CN107952083A - 脂代谢相关分子urg4或urgcp及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物制药领域，涉及脂代谢相关分子URG4或URGCP。本发明的脂代谢相关分子URG4或URGCP为乙肝病毒X蛋白HBx上调表达的分子，主要通过调控细胞周期、促增殖、抗凋亡在多种类型肿瘤的发生、进展及转移中发挥重要作用。本发明通过构建URG4基因转座子敲除小鼠，以及60％高脂饮食诱导脂代谢紊乱及非酒精性脂肪肝动物模型，证实URG4参与调控脂代谢，其表达下调可导致脂代谢异常及肝脏脂肪变、非酒精性脂肪性肝病的发生，本发明的URG4/URGCP分子可作为与非酒精性脂肪性肝病的生物标志物，进一步用于制备判断肝脏脂肪变、非酒精性脂肪性肝病的发生发展及其防治的制剂中。

Description

脂代谢相关分子URG4或URGCP及其应用

技术领域

本发明属于生物制药领域，涉及脂代谢相关分子URG4或URGCP，，更具体地，涉及脂代谢相关分子URG4或URGCP作为与非酒精性脂肪性肝病的生物标志物及所述生物标志物在制备判断肝脏脂肪变、非酒精性脂肪性肝病的发生发展及其防治的制剂中的用途。

背景技术

研究显示，非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指除外酒精和其他明确的损肝因素所致的肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征，与胰岛素抵抗和遗传易感性密切相关的获得性代谢应激性肝损伤，包括单纯性脂肪肝(SFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及其相关肝硬化。随着肥胖及其相关代谢综合征全球化的流行趋势，非酒精性脂肪性肝病现已成为欧美等发达国家和我国富裕地区慢性肝病的重要病因，普通成人NAFLD患病率10％～30％，其中10％～20％为NASH，后者10年内肝硬化发生率高达25％。

有研究报道，非酒精性脂肪性肝病除可直接导致失代偿期肝硬化、肝细胞癌和移植肝复发外，还可影响其他慢性肝病的进展，并参与2型糖尿病和动脉粥样硬化的发病。代谢综合征相关恶性肿瘤、动脉硬化性心脑血管疾病以及肝硬化为影响非酒精性脂肪性肝病患者生活质量和预期寿命的重要因素。为此，非酒精性脂肪性肝病是当代医学领域的新的挑战，据统计，近期内非酒精性脂肪性肝病对人类健康的危害仍将不断增加。

据报道，非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)已成为临床最常见慢性肝病之一，严重危害国民健康，其作为代谢综合征的一部分，目前已成为国内外研究热点。研究表明血脂异常、胰岛素抵抗、氧化应激、脂质过氧化反应等和NAFLD相关，脂肪细胞因子和炎性因子如IL-6、IL-8、IL-10、PAI-1、TNF-α、瘦素和脂联素等的分泌异常参与了NAFLD的发病。还有研究显示Hedgehog通路与NAFLD相关，自噬可逆转脂质代谢紊乱，微生物菌群失调加剧肝脏脂肪变性和NAFLD的治疗难度；其中，miRNA-10b、Fbxw7-SREBP-1轴可能在NAFLD发生发展过程中发挥重要作用；核染色质重塑的表观遗传机制如DNA甲基化、组蛋白转录后的修饰也被认为起较重要作用，诸多的上述研究进展，但NAFLD的发病机制仍未完全阐明，新的脂代谢相关分子有待进一步发现，NAFLD的防治也急需新靶标、新策略。

研究公开了有关上调表达基因-4(Upregulated gene-4，URG4)，也称为URGCP(Upregulator of cell proliferation)，是利用消减杂交和差异PCR技术(RACE)获得的新基因(GenBank：NM_017920)，定位在人类7号染色体，全长3607bp，编码104KD的蛋白，与乙肝病毒X蛋白HBx密切相关；蛋白质综合信息库分析(SWISS PROT)表明，此蛋白具有一个跨膜螺旋(Transmembrane helices：336-353)，三个核内定位信号肽(Nuclear localizationsignals：PYRGKRN 380，PRPRDKR 821，PRDKRQL 823)，一个ATP/GTP结合区(ATP/GTPbinding site：690-697GVPGTGKS)，和caspase修复成员6(caspase recruitment domainfamily 6)，在88-461氨基酸之间有34％同源；URG4基因主要表达于胞浆中，在细胞培养和软琼脂中URG4可以促进细胞增殖、生长、转移，在裸鼠体内URG4能加速肿瘤发展，故其为癌基因；有研究发现在肝细胞癌、胃癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、白血病等多种肿瘤中都存在URG4的扩增和过表达现象，这与肿瘤的发生、侵袭、转移、复发、预后和耐药密切相关。但迄今，尚无见URG4在脂代谢及脂肪肝中的作用和机制的研究报道。

转座子是生物界普遍存在的一种核外基因组，因其具有插入、跳出基因组并在基因组间转移的特性，成为推动生物遗传变异和进化的重要因素。利用改造后的转座子进行遗传操作，也成为近年来遗传分析和基因工程的重要手段。相比传统的基于重组的基因敲除操作，转座敲除的灵活性更大，适用基因区域更广。

因此，本申请的发明人基于现有技术的研究基础，拟提供脂代谢相关分子URG4及其应用，具体涉及(1)揭示URG4/URGCP分子的能，为非酒精性脂肪肝NAFLD发生提出新机制；(2)提供防治非酒精性脂肪性肝病的新靶标、新策略。

发明内容

本发明的目的是提供脂代谢相关分子URG4或URGCP的新的用途，更具体地，涉及脂代谢相关分子URG4或URGCP，作为与非酒精性脂肪性肝病的生物标志物及所述生物标志物在制备判断肝脏脂肪变、非酒精性脂肪性肝病的发生发展及其防治的制剂中的用途。

本发明，将提供URG4/URGCP分子的新的功能，为非酒精性脂肪肝NAFLD发生提供新的机制；进一步，提供防治非酒精性脂肪性肝病的新靶标、新策略，尤其涉及脂代谢相关分子URG4作为与非酒精性脂肪性肝病的生物标志物及所述生物标志物在制备判断肝脏脂肪变、非酒精性脂肪性肝病的发生发展及其防治的制剂中的用途。

本发明进行了动物实验，利用piggyBac转座子随机插入小鼠基因组，构建基于转座子打靶的转座敲除小鼠模型，经过筛选，获得了插入URG4基因第一内含子的转座敲除小鼠，经组织定量PCR验证，URG4表达被抑制；实验结果显示，URG4敲除小鼠肝组织病理切片(HE染色)显示，正常饮食组，WT肝组织无明显脂肪变性，而URG4敲除的HE和HO小鼠肝脏有轻中度脂滴沉积；高脂饲养后，WT小鼠仅出现轻度脂肪变，而URG4敲除鼠却发生严重脂肪变，表明URG4对脂代谢紊乱和肝脂肪变发挥保护因素的作用，其表达下调或缺失后将可诱发重度肝脂肪变；高脂饲料喂养期间监测体重变化结果显示，URG4敲除鼠较野生型小鼠的体重明显增加，小鼠体型明显肥胖；URG4敲除后，血清总胆固醇、总甘油三酯、低密度脂蛋白以及转氨酶均明显增高，高密度脂蛋白则下降，表明诱发脂代谢紊乱；URG4敲除鼠存在胰岛素抵抗、高胰岛素血症，糖耐量减低等代谢综合征的特征；URG4敲除鼠肝组织内脂肪合成和分解代谢相关酶和分子以及炎症因子均明显高于WT小鼠，表明URG4参与调控和介导肝脏炎症和脂代谢紊乱。

本发明通过构建URG4基因转座子敲除小鼠，以及60％高脂饮食诱导脂代谢紊乱及非酒精性脂肪肝动物模型，证实URG4参与调控脂代谢，为脂代谢相关分子，其表达下调(突变或缺失等)可导致脂代谢异常及肝脏脂肪变、非酒精性脂肪性肝病的发生，URG4/URGCP分子可作为防治NAFLD及胰岛素抵抗、代谢综合征的新的靶标，以及作为与非酒精性脂肪性肝病的生物标志物，进一步用于制备判断肝脏脂肪变、非酒精性脂肪性肝病的发生发展及其防治的制剂中。

附图说明：

图1：URG4转座敲除小鼠模型构建示意图。

图2：URG4基因敲除鼠高脂饮食期间体重变化。

图3：URG4基因敲除小鼠血生化指标变化。

图4：URG4敲除鼠葡萄糖耐受试验(GTT)和胰岛素耐受实验(ITT)。

图5：URG4敲除鼠肝组织脂代谢相关分子转录水平变化。

图6：URG4敲除鼠肝组织炎症因子转录水平变化。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1动物实验

(一)构建基于转座子打靶的URG4基因敲除小鼠模型，给予高脂饮食处理利用内含红色荧光蛋白基因RFP的piggyBac转座子(PB转座子)随机插入小鼠基因组，构建基于转座子打靶的转座敲除小鼠模型；经过筛选，获得插入URG4基因第一内含子的转座敲除小鼠，转座敲除鼠在紫外光照下发出红色荧光，未转座鼠呈现灰色；经组织定量PCR验证，比野生型(WT)小鼠，杂合敲除(HE)和纯和敲除(HO)小鼠的URG4基因表达被显著抑制；处理组为60％高脂饮食(High Fat Diet，HFD)1个月、2个月、3个月，对照组为正常普通饮食(Chow Diet)；

(二)取URG4敲除小鼠肝组织，固定后石蜡包埋，制作病理切片，通过HE染色，在光镜下观察肝脂肪变性和炎症活动情况；并通过油红O染色观察细胞内脂滴情况并计算脂变率；

(三)采用CLAMS系统监测小鼠饮食及代谢相关的各项指标，包括水和食物消耗量、氧气/二氧化碳消耗量、固体和液体排泄物质量、热量消耗等；每周称体重一次，并观察各组小鼠的食欲行为、粪便、毛发等情况，处理小鼠后称量体重、肝脏湿重；通过全自动生化分析仪检测血清中脂质代谢相关指标，包括谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)等；

(四)通过检测脂质代谢相关分子/脂肪细胞因子(adipokines/adipocytokines)证实URG4在转座敲除小鼠脂质代谢中的作用：

用Real-time PCR和Western blot检测肝组织内参与酮体产生和脂肪酸氧化分解的关键分子(HMGCS2，CPT1a，ACADVL，ACSL1，ACO，L-FABP)的转录和表达水平；

采用Real-time PCR和Western blot检测肝脏组织中脂肪合成代谢相关分子(PPARγ、SREBP-1a、SREBP-1c、SREBP-2、AMPK、FAS、CPT-I、ACC、pACC、丙二酸单酰CoA和HMGCR mRNA)的转录和表达水平；

(五)通过检测胰岛素及血糖耐受能力证实URG4在转座敲除小鼠脂质代谢中的作用：

在正常饮食及高脂饮食(HFD)条件下，GTT试验证实URG4在胰岛素抵抗中的作用，小鼠饥饿16h处理后分别给予正常饮食及高脂饮食，并腹腔注射葡萄糖，每15-30分钟测量小鼠葡萄糖水平，共120min。注射剂量为1g葡萄糖/kg小鼠体重；

在正常饮食及高脂饮食条件下，ITT试验证实URG4在葡萄糖耐受中的作用：小鼠饥饿4-6h处理后分别给予正常饮食及高脂饮食，并腹腔注射胰岛素，每15-30min测量一次胰岛素水平，共120min。注射剂量为0.75U胰岛素/kg小鼠体重；

(六)制备小鼠肝组织匀浆，采用R&D公司的Proteome Profiler Mouse AdipokineArray Kit检测分析URG4敲除小鼠肝组织中脂肪因子表达水平；

实验结果显示：

(一)URG4敲除小鼠肝组织病理切片(HE染色)显示，正常饮食组，WT肝组织无明显脂肪变性，而URG4敲除的HE和HO小鼠肝脏有轻中度脂滴沉积；高脂饲养后，WT小鼠仅出现轻度脂肪变，而URG4敲除鼠却发生严重脂肪变。说明URG4对脂代谢紊乱和肝脂肪变发挥保护因素的作用，其表达下调或缺失后将可诱发重度肝脂肪变；

(二)高脂饲料喂养期间监测体重变化，结果显示，相比较于野生型小鼠，URG4敲除鼠的体重明显增加，小鼠体型明显肥胖；

(三)小鼠血生化检测显示，URG4敲除后，血清总胆固醇、总甘油三酯、低密度脂蛋白以及转氨酶均明显增高，高密度脂蛋白则下降，说明诱发了脂代谢紊乱；

(四)葡萄糖耐受实验和胰岛素耐受实验结果显示，URG4敲除鼠存在胰岛素抵抗、高胰岛素血症，糖耐量减低，是代谢综合征的重要特征表现；

(五)荧光定量PCR结果显示，URG4敲除鼠肝组织内脂肪合成和分解代谢相关酶和分子以及炎症因子均明显高于WT小鼠，说明URG4参与调控和介导肝脏炎症和脂代谢紊乱。

本发明通过构建URG4基因转座子敲除小鼠，以及60％高脂饮食诱导脂代谢紊乱及非酒精性脂肪肝动物模型实验，证实URG4参与调控脂代谢，为新发现的脂代谢相关分子，其表达下调(突变或缺失等)可导致脂代谢异常及肝脏脂肪变、非酒精性脂肪性肝病的发生，为NAFLD的发生提供一种新的可能机制，URG4/URGCP分子可作为防治NAFLD及胰岛素抵抗、代谢综合征的新思路和靶标。

Claims (8)

1.脂代谢相关分子URG4或URGCP在用于制备肝脏脂肪变、非酒精性脂肪性肝病的生物标志物中的用途。

2.脂代谢相关分子URG4或URGCP在用于制备判断肝脏脂肪变、非酒精性脂肪性肝病的发生发展制剂中的用途。

3.脂代谢相关分子URG4或URGCP在用于制备防治肝脏脂肪变、非酒精性脂肪性肝病的制剂中的用途。

4.按权利要求1或2或3所述的用途，其特征在于，URG4表达下调或缺失后诱发重度肝脂肪变。

5.按权利要求1或2或3所述的用途，其特征在于，URG4敲除鼠的体重有变化，体重明显增加，体型明显肥胖。

6.按权利要求1或2或3所述的用途，其特征在于，URG4敲除后，实验鼠血清总胆固醇、总甘油三酯、低密度脂蛋白以及转氨酶均明显增高，高密度脂蛋白则下降，诱发脂代谢紊乱。

7.按权利要求1或2或3所述的用途，其特征在于，URG4敲除鼠存在代谢综合征的重要特征：胰岛素抵抗，高胰岛素血症，糖耐量减低。

8.按权利要求1或2或3所述的用途，其特征在于，URG4敲除鼠肝组织内脂肪合成和分解代谢相关酶和分子以及炎症因子均高，URG4参与调控和介导肝脏炎症和脂代谢紊乱。