CN113913507A - Ccl3蛋白作为评估非酒精性脂肪性肝病炎症水平及疾病进展的生物标志物的应用 - Google Patents

Ccl3蛋白作为评估非酒精性脂肪性肝病炎症水平及疾病进展的生物标志物的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了CCL3蛋白作为评估非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）炎症水平及疾病进展的生物标志物的应用。本发明将CCL3应用于制备NAFLD生物标志物；本发明还将CCL3蛋白应用于制备评估NAFLD的炎症水平检测试剂盒，其试剂盒用于检测血浆中CCL3的蛋白水平，可反映NAFLD疾病严重程度与进展。本发明首次通过实验证明，NAFLD患者和小鼠的肝脏和外周血中CCL3蛋白表达水平显著上调，且与炎症水平与肝损伤程度呈正相关。血浆中CCL3蛋白水平升高是NAFLD进展的标志，可能反映持续的炎症状态与肝损伤程度，可作为一种指示NAFLD发展的血浆标志物，具有重要的临床应用价值。

Description

CCL3蛋白作为评估非酒精性脂肪性肝病炎症水平及疾病进展 的生物标志物的应用
技术领域
本发明涉及巨噬细胞炎性蛋白3（C-C motif chemokine ligand 3, CCL3）作为评估非酒精性脂肪性肝病炎症水平及疾病进展的生物标志物的应用。
背景技术
随着肥胖和代谢综合征的不断增长，非酒精性脂肪性肝病（Non-alcoholic fattyliver disease, NAFLD）已成为全球最重要的公共健康问题。近十年来，我国NAFLD的患病率大幅增长，高达26%-45%，已跃居我国慢性肝病之首。非酒精性脂肪性肝病疾病谱包括非酒精性肝脂肪变（Non-alcoholic hepatic steatosis, NAS）、非酒精性脂肪性肝炎（Non-alcoholic steatohepatitis, NASH）、肝硬化和肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）。其中，NASH是NAFLD的关键节点，在未来10-15年内进展为肝硬化的发生率达15-25%。目前非酒精性脂肪性肝病的诊断金标准为肝活检，患者痛苦、费用昂贵。因此，寻找新的诊断靶点以预测非酒精性脂肪性肝病发生及其发展是非常有必要的。
炎症难控性是NAFLD进展的根本原因，作为炎症调控的核心细胞——肝脏巨噬细胞，其积累和炎性极化是NAFLD进展的关键标志。巨噬细胞炎性蛋白 3（C-C motifchemokine ligand 3, CCL3）对巨噬细胞具有重要趋化作用。在巨噬细胞中，CCL3由细菌脂多糖（LPS）、肿瘤坏死因子（TNF）α 或病毒感染诱导表达，进而对巨噬细胞发挥趋化作用导致其定向迁移。同时，CCL3可活化巨噬细胞，引起靶细胞脱颗粒，释放组胺、白三烯等炎症介质，诱导炎症反应。目前国内外尚无专利、文献中发现NAFLD病人外周血和肝组织中CCL3高表达，没有涉及CCL3蛋白与非酒精性脂肪性肝病炎症的关系，因此将CCL3蛋白做为生物标志物用于评估非酒精性脂肪性肝病炎症水，预测疾病严重程度具有重要研究价值。
发明内容
本发明首次通过实验证明，NAFLD患者和小鼠的肝脏和外周血中CCL3蛋白表达水平显著上调，且与炎症水平与肝损伤程度呈正相关。CCL3是预测NAFLD炎症水平与疾病严重程度的高特异性和灵敏性生物标志物。
本发明因此提供一种用于确定受试者非酒精性脂肪性肝病炎症水平与疾病严重程度的方法，包括
a)提供获自疑似或确认患有非酒精性脂肪性肝病的受试者的生物样品；
b)分析生物样品中CCL3表达和/或CCL3蛋白的水平；
c)将该CCL3表达和/或CCL3蛋白的量与基线值进行比较，其中所述基线值指示在未患有非酒精性脂肪性肝病的受试者中CCL3表达和/或CCL3蛋白的量；
其中，与基线值相比，统计学显著升高的CCL3表达和/或CCL3蛋白的量指示非酒精性脂肪性肝病肝内炎症水平高，与疾病严重程度与进展密切相关。
本发明的进一步设置是：分析步骤包括：分析生物样品中CCL3表达的核酸序列。
本发明的进一步设置是：核酸可以选自CCL3核糖核酸(RNA)或其片段和互补脱氧核糖核酸(cDNA)或片段。
本发明的进一步设置是：分析步骤包括分析生物样品中的CCL3蛋白或其片段。
本发明的进一步设置是：生物样品选自血液、血清、血浆、肝脏或脂肪组织样品。
本发明的进一步设置是：分析步骤包括：选自Northern印迹分析、聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、基于TaqMan的检测、直接测序、动态等位基因特异性杂交、引物延伸试验、寡核苷酸连接酶试验、温度梯度凝胶电泳(TGGE)、变性高效液相色谱、高分辨率熔解分析、DNA错配-结合蛋白试验、毛细管电泳、Southern印迹、免疫试验、免疫组织化学、ELISA、流式细胞术、Western印迹、HPLC和质谱的技术。
本发明还提供用于确定受试者非酒精性脂肪性肝病炎症水平与疾病严重程度的试剂盒，该试剂盒包括
a)至少一个能够检测CCL3表达和/或CCL3蛋白存在的探针；
b)使用探针分析来自患者的生物样品中CCL3表达和/或CCL3蛋白存在的说明书。
本发明的进一步设置是：探针选自：与CCL3表达的核苷酸序列的区域特异性杂交的寡核苷酸、或能够结合CCL3蛋白或其片段的结合分子。
本发明的进一步设置是：结合分子是抗体或其片段。
下面结合附图对本发明作进一步描述。
附图说明
图1. NAFLD患者外周血中CCL3水平示意图；
图2. NAFLD患者外周血中CCL3水平与BMI指数、AST和ALT水平的相关性分析示意图；
图3. NAFLD患者外周血中TNFa、IL-6和MCP-1水平，及CCL3水平与三者的相关性分析示意图；
图4. NAFLD患者肝脏和肝癌癌旁正常组织中CCL3蛋白表达水平示意图；
图5. 血浆CCL3蛋白水平与NAFLD病理严重程度相关性分析示意图；
图6. CCL3基因敲除小鼠及NAFLD小鼠模型构建示意图；
图7. NAFLD小鼠肝脏组织及肝细胞、巨噬细胞中CCL3基因表达水平示意图；
图8. NAFLD小鼠肝脏和血浆中CCL3蛋白表达水平示意图；
图9. CCL3基因敲除改善NAFLD小鼠肝脏组织学损伤示意图；
图10. CCL3基因敲除改善NAFLD小鼠炎症示意图；
图11. CCL3基因敲除对NAFLD小鼠糖脂代谢的影响示意图；
图12. NAFLD小鼠肝脏巨噬细胞上CCL3表达情况示意图。
具体实施方式
下面结合附图进一步说明本发明的实施例，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1. 患者临床标本收集及实验验证
本研究共纳入自2020-05至2021-09温州医科大学附属第一医院住院患者。45例受试者。其中健康对照组9例、NAFLD 36例（包括单纯性脂肪肝18例，NASH18例）。同时于病理室获取20例肝癌患者的癌旁正常组织的石蜡切片用于对照。本研究已通过温州医科大学附属第一医院伦理委员会批准（2020-zz-028）。
1.受试者入选标准
①NAFLD患者入组标准按照中华医学会肝病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组修订的《非酒精性脂肪性肝病防治指南》（2018更新版）诊断标准筛选；
②愿意充分了解试验的内容并按照研究医师的要求进行治疗、检查和随访；
③患者或其法定代理人签署知情同意书。
2.受试者排除标准
①合并有病毒性肝炎、酒精性肝炎、遗传性肝病、药物性肝炎、自身免疫性肝病等其他肝脏疾病；
②精神疾病史；
③既往或现患有肿瘤疾病者；
④活动性细菌，真菌或病毒感染（肝炎病毒感染除外），HIV感染者；
⑤伴有未控制的凝血障碍性疾病或结缔组织疾病等疾病；
⑥全身类固醇激素使用；
⑦并发肝性脑病、顽固性腹水、出血倾向、肝肾综合征等。
3.选择受试者的步骤
门诊或者住院部发现符合入组标准的患者，与患者充分沟通，取得患者同意后签署知情同意书。对照患者选择健康志愿者，取得同意后签署知情同意书。
4.样本收集
①收集病人全血（约5ml）：健康对照组9例（健康人全血将从本院体检中心的健康人血浆库中抽取，保证性别和年龄与后两组匹配）、NAFLD 36例（包括单纯性脂肪肝18例，NASH18例）；
②于病理室获取20例肝癌患者的癌旁正常组织的石蜡切片用于对照;收集入组NAFLD患者的肝穿刺组织石蜡切片36例。
5.实验内容：
1）ELISA试剂盒检测NAFLD患者外周血中CCL3水平。
采用酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测血浆中CCL3的表达水平，采用人CCL3 ELISA试剂盒检测血浆中CCL3表达水平，所有的实验步骤严格按照试剂盒说明书进行。
结果如图1所示，外周血中CCL3水平随着病人病情的严重程度逐渐增加。Control组血浆CCL3浓度为14.4 ± 2.1 pg/mL，NAFL组CCL3浓度为21.3 ± 3.0 pg/mL，NASH组CCL3浓度为40.6 ± 5.9 pg/mL（注：**表示P<0.01）。
2）分析外周血中CCL3水平与BMI指数、AST和ALT水平的相关性。
结果如图2所示，血浆中CCL3的浓度与受试者BMI指数，血浆AST和ALT水平呈正相关，说明CCL3水平能反映肥胖指数和肝损伤程度。
3）分析CCL3水平与炎症指标肿瘤坏死因子α（TNFα），白介素-6（IL-6）和单核细胞趋化蛋白（MCP-1）水平的相关性。
结果如图3所示，NAFLD患者外周血炎症指标浓度明显升高，CCL3浓度与炎症指标浓度之间存在正相关（注：*表示P<0.05，**表示P<0.01）。
4）免疫组化检测NAFLD患者肝脏与肝癌癌旁正常组织中CCL3蛋白表达水平。
结果如图4所示，肝脏中CCL3蛋白水平在NAFL和NASH病人中逐步升高，具有显著性差异（注：*表示P<0.05，**表示P<0.01）。
5) 分析血浆CCL3蛋白水平与NAFLD病理严重程度的相关性。
NAFLD患者病理结果包括肝脏气球样变(Ballooning)，肝脏脂肪变性(Steatosis)以及肝脏小叶炎症(Inflammation)三个要素，结果如图5所示，发现随着NAFLD病人病理结果的加剧，血浆CCL3浓度逐渐升高，说明血浆CCL3浓度与NAFLD肝脏严重程度密切相关。
实施例2. CCL3基因敲除小鼠及NAFLD小鼠模型构建及实验验证
C57BL/6野生型（WT）雄性小鼠，购自中国科学院上海生物科学研究所斯莱克动物中心，CCL3基因敲除（CCL3-/-）雄性小鼠，由美国杰克逊实验室（Jackson Lab）引进，之后在温州医科大学实验动物中心扩繁。
7周龄C57BL/6雄性小鼠及CCL3-/-雄性小鼠，均饲养于温州医科大学动物房SPF级负压层流架中。12/12小时光照/黑暗周期交替进行，室内温度22±2°C，湿度40%～60%，喂养期间提供充足的食物和饮水使其自由食饮。小鼠按照8只/笼随机分笼并标记，分为正常饮食组（Normal chow，NC 组，10%脂肪）、CL诱导NASH饮食组（CL组，60%脂肪，1.25%胆固醇，0.5%胆酸钠），详见图6。喂养普通饲料适应1周后，按实验分组分别更换为相应的普通饲料和CL饲料喂养16周。所有动物程序均按照温州医科大学《实验动物的护理和使用指南》中规定的标准进行。
（1）qPCR检测肝脏CCL3基因水平：
引物序列如表1所示。
表1
Figure DEST_PATH_IMAGE002A
结果如图7所示，在高胆固醇、高不饱和脂肪酸饲料（CL）诱导的NASH小鼠肝脏只CCL3基因的表达量显著升高。提取正常小鼠和NASH小鼠原代肝细胞和原代肝Kuppfer细胞发现，NASH小鼠在这两种细胞中CCL3的表达量均显著升高。尤其是在Kuppfer细胞中升高的更为显著（注：*表示P<0.05，**表示P<0.01）。
（2）ELISA试剂盒检测小鼠肝脏和血浆CCL3蛋白水平
使用ELISA技术检测NASH小鼠肝脏和血浆中CCL3的蛋白水平发现，如图8所示，NASH小鼠肝脏和血浆中CCL3的浓度均显著升高（注：*表示P<0.05，**表示P<0.01）。
（3）H&E染色观察NAFLD小鼠肝脏组织学损伤情况
结果如图9所示，H&E染色发现CL饮食能够诱导小鼠成NASH疾病，肝脏中脂肪变性，气球样变及小叶炎症明显增加。然而敲除CCL3后能够显著降低NASH肝脏的表型，减少肝脏的脂肪堆积。
（4）检测NAFLD小鼠外周血转氨酶水平，血浆和肝脏中炎症因子mRNA水以反映炎症严重程度
结果如图10A所示：NASH小鼠血浆中转氨酶水平显著升高，而在CCL3敲除小鼠血浆转氨酶显著被下调；结果如图10B所示：血浆中TNFa、IL-6和MCP-1的水平在CCL3敲除后显著降低；结果如图10C所示：NASH小鼠肝脏炎症因子的基因表达在CCL3缺失时显著被下调。进一步分析血浆中CCL3浓度与炎症因子TNFa、IL-6和MCP-1水平的相关性，结果如图10D所示，血浆中CCL3浓度与TNFa、IL-6和MCP-1水平存在显著正相关（注：#表示P<0.05，##表示P<0.01）。
（4）检测NAFLD小鼠脂质代谢情况
结果如图11A表示的是葡萄糖耐受实验结果，CCL3敲除后的小鼠具有更好的糖耐受。结果如图11B则显示CCL3缺失能够显著减少NASH小鼠肝脏甘油三酯（TG），总胆固醇(TC)以及游离脂肪酸(NEFA)的的含量。原因是如图11C所示：CCL3敲除能增加甘油三酯和脂肪酸氧化分解的相关基因Ppara，Cpt-1α,Pgc-1α和Lcad的表达（注：#表示P<0.05，##表示P<0.01）。
（5）流式细胞术（FACS）测NAFLD肝脏中巨噬细胞上CCL3表达情况
流式抗体染色
将肝脏细胞悬液用Fc Block封闭30min后根据下表进行抗体孵育，2% FBS-PBS 清洗并重悬后上机检测，如表2所示。
表2
Figure DEST_PATH_IMAGE004
FACS数据结果分析
流式细胞分选方法：利用PI (-)（Propidium iodide）燃料去除死细胞→CD45抗体孵育选取CD45(+)细胞→Dump （NK1.1，CD3，CD19和TER119）联合抗体孵育后选取Dump(-)细胞群（排除外周血单核细胞）→ Gr1（Ly-6G/Ly-6C）抗体阴性去除中性粒系细胞（Gr1-）→F4/80阳性抗体标记成熟总巨噬细胞（F4/80+）→ CD11b阳性指示髓系巨噬细胞→ CD11c标记M1型巨噬细胞，CD206标记M2型巨噬细胞→CD11c阳性，CD206阴性指示纯M1巨噬细胞；CD11c阴性，CD206阳性指示纯M2巨噬细胞。
分析结果如图12所示，在NASH条件下，F4/80(+)CCL3(+)巨噬细胞的数目显著增加，CD11c(+)CD206(-)CCL3(+) M1巨噬细胞和CD11c(-)CD206(+)CCL3(+) M2巨噬细胞的数目也显著增加。但是CD11c(-)CD206(+)CCL3(+) M2巨噬细胞所占总F4/80+CCL3(+)巨噬细胞的比例极低，所以CCL3+巨噬细胞的增加主要是来源于CD11c(+)CD206(-)CCL3(+) M1巨噬细胞（注：*表示P<0.05，**表示P<0.01）。
以上实施例，只是本发明优选地具体实施例，本领域技术人员在本发明技术方案范围内进行的通常变化和替换都包含在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.用于检测非酒精性脂肪性肝病生物标志物CCL3的表达和/或蛋白水平的试剂在制备用于确定受试者非酒精性脂肪性肝病炎症水平与疾病严重程度的试剂盒中的用途，包括
a)提供获自疑似或确认患有非酒精性脂肪性肝病的受试者的生物样品；
b)分析生物样品中CCL3表达和/或CCL3蛋白的水平；
c)将该CCL3表达和/或CCL3蛋白的量与基线值进行比较，其中所述基线值指示在未患有非酒精性脂肪性肝病的受试者中CCL3表达和/或CCL3蛋白的量；
其中，与基线值相比，统计学显著升高的CCL3表达和/或CCL3蛋白的量指示非酒精性脂肪性肝病肝内炎症水平高，与疾病严重程度与进展密切相关。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：分析步骤包括分析生物样品中CCL3表达的核酸序列。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述核酸选自CCL3核糖核酸(RNA)或其片段和互补的脱氧核糖核酸(cDNA)或其片段。
4.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：分析步骤包括分析生物样品中的CCL3蛋白或其片段。
5.根据权利要求1或2或3所述的用途，其特征在于：生物样品选自血液、血清、血浆、肝脏或脂肪组织样品。
6.根据权利要求1或2或3所述的用途，其特征在于：分析步骤包括选自Northern印迹分析、聚合酶链式反应(PCR)、基于TaqMan的检测、直接测序、动态等位基因特异性杂交、引物延伸试验、寡核苷酸连接酶试验、温度梯度凝胶电泳(TGGE)、高分辨率熔解分析、DNA错配-结合蛋白试验、毛细管电泳、Southern印迹、免疫试验、流式细胞术、Western印迹、HPLC和质谱的技术。
7.根据权利要求1或2或3所述的用途，其特征在于：分析步骤包括逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)。
8.根据权利要求1或2或3所述的用途，其特征在于：分析步骤包括变性高效液相色谱。
9.根据权利要求1或2或3所述的用途，其特征在于：分析步骤包括免疫组织化学。
10.根据权利要求1或2或3所述的用途，其特征在于：分析步骤包括ELISA。
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