CN114214237B - 一种洗脱细胞表面吸附纳米颗粒的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种洗脱细胞表面吸附纳米颗粒的方法，采用含有EDTA、柠檬酸盐、半胱氨酸的培养基对表面吸附有纳米颗粒的细胞进行洗涤。具体为配制含EDTA、柠檬酸盐、半胱氨酸的培养基；调节配制的培养基的pH值；先将暴露了纳米颗粒的细胞离心，弃上清溶液；将培养基悬浮沉淀细胞，静置后再次离心，弃上清溶液。本发明利用常见廉价、易得、无毒的络合剂作为洗涤液，通过优化其种类、浓度、接触时间、洗涤次数等参数，增强了其对吸附纳米颗粒的洗涤效果，提高了其应用的普适性。本工艺操作简单，原料易得，成本低，污染少。配制的洗涤液使用方法广泛，适合工业化生产。

Description

一种洗脱细胞表面吸附纳米颗粒的方法
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一种洗脱细胞表面吸附纳米颗粒的方法。
背景技术
作为毒性的决定因素之一，纳米颗粒的生物累积主要包括吸附在细胞壁或细胞膜上的纳米颗粒和内化到细胞中的纳米颗粒(Hassler等，2004；Von Moos等，2014)。纳米颗粒的内化是毒性的良好指标(Campbell，1994)。在研究纳米颗粒的生物累积动力学时，有必要区分吸附和内化的纳米颗粒。同时，纳米颗粒的生物累积动力学包括吸收和排出两个过程(Mortimer等，2014)。其中，集中关注内化纳米颗粒的排出过程的研究则较少(Frohlich，2016)。部分原因是吸附的纳米颗粒可能会对排出过程中细胞内纳米颗粒的变化的观察产生干扰，因为吸附也可能会随该过程而变化(Peng等，2013)。为了更准确地研究细胞内纳米颗粒的排出，有必要去除表面吸附的纳米颗粒。因此，建立有效去除细胞表面吸附的纳米颗粒的方法对精确研究纳米颗粒的生物累积和毒性机制有着重要意义。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种细胞表面吸附的纳米颗粒的洗脱方法，解决普遍存在的细胞表面吸附的纳米颗粒难以去除的问题。
为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种洗脱细胞表面吸附纳米颗粒的方法，采用含有EDTA、柠檬酸盐、半胱氨酸的培养基对表面吸附有纳米颗粒的细胞进行洗涤。
所述的细胞包括但不限于浮游植物(如绿藻、蓝藻等)，原生动物(如四膜虫、草履虫等)等细胞。
所述的纳米颗粒包括但不限于纳米金、纳米银、纳米氧化铁、纳米氧化钛、纳米氧化硅、纳米塑料、纳米氧化铜、纳米氧化锌等。
具体包括如下步骤：
(1)配制含EDTA、柠檬酸盐、半胱氨酸的培养基；
(2)调节步骤(1)配制的培养基的pH值；
(3)先将暴露了纳米颗粒的细胞离心，弃上清溶液；
(4)将步骤(2)培养基悬浮步骤(3)中的沉淀细胞，静置后再次离心，弃上清溶液。
优选地，步骤(1)中，所述的EDTA为EDTA钠盐，EDTA溶于细胞培养基中的浓度为0.3～3mmol/L，浓度不能对细胞产生毒害，最优选浓度为3mmol/L。
优选地，步骤(1)中，所述的柠檬酸盐在细胞培养基中的浓度为1～10mmol/L，优选柠檬酸钠，浓度不能对细胞产生毒害，最优选浓度为10mmol/L。
优选地，步骤(1)中，所述的半胱氨酸在细胞培养基中的浓度为1～10mmol/L，其浓度不能对细胞产生毒害，最优选浓度为10mmol/L。
优选地，步骤(2)中，调节pH值为4～7，调至相应pH的配制溶液需不对细胞产生毒害且对吸附在细胞表面的纳米颗粒有较高的洗脱效率，最优选为7。
优选地，步骤(3)中，离心条件为1000～4500rpm，时间为5～30min，离心条件的选择为能高效收集细胞的同时避免纳米颗粒的沉淀，最优选为3000rpm、5min。
优选地，步骤(4)中，静置的时间为5～30min，在保证有效洗脱吸附在细胞表面的纳米颗粒的基础上，应尽可能缩短洗脱溶液与细胞的接触时间，最优选为5min。
优选地，步骤(4)重复操作至少1次，在保证有效洗脱吸附在细胞表面的纳米颗粒的基础上，应尽可能减少洗涤次数。
有益效果：
本发明利用常见廉价、易得、无毒的络合剂作为洗涤液，通过优化其种类、浓度、接触时间、洗涤次数等参数，增强了其对吸附纳米颗粒的洗涤效果，提高了其应用的普适性。本工艺操作简单，原料易得，成本低，污染少。配制的洗涤液使用方法广泛，适合工业化生产。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1不同浓度和接触时间的EDTA对纳米氧化铁的洗脱效果。
图2洗涤剂EDTA(E)、柠檬酸盐(Ci)和半胱氨酸(Cy)溶解在Dryl’s培养基中的不同组合对纳米金的洗涤效果。
图3洗涤剂EDTA(E)、柠檬酸盐(Ci)和半胱氨酸(Cy)混合溶解在Dryl’s培养基中不同洗涤次数对纳米二氧化硅的洗涤效果。
图4洗涤剂EDTA(E)、柠檬酸盐(Ci)和半胱氨酸(Cy)混合溶解在Dryl’s培养基中对纳米银吸收动力学的洗涤效果。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。
实施例1：不同浓度和接触时间的EDTA对纳米氧化铁(Fe2O3NPs)的洗脱效果。
将EDTA溶解至Dryl’s培养基中，配制不同浓度EDTA(0，0.3，1，3mmol/L)。将暴露了2h纳米氧化铁的嗜热四膜虫细胞离心(3000rpm、5min)后，弃上清溶液，用配制的EDTA洗涤液洗涤不同时间(5，15，30min)后，离心弃上清溶液。与未洗涤的暴露细胞(Ctrl)比较洗涤效果。可发现3mmol/L的EDTA洗涤液洗涤暴露细胞5min的洗涤效果最佳(图1)。
实施例2：洗涤剂不同组合对纳米金(AuNPs)的洗涤效果。
将EDTA(E)、柠檬酸盐(Ci)和半胱氨酸(Cy)分别溶解至Dryl’s培养基中，最终浓度分别为3mmol/L、10mmol/L、10mmol/L，对它们进行两两组合和三组混合。将暴露了2h纳米金的嗜热四膜虫细胞离心(3000rpm、5min)后，弃上清溶液，用配制的单独和不同组合的洗涤液洗涤5min后，离心弃上清溶液。与未洗涤的暴露细胞(Ctrl)比较洗涤效果。可发现三组混合(Minxture)的洗涤效果最佳(图2)。
实施例3：混合洗涤剂的洗涤次数对纳米氧化硅(SiO2NPs)的洗涤效果。
将EDTA(E)、柠檬酸盐(Ci)和半胱氨酸(Cy)混合溶解至Dryl’s培养基中，得到最终浓度分别为3mmol/L、10mmol/L、10mmol/L的混合洗涤液(Mixture)，调节pH值7。将暴露了2h纳米氧化硅的嗜热四膜虫细胞离心(3000rpm、5min)后，弃上清溶液，用配制的Dryl’s和Mixture洗涤液洗涤不同次数(0～3次)，每次洗涤5min。可发现三组混合(Minxture)的洗涤2次即可达到最佳效果(图3)。
实施例4：混合洗涤剂对纳米银(AgNPs)吸收动力学的洗涤效果。
将EDTA(E)、柠檬酸盐(Ci)和半胱氨酸(Cy)混合溶解至Dryl’s培养基中，得到最终浓度分别为3mmol/L、10mmol/L、10mmol/L的混合洗涤液(Mixture)，调节pH值为7。将暴露了纳米氧化银的嗜热四膜虫细胞在每个时间点离心后，弃上清溶液，用配制的Dryl’s和Mixture洗涤液洗涤2次数，每次洗涤5min。可发现混合(Minxture)的洗涤可将吸附的纳米银基本去除(图4)。
实施例5：吸收动力学中混合洗液(Mixture)对不同纳米颗粒的表面吸附去除效率测试。
将本发明将优化得到的洗液对不同纳米颗粒吸附在细胞表面的去除效率(与原始培养基(Dyrl’s)相比较)和剩余吸附占总累积量的比值，如表1所示。
表1
Figure BDA0003428658300000041
本发明提供了一种洗脱细胞表面吸附纳米颗粒的方法的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

Claims (5)

1.一种洗脱细胞表面吸附纳米颗粒的方法，其特征在于，采用含有EDTA、柠檬酸盐、半胱氨酸的培养基对表面吸附有纳米颗粒的细胞进行洗涤；
具体地包括如下步骤：
（1）配制含EDTA、柠檬酸盐、半胱氨酸的培养基；
（2）调节步骤（1）配制的培养基的pH值；
（3）先将暴露了纳米颗粒的细胞离心，弃上清溶液；
（4）将步骤（2）培养基悬浮步骤（3）中的沉淀细胞，静置后再次离心，弃上清溶液；
步骤（1）中，所述的EDTA为EDTA钠盐，EDTA溶于细胞培养基中的浓度为0.3~3 mmol/L；
所述的柠檬酸盐在细胞培养基中的浓度为1~10 mmol/L；
所述的半胱氨酸在细胞培养基中的浓度为1~10 mmol/L；
所述的细胞包括浮游植物或原生动物细胞。
2.根据权利要求1所述的洗脱细胞表面吸附纳米颗粒的方法，其特征在于，步骤（2）中，调节pH值为4~7。
3.根据权利要求1所述的洗脱细胞表面吸附纳米颗粒的方法，其特征在于，步骤（3）中，离心条件为1000~4500 rpm，时间为5~30 min。
4.根据权利要求1所述的洗脱细胞表面吸附纳米颗粒的方法，其特征在于，步骤（4）中，静置的时间为5~30 min。
5.根据权利要求1所述的洗脱细胞表面吸附纳米颗粒的方法，其特征在于，步骤（4）重复操作至少1次。
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