 이루어진 군의 적어도 하나의 구성원과 폴리올의 친수성 에스터교환 생성물을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 폴리올은 글리세롤, 에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 소르비톨, 프로필렌 글리콜, 펜타에리트리톨 또는 당류일 수 있다.
다른 친수성-비-이온성 계면활성제는 제한 없이, PEG-10 라우레이트, PEG-12 라우레이트, PEG-20 라우레이트, PEG-32 라우레이트, PEG-32 다이라우레이트, PEG-12 올리에이트, PEG-15 올리에이트, PEG-20 올리에이트, PEG-20 다이올리에이트, PEG-32 올리에이트, PEG-200 올리에이트, PEG-400 올리에이트, PEG-15 스테아레이트, PEG-32 다이스테아레이트, PEG-40 스테아레이트, PEG-100 스테아레이트, PEG-20 다이라우레이트, PEG-25 글리세릴 트라이올리에이트, PEG-32 다이올리에이트, PEG-20 글리세릴 라우레이트, PEG-30 글리세릴 라우레이트, PEG-20 글리세릴 스테아레이트, PEG-20 글리세릴 올리에이트, PEG-30 글리세릴 올리에이트, PEG-30 글리세릴 라우레이트, PEG-40 글리세릴 라우레이트, PEG-40 팜커넬유, PEG-50 경화 피마자유, PEG-40 피마자유, PEG-35 피마자유, PEG-60 피마자유, PEG-40 경화 피마자유, PEG-60 경화 피마자유, PEG-60 옥수수유, PEG-6 카프레이트/카프릴레이트 글리세라이드, PEG-8 카프레이트/카프릴레이트 글리세라이드, 폴리글리세릴-10 라우레이트, PEG-30 콜레스테롤, PEG-25 파이토 스테롤, PEG-30 소야 스테롤, PEG-20 트라이올리에이트, PEG-40 소르비탄 올리에이트, PEG-80 소르비탄 라우레이트, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, POE-9 라우릴 에터, POE-23 라우릴 에터, POE-10 올레일 에터, POE-20 올레일 에터, POE-20 스테아릴 에터, 토코페릴 PEG-100 석시네이트, PEG-24 콜레스테롤, 폴리글리세릴-10올리에이트, 트윈 40, 트윈 60, 수크로스 모노스테아레이트, 수크로스 모노라우레이트, 수크로스 모노팔미테이트, PEG 10-100 노닐 페놀 시리즈, PEG 15-100 옥틸 페놀 시리즈 및 폴록사머를 포함한다.
적합한 친유성 계면활성제는 지방 알코올; 글리세롤 지방산 에스터; 아세틸화된 글리세롤 지방산 에스터; 저급 알코올 지방산 에스터; 프로필렌 글리콜 지방산 에스터; 소르비탄 지방산 에스터; 폴리에틸렌 글리콜 소르비탄 지방산 에스터; 스테롤 및 스테롤 유도체; 폴리옥시에틸화된 스테롤 및 스테롤 유도체; 폴리에틸렌 글리콜 알킬 에터; 당 에스터; 당 에터; 모노- 및 다이-글리세라이드의 락트산 유도체; 글리세라이드, 식물성 오일, 수소화 식물성 오일, 지방산 및 스테롤로 이루어진 군의 적어도 하나의 구성원과 폴리올의 소수성 에스터교환 생성물; 유용성(oil-soluble) 바이타민/바이타민 유도체; 및 이들의 혼합물을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 이러한 그룹 내에서, 바람직한 친유성 계면활성제는 글리세롤 지방산 에스터, 프로필렌 글리콜 지방산 에스터 및 이들의 혼합물을 포함하거나, 또는 식물성 오일, 수소화 식물성 오일 및 트라이글리세라이드로 이루어진 군의 적어도 하나의 구성원의 폴리올의 소수성 에스터교환 생성물이다.
본 발명에 포함되는 작용제(예를 들어, 화학적 화합물)의 우수한 가용화 및/또는 용해를 보장하고, 본 발명에 포함되는 약물 양식의 침전을 최소화하기 위해 가용화제가 본 제형에 포함될 수 있다. 이는 주사용 조성물과 같은 비-경구용 조성물에 특히 중요할 수 있다. 가용화제는 또한 친수성 약물 및/또는 계면활성제와 같은 다른 성분의 용해도를 증가시키거나 또는 조성물을 안정하거나 균질한 용액 또는 분산으로 유지하기 위해 첨가될 수 있다. 적합한 가용화제의 예는 다음의 알코올 및 폴리올, 예컨대 에탄올, 아이소프로판올, 뷰탄올, 벤질 알코올, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 뷰테인다이올 및 이의 이성질체, 글리세롤, 펜타에리트리톨, 소르비톨, 만니톨, 트랜스큐톨, 다이메틸 아이소소바이드, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리바이닐알코올, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스 및 다른 셀룰로스 유도체, 사이클로덱스트린 및 사이클로덱스트린 유도체; 평균 분자량이 약 200 내지 약 6000인 폴리에틸렌 글리콜의 에터, 예컨대 테트라하이드로퍼퓨릴알코올 PEG 에터(글리코퓨롤) 또는 메톡시 PEG; 아마이드 및 다른 질소-함유 화합물, 예컨대 2-피롤리돈, 2-피페리돈,
Figure pct00121
-카프로락탐, N-알킬피롤리돈, N-하이드록시알킬피롤리돈, N-알킬피페리돈, N-알킬카프로락탐, 다이메틸아세트아마이드 및 폴리바이닐피롤리돈; 에스터, 예컨대, 에틸 프로피오네이트, 트라이뷰틸시트레이트, 아세틸 트라이에틸시트레이트, 아세틸 트라이뷰틸 시트레이트, 트라이에틸시트레이트, 에틸 올리에이트, 에틸 카프릴레이트, 에틸 뷰티레이트, 트라이아세틴, 프로필렌 글리콜 모노아세테이트, 프로필렌 글리콜 다이아세테이트, 엡실론-카프로락톤 및 이의 이성질체,
Figure pct00122
-발레로락톤 및 이의 이성질체,
Figure pct00123
-뷰티로락톤 및 이의 이성질체; 및 당업계에 공지된 다른 가용화제, 예컨대 다이메틸 아세트아마이드, 다이메틸 아이소소바이드, N-메틸 피롤리돈, 모노옥타노인, 다이에틸렌 글리콜 모노에틸 에터 및 물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
가용화제의 혼합물이 또한 사용될 수 있다. 예는 트라이아세틴, 트라이에틸시트레이트, 에틸 올리에이트, 에틸 카프릴레이트, 다이메틸아세트아마이드, N-메틸피롤리돈, N-하이드록시에틸피롤리돈, 폴리바이닐피롤리돈, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 하이드록시프로필 사이클로덱스트린, 에탄올, 폴리에틸렌 글리콜 200-100, 글리코퓨롤, 트랜스큐톨, 프로필렌 글리콜 및 다이메틸 아이소소바이드를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 특히 바람직한 가용화제는 소르비톨, 글리세롤, 트라이아세틴, 에틸 알코올, PEG-400, 글리코퓨롤 및 프로필렌 글리콜을 포함한다.
약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 필요에 따라 제형에 포함될 수 있다. 이러한 첨가제 및 부형제는 제한 없이, 탈점착제(detackifier), 항소포제, 완충제, 중합체, 항산화제, 방부제, 킬레이트제, 점성 조절제, 긴장제, 향미제, 착색제, 착취제, 불투명화제, 현탁제, 결합제, 충전제, 가소제, 윤활제 및 이들의 혼합물을 포함한다.
또한, 산 또는 염기는 가공을 용이하게 하고 안정성을 향상시키기 위해 또는 다른 이유로 조성물에 혼입될 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 염기의 예는 아미노산, 아미노산 에스터, 암모늄하이드록사이드, 포타슘 하이드록사이드, 소듐 하이드록사이드, 소듐 수소 카보네이트, 알루미늄 하이드록사이드, 칼슘 카보네이트, 마그네슘 하이드록사이드, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 합성 알루미늄 실리케이트, 합성 하이드로칼사이트, 마그네슘 알루미늄 하이드록사이드, 다이아이소프로필에틸아민, 에탄올아민, 에틸렌다이아민, 트라이에탄올아민, 트라이에틸아민, 트라이아이소프로판올아민, 트라이메틸아민, 트리스(하이드록시메틸)아미노메테인(TRIS) 등을 포함한다. 또한, 아세트산, 아크릴산, 아디프산, 알긴산, 알케인설폰산, 아미노산, 아스코르브산, 벤조산, 붕산, 뷰티르산, 탄산, 시트르산, 지방산, 폼산, 퓨마르산, 글루콘산, 하이드로퀴노설폰산, 아이소아스코르브산, 락트산, 말레산, 옥살산, 파라-브로모페닐설폰산, 프로피온산, p-톨루엔설폰산, 살리실산, 스테아르산, 석신산, 타닌산, 타타르산, 티오글리콜산, 톨루엔설폰산, 요산 등과 같은 약제학적으로 허용 가능한 산의 염인 염기도 적합하다. 다양성자산의 염, 예컨대 소듐 포스페이트, 다이소듐 수소 포스페이트 및 소듐 다이하이드로겐 포스페이트가 또한 사용될 수 있다. 염기가 염인 경우, 양이온은 암모늄, 알칼리 금속 및 알칼리 토금속과 같은 임의의 편리하고 약제학적으로 허용 가능한 양이온일 수 있다. 예는 소듐, 포타슘, 리튬, 마그네슘, 칼슘 및 암모늄을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
적합한 산은 약제학적으로 허용 가능한 유기산 또는 무기산이다. 적합한 무기산의 예는 하이드로클로르산, 하이드로브롬산, 하이드리오드산, 황산, 질산, 붕산, 인산 등을 포함한다. 적합한 유기산의 예는 아세트산, 아크릴산, 아디프산, 알긴산, 알케인설폰산, 아미노산, 아스코르브산, 벤조산, 붕산, 뷰티르산, 탄산, 시트르산, 지방산, 폼산, 퓨마르산, 글루콘산, 하이드로퀴노설폰산, 아이소아스코르브산, 락트산, 말레산, 메테인설폰산, 옥살산, 파라-브로모페닐설폰산, 프로피온산, p-톨루엔설폰산, 살리실산, 스테아르산, 석신산, 타닌산, 타타르산, 티오글리콜산, 톨루엔설폰산 및 요산을 포함한다.
3. 지질-기반 제형
일부 실시형태에서, 지질-기반 제형이 사용된다. 따라서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 조성물 및 하나 이상의 지질을 포함하는 지질-기반 제형이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 지질은 지질 입자 또는 양친매성 화합물이다. 지질은 생리학적 pH에서 중성, 음이온성 또는 양이온성일 수 있다.
적합한 고체 지질은 고급 포화 알코올, 고급 지방산, 스핑고리피드, 합성 에스터 및 고급 포화 지방산의 모노-, 다이- 및 트라이글리세라이드를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 고체 지질은 10 내지 40개, 바람직하게는 12 내지 30개의 탄소 원자를 갖는 지방족 알코올, 예컨대 세토스테아릴 알코올을 포함할 수 있다. 고체 지질은 10 내지 40개, 바람직하게는 12 내지 30개의 탄소 원자의 고급 지방산, 예컨대 스테아르산, 팔미트산, 데카논산 및 베헨산을 포함할 수 있다. 고체 지질은 10 내지 40개, 바람직하게는 12 내지 30개의 탄소 원자를 갖는 고급 포화 지방산의 모노글리세라이드, 다이글리세라이드 및 트라이글리세라이드를 포함하는 글리세라이드, 예컨대 글리세릴 모노스테아레이트, 글리세롤 베헤네이트, 글리세롤 팔미토스테아레이트, 글리세롤 트라이라우레이트, 트라이카프린, 트라이라우린, 트라이미리스틴, 트라이팔미틴, 트라이스테아린 및 경화 피마자유를 포함할 수 있다. 적합한 고체 지질은 세틸 팔미테이트, 밀랍 또는 사이클로덱스트린을 포함할 수 있다.
양친매성 화합물은 0.01 내지 60(지질 중량/중합체 중량)의 비, 예를 들어 0.1 내지 30(지질 중량/중합체 중량)의 비로 혼입되는 포스포리피드, 예컨대 1,2 다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE), 다이팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 다이스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 다이아라키도일포스파티딜콜린(DAPC), 다이베헤노일포스파티딜콜린(DBPC), 다이트라이코사노일포스파티딜콜린(DTPC) 및 다이리그노세로일파티딜콜린(DLPC)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 사용될 수 있는 포스포리피드는 포스파티드산, 포화 및 불포화 리피드를 모두 갖는 포스파티딜 콜린, 포스파티딜 에탄올아민, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 라이소포스파티딜 유도체, 카디오리핀 및 β-아실-y-알킬 포스포리피드를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 포스포리피드의 예는 포스파티딜콜린, 예컨대 다이올레오일포스파티딜콜린, 다이미리스토일포스파티딜콜린, 다이펜타데카노일포스파티딜콜린 다이라우로일포스파티딜콜린, 다이팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 다이스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 다이아라키도일포스파티딜콜린(DAPC), 다이베헤노일포스파티딜콜린(DBPC), 다이트라이코사노일포스파티딜콜린(DTPC), 다이리그노세로일파티딜콜린(DLPC); 및 포스파티딜에탄올아민, 예컨대 다이올레오일포스파티딜에탄올아민 또는 1-헥사데실-2-팔미토일글리세로포스포에탄올아민을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 비대칭 아실 사슬을 갖는 합성 포스포리피드(예를 들어, 6개의 탄소의 하나의 아실 사슬 및 12개의 탄소의 또 다른 아실 사슬을 가짐)가 또한 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 지질-기반 입자가 사용된다. 용어 "지질 입자"는 리포솜, 지질 마이셀, 고체 지질 입자, 리포플렉스, 지질 나노입자(LNP) 또는 상이한 생체적합성 지질, 예를 들어 적어도 하나 이상의 양이온성 지질 및/또는 하나 이상의 중성 지질 및/또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-지질 중 하나 또는 이들의 혼합물로 구성된 지질-안정화된 중합체성 입자를 지칭한다.
입자는 지질 마이셀일 수 있다. 지질 마이셀은 예를 들어, 지질 계면활성제를 사용하여 유중수 에멀션으로 형성될 수 있다. 에멀션은 분산된 액적을 안정화시키기 위해 계면활성제가 첨가되는 2개의 비혼화 상(immiscible phase)의 혼합물(blend)이다. 일부 실시형태에서, 지질 마이셀은 마이크로에멀션이다. 마이크로에멀션은 적어도 물, 오일 및 지질 계면활성제로 구성된 투명성을 생성하는 열역학적 안정한 시스템이며, 액적 크기가 1 마이크론 미만, 약 10㎚ 내지 약 500㎚, 또는 약 10㎚ 내지 250㎚인 열역학적으로 안정한 시스템이다. 지질 마이셀은 일반적으로 소수성 치료제, 소수성 예방 작용제 또는 소수성 진단 작용제를 포함하는 소수성 활성제를 캡슐화하는데 유용하다.
입자는 고체 지질 입자일 수 있다. 고체 지질 입자는 콜로이드성 마이셀 및 리포솜에 대한 대안을 제공한다. 고체 지질 입자는 전형적으로 서브마이크론 크기, 즉 약 10㎚ 내지 약 1마이크론, 10㎚ 내지 약 500㎚, 또는 10㎚ 내지 약 250㎚이다. 고체 지질 입자는 실온에서 고체인 지질로 형성된다. 액체 오일을 고체 지질로 대체함으로써 수중유 에멀션이 얻어진다.
입자는 리포솜일 수 있다. 리포솜은 구형의 이중층으로 배열된 지질로 둘러싸인 수성 매질로 구성된 작은 소포이다. 리포솜은 작은 단층 소포, 큰 단층 소포 또는 다층 소포로 분류될 수 있다. 다층 리포솜은 다중 동심 지질 이중충을 함유한다. 리포솜은 친수성 작용제를 수성 내부 또는 이중층 사이에 가두거나 또는 소수성 작용제를 이중층 내에 가둠으로써 작용제를 캡슐화하는데 사용될 수 있다.
지질 마이셀 및 리포솜은 전형적으로 수성 중심을 갖는다. 수성 중심은 물 또는 물과 알코올의 혼합물을 함유할 수 있다. 적합한 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, (예컨대, 아이소프로판올), 뷰탄올(예컨대, n-뷰탄올, 아이소뷰탄올, sec-뷰탄올, tert-뷰탄올, 펜탄올(예컨대, 아밀 알코올, 아이소뷰틸 카빈올), 헥산올(예컨대, 1-헥산올, 2-헥산올, 3-헥산올), 헵탄올(예컨대, 1-헵탄올, 2-헵탄올, 3-헵탄올 및 4-헵탄올) 또는 옥탄올(예컨대, 1-옥탄올) 또는 이들의 조합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
리포솜은 주로 지질 이중층으로 구성될 수 있는 인공적으로 제조된 소포이며, 영양소 및 약제학적 제형의 투여를 위한 전달 비히클로서 사용될 수 있다. 리포솜은 직경이 수백 나노미터일 수 있으며 좁은 수성 구획에 의해 분리된 일련의 동심 이중층을 포함할 수 있는 다층 소포(multilamellar vesicle: MLV), 직경이 50㎚보다 작을 수 있는 작은 단세포 소포(small unicellular vesicle: SUV) 및 직경이 50㎚ 내지 500㎚일 수 있는 큰 단층 소포(large unilamellar vesicle: LUV)와 같이 크기가 다를 수 있지만 이들로 제한되지 않는다. 리포솜 설계는 건강하지 않은 조직에 대한 리포솜의 부착을 개선하거나 세포내 이입과 같지만 이로 제한되지 않는 이벤트를 활성화하기 위해 옵소닌 또는 리간드를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 리포솜은 약제학적 제형의 전달을 개선하기 위해 낮거나 높은 pH를 포함할 수 있다.
리포솜의 형성은 포획된 약제학적 제형 및 리포솜 성분, 지질 소포가 분산된 매질의 특성, 포획된 물질의 유효 농도 및 이의 잠재적인 독성, 소포의 적용 및/또는 전달 동안 관련되는 모든 추가적인 가공, 의도된 적용을 위한 소포의 최적화 크기, 다분산성 및 저장 수명, 배취간(batch-to-batch) 재현성 및 안전하고 효율적인 리포솜 제품의 대규모 생산 가능성과 같지만 이들로 제한되지 않는 물리화학적 특성에 따라 달라질 수 있다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 제한 없이, 예컨대 1,2-다이올레일옥시-N,N-다이메틸아미노프로페인(DODMA) 리포솜으로부터 형성된 것과 같은 리포솜, 마리나 바이오테크(Marina Biotech)(워싱턴주 보셀)의 DiLa2 리포솜, 1,2-다이리놀레일옥시-3-다이메틸아미노프로페인(DLin-DMA), 2,2-다이리놀레일-4-(2-다이메틸아미노에틸)-[1,3]-다이옥솔레인(DLin-KC2-DMA) 및 MC3(예를 들어, 미국 공개 제2010/0324120호에 기재된 것)을 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 조성물은 지질-다양이온 복합체로 제형화될 수 있다. 지질-다양이온 복합체의 형성은 당업계에 공지된 방법 및/또는 미국 공개 제2012/0178702호에 기재된 것에 의해 달성될 수 있다. 비-제한적 예로서, 다양이온은 폴리라이신, 폴리오르니틴 및/또는 폴리아르기닌 및 PCT 공개 WO 2012/013326에 기재된 양이온성 펩타이드와 같지만 이들로 제한되지 않는 양이온성 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 조성물은 콜레스테롤 또는 다이올레오일 포스파티딜에탄올아민(DOPE)과 같지만 이들로 제한되지 않는 중성 지질를 더 포함할 수 있는 지질-다양이온 복합체로 제형화될 수 있다. 리포솜 제형은 양이온성 지질 성분의 선택, 양이온성 지질 포화도, 페길화의 특성, 모든 성분의 비 및 크기와 같은 생물물리학적 매개변수에 의해 영향을 받을 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 지질 입자는 지질 나노입자(lipid nanoparticle: LNP)이다. 용어 "지질 나노입자(LNP)"는 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 지질 성분을 포함하는 서브마이크론 범위의 지질-기반 입자를 지칭한다. LNP는 리포솜의 구조적 특성을 갖고/갖거나 대안적 비-이중충 유형의 구조를 가질 수 있으며, 이는 예를 들어, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 바이오마커(예를 들어, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적)으로부터 전사된 mRNA의 핵산 서열에 상보적인 siRNA 분자를 포함하여 핵산 기반 약물을 전신으로 전달하는데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, LNP 제형은 하나 이상의 양이온성 지질을 포함한다. 양이온성 지질은 임의의 생리학적 pH에서 네트(net) 양전하를 띠는 지질이다. 소정의 특정 실시형태에서, LNP는 본 명세서에 기재된 바와 같은 리피도이드를 포함한다. 양전하는 siRNA 분자와 같은 음으로 하전된 치료제와의 결합에 유용하다.
소정의 실시형태에서, 지질 나노입자는 하나 이상의 지질 및 본 명세서에 기재된 바와 같은 조성물을 포함한다. 소정의 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 조성물은 지질 나노입자 내에 캡슐화된다.
일부 실시형태에서, LNP의 크기 및 전하 비율 및 기타 물리적 특성(예를 들어, 막 유동성)은 증가된 세포 형질감염 및 전달을 위해 최적화된다.
지질 또는 리피도이드 입자는 예를 들어, 양이온성 지질, 중성 지질, 아미노산- 또는 펩타이드-기반 지질, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-지질, 예를 들어, PEG 사슬을 갖는 지질, 예컨대 수소 첨가 대두 포스파티딜콜린(HSPC), 콜레스테롤(CHE), 1,2-다이스테아로일-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(PEG)-2000](DSPE-PEG2000), 사슬 1, 2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[maleimide(PEG)-2000]의 사슬의 먼 말단에서 말레이미드기로 변형된 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(PEG)-2000], DSPE-PEG2000-MAL, 1,2-다이미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-550](DMPE-PEG550), 1,2-다이올레오일-l-3-트라이메틸암모늄프로페인(DOTAP) 및 글리세롤 골격을 갖는 것들, 예를 들어 DMG-PEG, DSG-PEG(DMG-PEG2000) 등을 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용되는, 리포솜 수성 내부를 감싸는 지질-함유 막을 포함하는 구조이다. 예를 들어, 지질-기반 제형은 본 발명의 핵산 작용제, 예를 들어 siRNA, miRNA, 올리고뉴클레오타이드, 변형된 mRNA 및 다른 유형의 핵산 분자를 전달하는데 사용될 수 있다.
적합한 중성 및 음이온성 지질은 스테롤 및 지질, 예컨대 콜레스테롤, 포스포리피드, 라이소리피드, 라이소포스포리피드, 스핑고리피드 또는 페길화된 리피드를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 중성 및 음이온성 지질은 1,2-다이아실-글리세로-3-포스포콜린을 포함하는 포스파티딜콜린(PC)(예컨대, 난 PC, 대두 PC); 포스파티딜세린(PS), 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨(PI); 글리코리피드; 스핑고포스포리피드, 예컨대 스핑고마이엘린 및 스핑고글리코리피드(1-세라미딜 글루코사이드로도 알려져 있음), 예컨대 세라마이드 갈락토피라노사이드, 강글리오사이드 및 세레브로사이드; 카복실산기를 함유하는 지방산, 스테롤, 예를 들어 콜레스테롤; 1,2-다이올레일포스포에탄올아민(DOPE), 1,2-다이헥사데실포스포에탄올아민(DHPE), 1,2-다이스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 1,2-다이팔미토일 포스파티딜콜린(DPPC) 및 1,2-다이미리스토일포스파티딜콜린(DMPC)을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 1,2-다이아실-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 지질은 또한 다양한 천연(예를 들어, 조직 유래의 L-α-포스파티딜: 난황, 심장, 뇌, 간, 대두) 및/또는 합성(예를 들어, 포화 및 불포화 1,2-다이아실-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1-아실-2-아실-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-다이헵타노일-SN-글리세로-3-포스포콜린) 지질의 유도체를 포함할 수 있다.
다수의 양이온성 지질 및 이를 제조하는 방법은 예를 들어, 미국 특허 제5,830,430호; 제6,056,938호; 제7,893,302호; 제7,404,969제; 제8,034,376호; 제8,283,333호; 및 제8,642,076호뿐만 아니라 PCT 공개 WO 2010/054406, WO 2010/054401, WO 2010/054405, WO 2010/054384, WO 2012/040184, WO 2011/153120, WO 2011/149733, WO 2011/090965, WO 2011/043913, WO 2011/022460, WO 2012/061259, WO 2012/054365, WO 2012/044638, WO 2010/080724, WO 2010/21865 및 WO 2008/103276에 기재되어 있다.
용어 "양이온성 지질"은 1개 또는 2개의 지방산 또는 지방 지방족 사슬 및 생리학적 pH에서 양이온성 지질을 형성하도록 양성자화될 수 있는 아미노 헤드기(알킬아미노 또는 다이알킬아미노기를 포함함)를 갖는 지질을 포함하는 것을 의미하며, 이는 양으로 하전된 헤드기와 소수성 꼬리로 구성된다. 양으로 하전된 헤드기는 음으로 하전된 siRNA 분자에 정전기적으로 결합하는 역할을 할 수 있으며, 소수성 꼬리는 친유성 입자로의 자기-조립을 유도한다. 양이온성 지질의 예는: DLin-K-DMA, DLinDMA, DLinDAP, DLin-K-C2-DMA, DLin-K2-DMA, DOTAP, DMRIE, DORIE, DOTMA, DDAB, 에틸 PC, 다가 양이온성 지질 및 DC-콜레스테롤, DODA, DODMA, DSDMA, DOTMA, DDAB, DODAP, DOTAP, DOTAP-Cl, DC-Chol, DMRIE, DOSPA, DOGS, DOPE, CLinDMA, CpLinDMA, DMOBA, DOcarbDAP, DLincarbDAP, DLinCDAP를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 다수의 이러한 지질 및 관련 유사체는 미국 공개 제2006/0083780호 및 제2006/0240554호; 및 미국 특허 제5,208,036호; 제5,264,618호; 제5,279,833호; 제5,283,185호; 제5,753,613호 및 제5,785,992호에 기재되어 있다. 양이온성 지질은 또한 리포펙틴(예를 들어, 미국 특허 제5,705,188호 참조), 예컨대 Lipofectamine®, Lipofectamine 2000®, ipofectaLmine 3000®, RNAiMAX® 등일 수 있다.
N,N-다이올레일-N,N-다이메틸암모늄클로라이드(DODAC), 다이옥타데실다이메틸암모늄(DODMA), 다이스테아릴다이메틸암모늄(DSDMA), N-(1-(2,3-다이올레일옥시)프로필)-N,N,N-트라이메틸암모늄클로라이드(DOTMA), N,N-다이스테아릴-N,N-다이메틸암모늄브로마이드(DDAB), 1,2-다이올레오일-3-다이메틸암모늄프로페인(DODAP), N-(1-(2,3-다이올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트라이메틸암모늄클로라이드(DOTAP), 1,2-다이올레일옥시-3-트라이메틸아미노프로페인 클로라이드 염(DOTAP.Cl), 3-(N―(N',N'-다이메틸아미노에테인)-카바모일)콜레스테롤(DC-Chol), N-(1,2-다이미리스틸옥시프로프-3-일)-N,N-다이메틸-N-하이드록시에틸 암모늄브로마이드(DMRIE), 2,3-다이올레일옥시-N-[2(스퍼민-카복사미도)에틸]-N,N-다이메틸-1-프로판아미늄트라이플루오로아세테이트(DOSPA), 다이옥타데실아미도글리실 스퍼민(DOGS), 1,2-다이올레오일-sn-3-포스포에탄올아민(DOPE, 생리학적 pH에서는 양전하를 띠지 만 산성 pH에서는 아님), 3-다이메틸아미노-2-(콜레스트-5-엔-3-베타-옥시뷰탄-4-옥시)-1-(시스,시스-9,12-옥타데카다이엔옥시)프로페인(CLinDMA), 2-[5'-(콜레스트-5-엔-3β-옥시)-3'-옥사펜톡시)-3-다이메틸-1-(시스,시스-9',1-2'-옥타데카다이엔옥시)프로페인(CpLinDMA), N,N-다이메틸-3,4-다이올레일옥시벤질아민(DMOBA), 1,2-N,N'-다이올레일카바밀-3-다이메틸아미노프로페인(DOcarbDAP), 1,2-N,N'-다이리놀레일카바밀-3-다이메틸아미노프로페인(DLincarbDAP), 1,2-다이리놀레오일카바밀-3-다이메틸아미노프로페인(DLinCDAP) 및 이들의 혼합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 약 생리학적 pH에서 네트 양전하를 띠는 다른 양이온성 지질이 본 발명의 지질 입자에 사용될 수 있다. 다수의 이러한 지질 및 관련 유사체는 미국 공개 제2006/0083780호 및 제2006/0240554호; 미국 특허 제5,208,036호; 제5,264,618호; 제5,279,833호; 제5,283,185호; 제5,753,613호 및 제5,785,992호에 기재되어 있다.
적합한 추가적인 양이온성 지질은 또한 TAP 지질로도 지칭되는 N-[1-(2,3-다이올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트라이메틸 암모늄염, 예를 들어 메틸설페이트 염을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 적합한 TAP 지질은 DOTAP(다이올레오일-), DMTAP(다이미리스토일-), DPTAP(다이팔미토일-) 및 DSTAP(다이스테아로일-)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 리포솜에 적합한 양이온성 지질은 다이메틸다이옥타데실 암모늄브로마이드(DDAB), 1,2-다이아실옥시-3-트라이메틸암모늄프로페인, N-[1-(2,3-다이올로일옥시)프로필]-N,N-다이메틸 아민(DODAP), 1,2-다이아실옥시-3-다이메틸암모늄프로페인, N-[1-(2,3-다이올레일옥시)프로필]-N,N,N-트라이메틸암모늄클로라이드(DOTMA), 1,2-다이알킬옥시-3-다이메틸암모늄프로페인, 다이옥타데실아미도글리실스퍼민(DOGS), 3-[N-(N',N'-다이메틸아미노-에테인)카바모일]콜레스테롤(DC-Chol); 2,3-다이올레오일옥시-N-(2-(스퍼민카복사미도)-에틸)-N,N-다이메틸-1-프로판아미늄 트라이플루오로-아세테이트(DOSPA), β-알란일 콜레스테롤, 세틸 트라이메틸 암모늄브로마이드(CTAB), 다이C14-아미딘, N-페프-뷰틸-N'-테트라데실-3-테트라데실아미노-프로피온아미딘, N-(알파-트라이메틸암모니오아세틸)다이도데실-D-글루타메이트 클로라이드(TMAG), 다이테트라데카노일-N-(트라이메틸암모니오-아세틸)다이에탄올아민 클로라이드, 1,3-다이올레오일옥시-2-(6-카복시-스퍼밀)-프로필아마이드(DOSPER) 및 N,N,N',N'-테트라메틸-,N'-비스(2-하이드록실에틸)-2,3-다이올레오일옥시-1,4-뷰테인다이암모늄아이오다이드를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일 실시형태에서, 양이온성 지질은 1-[2-(아실옥시)에틸]2-알킬(알켄일)-3-(2-하이드록시에틸)-이미다졸리늄 클로라이드 유도체, 예를 들어, 1-[2-(9(Z)-옥타데세노일옥시)에틸]-2-(8(Z)-헵타데센일-3-(2-하이드록시에틸)이미다졸리늄 클로라이드(DOTIM) 및 1-[2-(헥사데카노일옥시)에틸]-2-펜타데실-3-(2-하이드록시에틸)이미다졸리늄 클로라이드(DPTIM)일 수 있다. 일 실시형태에서, 양이온성 지질은 4차 아민에 하이드록시알킬 모이어티를 함유하는 2,3-다이알킬옥시프로필 4차 암모늄 화합물 유도체, 예를 들어 1,2-다이올레오일-3-다이메틸-하이드록시에틸 암모늄브로마이드(DORI), 1,2-다이올레일옥시프로필-3-다이메틸-하이드록시에틸 암모늄브로마이드(DORIE), 1,2-다이올레일옥시프로필-3-다이메틸-하이드록시프로필 암모늄브로마이드(DORIE-HP), 1,2-다이올레일-옥시-프로필-3-다이메틸-하이드록시뷰틸 암모늄브로마이드(DORIE-HB), 1,2-다이올레일옥시프로필-3-다이메틸-하이드록시펜틸 암모늄브로마이드(DORIE-Hpe), 1,2-다이미리스틸옥시프로필-3-다이메틸-하이드록실에틸 암모늄브로마이드(DMRIE), 1,2-다이팔미틸옥시프로필-3-다이메틸-하이드록시에틸 암모늄브로마이드(DPRIE) 및 1,2-다이스테릴옥시프로필-3-다이메틸-하이드록시에틸 암모늄브로마이드(DSRIE)일 수 있다.
양이온성 지질은 또한 이온화 가능한 양이온성 지질일 수 있다. 본 명세서에 기재된 조성물을 제형화하는데 사용하기에 적합한 이온화 가능한 양이온성 지질은 WO2015/074805에 기재된 지질을 포함한다. 본 발명의 조성물을 제형화하기에 적합한 다른 적합한 이온화 가능한 양이온성 지질은 미국 공개 제2015/0239834호에 기재된 것들을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 대칭 또는 비대칭 또는 이온화 가능한 양이온성 지질은 나노입자 또는 지질 제형에 사용될 수 있다. 이러한 지질은 예를 들어, 미국 공개 제2015/0239926호, 제2015/0239834호 및 제2015/0141678호 및 PCT 공개 WO 2015/074805에 개시되어 있다.
추가로, LIPOFECTIN®(DOTMA 및 DOPE을 포함, 깁코/비알엘(GIBCO/BRL)로부터 입수 가능함), LIPOFECTAMINE®(DOSPA 및 DOPE을 포함, 깁코/비알엘로부터 입수 가능함), TRANSFECTIN®(from 바이오-라드 래버러토리스, 인코포레이션(바이오-라드 Laboratories, Inc.)) 및 siPORT NEOFX®(어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)로부터)와 같은 다수의 양이온성 지질의 상용 제제가 사용될 수 있다.
양이온성 지질은 또한 siRNA 분자(예를 들어, 미국 공개 제2013/0323269호에 기재된 것들 참조); 양이온성 글리세롤 유도체 및 다양이온 분자, 예컨대 폴리라이신(PCT 공개 WO 97/30731), 하나 이상의 생분해성기를 포함하는 양이온기(미국 공개 제2013/0195920호)와 같은 본 명세서에 기재된 작용제를 포함하는 조성물의 세포 전달에 적합한 변형된 양이온성 지질일 수 있다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 WO 2015/074805 또는 미국 공개 제2015/0239834호에 기재된 이온화 가능한 아미노 지질일 수 있다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물은 WO 2010/053572에 기재된 바와 같은 아미노알코올 리피도이드를 더 포함한다. 소정의 실시형태에서, 리피도이드 화합물은 하기 화학식 (I) 내지 (V) 및 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염으로부터 선택된다:
Figure pct00124
;
Figure pct00125
;
Figure pct00126
;
Figure pct00127
; 및
Figure pct00128
식 중,
A는 O, S 및 N으로부터 독립적으로 선택되는 1개 이상의 헤테로원자에 의해 선택적으로 중단된, 치환 또는 비치환된, 분지형 또는 비분지형, 고리형 또는 비고리형 C2-20 알킬렌이거나, 또는 A는 치환 또는 비치환된, 포화 또는 불포화 4-6-원 고리이고;
R1은 수소, 치환된, 비치환된, 분지형 또는 비분지형 C1-20-지방족 또는 치환된, 비치환된, 분지형 또는 비분지형 C1-20 헤테로지방족이되, 적어도 하나의 R1의 존재는 수소이며;
RB, RC 및 RD는 독립적으로, 수소, 치환된, 비치환된, 분지형 또는 비분지형 C1-20-지방족 또는 치환된, 비치환된, 분지형 또는 비분지형 C1-20-헤테로지방족 또는 -CH2CH(OH)RE이고;
RB 및 RD는 함께 선택적으로 고리형 구조를 형성할 수 있으며;
RC 및 RD는 함께 선택적으로 고리형 구조를 형성할 수 있고; 그리고
RE는 치환된, 비치환된, 분지형 또는 비분지형 C1-20 지방족 또는 치환된, 비치환된, 분지형 또는 비분지형 C1-20 헤테로지방족이다.
소정의 특정 실시형태에서, 리피도이드는 하기 화학식 (VI) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이다:
Figure pct00129
식 중,
p는 1 내지 3의 정수를 포함하고;
m은 1 내지 3의 정수를 포함하며;
RA는 수소; 치환 또는 비치환된, 고리형 또는 비고리형, 분지형 또는 비분지형 C1-20 지방족; 치환 또는 비치환된, 고리형 또는 비고리형, 분지형 또는 비분지형 C1-20 헤테로지방족; 치환 또는 비치환된 아릴; 치환 또는 비치환된 헤테로아릴;
Figure pct00130
;
Figure pct00131
; 또는
Figure pct00132
이고;
RF는 수소; 치환 또는 비치환된, 고리형 또는 비고리형, 분지형 또는 비분지형 C1-20 지방족; 치환 또는 비치환된, 고리형 또는 비고리형, 분지형 또는 비분지형 C1-20 헤테로지방족; 치환 또는 비치환된 아릴; 치환 또는 비치환된 헤테로아릴;
Figure pct00133
;
Figure pct00134
; 또는
Figure pct00135
이며;
R5의 각각의 존재는 독립적으로 수소; 치환 또는 비치환된, 고리형 또는 비고리형, 분지형 또는 비분지형 C1-20 지방족; 치환 또는 비치환된, 고리형 또는 비고리형, 분지형 또는 비분지형 C1-20 헤테로지방족; 치환 또는 비치환된 아릴; 또는 치환 또는 비치환된 헤테로아릴이되;
RA, RF, RY 및 RZ 중 적어도 하나는
Figure pct00136
또는
Figure pct00137
이고;
x의 각각의 존재는 1 내지 10의 정수를 포함하며;
y의 각각의 존재는 1 내지 10의 정수를 포함하고;
RY의 각각의 존재는 수소; 치환 또는 비치환된, 고리형 또는 비고리형, 분지형 또는 비분지형 C1-20 지방족; 치환 또는 비치환된, 고리형 또는 비고리형, 분지형 또는 비분지형 C1-20 헤테로지방족; 치환 또는 비치환된 아릴; 치환 또는 비치환된 헤테로아릴;
Figure pct00138
또는
Figure pct00139
이며;
RZ의 각각의 존재는 수소; 치환 또는 비치환된, 고리형 또는 비고리형, 분지형 또는 비분지형 C1-20 지방족; 치환 또는 비치환된, 고리형 또는 비고리형, 분지형 또는 비분지형 C1-20 헤테로지방족; 치환 또는 비치환된 아릴; 치환 또는 비치환된 헤테로아릴;
Figure pct00140
또는
Figure pct00141
이다.
화학식 (VI)의 소정의 실시형태에서, p는 1이다. 소정의 실시형태에서, m은 1이다. 소정의 실시형태에서, p 및 m은 둘 다 1이다. 소정의 실시형태에서, RF는
Figure pct00142
이다. 소정의 실시형태에서, RA는
Figure pct00143
이다.
소정의 실시형태에서, 조성물은 C14-120, C16-120, C14-98, C14-113, C14-96, C12-200, C12-205, C16-96, C12-111 및 C12-210로부터 선택된 아미노알코올 리피도이드를 포함한다(위에 언급된 미국 특허 제8,450,298호 및 PCT 공개 WO 2010/053572 참조)
소정의 특정 실시형태에서, 아미노알코올 리피도이드는 C12-200이다:
Figure pct00144
.
소정의 특정 실시형태에서, 리피도이드는 하기 화학식 (VII) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이다:
Figure pct00145
식 중,
RA의 각각의 존재는 독립적으로 수소; 치환 또는 비치환된, 고리형 또는 비고리형, 분지형 또는 비분지형 C1-20 지방족; 치환 또는 비치환된, 고리형 또는 비고리형, 분지형 또는 비분지형 C1-20 헤테로지방족; 치환 또는 비치환된 아릴; 치환 또는 비치환된 헤테로아릴;
Figure pct00146
또는
Figure pct00147
이되;
적어도 하나의 RA는
Figure pct00148
또는
Figure pct00149
이고;
R5의 각각의 존재는 독립적으로 수소; 치환 또는 비치환된, 고리형 또는 비고리형, 분지형 또는 비분지형 C1-20 지방족; 치환 또는 비치환된, 고리형 또는 비고리형, 분지형 또는 비분지형 C1-20 헤테로지방족; 치환 또는 비치환된 아릴; 또는 치환 또는 비치환된 헤테로아릴이며;
x의 각각의 존재는 1 내지 10의 정수를 포함하고; 그리고
y의 각각의 존재는 1 내지 10의 정수를 포함한다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물은 WO 2014/028847에 기재된 바와 같은 아민-함유 리피도이드를 더 포함한다.
소정의 실시형태에서, 아민-함유 리피도이드는 하기 화학식 (VIII) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이다:
Figure pct00150
식 중,
각각의 L은 독립적으로, 분지형 또는 비분지형 C1-6 알킬렌이되, L은 하나 이상의 플루오린 라디칼로 선택적으로 치환되고;
각각의 RA는 독립적으로, 분지형 또는 비분지형 C1-6 알킬, C3-7 사이클로알킬 또는 분지형 또는 비분지형 C4-12 사이클로알킬알킬이되, RA는 하나 이상의 플루오린 라디칼로 선택적으로 치환되며;
각각의 R은 독립적으로, 수소 또는 -CH2CH2C(=O)ORB이고;
각각의 RB는 독립적으로, C10-14 알킬이되, RB는 하나 이상의 플루오린 라디칼로 선택적으로 치환되며; 그리고
q는 1, 2 또는 3이되;
단, 적어도 3개의 R기는 -CH2CH2C(=O)ORB이고;
단, 화합물은
Figure pct00151
이 아니다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물은 WO 2016/004202에 기재된 바와 같은 폴리아민-지방산 유래 리피도이드를 더 포함한다.
소정의 실시형태에서, 아민-함유 리피도이드는 하기 화학식 (IX) 또는 약제학적으로 허용 가능한 염이다:
Figure pct00152
식 중,
X는 치환 또는 비치환된 알킬렌, 치환 또는 비치환된 알켄일렌, 치환 또는 비치환된 알킨일렌, 치환 또는 비치환된 헤테로알킬렌, 치환 또는 비치환된 헤테로알켄일렌, 치환 또는 비치환된 헤테로알킨일렌, 치환 또는 비치환된 카보사이클릴렌, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클릴렌, 치환 또는 비치환된 아릴렌, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴렌, 화학식
Figure pct00153
의 2가의 모이어티, 또는 이들의 조합이고, 식 중 RX의 각각의 경우는 독립적으로 수소, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 알켄일, 치환 또는 비치환된 알킨일, 치환 또는 비치환된 카보사이클릴, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클릴, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 질소 보호기, 또는 화학식
Figure pct00154
의 모이어티, 또는 RB1이고, RX의 경우는 연결되어 치환 또는 비치환된, 헤테로고리형 고리 또는 치환 또는 비치환된, 헤테로아릴 고리 또는 RB2를 형성하고, RX의 경우는 연결되어 치환 또는 비치환된, 헤테로고리형 고리 또는 치환 또는 비치환된, 헤테로아릴 고리를 형성하되,
LX의 각각의 경우는 독립적으로 치환 또는 비치환된 알킬렌 또는 치환 또는 비치환된 헤테로알킬렌이고; 그리고
RX1의 각각의 경우는 독립적으로 치환 또는 비치환된, C4-30 알킬, 치환 또는 비치환된, C4-30 알켄일 또는 치환 또는 비치환된, C4-30 알킨일이며;
L1a는 치환 또는 비치환된 알킬렌 또는 치환 또는 비치환된 헤테로알킬렌이고;
RA1a는 치환 또는 비치환된, C4-30 알킬, 치환 또는 비치환된, C4-30 알켄일 또는 치환 또는 비치환된, C4-30 알킨일이며;
RB1은 수소, 치환 또는 비치환된 아실, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 알켄일, 치환 또는 비치환된 알킨일, 치환 또는 비치환된 카보사이클릴, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클릴, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 질소 보호기 또는 화학식
Figure pct00155
의 모이어티(식 중, L1b는 치환 또는 비치환된 알킬렌 또는 치환 또는 비치환된 헤테로알킬렌이며, RA1b는 치환 또는 비치환된, C4-30 알킬, 치환 또는 비치환된, C4-30 알켄일 또는 치환 또는 비치환된, C4-30 알킨일임)이고;
L2a는 치환 또는 비치환된 알킬렌 또는 치환 또는 비치환된 헤테로알킬렌이며;
RA2a는 치환 또는 비치환된, C4-30 알킬, 치환 또는 비치환된, C4-30 알켄일 또는 치환 또는 비치환된, C4-30 알킨일이고; 그리고
RB2는 수소, 치환 또는 비치환된 아실, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 알켄일, 치환 또는 비치환된 알킨일, 치환 또는 비치환된 카보사이클릴, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클릴, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 질소 보호기 또는 화학식
Figure pct00156
의 모이어티(식 중, L2b는치환 또는 비치환된 알킬렌 또는 치환 또는 비치환된 헤테로알킬렌이고, RA2b는 치환 또는 비치환된, C4-30 알킬, 치환 또는 비치환된, C4-30 알켄일 또는 치환 또는 비치환된, C4-30 알킨일임)이거나; 또는
RB1 및 RB2는 연결되어 치환 또는 비치환된, 헤테로고리형 고리 또는 치환 또는 비치환된, 헤테로아릴 고리를 형성한다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물은 WO 2013/063468에 기재된 바와 같은 아미노산-, 펩타이드- 또는 폴리펩타이드-지질을 더 포함한다. 소정의 실시형태에서, 아민-함유 리피도이드는 하기 화학식 (X) 또는 약제학적으로 허용 가능한 염이다:
Figure pct00157
식 중,
p는 1 내지 9의 정수를 포함하고;
Q의 각각의 경우는 독립적으로 O, S 또는 NRQ이되, RQ는 수소, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알켄일, 선택적으로 치환된 알킨일, 선택적으로 치환된 카보사이클릴, 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴, 질소 보호기, 또는 화학식 (i), (ii), (iii)의 기이고;
R1의 각각의 경우는 독립적으로 수소, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알켄일, 선택적으로 치환된 알킨일, 선택적으로 치환된 카보사이클릴, 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴, 할로겐, -ORA1, -N(RA1)2, -SRA1이되; RA1의 각각의 존재는 독립적으로 수소, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알켄일, 선택적으로 치환된 알킨일, 선택적으로 치환된 카보사이클릴, 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴, 산소 원자에 부착될 경우 산소 보호기, 황 원자에 부착될 경우 황 보호기, 질소 원자에 부착될 경우 질소 보호기, 또는 2개의 RA1기는 연결되어 선택적으로 치환된 헤테로고리형 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴 고리를 형성하거나;
또는 R1의 적어도 하나의 경우는 하기 화학식의 기이며:
Figure pct00158
식 중, L은 선택적으로 치환된 알킬렌, 선택적으로 치환된 알켄일렌, 선택적으로 치환된 알킨일렌, 선택적으로 치환된 헤테로알킬렌, 선택적으로 치환된 헤테로알켄일렌, 선택적으로 치환된 헤테로알킨일렌, 선택적으로 치환된 카보사이클릴렌, 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴렌, 선택적으로 치환된 아릴렌 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴렌이고, 그리고
R6 및 R7은 각각 수소, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알켄일, 선택적으로 치환된 알킨일, 선택적으로 치환된 카보사이클릴, 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴 및 질소 보호기로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며;
R2의 각각의 경우는 독립적으로 수소, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알켄일, 선택적으로 치환된 알킨일, 선택적으로 치환된 카보사이클릴, 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴, 질소 보호기 또는 화학식 (i), (ii) 또는(iii)의 기이고; 그리고
화학식 (i), (ii) 및 (iii)은 다음과 같다:
Figure pct00159
,
Figure pct00160
또는
Figure pct00161
식 중,
R'의 각각의 경우는 독립적으로 수소 또는 선택적으로 치환된 알킬이고;
X는 O, S, NRX이되, RX는 수소, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알켄일, 선택적으로 치환된 알킨일, 선택적으로 치환된 카보사이클릴, 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴 또는 질소 보호기이며;
Y는 O, S, NRY이되, RY는 수소, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알켄일, 선택적으로 치환된 알킨일, 선택적으로 치환된 카보사이클릴, 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴 또는 질소 보호기이고;
RP는 수소, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알켄일, 선택적으로 치환된 알킨일, 선택적으로 치환된 카보사이클릴, 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴, 산소 원자에 부착될 경우 산소 보호기, 황 원자에 부착될 경우 황 보호기, 질소 원자에 부착될 경우 질소 보호기이며; 그리고
RL은 선택적으로 치환된 C1-50 알킬, 선택적으로 치환된 C2-50 알켄일, 선택적으로 치환된 C2-50 알킨일, 선택적으로 치환된 헤테로C1-50 알킬, 선택적으로 치환된 헤테로C2-50 알켄일, 선택적으로 치환된 헤테로C2-50 알킨일 또는 중합체이되;
단, RQ, R2, R6 또는 R7의 적어도 하나의 경우는 화학식 (i), (ii) 또는 (iii)의 기이다.
소정의 특정 실시형태에서, 아미노산-, 펩타이드- 또는 폴리펩타이드-지질은 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00162
소정의 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 조성물은 지질 나노입자를 함유하는 C12-200으로 제형화될 수 있다. 일부 실시형태에서, C12-200은 전체 조성물의 약 1.0% 내지 약 60.0%, 약 10.0% 내지 40.0% 또는 약 20.0% 내지 약 50.0%의 몰 퍼센트로 존재한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 전체 조성물의 몰 기준으로 약 5.0%, 약 7.5%, 약 10.0%, 약 12.5%, 약 15.0%, 약 17.5%, 약 20.0%, 약 20.5%, 약 21.0%, 약 21.5%, 약 22.0%, 약 22.5%, 약 23.0%, 약 23.5%, 약 24.0%, 약 24.5%, 약 25.0%, 약 25.5%, 약 26.0%, 약 26.5%, 약 27.0%, 약 27.5%, 약 28.0%, 약 28.5%, 약 29.0%, 약 29.5%, 약 30.0%, 약 30.5%, 약 31.0%, 약 31.5%, 약 32.0%, 약 32.5%, 약 33.0%, 약 33.5 %, 약 34.0%, 약 34.5%, 약 35.0%, 약 35.5%, 약 36.0%, 약 36.5%, 약 37.0%, 약 37.5%, 약 38.0%, 약 38.5%, 약 39.0%, 약 39.5%, 약 40.0%, 약 40.5%, 약 41.0%, 약 41.5%, 약 42.0%, 약 42.5%, 약 43.0%, 약 43.5%, 약 44.0%, 약 44.5%, 약 45.0%, 약 45.5%, 약 46.0%, 약 46.5%, 약 47.0%, 약 47.5%, 약 48.0%, 약 48.5%, 약 49.0%, 약 49.5%, 약 50.0%, 약 50.5%, 약 51.0%, 약 52.0%, 약 53.0%, 약 54.0%, 약 55.0%, 약 56.0%, 약 57.0%, 약 58.0%, 약 59.0% 또는 약 60.0%의 농도로 C12-200을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 조성물은 약 50.0 몰%의 C12-200을 포함한다.
일부 실시형태에서, 지질 나노입자는 또한 중성 지질, 양친 매성 지질, PEG-함유 지질, 음이온성 지질 및 스테롤을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 하나 이상의 보조 지질(본 명세서 "보조-지질(co-lipid)"이라고도 함)을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 지질 나노입자는 하나 이상의 중성 지질을 더 포함한다. 존재하는 경우, 중성 지질은 생리학적 pH에서 하전되지 않은 또는 중성 양쪽성 이온 형태로 존재하는 여러 지질 종 중 하나일 수 있다. 이러한 지질은 예를 들어, 다이아실포스파티딜콜린, 다이아실포스파티딜에탄올아민, 세라마이드, 스핑고마이엘린, 다이하이드로스핑고마이엘린, 세팔린 및 세레브로사이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 중성 지질 성분은 2개의 아실기(예를 들어, 다이아실포스파티딜콜린 및 다이아실포스파티딜에탄올아민)을 갖는 지질이다. 일부 실시형태에서, 중성 지질은 탄소 사슬 길이가 C10 내지 C20의 범위인 포화 지방산을 포함하며, 일부 실시형태에서, 중성 지질은 탄소 사슬 길이가 C10 내지 C20인 모노- 또는 다이-불포화 지방산을 포함한다. 적합한 중성 지질은 DPPC(다이팔미토일 포스파티딜콜린), POPC(팔미토일-올레오일 포스파티딜 Cholin), DOPE(1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민), DSPC(다이스테로일포스파티딜 콜린), 난(egg) L-알파-포스파티딜콜린(EPC); 1,2-다이팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPPE); 및 SM(스핑고마이엘린)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 중성 지질은 DSPC(다이스테로일포스파티딜 콜린)이다. 일부 실시형태에서, 조성물은 전체 조성물의 약 1.0% 내지 약 20.0% 또는 약 5.0% 내지 약 10.0 몰%로 DSPC를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 전체 조성물의 몰 기준으로 약 1.0%, 약 1.5%, 약 2.0%, 약 2.5%, 약 3.0%, 약 3.5%, 약 4.0%, 약 4.5%, 약 5.0%, 약 5.5%, 약 6.0%, 약 6.5%, 약 7.0%, 약 7.5%, 약 8.0%, 약 8.5%, 약 9.0%, 약 9.5%, 약 10.0%, 약 10.5%, 약 11.0%, 약 11.5%, 약 12.0%, 약 12.5%, 약 13.0%, 약 13.5%, 약 14.0%, 약 14.5%, 약 15.0%, 약 15.5%, 약 16.0%, 약 16.5%, 약 17.0%, 약 17.5%, 약 18.0%, 약 18.5%, 약 19.0% 약 19.5% 또는 약 20.0%로 DSPC를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 약 10 몰%의 DSPC를 포함한다.
일부 실시형태에서, 지질 나노입자는 하나 이상의 음이온성 지질을 더 포함한다. 음이온성 지질은 생리학적 pH에서 네트 음전하를 띠는 지질이다. 양이온성 지질과 조합하여 사용될 때, 음이온성 지질은 지질 입자의 전체 표면 전하를 감소시키고/시키거나 지질 구조의 pH-의존성 파괴를 도입하여 지질 입자(예를 들어, siRNA 분자)에 제형화된 치료제의 방출을 촉진한다. 음이온성 지질은 지방산(예를 들어, 올레산, 리놀레산, 리놀렌산); 콜레스테릴 헤미석시네이트(CHEMS); 1,2-다이-0-테트라데실-sn-글리세로-3-포스포-(l'-rac-글리세롤)(다이에터 PG); 1,2-다이미리스토일-sn-글리세로-3-포스포-(l'-rac-글리세롤)(소듐염); 1,2-다이미리스토일-sn-글리세로-3-포스포-L-세린(소듐염); l-헥사데카노일,2-(9Z,12Z)-옥타데카다이에노일-sn-글리세로-3-포스페이트; 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-[포스포-rac-(l-글리세롤)](DOPG); 다이올레오일포스파티드산(DOPA); 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포-L-세린(DOPS); 및 이들의 유도체를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 적합한 음이온성 지질의 다른 예는 지방산, 예컨대 올레산, 리놀레산 및 리놀렌산; 및 콜레스테릴 헤미석시네이트를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 이러한 지질은 리간드를 리포솜 표면에 부착하는 것과 같은 다양한 목적을 위해 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있다.
지질 나노입자는 또한 응집을 감소시킬 수 있는 하나 이상의 지질을 포함할 수 있다. 제형화 중 입자의 응집을 감소시키는 지질의 예는 PEG 리피드(예를 들어, DMG-PEG(1,2-다이미리스토일-sn-글리세롤, 메톡시폴리에틸렌 글리콜-PEG), DMA-PEG(폴리(에틸렌 글리콜)-다이메타크릴레이트-PEG) 및 DMPE-PEG550(1,2-다이미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-550]), PEG), 모노시알로강글리오사이드 Gml 및 폴리아마이드 올리고머(PAO), 예컨대 미국 특허 제6,320,017호에 기재된 것들을 포함한다. 지질 나노입자는 본 명세서에 교시된 임의의 제형에서 DMPE-PEG2000로 치환될 수 있는 DMPE-PEG2000 또는 DMG-PEG를 포함할 수 있다. 다른 적합한 PEG 지질은 PEG-변형된 포스파티딜에탄올아민 및 포스파티드산, PEG-세라마이드 접합체(예를 들어, PEG-CerC14 또는 PEG-CerC20)(예컨대, 미국 특허 제5,820,873호에 기재된 것들), PEG-변형된 다이알킬아민 및 PEG-변형된 1,2-다이아실옥시프로판-3-아민, PEG-변형된 다이아실글리세롤 및 다이알킬글리세롤, mPEG(mw2000)-다이아스테아로일포스파티딜에탄올아민(PEG-DSPE)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 응집을 감소시킬 수 있는 지질은 DMPE-PEG2000 또는 DMG-PEG(1,2-다이미리스토일-sn-글리세롤, 메톡시폴리에틸렌 글리콜, PEG)이다. 일부 실시형태에서, 조성물은 약 0.1 몰% 내지 약 5.0 몰%의 DMPE-PEG2000 또는 DMG-PEG(즉, 약 0.1 몰% 내지 약 5.0 몰% DMPE-PEG2000 또는 0.1 몰% 내지 약 5.0 몰% DMG-PEG) 또는 약 0.5 몰% 내지 2.0 몰% DMPE-PEG2000 또는 DMG-PEG를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 전체 조성물에서 몰 기준으로 약 0.1%, 약 0.2%, 약 0.3%, 약 0.4%, 약 0.5%, 약 0.6%, 약 0.7%, 약 0.8%, 약 0.9%, 약 1.0%, 약 1.1%, 약 1.2%, 약 1.3%, 약 1.4%, 약 1.5%, 약 1.6%, 약 1.7%, 약 1.8%, 약 1.9%, 약 2.0%, 약 2.1%, 약 2.2%, 약 2.3%, 약 2.4%, 약 2.5%, 약 2.6%, 약 2.7%, 약 2.8%, 약 2.9%, 약 3.0%, 약 3.1%, 약 3.2%, 약 3.3%, 약 3.4%, 약 3.5%, 약 3.6%, 약 3.7%, 약 3.8%, 약 3.9%, 약 4.0%, 약 4.1%, 약 4.2%, 약 4.3%, 약 4.4%, 약 4.5%, 약 4.6%, 약 4.7%, 약 4.8%, 약 4.9% 또는 약 5.0%의 DMPE-PEG2000 또는 DMG-PEG를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 몰 기준으로 약 1.5%의 DMPE-PEG2000 또는 DMG-PEG를 포함한다.
일부 실시형태에서, 지질 나노입자는 스테롤을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 스테롤은 콜레스테롤이다. 일부 실시형태에서, 조성물은 몰 기준으로 약 10.0% 내지 약 50.0%의 콜레스테롤 또는 몰 기준으로 약 15.0% 내지 약 40.0%의 콜레스테롤을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 몰 기준으로 약 10.0%, 약 11.0%, 약 11.5%, 약 12.0%, 약 12.5%, 약 13.0%, 약 13.5%, 약 14.0%, 약 14.5%, 약 15.0 %, 약 15.5%, 약 16.0%, 약 16.5 %, 약 17.0%, 약 17.5%, 약 18.0%, 약 18.5%, 약 19.0%, 약 19.5%, 약 20.0%, 약 20.5%, 약 21.0%, 약 21.5%, 약 22.0%, 약 22.5%, 약 23.0%, 약 23.5%, 약 24.0%, 약 24.5%, 약 25.0%, 약 25.5%, 약 26.0%, 약 26.5%, 약 27.0%, 약 27.5%, 약 28.0%, 약 28.5%, 약 29.0%, 약 29.5%, 약 30.0%, 약 30.5%, 약 31.0%, 약 31.5%, 약 32.0%, 약 32.5%, 약 33.0%, 약 3.5%, 약 34.0%, 약 34.5%, 약 35.0%, 약 35.5%, 약 36.0%, 약 36.5%, 약 37.0%, 약 37.5%, 약 38.0%, 약 38.5%, 약 39.0%, 약 39.5% 또는 약 40.0%의 콜레스테롤을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 몰 기준으로 약 38.5%의 콜레스테롤을 포함한다.
LNP 제형에서 PEG의 비는 증가 또는 감소될 수 있고/있거나 PEG 지질의 탄소 사슬 길이는 LNP 제형의 약동학 및/또는 생체분포를 변경하기 위해 C14에서 C18로 변형될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 지질 나노입자는 지질 나노입자및/또는 이의 캡슐화된 조성물(예를 들어, 유전자 침묵 작용제, siRNA 분자, 펩타이드 등)의 세포 흡수 또는 세포질 분포를 향상시킬 수 있는 하나 이상의 화합물을 더 포함한다. 세포 흡수를 향상시킬 수 있는 화합물은 레보도파, 나파졸린 하이드로클로라이드, 아세토헥사마이드, 나이클로사마이드, 다이프로필린 및 아이소시캄 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 세포질 분포를 향상시킬 수 있는 화합물은 아자구아닌-8, 아이소플루프레돈 아세테이트, 클로로퀸, 트라이메토벤즈아마이드, 하이드로클로라이드, 아이속수프린 하이드로클로라이드 및 다이페마닐 메틸설페이트 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 지질 나노입자는 본 발명에 포함되는 하나 이상의 작용제, 예컨대 적어도 하나의 본 명세서에 기재된 바이오마커 mRNA 전사 생성물에 대해 충분히 상보적인 siRNA 분자를 캡슐화하는 지질 이중층을 포함한다. 일부 실시형태에서, 지질 나노입자는 세포로의 흡수를 촉진하도록 제형화된다. 일부 실시형태에서, 지질 나노입자는 단핵구, 수지상 세포 및/또는 대식세포로의 흡수를 촉진하도록 제형화된다.
지질 나노입자는 일부 양태에서, 추가적인 작용제를 더 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 지질 나노입자는 하나 이상의 항산화제를 더 포함한다. 임의의 특정 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 항산화제는 지질 나노입자를 안정화하고, 지질 나노입자에 캡슐화된 양이온성 지질 및/또는 활성제의 분해를 방지, 감소 및/또는 저해하는 것을 도울 수 있다. 일부 실시형태에서, 항산화제는 친수성 항산화제, 친유성 항산화제, 금속 킬레이트제, 일차 항산화제, 이차 항산화제 또는 이들의 염 또는 혼합물이다. 일부 실시형태에서, 항산화제는 EDTA 또는 이의 염을 포함한다. 일부 실시형태에서, 지질 나노입자는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개 이상의 추가적인 항산화제(예를 들어, 일차 항산화제, 이차 항산화제 또는 다른 금속 킬레이트제)와 조합하여 EDTA를 더 포함한다. 항산화제의 예는 친수성 항산화제, 친유성 항산화제 및 이들의 혼합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 친수성 항산화제의 비-제한적 예는 킬레이트제(예를 들어, 금속 킬레이트제), 예컨대 에틸렌다이아민테트라아세트산(EDTA), 시트레이트, 에틸렌 글리콜 테트라아세트산(EGTA), 1,2-비스(o-아미노페녹시)에테인-N,N,N',N'-테트라아세트산(BAPTA), 다이에틸렌 트라이아민 펜타아세트산(DTPA), 2,3-다이머캅토-1-프로페인설폰산(DMPS), 다이머캅토석신산(DMSA), cc-리포산, 살리실알데하이드 아이소나이코티노일 하이드라존(SIR), 헥실 티오에틸아민 하이드로클로라이드(HTA), 데스페리옥사민, 이들의 염 및 이들의 혼합물을 포함한다. 추가적인 친수성 항산화제는 아스코르브산, 시스테인, 글루타티온, 다이하이드로리포산, 2-머캅토에테인 설폰산, 2-머캅토벤즈이미다졸 설폰산, 6-하이드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로만-2-카복실산, 소듐 메타바이설파이트, 이들의 염 및 이들의 혼합물을 포함한다. 친유성 항산화제의 비-제한적 예는 바이타민 E 이성질체, 예컨대 α-, β-, γ- 및 δ-토코페롤 및 α-, β-, γ- 및 δ-토코트라이에놀; 폴리페놀, 예컨대 2-tert-뷰틸-4-메틸 페놀, 2-tert-뷰틸-5-메틸 페놀 및 2-tert-뷰틸-6-메틸 페놀; 뷰틸화 하이드록시아니솔(BHA)(예를 들어, 2-teri-뷰틸-4-하이드록시아니솔 및 3-tert-뷰틸-4-하이드록시아니솔); 뷰틸하이드록시톨루엔(BHT); tert-뷰틸하이드로퀴논(TBHQ); 아스코빌 팔미테이트; rc-프로필 갈레이트; 이들의 염; 및 이들의 혼합물을 포함한다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 작용제(예를 들어, 유전자 침묵 작용제, siRNA 분자, 펩타이드)의 전달을 위해 제형화된 지질-기반 입자는 지질 벡터, 리포솜, 리포플렉스, 지질 나노입자 및 마이셀로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 지질-기반 입자는 pH-민감성 나노입자이다. 산에 불안정한 아세탈 링커를 통해 다중-암 폴리(에틸렌 글리콜) 담체와 화학적으로 가교결합된 siRNA를 포함하는 양전하가 없는 나노 담체인 pH-민감성 나노입자(pH-sensitive nanoparticle: PNSDS)는 siRNA 분자의 전달에 유익할 수 있다(문헌[Tang et al., SiRNA Crosslinked Nanoparticles for the Treatment of Inflammation-induced Liver Injury, Advanced Science, 2016, 4(2), e1600228]).
일부 실시형태에서, 지질 나노입자는 하나 이상의 C12-200 아미노알코올 지질을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 지질 나노입자는 약 40.0 몰% 내지 약 50.0 몰%의 C12-200을 포함한다. 일부 실시형태에서, 지질 나노입자는 약 5.0 몰% 내지 약 10.0 몰%의 DSPC를 포함한다. 일부 실시형태에서, 지질 나노입자는 약 1.0 몰% 내지 약 2.0 몰%의 DMG-PEG를 포함한다. 일부 실시형태에서, 지질 나노입자는 약 20.0 몰% 내지 약 40.0 몰%의 콜레스테롤을 포함한다. 일부 실시형태에서, 지질 나노입자는 50 몰%의 C12-200, 10.0 몰%의 DSPC, 1.5 몰%의 DMG-PEG 및 38.5 몰% 콜레스테롤을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제형 내의 총 지질 몰에 대한 총 siRNA 분자 몰은 약 1:5 내지 약 1:20 범위이다. 일부 실시형태에서, 총 지질 몰에 대한 총 siRNA 분자 몰은 약 1:5, 약 1:6, 약 1:7, 약 1:8, 약 1:9, 약 1:10, 약 1:11, 약 1:12, 약 1:13, 약 1:14, 약 1:15, 약 1:16, 약 1:17, 약 1:18, 약 1:18, 약 1:19 또는 약 1:20이다. 일부 실시형태에서, 총 지질 몰에 대한 총 siRNA 분자 몰은 약 1:9이다.
일부 실시형태에서, 지질 나노입자(LNP)는 이전에 문헌[Semple　et al. (2010)　Nat. Biotechnol. 28172-28176]에 기재된 바와 같은 자발적 소포 형성 제형화 절차를 사용하여 siRNA와 같은 작용제를 캡슐화하도록 제형화된다.
일부 실시형태에서, 제형에서 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 바이오마커의 mRNA 전사 생성물에 충분히 상보적인 siRNA 분자와 같은 본 발명에 포함되는 하나 이상의 작용제의 총 농도는 약 0.001 ㎎/㎖ 내지 약 100 ㎎/㎖, 약 0.01 ㎎/㎖ 내지 약 10 ㎎/㎖ 또는 약 0.1 ㎎/㎖ 내지 약 20㎎/㎖이다. 일부 실시형태에서, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상 또는 6개 모두의 siRNA 분자의 총 농도는 약 0.001 ㎎/㎖ 내지 약 100 ㎎/㎖, 약 0.01 ㎎/㎖ 내지 약 10 ㎎/㎖ 또는 약 0.1 ㎎/㎖ 내지 약 20 ㎎/㎖이다.
일부 실시형태에서, 지질 나노입자(LNP)는 크기가 약 40㎚ 내지 약 200nm 또는 약 50nm 내지 약 100nm 범위이다. 일부 실시형태에서, 지질 나노입자는 크기가 약 40㎚, 약 45㎚, 약 50㎚, 약 55㎚, 약 60㎚, 약 65㎚, 약 70㎚, 약 75㎚, 약 80㎚, 약 85㎚, 약 90㎚, 약 95㎚, 약 100㎚, 약 110㎚, 약 120㎚, 약 130㎚, 약 140㎚, 약 150㎚, 약 160㎚, 약 170㎚, 약 180nm 또는 약 200nm이다. 일부 실시형태에서, 지질 나노입자는 크기가 약 80㎚이다.
본 발명에 따르면, 본 명세서에 기재된 제형은 안정하다. 본 명세서에 사용되는 용어 "안정한"은 환자에게 투여하기에 적합한 상태(state) 또는 상태(condition)로 남아 있음을 의미한다. 일부 실시형태에서, 제형은 실질적으로 순수하다. 본 명세서에 사용되는, "실질적으로 순수한"은 활성 성분(예를 들어, 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 바이오마커의 mRNA 전사 생성물에 충분히 상보적인 siRNA 분자)이 제형에 존재하는 우세한 종임을 의미한다. 일부 실시형태에서, 실질적으로 순수한 조성물은 80%를 초과하는 거대 분자 종(예를 들어, 활성제, 유전자 침묵 작용제, siRNA 분자, 추가적인 작용제(예를 들어, 항산화제))으로 구성된 조성물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 실질적으로 순수한 조성물은 거대 분자 종이 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%를 초과하는 조성물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 활성제는 본질적인 동질성(즉, 오염된 종은 종래의 검출 방법에 의해 조성물에서 검출될 수 없음)에 대해 정제되되, 조성물은 본질적으로 단일 거대 분자 종으로 구성된다.
다른 나노입자는 본 명세서에 기재된 작용제 및 조성물의 전달 비히클로서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 나노입자는 화학적으로 및/또는 효소적으로 변형된 지질단백질(예를 들어, 미국 공개 제2011/0256224호에 기재된 바와 같은 아포지질단백질)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 나노입자는 다른 지질단백질-기반 나노입자, 예컨대 HDL, HDL-유사 지질단백질 입자 또는 합성 HDL-유사 입자를 포함한다(예를 들어, 미국 공개 제2009/0110739호; 및 미국 특허 제7,824,709호 참조).
일부 실시형태에서, 증가된 대식세포 표적화된 전달을 갖는 나노입자가 본 명세서에 기재된 바와 같은 조성물을 캡슐화하기 위해 사용된다. 일부 실시형태에서, 나노입자는 1,3-D-글루칸(문헌[Soto et al. (2012) J. Drug. Deliv. e143524]) 또는 만노실화된 키토산(MCS) 나노입자(문헌[Peng et al. (2015) J. Nanosci. Nanotechnol. 15:2619-2627])를 포함하는 GP 나노입자이다.
나노입자 제형은 탄수화물 담체를 포함하는 탄수화물 나노입자일 수 있다. 비-제한적 예로서, 탄수화물 담체는 무수물-변형된 파이토글리코겐 또는 글리코겐-유형 물질, 파이토글리코겐 옥텐일 석시네이트, 파이토글리코겐 베타-덱스트린, 무수물-변형된 파이토글리코겐 베타-덱스트린을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다(예를 들어, PCT 공개 WO 2012/109121 참조).
일부 실시형태에서, 지질 나노입자는 입자의 표면 특성을 변경하도록 조작되어 지질 나노 입자가 점막 장벽을 통과할 수 있다. 점액은 경구(예를 들어, 구강 및 식도 막 및 편도선 조직), 눈, 위장관(예를 들어, 위, 소장, 큰 창자, 결장, 직장), 비강, 호흡기(예를 들어, 비강, 인두, 기관 및 기관지 막), 생식기(예를 들어, 질, 자궁경부 및 요도 막)과 같지만 이들로 제한되지 않는 점막 조직에 위치한다. 더 높은 약물 캡슐화 효율과 광범위한 약물의 지속적인 전달을 제공하는 능력을 위해 선호되는 10㎚ 내지 200㎚보다 큰 나노 입자는 너무 커서 점막 장벽을 통해 빠르게 확산되지 않는 것으로 생각되었다. 점액은 지속적으로 분비, 배출, 폐기 또는 분해되고 재활용되므로, 갇힌 입자의 대부분은 몇 초 내에 또는 몇 시간 내에 점막 조직에서 제거될 수 있다. 점액을 통해 확산된 저분자량 폴리에틸렌 글리콜(PEG)로 조밀하게 코팅된 대형 중합체성 나노입자(직경 200㎚ 내지 500㎚)는 물에 확산되는 동일한 입자보다 4 내지 6 배 더 낮다(문헌[Lai et al. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104:1482-1487; Lai et al. (2009) Adv Drug Deliv Rev. 61:158-171]). 나노 입자의 수송은 광표백 후 형광 회복(fluorescence recovery after photo bleaching: FRAP) 및 고해상도 다중 입자 추적(high resolution multiple particle tracking: MPT)을 포함할 수 있지만 이들로 제한되지 않는 투과율 및/또는 형광 현미경 기법을 사용하여 결정될 수 있다. 비-제한적 예로서, 점막 장벽을 통과할 수 있는 조성물은 미국 특허 제8,241,670호에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다.
점막을 통과하도록 조작된 지질 나노입자는 중합체 물질(즉, 중합체성 코어) 및/또는 중합체-바이타민 접합체 및/또는 트라이-블록 공중합체를 포함할 수 있다. 중합체 물질은 폴리아민, 폴리에터, 폴리아마이드, 폴리에스터, 폴리카바메이트, 폴리우레아, 폴리카보네이트, 폴리(스타이렌), 폴리이미드, 폴리설폰, 폴리우레테인, 폴리아세틸렌, 폴리에틸렌, 폴리에틸렌이민, 폴리아이소사이아네이트, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴로나이트릴 및 폴리아릴레이트를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 중합체 물질은 생분해성 및/또는 생체적합성일 수 있다. 중합체 물질은 추가로 조사될(irradiated) 수 있다. 비-제한적 예로서, 중합체 물질은 감마선이 조사될 수 있다(예를 들어, PCT 공개 WO 2012/082165 참조). 특정 중합체의 비-제한적 예는 폴리(카프로락톤)(PCL), 에틸렌 바이닐 아세테이트 중합체(EVA), 폴리(락트산)(PLA), 폴리(L-락트산)(PLLA), 폴리(글리콜산)(PGA), 폴리(락트산-코-글리콜산)(PLGA), 폴리(L-락트산-코-글리콜산)(PLLGA), 폴리(D,L-락타이드)(PDLA), 폴리(L-락타이드)(PLLA), 폴리(D,L-락타이드-코-카프로락톤), 폴리(D,L-락타이드-코-카프로락톤-코-글리콜라이드), 폴리(D,L-락타이드-코-PEO-코-D,L-락타이드), 폴리(D,L-락타이드-코-PPO-코-D,L-락타이드), 폴리알킬 사이아노아크릴레이트, 폴리우레테인, 폴리-L-라이신(PLL), 하이드록시프로필 메타크릴레이트(HPMA), 폴리에틸렌글리콜, 폴리-L-글루탐산, 폴리(하이드록시산), 폴리무수물, 폴리오르토에스터, 폴리(에스터 아마이드), 폴리아마이드, 폴리(에스터 에터), 폴리카보네이트, 폴리알킬렌, 예컨대 폴리에틸렌 및 폴리프로필렌, 폴리알킬렌 글리콜, 예컨대 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG), 폴리알킬렌 옥사이드(PEO), 폴리알킬렌 테레프탈레이트, 예컨대 폴리(에틸렌 테레프탈레이트), 폴리바이닐 알코올(PVA), 폴리바이닐 에터, 폴리바이닐 에스터, 예컨대 폴리(바이닐 아세테이트), 폴리바이닐 할라이드, 예컨대 폴리(바이닐 클로라이드)(PVC), 폴리바이닐피롤리돈, 폴리실록산, 폴리스타이렌(PS), 폴리우레테인, 유도체화된 셀룰로스, 예컨대 알킬 셀룰로스, 하이드록시알킬 셀룰로스, 셀룰로스 에터, 셀룰로스 에스터, 나이트로 셀룰로스, 하이드록시프로필셀룰로스, 카복시메틸셀룰로스, 아크릴산의 중합체, 예컨대 폴리(메틸(메트)아크릴레이트)(PMMA), 폴리(에틸(메트)아크릴레이트), 폴리(뷰틸(메트)아크릴레이트), 폴리(아이소뷰틸(메트)아크릴레이트), 폴리(헥실(메트)아크릴레이트), 폴리(아이소데실(메트)아크릴레이트), 폴리(라우릴(메트)아크릴레이트), 폴리(페닐(메트)아크릴레이트), 폴리(메틸 아크릴레이트), 폴리(아이소프로필 아크릴레이트), 폴리(아이소뷰틸 아크릴레이트), 폴리(옥타데실 아크릴레이트) 및 이들의 공중합체 및 혼합물, 폴리다이옥사논 및 이의 공중합체, 폴리하이드록시알카노에이트, 폴리프로필렌 퓨마레이트, 폴리옥시메틸렌, 폴록사머, 폴리(오쏘)에스터, 폴리(뷰티르산), 폴리(발레르산), 폴리(락타이드-코-카프로락톤) 및 트라이메틸렌 카보네이트, 폴리바이닐피롤리돈을 포함한다. 지질 나노입자는 블록 공중합체 및 (폴리(에틸렌 글리콜))-(폴리(프로필렌 옥사이드))-(폴리(에틸렌 글리콜)) 삼중블록 공중합체와 같지만 이들로 제한되지 않는 공중합체로 코팅되거나 결합될 수 있다(예를 들어, 미국 공개 제2012/0121718호 및 제2010/0003337호; 및 미국 특허 제8,263,665호 참조). 공중합체는 일반적으로 안전한 것으로 간주되는(generally regarded as safe: GRAS) 중합체일 수 있으며, 지질 나노 입자의 형성은 새로운 화학 물질이 생성되지 않는 방식으로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 지질 나노입자는 인간 점액을 여전히 빠르게 통과할 수 있는 새로운 화학 물질을 형성하지 않고 PLGA 나노입자를 코팅하는 폴록사머를 포함할 수 있다(문헌[Yang et al. (2011) Angew. Chem. Int. Ed. 50:2597-2600]).
예를 들어, 본 발명에 포함되는 LNP는 PLGA-PEG 블록 공중합체(예를 들어, 미국 공개 제2012/0004293호 및 미국 특허 제8,236,330호 참조); PEG와 PLA 또는 PEG와 PLGA의 이중블록 공중합체(예를 들어, 미국 특허 제8,246,968호 참조); 다중블록 공중합체(예를 들어, 미국 특허 제8,263,665호 및 제8,287,910호 참조); 비-중합체성 마이셀 및 블록 공중합체를 포함하는 다중이온 복합체(예를 들어, 미국 공개 제2012/00768호 참조); 또는 폴리라이신, 폴리에틸렌 이민, 폴리(아미도아민) 덴드리머, 폴리(베타-아미노 에스터)와 같지만 이들로 제한되지 않는 아민-함유 중합체(예를 들어, 미국 특허 제8,287,849호 참조)를 포함할 수 있다.
본 발명에 포함되는 LNP는 아크릴 중합체와 같은 하나 이상의 다른 중합체를 포함할 수 있다. 아크릴 중합체는 아크릴산, 메타크릴산 및 메타크릴산 공중합체, 메틸 메타크릴레이트 공중합체, 에톡시에틸 메타크릴레이트, 사이아노에틸 메타크릴레이트, 아미노 알킬 메타크릴레이트 공중합체, 폴리(아크릴산), 폴리(메타크릴산), 폴리사이아노아크릴레이트 및 이들의 조합을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 발명에 포함되는 LNP는 다양이온 측쇄를 함유할 수 있는 적어도 하나의 분해성 폴리에스터를 포함할 수 있다. 분해성 폴리에스터는 폴리(세린 에스터), 폴리(L-락타이드-코-L-라이신), 폴리(4-하이드록시-L-프롤린 에스터) 및 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 다른 실시형태에서, 분해성 폴리에스터는 페길화된 중합체를 형성하기 위해 PEG 접합을 포함할 수 있다. LNP는 적어도 하나의 표적화 리간드를 더 포함할 수 있다. 표적화 리간드는 단일클론 항체(문헌[Kirpotin et al. (2006) Cancer Res. 66:6732-6740])와 같지만 이들로 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 리간드일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 조성물은 고체 지질 나노입자로 제형화될 수 있다. 고체 지질 나노입자(SLN)는 평균 직경이 10 내지 1000㎚인 구형 일 수 있다. SLN은 친유성 분자를 용해시킬 수 있고, 계면활성제 및/또는 유화제로 안정화될 수 있는 고체 지질 코어 매트릭스를 보유한다. 추가의 실시형태에서, 지질 나노입자는 자기-조립 지질-중합체 나노입자일 수 있다(예를 들어, 문헌[Zhang et al. (2008) ACS Nano 2:1696-1702] 참조).
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 작용제는 나노입자 또는 빠르게 제거되는 나노입자로 캡슐화된 것과 같은 지속 방출(sustained release) 제형일 수 있으며, 나노입자 또는 빠르게 제거되는 나노입자는 이어서 본 명세서에 기재되고/되거나 당업계에 공지되어 있는 중합체, 하이드로겔 및/또는 외과용 실란트로 캡슐화될 수 있다. 비-제한적 예로서, 중합체, 하이드로겔 또는 외과용 실란트는 PLGA, 에틸렌 바이닐 아세테이트(EVAc), 폴록사머, GELSITE®(나노테라퓨틱스 인코포레이션 플로리다주 알라추아), HYLENEX®(할로자임 테라퓨틱스, 캘리포니아주 샌디에고), 외과용 실란트, 예컨대 피브리노겐 중합체(에티콘 인코포레이션 조지아주 코넬리아), TISSELL®(백스터 인터내셔널 인코포레이션(Baxter International, Inc), 일리노이주 데어필드), PEG-기반 실란트 및 COSEAL®(백스터 인터내셔널 인코포레이션, 일리노이주 데어필드)일 수 있다. 다른 실시형태에서, 나노입자는 대상체에게 주입될 때 겔을 형성할 수 있는 당업계에 공지된 임의의 중합체로 캡슐화될 수 있다. 비-제한적 예로서, 나노입자는 생분해성일 수 있는 중합체 매트릭스로 캡슐화될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 조성물은 제어된 방출 나노입자로 제형화될 수 있다. 일 예에서, 제어된 방출 및/또는 표적화된 전달을 위한 나노입자 제형은 적어도 하나의 제어된 방출 코팅을 더 포함할 수 있다. 제어된 방출 코팅은 OPADRY®, 폴리바이닐피롤리돈/바이닐 아세테이트 공중합체, 폴리바이닐피롤리돈, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 하이드록시프로필 셀룰로스, 하이드록시에틸 셀룰로스, EUDRAGIT RL®, EUDRAGIT RS® 및 셀룰로스 유도체, 예컨대 에틸셀룰로스 수성 분산(AQUACOAT® 및 SURELEASE®)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 다른 예에서, 제어된 방출 및/또는 표적화된 전달 제형은 다양이온 측쇄를 함유할 수 있는 적어도 하나의 분해성 폴리에스터를 포함할 수 있다. 분해성 폴리에스터는 폴리(세린 에스터), 폴리(L-락타이드-코-L-라이신), 폴리(4-하이드록시-L-프롤린 에스터) 및 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
다른 실시형태에서, 분해성 폴리에스터는 페길화된 중합체를 형성하기 위해 PEG 접합을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 조성물은 제한 없이, ATUPLEX™ 시스템, DACC 시스템, DBTC 시스템 및 사일런스 테라퓨틱스(Silence Therapeutics)(영국, 런던)의 다른 접합체-리포플렉스 기술, 스템젠트®(STEMGENT®)(메사추세츠주 케임브리지)의 STEMFECT™ 및 치료제의 폴리에틸렌이민(PEI) 또는 프로타민-기반 표적화된 및 비-표적화된 전달과 같은 리포플렉스로서 제형화될 수 있다(문헌[Aleku et al. (2008) Cancer Res. 68: 9788-9798; Strumberg et al. (2012) Int. J. Clin. Pharmacol. Ther. (2012) 50:76-78; Santel et al. (2006) Gene Ther. 13:1222-1234; Santel et al. (2006) Gene Ther. 13:1360-1370; Gutbier et al. (2010) Pulm. Pharmacol. Ther. 23:334-344; Kaufmann et al. (2010) Microvasc. Res. 80:286-293; Weide et al. (2009) J. Immunother. 32:498-507; Weide et al. (2008) J. Immunother. 31:180-188; Pascolo (2004) Exp. Opin. Biol. Ther. 4:1285-1294; Fotin-Mleczek et al. (2011) J. Immunother. 34:1-15; Song et al. (2005) Nature Biotechnol. 23:709-717; Peer et al. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 6:4095-4100; 및 deFougerolles (2008) Hum. Gene Ther. 19:125-132]).
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 치료제 및 조성물은 합성 나노 담체에 캡슐화, 연결 및/또는 결합될 수 있다. 합성 나노담체는 국제 공개 WO 2010/005740, WO 2010/030763, WO 2012/13501, WO 2012/149252, WO 2012/149255, WO 2012/149259, WO 2012/149265, WO 2012/149268, WO 2012/149282, WO 2012/149301, WO 2012/149393, WO 2012/149405, WO 2012/149411 및 WO 2012/149454 및 미국 공개 제2011/0262491호, 제2010/0104645호, 제2010/0087337호 및 제2012/0244222호에 기재된 것들을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 다른 실시형태에서, 합성 나노담체 제형은 예를 들어, PCT 공개 WO 2011/072218 및 미국 특허 제8,211,473호에 기재된 방법에 의해 동결건조될 수 있다.
일부 실시형태에서, 합성 나노담체는 본 명세서에 기재된 접합체를 방출하기 위해 반응성기를 함유할 수 있다(예를 들어, PCT 공개 WO 2012/0952552 및 미국 공개 제2012/0171229호 참조). 일 실시형태에서, 합성 나노담체는 표적화된 방출을 위해 제형화될 수 있다. 일 실시형태에서, 합성 나노담체는 특정 pH에서 및/또는 원하는 시간 간격 후에 치료제를 방출하도록 제형화된다. 비-제한적 예로서, 합성 나노입자는 24시간 후 및/또는 pH 4.5에서 접합체를 방출하도록 제형화될 수 있다(예를 들어, PCT 공개 WO 2010/138193 및 WO 2010/138194 및 미국 공개 제2011/0020388호 및 제2011/0027217호 참조). 일부 실시형태에서, 합성 나노담체는 본 명세서에 기재된 접합체의 제어 및/또는 지속 방출을 위해 제형화될 수 있다. 비-제한적 예로서, 서방성 방출을 위한 합성 나노담체는 당업계에 공지되고, 본 명세서에 기재되고/되거나 PCT 공개 WO 2010/138192 및 미국 공개 제2010/0303850호에 기재된 방법에 의해 제형화될 수 있다.
일부 실시형태에서, 나노입자는 경구 투여용으로 최적화될 수 있다. 나노입자는 키토산 또는 이들의 유도체와 같지만 이들로 제한되지 않는 적어도 하나의 양이온성 생체고분자를 포함할 수 있다. 비-제한적 예로서, 나노입자는 미국 공개 제20120282343호에 기재된 방법에 의해 제형화될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 작용제는 또한 천연 및/또는 합성 중합체를 사용하여 제형화될 수 있다. 약물 전달에 사용될 수 있는 중합체의 비-제한적 예는 미러스® 바이오(MIRUS® Bio)(위스콘신주 매디슨) 및 로슈 매디슨(Roche Madison)(위스콘신주 매디슨)의 DYNAMIC POLYCONJUGATE®(애로우헤드 리서치 코포레이션(Arrowhead Research Corp.), 캘리포니아주 패서디나) 제형, PHASERX™ 중합체 제형, 예컨대, 제한 없이, SMARTT POLYMER TECHNOLOGY™(워싱턴주 시애틀), DMRI/DOPE, 폴록사머, 바이칼(Vical)(캘리포니아주 샌디에고)의 VAXFECTIN® 보조제, 키토산, 캐란도 파마슈티칼스(Calando Pharmaceuticals)(캘리포니아주 패서디나)의 사이클로덱스트린, 덴드리머 및 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA) 중합체, RONDEL™(RNAi/올리고뉴클레오타이드 나노입자 전달) 중합체(애로우헤드 리서치 코포레이션(arrowhead Research Corporation), 캘리포니아주 패서디나) 및 PHASERX™(워싱턴주 시애틀)와 같지만 이들로 제한되지 않는 pH 반응성 코-블록 중합체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 포함되는 작용제 및 조성물은 폴리(알킬렌 이민), 생분해성 양이온성 지질중합체, 생분해성 블록 공중합체, 생분해성 중합체 또는 생분해성 랜덤 공중합체, 생분해성 폴리에스터 블록 공중합체, 생분해성 폴리에스터 중합체, 생분해성 폴리에스터 랜덤 공중합체, 선형 생분해성 공중합체, PAGA, 생분해성 가교결합된 양이온성 다중-블록 공중합체 또는 이들의 조합을 포함하는 약제학적 화합물로 제형화될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 중합체는 중합체 표면에 대한 박테리아와 같지만 이로 제한되지 않는 원치않는 물질의 부착을 감소 및/또는 저해하기 위해 가공을 거칠 수 있다. 중합체는 공지되고/되거나 당업계에 기재되어 있고/있거나 PCT 공개 WO 2011/50467에 기재되어 있는 방법에 의해 가공될 수 있다.
나노입자는 하나 이상의 중합체를 함유할 수 있다. 중합체는 다음의 폴리에스터 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 본 명세서에서 "PGA"라 지칭되는 글리콜산 단위, 및 본 명세서에서 "PLA"로 총칭되는 락트산 단위, 예컨대 폴리-L-락트산, 폴리-D-락트산, 폴리-D,L-락트산, 폴리-L-락타이드, 폴리-D-락타이드 및 폴리-D,L-락타이드, 및 본 명세서에서 "PCL"로 총칭되는 카프로락톤 단위, 예컨대 폴리(ε-카프로락톤), 및 본 명세서에서 "PLGA"로 총칭되는 락트산 및 글리콜산 단위를 포함하는 공중합체, 예컨대 락트산:글리콜산의 비를 특징으로 하는 다양한 형태의 폴리(락트산-코-글리콜산) 및 폴리(락타이드-코-글리콜라이드), 및 폴리아크릴레이트, 및 이들의 유도체를 포함하는 단일중합체. 예시적 중합체는 또한 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 전술한 폴리에스터의 공중합체, 예컨대 본 명세서에서 "페길화된 중합체"로 총칭되는 다양한 형태의 PLGA-PEG 또는 PLA-PEG 공중합체를 포함한다. 소정의 실시형태에서, PEG 영역은 절단 가능한 링커에 의해 "페길화된 중합체"를 생성하기 위해 중합체와 공유적으로 결합될 수 있다.
나노입자는 하나 이상의 친수성 중합체를 함유할 수 있다. 친수성 중합체는 셀룰로스 중합체, 예컨대 전분 및 다당류; 친수성 폴리펩타이드; 폴리(아미노산), 예컨대 폴리-L-글루탐산(PGS), 감마-폴리글루탐산, 폴리-L-아스파르트산, 폴리-L-세린 또는 폴리-L-라이신; 폴리알킬렌 글리콜 및 폴리알킬렌 옥사이드, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜(PPG) 및 폴리(에틸렌 옥사이드)(PEO); 폴리(옥시에틸화된 폴리올); 폴리(올레핀 알코올); 폴리바이닐피롤리돈); 폴리(하이드록시알킬메타크릴아마이드); 폴리(하이드록시알킬메타크릴레이트); 폴리(사카라이드); 폴리(하이드록시산); 폴리(바이닐 알코올); 폴리옥사졸린; 및 이들의 공중합체를 포함한다.
나노입자는 하나 이상의 소수성 중합체를 함유할 수 있다. 적합한 소수성 중합체의 예는 폴리하이드록시산, 예컨대 폴리(락트산), 폴리(글리콜산) 및 폴리(락트산-코-글리콜산); 폴리하이드록시알카노에이트, 예컨대 폴리3-하이드록시뷰티레이트 또는 폴리4-하이드록시뷰티레이트; 폴리카프로락톤; 폴리(오르토에스터); 폴리무수물; 폴리(포스파젠); 폴리(락타이드-코-카프로락톤); 폴리카보네이트, 예컨대 타이로신 폴리카보네이트; 폴리아마이드(합성 및 천연의 폴리아마이드를 포함), 폴리펩타이드 및 폴리(아미노산); 폴리에스터아마이드; 폴리에스터; 폴리(다이옥사논); 폴리(알킬렌 알킬레이트); 소수성 폴리에터; 폴리우레테인; 폴리에터에스터; 폴리아세탈; 폴리사이아노아크릴레이트; 폴리아크릴레이트; 폴리메틸메타크릴레이트; 폴리실록산; 폴리(옥시에틸렌)/폴리(옥시프로필렌) 공중합체; 폴리케탈; 폴리포스페이트; 폴리하이드록시발러레이트; 폴리알킬렌 옥살레이트; 폴리알킬렌 석시네이트; 폴리(말레산)뿐만 아니라 이들의 공중합체를 포함한다.
소정의 실시형태에서, 소수성 중합체는 지방족 폴리에스터이다. 일부 실시형태에서, 소수성 중합체는 폴리(락트산), 폴리(글리콜산) 또는 폴리(락트산-코-글리콜산)이다.
나노입자 하나 이상의 양친매성 중합체를 함유할 수 있다. 양친매성 중합체는 소수성 중합체 블록 및 친수성 중합체 블록을 함유하는 중합체일 수 있다. 소수성 중합체 블록은 위의 소수성 중합체 또는 이의 유도체 또는 공중합체 중 하나 이상을 함유할 수 있다. 친수성 중합체 블록은 위의 친수성 중합체 또는 이의 유도체 또는 공중합체 중 하나 이상을 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 양친매성 중합체는 소수성 중합체로부터 형성된 소수성 말단 및 친수성 중합체로부터 형성된 친수성 말단을 함유하는 이중-블록 중합체이다. 일부 실시형태에서, 모이어티는 소수성 말단, 친수성 말단 또는 둘 다에 부착될 수 있다. 입자는 2개 이상의 양친매성 중합체를 함유할 수 있다.
중합체는 또한 폴리에텐, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리(l-라이신)(PLL), PLL에 그라프트된 PEG, 양이온성 지질중합체, 생분해성 양이온성 지질중합체, 폴리에틸렌이민(PEI), 가교결합된 분지형 폴리(알킬렌 이민), 폴리아민 유도체, 변형된 폴록사머, 생분해성 중합체, 탄성 생분해성 중합체, 생분해성 블록 공중합체, 생분해성 랜덤 공중합체, 생분해성 폴리에스터 공중합체, 생분해성 폴리에스터 블록 공중합체, 생분해성 폴리에스터 블록 랜덤 공중합체, 다중블록 공중합체, 선형 생분해성 공중합체, 폴리[α-(4-아미노뷰틸)-L-글리콜산)(PAGA), 생분해성 가교결합된 양이온성 다중-블록 공중합체, 폴리카보네이트, 폴리무수물, 폴리하이드록시산, 폴리프로필퓨머레이트, 폴리카프로락톤, 폴리아마이드, 폴리아세탈, 폴리에터, 폴리에스터, 폴리(오르토에스터), 폴리사이아노아크릴레이트, 폴리바이닐 알코올, 폴리우레테인, 폴리포스파젠, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리사이아노아크릴레이트, 폴리우레아, 폴리스타이렌, 폴리아민, 폴리라이신, 폴리(에틸렌 이민), 폴리(세린 에스터), 폴리(L-락타이드-코-L-라이신), 폴리(4-하이드록시-L-프롤린 에스터), 아크릴 중합체, 아민-함유 중합체, 덱스트란 중합체, 덱스트란 중합체 유도체 또는 이들의 조합을 포함할 수 있지만 이들로 제한되지 않는다.
중합체는 가교 가능한 폴리에스터일 수 있다. 가교 가능한 폴리에스터는 당업계에 공지되어 있고, 미국 공개 제2012/0269761호에 기재된 것들을 포함한다.
나노입자는 하나 이상의 생분해성 중합체를 함유할 수 있다. 생분해성 중합체는 물에 불용성이거나 난용성이고, 체내에서 화학적으로 또는 효소적으로 수용성 물질로 전환되는 중합체를 포함할 수 있다. 생분해성 중합체는 가교결합된 중합체를 물에 불용성 또는 난용성으로 만들기 위해 수소화 가능한 가교-결합기에 의해 가교결합된 가용성 중합체를 포함할 수 있다.
생분해성 중합체는 폴리아마이드, 폴리카보네이트, 폴리알킬렌, 폴리알킬렌 글리콜, 폴리알킬렌 옥사이드, 폴리알킬렌 테레프탈레이트, 폴리바이닐 알코올, 폴리바이닐 에터, 폴리바이닐 에스터, 폴리바이닐 할라이드, 폴리바이닐피롤리돈, 폴리글리콜라이드, 폴리실록산, 폴리우레테인 및 이의 공중합체, 알킬 셀룰로스, 예컨대 메틸 셀룰로스 및 에틸 셀룰로스, 하이드록시알킬 셀룰로스, 예컨대 하이드록시프로필 셀룰로스, 하이드록시-프로필 메틸 셀룰로스 및 하이드록시뷰틸 메틸 셀룰로스, 셀룰로스 에터, 셀룰로스 에스터, 나이트로 셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트, 셀룰로스 프로피오네이트, 셀룰로스 아세테이트 뷰티레이트, 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트, 카복실에틸 셀룰로스, 셀룰로스 트라이아세테이트, 셀룰로스 설페이트 소듐 염, 아크릴 및 메타크릴 에스터의 중합체, 예컨대 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(에틸메타크릴레이트), 폴리(뷰틸메타크릴레이트), 폴리(아이소뷰틸메타크릴레이트), 폴리(헥실메타크릴레이트), 폴리(아이소데실메타크릴레이트), 폴리(라우릴 메타크릴레이트), 폴리(페닐 메타크릴레이트), 폴리(메틸 아크릴레이트), 폴리(아이소프로필 아크릴레이트), 폴리(아이소뷰틸 아크릴레이트), 폴리(옥타데실 아크릴레이트), 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리(에틸렌 테레프탈레이트), 폴리(바이닐 알코올), 폴리(바이닐 아세테이트, 폴리 바이닐 클로라이드 폴리스타이렌 및 폴리바이닐피롤리돈, 이들의 유도체, 선형 및 분지형 공중합체 및 이의 블록 공중합체 및 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 예시적 생분해성 중합체는 폴리에스터, 폴리(오르토 에스터), 폴리(에틸렌 이민), 폴리(카프로락톤), 폴리(하이드록시알카노에이트), 폴리(하이드록시발러레이트), 폴리무수물, 폴리(아크릴산), 폴리글리콜라이드, 폴리(우레테인), 폴리카보네이트, 폴리포스페이트 에스터, 폴리포스파젠, 이들의 유도체, 선형 및 분지형 공중합체 및 이의 블록 공중합체 및 이의 혼합물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 입자는 생분해성 폴리에스터 또는 폴리무수물, 예컨대 폴리(락트산), 폴리(글리콜산) 및 폴리(락틱-코-글리콜산)을 함유한다.
분해성 폴리에스터는 다양이온 측쇄를 함유할 수 있다. 분해성 폴리에스터는 폴리(세린 에스터), 폴리(L-락타이드-코-L-라이신), 폴리(4-하이드록시-L-프롤린 에스터) 및 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 다른 실시형태에서, 분해성 폴리에스터는 페길화된 중합체를 형성하기 위해 PEG 접합을 포함할 수 있다.
생분해성 양이온성 지질중합체는 미국 특허 제6,696,038호 및 미국 공개 제2003/0073619호 및 제2004/0142474호에 기재된 것들과 같은 당업계에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 폴리(알킬렌 이민)은 미국 공개 제2010/0004315호에 기재된 것들과 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 생분해성 중합체, 생분해성 블록 공중합체, 생분해성 랜덤 공중합체, 생분해성 폴리에스터 블록 공중합체, 생분해성 폴리에스터 중합체 또는 생분해성 폴리에스터 랜덤 공중합체는 미국 특허 제6,517,869호 및 제6,267,987호에 기재된 것들과 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 선형 생분해성 공중합체는 미국 특허 제6,652,886호에 기재된 것들과 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. PAGA 중합체는 미국 특허 제6,217,912호에 기재된 것들과 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. PAGA 중합체는 폴리-L-라이신, 폴리아르기닌, 폴리오르니틴, 히스톤, 아비딘, 프로타민, 폴리락타이드 및 폴리(락타이드-코-글리콜라이드)와 같지만 이들로 제한되지 않는 중합체와 공중합체 또는 블록 공중합체를 형성하기 위해 공중합체화될 수 있다. 생분해성 가교결합된 양이온성 다중-블록 공중합체는 미국 특허 제8,057,821호 및 미국 공개 제2012/009145호에 기재된 것들과 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 다중-블록 공중합체는 분지형 폴리에틸렌이민과 비교하여 별개의 패턴을 갖는 선형 폴리에틸렌이민(LPEI) 블록을 사용하여 합성될 수 있다.
본 명세서에 기재된 중합체는 지질-종결 PEG에 접합될 수 있다. 비-제한적 예로서, PLGA는 PLGA-DSPE-PEG를 형성하는 지질-종결 PEG에 접합될 수 있다. 다른 비-제한적 예로서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 PEG 접합체는 PCT 공개 WO 2008/103276에 기재되어 있다. 중합체는 미국 특허 제8,273,363호에 기재된 접합체와 같지만 이들로 제한되지 않는 리간드 접합체를 사용하여 접합될 수 있다.
중합체 나노입자는 또한 키토산을 포함할 수 있다. 키토산 제형은 양으로 하전된 키토산의 코어 및 음으로 하전된 기질의 외부 부분을 포함한다(예를 들어, 미국 공개 제2012/0258176호 참조). 키토산은 N-트라이메틸 키토산, 모노-N-카복시메틸 키토산(MCC), N-팔미토일 키토산(NPCS), EDTA-키토산, 저분자량 키토산, 키토산 유도체 또는 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
중합체 나노입자는 또한 PLGA를 포함할 수 있다. PLGA 제형은 PLGA 주사용 데포(예를 들어, 66% N-메틸-2-피롤리돈(NMP)에 PLGA를 용해시켜 형성되는 ELIGARD® 및 나머지는 수성 용매 및 류프롤라이드)를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 일단 주입되면, PLGA와 류프롤라이드 펩타이드는 피하 공간으로 침전된다. 다른 예에서, PLGA 마이크로스피어는 조정 가능한 방출 속도(예를 들어,일 및 주)를 갖는 PLGA 마이크로스피어를 제조하고, 캡슐화 과정 동안 작용제의 온전성을 유지하면서 활성제를 PLGA로 캡슐화함으로써 제형화될 수 있다.
일부 실시형태에서, 전임상의 지속 방출 임플란트 응용분야에서 널리 사용되는 비-생분해성의, 생체적합성 중합체인 Evac(예를 들어, 녹내장용 필로카르핀 안과 삽입물인 연장 방출 제품 Ocusert 또는 지연 방출 프로게스테론 자궁내 장치인 프로게스타서트(progestasert); 경피 전달 시스템인 테스토덤, 듀라게식 및 셀레길린; 및 카테터)이 사용될 수 있다. 폴록사머 F-407 NF는 5℃ 미만의 온도에서 낮은 점도를 갖는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌의 친수성의, 비-이온성 계면활성제 삼중블록 공중합체이며, 15℃ 초과의 온도에서 고체 겔을 형성한다. PEG-기반 외과용 실란트는 전달 장치에 혼합된 2개의 합성 PEG 성분으로 구성되며, 1분 안에 준비되고, 3분 안에 밀봉되며, 30일 이내에 재흡수될 수 있다. GELSITE® 및 천연의 중합체는 투여 부위에서 인 시투 겔화가 가능하다. 이들은 안정화 효과를 제공하기 위해 이온 상호작용을 통해 단백질 및 펩타이드 치료 후보와 상호작용하는 것으로 나타났다.
본 발명에 따라 유용한 중합체 나노 입자의 다른 대표적인 예는 미국 특허 제6,177,274호에 개시된 바와 같은 PLL로 그라프트된 PEG의 중합체 화합물뿐만 아니라 양이온성 중합체를 갖는 용액 또는 매질, 건조 약제학적 조성물 또는 미국 공개 제2009/0042829호 및 제2009/0042825호에 기재된 바와 같이 건조될 수 있는 용액 내의 현탁액을 포함한다.
폴리아민 유도체는 본 발명에 포함되는 치료제 및 조성물을 전달하거나 또는 질환을 치료 및/또는 예방하는데 사용될 수 있거나, 또는 이식 가능하거나 주사용 장치에 포함될 수 있다(미국 공개 제2010/0260817호). 비-제한적 예로서, 본 발명에 포함되는 작용제는 탄수화물 다이아자이드 모노머를 올리고아민을 포함하는 다이알카인 단위와 배합하여 제조된 1,3-이극성 부가 중합체를 포함하는 폴리아마이드 중합체를 사용하여 전달될 수 있다(미국 특허 제8,236,280호).
다른 중합체는 아크릴 중합체, 예컨대 아크릴산, 메타크릴산, 아크릴산 및 메타크릴산 공중합체, 메틸 메타크릴레이트 공중합체, 에톡시에틸 메타크릴레이트, 사이아노에틸 메타크릴레이트, 아미노 알킬 메타크릴레이트 공중합체, 폴리(아크릴산), 폴리(메타크릴산), 폴리사이아노아크릴레이트 및 이들의 조합; 또는 폴리라이신, 폴리에틸렌 이민, 폴리(아미도아민) 덴드리머 또는 이들의 조합과 같지만 이들로 제한되지 않는 아민-함유 중합체; 또는 PEG-전하 전환성 중합체를 포함할 수 있다(문헌[Pitella et al. (2011) Biomat. 32:3106-3114]).
중합체 나노입자는 이중블록 공중합체를 더 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 이중블록 공중합체는 폴리에틸렌, 폴리카보네이트, 폴리무수물, 폴리하이드록시산, 폴리프로필퓨머레이트, 폴리카프로락톤, 폴리아마이드, 폴리아세탈, 폴리에터, 폴리에스터, 폴리(오르토에스터), 폴리사이아노아크릴레이트, 폴리바이닐 알코올, 폴리우레테인, 폴리포스파젠, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리사이아노아크릴레이트, 폴리우레아, 폴리스타이렌, 폴리아민, 폴리라이신, 폴리(에틸렌 이민), 폴리(세린 에스터), 폴리(L-락타이드-코-L-라이신), 폴리(4-하이드록시-L-프롤린 에스터) 또는 이들의 조합과 같지만 이들로 제한되지 않는 중합체와 결합된 PEG를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 작용제는 PLGA-PEG 블록 공중합체(예를 들어, 미국 공개 US 2012/0004293 및 미국 특허 제8,236,330호 참조) 또는 PLGA-PEG-PLGA 블록 공중합체(예를 들어, 미국 특허 제6,004,573호 참조)로 제형화될 수 있다. 비-제한적 예로서, 본 발명에 포함되는 작용제는 PEG와 PLA 또는 PEG와 PLGA의 이중블록 공중합체로 제형화될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제8,246,968호).
일부 실시형태에서, 중합체 나노입자는 친수성-소수성 중합체(예를 들어, PEG-PLGA), 소수성 중합체(예를 들어, PEG) 및/또는 친수성 중합체(예를 들어, PCT 공개 WO 2012/0225129 참조)와 같지만 이들로 제한되지 않는 다수의 중합체를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 중합체 나노입자는 치료 나노입자로 제형화될 수 있다. 치료 나노입자는 본 명세서에 기재되고, PCT 공개 WO 2010/005740, WO 2010/030763, WO 2010/005721, WO 2010/005723 및 WO 2012/054923 및 미국 공개 제2011/0262491호, 제2010/0104645호, 제2010/0087337호, 제2010/0068285호, 제2011/0274759호, 제2010/0068286호 및 제2012/0288541호 및 미국 특허 제8,206,747호; 제8,293,276호; 제8,318,208호; 및 제8,318,211호와 같지만 이들로 제한되지 않는 당업계에 공지된 방법 및 중합체에 의해 제형화될 수 있다. 치료 중합체 나노입자는 미국 공개 제2012/0140790호에 기재된 방법에 의해 확인될 수 있다.
중합체 제형은 또한 폴레이트, 트랜스페린 및 N-아세틸갈락토사민(GalNAc)으로 예시되는 바와 같지만 이들로 제한되지 않는 상이한 리간드의 발현을 통해 선택적으로 표적화될 수 있다(문헌[Benoit et al. (2011) Biomacromol. 12:2708-2714; Rozema et al. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104:12982-12887; Davis (2009) Mol. Pharm. 6:659-668; Davis (2010) Nature 464:1067-1070]).
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 중합체 제형은 양이온성 담체를 포함할 수 있는 중합체 제형을 콜레스테롤 및 폴리에틸렌 글리콜기에 공유결합될 수 있는 양이온성 지질중합체와 접촉시킴으로써 안정화될 수 있다. 중합체 제형은 미국 공개 제2009/0042829호에 기재된 방법을 사용하여 양이온성 지질중합체와 접촉될 수 있다. 양이온성 담체는 폴리에틸렌이민, 폴리(트라이메틸렌이민), 폴리(테트라메틸렌이민), 폴리프로필렌이민, 아미노글리코사이드-폴리아민, 다이데옥시-다이아미노-b-사이클로덱스트린, 스퍼민, 스퍼미딘, 폴리(2-다이메틸아미노)에틸 메타크릴레이트, 폴리(라이신), 폴리(히스티딘), 폴리(아르기닌), 양이온화된 젤라틴, 덴드리머, 키토산, 1,2-다이올레오일-3-트라이메틸암모늄-프로페인(DOTAP), N-[1-(2,3-다이올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트라이메틸암모늄클로라이드(DOTMA), 1-[2-(올레오일옥시)에틸]-2-올레일-3-(2-하이드록시에틸)이미다졸리늄 클로라이드(DOTIM), 2,3-다이올레일옥시-N-[2(스퍼민카복사미도)에틸]-N,N-다이메틸-1-프로판아미늄 트라이플루오로아세테이트(DOSPA), 3B-[N―(N',N'-다이메틸아미노에테인)-카바모일]콜레스테롤 하이드로클로라이드(DC-콜레스테롤 HCl) 다이헵타데실아미도글리실 스퍼미딘(DOGS), N,N-다이스테아릴-N,N-다이메틸암모늄브로마이드(DDAB), N-(1,2-다이미리스틸옥시프로프-3-일)-N,N-다이메틸-N-하이드록시에틸 암모늄브로마이드(DMRIE), N,N-다이올레일-N,N-다이메틸암모늄클로라이드(DODAC) 및 이들의 조합을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 발명에 포함되는 접합체는 하나 이상의 중합체의 폴리플렉스로 제형화될 수 있다(예를 들어, 미국 공개 제2012/0237565호 및 제2012/0270927호 참조). 일 실시형태에서, 폴리플렉스는 2개 이상의 양이온성 중합체를 포함한다. 양이온성 중합체는 선형 PEI와 같은 폴리(에틸렌 이민)(PEI)을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 다른 형태의 나노입자가 사용될 수 있다.
예를 들어, 본 발명에 포함되는 작용제 및 조성물은 중합체, 리피드 및/또는 칼슘 포스페이트와 같지만 이들로 제한되지 않는 다른 생분해성 작용제의 조합을 사용하여 나노입자로 제형화될 수 있다. 성분은 나노 입자의 미세 조정을 허용하여 본 발명에 포함되는 조성물을 전달할 수 있게 하기 위해 코어-쉘, 하이브리드및/또는 층별 구조로 결합될 수 있다. 리피드 및/또는 중합체와 조합되는 생분해성 칼슘 포스페이트 나노입자는 생체내에서 치료제를 전달하는 것으로 나타났다. 일 실시형태에서, 아니스아마이드와 같은 표적화 리간드를 또한 함유할 수 있는 지질 코팅된 칼슘 포스페이트 나노입자가 본 발명에 포함되는 조성물을 전달하기 위해 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Li et al. (2010) J. Contr. Rel. 142:416-421; Li et al. (2012) J. Contr. Rel. 158:108-114; Yang et al. (2012) Mol. Ther. 20:609-615] 참조). 이러한 전달 시스템은 작용제의 전달을 개선하기 위하여, 표적화된 나노 입자 및 엔도솜 탈출을 향상시키는 성분인 칼슘 포스페이트를 결합한다.
일부 실시형태에서, 입자는 위에 기재된 바와 같은 하나 이상의 접합체 및 반대 이온에 의해 형성되는 소수성 이온-쌍 복합체 또는 소수성 이온-쌍일 수 있다.
일부 실시형태에서, 코어-쉘 나노입자는 약제학적 제형에 사용될 수 있다. 코어-쉘 나노입자의 사용은 양이온성 가교 나노겔 코어 및 다양한 쉘을 합성하기 위해 고 처리량 접근법에 추가로 초점을 맞추었다(문헌[Siegwart et al. (2011) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108:12996-13001]). 중합체성 나노입자의 복합체화, 전달 및 내재화는 나노 입자의 코어 및 쉘 성분 모두에서 화학적 조성을 변경함으로써 정밀하게 제어될 수 있다. 예를 들어, 코어-쉘 나노입자는 콜레스테롤을 나노 입자에 공유적으로 부착시킨 후 마우스 간세포에 치료제를 효율적으로 전달할 수 있다. 본 발명에 포함되는 조성물과 함께 사용하기 위한 코어-쉘 나노 입자가 기재되어 있으며, 미국 특허 제8,313,777호에 기재된 방법에 의해 형성될 수 있다.
무기 나노입자는 물리적, 화학적, 광학적 및 전기적 특성의 조합을 나타내며, 질환을 이미징 및 진단하고, 치료제를 선택적으로 전달하고, 민감한 세포와 조직을 치료 양생법에 전달하는 고도의 다기능 플랫폼을 제공한다. 임의의 이론에 얽매이기를 바라는 것은 아니지만, 무기 나노입자의 향상된 투과성 및 유지(enhanced permeability and retention: EPR) 효과는 많은 고분자량 약물의 선택적 축적을 위한 기초를 제공한다. 순환하는 무기 나노입자는 우선적으로 종양 부위 및 염증이 있는 조직에 축적되며(문헌[Yuan et al. (1995) Cancer Res. 55:3752-3756]), 이들의 낮은 확산률로 인해 머물러 있다(문헌[Pluen et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:4628-4633]). 무기 나노입자의 크기는 10nm 내지 500㎚, 10nm 내지 100nm 또는 100nm 내지 500nm일 수 있다. 무기 나노입자는 금속(금, 철, 은, 구리, 니켈 등), 옥사이드(ZnO, TiO2, Al2O3, SiO2, 산화철, 구리 옥사이드, 니켈 옥사이드 등) 또는 반도체(CdS, CdSe 등)을 포함할 수 있다. 무기 나노입자는 또한 퍼플루오로카본 또는 FeCo일 수 있다.
무기 나노입자는 단위 부피당 표면적이 크다. 따라서, 이들은 고밀도로 치료 약물 및 조영제를 로딩할 수 있다. 치료 약물을 무기 나노입자 내/위로 로딩하기 위해, 공유 결합, 정전기 상호 작용, 포획 및 캡슐화를 포함하지만 이로 제한되지 않는 다양한 방법이 사용될 수 있다. 치료제 약물 로딩 외에도, 무기 나노입자는 표면에서 종양-표적화 리간드와 같은 표적화 모이어티로 기능화될 수 있다. 무기 나노입자로 치료제를 제형화하느 것은 치료제의 이미징, 검출 및 모니터링을 가능하게 한다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 작용제 및 조성물은 소수성이며, 수용성 양쪽이온성 리간드로 기능화된 금 나노입자와 동역학적으로 안정한 복합체를 형성할 수 있다(예를 들어, 문헌[Kim et al. (2009) JACS 131:1360-1361] 참조).
본 발명에 포함되는 작용제 및 조성물은 금 나노쉘로 제형화될 수 있다. 비-제한적 예로서, 조성물은 중합체 및 금 나노쉘을 포함하는 온도 민감성 시스템으로 전달될 수 있고, 광열적으로(photothermally) 방출될 수 있다(예를 들어, 문헌[Sershen et al. (2000) J. Biomed. Mater. 51:293-298] 참조). 1064㎚의 조사는 나노쉘에 의해 흡수되고 열에 의해 전환되어 수소의 붕괴와 약물의 방출을 초래한다. 작용제는 또한 예를 들어, 작용제와 나노입자 간의 공유 결합에 의해 중공 금 나노쉘 내부에 캡슐화될 수 있다. 금 나노입자에 대한 공유 부착은 링커, 예컨대 유리 티올, 아민 또는 카복실레이트 작용기를 통해 달성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 링커는 금 나노입자의 표면에 위치한다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 작용제는 링커를 포함하도록 변형될 수 있다. 링커는 생물학적 환경에서 입자의 안정성을 증가시키고 약물 로딩의 밀도를 제어하기 위해 다양한 길이를 갖는 PEG 또는 올리고에틸렌 글리콜 모이어티를 포함할 수 있다. PEG 또는 올리고에틸렌 글리콜 모이어티는 또한 원치않는 생체 분자의 비특이적 흡착을 최소화한다. PEG 또는 올리고에틸렌 글리콜 모이어티는 분지형 또는 선형(예를 들어, 문헌[Tong et al. (2009) Langmuir 25:12454-12549] 참조)일 수 있다. 본 발명에 포함되는 작용제는 아민-기능화된 금 나노입자에 연결될 수 있다(예를 들어, 문헌[Lippard et al. (2009) JACS 131:14652-14653] 참조). pT(IV)-금 나노입자 복합체에 대한 세포독성 효과는 유리 Pt(IV) 약물 및 유리 시스플라틴보다 높다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 작용제는 철, 코발트, 니켈 및 이들의 산화물 또는 수산화철 나노입자로 만들어진 것과 같은 자성 나노 입자로 제형화될 수 있다. 국소 자기장 구배는 자성 나노입자를 선택된 부위로 끌어 당기고, 치료가 완료될 때까지 유지한 다음 제거하는데 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Alexiou et al. (2000) Cancer Res. 60:6641-6648] 참조). 일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 작용제는 링커를 사용하여 자성 나노입자에 결합될 수 있다. 링커는 작용제를 방출하기 위해 분자내 고리화를 겪을 수 있는 링커일 수 있다. 개시된 임의의 링커 및 나노입자가 사용될 수 있다(예를 들어, PCT 공개 WO 2014/124329 참조). 고리화는 자성 나노입자를 가열함으로써, 또는 자성 나노입자에 교류전자기장을 인가함으로써 유도될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 작용제는 산화철 나노입자에 로딩된다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 작용제는 산화철(SPION)로 이루어진 코어에 기반한 수퍼 상자성 나노입자로 제형화된다. SPION은 무기 물질(실리카, 금 등) 또는 유기 물질(포스포리피드, 지방산, 다당류, 펩타이드 또는 다른 계면활성제 및 중합체)로 코팅되며, 약물, 단백질 또는 플라스미드로 더 기능화될 수 있다.
일 실시형태에서, 작용제를 전달하는데 사용될 수 있는 수분산성 올레산(OA)-폴록사머-코팅된 산화철 자성 나노입자가 사용된다(예를 들어, 문헌[Jain Mol. Pharm. (2005) 2:194-205] 참조). 작용제는 산화철 나노입자를 둘러싸는 OA 쉘로 분할될 수 있으며, 폴록사머 공중합체(예를 들어, 플루로닉)는 제형에 수분산성을 부여한다.
일부 실시형태에서, 포스페이트 모이어티를 갖는 나노입자는 본 발명에 포함되는 작용제를 전달하는데 사용된다(예를 들어, 미국 특허 제8,828,975호 참조). 나노입자는 금, 산화철, 이산화 티탄, 산화 아연, 산화 주석, 산화 구리, 알루미늄, 카드뮴 셀레나이드, 이산화 규소 및/또는 다이아몬드를 포함할 수 있다. 나노입자는 표면에 PEG 모이어티를 함유할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 작용제는 대식세포 및 다른 면역 세포와 같은 세포의 투과성을 증가시키기 위해 펩타이드 및/또는 다른 접합체로 제형화될 수 있다. 일 실시형태에서, 세포 침투 펩타이드 및 세포내 전달을 가능하게 하는 단백질 및 펩타이드와 같지만 이들로 제한되지 않는 펩타이드는 약제학적 제형을 전달하는데 사용될 수 있다. 본 발명에 포함되는 작용제와 함께 사용될 수 있는 세포-침투 펩타이드의 비-제한적 예는 세포내 공간으로 전달을 용이하게 하는 다양이온에 부착된 세포-침투 펩타이드 서열, 예를 들어 HIV-유래 TAT 펩타이드, 페네트라틴, 트랜스포탄 또는 hCT 유래 세포-침투 펩타이드를 포함한다(예를 들어, 문헌[Caron et al. (2001) Mol. Ther. 3:310-318; Langel, Cell-Penetrating Peptides: Processes and Applications (CRC Press, Boca Raton FL, 2002); El-Andaloussi et al. (2003) Curr. Pharm. Des. 11:3597-35611; 및 Deshayes et al. (2005) Cell. Mol. Life Sci. 62:1839-1849]).
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 작용제는 표적 세포(예를 들어, 단핵구, 대식세포 등)로의 활성제(예를 들어, siRNA 분자)의 전달을 향상시키는 하나 이상의 접합체를 더 포함할 수 있다. 접합체는 특히 관심있는 세포를 표적화하기 위해 지질 제형에 혼입될 수 있는 리간드일 수 있다. 지질 입자 약물 전달에 리간드 표적화 전략을 사용하면 잠재적으로 표적 특이성이 증가하며, 세포내 전달을 촉발하기 위해 양이온성 지질이 필요가 없다는 이점이 있다. 리간드는 단핵 포식세포 특성 수용체 발현 및 식세포의 선천적 과정을 사용하는 펩타이드, 항체, 단백질, 다당류, 글리코리피드, 당단백질 및 렉틴을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 접합된 리간드는 세포-특이적 표적화 및 세포 흡수를 향상시킬 수 있는 세포 표적화 펩타이드(cell targeting peptide: CTP) 또는 세포-침투 펩타이드(cell-penetrating peptide: CPP)일 수 있다. 펩타이드의 몇 가지 예는 단핵구와 선택적으로 결합된 무라밀 트라이펩타이드(MTP), RGD 펩타이드, GGP-펩타이드를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다(문헌[Karathanasis et al. (2009) Ann. Biomed. Engin. 37:1984-1992]). 대식세포 펩타이드 표적화 작용제는 또한 파지 디스플레이 및 시퀀싱으로부터 확인된 것들을 포함할 수 있다(예를 들어, 문헌[Liu et al. (2015) Bioconjug. Chem. 26:1811-1817] 참조). 일부 실시형태에서 리간드는 항체 및 이의 단편일 수 있으며, 단핵구 및 대식세포에 특이적인 예시적 항체는 항-VCAM-1 항체, 항-CC52 항체, 항-CC531 항체, 항-CD11c/DEC-205 항체를 포함한다. 예를 들어, 항체는 리포솜의 표면에 결합되거나 Fc 영역을 통해 리포솜이 부착된 PEG에 대해 말단으로 결합될 수 있다.
일부 실시형태에서, 나노입자는 알킬 만노사이드, Mann-C4-Chol, Mann-His-C4-Chol, Man2DOG, 4-아미노페닐-a-D-만노피라노사이드, 아미노페닐-α-D-만노피라노사이드 및 Man3-DPPE와 같은 렉틴인 지질 입자로 혼입함으로써 만노실화될 수 있다. 폐포낭 대식세포, 복막 대식세포, 단핵구-유래 수지상 세포 및 쿠퍼 세포를 포함하는 면역세포는 고수준의 만노스 수용체(MR)를 구성적으로 발현한다. 대식세포 및 DC는 만노실화된 지질 나노입자를 통해 표적화될 수 있다.
다른 리간드는 또한 말레일화된 소 혈청 알부민(maleylated bovine serum albumin: MBSA), O-스테아로일 아밀로펙틴(O-SAP) 및 피브로넥틴을 포함할 수 있다(예를 들어, 문헌[Ahsan et al. (2002) J. Cont. Rel. 79:29-40; Vyas et al. (2004) Intl. J. Pharm. 269:37-49] 참조).
VII. 투여 및 투여
본 명세서에 기재된 작용제(예를 들어, 조성물 및 제형)는 목적하는 대상(예를 들어, 세포, 무세포 결합 파트너 등)과 접촉할 수 있고/있거나 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 유기체에 투여될 수 있다. 예를 들어, 작용제는 양이온성 리포솜 및 중합체와 같은 화학적 방법 또는 유전자 총, 전기 천공, 입자 충격, 초음파 이용 및 자기감염과 같은 물리적 방법을 통해 세포로 전달될 수 있다.
접촉 대식세포에 투여하는 방법은 특히 대식세포가 조직 유형에 걸쳐 일반적으로 존재하기 때문에 당업계에 잘 알려져 있다(문헌[Ries et al. (2014) Cancer Cell 25:846-859; Perry et al. (2018) J. Exp. Med. 215:877-893; Novobrantseva et al. (2012) Mol. Ther. Nucl. Acids 1:e4; Majmudar et al. (2013) Circulation 127:2038-2046; Leuschner et al. (2011) Nat. Biotechnol. 29:11] 참조). 또한, 투여 방법은 예를 들어, 공간적으로 제한된 대식세포의 집단을 표적화하기 위해 작용제의 국소 투여를 사용함으로써, 관심있는 대식세포 집단을 표적화하기 위해 조정될 수 있다(예를 들어, TAM을 표적으로 하기 위한 종양내 투여)(문헌[Shirota et al. (2012) J. Immunol. 188:1592-1599; Wang et al. (Oct. 2016) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 113:11525-11530] 참조). 이러한 차별적 투여 방법은 다른 대 식세포 집단과의 접촉을 줄이거나 제거하면서 관심있는 대식세포 집단을 선택적으로 표적화(예를 들어, 순환하는 대식세포로부터 선택적으로 TAM을 표적으로 하는 종양내 투여)할 수 있다.
작용제는 치료적으로 유효한 결과를 가져오는 임의의 경로에 의해 유효량으로 투여될 수 있다. 투여 경로는 장내(장으로), 위장, 경막외(경막 내로), 경구(입을 통해), 경피, 경막주위, 뇌내(대뇌로), 뇌실내(대뇌 뇌실로), 표피(피부에 적용), 피내(피부 자체에), 피하(피부 아래), 비강 투여(코를 통해), 정맥내(정맥으로), 정맥내 볼루스, 정맥내 점적, 동맥내(동맥으로), 근육내(근육으로), 심장내(심장으로), 골수내 주입(골수로), 척수강내(척수 관으로), 복강내,(복막으로 주입 또는 주사), 방광내 주입, 유리체내,(눈을 통해), 해면내 주사(병리학적 공동으로), 강내(음경 기저로), 질내 투여, 자궁내, 양수외 투여, 경피(전신 분포를 위해 온전한 피부를 통한 확산), 경점막(점막을 통한 확산), 경질, 흡입(코흡입), 설하, 입술밑, 관장, 점안액(결막으로), 이어 드롭으로, 귀(귀내 또는 귀를 통해), 협측(뺨쪽으로 향함), 결막, 피부, 치과(치아 또는 치아들로), 전기 삼투, 자궁경부, 내시경, 기관내, 체외, 혈액 투석, 침윤, 간질, 복강내, 양막내, 관절내, 담도내, 기관지내, 점액내, 연골내(연골 내로), 미추내(꼬리 내로), 낭내(소내연수조 내로), 각막내(각막 내로), 치아내, 관상동맥내(관상 동맥 내로), 해면체내(음경의 해면체의 팽창되는 공간 내로), 추간판내(디스크 내로), 관내(샘의 관 내로), 십이지장내(십이지장 내로), 경막내(경질 내로 또는 아래로), 표피내(표피까지), 식도 내(식도로), 위내(위 내로), 치은내(치은 내로), 회장내(소장의 말단 부분 내로), 병변내(국소 병변 내로 또는 직접 도입), 강내(관의 내강 내), 림프내(림프 내로), 골수내(골수강 내로), 뇌막내(수막 내로), 심근내(심근 내로), 안구내(눈 내로), 난소내(난소 내로), 심낭내(심낭 내로), 흉강내(흉막 내로), 전립선내(전립선 내로), 폐내(폐 또는 기관지 내로), 강내(비강 또는 안와주위 부비강 내로), 척추내(척주 내로), 활액내(관절의 활액 내로), 건내(건 내로), 고환내(고환 내로), 수막강내(뇌척수 축의 임의의 수준에서 뇌척수액 내로), 흉곽내(흉곽 내로), 세관내(기관의 세관 내로), 종양내(종양 내로), 고실내(고실 내부로), 관내(혈관 또는 혈관들 내로), 심실내(심실 내로), 이온 삼투법(용해성 염 이온이 신체 조직으로 이동하는 전류 사용), 관주(개방된 상처 또는 체강을 세척 또는 수세), 후두(후두에 직접), 경비(코를 통해 위까지), 폐쇄 드레싱 기법(국소 경로 투여 후 그 부분을 밀봉하는 붕대로 덮음), 안과(외부 눈에), 구강인두(입과 인두에 직접), 비경구, 경피, 관절주위, 경막주위, 신경주위, 치주, 직장, 호흡기(국소적 또는 전신적 효과를 위해 구강 또는 비강으로 흡입하여 호흡기 내로), 안구뒤(뇌교뒤 또는 안구뒤), 심근내(심근에 들어감), 연조직, 지주막하, 결막하, 점막하, 국소, 태반(태반을 통하거나 가로지름), 경기관(기관 벽을 통해), 고막(고막강을 가로지르거나 통과함), 요관(요관으로), 요도(요도로), 질, 미주 차단, 진단, 신경 차단, 담도 관류, 심장 관류, 광선요법 또는 척추를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
작용제는 전형적으로 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위한 용량 단위 형태로 제형화된다. 그러나, 본 발명에 포함되는 작용제의 총 일일 사용량은 타당한 의학적 판단의 범위 내에서 주치의에 의해 결정될 수 있음이 이해될 것이다. 특정 환자에 대한 특정 치료적 효과, 예방적 효과 또는 적절한 이미징 용량 수준은 치료될 장애 및 장애의 중증도; 사용되는 특정 작용제의 활성; 사용되는 특정 조성물; 환자의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별 및 식이; 사용되는 특정 작용제의 투여 시간, 투여 경로 및 배설률; 치료 기간; 사용되는 특정 화합물과 함께 또는 동시에 사용되는 약물; 그리고 의학 분야에서 잘 알려진 요인들과 같은 것을 포함하는 다양한 요인에 따라 달라질 것이다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 작용제는 목적하는 치료, 진단, 예방 또는 이미징 효과를 얻기 위해, 하루에 한 번 이상 대상체 체중의 약 0.0001 ㎎/㎏ 내지 약 1000 ㎎/㎏, 약 0.001 ㎎/㎏ 내지 약 0.05 ㎎/㎏, 약 0.005 ㎎/㎏ 내지 약 0.05 ㎎/㎏, 약 0.001 ㎎/㎏ 내지 약 0.005 ㎎/㎏, 약 0.05 ㎎/㎏ 내지 약 0.5 ㎎/㎏, 약 0.01 ㎎/㎏ 내지 약 50 ㎎/㎏, 약 0.1 ㎎/㎏ 내지 약 40 ㎎/㎏, 약 0.5 ㎎/㎏ 내지 약 30 ㎎/㎏, 약 0.01 ㎎/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏, 약 0.1 ㎎/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏, 또는 약 1 ㎎/㎏ 내지 약 25 ㎎/㎏, 또는 약 10 ㎎/㎏ 내지 약 100 ㎎/㎏, 또는 약 100 ㎎/㎏ 내지 약 500 ㎎/㎏을 전달하기에 충분한 용량 수준으로 투여될 수 있다. 목적하는 용량은 1일 3회, 1일 2회, 1일 1회, 격일, 3일마다, 매주, 2주마다, 3주마다, 또는 4주마다 또는 2개월마다 전달될 수 있다. 일부 실시형태에서, 목적하는 투여량은 다중 투여(예를 들어, 2번, 3번, 4번, 5번, 6번, 7번, 8번, 9번, 10번, 11번, 12번, 13번, 14번 이상 투여)를 사용하여 전달될 수 있다. 다중 투여가 사용되는 경우, 본 명세서에 기재된 것과 같은 분할 투여 양생법이 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 포함되는 작용제는 항체이다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 항체의 치료적 유효량(즉, 효과적인 용량)은 약 0.001 내지 30 ㎎/㎏ 체중, 바람직하게는 약 0.01 내지 25 ㎎/㎏ 체중, 더욱 바람직하게는 약 0.1 내지 20 ㎎/㎏ 체중 및 훨씬 더욱 바람직하게는 약 1 ㎎/㎏ 내지 10 ㎎/㎏, 2 ㎎/㎏ 내지 9 ㎎/㎏, 3 ㎎/㎏ 내지 8 ㎎/㎏, 4 ㎎/㎏ 내지 7 ㎎/㎏ 또는 5 ㎎/㎏ 내지 6 ㎎/㎏ 체중의 범위이다. 당업자는 질환 또는 장애의 중증도, 이전 치료, 대상체의 일반적인 건강 및/또는 연령, 및 존재하는 다른 질병을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 대상체를 효과적으로 치료하는데 필요한 용량에 특정 인자가 영향을 미칠 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 치료적 유효량의 항체로 대상체를 치료하는 것은 단일 치료를 포함할 수 있거나, 또는 바람직하게는 일련의 치료를 포함할 수 있다. 바람직한 예에서, 대상체는 약 0.1 내지 20 ㎎/㎏ 체중 범위의 항체로, 약 1 내지 10주, 바람직하게는 2 내지 8주, 더욱 바람직하게는 약 3 내지 7주 및 훨씬 더욱 바람직하게는 약 4주, 5주 또는 6주 동안 매주 1회 치료된다. 치료에 사용되는 항체의 유효한 투여량은 특정 치료의 과정에 걸쳐 증가 또는 감소할 수 있음이 또한 이해될 것이다. 투여량의 변화는 진단 검정의 결과로 인해 발생할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 "분할 용량"은 단일 단위 용량 또는 총 1일 용량을 2회 이상의 용량, 예를 들어 단일 단위 용량의 2회 이상의 투여로 분할하는 것이다. 본 명세서에 사용되는 "단일 단위 용량"은 1회 용량/한번에/단일 경로/단일 접촉 지점, 즉, 단일 투여 이벤트로 투여되는 임의의 치료제의 용량이다.
본 명세서에 사용되는 "총 일일 용량"은 24시간 동안 제공되거나 처방된 양이다. 이는 단일 단위 용량으로 투여될 수 있다.
일부 실시형태에서, 투여 형태은 액체 투여 형태일 수 있다. 비경구 투여용 액체 투여 형태는 약제학적으로 허용 가능한 에멀션, 마이크로에멀션, 용액, 현탁액, 시럽 및/또는 엘릭서를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 활성 성분 이외에, 액체 투여 형태는 물 또는 다른 용매, 가용화제 및 유화제, 예컨대 에틸 알코올, 아이소프로필 알코올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-뷰틸렌 글리콜, 다이메틸폼아마이드, 오일(특히, 면실유, 땅콩유, 옥수수유, 배아유, 올리브유, 피마자유 및 참기름), 글리세롤, 테트라하이드로퍼퓨릴알코올, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스터 및 이들의 혼합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 당업계에서 일반적으로 사용되는 불활성 희석제를 포함할 수 있다. 비경구 투여를 위한 소정의 실시형태에서, 조성물은 가용화제, 예컨대 CREMOPHOR®, 알코올, 오일, 변형된 오일, 글리콜, 폴리소르베이트, 사이클로덱스트린, 중합체 및/또는 이들의 조합물과 혼합될 수 있다.
소정의 실시형태에서, 투여 형태는 주사용일 수 있다. 주사용 제제, 예를 들어, 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액은 공지된 기술에 따라 제형화될 수 있으며, 적합한 분산제, 습윤제 및/또는 현탁제를 포함할 수 있다. 멸균 주사용 제제는 무독성의 비경구적으로 허용 가능한 희석제 및/또는 용매 중 멸균 주사용 용액, 현탁액 및/또는 에멀션, 예를 들어 1,3-뷰테인다이올 중 용액일 수 있다. 사용될 수 있는 허용 가능한 비히클 및 용매는 물, 링거 용액, U.S.P. 및 등장성 소듐 클로라이드 용액을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 멸균, 고정유는 일반적으로 용매 또는 현탁 매질로 사용된다. 이러한 목적을 위해, 합성 모노- 또는 다이글리세라이드를 포함하는 임의의 블랜드 고정유가 사용될 수 있다. 올레산과 같은 지방산이 주사의 제조에 사용될 수 있다. 주사용 제형은 예를 들어, 세균성-보유 필터를 통한 여과하고/하거나 사용 전에 멸균수 또는 다른 멸균 주사용 매질에 용해 또는 분산될 수 있는 멸균 고체 조성물의 형태로 멸균제를 혼입시킴으로써 멸균될 수 있다.
일부 실시형태에서, 정제, 당의정, 캡슐, 알약 및 과립의 고체 투여 형태는 코팅 및 쉘, 예컨대 장용 코팅 및 제약 분야에서 잘 알려진 기타 코팅으로 제조될 수 있다. 이들은 선택적으로 불투명화제를 포함할 수 있고, 활성 성분(들)만을 방출하거나 우선적으로 장관의 소정의 부분에서, 선택적으로 지연된 방식으로 방출하는 조성물일 수 있다. 사용될 수 있는 포매 조성물의 예는 중합체 물질 및 왁스를 포함한다. 유사한 유형의 고체 조성물이 락토스 또는 유당뿐만 아니라 고분자량 폴리에틸렌 글리콜 등과 같은 부형제를 사용하여 연질 및 경질 충전 젤라틴 캡슐의 충전제로 사용될 수 있다.
세포는 대상체 체중의 킬로그램당 0.1×106, 0.2×106, 0.3×106, 0.4×106, 0.5×106, 0.6×106, 0.7×106, 0.8×106, 0.9×106, 1.0×106, 5.0×106, 1.0×107, 5.0×107, 1.0×108, 5.0×108 이상의 세포, 또는 그 사이의 임의의 범위 또는 그 사이의 임의의 값으로 투여될 수 있다. 이식된 세포의 수는 주어진 시간 동안 목적하는 생착 수준에 기초하여 조정될 수 있다. 일반적으로, 필요에 따라 1×105 내지 약 1×109　세포/체중의 ㎏, 약 1×106　내지 약 1×108　세포/체중의 ㎏ 또는 약 1×107　세포/체중의 ㎏ 이상의 세포가 이식될 수 있다. 일부 실시형태에서, 평균 크기 마우스에 대해 적어도 약 0.1×106, 0.5×106, 1.0×106, 2.0×106, 3.0×106, 4.0×106 또는 5.0×106의 총 세포의 이식이 효과적이다.
세포는 주입과 같은 본 명세서에 기재된 바와 같은 임의의 적합한 경로로 투여될 수 있다. 세포는 또한 다른 항암제 이전에, 동시에 또는 이후에 투여될 수 있다.
투여는 일반적으로 당업계에 공지되어 있는 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 세포를 포함하는 작용제는 직접 주사에 의해, 또는 혈관내, 뇌내, 비경구, 복강내, 정맥내, 경막외, 척추내, 흉골내, 활막내, 척추강내, 동맥내, 심장내 또는 근육내 투여를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 당업계에서 사용되는 임의의 다른 수단에 의해 목적하는 부위에 도입될 수 있다. 예를 들어, 관심있는 대상체는 다양한 경로에 의해 이식된 세포와 생착될 수 있다. 이러한 경로는 정맥내 투여, 피하 투여, 특정 조직에 대한 투여(예를 들어, 초점 이식), 대퇴골 골수 강으로의 주사, 비장으로의 주사, 태아 간의 신피막 아래 투여 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 소정의 실시형태에서, 본 발명의 암 백신은 종양 내부로 또는 피하로 대상체에게 주사된다. 세포는 한 번의 주입으로 또는 목적하는 효과를 생성하기에 충분한 정의된 기간 동안 연속 주입을 통해 투여될 수 있다. 이식된 세포의 이식, 생착 평가 및 마커 표현형 분석을 위한 예시적 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Pearson et al. (2008) Curr. Protoc. Immunol. 81:15.21.1-15.21.21; Ito et al. (2002) Blood 100:3175-3182; Traggiai et al. (2004) Science 304:104-107; Ishikawa et al. Blood (2005) 106:1565-1573;　Shultz et al. (2005) J. Immunol. 174:6477-6489; 및 Holyoake et al. (1999) Exp. Hematol. 27:1418-1427] 참조).
세포-기반 요법 및 줄기 세포의 입양 세포 전달, 암 백신 및 세포-기반 요법 등과 같은 2개 이상의 세포 유형이 조합되고 투여될 수 있다. 예를 들어, 입양 세포-기반 면역요법은 본 발명 세포-기반 요법과 조합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포-기반 작용제는 단독으로 또는 입양 T 세포 요법(adoptive T cell therapy: ACT)과 같은 면역요법과 같은 추가적인 세포-기반 작용제과 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, CD19를 인식하도록 유전자 조작된 T 세포가 여포성 B 세포 림프종을 치료하는데 사용된다. ACT를 위한 면역 세포는 수지상 세포, T 세포, 예컨대 CD8+ T 세포 및 CD4+ T 세포, 자연 살해(NK) 세포, NK T 세포, 세포독성 T 림프구(CTL), 종양 침윤 림프구(TIL), 림포카인 할성화 살해(LAK) 세포, 메모리 T 세포, 조절성 T 세포(Treg), 헬퍼 T 세포, 사이토카인-유도성 킬러(CIK) 세포 및 이들의 임의의 조합일 수 있다. 방사선 조사된 자가유래 또는 동종이계 종양 세포, 종양 용해물 또는 아폽토시스성 종양 세포, 항원-제시 세포-기반 면역요법, 수지상 세포-기반 면역요법, 입양 T 세포 전달, 입양 CAR T 세포 요법, 자가유래 면역 강화 요법(autologous immune enhancement therapy: AIET), 암 백신 및/또는 항원 제시 세포를 제한 없이 포함하는 입양 세포-기반 면역요법 양식이 잘 알려져 있다. 이러한 세포-기반 면역요법은 면역 반응을 더 조절하기 위해 하나 이상의 유전자 산물을 발현, 예컨대 GM-CSF와 같은 사이토카인을 발현하고/하거나 Mage-1, gp-100 등과 같은 종양-관련 항원(TAA) 항원을 발현하도록 더 변형될 수 있다.
암 세포와 같은 본 발명에 포함되는 작용제와 본 발명에 포함되는 다른 작용제 또는 다른 조성물의 비는 서로에 대해 1:1(예를 들어, 동일한 양의 2개의 작용제, 3개의 작용제, 4개의 작용제 등)일 수 있지만, 목적하는 임의의 양(예를 들어, 1:1, 1.1:1, 1.2:1, 1.3:1, 1.4:1, 1.5:1, 2:1, 2.5:1, 3:1, 3.5:1, 4:1, 4.5:1, 5:1, 5.5:1, 6:1, 6.5:1, 7:1, 7.5:1, 8:1, 8.5:1, 9:1, 9.5:1, 10:1 이상)으로 조절될 수 있다.
이식된 세포의 생착은 종양 부피, 사이토카인 수준, 투여 시간, 이식 후 하나 이상의 시점에서 대상체로부터 수득된 관심있는 세포의 유세포 분석과 같지만 이들로 제한되지 않는 임의의 다양한 방법에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28일을 대기하는 시간-기반 분석은 종양 채취를 위한 시간을 표시할 수 있다. 임의의 이러한 지표는 항암 면역요법에 대한 반응에 대한 변수의 효과를 결정하기 위해 잘 알려진 매개변수에 따라 조정될 수 있는 변수이다. 또한, 이식된 세포는 사이토카인, 세포외 매트릭스, 세포 배양 지지체 등과 같은 다른 작용제와 공동 이식될 수 있다.
VII. 키트
본 발명 또한 본 명세서에 기재된 바이오마커를 검출 및/또는 조절하기 위한 키트를 포함한다. "키트"는 본 발명의 마커의 발현을 특이적으로 검출하고/하거나 이에 영향을 주기 위한 하나 이상의 시약, 예를 들어 프로브 또는 소분자를 포함하는 임의의 제조물(예를 들어, 패키지 또는 용기)이다. 키트는 본 발명의 방법을 수행하기 위한 단위로 홍보, 배포 또는 판매될 수 있다. 키트는 본 발명의 방법에 유용한 하나 이상의 작용제를 검출, 발현, 스크리닝하는 등에 필요한 하나 이상의 시약을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 포함되는 바이오마커(예를 들어, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 표적)을 검출하는 데 유용한 작용제의 조합은 바이오마커 및 이의 조절을 검출하기 위한 키트로 제공될 수 있으며, 이는 단핵구 및/또는 대식세포 염증성 표현형, 면역 반응, 항암 기능, 면역관문 요법에 대한 감수성 등을 확인하는데 유용하다. 이러한 조합은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상, 예컨대 본 발명에 포함되는 모든 바이오마커를 포함하는 바이오마커를 검출하기 위한 하나 이상의 작용제를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 키트는 참조 표준물질, 예를 들어 세포 성장, 분열, 이동, 생존 또는 아폽토시스를 제어하는 신호전달 경로에 영향을 미치지 않거나 이를 조절하지 않는 단백질을 암호화하는 핵산을 더 포함할 수 있다. 당업자는 일반적인 분자 태그(예를 들어, 녹색 형광 단백질 및 베타-갈락토시데이스), 유전자 온톨로지(GeneOntology) 참고자료에 의해 세포 성장, 분열, 이동, 생존 또는 아폽토시스를 포함하는 임의의 경로로 분류되지 않은 단백질 또는 보편적인 하우스키핑 단백질을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 많은 이러한 대조군 단백질을 구상할 수 있다. 키트의 시약은 개별 용기에 제공되거나 단일 용기에 2개 이상의 시약 혼합물로 제공될 수 있다. 또한, 키트 내의 조성물의 사용을 설명하는 지침 자료가 포함될 수 있다. 본 발명에 포함되는 키트는 또한 본 명세서에 제공되는 바와 같은 개시된 발명의 방법에서 개시된 발명의 키트 또는 항체의 사용을 개시하거나 설명하는 지침 자료를 포함할 수 있다. 키트는 또한 키트가 설계된 특정 적용을 용이하게 하기 위해 추가적인 성분을 포함한다. 예를 들어, 키트는 추가적으로 표지를 검출하는 수단(예를 들어, 효소적 표지를 위한 효소 기질, 형광 표지를 검출하기 위한 필터 세트, 양 항-마우스-HRP 등과 같은 적절한 이차 표지) 및 대조에 필요한 시약 (예를 들어, 대조군 생물학적 샘플 또는 표준물질)을 함유한다. 키트는 추가적으로 개시된 발명의 방법에 사용하기 위해 인식되는 완충액 및 기타 시약을 포함할 수 있다. 비-제한적 예는 담체 단백질 또는 세제와 같은 비-특이적 결합을 감소시키는 작용제를 포함한다.
본 발명에 포함되는 다른 실시형태가 하기 실시예에 기재된다. 본 발명은 추가로 제한하는 것으로 해석되어서는 안되는 하기 실시예에 의해 추가로 기재된다.
실시예
실시예 1: 일차 단핵구 및 대식세포 시스템은 생체내 단핵구 및 대식세포의 생물학적 특성을 재현한다
인간 대식세포는 전-염증성(M1-유사, 제1형으로도 지칭됨)에서 전-종양성/항-염증성(M2-유사, 제2형으로도 지칭됨)가지의 분화 스펙트럼을 따라 존재한다(예를 들어, 문헌[Biswas et al. (2010) Nat. Immunol. 11: 889-896; Mosser and Edwards (2008) Nat. Rev. Immunol. 8:958-969; Mantovani et al. (2009) Hum. Immunol. 70:325-330]).
이러한 기능 스펙트럼에 따라, 대식세포는 여러 다른 특징을 변경하는 것 외에도 이들의 표면 마커 발현 및 형태를 변경한다. 이러한 마커가 일차 인간 대식세포에서 이러한 스펙트럼을 따라 어떻게 변하는지 이해하는 것은 종양(종양-관련 대 식세포) 및/또는 염증이 있는 조직과 같은 주어진 면역학적 환경에 어떤 세포가 존재하는지 이해하고 이러한 대식세포가 이러한 조직 내 면역 반응에 어떻게 영향을 미치는지 이해하는 데 중요하다. CD163, CD16 및 CD206을 포함하는 소정의 세포 표면 마커는 전통적으로 대식세포 하위유형을 분류하는데 사용되었다. 이러한 표면 마커 외에도, 대식세포 하위유형은 고유의 형태를 보인다. M1 대식세포는 수상돌기 돌출이 증가된 수지상 세포-유사 외관을 보인다. M2 대식세포는 더 둥글거나 스핀들-유사 형태를 보인다.
본 명세서에 기재된 각각의 단핵구/대식세포 세포-기반 실험을 위해, 세포주를 사용한 것과는 반대로, 단리된 세포 유형을 갖는 임의의 시험관내 실험적 시스템이 허용하는 가장 가까운 가능한 방식으로 생체내의 기존의 세포를 모방한 생물학적 특성을 재현하기 위해 일차 인간 단핵구/대식세포를 사용하였다. 특히, 이 시스템은 일차 세포의 천연의 생물학적 특성을 연구할 수 있는 기회를 제공하고, 상이한 유전적 및 환경적 노출된 상이한 공여체로부터 발생하는 천연의 다양성에 대한 접근을 제공한다. 따라서, 분석 결과를 해석할 때 인간 집단 간의 천연의 유전 적 및 면역학적 가변성을 고려하는 것이 중요하다.
단핵구는 시험관내에서 M1-유사(제1형) 및/또는 M2-유사(제2형) 표현형으로 분화시켰다(문헌[Ries et al. (2014) Cancer Cell 25:846-859; Vogel et al. (2014) Immunobiol. 219:695-703]). 단핵구를 M1 대 M2 표현형으로 구별하기 위해, 제조업체의 지침에 따라 RosetteSep™ 인간 단핵구 농축 칵테일(스템셀 테크놀로지스(Stemcell Technologies), 캐나다주 밴쿠버)을 사용한 피콜 분리에 의해 건강한 공여자의 전혈에서 단핵구를 단리하였다. 단리된 단핵구를 10% 소 태아 혈청을 함유하는 IMDM 배지에서 밤새 24-웰 플레이트에 배열하고, 24시간 후에 부착되지 않은 세포를 세척하였다. 단핵구를 IMDM 10% FBS와 M2 대식세포의 경우 50 ng/㎖ 인간 M-CSF 또는 M1 대식세포의 경우 50 ng/㎖ GM-CSF(바이오레전드(Biolegend), 캘리포니아주 샌디에고)에서 6일 동안 배양하여 대식세포로 분화시켰다. 6일 후, M1 대식세포는 10 ng/㎖d의 인간 인터페론 감마 및 100 ng/㎖의 LPS(인비보젠, 캘리포니아주 샌디에고)로 활성화시키고, M2-유사 대식세포는 2개의 별도의 배양물로 나누고, 각각에 IL-10을 첨가하여 M2c 대식세포로 그리고 IL-4, IL-10 및 TGF-β를 첨가하여 M2d 대식세포로 각각 더 유도하였다. 8일 후, 대식세포를 수거하고, 추가 분석을 위해 처리하였다. M1 및 M2 대식세포 마커 및 표면 발현된 표적의 발현을 유세포 분석으로 평가하였다. 유세포 분석을 위해, 세포를 수집하고, 50㎕의 FACS 완충액(PBS+2.5% FBS+0.5% 소듐 아자이드)에 현탁시키고, 얼음 위에서 TruStain FcX™(바이오레전드 Cat. No. 422302)로 15분 동안 차단시켰다. 항체(표 3)를 제조업체의 지침에 따라 FACS 완충액으로 희석하고, 얼음 위에서 15분 동안 세포를 첨가하였다.
표지된 세포를 FACS 완충액으로 2회 세척하고, fixed with for on an Attune™ 유세포 분석기(써모피셔)에서 유세포 분석을 위해 PBS+2% 파라폼알데하이드로 고정하였다. FlowJo 소프트웨어를 통해 데이터를 분석하였다. 형태는 현미경을 통해 평가하였다.
Figure pct00163
Figure pct00164
Figure pct00165
대식세포를 M2 표현형으로 스큐잉시키는 것은 M1 대식세포에 비해 CD163, CD16 및 CD206을 상향조절하는 것으로 나타났다(도 1A). 이러한 전통적인 마커 이외에도, 도 1B는 CD53, PSGL1 및 VSIG4와 같은 본 명세서에 기재된 새로운 바이오마커가 M2 대식세포에서도 상향조절됨을 보여준다. 도 1C는 대식세포 스펙트럼 내에 존재하는 형태학적 차이를 보여주며, 중요하게는 일차 인간 세포 내에 존재하는 가변성을 보여준다.
실시예 2: 표적 핵산 넉다운에 의해 대식세포 염증성 표현형을 조절하는 표적의 검증
대식세포 표현형을 조절하는 본 명세서에 기재된 대식세포 관련 표적의 능력을 검증하기 위하여, 예를 들어, 일차 인간 대식세포에서 설계, 검증 및 테스트된 표적-특이적 siRNA를 사용하여 표적 넉다운 실험을 수행하였다.
siRNA는 악소 랩스(AXO Labs)(독일 쿨름바흐)에서 합성하였다. 올리고리보뉴클레오타이드를 10 μ㏖의 규모로 ABI 394 합성기(어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems))를 사용하여 고체상에서 포스포아미다이트 기술을 사용하여 합성하였다. 조절된 공극 유리(CPG, 520Å, 75 μ㏖/g의 로딩을 사용, 프라임 신테시스(Prime Synthesis)(미국 펜실베이니아주 애스톤)로부터 구입)로 제조된 고체 지지체 상에서 합성을 수행하였다.
정규 RNA 포스포아미다이트, 2'-O-메틸포스포아미다이트 및 보조 시약은 프롤리고(Proligo)(독일 함부르크)로부터 구입하였다. 구체적으로, 다음의 아미다이트를 사용하였다: (5'-O-다이메톡시트라이틸-N6-(벤조일)-2'-O-t-뷰틸다이메틸실릴-아데노신-3'-O-(2-사이아노에틸-N,N-다이아이소프로필아미노) 포스포아미다이트, 5'-O-다이메톡시트라이틸-N4-(아세틸)-2'-O-t-뷰틸다이메틸실릴-사이티딘-3'-O-(2-사이아노에틸-N,N-다이아이소프로필아미노) 포스포아미다이트, (5'-O-다이메톡시트라이틸-N2-(아이소뷰티릴)-2'-O-t-뷰틸다이메틸실릴-구아노신-3'-O-(2-사이아노에틸-N,N-다이아이소프로필아미노) 포스포아미다이트 및 5'-O-다이메톡시트라이틸-2'-O-t-뷰틸다이메틸실릴-우리딘-3'-O-(2-사이아노에틸-N,N-다이아이소프로필아미노) 포스포아미다이트. 2'-O-메틸포스포아미다이트는 정규 RNA 아미다이트와 동일한 보호기를 가졌다. 모든 아미다이트를 무수 아세토나이트릴(100mM)에 용해시키고, 분자체(3Å)를 첨가하였다. 5-에틸 티오테트라졸(ETT, 아세토나이트릴 중 500mM)을 활성인자 용액으로 사용하였다. 결합 시간은 6분이었다. 포스포로티오에이트 결합을 도입하기 위하여, 무수 아세토나이트릴 중 3-((N,N-다이메틸아미노메틸idene)아미노)-3H-1,2,4-다이티아졸-5-티온(DDTT, 켐젠스(Chemgenes)(미국 매사추세츠주 월밍턴)으로부터 구입)의 50mM 용액을 사용하였다.
고체상 합성이 완료된 후, 건조된 고체 지지체를 15㎖ 튜브로 옮기고, 45℃에서 180분 동안 메탄올(2M, 알드리치(Aldrich)) 중 메틸 아민으로 처리하였다. 원심분리 후, 상청액을 새로운 15㎖ 튜브로 옮기고, CPG를 1200㎕의 N-메틸피롤리딘-2-온(NMP, 플루카(Fluka)(스위스 부크스)으로 세척하였다. 세척액을 메탄올성 메틸아민 용액과 합하고, 450㎕의 트라이에틸아민 트라이하이드로플루오라이드(TEA·3HF, 알파 에이사(Alfa Aesar), 독일 카를스루에)를 첨가하였다. 이 혼합물을 150분 동안 65℃로 만들었다. 실온으로 냉각 후, 0.75㎖의 NMP와 1.5㎖의 에톡시트라이메틸실레인(머크(Merck), 독일 다름슈타트)을 첨가하였다. 10분 후, 침전된 올리고리보뉴클레오타이드를 원심분리에 의해 수집하고, 상청액을 버리고, 고체를 1㎖의 완충액 A(아래 기재됨)에 재구성하였다.
미정제 올리고머를 Source Q15(지이 헬스케어(GE Healthcare)) 및 AKTA 익스플로러 시스템(지이 헬스케어)으로 패킹된 칼럼을 사용하여 음이온성 교환 HPLC로 정제하였다. 완충액 A는 10 mM 소듐 퍼클로레이트, 20 mM 트리스, 1 mM EDTA(pH 7.4)(시그마 알드리치(Sigma Aldrich))이고, 20% 아세토나이트릴을 함유하였다. 완충액 B는 500 mM 소듐 퍼클로레이트를 제외하고는 완충액 A와 동일하였다. 42 칼럼 부피(column volume: CV) 내에서 22% B에서 42% B의 구배를 사용하였다. 280㎚에서 UV 흔적이 기록되었다. 적절한 분획을 혼주하고, 및 3M NaOAc, 5.2의 pH 및 70% 에탄올로 침전시켰다. 마지막으로, 펠릿을 70% 에탄올로 세척하였다. 대안적으로, 제조업체의 권장사항에 따라 Sephadex® HiTrap® 칼럼(지이 헬스케어)을 사용하여 탈염을 수행하였다. 용액의 농도는 UV 광도계(에펜도르프(Eppendorf), 독일 함부르크)에서 260㎚에서 흡광도 측정에 의해 결정하였다. 어닐링까지, 각각의 가닥을 -20℃에서 냉동 용액으로 저장하였다. 등몰 RNA 용액을 배합하여 상보적 가닥을 어닐링하였다. 혼합물을 동결건조하고, 적절한 부피의 어닐링 완충액(100mM NaCl, 20mM 소듐 포스페이트, pH 6.8)으로 재구성하여 목적하는 농도를 얻었다. 이 용액을 75℃의 수조에 넣고, 2시간 이내에 실온으로 냉각시켰다.
표 4에 따른 다양한 세포주를 사용하여 시험관내에서 siRNA에 대한 용량 반응 곡선을 생성하였다.
Figure pct00166
간략하게는, 세포를 96-웰 플레이트에 씨딩하고, siRNA, Lipofectamine® 2000(0.5㎕/웰; 써모피셔(ThermoFisher)) 및 일부 경우, 리포터 플라스미드(50ng/웰)로 역 형질감염시켰다. 리포터 플라스미드(psiCHECK™-2, 프로메가(Promega))는 반딧불이 루시퍼레이스 및 레닐라 루시퍼레이스에 융합된 관심있는 유전자를 모두 암호화하였다; 관심있는 유전자의 침묵이 레닐라 루시퍼레이스의 침묵을 초래하였지만, 반딧불이 루시퍼레이스는 내부 대조군으로서 영향을 받지 않았다.
37℃에서 24시간 항온처리 후, mRNA 넉다운을 종말점 검정을 사용하여 측정하였다. 리포터 플라스미드가 없는 표적의 경우, 제조업체(QuantiGene® 싱글플렉스 유전자 발현 검정, 써모피셔)의 지침에 따라 분지형 DNA(bDNA) 검정을 수행하여 표적 유전자와 GAPDH(하우스키핑 유전자) mRNA를 모두 측정하였다. siRNA 농도(nM) 대 남아있는 mRNA(표적 유전자 대 GAPDH의 비, 모의 siRNA-형질감염된 세포로 정규화됨)로 데이터를 플로팅하였다. 리포터 플라스미드가 있는 표적의 경우, 제조업체의 지침에 따라(프로메가) Dual-Glo® 루시퍼레이스 검정을 수행하여 반딧불이 및 레닐라 루시퍼레이스 발현을 측정하였다. siRNA 농도(nM) 대 남아있는 mRNA(레닐라 대 반딧불이 발광의 비, 모의 siRNA-형질감염된 세포로 정규화됨)로 데이터를 플로팅하였다.
모든 용량 반응 곡선에 대해, 4-매개변수 로지스틱 모델을 사용하여 각각의 siRNA 서열(표 5 및 도 2)의 IC50을 결정하였다. 표 5 및 도 2에 나타낸 데이터는 +/- 표준 편차의 4중 평균을 나타낸다.
Figure pct00167
Figure pct00168
Figure pct00169
Figure pct00170
Figure pct00171
이어서, 검증된 siRNA를 일차 인간 대식세포 검정에 사용하여 위의 실시예 1에 기재된 바와 같이 전-종양성(M2) 또는 전-염증성(M1) 표현형을 변경하는 표적 넉다운의 능력을 결정하였다. 간략하게는, 제조업체의 지침에 따라 RosetteSep™ 인간 단핵구 농축 칵테일(스템셀 테크놀로지스(Stemcell Techhnologies), 캐나다 밴쿠버)을 사용한 피콜 분리에 의해 신선한 공여자의 전혈로부터 단핵구를 단리하였다. 단리된 단핵구를 10% 소 태아 혈청을 함유하는 이스코브 변형 둘베코 배지(IMDM)(써모피셔)에서 밤새 24-웰 플레이트에 배열하고, 부착되지 않은 세포를 24시간 후에 세척하였다. 단핵구를 IMDM 10% FBS와 M2 대식세포의 경우 50 ng/㎖ 인간 M-CSF 또는 M1 대식세포의 경우 50 ng/㎖ GM-CSF(바이오레전드, 캘리포니아주 샌디에고)에서 6일 동안 배양하여 대식세포로 분화시켰다.
siRNA 지질 나노입자를 제1일 및 제3일에 50 nM의 최종 농도로 투여하였다. C12-200 지질 나노입자(LNP)를 문헌[Novobrantseva et al. (2012) Mol Ther. Nucl. Acids 1:e4]에 기재된 바와 같이 제형화하였다. 간략하게는, 이온화 가능한 리피드 C12-200(문헌[Love et al. (2010)]에 기재됨, 악소 랩스 게엠베하(AXO Labs GmbH), 독일 쿨름바흐; doi.org/10.1073/PNA.0910603106의 월드 와이드 앱에서 이용 가능함)을 함유하는 에탄올 상, 다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC, 아반티 폴라 리피드(아반티 Polar Lipids), 앨라배마주 앨러배스터), 콜레스테롤(엠피 바이오메디칼스(MP Biomedicals), 캘리포니아주 샌타애나) 및 DMPE-PEG2000(1,2-다이미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000], 아반티)을 50:10:38.5:1.5의 몰비로 미세유체 혼합을 통해 10mM의 시트레이트 완충액 중 siRNA의 수성 상과 함께 혼합하였다. 에탄올:수성 부피 비는 1:3이었으고, 총 지질:siRNA 중량비는 대략 9:1이었다. 생성된 LNP를 밤새 1×PBS로 투석하였다. 제형화된 LNP는 나노 입자 추적 분석(Zeta View, 파티클메트릭스(ParticleMetrix))에 의해 측정하였을 때 중앙 입자 직경이 약 60 내지 70㎚였고, 변형된 Quant-iT™ RiboGreen® 검정(문헌[Heyes et al., 2005]; doi:10.1016/j.jconrel.2005.06.014)으로 측정하였을 때 siRNA 캡슐화 효율이 약 80% 내지 90%였다.
배양 6일째에 M2 대식세포를 20 ng/㎖의 인간 IL-10(바이오레전드, 캘리포니아주 샌디에고)로 분극화시켰다. 48시간 후, 대식세포를 스크래핑하여 플레이트로부터 제거하고, mRNA 수준을 위에 기재된 바와 같이 bDNA로 평가하였다. 도 3A는 M2 대식세포에서 평가된 각각의 개별 표적의 상대적 넉다운을 보여준다. 도 3B는 유세포 분석을 통해 동일한 M2 대식세포에서 표면 발현된 경우 표적 단백질의 넉다운을 보여준다.
도 3은 예를 들어, CD163, CD16 및 CD206의 전통적인 마커의 발현을 사용한 평가뿐만 아니라 CD53, PSGL1 및 VSIG4와 같이 위의 실시예 1에 기재된 바이오마커를 통한 평가와 같이 M2 대식세포를 M1 표현형으로 및/또는 M2 스펙트럼을 따라 추가로 유도하는 것으로 결정된 26개의 검증된 표적을 보여주는 위에 기재된 바와 같은 siRNA-처리된 M2 대식세포의 결과를 보여준다. 또한, 이러한 표적은 이러한 M2 대식세포의 형태를 M1-유사 및/또는 더욱 M2-유사하도록 변경하는 능력을 보여주었다. 중요하게는, 분화를 겪고 있는 이러한 검정 내 세포가 검정 전체를 통해 스큐잉 조건의 존재하에 남아 있다. 따라서, siRNA가 M2-유사에서 M1-유사로 표적을 유도하려면, 지속적으로 강력한 스큐잉 칵테일의 존재하에서 그렇게 해야만 한다. 이것은 완전한 넉다운을 달성하지 못하기 때문에, 이러한 siRNA의 기능에 대한 매우 높은 기준을 설정하지만 중요한 표현형 변화가 입증되었다. 실시예 1은 전통적인 대식세포 마커 CD163, CD16 및 CD206뿐만 아니라 바이오마커 CD53, PSGL1 및 VSIG4의 발현을 보여준다. 도 1은 또한 개별적인 공여자 간의 이러한 마커 내에서의 자연스럽고 중요한 변동성을 보여준다. 또한, 주목할 점은 일부 마커에 대한 M1 분화 세포와 M2 분화 세포 간의 발현 차이가 0.5배 미만의 변화(도 1A)이며, 이는 작은 발현 변화도 매우 극적인 기능적 결과를 가질 수 있음을 나타낸다. 따라서, 표 1 및 표 2의 표적은 최소 4명의 공여자의 평균 변화가 다음 둘 중 10% 이상일 때 siRNA 넉다운을 통해 검증된 것으로 간주하였다: i) 전형적인 마커, ii) 새로운 바이오마커, iii) 전형적인 또는 새로운 바이오마커의 조합, 또는 iv) 형태적 변화와 함께 i, ii 또는 iii.
실시예 3: 표적 단백질을 차단함으로써 대식세포 염증성 표현형을 조절하는 표적의 검증
대식세포는 면역 반응을 유도하거나 억제하도록 생물학적으로 최적화된다. 따라서 siRNA, 항체 또는 기타 양식을 통한 대식세포 표적화는 면역 반응의 개시, 억제 및/또는 영속화의 변경을 허용한다.
실시예 2에 기재된 바와 같이 검증된 표적에 대한 항체가 확인되고 생성되었다. 본 명세서에 기재된 실험에 사용된 항체는 상업적 공급업체로부터 공급받았거나 재조합으로 생성되었다. 예를 들어, 항체 가변 영역 서열은 다음 출처에 기재된 바와 같이 공지된 결합로부터 유도되었다: 미국 공개 제2007/0160601호, 미국 특허 제7,833,530호, 미국 특허 제7,604,802호 및 미국 공개 제2017/0190782호. 항체 가변 영역 서열은 표 6에 기재되어 있거나 생산된다.
Figure pct00172
Figure pct00173
모든 재조합 항체는 카파 또는 람다 경쇄와 쌍을 이루는 S228P 중쇄 돌연변이를 가진 인간 IgG4 키메라로 발현되었다. 가변 중쇄(HC) 및 경쇄(LC) 서열을 표 7에 제시된 항체 불변 영역 서열을 포함하는 벡터로 클로닝하였다.
Figure pct00174
중쇄- 및 경쇄-함유 독점 벡터를 현탁액-적합화된 HEK293 세포로 일시적 형질감염시킴으로써 ATUM(뉴왁, 캐나다)에 의해 단백질 발현 및 정제를 수행하였다. 세포 배양 상청액을 제조업체의 프로토콜에 따라 단백질 친화성 크로마토그래피(MabSelect SuRe™ pcc, 지이 라이프 사이언시스(GE Life Sciences))로 정제하였다. 용리되고, 중성화된 단백질을 PBS(pH 7.4)(코닝(Corning))로 완충액 교환하고, 및 필터 멸균하였다. 정제된 항체를 일차 아미노산 서열에서 계산된 흡광 계수를 사용하여 OD280에 의해 정량화하였다. 정제된 항체를 모세관 겔 전기영동(퍼킨 엘머(Perkin Elmer) GXII) 또는 SDS-PAGE(바이오-라드 크리테리온™ 트리스/글리신/SDS, 4% 내지 20%) 및 HPLC-SEC로 특성화하였다. 내독소 수준을 또한 특성화하였다(찰스 리버 엔도세이프™).
표 8에 열거된 상업적 항체를 구입하여 검정에 사용하였다. 또한, 표 9에 열거된 항체는 실시예 2에 기재된 검증된 표적에 대해 생성되었으며, 이들 검정에 포함된다.
Figure pct00175
Figure pct00176
실시예 2에 기재된 바와 같이 검증된 표적에 대해 생성된 항체를 기능 검정에 이용하였다. 대식세포 분화 상태에 대한 이들 항체의 효과를 대식세포 상태-특이적 바이오마커, 사이토카인 분비 및 복잡한 다세포 분석에서 협동 면역 반응을 영속화하는 능력과 같은 기타 기능적 특성을 포함하는 판독값으로 측정하였다.
예를 들어, 도 4는 대식세포 분화 검정에 사용된 표 6, 표 8 및 표 9에 열거된 20개의 항체의 결과를 보여준다.
간략하게는, 제조업체의 지침에 따라 RosetteSep™인간 단핵구 농축 칵테일(스템셀 테크놀로지스, 캐나다 밴쿠버)을 사용한 피콜 분리에 의해 신선한 공여자의 전혈로부터 단핵구를 단리하였다. 단리된 단핵구를 10% 소 태아 혈청을 함유하는 이스코브 변형 둘베코 배지(IMDM)(써모피셔)에서 밤새 24-웰 플레이트에 배열하고, 부착되지 않은 세포를 24시간 후에 세척하였다. 단핵구를 IMDM 10% FBS와 M2 대식세포의 경우 50 ng/㎖ 인간 M-CSF 또는 M1 대식세포의 경우 50 ng/㎖ GM-CSF(바이오레전드, 캘리포니아주 샌디에고)에서 6일 동안 배양하여 대식세포로 분화시켰다. M1 대식세포는 IFN-감마 및 LPS로 제6일에 활성화된 반면, M2 대식세포는 20 ng/㎖의 IL-10으로 제6일에 분극되고, 100 ng/㎖의 LPS로 제7일에 활성화되었다. 표 6 및 표 8에 열거된 단일 클론 항체를 배양 제1일, 제3일 및 제7일에 최종 농도 10 ㎍/㎖로 투여하였다. 상기 기재된 바와 같이, 세포를 M1 및 M2 마커의 발현에 대해 평가하고, 분석을 위해 무세포 상청액을 수집하였다. 데이터는 적어도 3 내지 4명의 건강한 공여자를 나타낸다.
특이적 항체를 실시예 1에서와 같이 전형적인 및 본 명세서에 기재된 새로운 바이오마커 둘 다에 의해 결정된 바와 같이 M2 표현형에 대한 스큐잉을 역전시킬 수 있었다. 주어진 표적에 대한 모든 mAb가 대식세포 표현형 마커에서 주목할 만한 변화를 유도하지 않았기 때문에, 이는 표적에 대한 모든 항체에 대한 범기능적 효과가 아니다. 또한, 항체 Ab 8 및 Ab 18은 이러한 모든 마커 세트에 대해 용량 적정 효과를 보여줄 수 있었다(도 4). 위와 같이, 표적은 적어도 4명의 공여자의 평균 변화가 다음 둘 중 10% 이상일 때 항체 처리를 통해 검증된 것으로 간주하였다: i) 전형적인 마커, ii) 새로운 바이오마커, iii) 전형적인 또는 새로운 바이오마커의 조합, 또는 iv) 형태적 변화와 함께 i, ii 또는 iii.
표현형 표면 마커 외에도, M1(예컨대, 제1형) 및 M2(예컨대, 제2형) 대식세포는 다른 사이토카인과 케모카인을 생성한다. 예를 들어, M1 대식세포는 GM-CSF, IL-12 및 TNF 알파를 포함하지만 이로 제한되지 않는 더 많은 전-염증성 사이토카인을 생산하는 반면, M2 대식세포는 VEGF, IL-10 및 TGFb와 같은 더 많은 전-종양성 및 면역억제성 사이토카인을 생산한다. 이러한 효과는 M1-분화된 대식세포가 M2 대식세포와 비교하여 높은 수준의 전-염증성 사이토카인을 생성하는 도 4C에서 볼 수 있다. 이러한 검정을 통해 대식세포는 강력한 사이토카인 IL-10 및 M-CSF의 존재를 통해 M2 표현형으로 강력하게 유도된다. 분화 과정 전반에 걸쳐 검증된 표적에 결합하는 mAb를 추가하면, 이러한 강력한 분극화를 극복하고 M2 대식세포를 M1과 유사한 상태로 유도할 수 있다. 이는 전형적인 표현형 마커뿐만 아니라 새로운 바이오 마커의 변화뿐만 아니라 전-염증성 사이토카인 생산의 기능적 유도에 의해 입증된다.
분화 및 분극화 과정 전체를 위해 첨가된 siRNA 또는 항체가 반응을 일으키는 능력은 위에서 입증되었다. 종양과 같은 질환 환경에서, 세포는 이미 M2 스펙트럼을 따라 어느 정도 이미 분화될 것으로 여겨진다. 따라서, 도 4D-4G에서, 단핵구는 위에 기재된 바와 같이 M2로 분극화되었지만, 항체는 분극화 과정의 마지막 2 일 동안만 추가하였다. 또한, 항체 77, 78 및 81 내지 84는 위에서 언급한 바와 같이 다른 모든 mAb가 투여된 10 ㎍/㎖이 아닌 1 ㎍/㎖로 투여하였다. 이 제한된 기간 동안, mAb 8, 18 및 75 내지 82는 전-염증성 사이토카인의 증가에 의해 입증된 바와 같이 M2 대식세포의 분극화를 더욱 M1-유사 상태로 극적으로 영향을 미칠 수 있었다. 실시예 2에 나타낸 바와 같이, 일부 표적의 siRNA 넉다운 대 하향 조절은 대식세포가 보다 M2-유사 면역억제성 표현형을 달성하도록 유도하였다. mAb 83 및 84는 mAb를 사용한 표적 차단을 통해 이러한 기능적 효과를 반복하는 능력을 보여준다.
이러한 도면은 M2 대식세포의 표현형뿐만 아니라 기능적 특징을 모두 역전시키는 검증된 표적에 대한 항체의 능력을 보여주어 M2 대식세포를 더욱 M1-유사하게 만들 뿐만 아니라 대식세포를 더욱 면역억제성 M2 유사 표현형으로 유도한다.
실시예 4: 복합 다세포 검정을 사용하여 대식세포 염증성 표현형을 조절하는 표적의 검증
대식세포가 종양 면역원성을 유도하거나 자가면역 및 염증성 장애의 과정을 역전시키기 위해서는, 일반적으로 협동 면역 반응을 유도하거나 차단할 수 있어야 한다. 여기에는 골수성 및 림프성 세포 둘 다에 대한 직접 및 하류 효과가 포함될 수 있다. 이러한 효과를 분석하기 위해서는 림프성 및 골수성 계통 둘 다의 일차 세포로 구성된 복합 다세포 검정이 필요하다.
포도상 구균의 장 독소 B(SEB) 검정 및 혼합 림프구 반응(MLR) 검정을 포함하는, 협동 면역 반응을 유도하는 본 명세서에 기재된 검증된 표적의 능력을 입증하기 위해 여러 시스템이 이용되어왔다. 이러한 검정은 연구하기에 가장 자연적인 세포이며 인간 질환과 같은 생체내 질환에 대한 최고의 예측력을 가진 일차 인간 세포를 활용한다. 이러한 검정 자연적으로 백그라운드 활성 및 반응의 진폭 모두에서 공여자마다 높은 가변성을 갖는다.
SEB 검정의 경우, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 Ficoll® 분리에 의해 신선한 공여자의 혈액에서 단리, 장기 보관을 위해 -150℃에서 90% 소 태아 혈청 (FBS), 10% DMSO에 냉동하였다. PBMC를 10% FBS, 50nM 2-머캅토에탄올, 비-필수 아미노산, 1mM 소듐 피루베이트 및 10mM HEPES를 함유하는 완전한 RPMI 배지로 해동하였다. 다음으로, 완전한 RPMI로 96-웰 플레이트의 각 웰에 200,000개의 세포를 플레이팅하였다. 항-인간 PD-1 펨브롤리주맙(머크, KEYTRUDA®, MK-3475)을 5 μg/㎖로 첨가하고, 표 6 내지 표 9에 표시된 다른 항체를 1 μg/㎖로 첨가된 mAb 77, 78 및 81 내지 84를 제외하고는 표시된 대로 10 μg/㎖로 첨가하였다. 세포와 mAb를 37℃에서 30분 동안 배양하고, 포도상 구균의 장 독소 B(SEB)(이엠디 밀리포어(EMD Millipore), 매사추세츠주 빌레리카)를 최종 농도 0.1 μg/㎖로 첨가하였다. 활성화 4일 후, 상청액을 수집하고 -20℃에서 냉동하였다. 다중-매개변수 ProcartaPlex™ 검정(써모피셔 사이언티픽)을 사용하여 사이토카인 농도를 측정하였다. 데이터는 적어도 4명의 건강한 공여자를 나타낸다.
MLR 검정의 경우, Ficoll® Paque Plus(지이 헬스케어, 일리노이주 시카고)를 통한 구배 원심분리에 의해 전혈에서 PBMC를 먼저 단리하여 MHC-불일치 공여자로부터 단핵구와 T 세포를 단리하였다. 단핵구를 제조업체의 매뉴얼에 따라 CD16 고갈이 없는 EasySep™ 인간 단핵구 농축 키트(스템셀 테크놀로지스, 캐나다 밴쿠버)를 사용하여 PBMC로부터 단리하였다. 지시된 경우, 단핵구는 위에 기재된 바와 같은 항체의 존재하에 M2 대식세포로 분화되었다. T 세포를 제조업체의 매뉴얼에 따라 EasySep™ 인간 T 세포 단리 키트(스템셀 테크놀로지스(StemCell Technologies), 캐나다 밴쿠버)를 사용하여 PBMC로부터 단리하였다. 동종이계 혼합 림프구 반응을 U 바닥 96-웰 플레이트에 20,000개의 단핵구(M0)를 플레이팅하고, 표시된 1 μg/㎖의 항체와 함께 37℃에서 30분 동안 사전 항온처리하여 준비하였다. 그런 다음, 50,000개의 T 세포를 각각의 웰에 첨가하고, 및 세포를 37℃/5% CO2의 가습 인큐베이터에서 3일 동안 항온처리하였다. 배양 배지는 IMDM+10% FCS(소 태아 혈청)이었다. 제3일에, 세포를 제조업체의 매뉴얼에 따라 브레펠딘 A(바이오레전드, 캘리포니아주 샌디에고)와 함께 T 세포 활성화 칵테일을 사용하여 4시간 동안 세포를 다시 자극하였다. 지시된 경우, 상청액을 수집하고, T 세포를 Attune 유세포 분석기(써모 피셔 사이언티픽, 매사추세츠주 월섬)에서 유세포 분석에 의해 분석하고, FlowJo 소프트웨어(비디 바이오사이언스(BD Bioscience), 캘리포니아주 산호세)를 사용하여 분석하였다. 상청액으로부터의 사이토카인을 제조업체의 프로토콜에 따라 루미넥스 패널(써모 피셔(Thermo Fisher), 매사추세츠주 월섬)을 사용하여 측정하였다. 발광을 사이테이션 5 이미징 판독기(바이오텍(Biotek), 버몬트주 위누스키)를 사용하여 검출하였다. 데이터를 동형 대조군 그룹에 대해 정규화된 것으로 제시하였다.
이러한 검정에서, 검증된 표적에 대한 특정 항체가 다세포 면역 반응에 영향을 미칠 수 있음이 입증되었다. 이러한 일관 다세포 반응에는 이전에 입증된 바와 같이 골수 세포의 표현형 및 기능뿐만 아니라 림프 세포, 특히 T 세포의 기능적 결과물을 변경하는 것도 포함된다. SEB 분석의 결과는 도 5에 나타나 있다. 도 5A는 IFNγ의 T 세포 특이적 세포내 염색을 보여준다. 보다시피 특정 검증된 mAb는 IFNγ를 대조군 수준 이상으로 증가시킬 수 있다. 도 5B 및 도 5C는 SEB 검정으로부터 분비된 사이토카인 수준을 보여준다. 검증된 mAb로 처리하면 골수-유래 사이토카인 및 케모카인(예를 들어, IL-1B, GM-CSF 및 CCL3.4) 및 T 세포 유래 사이토카인(예를 들어, IL-2, IFNγ 및 IL-10)의 생산이 변경되었다. 이는 대식세포를 더욱 전-염증성 M1-유사 상태로 유도하는 것으로 검증된 mAb가 다세포 검정에서 일관된 효과를 가질 수 있고 염증성 사이토카인을 증가시킬 뿐만 아니라, 대식세포를 더욱 면역억제성 상태로 유도하는 것으로 검증된 mAb가 복합 다세포 검정에서 그 효과를 재현할 수 있음을 분명히 나타낸다.
도 6은 두 개의 서로 다른 반응이 표시된 MLR 실험의 결과를 보여준다. 도 6A는 T 세포에서 IFNγ 및 그랜자임 B에 대한 세포내 흐름 염색을 보여준다. 고정 및 투과화 단계를 포함하여 위에 기재된 바와 같이 세포내 염색을 수행하였다. 제조업체의 프로토콜에 따라 BD Cytofix/Cytoperm™ 고정/투과화 키트를 사용하여 세포내 에피토프에 대한 염색을 수행하였다. 이러한 검정에서, 일부 mAb는 T 세포 기능의 감소에 영향을 미칠 수 있다. MLR 분석이 염증성 GVHD 유형 반응을 모방한다는 점을 감안할 때, 결과는 염증 감소가 보장되거나 목적하 환경에서 대식세포 관련 표적을 사용할 가능성을 보여준다. 도 6B는 이전에 M2 대식세포를 더욱 M1-유사 상태로 유도하는 능력을 보여준 mAb에 대한 다른 별개의 반응을 보여준다. 림프- 및 골수-유래 사이토카인 둘 다의 증가가 결정되었으며, 이는 SEB 검정에서 결정된 것을 연상시킨다. 이 두 가지 검정은 대식세포 기능뿐만 아니라 T 세포 기능을 모두 변경하여 협동 면역 반응을 유도하는 대식세포 관련 표적을 조절하는 잠재력을 명확하게 보여준다.
실시예 5: 면역관문 저해제 치료와 비교하여 검증된 표적을 조절함으로써 대식세포 염증성 표현형 조절
관문 저해제, 예를 들어 PD-1 차단 항체는 현재 골드 스탠다드 면역-종양 치료제이다. 전통적으로, 관문 저해제는 T 세포 상에 직접 발현되는 저해성 수용체를 차단하여 종양에 대한 T 세포 활성을 직접 증가시키는 데 중점을 두었다. 위에서 검증된 것으로 나타난 표적은 먼저 대식세포의 표현형 및 기능을 변경한 다음 T 세포 활성화를 포함한 협동 면역 반응을 유도하는 것으로 나타났다. 따라서, 이러한 대식세포 관련 표적이 관문 저해제와 동일하거나 더 잘 기능하거나 잠재적으로 결합할 수 있는 능력을 확인하여야 한다.
관문 저해제가 작동하지 않는 경우를 포함하여 관문 저해제와 동일하거나 더 나은 기능을 하는 검증된 표적의 능력은 도 5에 나타나 있다. 이 검정에서, 2명의 공여자가 나타나 있다. 검정은 상기 SEB 검정에 기재된 바와 같이 수행하였다. 예를 들어, 공여자 5에서 PD1 차단제(예를 들어, 펨브롤리주맙 사용)는 IFNg 생산에 의해 표시되는 T 세포 특이적 반응의 증가를 초래한 반면, 공여자 2에서는 PD1 차단제의 존재하에 T 세포 활성의 증가가 없었다. 공여자 2 및 공여자 5 둘 다에서, 특정 항체는 T 세포- 및 골수성 세포-특이적 반응을 모두 유도할 수 있었다. 또한, PD1 차단제와 검증된 표적 항체의 조합은 부가적인 반응을 일으켜 단독으로 또는 관문 저해제와 조합하여 항-표적 치료제 사용의 효능을 나타낸다.
실시예 6: 종양 미세환경에서 대식세포-관련 표적의 발현 및 기능
검증된 대식세포-관련 표적을 종양 관련 대식세포(TAM)에서의 발현에 대해 테스트하였다(도 7). 위에 기재된 바와 같이 유세포 분석을 수행하였다. 대식세포-관련 표적은 폐, 종양, 신장 종양 및 부인과 암으로부터의 복수액의 세포 성분과 같은 TAM에서 발현되는 것으로 나타났다(도 7B). 이러한 검증된 대식세포-관련 표적의 일관된 강력한 발현은 다양한 종양 유형 및 시스템에서 볼 수 있다.
상기 시험관내 시스템은 이러한 검증된 대식세포-관련 표적이 대식세포 기능뿐만 아니라 T 세포를 포함한 복합 다세포 검정을 변경하는 능력을 명확하게 보여준다. 이러한 데이터는 생체외 배양 시스템에서 환자 종양 물질을 사용하여 추가로 확인하였다. 이러한 유형의 시스템은 인간 생체내 연구에 가깝고 일반적으로 인정되는 대용물을 나타내므로 치료적 이익에 대한 강력한 증거를 제공한다. 대식세포-관련 표적은 여러 독립적인 시스템을 사용하여 조직 환경에서 대식세포 생물학의 조절에 대해 추가로 테스트하였다.
이러한 목적을 위해 사용된 한 시스템은 해리된 종양 검정이었다. 해리된 종양은 예를 들어, 종양 세포, 면역 세포 및 지지 T 세포를 포함하는 종양 미세환경에 존재하는 모든 다양한 세포 집단을 포함한다. 이러한 생존 가능한 단일 세포 현탁액은 많은 응용 분야에 유용하며, 실험의 각 반복 내에서 세포 수 및 조성물의 정규화를 허용한다. 신선한 종양 조직(24 시간 미만) 획득시 해리된 종양 실험을 수행하기 위해, 가위와 메스를 사용하여 종양 샘플에서 주변 지방, 섬유질 영역 및 괴사 영역을 제거하였다. 종양을 2 내지 4 mm3의 작은 조각으로 절단하였다. 제조업체의 프로토콜에 따라 종양 해리 키트 효소 믹스(엠에이씨에스 밀텐이 바이오텍(MACS Miltenyi Biotec))를 제조하였다. 종양 조각 및 해리 효소를 5㎖의 스냅록 마이크로원심분리 튜브로 옮기고, 직선 가위를 사용하여 조직을 다졌다. 튜브를 200 내지 250rpm으로 37℃에서 45분 내지 1시간 동안 진탕기에 두었다. 항온처리 시간이 끝나면, 분해된 종양을 40 μM의 세포 여과기를 통해 50㎖ Falcon™ 원추형 원심 분리 튜브로 여과하였다. 튜브를 차가운 2% 내지 5% FBS/PBS 혼합물로 채워 분해를 중단하였다. 나머지 단계는 모두 얼음에서 수행하였다. 특히, 튜브를 300g에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 버리고, 세포를 차가운 2% 내지 5% FBS/PBS 혼합물로 2회 세척하였다. 마지막 세척 후, 세포를 1㎖ 내지 5㎖의 차가운 2% 내지 5% FBS/PBS 혼합물에 재현탁시키고 세포 계수를 수행하였다.
대략 300k 내지 400k의 세포를 1㎖의 배지(L-글루타민, 4.5 g/L 글루코스 및 소듐 피루베이트(피셔 사이언티픽(Fisher Scientific)), Gibco™ GlutaMAX™ 보충제(피셔 사이언티픽), Gibco™ MEM 비-필수 아미노산 용액(피셔 사이언티픽), 2-머캅토에탄올(55mM)(피셔 사이언티픽), 열 불활성화된 인간 남성 AB 혈장(시그마-알드리치 인코포레이션(Sigma-Aldrich, Inc)), 소 혈청 열 불활성화된(바이오플루이드 테크놀로지스(BioFluid Technologies)), 100×펜/스트렙 및 인간 M-CSF(바이오레전드)를 갖는 DMEM) 및 지시된 항체를 포함하는 6-웰 배양 플레이트의 각각의 웰에 플레이팅하였다. 모든 항체를 10 ㎍/㎖의 농도로 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 5% CO2로 24시간 또는 48시간 동안 세포 배양 인큐베이터에서 항온처리하였다. 연구의 마지막에, 배양 상청액의 사이토카인/케모카인을 제조업체의 지침에 따라 Invitrogen™ Luminex™ 사이토카인 인간 자성 25-플렉스 패널을 사용하여 측정하였다.
특이적 항체로 처리된 종양 샘플뿐만 아니라 펨브롤리주맙(KEYTRUDA®)이 도 8에 나타나 있다. 본 명세서에 기재된 데이터는 6개의 종양 유형을 포함하는 34개(도 8A 내지 도 8C) 또는 11개(도 8D)의 개별적인 종양을 제시한다. 데이터는 TNFα, GM-CSF 및 IL-12의 생산에 의해 나타난 바와 같이 TAM 내에서 M1-유사 전-염증성 기능을 유도하는 검증된 대식세포-관련 표적에 대한 항체의 능력을 보여준다. 이러한 검정은 또한 IFNg와 같은 사이토카인의 생산에 의해 나타난 바와 같이 대식세포 기능을 넘어서 종양 내에서 협동 면역 반응을 유도할 가능성을 보여준다. 이것은 면역억제성 환경에서 표면 수용체를 향한 단일 작용제를 투여하고, 골수성 세포를 조절하고, 차례로 T 세포 반응에 영향을 주어 종양에서 M2-를 M1-유사로 분화를 유도하며 항 종양 반응을 유도할 수 있는 잠재력을 보여주므로 중요한 발견이다. 이러한 강력한 협동 면역 반응을 펨브롤리주맙(KEYTRUDA®) 반응과 직접 비교하였고, 그 결과는 대식세포 관련 표적을 조절하는 것이 검증된 표적을 대상으로하는 단일 작용제 요법의 효과적인 사용을 보여주는 훨씬 더 강력한 반응을 가질 수 있음을 보여준다. 또한, 펨브롤리주맙(KEYTRUDA®)이 분명하지 않은 경우에 대식세포-관련 표적의 효과가 나타나 반응자의 수를 늘리는 길을 열었다. 선택된 항체는 또한 펨브롤리주맙(KEYTRUDA®)과 결합되어 효능을 증가시키고/시키거나 관문 요법에 대한 저항성을 극복하기 위한 조합 요법을 보여주는 추가적 효과를 보여준다. 또한, 펨브롤리주맙(KEYTRUDA®)은 IFNg 생산을 자극하는 것 외에도 면역억제성 IL-10을 유도하여 그 활성을 제한할 수 있는 반면, 표적 참여는 면역억제성 IL-10을 자극하지 않았음에 유의하여야 한다. 또한, 항-종양 면역 반응을 더 영속화하기 위해 신선한 면역 세포를 동원하는 것으로 여겨지는 케모카인의 상당한 상향 조절의 분명한 사례가 있다.
해리된 종양 검정의 결과를 추가로 확인하기 위해 제2 시스템을 사용하였다. 간략하게는, 해리된 종양 검정은 수행된 모든 조건에서 세포 수를 정규화할 수 있다는 장점이 있다. 이들은 또한 종양 구조및 비-세포 기질 성분 잃는 잠재적인 단점을 가지고 있다. 이러한 문제를 해결하고 온전한 종양에서 협동 면역 반응을 유도하는 검증된 표적의 능력을 입증하기 위해 조직 슬라이스 배양을 수행하였다. 신선한 종양 조직 샘플(24 시간 미만)을 획득한 후, 가위와 메스를 사용하여 종양 샘플에서 주변 지방, 섬유 및 괴사 부위를 최대한 제거하였다. 조직을 4% 아가로스를 사용하여 조직 몰드의 중앙에 포매하였다. 응고 후, 아가로스 블록을 제거하고 몰드를 Leica VT1000 S 마이크로톰 조직 홀더에 부착하고, Leica VT1000 S 마이크로톰을 사용하여 300 내지 400 마이크론 절편으로 절단하였다.
조직 슬라이스를 세포 배양 삽입물로 옮긴 다음, 배지(L-글루타민, 4.5g/L 글루코스 및 소듐 피루베이트(피셔 사이언티픽), Gibco™ GlutaMAX™ 보충제(피셔 사이언티픽), Gibco™ MEM 비-필수 아미노산 용액(피셔 사이언티픽), 2-머캅토에탄올(55mM)(피셔 사이언티픽), 열 불활성화된 인간 남성 AB 혈장(시그마-알드리치 인코포레이션), 열 불활성화된 소 혈청(바이오플루이드 테크놀로지스), 100×펜/스트렙, 및 인간 M-CSF(바이오레전드)갖는 DMEM) 및 지시된 항체가 담긴 6-웰 세포 배양 플레이트의 웰에 넣었다. 모든 항체를 10 ㎍/㎖의 농도로 첨가하였다. 그런 다음, 슬라이스를 37℃, 5% mRNA 전mRNA 전 1일 내지 5일 동안 항온처리하였다. 연구의 마지막에, 제조업체의 지침에 따라 Invitrogen™ Luminex™ 사이토카인 인간 자성 25-플렉스 패널을 사용하여 측정된 배양 상청액으로 분비된 사이토카인/케모카인 양을 분석하여 효능을 평가하였다. 종양 조직 샘플이 Leica VT1000 S 마이크로톰을 사용하여 절단하기에 적절하지 않은 경우, 가능한 한 얇게 메스를 사용하여 절단하고, 이후에 슬라이스는 위에 기재된 바와 같이 처리하였다. 모든 샘플에 대해, 처리 전에 슬라이스를 취하고 면역 표현형 분석에 이용하였다. 이 슬라이스는 위에 기재된 바와 같이 해리하고, 유세포 분석을 위해 위에 기재된 바와 같이 염색하였다.
도 8은 여러 종양 유형 및 공여자에 대해 선택된 항체의 기능을 보여준다. 이 도면에서, 신장, 폐 및 GI 종양을 포함한 6개의 상이한 종양의 결과를 각각의 치료에 대해 조합하였다. 전-염증성 반응의 유도는 일관되고 유의미하여, 광범위한 기능과 적용 가능성을 보여주었다. 이러한 다양한 종양은 도 10A 내지 도 10C에 나타낸 바와 같이 고도로 침윤된 예와 최소로 침윤된 종양으로 구성된다. 이러한 결과는 검증된 표적에 대한 항체가 종양 미세환경 내에서 강력한 전-염증성 및 가능성 있는 항-종양 면역 반응을 유도할 수 있음을 추가로 보여준다. 이러한 효과는 T 세포 침윤이 매우 적거나 없는 종양을 포함하여 펨브롤리주맙(KEYTRUDA®)의 효과와 같거나 더 클 수 있다.
도 9A 내지 도9C는 위에 기재된 바와 같이 검증된 siRNA뿐만 아니라 항체로 처리된 3개의 개별 종양 유형으로부터 발생하는 사이토카인 생성을 보여준다. 3개의 독립적인 샘플 모두에서, 검증된 대식세포-관련 표적을 항체 또는 siRNA로 조절하면 골수성 및 림프성 특이적 반응을 포함한 전-염증성 면역 반응이 유도되었다.
도 9A 및 도9B는 또한 PD1 차단제와 관련하여 두 가지 상이한 반응을 보여준다. 폐 종양 검정(도 9A)은 IFNg 및 TNFα와 같은 예상되는 사이토카인이 생성되는 펨브롤리주맙(KEYTRUDA®)에 대한 반응을 보여준다.
이러한 종양에서 표적에 대해 선택된 항체는 펨브롤리주맙(KEYTRUDA®) 치료와 동일하거나 더 큰 반응을 유도하였다. 도 9B에 나타낸 GI 종양 결과는 펨브롤리주맙(KEYTRUDA®)에 의해 유도된 반응을 제공하지 않는다. 중요하게는, 이러한 종양의 면역표현형은 PD1+CD8 T 세포의 현저한 집단을 보여 주었다(도 10A)-PD-1 반응에 필요하지만 충분하지는 않은 특징. 이러한 종양에서, 나타낸 항체는 IFNg의 생산에 의해 입증된 바와 같고, CCL3, CCL4 및 GM-CSF 및 T 세포의 생산에 의해 입증된 바와 같이 두 골수성 세포로부터 반응을 여전히 유도할 수 있었다.
따라서, 적어도 다음의 대표적인 예가 제공된다: a) T 세포 침윤 종양에서, 검증된 대식세포-관련 표적(VTx) 단일요법 또는 병용 요법은 펨브롤리주맙(KEYTRUDA®)보다 T 세포 및 대식세포의 더 강력한 활성화를 유도함; b) T 세포 침윤 종양에서, VTx 단일요법 또는 병용은 펨브롤리주맙(KEYTRUDA®)이 그렇지 않은 경우 T 세포 및 대식세포 둘 다의 활성화를 유도할 수 있음; c) T 세포 침윤이 전혀 없거나/매우 불량한 종양에서, VTx 단일요법 또는 병용은 종양 미세환경에서 광범위한 염증성 변화를 유발할 수 있음; 및 면역관문 저해에 대해 가산적이고 잠재적인 시너지 효과의 명확한 달성.
이론에 얽매이지 않고, 염증 상태에 의해 영향을 받는 대식세포는 이들의 존재가 다른 면역 세포와 같은 항원-특이적 상호작용에 국한되지 않으므로 면역 반응을 조절한다고 여겨진다. 따라서, 이러한 모든 수준의 면역 침윤에 걸쳐 면역 반응을 유도하는 능력은 종양 유형 및 면역 상태에 걸쳐 광범위한 적용 가능성을 보여준다. 모든 인간 암의 약 4분의 1이 면역 결핍(immune desert)으로 간주되는 반면, 나머지는 면역 세포에 의해 침윤된다. 이들 종양 중 소수만이 T 세포에 의해 완전한 면역 감시를 받는 반면, 이들 모두는 감시(전-염증성) 및 종양 지원 (전-종양성) 대식세포 모두에 의해 상당한 침윤을 보인다. 도 11은 인간 암의 대규모 공개 데이터 세트(TCGA, 문헌[The Cancer Genome Atlas, 2017 버전], 오믹소프트(OmicSoft)/퀴아젠(Qiagen)에 의해 처리되고 배포됨)의 암 유형 전반에 걸친 대 식세포 침윤-종양 분포를 보여준다. 종양 침윤은 컷오프 위의 정규 골수성 마커 CD11b의 존재에 의해 측정하였다. 컷오프는 데이터 세트의 모든 원발성 종양에 걸친 CD11b mRNA 발현 분포의 제1 사분위수(first quartile)로 정의된다. 이러한 대식세포-침윤 종양은 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법에 따른 조절에 특히 유용한 것으로 여겨진다.
생물학적 기탁
본 발명의 대표 물질은 2019년 6월 4일 및 2019년 6월 20일에 버소 테라퓨틱스 인코포레이션(Verseau Therapeutics, Inc.)에 의해 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection: ATCC)에 기탁되었다. 특히, "13H10"(PTA-125944), "13J19"(PTA-125945), "18F02"(PTA-125946) 및 "19I01"(PTA-125943)의 이름을 가진 단일 클론 항체가 개별 기탁으로 기탁되었고, 표 9 및 실시 예에 나타낸 특성을 확인하였으며, 특허 절차 및 그에 따른 규정을 목적으로 하는 미생물 기탁에 대한 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약(부다페스트 조약)의 조항에 따라 버소 테라퓨틱스 인코포레이션에 의해 2019년 6월 4일 ATCC에 기탁되었다. 마찬가지로, "1F01"(PTA-126025), "3C01"(PTA-126026), "10M15"(PTA-126027), "4H23"(PTA-126028), "7A12"(PTA-126029) 및 "7F19"(PTA-126030)의 이름을 가진 단일클론 항체가 개별 기탁으로 기탁되었고, 표 9 및 실시 예에 나타낸 특성을 확인하였으며, 특허 절차 및 그에 따른 규정을 목적으로 하는 미생물 기탁에 대한 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약(부다페스트 조약)의 조항에 따라 버소 테라퓨틱스 인코포레이션에 의해 2019년 6월 20일 ATCC에 기탁되었다. 이는 기탁일로부터 30년 동안 유효한 기탁의 유지를 보장한다. 기탁은 부다페스트 조약의 조건에 따라 ATCC에 의해 제공되며, 버소 테라퓨틱스 인코포레이션과 ATCC 사이의 계약에 따라 해당 미국 특허 또는 관련 미국 특허의 발행시 대중에게 영구적이고 제한되지 않은 기탁의 이용 가능성을 보장한다. 미국 또는 외국 특허 출원 중 먼저 도래하는 것이 공개될 때, 35 U.S.C. 섹션 122 및 이에 따른 위원의 규칙에 따라 미국 특허 및 상표 국장이 결정한 기탁의 이용 가능성을 보장한다(886 OG 638에 대한 특정 참조와 함께 37 C.F.R. 섹션 1.14 포함).
본 출원의 양수인은 기탁이 소실되거나 파기되어야 할 경우, 해당 물질은 통지하는 즉시 동일한 다른 것으로 대체될 것이라는 데 동의하였다. 기탁된 물질의 이용 가능성은 특허법에 따라 임의의 정부의 권한하에 부여된 권리를 위반하여 발명을 실시할 수 있는 라이센스로 해석되어서는 안된다.
참조에 의한 원용
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 참조에 의해 원용되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 것처럼 그 전문이 참조에 의해 원용된다. 상충되는 경우, 본 명세서에 정의된 정의를 포함하는 본 출원이 우선한다.
또한 월드 와이드 웹 상의 게놈 연구소(Institute for Genomic Research: TIGR) 및/또는 월드 와이드 웹 상의 미국 국립생물공학정보센터(NCBI)에 의해 유지되는 것과 같은 공개 데이터베이스의 항목과 관련된 수탁 번호를 참조하는 모든 폴리 뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 서열은 그 전체가 참조에 의해 원용된다.
등가물 및 범위
본 발명에 포함되는 하나 이상의 실시형태의 세부 사항은 위의 설명에 기재되어 있다. 바람직한 물질 및 방법이 위에 기재되었지만, 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 물질 및 방법이 본 발명에 포함되는 실시형태의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있다. 본 발명과 관련된 다른 특징, 목적 및 이점은 설명으로부터 명백하다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 상충되는 경우, 위에 제공된 본 설명이 우선한다.
당업자는 일상적인 실험, 본 명세서에 기재된 본 발명에 포함되는 특정 실시형태에 대한 많은 등가물을 사용하여 인지하거나 확인할 수 있을 것이다. 본 발명의 범위는 본 명세서에 제공된 설명으로 제한되지 않으며, 이러한 등가물은 첨부된 청구범위에 포함되도록 의도된다.
단수 표현은 반대로 지시되거나 문맥에서 달리 명백하지 않는 한, 단수 표현의 문법적 대상 중 하나 또는 하나 이상(즉, 적어도 하나)을 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용된다. 예로서, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 이상의 요소를 의미한다. 하나 이상의 그룹의 구성원 사이에 "또는"을 포함하는 청구항 또는 설명은 그룹 구성원 중 하나, 둘 이상 또는 모든 구성원이 상반되는 것으로 표시되거나 문맥에서 달리 명백하지 않는 한 주어진 제품 또는 프로세스에 존재하거나, 사용되거나 또는 달리 관련되는 경우 충족된 것으로 간주된다. 본 발명은 그룹의 정확히 하나의 구성원이 주어진 제품 또는 공정에 존재하거나, 사용되거나, 달리 관련되는 실시형태를 포함한다. 본 발명은 또한 하나 이상의 또는 전체 그룹 구성원이 주어진 제품 또는 공정에 존재하거나, 사용되거나, 달리 관련되는 실시형태를 포함한다.
또한, 용어 "포함하는"은 개방적이며 허용되는 것으로 의도되지만, 추가적인 요소 또는 단계를 포함할 필요가 없다는 점에 유의한다. 용어 "포함하는"이 본 명세서에서 사용되는 경우, 따라서 용어 "이루어지는"도 또한 포함되고 개시된다.
범위가 제공되는 경우, 종료 지점이 포함된다. 또한, 달리 표시되지 않거나 또는 문맥 및 당업자의 이해로부터 명백하지 않는 한, 범위로 표현되는 값은 본 발명은 문맥상 명백히 달리 명시하지 않는 한, 범위의 하한의 단위의 10 분의 1까지 본 발명에 포함된 다른 실시형태에서 언급된 범위 내의 임의의 특정 값 또는 하위 범위를 추정할 수 있음이 이해되어야 한다.
또한, 종래 기술에 속하는 본 발명의 임의의 특정 실시형태는 임의의 하나 이상의 청구항으로부터 명시적으로 배제될 수 있음이 이해되어야 한다. 이러한 실시형태는 당업자에게 공지된 것으로 간주되기 때문에, 본 명세서에서 배제가 명시 적으로 기재되지 않더라도 배제될 수 있다. 본 발명에 포함되는 조성물의 임의의 특정 실시형태(예를 들어, 임의의 항생제, 치료 또는 활성 성분, 임의의 생산 방법, 임의의 사용 방법 등)는 선행 기술의 존재와 유무와 관련없이 임의의 이유로 임의의 하나 이상의 청구항에서 배제될 수 있다.
사용된 단어는 제한이 아니라 설명을 위한 단어이며, 더 넓은 측면에서 본 발명에 포함된 진정한 범위 및 정신을 벗어나지 않고 첨부된 청구범위의 범위 내에서 변경이 이루어질 수 있음이 이해되어야 한다.
본 발명이 여러 기재된 실시형태에 대해 어느 정도 상세하게 설명되었지만, 이러한 특정 또는 실시형태 또는 임의의 특정 실시형태로 제한되어야 하는 것은 아니지만, 이는 종래 기술의 관점에서 그러한 청구범위의 가능한 가장 넓은 해석을 제공하고 따라서 본 발명의 의도된 범위를 효과적으로 포함하도록 첨부된 청구범위를 참조하여 해석되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> VERSEAU THERAPEUTICS, INC. <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING MONOCYTE AND MACROPHAGE INFLAMMATORY PHENOTYPES AND IMMUNOTHERAPY USES THEREOF <130> WO2020006385 <140> PCT/US2019/039773 <141> 2019-06-28 <150> 62/867,532 <151> 2019-06-27 <150> 62/857,199 <151> 2019-06-04 <150> 62/810,683 <151> 2019-02-26 <150> 62/692,463 <151> 2018-06-29 <160> 730 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1600 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 tagggcctcc tctaagtctt gagcccgcag ttcctgagag aagaaccctg aggaacagac 60 gttccctcgc ggccctggca cctctaaccc cagacatgct gctgctgctg ctgcccctgc 120 tctgggggag ggagagggcg gaaggacaga caagtaaact gctgacgatg cagagttccg 180 tgacggtgca ggaaggcctg tgtgtccatg tgccctgctc cttctcctac ccctcgcatg 240 gctggattta ccctggccca gtagttcatg gctactggtt ccgggaaggg gccaatacag 300 accaggatgc tccagtggcc acaaacaacc cagctcgggc agtgtgggag gagactcggg 360 accgattcca cctccttggg gacccacata ccaagaattg caccctgagc atcagagatg 420 ccagaagaag tgatgcgggg agatacttct ttcgtatgga 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ctcggctctc 1080 agcaggtcta cctgaacgtc tccctgcaga gcaaagccac atcaggagtg actcaggggg 1140 tggtcggggg agctggagcc acagccctgg tcttcctgtc cttctgcgtc atcttcgttg 1200 tagtgaggtc ctgcaggaag aaatcggcaa ggccagcagc gggcgtggga gatacgggca 1260 tagaggatgc aaacgctgtc aggggttcag cctctcaggg gcccctgact gaaccttggg 1320 cagaagacag tcccccagac cagcctcccc cagcttctgc ccgctcctca gtgggggaag 1380 gagagctcca gtatgcatcc ctcagcttcc agatggtgaa gccttgggac tcgcggggac 1440 aggaggccac tgacaccgag tactcggaga tcaagatcca cagatgagaa actgcagaga 1500 ctcaccctga ttgagggatc acagcccctc caggcaaggg agaagtcaga ggctgattct 1560 tgtagaatta acagccctca acgtgatgag ctatgataac actatgaatt atgtgcagag 1620 tgaaaagcac acaggcttta gagtcaaagt atctcaaacc tgaatccaca ctgtgccctc 1680 ccttttattt ttttaactaa aagacagaca aattcctaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 1737 <210> 4 <211> 463 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Gly Arg Glu Arg Ala Glu 1 5 10 15 Gly Gln Thr Ser Lys Leu Leu Thr Met Gln Ser Ser Val Thr Val Gln 20 25 30 Glu 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tcataagctt 1620 gaccttttta ctcctcttct ccccttcccc tccttccccg ccccctcttc tcctcctcct 1680 ctctcccctc tcctcccctc ttccttttgt tttttccaag acagggtttc tctgtgtagc 1740 cttggctgtc ctagaacttg ctctgcagac cagactgccc ttgaactctt ctttccaagt 1800 gctgggatta aagatgtgca ccaccaccca gcacttgact ttattgtaa 1849 <210> 6 <211> 467 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Met Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Trp Gly Ile Lys Gly Val 1 5 10 15 Glu Gly Gln Asn Pro Gln Glu Val Phe Thr Leu Asn Val Glu Arg Lys 20 25 30 Val Val Val Gln Glu Gly Leu Cys Val Leu Val Pro Cys Asn Phe Ser 35 40 45 Tyr Leu Lys Lys Arg Leu Thr Asp Trp Thr Asp Ser Asp Pro Val His 50 55 60 Gly Phe Trp Tyr Arg Glu Gly Thr Asp Arg Arg Lys Asp Ser Ile Val 65 70 75 80 Ala Thr Asn Asn Pro Ile Arg Lys Ala Val Lys Glu Thr Arg Asn Arg 85 90 95 Phe Phe Leu Leu Gly Asp Pro Trp Arg Asn Asp Cys Ser Leu Asn Ile 100 105 110 Arg Glu Ile Arg Lys Lys Asp Ala Gly Leu Tyr Phe Phe Arg Leu Glu 115 120 125 Arg Gly Lys Thr Lys Tyr Asn Tyr Met Trp Asp Lys Met Thr Leu Val 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tgatggacaa acgatagcgg aatccttcaa ggtttcaagg 2220 ctgtctcctt caggcagcct tcccggaatt ctccatccct cagtgcagga tgggggctgg 2280 tcctcagctg tctgccctca gcccctggcc ccccaggaag cctctttcat gggctgttag 2340 gttgacttca gttttgcctc ttggacaaca gggggtcttg tacatccttg ggtgaccagg 2400 aaaagttcag gctatggggg gccaaaggga gggctgcccc ttccccacca gtgaccactt 2460 tattccactt cctccattac ccagttttgg cccacagagt ttggtccccc ccaaacctcg 2520 gaccaatatc cctctaaaca tcaatctatc ctcctgttaa agaaaaaaaa aaa 2573 <210> 40 <211> 412 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Met Pro Leu Gln Leu Leu Leu Leu Leu Ile Leu Leu Gly Pro Gly Asn 1 5 10 15 Ser Leu Gln Leu Trp Asp Thr Trp Ala Asp Glu Ala Glu Lys Ala Leu 20 25 30 Gly Pro Leu Leu Ala Arg Asp Arg Arg Gln Ala Thr Glu Tyr Glu Tyr 35 40 45 Leu Asp Tyr Asp Phe Leu Pro Glu Thr Glu Pro Pro Glu Met Leu Arg 50 55 60 Asn Ser Thr Asp Thr Thr Pro Leu Thr Gly Pro Gly Thr Pro Glu Ser 65 70 75 80 Thr Thr Val Glu Pro Ala Ala Arg Arg Ser Thr Gly Leu Asp Ala Gly 85 90 95 Gly Ala Val Thr Glu Leu Thr Thr 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1560 ccaagatttc cttctgtatc actccaagca gcctcagcag aagaagcagc catgcccagt 1620 attcccactc tccaaaagga actgaccagc ttatatttct cacacttctg gggaactggg 1680 tataatccaa ccatcaaaat agaagacctt gcaagaagca gagtcattct ccagaaggaa 1740 cttgggagat gatggtgcag atgatgaaac tgggttcatc ccagttccaa agactcagag 1800 aactagagtt taagctgagg cagagtgccg ccaccctggc atgccccaca aacagatcac 1860 cagccagctt acacaggcat taactctcct caatgaggaa gaatcattca caactgagca 1920 agacattcat atgatcattt aaggaagtgt ttcccttatg tgttagcaag tataatcggc 1980 taactcctaa atcccaatga atagtcctag gctggacagc aatgggctgc aattaggcag 2040 ataaagacat cagtcccagt aaatgaatcc atagactcat ctagcaccaa ctaccattag 2100 cactatgtta ggagctgcaa ggccccaaag tagaagatgt gcataatgtc tgctcttgtg 2160 tagctcagga gacaattcca gcacagacac tacagttaac gctgaactgc agctgcaagt 2220 aatagcatga acagtcagaa aaatacctta tgagggggca gggctgaagc tgggccttga 2280 aggatggatg aaatttggat agagaatgag gaagacagag ggcctccaag tgagagaagc 2340 atgaaaaatg agcaggggcc tggatcagtg gggtgtattc agagcacctc tccagatgca 2400 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musculus <400> 66 Met Ala Gln Arg His Leu Trp Ile Trp Phe Leu Cys Leu Gln Thr Trp 1 5 10 15 Ser Glu Ala Ala Gly Lys Asp Ala Asp Pro Val Val Met Asn Gly Ile 20 25 30 Leu Gly Glu Ser Val Thr Phe Leu Leu Asn Ile Gln Glu Pro Lys Lys 35 40 45 Ile Asp Asn Ile Ala Trp Thr Ser Gln Ser Ser Val Ala Phe Ile Lys 50 55 60 Pro Gly Val Asn Lys Ala Glu Val Thr Ile Thr Gln Gly Thr Tyr Lys 65 70 75 80 Gly Arg Ile Glu Ile Ile Asp Gln Lys Tyr Asp Leu Val Ile Arg Asp 85 90 95 Leu Arg Met Glu Asp Ala Gly Thr Tyr Lys Ala Asp Ile Asn Glu Glu 100 105 110 Asn Glu Glu Thr Ile Thr Lys Ile Tyr Tyr Leu His Ile Tyr Arg Lys 115 120 125 Leu Trp Gln His Gly Ala Leu Asp Leu Leu Leu Ile 130 135 140 <210> 67 <211> 3287 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 67 agtgcttgga gttcctctgt gactgaccac ttcttccttt tctgtctaat ggtgaacacc 60 tttctggacc agctctggac cagaatctga tttatgctct gctccggaaa caccacactg 120 aagtgaaagc agctaccaca ccagttattt ttcctcagaa gactggagtc tgactggaca 180 tggcccagcg ccatctgtgg atctggttcc tttgcctaca aacctggtct 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aagaatggca cggtctgcct 720 cagtccaccc tgtaccctgg gtaagaagga tccctgggag ctgagggggg cacagggtaa 780 ctggagttgt tttgaacaaa gaaaggctgg gggtcctatt cagcctcctt gcacagtgtg 840 gtggtgaatc cctaaggtgt ctgggagagc tgggagacgt gggttctgcc accagctcta 900 ccaccacctc ccagccagct tacctcaact tcgtgggggc tcagtgttct cacctgcaaa 960 ggacgtttgg gagagatctc tgatactcct cttccctctc ccgctctaac aaagcatagt 1020 cctaacatct gaggccaggg tcatcataga gtagactgaa acatcagggt gagcagggag 1080 aaggaagggc aagtgggcga gcagctgtct agaggggctt cattagacag ccgaagtcag 1140 ccaaggaaag agggaccgag gtcattagac cgccaaagtc agccagggaa agagggactg 1200 aggagacggg cctgagagag gccgtcgagg aggcgtgaga gcctgagcct caggcgaagc 1260 ttctcctccc cagcctgatg ttcctagatg aacttaggaa gccagattcc cctgtctcct 1320 gggaggatcc actcatgagt gtcacacctg gctctagatc aggcctacac tggtgctagc 1380 atgggacagc taaggccatg ggttttagag tcagtcatac ctggggtcac ttctaggact 1440 gtcacttact agctaaacaa gttacttagc ttccccaagt catgttcttc ctaaataaag 1500 gacaaaataa cagttcctat aaaaaaaaaa aaaaaaa 1537 <210> 76 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tatatgtatc tacgggggcc tggggctggg cgggctcctg cttctggcag tggtccttct 180 gtccgcctgc ctgtgttggc tgcatcgaag agtaaagagg ctggagagga gctggcacct 240 tctgtcctgg tcccaggccc agggctcctc agagcaggaa ctccactatg catctctgca 300 gaggctgcca gtgcccagca gtgagggacc tgacctcagg ggcagagaca agagaggcac 360 caaggaggat ccaagagctg actatgcctg cattgctgag aacaaaccca cctgagcacc 420 ccagacacct tcctcaaccc aggcgggtgg acagggtccc cctgtggtcc agccagtaaa 480 aaccatggtc cccccacttc tgtgtctcag tcctctcagt ccatctcgag cctccgttca 540 aattgatcat catcaaaact tatgtggctt tttgaccttt gaatagggaa ttttttaaat 600 tttttaaaaa ttaaaataaa aaaaacacat ggctcaccct tccacccaaa aaa 653 <210> 88 <211> 104 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 88 Met Leu Ser Arg Asn Asp Asp Ile Cys Ile Tyr Gly Gly Leu Gly Leu 1 5 10 15 Gly Gly Leu Leu Leu Leu Ala Val Val Leu Leu Ser Ala Cys Leu Cys 20 25 30 Trp Leu His Arg Arg Val Lys Arg Leu Glu Arg Ser Trp His Leu Leu 35 40 45 Ser Trp Ser Gln Ala Gln Gly Ser Ser Glu Gln Glu Leu His Tyr Ala 50 55 60 Ser Leu Gln Arg Leu Pro Val 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gatgaggagg agggtgagag gcagagccct cccctggagg tgtctgatgg 720 agaagctgat ggcttggagc ctgggccagg tcttctgcac ggggagacag gcagcaagaa 780 aaagattcgc ctgtaccagt tcctgctgga cctgctgcgc agcggcgaca tgaaggacag 840 catctggtgg gtggacaagg acaaaggtac cttccagttc tcgtccaagc acaaggaggc 900 gctggcgcac cgctggggca tccagaaggg caaccgcaag aagatgacct accagaagat 960 ggcgcgcgcg ctgcgcaact acggcaagac aggcgaggtg aagaaagtca agaagaagct 1020 cacctaccag ttcagcggcg aggtgctggg ccgtgggggc ctggccgagc ggcgcctccc 1080 gccccactga tcgcccgcag agaccgccag gctcctggac cccgccggcc atagcattaa 1140 cccgtcgccc ggcccggaca cagggaggac attcccaggg ccgaggcagg actgggggcc 1200 cggcctcgcc ctcccatgcc cggcctggcc cgccccaccc gctttgcctc ccaccaggac 1260 tctagcccgc tccaagggcc gcctgggcct cggacctcaa ccgagggtca gcctggctta 1320 gtggccacgg tgcttccttg ggagtctggc gctggcacct ttttgtatat tgaatgcttt 1380 ttaaaaagct cttcctcccc accccctcat tagtcactaa agacaagtaa aattattgac 1440 agctattctc ccagaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 1473 <210> 108 <211> 272 <212> PRT <213> Mus musculus 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gaaggtcttc attacacctg cagctctcat 900 tttccataca gtcagtatca attctggaag aatttccaga cattaaagat agtcatcttg 960 gggctggtcc tgccgctgct tgtcatggtc atctgctact cgggaatcct aaaaactctg 1020 cttcggtgtc gaaatgagaa gaagaggcac agggctgtga ggcttatctt caccatcatg 1080 attgtttatt ttctcttctg ggctccctac aacattgtcc ttctcctgaa caccttccag 1140 gaattctttg gcctgaataa ttgcagtagc tctaacaggt tggaccaagc tatgcaggtg 1200 acagagactc ttgggatgac gcactgctgc atcaacccca tcatctatgc ctttgtcggg 1260 gagaagttca gaaactacct cttagtcttc ttccaaaagc acattgccaa acgcttctgc 1320 aaatgctgtt ctattttcca gcaagaggct cccgagcgag caagctcagt ttacacccga 1380 tccactgggg agcaggaaat atctgtgggc ttgtgacacg gactcaagtg ggctggtgac 1440 ccagtcagag ttgtgcacat ggcttagttt tcatacacag cctgggctgg gggtggggtg 1500 ggagaggtct tttttaaaag gaagttactg ttatagaggg tctaagattc atccatttat 1560 ttggcatctg tttaaagtag attagatctt ttaagcccat caattataga aagccaaatc 1620 aaaatatgtt gatgaaaaat agcaaccttt ttatctcccc ttcacatgca tcaagttatt 1680 gacaaactct cccttcactc cgaaagttcc ttatgtatat ttaaaagaaa gcctcagaga 1740 attgctgatt cttgagttta gtgatctgaa cagaaatacc aaaattattt cagaaatgta 1800 caacttttta cctagtacaa ggcaacatat aggttgtaaa tgtgtttaaa acaggtcttt 1860 gtcttgctat ggggagaaaa gacatgaata tgattagtaa agaaatgaca cttttcatgt 1920 gtgatttccc ctccaaggta tggttaataa gtttcactga cttagaacca ggcgagagac 1980 ttgtggcctg ggagagctgg ggaagcttct taaatgagaa ggaatttgag ttggatcatc 2040 tattgctggc aaagacagaa gcctcactgc aagcactgca tgggcaagct tggctgtaga 2100 aggagacaga gctggttggg aagacatggg gaggaaggac aaggctagat catgaagaac 2160 cttgacggca ttgctccgtc taagtcatga gctgagcagg gagatcctgg ttggtgttgc 2220 agaaggttta ctctgtggcc aaaggagggt caggaaggat gagcatttag ggcaaggaga 2280 ccaccaacag ccctcaggtc agggtgagga tggcctctgc taagctcaag gcgtgaggat 2340 gggaaggagg gaggtattcg taaggatggg aaggagggag gtattcgtgc agcatatgag 2400 gatgcagagt cagcagaact ggggtggatt tgggttggaa gtgagggtca gagaggagtc 2460 agagagaatc cctagtcttc aagcagattg gagaaaccct tgaaaagaca tcaagcacag 2520 aaggaggagg aggaggttta ggtcaagaag aagatggatt ggtgtaaaag gatgggtctg 2580 gtttgcagag cttgaacaca gtctcaccca gactccaggc tgtctttcac tgaatgcttc 2640 tgacttcata gatttccttc ccatcccagc tgaaatactg aggggtctcc aggaggagac 2700 tagatttatg aatacacgag gtatgaggtc taggaacata cttcagctca cacatgagat 2760 ctaggtgagg attgattacc tagtagtcat ttcatgggtt gttgggagga ttctatgagg 2820 caaccacagg cagcatttag cacatactac acattcaata agcatcaaac tcttagttac 2880 tcattcaggg atagcactga gcaaagcatt gagcaaaggg gtcccataga ggtgagggaa 2940 gcctgaaaaa ctaagatgct gcctgcccag tgcacacaag tgtaggtatc attttctgca 3000 tttaaccgtc aataggcaaa ggggggaagg gacatattca tttggaaata agctgccttg 3060 agccttaaaa cccacaaaag tacaatttac cagcctccgt atttcagact gaatgggggt 3120 ggggggggcg ccttaggtac ttattccaga tgccttctcc agacaaacca gaagcaacag 3180 aaaaaatcgt ctctccctcc ctttgaaatg aatatacccc ttagtgtttg ggtatattca 3240 tttcaaaggg agagagagag gtttttttct gttctgtctc atatgattgt gcacatactt 3300 gagactgttt tgaatttggg ggatggctaa aaccatcata gtacaggtaa ggtgagggaa 3360 tagtaagtgg tgagaactac tcagggaatg aaggtgtcag aataataaga ggtgctactg 3420 actttctcag cctctgaata tgaacggtga gcattgtggc tgtcagcagg aagcaacgaa 3480 gggaaatgtc tttccttttg ctcttaagtt gtggagagtg caacagtagc ataggaccct 3540 accctctggg ccaagtcaaa gacattctga catcttagta tttgcatatt cttatgtatg 3600 tgaaagttac aaattgcttg aaagaaaata tgcatctaat aaaaaacacc ttctaaaata 3660 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 3686 <210> 121 <211> 3451 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 121 cttcagatag attatatctg gagtgaagaa tcctgccacc tatgtatctg gcatagtctc 60 atctggccag aagagctgag acatccgttc ccctacaaga aactctcccc gggtggaaca 120 agatggatta tcaagtgtca agtccaatct atgacatcaa ttattataca tcggagccct 180 gccaaaaaat caatgtgaag caaatcgcag cccgcctcct gcctccgctc tactcactgg 240 tgttcatctt tggttttgtg ggcaacatgc tggtcatcct catcctgata aactgcaaaa 300 ggctgaagag catgactgac atctacctgc tcaacctggc catctctgac ctgtttttcc 360 ttcttactgt ccccttctgg gctcactatg ctgccgccca gtgggacttt ggaaatacaa 420 tgtgtcaact cttgacaggg ctctatttta taggcttctt ctctggaatc ttcttcatca 480 tcctcctgac aatcgatagg tacctggctg tcgtccatgc tgtgtttgct ttaaaagcca 540 ggacggtcac ctttggggtg gtgacaagtg tgatcacttg ggtggtggct gtgtttgcgt 600 ctctcccagg aatcatcttt accagatctc aaaaagaagg tcttcattac acctgcagct 660 ctcattttcc atacagtcag tatcaattct ggaagaattt ccagacatta aagatagtca 720 tcttggggct ggtcctgccg ctgcttgtca tggtcatctg ctactcggga atcctaaaaa 780 ctctgcttcg gtgtcgaaat gagaagaaga ggcacagggc tgtgaggctt atcttcacca 840 tcatgattgt ttattttctc ttctgggctc cctacaacat tgtccttctc ctgaacacct 900 tccaggaatt ctttggcctg aataattgca gtagctctaa caggttggac caagctatgc 960 aggtgacaga gactcttggg atgacgcact gctgcatcaa ccccatcatc tatgcctttg 1020 tcggggagaa gttcagaaac tacctcttag tcttcttcca aaagcacatt gccaaacgct 1080 tctgcaaatg ctgttctatt ttccagcaag aggctcccga gcgagcaagc tcagtttaca 1140 cccgatccac tggggagcag gaaatatctg tgggcttgtg acacggactc aagtgggctg 1200 gtgacccagt cagagttgtg cacatggctt agttttcata cacagcctgg gctgggggtg 1260 gggtgggaga ggtctttttt aaaaggaagt tactgttata gagggtctaa gattcatcca 1320 tttatttggc atctgtttaa agtagattag atcttttaag cccatcaatt atagaaagcc 1380 aaatcaaaat atgttgatga aaaatagcaa cctttttatc tccccttcac atgcatcaag 1440 ttattgacaa actctccctt cactccgaaa gttccttatg tatatttaaa agaaagcctc 1500 agagaattgc tgattcttga gtttagtgat ctgaacagaa ataccaaaat tatttcagaa 1560 atgtacaact ttttacctag tacaaggcaa catataggtt gtaaatgtgt ttaaaacagg 1620 tctttgtctt gctatgggga gaaaagacat gaatatgatt agtaaagaaa tgacactttt 1680 catgtgtgat ttcccctcca aggtatggtt aataagtttc actgacttag aaccaggcga 1740 gagacttgtg gcctgggaga gctggggaag cttcttaaat gagaaggaat ttgagttgga 1800 tcatctattg ctggcaaaga cagaagcctc actgcaagca ctgcatgggc aagcttggct 1860 gtagaaggag acagagctgg ttgggaagac atggggagga aggacaaggc tagatcatga 1920 agaaccttga cggcattgct ccgtctaagt catgagctga gcagggagat cctggttggt 1980 gttgcagaag gtttactctg tggccaaagg agggtcagga aggatgagca tttagggcaa 2040 ggagaccacc aacagccctc aggtcagggt gaggatggcc tctgctaagc tcaaggcgtg 2100 aggatgggaa ggagggaggt attcgtaagg atgggaagga gggaggtatt cgtgcagcat 2160 atgaggatgc agagtcagca gaactggggt 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tttctgttct gtctcatatg attgtgcaca 3060 tacttgagac tgttttgaat ttgggggatg gctaaaacca tcatagtaca ggtaaggtga 3120 gggaatagta agtggtgaga actactcagg gaatgaaggt gtcagaataa taagaggtgc 3180 tactgacttt ctcagcctct gaatatgaac ggtgagcatt gtggctgtca gcaggaagca 3240 acgaagggaa atgtctttcc ttttgctctt aagttgtgga gagtgcaaca gtagcatagg 3300 accctaccct ctgggccaag tcaaagacat tctgacatct tagtatttgc atattcttat 3360 gtatgtgaaa gttacaaatt gcttgaaaga aaatatgcat ctaataaaaa acaccttcta 3420 aaataaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 3451 <210> 122 <211> 352 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 122 Met Asp Tyr Gln Val Ser Ser Pro Ile Tyr Asp Ile Asn Tyr Tyr Thr 1 5 10 15 Ser Glu Pro Cys Gln Lys Ile Asn Val Lys Gln Ile Ala Ala Arg Leu 20 25 30 Leu Pro Pro Leu Tyr Ser Leu Val Phe Ile Phe Gly Phe Val Gly Asn 35 40 45 Met Leu Val Ile Leu Ile Leu Ile Asn Cys Lys Arg Leu Lys Ser Met 50 55 60 Thr Asp Ile Tyr Leu Leu Asn Leu Ala Ile Ser Asp Leu Phe Phe Leu 65 70 75 80 Leu Thr Val Pro Phe Trp Ala His Tyr Ala Ala Ala Gln Trp Asp Phe 85 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atatgatcta catatactta ttattaccca atagatttcc 1800 cccgaaaagc tgtatataaa catatcttaa ataaataaaa ttctattttt tccacctcaa 1860 aatttggggt ataataaaaa tggaaatttt taaatggtca aagttttaat acttcaaata 1920 ttaagtaaat attttcattt atagagatta aacacacagc taccaaactg tattaaaaca 1980 tgaagtctga gtgctgtgtt tgggatacat ttaccctgaa aaagtgagca cttaccataa 2040 aattttcttt tttctttata attaaaaatt ttatgtatat aagagttttg cctgaatatg 2100 tgtgtatata ttcatatagt cacacacaca cacatatata taagacagaa gatggcacta 2160 ctaacatttg ccaatgcccc gtgagtcctg gaactgactc caagtcctct gtaagtgctc 2220 ttaaccaccg agcccctgca actccgttct tcccctcctc ttcctcctcc tcctcttcct 2280 cctcctcttc ctcttcaaat gtttggggcg tgggggtgga ggtcaaagag ataggctgta 2340 tttggggtta gaagatgact tgtgggagtt gatttttttc ttccacctca aggataaaat 2400 tcagaactca agtcatgaga cctgacagca agcaaccttt atcctctaag cccatctcac 2460 tgcccccaaa atgtaaacat ttttctaaaa tgttagggaa gcataaacta accacttaga 2520 caaaaatcaa atgatatgga agacgggaga aaaaaataga agtgggctgt atctgtgtgt 2580 ctcttcccac acatgcatga taccagcctg tgtgagggtg tctgtggaga ccacagagga 2640 taccagccat cctggaactg aagtcccagg aagttatgag ctgctgtcta acacgggtac 2700 tgggaactga acttgggtcc tataggacag cagcaagttc tctaaagtac tgacccatca 2760 ctgcagcccc agcctccttt tgtaaatgca ggaatgtaat catcacctga aggttgttga 2820 gtatgaggca ctcagaacag aagtgggcac aacttttgtt aaagtggagg cggcagtggg 2880 tactggccta ccttttgcag atgtcaaatg ttcatctgcc caacaagcca tccttctctt 2940 attattatta caagtccaag aaaggacagt tgcttagagc acagattttg gcacttttca 3000 agatagtata tagtatttat tggtaacatt aatgttcaaa tactaaaaat cccatgtaga 3060 ataaaaacaa gaaggttctc gggcagtgga gttttactac tactgctact attactacta 3120 catactacta ctattattta gtatataatt atcaataaac aattattata catattataa 3180 atacatgtaa atttattatt gttgttgttt gtgttctgag acaggagtcc tctggtagcc 3240 ctggctgtcc tggcactctc tctctataga cccactgtcc tcaaactcac agatacacct 3300 gcctctgtct cccaatcttt gtgattaacg gtgtgacctt taaacacctt aaaagacact 3360 gggcttaagt gttattttac atacaatact taccttactt cttacaagcc acctcttact 3420 gataacactt tttttatcta 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acacttcgac tctcaaagca ataccaggat agctgttgtt tcagagaaag gatcgtgtgc 300 tgcatctcct ccttggcgcc tcattgctgt aattttggga atcctatgct tggtaatact 360 ggtgatagct gtggtcctgg gtaccatggg ggttctttcc agcccttgtc ctcctaattg 420 gattatatat gagaagagct gttatctatt cagcatgtca ctaaattcct gggatggaag 480 taaaagacaa tgctggcaac tgggctctaa tctcctaaag atagacagct caaatgaatt 540 gggatttata gtaaaacaag tgtcttccca acctgataat tcattttgga taggcctttc 600 tcggccccag actgaggtac catggctctg ggaggatgga tcaacattct cttctaactt 660 atttcagatc agaaccacag ctacccaaga aaacccatct ccaaattgtg tatggattca 720 cgtgtcagtc atttatgacc aactgtgtag tgtgccctca tatagtattt gtgagaagaa 780 gttttcaatg taagaggaag ggtggagaag gagagagaaa tatgtgaggt agtaaggagg 840 acagaaaaca gaacagaaaa gagtaacagc tgaggtcaag ataaatgcag aaaatgttta 900 gagagcttgg ccaactgtaa tcttaaccaa gaaattgaag ggagaggctg tgatttctgt 960 atttgtcgac ctacaggtag gctagtatta tttttctagt tagtagatcc ctagacatgg 1020 aatcagggca gccaagcttg agtttttatt ttttatttat ttattttttt gagatagggt 1080 ctcactttgt tacccaggct ggagtgcagt ggcacaatct cgactcactg cagctatctc 1140 tcgcctcagc ccctcaagta gctgggacta caggtgcatg ccaccatgcc aggctaattt 1200 ttggtgtttt ttgtagagac tgggttttgc catgttgacc aagctggtct ctaactcctg 1260 ggcttaagtg atctgcccgc cttggcctcc caaagtgctg ggattacaga tgtgagccac 1320 cacacctggc cccaagcttg aattttcatt ctgccattga cttggcattt accttgggta 1380 agccataagc gaatcttaat ttctggctct atcagagttg tttcatgctc aacaatgcca 1440 ttgaagtgca cggtgtgttg ccacgatttg accctcaact tctagcagta tatcagttat 1500 gaactgaggg tgaaatatat ttctgaatag ctaaatgaag aaatgggaaa aaatcttcac 1560 cacagtcaga gcaattttat tattttcatc agtatgatca taattatgat tatcatctta 1620 gtaaaaagca ggaactccta ctttttcttt atcaattaaa tagctcagag agtacatctg 1680 ccatatctct aatagaatct tttttttttt tttttttttt gagacagagt ttcgctcttg 1740 ttgcccaggc tggagtgcaa cggcacgatc tcggctcacc gcaacctccg ccccctgggt 1800 tcaagcaatt ctcctgcctc agcctcccaa gtagctggga ttacagtcag gcaccaccac 1860 acccggctaa ttttgtattt ttttagtaga gacagggttt ctccatgtcg gtcagggtag 1920 tcccgaactc 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Leu 50 55 60 Gly Thr Met Gly Val Leu Ser Ser Pro Cys Pro Pro Asn Trp Ile Ile 65 70 75 80 Tyr Glu Lys Ser Cys Tyr Leu Phe Ser Met Ser Leu Asn Ser Trp Asp 85 90 95 Gly Ser Lys Arg Gln Cys Trp Gln Leu Gly Ser Asn Leu Leu Lys Ile 100 105 110 Asp Ser Ser Asn Glu Leu Gly Phe Ile Val Lys Gln Val Ser Ser Gln 115 120 125 Pro Asp Asn Ser Phe Trp Ile Gly Leu Ser Arg Pro Gln Thr Glu Val 130 135 140 Pro Trp Leu Trp Glu Asp Gly Ser Thr Phe Ser Ser Asn Leu Phe Gln 145 150 155 160 Ile Arg Thr Thr Ala Thr Gln Glu Asn Pro Ser Pro Asn Cys Val Trp 165 170 175 Ile His Val Ser Val Ile Tyr Asp Gln Leu Cys Ser Val Pro Ser Tyr 180 185 190 Ser Ile Cys Glu Lys Lys Phe Ser Met 195 200 <210> 131 <211> 2503 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 131 agcatagttt catttcctgc tcttgaatat ctggttgaac tacttaagct taatttgtta 60 aactccggta agtacctagc ccacatgatt tgactcagag attctctttt gtccacagac 120 agtcatctca ggagcagaaa gaaaagagct cccaaatgct atatctattc aggggctctc 180 aagaacaatg gaatatcatc ctgatttaga aaatttggat gaagatggat atactcaatt 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Val Ile Ala Val Val Leu 50 55 60 Gly Thr Met Ala Ile Trp Arg Ser Asn Ser Gly Ser Asn Thr Leu Glu 65 70 75 80 Asn Gly Tyr Phe Leu Ser Arg Asn Lys Glu Asn His Ser Gln Pro Thr 85 90 95 Gln Ser Ser Leu Glu Asp Ser Val Thr Pro Thr Lys Ala Val Lys Thr 100 105 110 Thr Gly Val Leu Ser Ser Pro Cys Pro Pro Asn Trp Ile Ile Tyr Glu 115 120 125 Lys Ser Cys Tyr Leu Phe Ser Met Ser Leu Asn Ser Trp Asp Gly Ser 130 135 140 Lys Arg Gln Cys Trp Gln Leu Gly Ser Asn Leu Leu Lys Ile Asp Ser 145 150 155 160 Ser Asn Glu Leu Ile Ser Asp Gln Asn His Ser Tyr Pro Arg Lys Pro 165 170 175 Ile Ser Lys Leu Cys Met Asp Ser Arg Val Ser His Leu 180 185 <210> 133 <211> 2365 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 133 agcatagttt catttcctgc tcttgaatat ctggttgaac tacttaagct taatttgtta 60 aactccggta agtacctagc ccacatgatt tgactcagag attctctttt gtccacagac 120 agtcatctca ggagcagaaa gaaaagagct cccaaatgct atatctattc aggggctctc 180 aagaacaatg gaatatcatc ctgatttaga aaatttggat gaagatggat atactcaatt 240 acacttcgac tctcaaagca ataccaggat 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caagctggtc tctaactcct 1140 gggcttaagt gatctgcccg ccttggcctc ccaaagtgct gggattacag atgtgagcca 1200 ccacacctgg ccccaagctt gaattttcat tctgccattg acttggcatt taccttgggt 1260 aagccataag cgaatcttaa tttctggctc tatcagagtt gtttcatgct caacaatgcc 1320 attgaagtgc acggtgtgtt gccacgattt gaccctcaac ttctagcagt atatcagtta 1380 tgaactgagg gtgaaatata tttctgaata gctaaatgaa gaaatgggaa aaaatcttca 1440 ccacagtcag agcaatttta ttattttcat cagtatgatc ataattatga ttatcatctt 1500 agtaaaaagc aggaactcct actttttctt tatcaattaa atagctcaga gagtacatct 1560 gccatatctc taatagaatc tttttttttt tttttttttt tgagacagag tttcgctctt 1620 gttgcccagg ctggagtgca acggcacgat ctcggctcac cgcaacctcc gccccctggg 1680 ttcaagcaat tctcctgcct cagcctccca agtagctggg attacagtca ggcaccacca 1740 cacccggcta attttgtatt tttttagtag agacagggtt tctccatgtc ggtcagggta 1800 gtcccgaact cctgacctca agtgatctgc ctgcctcggc ctcccaagtg ctgggattac 1860 aggcgtgagc cactgcaccc agcctagaat cttgtataat atgtaattgt agggaaactg 1920 ctctcatagg aaagttttct gctttttaaa tacaaaaata 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acgtgtcagt catttatgac caactgtgta gtgtgccctc 660 atatagtatt tgtgagaaga agttttcaat gtaagaggaa gggtggagaa ggagagagaa 720 atatgtgagg tagtaaggag gacagaaaac agaacagaaa agagtaacag ctgaggtcaa 780 gataaatgca gaaaatgttt agagagcttg gccaactgta atcttaacca agaaattgaa 840 gggagaggct gtgatttctg tatttgtcga cctacaggta ggctagtatt atttttctag 900 ttagtagatc cctagacatg gaatcagggc agccaagctt gagtttttat tttttattta 960 tttatttttt tgagataggg tctcactttg ttacccaggc tggagtgcag tggcacaatc 1020 tcgactcact gcagctatct ctcgcctcag cccctcaagt agctgggact acaggtgcat 1080 gccaccatgc caggctaatt tttggtgttt tttgtagaga ctgggttttg ccatgttgac 1140 caagctggtc tctaactcct gggcttaagt gatctgcccg ccttggcctc ccaaagtgct 1200 gggattacag atgtgagcca ccacacctgg ccccaagctt gaattttcat tctgccattg 1260 acttggcatt taccttgggt aagccataag cgaatcttaa tttctggctc tatcagagtt 1320 gtttcatgct caacaatgcc attgaagtgc acggtgtgtt gccacgattt gaccctcaac 1380 ttctagcagt atatcagtta tgaactgagg gtgaaatata tttctgaata gctaaatgaa 1440 gaaatgggaa aaaatcttca ccacagtcag agcaatttta ttattttcat cagtatgatc 1500 ataattatga ttatcatctt agtaaaaagc aggaactcct actttttctt tatcaattaa 1560 atagctcaga gagtacatct gccatatctc taatagaatc tttttttttt tttttttttt 1620 tgagacagag tttcgctctt gttgcccagg ctggagtgca acggcacgat ctcggctcac 1680 cgcaacctcc gccccctggg ttcaagcaat tctcctgcct cagcctccca agtagctggg 1740 attacagtca ggcaccacca cacccggcta attttgtatt tttttagtag agacagggtt 1800 tctccatgtc ggtcagggta gtcccgaact cctgacctca agtgatctgc ctgcctcggc 1860 ctcccaagtg ctgggattac aggcgtgagc cactgcaccc agcctagaat cttgtataat 1920 atgtaattgt agggaaactg ctctcatagg aaagttttct gctttttaaa tacaaaaata 1980 cataaaaata cataaaatct gatgatgaat ataaaaaagt aaccaacctc attggaacaa 2040 gtattaacat tttggaatat gttttattag ttttgtgatg tactgtttta caatttttac 2100 catttttttc agtaattact gtaaaatggt attattggaa tgaaactata tttcctcatg 2160 tgctgatttg tcttattttt ttcatacttt cccactggtg ctatttttat ttccaatgga 2220 tatttctgta ttactaggga ggcatttaca gtcctctaat gttgattaat atgtgaaaag 2280 aaattgtacc aattttacta aattatgcag 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agcatagttt catttcctgc tcttgaatat ctggttgaac tacttaagct taatttgtta 60 aactccggta agtacctagc ccacatgatt tgactcagag attctctttt gtccacagac 120 agtcatctca ggagcagaaa gaaaagagct cccaaatgct atatctattc aggggctctc 180 aagaacaatg gaatatcatc ctgatttaga aaatttggat gaagatggat atactcaatt 240 acacttcgac tctcaaagca ataccaggat agctgttgtt tcagagaaag gatcgtgtgc 300 tgcatctcct ccttggcgcc tcattgctgt aattttggga atcctatgct tggtaatact 360 ggtgatagct gtggtcctgg gtaccatggc tggtttcaaa gctgtggaat tcaaaggata 420 aattaatgaa gaaaacaagc ggagctgaag aagaaagtac aatatggtgc tgtcttccta 480 atgaaataaa ttcactaaat ggacattaaa aaaaaaaaa 519 <210> 138 <211> 77 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 138 Met Glu Tyr His Pro Asp Leu Glu Asn Leu Asp Glu Asp Gly Tyr Thr 1 5 10 15 Gln Leu His Phe Asp Ser Gln Ser Asn Thr Arg Ile Ala Val Val Ser 20 25 30 Glu Lys Gly Ser Cys Ala Ala Ser Pro Pro Trp Arg Leu Ile Ala Val 35 40 45 Ile Leu Gly Ile Leu Cys Leu Val Ile Leu Val Ile Ala Val Val Leu 50 55 60 Gly Thr Met Ala Gly Phe Lys Ala Val Glu Phe 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gaacagaaca gaacagaaca gattaatatt aaaaaacaga aaaaatgctg 840 ggatgctaag agactttaac ctcatttgag aacttggatg aagaagctga gacttttgta 900 cttgtcatct tcacaaagat ggtggcacta tcttccagtt aggaagtcac tagacatgga 960 gtgagggcag ctcaacaata cagagaatat gtgaacctga ggtaccctga ctcaaatttc 1020 acaaccacaa tgaaacccct acactatcag gaaacactgt agaggagtga gactgaagac 1080 tttaaaagcc agagaatcag cctacttact gtggtgtttt ctagacagga cagggaaagt 1140 atatctagga aataaaaaca atacaattca gcaaacaaaa tctgcataat gacaacctca 1200 gttggtatgg tatgttatgg tatggtatgg gtgtagaagt ttcacaaggc cctatgaaga 1260 actacagaca gttaaatagg gggaaagctt tttctaggat caagcctact gaaccccaag 1320 aagtcagcac tgaacatatg tacagatcag tatcattaaa tgaactagta agacatatac 1380 atatatgtta atcaaatatt ggtaccagag tacacactgt gtttgcatga ttttctcagt 1440 atctacagta caccagacac agggagaagg caaaatgaac ttctaaattg agaagtgaaa 1500 aaaatgaggg aagagaatct tcaccacaaa tagggattct attttcaccc acatgatcat 1560 tattaagatg gccatcaccc aaacgtcgtg acccaagcta cttcctcaac tagataactc 1620 aaagagtctg 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cctgactcaa atttcacaac cacaatgaaa cccctacact atcaggaaac actgtagagg 1200 agtgagactg aagactttaa aagccagaga atcagcctac ttactgtggt gttttctaga 1260 caggacaggg aaagtatatc taggaaataa aaacaataca attcagcaaa caaaatctgc 1320 ataatgacaa cctcagttgg tatggtatgt tatggtatgg tatgggtgta gaagtttcac 1380 aaggccctat gaagaactac agacagttaa atagggggaa agctttttct aggatcaagc 1440 ctactgaacc ccaagaagtc agcactgaac atatgtacag atcagtatca ttaaatgaac 1500 tagtaagaca tatacatata tgttaatcaa atattggtac cagagtacac actgtgtttg 1560 catgattttc tcagtatcta cagtacacca gacacaggga gaaggcaaaa tgaacttcta 1620 aattgagaag tgaaaaaaat gagggaagag aatcttcacc acaaataggg attctatttt 1680 cacccacatg atcattatta agatggccat cacccaaacg tcgtgaccca agctacttcc 1740 tcaactagat aactcaaaga gtctgcccac cttttctgat agcaaatctg gtatctagat 1800 ttcactgttt ccttatgctg tctggccagc agtatgacaa aggtgctgcc ctttcaggaa 1860 gcagtctcct taaatgctgt agttggaaag ataaatcata tctgatagtg aatatttaaa 1920 aagcgcccag tcaggataag tgttttggaa cacagaacat atttcatctt tttatgatac 1980 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tgaaatggta ctccacatca gcattctcaa gactggagaa 360 gttaggcctc agacatccca agccttctcc tttcattgga aacttgacat ttttccgcca 420 gggtttttgg gaaagccaaa tggagctcag aaagctgtat ggacctctgt gtgggtacta 480 tcttggtcgt cggatgttta ttgttatttc tgagccagac atgatcaagc aggtgttggt 540 tgagaacttc agtaacttta ccaacagaat ggcgtcgggt ttggagttca agtcggtagc 600 cgacagcgtt ctgtttttac gtgacaaaag atgggaagag gtcagaggtg ccctgatgtc 660 tgctttcagt cctgaaaagc tgaacgagat ggttcccctc atcagccaag cctgcgacct 720 tctcctggct catttaaaac gctatgcgga atctggggac gcatttgaca tccagaggtg 780 ctactgcaat tacaccacag atgtggttgc cagcgtcgcc tttggcaccc cggtggactc 840 ctggcaggcc cctgaggatc cctttgtgaa acactgcaag cgtttcttcg aattctgcat 900 ccccagacct atcctggttt tactcttatc atttccatcc ataatggtcc cactggcccg 960 gattttgccc aataagaacc gagacgaact gaatggcttt tttaacaaac tcattaggaa 1020 tgtgattgcc ttgcgggacc agcaagctgc cgaagagagg cggagagact tcctccaaat 1080 ggtcctggat gcccgacatt ctgcaagtcc catgggcgtg caagactttg acatcgtcag 1140 agacgttttc tcctctactg ggtgcaagcc 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gaaaaaaaaa aaaaaaaaa 1919 <210> 146 <211> 460 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 146 Met Met Glu Ala Leu Gly Phe Leu Lys Leu Glu Val Asn Gly Pro Met 1 5 10 15 Val Thr Val Ala Leu Ser Val Ala Leu Leu Ala Leu Leu Lys Trp Tyr 20 25 30 Ser Thr Ser Ala Phe Ser Arg Leu Glu Lys Leu Gly Leu Arg His Pro 35 40 45 Lys Pro Ser Pro Phe Ile Gly Asn Leu Thr Phe Phe Arg Gln Gly Phe 50 55 60 Trp Glu Ser Gln Met Glu Leu Arg Lys Leu Tyr Gly Pro Leu Cys Gly 65 70 75 80 Tyr Tyr Leu Gly Arg Arg Met Phe Ile Val Ile Ser Glu Pro Asp Met 85 90 95 Ile Lys Gln Val Leu Val Glu Asn Phe Ser Asn Phe Thr Asn Arg Met 100 105 110 Ala Ser Gly Leu Glu Phe Lys Ser Val Ala Asp Ser Val Leu Phe Leu 115 120 125 Arg Asp Lys Arg Trp Glu Glu Val Arg Gly Ala Leu Met Ser Ala Phe 130 135 140 Ser Pro Glu Lys Leu Asn Glu Met Val Pro Leu Ile Ser Gln Ala Cys 145 150 155 160 Asp Leu Leu Leu Ala His Leu Lys Arg Tyr Ala Glu Ser Gly Asp Ala 165 170 175 Phe Asp Ile Gln Arg Cys Tyr Cys Asn Tyr Thr Thr Asp Val Val Ala 180 185 190 Ser Val Ala 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agcaagctgc cgaagagagg cggagagact tcctccaaat ggtcctggat 1140 gcccgacatt ctgcaagtcc catgggcgtg caagactttg acatcgtcag agacgttttc 1200 tcctctactg ggtgcaagcc gaacccttcc cggcaacacc agcccagccc tatggccagg 1260 cctttgactg tggatgagat tgtgggccag gccttcatct tcctcatcgc tggctatgaa 1320 atcatcacca acacactttc ttttgccacc tacctactgg ccaccaaccc tgactgccaa 1380 gagaagcttc tgagagaggt agacgttttt aaggagaaac acatggcccc tgagttctgc 1440 agcctcgagg aaggcctgcc ctatctggac atggtgattg cagagacgct gaggatgtac 1500 ccgccagctt tcagattcac acgggaggca gctcaggact gcgaggtgct ggggcagcgc 1560 atccccgcag gcgctgtgct agagatggcc gtgggtgccc tgcaccatga ccctgagcac 1620 tggccaagcc cggagacctt caaccctgaa aggttcacgg ctgaggcccg gcagcagcac 1680 cggcccttca cgtacctgcc cttcggggcc ggcccacgga gctgcctcgg ggtgcgtcta 1740 gggctgcttg aggtcaagtt gacactgctc cacgtgctgc acaagttccg gttccaagcc 1800 tgccctgaga cccaggtacc gctgcagcta gaatccaaat ctgccctagg tccaaaaaat 1860 ggtgtctata tcaagatcgt atcccgctga cacagaaggc tgccgggtgg ggggagggca 1920 cccccaaatt caaagaaaac cctaagtgtg gatgttcaga attttggaaa aatgtcactg 1980 aagtgattga aagagtgcct ggcatgcaag gataagaggt tctttacata acatttccta 2040 aatgcttaat aaacgtttgt tgcacttggt tttgacattg ccaatggggt ttgaaccagt 2100 gctctctcta aatgaaaaaa aaaaaaaaaa aa 2132 <210> 151 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 151 Met Glu Leu Arg Lys Leu Tyr Gly Pro Leu Cys Gly Tyr Tyr Leu Gly 1 5 10 15 Arg Arg Met Phe Ile Val Ile Ser Glu Pro Asp Met Ile Lys Gln Val 20 25 30 Leu Val Glu Asn Phe Ser Asn Phe Thr Asn Arg Met Ala Ser Gly Leu 35 40 45 Glu Phe Lys Ser Val Ala Asp Ser Val Leu Phe Leu Arg Asp Lys Arg 50 55 60 Trp Glu Glu Val Arg Gly Ala Leu Met Ser Ala Phe Ser Pro Glu Lys 65 70 75 80 Leu Asn Glu Met Val Pro Leu Ile Ser Gln Ala Cys Asp Leu Leu Leu 85 90 95 Ala His Leu Lys Arg Tyr Ala Glu Ser Gly Asp Ala Phe Asp Ile Gln 100 105 110 Arg Cys Tyr Cys Asn Tyr Thr Thr Asp Val Val Ala Ser Val Ala Phe 115 120 125 Gly Thr Pro Val Asp Ser Trp Gln Ala Pro Glu Asp Pro Phe Val Lys 130 135 140 His Cys Lys Arg Phe Phe Glu 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Gly Gly Gln Val Met Ala Ile Asn Ser Val Met Ala Asn Phe 130 135 140 Pro Ser Glu Ser Ser Phe Glu Asp Gly Pro Leu Leu Lys Ser Ser Glu 145 150 155 160 Ile Ser Leu Ser Met Glu Asp Ser Thr Ser Thr Gln Leu Thr Glu Leu 165 170 175 Pro Leu Lys Pro Ile Gln Arg Tyr Ser Ser Tyr Trp Arg Ile Thr Ser 180 185 190 Ile Lys Glu Lys Ser Ser Leu Gln Met Gln Lys Pro Ile Ser Asn Ala 195 200 205 Val Leu Asn Glu Tyr Leu Glu Gln Lys Val Val Glu Leu Tyr Lys Gln 210 215 220 Tyr Ile Met Asp Thr Val Phe His Asp Ser Ser Pro Thr Gln Ile Leu 225 230 235 240 Ala Ser Glu Phe Ile Met Thr Asn Val Asp Gln Ile Ser Leu Gln Val 245 250 255 Ser Lys Glu Lys Asn Leu Asp Thr Ser Lys Val Lys Asp Ile Val Ile 260 265 270 Ser His Leu Leu Gln Leu Val Ser Ser Glu Ile Ser Thr Pro Ser Leu 275 280 285 His Ile Ser Gln Tyr Ser Asn Ile Thr Pro 290 295 <210> 194 <211> 1155 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 194 gtttggtaag ttccgttttt agccccggcc tttttctagc caggctctca actgtctcct 60 gcgttgctgg gaagttctgg aaggaagcat gtgctccaga ggttgggatt 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ttttaaatac tggttattat ttaattttat atccctttgt tgttttctag tacacagaga 1020 tatagagata cacatgcttt tttcccaccc aaaattgtga caacattatg tgaatgtttt 1080 attatttttt aaaataaaca tttgatataa ttgtcaatta actgaaaaaa aaaaaaaaaa 1140 aaaaaaaaaa aaaaa 1155 <210> 195 <211> 243 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 195 Met Cys Ser Arg Gly Trp Asp Ser Cys Leu Ala Leu Glu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Pro Leu Ser Leu Leu Val Thr Ser Ile Gln Gly His Leu Val His 20 25 30 Met Thr Val Val Ser Gly Ser Asn Val Thr Leu Asn Ile Ser Glu Ser 35 40 45 Leu Pro Glu Asn Tyr Lys Gln Leu Thr Trp Phe Tyr Thr Phe Asp Gln 50 55 60 Lys Ile Val Glu Trp Asp Ser Arg Lys Ser Lys Tyr Phe Glu Ser Lys 65 70 75 80 Phe Lys Gly Arg Val Arg Leu Asp Pro Gln Ser Gly Ala Leu Tyr Ile 85 90 95 Ser Lys Val Gln Lys Glu Asp Asn Ser Thr Tyr Ile Met Arg Val Leu 100 105 110 Lys Lys Thr Gly Asn Glu Gln Glu Trp Lys Ile Lys Leu Gln Val Leu 115 120 125 Asp Pro Val Pro Lys Pro Val Ile Lys Ile Glu Lys Ile Glu Asp Met 130 135 140 Asp Asp Asn Cys Tyr Leu Lys Leu Ser 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actgggaatg agcaagaatg gaagatcaag ctgcaagtgc ttgaccctgt 480 acccaagcct gtcatcaaaa ttgagaagat agaagacatg gatgacaact gttatctgaa 540 actgtcatgt gtgatacctg gcgagtctgt aaactacacc tggtatgggg acaaaaggcc 600 cttcccaaag gagctccaga acagtgtgct tgaaaccacc cttatgccac ataattactc 660 caggtgttat acttgccaag tcagcaattc tgtgagcagc aagaatggca cggtctgcct 720 cagtccaccc tgtaccctgg gtaagaagga tccctgggag ctgagggggg cacagggtaa 780 ctggagttgt tttgaacaaa gaaaggctgg gggtcctatt cagcctcctt gcacagtgtg 840 gtggtgaatc cctaaggtgt ctgggagagc tgggagacgt gggttctgcc accagctcta 900 ccaccacctc ccagccagct tacctcaact tcgtgggggc tcagtgttct cacctgcaaa 960 ggacgtttgg gagagatctc tgatactcct cttccctctc ccgctctaac aaagcatagt 1020 cctaacatct gaggccaggg tcatcataga gtagactgaa acatcagggt gagcagggag 1080 aaggaagggc aagtgggcga gcagctgtct agaggggctt cattagacag ccgaagtcag 1140 ccaaggaaag agggaccgag gtcattagac cgccaaagtc agccagggaa agagggactg 1200 aggagacggg cctgagagag gccgtcgagg aggcgtgaga gcctgagcct caggcgaagc 1260 ttctcctccc cagcctgatg ttcctagatg aacttaggaa gccagattcc cctgtctcct 1320 gggaggatcc actcatgagt gtcacacctg gctctagatc aggcctacac tggtgctagc 1380 atgggacagc taaggccatg ggttttagag tcagtcatac ctggggtcac ttctaggact 1440 gtcacttact agctaaacaa gttacttagc ttccccaagt catgttcttc ctaaataaag 1500 gacaaaataa cagttcctat aaaaaaaaaa aaaaaaa 1537 <210> 197 <211> 252 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 197 Met Cys Ser Arg Gly Trp Asp Ser Cys Leu Ala Leu Glu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Pro Leu Ser Leu Leu Val Thr Ser Ile Gln Gly His Leu Val His 20 25 30 Met Thr Val Val Ser Gly Ser Asn Val Thr Leu Asn Ile Ser Glu Ser 35 40 45 Leu Pro Glu Asn Tyr Lys Gln Leu Thr Trp Phe Tyr Thr Phe Asp Gln 50 55 60 Lys Ile Val Glu Trp Asp Ser Arg Lys Ser Lys Tyr Phe Glu Ser Lys 65 70 75 80 Phe Lys Gly Arg Val Arg Leu Asp Pro Gln Ser Gly Ala Leu Tyr Ile 85 90 95 Ser Lys Val Gln Lys Glu Asp Asn Ser Thr Tyr Ile Met Arg Val Leu 100 105 110 Lys Lys Thr Gly Asn Glu Gln Glu Trp Lys Ile Lys Leu Gln Val Leu 115 120 125 Asp Pro Val Pro Lys Pro Val Ile Lys Ile 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gagtctgaat ttaaaggcag ggtttatctt 360 gaagaaaaca atggtgcact tcatatctct aatgtccgga aagaggacaa aggtacctac 420 tacatgagag tgctgcgtga aactgagaac gagttgaaga taaccctgga agtatttgat 480 cctgtgccca agccttccat agaaatcaat aagactgaag cgtcgactga ttcctgtcac 540 ctgaggctat cgtgtgaggt aaaggaccag catgttgact atacttggta tgagagctcg 600 ggacctttcc ccaaaaagag tccaggatat gtgctcgatc tcatcgtcac accacagaac 660 aagtctacat tttacacctg ccaagtcagc aatcctgtaa gcagcaagaa cgacacagtg 720 tacttcactc taccttgtga tctagccaga tcttctggag tatgttggac tgcaacttgg 780 ctagtggtca caacactcat cattcacagg atcctgttaa cctgacaaga actcttctca 840 cccaagaagg caacttggaa gcacagagtc ttgccttcat ccctagcagt gttcctagcc 900 agcgaagcaa ctctggctct attggacaaa ggaaaatgtg ttactgaacg tctgcgagag 960 tttgcatgca tgctctatga aacaagcaca ggaccttgta cagtgctcca ccactgacct 1020 gtgtgcccag tcctttacaa agatttcaaa tcaacctttt aaaaactgtg cataatatct 1080 aattttatat accctagttg tttcccaaca tatattaaag ataaatgcat tctttttacc 1140 aaaatgtgac tatattattt tcatgttttc atatctcttt 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cctgtcagca acaattctga ctccatctct gcccggcagc tctgtgcaga 720 catcgcaatg ggcttccgta ctcaccacac cgggttgctg agcgtgctgg ctatgttctt 780 tctgcttgtt ctcattctgt cttcagtgtt tttgttccgt ttgttcaaga gaagacaagg 840 taggattttc ccagaaggtt cctgcttgaa caccttcact aagaaccctt atgctgcctc 900 aaagaaaacc atatacacat atatcatggc ttcaaggaac acccagccag cagagtccag 960 aatctatgat gaaatcctgc agtccaaggt gcttccctcc aaggaagagc cagtgaacac 1020 agtttattcc gaagtgcagt ttgctgataa gatggggaaa gccagcacac aggacagtaa 1080 acctcctggg acttcaagct atgaaattgt gatctaggct gctgggctga attctccctc 1140 tggaaactga gttacaacca ccaatactgg caggttccct ggatccagat cttctctgcc 1200 caactcttac tgggagattg caaactgcca catctcagcc tgtaagcaaa gcaggaaacc 1260 ttctgctggg catagcttgt gcctaaatgg acaaatggat gcataccctt cctgaaatga 1320 ctcccttctg aatgaatgac aaagcaggtt acctagtata gttttcccaa acttcttccc 1380 atcatagcac atgtagaaaa taatattttt atggcacact gggataaaca agcaagattg 1440 ctcacttctg gaagctgcat atgactagag gcctcttgtg actggaggta acaaccctgc 1500 ccagtaactg tgggagaagg 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taagaaacta tatgcagagt ggtctttata aggcttctgc ttttaagata attacagaat 900 gcataggaaa atgcaaagaa ctatgaaagg atgtgttctg tgcccttctc ttgccctctc 960 ctctgttata ctagatccaa actcttagtc tcatcccccg tcttatacag accttctggg 1020 gtagcctttc ttcattgtct ctcctgattc caaagagata aaataagcag atcctggcac 1080 acacctttga ttccagcact caggaggcaa agacagaagg atctctatga gttcaaggct 1140 agcttggtct tcagagaaag ttccagaaca gccaagacta acaaaaagaa accctttctc 1200 aaaccaacct cccatcccca tcctcacccc ccaaaaacta ctagaatgaa agaaaaaaaa 1260 ataccaagac acaaaatgaa cagtgtctga ggaactctta tttctgtaag tattaatact 1320 ttcagaaatg cagaacagtg ttcaaggtca aaaacagaaa attggaactt tcttggaatg 1380 tgccagcact tacttaggaa tggaatcact tatattccta tagaatttaa tcacatatat 1440 agcaccggac agcattaatc acatatatag caccggacat cataagcaag gtagtagtga 1500 agcaccatcc caacattttc ttgtctcagt tctgcagggc agagaactgt tagccctgac 1560 tccagctttt tctacctaac agttttgtgc aggtgacatc tcgtccctgc tgagaaaatg 1620 aaatgagatt tagttttcac cactatggct gtaccaatac ctaccccaac gggtggcaca 1680 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caacatccta aatggaaaaa ataggatatt ccataataaa gccaaattta aacaatatct 3420 gtctacaaat ccatctatag aagatgacag ggcggaaaat tccaaccaaa agagtttaac 3480 tataccaaat aaaaacaaaa ggaataaaca atctcaaagc 3520 <210> 215 <211> 140 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 215 Met Ala Gln Arg His Leu Trp Ile Trp Phe Leu Cys Leu Gln Thr Trp 1 5 10 15 Ser Glu Ala Ala Gly Lys Asp Ala Asp Pro Val Val Met Asn Gly Ile 20 25 30 Leu Gly Glu Ser Val Thr Phe Leu Leu Asn Ile Gln Glu Pro Lys Lys 35 40 45 Ile Asp Asn Ile Ala Trp Thr Ser Gln Ser Ser Val Ala Phe Ile Lys 50 55 60 Pro Gly Val Asn Lys Ala Glu Val Thr Ile Thr Gln Gly Thr Tyr Lys 65 70 75 80 Gly Arg Ile Glu Ile Ile Asp Gln Lys Tyr Asp Leu Val Ile Arg Asp 85 90 95 Leu Arg Met Glu Asp Ala Gly Thr Tyr Lys Ala Asp Ile Asn Glu Glu 100 105 110 Asn Glu Glu Thr Ile Thr Lys Ile Tyr Tyr Leu His Ile Tyr Arg Lys 115 120 125 Leu Trp Gln His Gly Ala Leu Asp Leu Leu Leu Ile 130 135 140 <210> 216 <211> 3287 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 216 agtgcttgga gttcctctgt gactgaccac 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Ala Gly Lys Asp Ala Asp Pro Val Val Met Asn Gly Ile 20 25 30 Leu Gly Glu Ser Val Thr Phe Leu Leu Asn Ile Gln Glu Pro Lys Lys 35 40 45 Ile Asp Asn Ile Ala Trp Thr Ser Gln Ser Ser Val Ala Phe Ile Lys 50 55 60 Pro Gly Val Asn Lys Ala Glu Val Thr Ile Thr Gln Gly Thr Tyr Lys 65 70 75 80 Gly Arg Ile Glu Ile Ile Asp Gln Lys Tyr Asp Leu Val Ile Arg Asp 85 90 95 Leu Arg Met Glu Asp Ala Gly Thr Tyr Lys Ala Asp Ile Asn Glu Glu 100 105 110 Asn Glu Glu Thr Ile Thr Lys Ile Tyr Tyr Leu His Ile Tyr Arg Arg 115 120 125 Leu Lys Thr Pro Lys Ile Thr Gln Ser Leu Ile Ser Ser Leu Asn Asn 130 135 140 Thr Cys Asn Ile Thr Leu Thr Cys Ser Val Glu Lys Glu Glu Lys Asp 145 150 155 160 Val Thr Tyr Ser Trp Ser Pro Phe Gly Glu Lys Ser Asn Val Leu Gln 165 170 175 Ile Val His Ser Pro Met Asp Gln Lys Leu Thr Tyr Thr Cys Thr Ala 180 185 190 Gln Asn Pro Val Ser Asn Ser Ser Asp Ser Val Thr Val Gln Gln Pro 195 200 205 Cys Thr Asp Thr Pro Ser Phe His Pro Arg His Ala Val Leu Pro Gly 210 215 220 Gly Leu Ala Val Leu Phe Leu Leu 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 220 ucgcauggcu ggauuuacct t 21 <210> 221 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 221 guuccgggaa ggggccaaut t 21 <210> 222 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 222 gggccaauac agaccaggat t 21 <210> 223 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 223 ccagaagaag ugaugcgggt t 21 <210> 224 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 224 ucaccggcuc ucugugaaut t 21 <210> 225 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 225 gaccacgaac aagaccguct t 21 <210> 226 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 226 gaacaagacc guccaucuct t 21 <210> 227 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 227 agaccgucca ucucaacgut t 21 <210> 228 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 228 ccguccaucu caacguguct t 21 <210> 229 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 229 ggagacggca caguauccat t 21 <210> 230 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 230 caguauccac agucuugggt t 21 <210> 231 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 231 guauccacag ucuugggaat t 21 <210> 232 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 232 cucagcaggu cuaccugaat t 21 <210> 233 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 233 gcgugggaga uacgggcaut t 21 <210> 234 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 234 ugggagauac gggcauagat t 21 <210> 235 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 235 ggagauacgg gcauagaggt t 21 <210> 236 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 236 gauacgggca uagaggaugt t 21 <210> 237 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 237 acgggcauag aggaugcaat t 21 <210> 238 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 238 ggagcugucg ggaagaucat t 21 <210> 239 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 239 gcgcgaccuu aucuccaact t 21 <210> 240 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 240 gcgaccuuau cuccaacaat t 21 <210> 241 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 241 cuggacaaac ugacagucat t 21 <210> 242 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 242 ggaacuggag gacccgucut t 21 <210> 243 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 243 gcagaggcgg ucuucaacat t 21 <210> 244 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 244 uguaccucau cccaugagat t 21 <210> 245 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 245 gacaaaccaa gucggaacat t 21 <210> 246 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 246 aaaccaaguc ggaacagcat t 21 <210> 247 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 247 agcuagacag auccccguut t 21 <210> 248 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 248 cuaggcucau ggacgagaut t 21 <210> 249 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 249 gagaagggau aacccuacat t 21 <210> 250 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 250 ccaauguuuu ccacccauat t 21 <210> 251 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 251 guuuuccacc cauaauccut t 21 <210> 252 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide 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Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 256 gcaugaguag cuugaaacut t 21 <210> 257 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 257 gcaugggcuc uaucaaggat t 21 <210> 258 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 258 acuaauaucu gagcaucuut t 21 <210> 259 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 259 ggauuuaaug gcccaacaut t 21 <210> 260 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 260 agggcaagau cucauuucat t 21 <210> 261 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 261 uuuauuagag ggccuuauut t 21 <210> 262 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 262 auugaugugu ucuaagucut t 21 <210> 263 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 263 gggcagauga agccgagaat t 21 <210> 264 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 264 ccaccgaaua ugaguaccut t 21 <210> 265 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 265 ccgaauauga guaccuagat t 21 <210> 266 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 266 gcacagacca cucaacccat t 21 <210> 267 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 267 accaaaagag gucuguucat t 21 <210> 268 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 268 aagcagacgg gcaaguggat t 21 <210> 269 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 269 aguacugaag agugacggat t 21 <210> 270 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 270 acugaagagu gacggacuut t 21 <210> 271 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 271 ccaagggcag accuuucuut t 21 <210> 272 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 272 aaggcuacac ccaagucuut t 21 <210> 273 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 273 cuuucuacgu gacucuucut t 21 <210> 274 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 274 gcaaccaagu cgugagagat t 21 <210> 275 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 275 cgugagagau aagauuacut t 21 <210> 276 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide 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21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 293 cucaccuaga gcuaaagaat t 21 <210> 294 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 294 ucaccuagag cuaaagaaat t 21 <210> 295 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 295 accuagagcu aaagaaauut t 21 <210> 296 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 296 ccuagagcua aagaaauuat t 21 <210> 297 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 297 ccggggagac guucagcuat t 21 <210> 298 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 298 accaaaaauu acacagagut t 21 <210> 299 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 299 gaggguaaug uccuucaaat t 21 <210> 300 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 300 gguaaugucc uucaaaucut t 21 <210> 301 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 301 ucauaugauc auuuaaggat t 21 <210> 302 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 302 gaacacaguu uauuccgaat t 21 <210> 303 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 303 ggaacugggu auaauccaat t 21 <210> 304 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 304 gcaccaacua ccauuagcat t 21 <210> 305 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 305 cacuacaguu aacgcugaat t 21 <210> 306 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 306 gguaucagga aucaaaauut t 21 <210> 307 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 307 ccuuacagca uaacuaauut t 21 <210> 308 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 308 gaggccguca ccauaaagut t 21 <210> 309 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 309 gaagcgagag cuaaacagat t 21 <210> 310 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 310 gugcucggcg uauuuuucat t 21 <210> 311 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 311 agaacuauac cauaagagat t 21 <210> 312 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 312 ccauaagaga cauguggaat t 21 <210> 313 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 313 ggccauagaa acguuuuaat t 21 <210> 314 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 314 ccauagaaac guuuuaauut t 21 <210> 315 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 315 acauauauca ucaggucuut t 21 <210> 316 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 316 cgacgcacgc cucuucuuut t 21 <210> 317 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 317 ggcugcgcuu caaguacuat t 21 <210> 318 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 318 guucccgaug uuaacgucut t 21 <210> 319 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 319 ccagcugccg aauuguacat t 21 <210> 320 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 320 gcugccgaau uguacacgat t 21 <210> 321 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 321 guagcuacag gaugaugaat t 21 <210> 322 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 322 cucuggaauu gcuacugcut t 21 <210> 323 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 323 cuaaccuggu uuuauacuut t 21 <210> 324 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 324 cuuucgacca gaagauugut t 21 <210> 325 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 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Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 333 ggccccagga cuacucacut t 21 <210> 334 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 334 acuccucggu gcucauaaut t 21 <210> 335 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 335 caacgucacc uauguuccat t 21 <210> 336 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 336 ucaccuaugu uccacagaat t 21 <210> 337 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 337 cccaacaacu gguaucuuut t 21 <210> 338 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 338 ccagagcagg agugguucat t 21 <210> 339 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 339 gguucauggg gccauuggat t 21 <210> 340 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 340 cugaucauuu cgccuaaaat t 21 <210> 341 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 341 cauuucgccu aaaagagcat t 21 <210> 342 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 342 gccuaaaaga gcaaggacut t 21 <210> 343 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 343 ggaacuccac uaugcaucut t 21 <210> 344 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 344 caaggaggau ccaagagcut t 21 <210> 345 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 374 gucucaaguc cguauguaat t 21 <210> 375 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 375 ucucaagucc guauguaaat t 21 <210> 376 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 376 ccguauguaa aucagaucut t 21 <210> 377 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 377 acaaguaaag uuauucucat t 21 <210> 378 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial 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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 382 guccgugcug cauuaaucut t 21 <210> 383 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 383 ugcugaaagg ucguguggat t 21 <210> 384 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 384 gcguucagau ccagauggut t 21 <210> 385 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 385 aaauacaaag auccgggcat t 21 <210> 386 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 386 auaugagcaa guugcucaat t 21 <210> 387 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 387 uauucuacag gugguuucut t 21 <210> 388 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 388 uauagugccg agcaguucut t 21 <210> 389 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 389 cagcaucuug gauuacaca 19 <210> 390 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 390 ggauacgacc agagcuuga 19 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oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 401 ccaucugccc guacuucuat t 21 <210> 402 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 402 ccaccaaagu cauuugucut t 21 <210> 403 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 403 gucaaaaauu caccuaggat t 21 <210> 404 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 404 ggauuuaucu uagauacuat t 21 <210> 405 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 405 cauacuaauu gguguacuut t 21 <210> 406 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 406 agcuauaauc aucauuguat t 21 <210> 407 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 407 cucccaacuc ugaucaagat t 21 <210> 408 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 408 ggauauacuc aauuacacut t 21 <210> 409 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 409 ggucaagaua aaugcagaat t 21 <210> 410 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 410 agguaggcua guauuauuut t 21 <210> 411 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 411 ccccaagcuu gaauuuucat t 21 <210> 412 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 412 ggguaagcca uaagcgaaut t 21 <210> 413 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 413 ccauaagcga aucuuaauut t 21 <210> 414 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 414 ugccauaucu cuaauagaat t 21 <210> 415 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 415 gccuagaauc uuguauaaut t 21 <210> 416 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 416 ccuagaaucu uguauaauat t 21 <210> 417 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 417 gcucucauag gaaaguuuut t 21 <210> 418 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 418 cugucagaag gguaucucat t 21 <210> 419 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 419 cuacgugagc ugcaaaucat t 21 <210> 420 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 420 ggugauggcc auuaauucat t 21 <210> 421 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: 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<400> 429 ggauuuugcc caauaagaat t 21 <210> 430 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 430 caauaagaac cgagacgaat t 21 <210> 431 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 431 gaaccgagac gaacugaaut t 21 <210> 432 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 432 agacgaacug aauggcuuut t 21 <210> 433 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 433 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Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 439 ggaaggauua cucgcugaa 19 <210> 440 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 440 ggauuacucg cugacgaua 19 <210> 441 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 441 ccgugcaaga gggcaugua 19 <210> 442 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 442 cgggcaggga augauauaa 19 <210> 443 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 443 gcagggaaug auauaagca 19 <210> 444 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 444 ggaaugauau aagcuggaa 19 <210> 445 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 445 ggaacaagau ggauuaucat t 21 <210> 446 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 446 ccauacaguc aguaucaaut t 21 <210> 447 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 447 cauuaaagau agucaucuut t 21 <210> 448 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 448 agguaugguu aauaaguuut t 21 <210> 449 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 449 gauccugguu gguguugcat t 21 <210> 450 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 450 guaugagguc uaggaacaut t 21 <210> 451 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 451 caucaaacuc uuaguuacut t 21 <210> 452 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 452 cuccguauuu cagacugaat t 21 <210> 453 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 453 gcacauacuu gagacuguut t 21 <210> 454 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 454 gcaacgaagg gaaaugucut t 21 <210> 455 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 455 cacggcgugg ccauauacat t 21 <210> 456 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 456 ggggauaccu cauaaagcat t 21 <210> 457 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 457 caagcaaacg gucauaagut t 21 <210> 458 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 458 uuguguacua ucaagucaat t 21 <210> 459 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 459 ccaucugcga uucauguuut t 21 <210> 460 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 460 cucuacacga uggauuccat t 21 <210> 461 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 461 cucauugcag accggaaaut t 21 <210> 462 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 462 accggaaauu ucagcauuut t 21 <210> 463 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 463 ggucgaggac auuauuuuct t 21 <210> 464 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 464 cuuacgcuga guacuucgat t 21 <210> 465 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 465 ucgucagcag uuuacuugut t 21 <210> 466 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 466 ugcaucguca gcaguuuact t 21 <210> 467 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 467 gguaaaucca gccaugcgat t 21 <210> 468 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 468 auuggccccu ucccggaact t 21 <210> 469 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 469 uccuggucug uauuggccct t 21 <210> 470 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 470 cccgcaucac uucuucuggt t 21 <210> 471 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 471 auucacagag agccggugat t 21 <210> 472 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 472 gacggucuug uucgugguct t 21 <210> 473 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 473 gagauggacg gucuuguuct t 21 <210> 474 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 474 acguugagau ggacggucut t 21 <210> 475 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 475 gacacguuga gauggacggt t 21 <210> 476 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 476 uggauacugu gccgucucct t 21 <210> 477 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 477 cccaagacug uggauacugt t 21 <210> 478 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 478 uucccaagac uguggauact t 21 <210> 479 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 479 uucagguaga ccugcugagt t 21 <210> 480 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 480 augcccguau cucccacgct t 21 <210> 481 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 481 ucuaugcccg uaucucccat t 21 <210> 482 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 482 ccucuaugcc cguaucucct t 21 <210> 483 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 483 cauccucuau gcccguauct t 21 <210> 484 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 484 uugcauccuc uaugcccgut t 21 <210> 485 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 485 ugaucuuccc gacagcucct t 21 <210> 486 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 486 guuggagaua aggucgcgct t 21 <210> 487 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 487 uuguuggaga uaaggucgct t 21 <210> 488 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 488 ugacugucag uuuguccagt t 21 <210> 489 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 489 agacgggucc uccaguucct t 21 <210> 490 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 490 uguugaagac cgccucugct t 21 <210> 491 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 491 ucucauggga ugagguacat t 21 <210> 492 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 492 uguuccgacu ugguuuguct t 21 <210> 493 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 493 ugcuguuccg 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 506 auguugggcc auuaaaucct t 21 <210> 507 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 507 ugaaaugaga ucuugcccut t 21 <210> 508 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 508 aauaaggccc ucuaauaaat t 21 <210> 509 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 509 agacuuagaa cacaucaaut t 21 <210> 510 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial 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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 514 ugaacagacc ucuuuuggut t 21 <210> 515 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 515 uccacuugcc cgucugcuut t 21 <210> 516 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 516 uccgucacuc uucaguacut t 21 <210> 517 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 517 aaguccguca cucuucagut t 21 <210> 518 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 518 aagaaagguc ugcccuuggt t 21 <210> 519 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 519 aagacuuggg uguagccuut t 21 <210> 520 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 520 agaagaguca cguagaaagt t 21 <210> 521 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 521 ucucucacga cuugguugct t 21 <210> 522 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 522 aguaaucuua ucucucacgt t 21 <210> 523 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 523 ucguagacau gcucuuguut t 21 <210> 524 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 524 ugaugaccaa guccuagugt t 21 <210> 525 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 525 augaugacca aguccuagut t 21 <210> 526 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 526 ugucuguagg caugaugact t 21 <210> 527 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 527 aauuaaaagc ugucuggcct t 21 <210> 528 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 528 ucgcuggcgu uccucuggct t 21 <210> 529 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 529 augcuggaaa agcgacggct t 21 <210> 530 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 530 agcucucgca ggccguucct t 21 <210> 531 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 531 aacauguucu cauagucggt t 21 <210> 532 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 532 agguuaggac aucuuaggct t 21 <210> 533 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 533 agccucgaag cauuuauugt t 21 <210> 534 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 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<220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 538 uuucuccagc auucguuuct t 21 <210> 539 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 539 uuuagcucua ggugagucut t 21 <210> 540 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 540 uucuuuagcu cuaggugagt t 21 <210> 541 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 541 uuucuuuagc ucuaggugat t 21 <210> 542 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 542 aauuucuuua gcucuaggut t 21 <210> 543 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 543 uaauuucuuu agcucuaggt t 21 <210> 544 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 544 uagcugaacg ucuccccggt t 21 <210> 545 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 545 acucugugua auuuuuggut t 21 <210> 546 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 546 uuugaaggac auuacccuct t 21 <210> 547 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 547 agauuugaag gacauuacct t 21 <210> 548 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 548 uccuuaaaug aucauaugat t 21 <210> 549 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 549 uucggaauaa acuguguuct t 21 <210> 550 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 550 uuggauuaua cccaguucct t 21 <210> 551 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 551 ugcuaauggu aguuggugct t 21 <210> 552 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 552 uucagcguua acuguagugt t 21 <210> 553 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 553 aauuuugauu ccugauacct t 21 <210> 554 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 554 aauuaguuau gcuguaaggt t 21 <210> 555 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 555 acuuuauggu gacggccuct t 21 <210> 556 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 556 ucuguuuagc ucucgcuuct t 21 <210> 557 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 557 ugaaaaauac gccgagcact t 21 <210> 558 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 558 ucucuuaugg uauaguucut t 21 <210> 559 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 559 uuccacaugu cucuuauggt t 21 <210> 560 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 560 uuaaaacguu ucuauggcct t 21 <210> 561 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 561 aauuaaaacg uuucuauggt t 21 <210> 562 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 562 aagaccugau gauauaugut t 21 <210> 563 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 563 aaagaagagg cgugcgucgt t 21 <210> 564 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 564 uaguacuuga agcgcagcct t 21 <210> 565 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 565 agacguuaac aucgggaact t 21 <210> 566 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 566 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 583 uucuguggaa cauaggugat t 21 <210> 584 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 584 aaagauacca guuguugggt t 21 <210> 585 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 585 ugaaccacuc cugcucuggt t 21 <210> 586 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 586 uccaauggcc ccaugaacct t 21 <210> 587 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial 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Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 595 uaaguuuuga ugaugaucat t 21 <210> 596 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 596 aaauucccua uucaaaggut t 21 <210> 597 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 597 agagaucacg gccuggucct t 21 <210> 598 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 598 aagagaucuc caccugacct t 21 <210> 599 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 599 uugguagcga uacauuaaat t 21 <210> 600 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 600 cuuuuucagg ugucgauuut t 21 <210> 601 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 601 aauuccuucc agcgcaacgt t 21 <210> 602 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 602 uguauugcgc cucgcgcagt t 21 <210> 603 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 603 aagcuaugua caucgagggt t 21 <210> 604 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 604 aaacugcuua ugcacugugt t 21 <210> 605 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 605 aguguaacau gauugauuut t 21 <210> 606 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 606 aguucagcuu gcuaugugct t 21 <210> 607 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 607 ucuacgacgu cccgcaagct t 21 <210> 608 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 608 ugguuuucuc uacgacguct t 21 <210> 609 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 609 auuguggagu cguuggucgt t 21 <210> 610 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 610 aggauugugg agucguuggt t 21 <210> 611 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 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Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 619 augcuguccu ucaugucgct t 21 <210> 620 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 620 uaaugcuaug gccagcgggt t 21 <210> 621 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 621 uuacauacgg acuugagact t 21 <210> 622 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 622 uuuacauacg gacuugagat t 21 <210> 623 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 623 agaucugauu uacauacggt t 21 <210> 624 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 624 ugagaauaac uuuacuugut t 21 <210> 625 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 625 auggauugag aauaacuuut t 21 <210> 626 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 626 agucauccug agugcucact t 21 <210> 627 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 627 acggacugug gguguuuuct t 21 <210> 628 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 628 auuaaugcag cacggacugt t 21 <210> 629 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 629 agauuaaugc agcacggact t 21 <210> 630 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 630 uccacacgac cuuucagcat t 21 <210> 631 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 631 accaucugga ucugaacgct t 21 <210> 632 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 632 ugcccggauc uuuguauuut t 21 <210> 633 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 633 uugagcaacu ugcucauaut t 21 <210> 634 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 634 agaaaccacc uguagaauat t 21 <210> 635 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 635 agaacugcuc ggcacuauat t 21 <210> 636 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 636 tguguaaucc aagaugcugu u 21 <210> 637 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 637 tcaagcucug gucguauccu u 21 <210> 638 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 638 tuacugacag ccauaucgcu u 21 <210> 639 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 660 aauuaagauu cgcuuauggt t 21 <210> 661 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 661 uucuauuaga gauauggcat t 21 <210> 662 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 662 auuauacaag auucuaggct t 21 <210> 663 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 663 uauuauacaa gauucuaggt t 21 <210> 664 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial 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Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 676 uucuuauugg gcaaaaucct t 21 <210> 677 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 677 uucgucucgg uucuuauugt t 21 <210> 678 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 678 auucaguucg ucucgguuct t 21 <210> 679 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 679 aaagccauuc aguucgucut t 21 <210> 680 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial 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Synthetic oligonucleotide <400> 708 auuuccgguc ugcaaugagt t 21 <210> 709 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 709 aaaugcugaa auuuccggut t 21 <210> 710 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 710 gaaaauaaug uccucgacct t 21 <210> 711 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 711 ucgaaguacu cagcguaagt t 21 <210> 712 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 712 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala 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Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Asp Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Phe 35 40 45 Tyr Trp Thr Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Arg Asn Val Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Arg Ser Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 728 <211> 327 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 728 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys 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Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp 20 25 30 Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro 35 40 45 Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn 50 55 60 Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys 65 70 75 80 Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val 85 90 95 Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 100 105

Claims (164)

  1. 적어도 하나의 작용제와 접촉 후 증가된 염증성 표현형을 갖는 단핵구 및/또는 대식세포를 생성하는 방법으로서, 단핵구 및/또는 대식세포를 유효량의 상기 적어도 하나의 작용제와 접촉시키는 단계를 포함하되, 상기 적어도 하나의 작용제는 a) 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 하향조절하는 작용제 및/또는 b) 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 상향조절하는 작용제인, 증가된 염증성 표현형을 갖는 단핵구 및/또는 대식세포를 생성하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 증가된 염증성 표현형을 갖는 단핵구 및/또는 대식세포는 상기 작용제 또는 작용제들과 접촉 후 하기 중 하나 이상을 나타내는, 방법:
    a) 분화 클러스터 80(CD80), CD86, MHCII, MHCI, 인터류킨 1-베타(IL-1β), IL-6, CCL3, CCL4, CXCL10, CXCL9, GM-CSF 및/또는 종양 괴사 인자 알파(TNF-α)의 증가된 발현 및/또는 분비;
    b) CD206, CD163, CD16, CD53, VSIG4, PSGL-1, TGFb 및/또는 IL-10의 감소된 발현 및/또는 분비;
    c) IL-1β, TNF-α, IL-12, IL-18, GM-CSF, CCL3, CCL4 및 IL-23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 사이토카인 또는 케모카인의 증가된 분비;
    d) IL-1β, IL-6 및/또는 TNF-α의 발현 대 IL-10의 발현의 증가된 비;
    e) 증가된 CD8+ 세포독성 T 세포 활성화;
    f) CD8+ 세포독성 T 세포 활성화의 증가된 동원;
    g) 증가된 CD4+ 헬퍼 T 세포 활성;
    h) CD4+ 헬퍼 T 세포 활성의 증가된 동원;
    i) 증가된 NK 세포 활성;
    j) NK 세포의 증가된 동원;
    k) 증가된 호중구 활성;
    l) 증가된 대식세포 활성; 및/또는
    m) 현미경에 의해 평가되는 바와 같이 증가된 방추형 형태, 외관의 편평함 및/또는 수상돌기의 수.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 작용제 또는 작용제들과 접촉시킨 상기 단핵구 및/또는 대식세포는 세포의 집단에 포함되며, 상기 작용제는 세포의 집단에서 제1형 및/또는 M1 대식세포의 수를 증가시키고/시키거나 제2형 및/또는 M2 대식세포의 수를 감소시키는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작용제 또는 작용제들과 접촉시킨 상기 단핵구 및/또는 대식세포는 세포의 집단에 포함되며, 상기 작용제 또는 작용제들은 상기 i) 내지 ii)의 비를 증가시키되, 세포의 집단에서 상기 i)은 제1형 및/또는 M1 대식세포이고, 상기 ii)는 제2형 및/또는 M2 대식세포인, 방법.
  5. 적어도 하나의 작용제와 접촉 후 감소된 염증성 표현형을 갖는 단핵구 및/또는 대식세포를 생성하는 방법으로서, 단핵구 및/또는 대식세포를 유효량의 적어도 하나의 작용제와 접촉시키는 단계를 포함하되, 상기 작용제는 a) 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 상향조절하는 작용제 및/또는 b) 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 하향조절하는 작용제인, 감소된 염증성 표현형을 갖는 단핵구 및/또는 대식세포를 생성하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 감소된 염증성 표현형을 갖는 단핵구 및/또는 대식세포는 상기 작용제 또는 작용제들과 접촉 후 하기 중 하나 이상을 나타내는, 방법:
    a) 분화 클러스터 80(CD80), CD86, MHCII, MHCI, 인터류킨 1-베타(IL-1β), IL-6, CCL3, CCL4, CXCL10, CXCL9, GM-CSF 및/또는 종양 괴사 인자 알파(TNF-α)의 감소된 발현 및/또는 분비;
    b) CD206, CD163, CD16, CD53, VSIG4, PSGL-1 및/또는 IL-10의 증가된 발현 및/또는 분비;
    c) IL-1β, TNF-α, IL-12, IL-18 및 IL-23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 사이토카인의 감소된 분비;
    d) IL-1β, IL-6 및/또는 TNF-α의 발현 대 IL-10의 발현의 감소된 비;
    e) 감소된 CD8+ 세포독성 T 세포 활성화;
    f) 감소된 CD4+ 헬퍼 T 세포 활성;
    g) 감소된 NK 세포 활성;
    h) 감소된 전-염증성 호중구 활성;
    i) 감소된 대식세포 활성; 및/또는
    j) 현미경에 의해 평가되는 바와 같이 감소된 방추형 형태, 외관의 편평함 및/또는 수상돌기의 수.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 작용제 또는 작용제들과 접촉시킨 상기 단핵구 및/또는 대식세포는 세포의 집단에 포함되며, 상기 작용제는 세포의 집단에서 제1형 및/또는 M1 대식세포의 수를 감소시키고/시키거나 제2형 및/또는 M2 대식세포의 수를 증가시키는, 방법.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작용제 또는 작용제들과 접촉시킨 상기 단핵구 및/또는 대식세포는 세포의 집단에 포함되며, 상기 작용제 또는 작용제들은 상기 i) 내지 ii)의 비를 감소시키되, 세포의 집단에서 상기 i)는 제1형 및/또는 M1 대식세포이고, 상기 ii)는 제2형 및/또는 M2 대식세포인, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 하향조절하는 상기 작용제 또는 작용제들은 소분자 저해제, CRISPR 가이드 RNA(gRNA), RNA 간섭 작용제, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 단일-가닥 핵산, 이중-가닥 핵산, 압타머, 리보자임, DNA자임, 펩타이드, 펩타이도모방체, 항체, 인트라바디 또는 세포인, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 RNA 간섭 작용제는 작은 간섭 RNA(siRNA), 작은 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로RNA(miRNA) 또는 피위-결합 RNA(piRNA)인, 방법.
  11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 하향조절하는 상기 작용제 또는 작용제들은 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적에 특이적으로 결합하는 항체 및/또는 인트라바디 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 항체 및/또는 인트라바디 또는 이의 항원 결합 단편은 낙타, 뮤린, 키메라, 인간화된 것, 인간, 검출 가능하게 표지된 것이고, 효과기 도메인을 포함하며, Fc 도메인을 포함하고/하거나 Fv, Fav, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)2 및 다이어바디 단편(diabodies fragment)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 항체 및/또는 인트라바디 또는 이의 항원 결합 단편은 세포독성 작용제에 접합되는, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 세포독성 작용제는 화학치료제, 생물학적 작용제, 독소 및 방사성 동위원소로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  15. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 상향조절하는 상기 작용제 또는 작용제들은 표 1 및/또는 표 2에 열거된 하나 이상의 표적을 암호화하는 핵산 분자 또는 이의 단편, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 하나 이상의 표적의 폴리펩타이드 또는 이의 단편(들), 표 1 및/또는 표 2에 열거된 하나 이상의 표적에 결합하는 활성화 항체 및/또는 인트라바디 또는 표 1 및/또는 표 2에 열거된 하나 이상의 표적에 결합하는 소분자인, 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대식세포는 제1형 대식세포, M1 대식세포, 제2형 대식세포, M2 대식세포, M2c 대식세포, M2d 대식세포, 종양-관련 대식세포(TAM), CD11b+ 세포, CD14+ 세포 및/또는 CD11b+/CD14+ 세포를 포함하되, 선택적으로 상기 세포 및/또는 대식세포는 상기 표적을 발현하는, 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단핵구 및/또는 대식세포는 시험관내 또는 생체외에서 접촉되는, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 단핵구 및/또는 대식세포는 일차 단핵구 및/또는 일차 대식세포인, 방법.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 단핵구 및/또는 대식세포는 작용제 또는 작용제들과 접촉되기 전에 정제되고/되거나 배양되는, 방법.
  20. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단핵구 및/또는 대식세포는 생체내에서 접촉되는, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 단핵구 및/또는 대식세포는 전신, 종양 부근 또는 종양내 작용제의 투여에 의해 생체내에서 접촉되는, 방법.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 단핵구 및/또는 대식세포는 조직 미세환경에서 접촉되는, 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단핵구 및/또는 대식세포를 염증성 표현형을 조절하는 적어도 하나의 면역치료제와 접촉시키는 단계를 더 포함하되, 선택적으로 상기 면역치료제는 면역관문 저해제, 면역-자극성 효능제, 염증성 작용제, 세포, 암 백신 및/또는 바이러스를 포함하는, 방법.
  24. 조성물로서, i) 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 방법에 따라 생성된 단핵구 및/또는 대식세포 및/또는 ii) 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 양 및/또는 활성을 하향조절하기 위한 siRNA를 포함하는, 조성물.
  25. 적어도 하나의 작용제와 접촉 후 대상체에서 단핵구 및/또 대식세포의 염증성 표현형을 증가시키는 방법으로서, 상기 유효량의 적어도 하나의 작용제를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 적어도 하나의 작용제는 a) 상기 단핵구 및/또 대식세포에서 또는 그 위에서 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 하향조절하는 작용제, 및/또는 b) 상기 단핵구 및/또 대식세포에서 또는 그 위에서 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피수, 양 및/또는 활성을 상향조절하는 작용제인, 상기 대상체에서 단핵구 및/또 대식세포의 염증성 표현형을 증가시키는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 증가된 염증성 표현형을 갖는 단핵구 및/또는 대식세포는 상기 작용제 또는 작용제들과 접촉 후 하기 중 하나 이상을 나타내는, 방법:
    a) 분화 클러스터 80(CD80), CD86, MHCII, MHCI, 인터류킨 1-베타(IL-1β), IL-6, CCL3, CCL4, CXCL10, CXCL9, GM-CSF 및/또는 종양 괴사 인자 알파(TNF-α)의 증가된 발현 및/또는 분비;
    b) CD206, CD163, CD16, CD53, VSIG4, PSGL-1 및/또는 IL-10의 감소된 발현 및/또는 분비;
    c) IL-1β, TNF-α, IL-12, IL-18 및 IL-23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 사이토카인의 증가된 분비;
    d) IL-1β, IL-6 및/또는 TNF-α의 발현 대 IL-10의 발현의 증가된 비;
    e) 증가된 CD8+ 세포독성 T 세포 활성화;
    f) 증가된 CD4+ 헬퍼 T 세포 활성;
    g) 증가된 NK 세포 활성;
    h) 증가된 호중구 활성;
    i) 증가된 대식세포 활성; 및/또는
    j) 현미경에 의해 평가되는 바와 같이 증가된 방추형 형태, 외관의 편평함 및/또는 수상돌기의 수.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 작용제 또는 작용제들은 제1형 및/또는 M1 대식세포의 수를 증가시키거나, 제2형 및/또는 M2 대식세포의 수를 감소시키고/시키거나 상기 i) 내지 ii)의 비를 증가시키되, 상기 대상체에서 상기 i)는 제1형 및/또는 M1 대식세포이고, 상기 ii)는 제2형 및/또는 M2 대식세포인, 방법.
  28. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에서 세포독성 CD8+ T 세포의 수 및/또는 활성은 상기 작용제 또는 작용제들의 투여 후에 증가되는, 방법.
  29. 적어도 하나의 작용제와 접촉 후 대상체에서 단핵구 및/또는 대식세포의 염증성 표현형을 감소시키는 방법으로서, 유효량의 상기 적어도 하나의 작용제를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 적어도 하나의 작용제는 a) 상기 단핵구 및/또는 대식세포에서 또는 그 위에서 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 상향조절하는 작용제 및/또는 b) 상기 단핵구 및/또는 대식세포에서 또는 그 위에서 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 하향조절하는 작용제인, 대상체에서 단핵구 및/또는 대식세포의 염증성 표현형을 감소시키는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 감소된 염증성 표현형을 갖는 단핵구 및/또는 대식세포는 상기 작용제 또는 작용제들과 접촉 후 하기 중 하나 이상을 나타내는, 방법:
    a) 분화 클러스터 80(CD80), CD86, MHCII, MHCI, 인터류킨 1-베타(IL-1β), IL-6, CCL3, CCL4, CXCL10, CXCL9, GM-CSF 및/또는 종양 괴사 인자 알파(TNF-α)의 감소된 발현 및/또는 분비;
    b) CD206, CD163, CD16, CD53, VSIG4, PSGL-1 및/또는 IL-10의 증가된 발현 및/또는 분비;
    c) IL-1β, TNF-α, IL-12, IL-18 및 IL-23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 사이토카인의 감소된 분비;
    d) IL-1β, IL-6 및/또는 TNF-α의 발현 대 IL-10의 발현의 감소된 비;
    e) 감소된 CD8+ 세포독성 T 세포 활성화;
    f) 감소된 CD4+ 헬퍼 T 세포 활성;
    g) 감소된 NK 세포 활성;
    h) 감소된 호중구 활성;
    i) 감소된 대식세포 활성; 및/또는
    j) 현미경에 의해 평가되는 바와 같이 감소된 방추형 형태, 외관의 편평함 및/또는 수상돌기의 수.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 상기 작용제 또는 작용제들은 제1형 및/또는 M1 대식세포의 수를 감소시키거나, 제2형 및/또는 M2 대식세포의 수를 증가시키고/시키거나 상기 i) 내지 ii)의 비를 감소시키되, 상기 대상체에서 상기 i)은 제1형 및/또는 M1 대식세포이고, 상기 ii)는 제2형 및/또는 M2 대식세포인, 방법.
  32. 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에서 세포독성 CD8+ T 세포의 수 및/또는 활성은 작용제의 투여 후 감소되는, 방법.
  33. 제25항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 하향조절하는 상기 작용제는 소분자 저해제, CRISPR 가이드 RNA(gRNA), RNA 간섭 작용제, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드 또는 펩타이도모방체 저해제, 압타머, 항체, 인트라바디 또는 세포인, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 RNA 간섭 작용제는 작은 간섭 RNA(siRNA), 작은 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로RNA(miRNA) 또는 피위-결합 RNA(piRNA)인, 방법.
  35. 제25항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 하향조절하는 상기 작용제는 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적에 특이적으로 결합하는 항체 및/또는 인트라바디 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 항체 및/또는 인트라바디 또는 이의 항원 결합 단편은 낙타, 뮤린, 키메라, 인간화된 것, 인간, 검출 가능하게 표지된 것이고, 효과기 도메인을 포함하며, Fc 도메인을 포함하고/하거나 Fv, Fav, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)2 및 다이어바디 단편(diabodies fragment)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 상기 항체 및/또는 인트라바디 또는 이의 항원 결합 단편은 세포독성 작용제에 접합되는, 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 세포독성 작용제는 화학치료제, 생물학적 작용제, 독소 및 방사성 동위원소로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  39. 제25항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 상향조절하는 상기 작용제는 표 1 및/또는 표 2에 열거된 하나 이상의 표적을 암호화하는 핵산 분자 또는 이의 단편, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 하나 이상의 표적의 폴리펩타이드 또는 이의 단편(들), 표 1 및/또는 표 2에 열거된 하나 이상의 표적에 결합하는 활성화 항체 및/또는 인트라바디 또는 표 1 및/또는 표 2에 열거된 하나 이상의 표적에 결합하는 소분자인, 방법.
  40. 제25항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대식세포는 제1형 대식세포, M1 대식세포, 제2형 대식세포, M2 대식세포, M2c 대식세포, M2d 대식세포, 종양-관련 대식세포(TAM), CD11b+ 세포, CD14+ 세포 및/또는 CD11b+/CD14+ 세포를 포함하되, 선택적으로 상기 세포 및/또는 대식세포는 상기 표적을 발현하는, 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 작용제 또는 작용제들은 전신, 종양 부근 또는 종양내 작용제의 투여에 의해 생체내에 투여되는, 방법.
  42. 제40항 또는 제41항에 있어서, 상기 작용제 또는 작용제들은 조직 미세환경에서 단핵구 및/또는 대식세포와 접촉하는, 방법.
  43. 제25항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, further comprising contacting 상기 단핵구 및/또는 대식세포를 염증성 표현형을 조절하는 적어도 하나의 면역치료제와 접촉시키는 단계를 더 포함하되, 선택적으로 상기 면역치료제는 면역관문 저해제, 면역-자극성 효능제, 염증성 작용제, 세포, 암 백신 및/또는 바이러스를 포함하는, 방법.
  44. 대상체에서 염증을 증가시키는 방법으로서, 유효량의 a) 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 하향조절하기 위해 적어도 하나의 작용제와 접촉시킨 단핵구 및/또는 대식세포 및/또는 b) 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 상향조절하기 위해 적어도 하나의 작용제와 접촉시킨 단핵구 및/또는 대식세포를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 염증을 증가시키는 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 대식세포는 제1형 대식세포, M1 대식세포, 제2형 대식세포, M2 대식세포, M2c 대식세포, M2d 대식세포, 종양-관련 대식세포(TAM), CD11b+ 세포, CD14+ 세포 및/또는 CD11b+/CD14+ 세포를 포함하되, 선택적으로 상기 세포 및/또는 대식세포는 상기 표적을 발현하는, 방법.
  46. 제44항 또는 제45항에 있어서, 상기 단핵구 및/또는 대식세포는 대상체의 단핵구 및/또는 대식세포에 대하여 유전자 조작, 자가유래, 동계 또는 동종이계인, 방법.
  47. 제44항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 a)의 적어도 하나의 작용제와 접촉시킨 단핵구 및/또는 대식세포는 상기 b)의 적어도 하나의 작용제와 접촉시킨 단핵구 및/또는 대식세포와 상이한, 방법.
  48. 제44항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 a)의 적어도 하나의 작용제와 접촉시킨 단핵구 및/또는 대식세포는 상기 b)의 적어도 하나의 작용제와 접촉시킨 단핵구 및/또는 대식세포와 동일한, 방법.
  49. 제44항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작용제 또는 작용제들은 전신으로, 종양 근처로 또는 종양 내부로 투여되는, 방법.
  50. 대상체에서 염증을 감소시키는 방법으로서, 유효량의 a) 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 상향조절하는 적어도 하나의 작용제와 접촉시킨 단핵구 및/또는 대식세포 및/또는 b) 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 하향조절하는 적어도 하나의 작용제와 접촉시킨 단핵구 및/또는 대식세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 염증을 감소시키는 방법.
  51. 제50항에 있어서, 상기 대식세포는 제1형 대식세포, M1 대식세포, 제2형 대식세포, M2 대식세포, M2c 대식세포, M2d 대식세포, 종양-관련 대식세포(TAM), CD11b+ 세포, CD14+ 세포 및/또는 CD11b+/CD14+ 세포를 포함하되, 선택적으로 상기 세포 및/또는 대식세포는 상기 표적을 발현하는, 방법.
  52. 제50항 또는 제51항에 있어서, 상기 단핵구 및/또는 대식세포는 상기 대상체의 단핵구 및/또는 대식세포에 대해 유전자 조작, 자가유래, 동계 또는 동종이계인, 방법.
  53. 제50항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 a)의 적어도 하나의 작용제와 접촉시킨 단핵구 및/또는 대식세포는 상기 b)의 적어도 하나의 작용제와 접촉시킨 단핵구 및/또는 대식세포와 상이한, 방법.
  54. 제50항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 a)의 적어도 하나의 작용제와 접촉시킨 단핵구 및/또는 대식세포는 상기 b)의 적어도 하나의 작용제와 접촉시킨 단핵구 및/또는 대식세포와 동일한, 방법.
  55. 제50항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작용제 또는 작용제들은 전신으로, 종양 근처로 또는 종양 내부로 투여되는 방법.
  56. 세포독성 CD8+ T 세포-매개성 살해 및/또는 면역관문 요법에 대해 대상체에서 암 세포를 감작시키는 방법으로서, 치료적 유효량의 a) 단핵구 및/또는 대식세포에서 또는 그 위에서 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 하향조절하는 적어도 하나의 작용제 및/또는 b) 단핵구 및/또는 대식세포에서 또는 그 위에서 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 상향조절하는 적어도 하나의 작용제를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암 세포를 감작시키는 방법.
  57. 제56항에 있어서, 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 하향조절하는 적어도 하나의 작용제를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  58. 제57항에 있어서, 상기 작용제는 소분자 저해제, CRISPR 가이드 RNA(gRNA), RNA 간섭 작용제, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드 또는 펩타이도모방체 저해제, 압타머, 항체, 인트라바디 또는 세포인, 방법.
  59. 제58항에 있어서, 상기 RNA 간섭 작용제는 작은 간섭 RNA(siRNA), 작은 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로RNA(miRNA) 또는 피위-결합 RNA(piRNA)인, 방법.
  60. 제58항에 있어서, 상기 작용제는 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적에 특이적으로 결합하는 항체 및/또는 인트라바디 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 방법.
  61. 제60항에 있어서, 상기 항체 및/또는 인트라바디 또는 이의 항원 결합 단편은 낙타, 뮤린, 키메라, 인간화된 것, 인간, 검출 가능하게 표지된 것이고, 효과기 도메인을 포함하며, Fc 도메인을 포함하고/하거나 Fv, Fav, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)2 및 다이어바디 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  62. 제60항 또는 제61항에 있어서, 상기 항체 및/또는 인트라바디 또는 이의 항원 결합 단편은 세포독성 작용제에 접합되는, 방법.
  63. 제62항에 있어서, 상기 세포독성 작용제는 화학치료제, 생물학적 작용제, 독소 및 방사성 동위원소로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  64. 제56항에 있어서, 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 상향조절하는 적어도 하나의 작용제를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  65. 제64항에 있어서, 상기 작용제는 표 2에 열거된 하나 이상의 표적을 암호화하는 핵산 분자 또는 이의 단편, 표 2에 열거된 하나 이상의 표적의 폴리펩타이드 또는 이의 단편(들), 표 2에 열거된 하나 이상의 표적에 결합하는 활성화 항체 및/또는 인트라바디 또는 표 2에 열거된 하나 이상의 표적에 결합하는 소분자인, 방법.
  66. 세포독성 CD8+ T 세포-매개성 살해 및/또는 면역관문 요법에 대해 암을 앓고 있는 대상체에서 암 세포를 감작시키는 방법으로서, 치료적 유효량의 a) 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 하향조절하는 적어도 하나의 작용제와 접촉시킨 단핵구 세포 및/또는 대식세포 세포 및/또는 b) 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 상향조절하는 적어도 하나의 작용제와 접촉시킨 단핵구 세포 및/또는 대식세포를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암 세포를 감작시키는 방법.
  67. 제66항에 있어서, 상기 대식세포는 제1형 대식세포, M1 대식세포, 제2형 대식세포, M2 대식세포, M2c 대식세포, M2d 대식세포, 종양-관련 대식세포(TAM), CD11b+ 세포, CD14+ 세포 및/또는 CD11b+/CD14+ 세포를 포함하되, 선택적으로 상기 세포 및/또는 대식세포는 상기 표적을 발현하는, 방법.
  68. 제66항 내지 제67항에 있어서, 상기 단핵구 및/또는 대식세포는 상기 대상체의 단핵구 및/또는 대식세포에 대해 유전자 조작, 자가유래, 동계 또는 동종이계인, 방법.
  69. 제66항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 a)의 적어도 하나의 작용제와 접촉시킨 단핵구 및/또는 대식세포는 상기 b)의 적어도 하나의 작용제와 접촉시킨 단핵구 및/또는 대식세포와 상이한, 방법.
  70. 제66항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 a)의 적어도 하나의 작용제와 접촉시킨 단핵구 및/또는 대식세포는 상기 b)의 적어도 하나의 작용제와 접촉시킨 단핵구 및/또는 대식세포와 동일한, 방법.
  71. 제56항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작용제 또는 작용제들은 전신으로, 종양 근처로 또는 종양 내부로 투여되는, 방법.
  72. 제56항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 적어도 하나의 면역요법을 투여함으로써 상기 대상체에서 암을 치료하는 단계를 더 포함하되, 선택적으로 상기 면역요법은 면역관문 저해제, 면역-자극성 효능제, 염증성 작용제, 세포, 암 백신 및/또는 바이러스를 포함하는, 방법.
  73. 제72항에 있어서, 상기 면역관문은 PD-1, PD-L1, PD-L2 및 CTLA-4로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  74. 제73항에 있어서, 상기 면역관문은 PD-1인, 방법.
  75. 제56항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작용제 또는 작용제들은 암에서 증식하는 세포의 수를 감소시키고/시키거나 암 세포를 포함하는 종양의 부피 또는 크기를 감소시키는, 방법.
  76. 제56항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작용제 또는 작용제들은 CD8+ T 세포 침윤 암 세포를 포함하는 종양의 양 및/또는 활성을 증가시키는 방법.
  77. 제56항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작용제 또는 작용제들은 a) M1 대식세포 침윤 암 세포를 포함하는 종양의 양 및/또는 활성을 증가시키고/시키거나, b) M2 대식세포 침윤 암 세포를 포함하는 종양의 양 및/또는 활성을 감소시키는, 방법.
  78. 제56항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 암을 치료하기 위한 적어도 하나의 추가적인 요법 또는 양생법을 대상체에게 투여하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  79. 제51항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 요법은 작용제 이전, 이와 동시에 또는 이후에 투여되는, 방법.
  80. 적어도 하나의 표적을 조절함으로써 염증성 표현형을 증가시킬 수 있는 단핵구 및/또는 대식세포를 확인하는 방법으로서,
    a) 상기 단핵구 및/또는 대식세포로부터 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 결정하는 단계;
    b) 대조군에서 상기 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 결정하는 단계; 및
    c) 상기 a) 및 b) 단계에서 검출된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 비교하는 단계를 포함하되,
    상기 적어도 하나의 표적의 대조군 카피 수, 양 및/또는 활성과 비교하여 상기 단핵구 및/또는 대식세포에서 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성의 존재 또는 증가 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성의 부재 또는 감소는 상기 단핵구 및/또는 대식세포가 적어도 하나의 표적을 조절함으로써 염증성 표현형을 증가시킬 수 있음을 나타내는, 염증성 표현형을 증가시킬 수 있는 단핵구 및/또는 대식세포를 확인하는 방법.
  81. 제80항에 있어서, 상기 세포를 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적을 조절하는 작용제와 세포를 접촉시키는 단계, 이를 권장, 처방 또는 투여하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  82. 제80항에 있어서, 대상체가 하나 이상의 표적을 조절함으로써 염증성 표현형을 증가시키는 것으로부터 혜택을 받지 않는다고 결정되는 경우, 상기 세포를 표 1 및/또는 표 2에 열거된 하나 이상의 표적을 조절하는 작용제 이외의 암 요법과 접촉시키고, 이를 권장, 처방 또는 투여하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  83. 제81항 또는 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포를 면역 반응을 증가시키는 적어도 하나의 추가적인 작용제와 접촉시키고/시키거나 이를 투여하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  84. 제83항에 있어서, 상기 추가적인 작용제는 표적화 요법, 화학요법, 방사선 요법 및/또는 호르몬 요법으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  85. 제80항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대조군은 상기 대상체가 속한 동일한 종의 구성원으로부터 유래되는, 방법.
  86. 제80항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대조군은 상기 세포를 포함하는 샘플인, 방법.
  87. 제80항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 암을 앓고 있는, 방법.
  88. 제80항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대조군은 상기 대상체로부터의 암 샘플인, 방법.
  89. 제80항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대조군은 상기 대상체로부터의 비-암성 샘플인, 방법.
  90. 적어도 하나의 표적을 조절함으로써 염증성 표현형을 감소시킬 수 있는 단핵구 및/또는 대식세포를 확인하는 방법으로서,
    a) 상기 단핵구 및/또는 대식세포로부터 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 결정하는 단계;
    b) 대조군에서 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 결정하는 단계; 및
    c) 상기 a) 및 b) 단계에서 검출된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 비교하는 단계를 포함하되,
    적어도 하나의 표적의 대조군 카피 수, 양 및/또는 활성과 비교하여 상기 단핵구 및/또는 대식세포에서 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성의 부재 또는 감소 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성의 존재 또는 증가는 단핵구 및/또는 대식세포가 적어도 하나의 표적을 조절함으로써 염증성 표현형을 감소시킬 수 있음을 나타내는, 방법.
  91. 제90항에 있어서, 상기 단핵구 및/또는 대식세포를 표 1 및/또는 표 2에 열거된 하나 이상의 표적을 조절하는 작용제 또는 작용제들과 접촉시키고, 이를 권장, 처방 또는 투여하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  92. 제91항에 있어서, 대상체가 적어도 하나의 표적을 조절함으로써 염증성 표현형을 감소시키는 것으로부터 혜택을 받지 않는 것으로 결정된 경우, 상기 단핵구 및/또는 대식세포를 표 1 및/또는 표 2에 열거된 하나 이상의 표적을 조절하는 작용제 또는 작용제들 이외에 암 요법과 접촉시키고, 이를 권장, 처방 또는 투여하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  93. 제91항 또는 제92항에 있어서, 상기 단핵구 및/또는 대식세포를 면역 반응을 감소시키는 적어도 하나의 추가적인 작용제와 접촉시키고/시키거나 이를 투여하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  94. 제90항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대조군은 상기 대상체가 속한 동일한 종의 구성원으로부터 유래되는, 방법.
  95. 제90항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대조군은 상기 세포를 포함하는 샘플인, 방법.
  96. 제90항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 암을 앓고 있는, 방법.
  97. 제90항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대조군은 상기 대상체로부터의 암 샘플인, 방법.
  98. 제90항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대조군은 상기 대상체로부터의 비-암성 샘플인, 방법.
  99. 암에 걸린 대상체의 임상 결과를 예측하는 방법으로서,
    a) 상기 대상체로부터의 단핵구 및/또는 대식세포로부터 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 결정하는 단계;
    b) 나쁜 임상 결과를 갖는 대조군으로부터 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 결정하는 단계; 및
    c) 상기 대상체 샘플 및 상기 대조군 대상체로부터의 샘플에서 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 비교하는 단계를 포함하되,
    상기 대조군에서 카피 수, 양 및/또는 활성과 비교하여 상기 대상체로부터의 단핵구 및/또는 대식세포로부터 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성의 존재 또는 증가 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성의 부재 또는 감소는 대상체가 나쁜 임상 결과를 갖지 않음을 나타내는, 암에 걸린 대상체의 임상 결과를 예측하는 방법.
  100. 대상체에서 단핵구 및/또는 대식세포의 염증성 표현형을 모니터링하는 방법으로서,
    a) 첫 번째 시점에서 제1 대상체 샘플에서 상기 대상체로부터의 단핵구 및/또는 대식세포로부터 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 검출하는 단계;
    b) 이후의 시점에서 수득된 단핵구 및/또는 대식세포를 포함하는 후속 샘플을 사용하여 a) 단계를 반복하는 단계; 및
    c) 상기 a) 및 b) 단계에서 검출된 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 양 또는 활성을 비교하는 단계를 포함하되,
    상기 제1 샘플로부터의 단핵구 및/또는 대식세포로부터의 카피 수, 양 및/또는 활성과 비교하여 상기 후속 샘플로부터의 단핵구 및/또는 대식세포로부터 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성의 부재 또는 감소 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성의 존재 또는 증가는 상기 대상체의 단핵구 및/또는 대식세포가 상향조절된 염증성 표현형을 갖거나; 또는
    상기 제1 샘플로부터의 단핵구 및/또는 대식세포로부터의 카피 수, 양 및/또는 활성과 비교하여 상기 후속 샘플로부터의 단핵구 및/또는 대식세포로부터 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성의 존재 또는 증가 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성의 부재 또는 감소는 상기 대상체의 단핵구 및/또는 대식세포가 하향조절된 염증성 표현형을 갖는, 단핵구 및/또는 대식세포의 염증성 표현형을 모니터링하는 방법.
  101. 제100항에 있어서, 상기 제1 및/또는 적어도 하나의 후속 샘플은 시험관내에서 배양된 단핵구 및/또는 대식세포를 포함하는, 방법.
  102. 제100항에 있어서, 상기 제1 및/또는 적어도 하나의 후속 샘플은 시험관내에서 배양되지 않은 단핵구 및/또는 대식세포를 포함하는, 방법.
  103. 제100항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및/또는 적어도 하나의 후속 샘플은 상기 대상체로부터 수득된 단일 샘플 또는 혼주된(pooled) 샘플의 일부인, 방법.
  104. 제100항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플은 상기 대상체로부터 수득된 혈액, 혈청, 종양 부근 조직 및/또는 종양내 조직을 포함하는, 방법.
  105. 대상체에서 단핵구 및/또는 대식세포의 염증성 표현형을 증가시키는 작용제의 효능을 평가하는 방법으로서,
    a) 첫 번째 시점에서 단핵구 및/또는 대식세포를 포함하는 대상체 샘플에서 i) 상기 단핵구 및/또는 대식세포에서 또는 그 위에서 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성 및/또는 ii) 상기 단핵구 및/또는 대식세포의 염증성 표현형을 검출하는 단계;
    b) 상기 단핵구 및/또는 대식세포가 작용제와 접촉된 후 적어도 하나의 후속 시점 동안 a) 단계를 반복하는 단계; 및
    c) 상기 a) 및 b) 단계에서 검출된 i) 및/또는 ii)의 값을 비교하는 단계를 포함하되,
    상기 첫 번째 시점에서 상기 샘플의 카피 수, 양 및/또는 활성과 비교하여 상기 후속 샘플에서 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성의 부재 또는 감소 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성의 존재 또는 증가 및/또는 상기 ii)의 증가는 상기 작용제가 상기 대상체에서 단핵구 및/또는 대식세포의 염증성 표현형을 증가시킴을 나타내는, 방법.
  106. 제105항에 있어서, 상기 작용제와 접촉시킨 단핵구 및/또는 대식세포는 세포의 집단에 포함되며, 상기 작용제는 상기 세포의 집단에서 제1형 및/또는 M1 대식세포의 수를 증가시키는, 방법.
  107. 제105항 또는 제106에 있어서, 상기 작용제와 접촉시킨 단핵구 및/또는 대식세포는 세포의 집단에 포함되며, 상기 작용제는 상기 세포의 집단에서 제2형 및/또는 M2 대식세포의 수를 감소시키는, 방법.
  108. 단핵구 및/또는 대식세포의 염증성 표현형을 감소시키는 작용제의 효능을 평가하는 방법으로서,
    a) 첫 번째 시점에서 단핵구 및/또는 대식세포를 포함하는 대상체 샘플에서 i) 상기 단핵구 및/또는 대식세포에서 또는 그 위에서 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성 및/또는 ii) 단핵구 및/또는 대식세포의 염증성 표현형을 검출하는 단계;
    b) 상기 단핵구 및/또는 대식세포가 상기 작용제와 접촉된 후 적어도 하나의 후속 시점 동안 a) 단계를 반복하는 단계; 및
    c) 상기 a) 및 b) 단계에서 검출된 i) 및/또는 ii)의 값을 비교하는 단계를 포함하되,
    상기 첫 번째 시점에서 상기 샘플의 카피 수, 양 및/또는 활성과 비교하여 상기 후속 샘플에서 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성의 존재 또는 증가 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성의 부재 또는 감소 및/또는 ii)의 감소는 상기 작용제가 상기 대상체에서 단핵구 및/또는 대식세포의 염증성 표현형을 감소시킴을 나타내는, 작용제의 효능을 평가하는 방법.
  109. 제108항에 있어서, 상기 작용제와 접촉시킨 단핵구 및/또는 대식세포는 세포의 집단에 포함되며, 상기 작용제는 선택적으로 상기 세포의 집단에서 제1형 및/또는 M1 대식세포의 수를 감소시키는, 방법.
  110. 제108항 또는 제109항에 있어서, 상기 작용제와 접촉시킨 단핵구 및/또는 대식세포는 세포의 집단에 포함되며, 상기 작용제는 선택적으로 상기 세포의 집단에서 제2형 및/또는 M2 대식세포의 수를 증가시키는, 방법.
  111. 제105항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단핵구 및/또는 대식세포는 시험관내 또는 생체외에서 접촉되는, 방법.
  112. 제111항에 있어서, 상기 단핵구 및/또는 대식세포는 일차 단핵구 및/또는 일차 대식세포인, 방법.
  113. 제111항 또는 제112항에 있어서, 상기 단핵구 및/또는 대식세포는 상기 작용제와 접촉되기 전에 정제되고/되거나 배양되는, 방법.
  114. 제105항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단핵구 및/또는 대식세포는 생체내에서 접촉되는, 방법.
  115. 제114항에 있어서, 상기 단핵구 및/또는 대식세포는 전신, 종양 부근 또는 종양내 작용제의 투여에 의해 생체내에서 접촉되는, 방법.
  116. 제114항 또는 제115항에 있어서, 상기 단핵구 및/또는 대식세포는 조직 미세환경에서 접촉되는, 방법.
  117. 제105항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단핵구 및/또는 대식세포를 염증성 표현형을 조절하는 적어도 하나의 면역치료제와 접촉시키는 단계를 더 포함하되, 선택적으로 상기 면역치료제는 면역관문 저해제, 면역-자극성 효능제, 염증성 작용제, 세포, 암 백신 및/또는 바이러스를 포함하는, 방법.
  118. 제105항 내지 117항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 포유동물인, 방법.
  119. 제118항에 있어서, 상기 포유동물은 비인간 동물 모델 또는 인간인, 방법.
  120. 대상체에서 암을 치료하는 작용제의 효능을 평가하는 방법으로서,
    a) 첫 번째 시점에서 단핵구 및/또는 대식세포를 포함하는 대상체 샘플에서 i) 단핵구 및/또는 대식세포에서 또는 그 위에서 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성 및/또는 ii) 단핵구 및/또는 대식세포의 염증성 표현형을 검출하는 단계;
    b) 작용제의 투여 후 적어도 하나의 후속 시점 동안 a) 단계를 반복하는 단계; 및
    c) 상기 a) 및 b) 단계에서 검출된 i) 및/또는 ii)의 값을 비교하는 단계를 포함하되,
    상기 첫 번째 시점에서 상기 대상체 샘플의 단핵구 및/또는 대식세포에서 또는 그 위에서의 카피 수, 양 및/또는 활성과 비교하여 상기 후속 시점에서 상기 단핵구 및/또는 대식세포에서 또는 그 위에서 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성의 부재 또는 감소 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성의 존재 또는 증가 및/또는 상기 ii)의 증가는 상기 작용제가 상기 대상체에서 암을 치료함을 나타내는, 암을 치료하는 작용제의 효능을 평가하는 방법.
  121. 제120항에 있어서, 상기 첫 번째 시점과 상기 후속 시점 사이에서, 상기 대상체는 치료를 받았거나, 치료를 완료하고/하거나 암에 대해 관해 상태에 있는, 방법.
  122. 제120항 또는 제121항에 있어서, 상기 제1 및/또는 적어도 하나의 후속 샘플은 생체외 및 생체내 샘플로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  123. 제120항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및/또는 적어도 하나의 후속 샘플은 암의 비인간 동물 모델로부터 수득되는, 방법.
  124. 제120항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및/또는 적어도 하나의 후속 샘플은 상기 대상체로부터 수득된 단일 샘플 또는 혼주된 샘플의 일부인, 방법.
  125. 제120항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플은 상기 대상체로부터 수득된 세포, 혈청, 종양 부근 조직 및/또는 종양내 조직인, 방법.
  126. 세포독성 T 세포-매개성 살해 및/또는 면역관문 요법에 대해 암 세포를 감작시키는 작용제를 스크리닝하는 방법으로서,
    a) 상기 암 세포를 i) 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 감소시키는 적어도 하나의 작용제 및/또는 ii) 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 증가시키는 적어도 하나의 작용제와 접촉시킨 단핵구 및/또는 대식세포의 존재하에 세포독성 T 세포 및/또는 면역관문 요법과 접촉시키는 단계;
    b) 상기 암 세포를 적어도 하나의 작용제 또는 작용제들과 접촉시키지 않은 대조군 단핵구 및/또는 대식세포의 존재하에 세포독성 T 세포 및/또는 면역관문 요법과 접촉시키는 단계; 및
    c) 상기 b)와 비교하여 상기 a)에서 세포독성 T 세포-매개성 살해 및/또는 면역관문 요법 효능을 증가시키는 작용제를 확인함으로써 상기 세포독성 T 세포-매개성 살해 및/또는 면역관문 요법에 대해 상기 암 세포를 감작시키는 작용제를 확인하는 단계를 포함하는, 방법.
  127. 세포독성 T 세포-매개성 살해 및/또는 면역관문 요법에 대해 암 세포를 감작시키는 작용제를 스크리닝하는 방법으로서,
    a) 상기 암 세포를 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 감소시키도록 조작된 및/또는 ii) 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적의 카피 수, 양 및/또는 활성을 증가시키도록 조작된 단핵구 및/또는 대식세포의 존재하에 세포독성 T 세포 및/또는 면역관문 요법과 접촉시키는 단계;
    b) 상기 암 세포를 대조군 단핵구 및/또는 대식세포의 존재하에 세포독성 T 세포 및/또는 면역관문 요법과 접촉시키는 단계; 및
    c) 상기 b)와 비교하여 상기 a)에서 세포독성 T 세포-매개성 살해 및/또는 면역관문 요법 효능을 증가시키는 작용제를 확인함으로써 세포독성 T 세포-매개성 살해 및/또는 면역관문 요법에 대해 상기 암 세포를 감작시키는 작용제를 확인하는 단계를 포함하는, 방법.
  128. 제126항 또는 제127항에 있어서, 상기 접촉 단계는 생체내, 생체외 또는 시험관내에서 발생하는, 방법.
  129. 제120항 내지 제128항 중 어느 한 항에 있어서, i) 암에서 증식하는 세포의 수의 감소 및/또는 ii) 암 세포를 포함하는 종양의 부피 또는 크기의 감소를 결정하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  130. 제120항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, i) 증가된 수의 CD8+ T 세포 및/또는 ii) 증가된 수의 제1형 및/또는 M1 대식세포 침윤 암 세포를 포함하는 종양을 결정하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  131. 제120항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서, 임상적 이득률, 사망할 때까지의 생존기간, 병리학적 완전 반응, 병리학적 반응의 반-정량적 측정값, 임상적 완전 관해, 임상적 부분 관해, 임상적 안정 질환, 무재발 생존기간, 무전이 생존기간, 무질환 생존기간, 순환 종양 세포 감소, 순환 마커 반응 및 RECIST 기준으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 기준에 의해 측정된, 표 1 및/또는 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적을 조절하는 작용제에 대한 반응성을 결정하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  132. 제120항 내지 제131항 중 어느 한 항에 있어서, 암 세포를 적어도 하나의 추가적인 암 치료제 또는 양생법과 접촉시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
  133. 제1항 내지 제132항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작용제 또는 작용제들은 지질 또는 리피도이드를 더 포함하는, 방법 또는 조성물.
  134. 제133항에 있어서, 상기 리피도이드는 하기의 화학식 (VI) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염인, 방법 또는 조성물:
    Figure pct00177

    식 중,
    p는 1 내지 3의 정수를 포함하고;
    m은 1 내지 3의 정수를 포함하며;
    RA는 수소; 치환 또는 비치환된, 고리형 또는 비고리형, 분지형 또는 비분지형 C1-20 지방족; 치환 또는 비치환된, 고리형 또는 비고리형, 분지형 또는 비분지형 C1-20 헤테로지방족; 치환 또는 비치환된 아릴; 치환 또는 비치환된 헤테로아릴;
    Figure pct00178
    ;
    Figure pct00179
    또는
    Figure pct00180
    이고;
    RF는 수소; 치환 또는 비치환된, 고리형 또는 비고리형, 분지형 또는 비분지형 C1-20 지방족; 치환 또는 비치환된, 고리형 또는 비고리형, 분지형 또는 비분지형 C1-20 헤테로지방족; 치환 또는 비치환된 아릴; 치환 또는 비치환된 헤테로아릴;
    Figure pct00181
    ;
    Figure pct00182
    또는
    Figure pct00183
    이며;
    R5의 각각의 존재는 독립적으로 수소; 치환 또는 비치환된, 고리형 또는 비고리형, 분지형 또는 비분지형 C1-20 지방족; 치환 또는 비치환된, 고리형 또는 비고리형, 분지형 또는 비분지형 C1-20 헤테로지방족; 치환 또는 비치환된 아릴; 또는 치환 또는 비치환된 헤테로아릴이되;
    RA, RF, RY 및 RZ 중 적어도 하나는
    Figure pct00184
    또는
    Figure pct00185
    이고;
    x의 각각의 존재는 1 내지 10의 정수를 포함하며;
    y의 각각의 존재는 1 내지 10의 정수를 포함하고;
    RY의 각각의 존재는 수소; 치환 또는 비치환된, 고리형 또는 비고리형, 분지형 또는 비분지형 C1-20 지방족; 치환 또는 비치환된, 고리형 또는 비고리형, 분지형 또는 비분지형 C1-20 헤테로지방족; 치환 또는 비치환된 아릴; 치환 또는 비치환된 헤테로아릴;
    Figure pct00186
    또는
    Figure pct00187
    이며;
    RZ의 각각의 존재는 수소; 치환 또는 비치환된, 고리형 또는 비고리형, 분지형 또는 비분지형 C1-20 지방족; 치환 또는 비치환된, 고리형 또는 비고리형, 분지형 또는 비분지형 C1-20 헤테로지방족; 치환 또는 비치환된 아릴; 치환 또는 비치환된 헤테로아릴;
    Figure pct00188
    또는
    Figure pct00189
    이다.
  135. 제134항에 있어서, p는 1인, 방법 또는 조성물.
  136. 제134항 또는 제135항에 있어서, m은 1인, 방법 또는 조성물.
  137. 제134항 내지 제136항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 p 및 m은 1인, 방법 또는 조성물.
  138. 제134항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, RF는
    Figure pct00190
    인, 방법 또는 조성물.
  139. 제134항 내지 제138항 중 어느 한 항에 있어서, RA는
    Figure pct00191
    인, 방법 또는 조성물.
  140. 제134항에 있어서, 상기 화학식 (VI)의 화합물은 하기의 화학식 또는 이의 염인, 방법 또는 조성물:
    Figure pct00192
  141. 제134항 내지 제140항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 지질 나노입자의 형태인, 방법 또는 조성물.
  142. 제141항에 있어서, 상기 지질 나노입자는 약 1.0% 내지 약 60.0 몰%의 C12-200을 포함하는, 방법 또는 조성물.
  143. 제141항 또는 제142항에 있어서, 상기 지질 나노입자 하나 이상의 보조-지질(co-lipid)을 더 포함하는, 방법 또는 조성물.
  144. 제143항에 있어서, 각각의 보조-지질은 다이스테로일포스파티딜 콜린(DSPC), 콜레스테롤 및 DMG-PEG로부터 선택되는, 방법 또는 조성물.
  145. 제144항에 있어서, 상기 DSPC의 농도는 약 1.0% 내지 약 20.0 몰%인, 방법 또는 조성물.
  146. 제144항 또는 제145항에 잇어서, 상기 콜레스테롤의 농도는 약 10.0% 내지 약 50.0 몰%인, 방법 또는 조성물.
  147. 제144항 내지 제146항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DMG-PEG의 농도는 약 0.1% 내지 약 5.0 몰%인, 방법 또는 조성물.
  148. 제136항 내지 제147항 중 어느 한 항에 있어서, DSPC는 약 1.0% 내지 약 20.0 몰%의 농도로 존재하고; 콜레스테롤은 약 10.0% 내지 약 50.0 몰%의 농도로 존재하며; DMG-PEG는 약 0.1% 내지 약 5.0 몰%의 농도로 존재하는, 방법 또는 조성물.
  149. 제1항 내지 제148항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작용제는 약제학적으로 허용 가능한 제형으로 존재하되, 선택적으로 상기 약제학적으로 허용 가능한 제형은 실질적으로 내독소가 없고/없거나 약 1 EU/㎎ 미만의 단백질을 갖는, 방법 또는 조성물.
  150. 제1항 내지 제149항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조절된 염증성 표현형을 갖는 단핵구 및/또는 대식세포는 하기 중 하나 이상을 나타내는, 방법 또는 조성물:
    a) 분화 클러스터 80(CD80), CD86, MHCII, MHCI, 인터류킨 1-베타(IL-1β), IL-6, CCL3, CCL4, CXCL10, CXCL9, GM-CSF 및/또는 종양 괴사 인자 알파(TNF-α)의 조절된 발현;
    b) CD206, CD163, CD16, CD53, VSIG4, PSGL-1 및/또는 IL-10의 조절된 발현;
    c) IL-1β, TNF-α, IL-12, IL-18 및 IL-23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 사이토카인의 조절된 분비;
    d) IL-1β, IL-6 및/또는 TNF-α의 발현 대 IL-10의 발현의 조절된 비;
    e) 조절된 CD8+ 세포독성 T 세포 활성화;
    f) 조절된 CD4+ 헬퍼 T 세포 활성;
    g) 조절된 NK 세포 활성;
    h) 조절된 호중구 활성;
    i) 조절된 대식세포 활성; 및/또는
    j) 현미경에 의해 평가되는 바와 같이 조절된 방추형 형태, 외관의 편평함 및/또는 수상돌기의 수.
  151. 제1항 내지 제150항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 및/또는 대식세포는 제1형 대식세포, M1 대식세포, 제2형 대식세포, M2 대식세포, M2c 대식세포, M2d 대식세포, 종양-관련 대식세포(TAM), CD11b+ 세포, CD14+ 세포 및/또는 CD11b+/CD14+ 세포를 포함하되, 선택적으로 상기 세포 및/또는 대식세포는 표 1 및/또는 표 2에 열거된 표적으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 표적을 발현하거나 또는 발현하는 것으로 결정된, 방법 또는 조성물.
  152. 제1항 내지 제151항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적은 인간 SIGLEC9, VSIG4, CD74, CD207, LRRC25, SELPLG, AIF1, CD84, IGSF6, CD48, CD33, LST1, TNFAIP8L2(TIPE2), SPI1(PU.1), LILRB2, CCR5, EVI2B, CLEC7A, TBXAS1, SIGLEC7 및 DOCK2 또는 이들의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법 또는 조성물.
  153. 제1항 내지 제152항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적은 인간 CD53, FERMT3, CD37, CXorf21, CD48 및 CD84 또는 이들의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법 또는 조성물.
  154. 제1항 내지 제153항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 대식세포가 침윤된 고형 종양이되, 상기 침윤 대식세포는 종양 또는 종양 미세환경에서 세포의 질량, 부피 및/또는 수의 적어도 약 5%를 나타내고/내거나 상기 암은 중피종, 신장 투명세포형 신세포 암종, 교모세포종, 폐 선암종, 폐 편평세포 암종, 췌장 선암종, 유방 침습 암종, 급성 골수성 백혈병, 부신피질 암종, 방광 요로상피성 암종, 뇌 저등급 신경교종, 유방 침습 암종, 자궁경부 편평세포 암종 및 자궁경내 선암종, 담관암종, 결장 선암종, 식도 암종, 다발성 교모세포종, 두경부 편평세포 암종, 혐색소 신세포암, 신장 투명세포형 신세포 암종, 신장 신유두세포 암종, 간세포 암종, 림프구성 세포종양 미만성 거대 B-세포 림프종, 중피종, 난소 장액성 종양, 낭샘암종, 크롬 친화성 세포종, 부신경절종, 전립선 선암종, 직장 선암종, 육종, 피부 흑색종, 위 선암, 고환 생식세포 종양, 흉선종, 갑상선암종, 자궁 암육종, 자궁체부 내막 암종 및 포도막 흑색종으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법 또는 조성물.
  155. 제154항에 있어서, 상기 대식세포는 제1형 대식세포, M1 대식세포, 제2형 대식세포, M2 대식세포, M2c 대식세포, M2d 대식세포, 종양-관련 대식세포(TAM), CD11b+ 세포, CD14+ 세포 및/또는 CD11b+/CD14+ 세포를 포함하되, 선택적으로 상기 대식세포는 TAM 및/또는 M2 대식세포인, 방법 또는 조성물.
  156. 제155항에 있어서, 상기 대식세포는 표 1 및/또는 표 2에 열거된 표적으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 표적을 발현하거나 또는 발현하는 것으로 결정된, 방법 또는 조성물.
  157. 제156항에 있어서, 상기 표 1에 열거된 적어도 하나의 표적은 인간 SIGLEC9, VSIG4, CD74, CD207, LRRC25, SELPLG, AIF1, CD84, IGSF6, CD48, CD33, LST1, TNFAIP8L2(TIPE2), SPI1(PU.1), LILRB2, CCR5, EVI2B, CLEC7A, TBXAS1, SIGLEC7 및 DOCK2 또는 이들의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법 또는 조성물.
  158. 제156항 또는 제157항에 있어서, 상기 표 2에 열거된 적어도 하나의 표적은 인간 CD53, FERMT3, CD37, CXorf21, CD48 및 CD84 또는 이들의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법 또는 조성물.
  159. 제1항 내지 제158항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단핵구 및/또는 대식세포는 일차 단핵구 및/또는 일차 대식세포인, 방법 또는 조성물.
  160. 제1항 내지 제159항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단핵구 및/또는 대식세포는 조직 미세환경에 포함되는, 방법 또는 조성물.
  161. 제1항 내지 제160항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단핵구 및/또는 대식세포는 인간 종양 모델 또는 암의 동물 모델에 포함되는, 방법 또는 조성물.
  162. 제1항 내지 제161항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 포유동물인, 방법 또는 조성물.
  163. 제162항에 있어서, 상기 포유동물은 인간인, 방법 또는 조성물.
  164. 제163항에 있어서, 상기 인간은 암을 앓고 있는, 방법 또는 조성물.
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