CN103543265A - 一种检测乙肝肝癌前病变标志物elisa试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测乙肝肝癌前病变标志物ELISA试剂盒，以及该试剂盒在快速检测肝癌前病变的应用；该试剂盒是采用固相免疫试验ELISA来检测肝癌前病变抗体，在X基因阳性与阴性的HepG2细胞系中，通过抑制性cDNA差减杂交，克隆出异常表达的基因片段URG4、URG7、URG11、URG12、URG19和DRG2，并选择亲水端序列，固相合成人工多肽，作为包被抗原，制成检测乙肝肝癌前病变标志物的ELISA试剂盒；该试剂盒可有效对肝癌前病变进行检测，方法特异，操作简便，价格低廉，安全无创，可用简便的血清学方法检测。

Description

一种检测乙肝肝癌前病变标志物ELISA试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及一种ELISA试剂盒及应用，具体涉及一种检测乙肝肝癌前病变标志物ELISA试剂盒及应用，属于医药卫生领域。

背景技术

近年统计表明，我国原发性肝癌死亡率为20.40/10万，占恶性肿瘤死亡率的次位，约占全世界肝癌死亡人数的45%。尽管我国肝癌的一级预防已采取了包括乙肝疫苗在内的多项措施，但其效果尚需等待几十年。因此，肝癌的早期发现、早期诊断与早期治疗的二级预防尤为重要。

我国从1971年开展甲胎蛋白（AFP）自然人群普查，但效果不理想。八十年代根据流行病学调查结果，对肝癌高危人群进行划分，使肝癌普查转为对高危对象普查。我国对肝癌流行因素的研究表明：危险因素为HBV感染与肝癌家族史，国外的流行病学调查也提示HBV是肝细胞癌（HCC）的发生的对立致病危险因素。

“上海肝癌高危人群监测方案”对高危对象，每6个月作一次AFP与实时超声检查，结果说明可使无症状体征的小肝癌检出率提高34倍，由此汤钊猷在国际上最早系统提出“亚临床肝癌”的概念和理论，使肝癌的手术患者5年生存率达到61.3%。

但是“亚临床肝癌”仍然是小肝癌，只是尚未出现临床症状，而癌前病变是机体在多种致癌因素作用下，开始启动癌变过程，如何诊断这一阶段病变，尚未见报道。因而高危对象，癌前病变，临床小肝癌，是疾病发展的不同过程。

AFP是第一个用于随访肝癌的肿瘤标志物，1956年首次被发现，1964年发现肝细胞癌患者血中可检得AFP，直至六、七十年代反复验证，AFP检测在全世界普及，成为诊断肝癌的重要标志物，由于AFP检测对肝癌诊断阳性率只有60%-80%，且AFP是肝肿瘤标志物，一旦AFP持续进行性升高，即为肝癌已形成，所以AFP不能作为肝癌前病变的诊断指标。

乙肝是肝癌的高危因素，其致癌机制主要定位在X基因上，其具有反式转录激活作用，能广泛激活病毒和细胞启动子的转录，因此可能干扰宿主细胞生化代谢，影响细胞基因的正常表达而诱发HCC。

早期肝癌病变检出并不是对高危人群防治的最终目的，肝癌是一种进行性发展的疾病，即使是早期发现，如无有效的治疗，患者仍难免因肿瘤的发展而死亡，因而早期防治，提高生存率才是目的。

由于AFP检测对肝癌诊断阳性率只有60~80%，且不能进行癌前病变诊断，使临床二级预防不能进行癌前阻断治疗研究。采用对肝癌高危对象进行肝癌前相关抗体、AFP同时检测，进一步分析两者对早期肝癌诊断，尤其是肝癌前病变的诊断价值，试图通过分析，使AFP的小肝癌的早期发现，提前到癌前病变阶段，这样为寻求尽早阻断癌前病变提供时机。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测乙肝肝癌前病变标志物的ELISA试剂盒及应用，对高危病人血清用这种简单ELISA方法，可以在肝癌发生数年或数月前，可检测到一种或多种抗体的表达。一旦在慢性乙型肝炎患者中检测到多个抗体，尤其是URG11和URG19出现，提示患者可能在数月或数年后发生肝癌，因而密切加强随访与监测（包括影像与组织学），为更早期的干预提供了诊断依据；由于这种特异的ELISA方法，将可用于临床肝癌前抗体诊断，可使血清AFP早期肝癌的诊断提前到癌前病变。

为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案是：

一种检测乙肝肝癌前病变标志物的ELISA试剂盒，该试剂盒是采用固相免疫试验ELISA来检测肝癌前病变抗体，在X基因阳性与阴性的HepG2细胞系中，通过抑制性cDNA差减杂交，克隆出异常表达的基因片段URG4、URG7、URG11、URG12、URG19和DRG2，并选择亲水端序列，固相合成人工多肽，作为包被抗原，制成检测乙肝肝癌前病变标志物的ELISA试剂盒，URG4、URG7、URG11、URG12、URG19和DRG2的基因序列见序列表；

一种检测乙肝肝癌前病变标志物的ELISA试剂盒的建立方法，该建立方法包括下列步骤：

（一）建立HBX和CAT的HepG2系

   将HBX基因转染到HepG2中，对照组用氯霉素乙酰转移酶（CAT）转染到HepG2，建立

HepG2-X细胞和HepG2-CAT两个细胞系，培养，传代，观察其表达。首先提取HepG2-X和HepG2-CAT总RNA及mRNA, RT-PCR反转录建立cDAN文库，用抑制性cDAN差减杂交，cDAN探针的克隆及测序。有8个cDAN探针从HepG2-X细胞中克隆出，有2个基因片段从HepG2-CAT细胞克隆出。HepG2-X细胞克隆出的8个片段，在对照组不表达，反映这些基因高表达（up-regulated）与X基因有关；而对照组克隆出的2个基因片段，在HepG2-X细胞中没有克隆出，说明这些基因低表达（down-regulated）与X基因也有关。等量HepG2-X细胞和HepG2-CAT细胞于含有10%的胎牛血清中生长无差异；但在无血清培养液中，HepG2-X生长要明显快于HepG2-CAT细胞，在无血清培养液中，HBxAg可明显促进HepG2细胞的生长；

   （二）建立ELISAs检测方法

    我们从HepG2-X细胞和HepG2-CAT细胞系克隆出6个基因蛋白（URG4，URG7，URG11，URG12，URG19，DRG2）。ELISA检测每一个基因蛋白相对应的抗体，称之为肝癌前病变抗体。方法是采用固相组合成的人工多肽，序列选择跨越亲水区域。人工多肽由Thomas Jefferson University分子生活实验室合成，其序列如表1。多肽分别用载体蛋白钥孔戚血兰素（KLH， Sigma Chemical Co.,St,Louis,MO）偶联，配成一定浓度的人工多肽。

    建立一定方法的ELISA。分实验组与对照组，实验组包被用人工多肽，对照组用PBS（Phosphate Buffered Saline）。检测中还设立阳性对照与阴性对照，阳性对照是用专门的兔抗人工合成多肽血清，阴性血清是从公司购买。具体方法：首先将每个人工多肽（如表1）1μg加入50μlPBS，包被在96孔平皿板（Immunolon 4,Thermo Lab Systems, Franklin, MA）孔中，放在4℃冰箱孵化过夜，用PBS洗7次（用Nunc Immuno Wash120），然后用含10%小牛血清（FSC）PBS封闭，再用PBS洗3次。加入待检的血清50μl（用含小牛血清的PBS 1:10稀释）后放入4℃冰箱过夜。再用PBS洗7次。辣根过氧化酶（50μl/well, 用1:100PBS/FCS稀释，Cooper Biomedical,Malvern,PA）结合的羊抗人免疫球蛋白加入培养板中，在37℃ CO2培养箱中孵化1h，再用PBS洗7次，加入苯丙氨酸脱氨酶（OPD，Abbott Labs，North Chicago，IL）检测，在酶标仪上，450nm光波自动读数。

（三）特异性及放射免疫沉淀检测

    为检测建立的ELISA方法的特异性，我们在ELISA实验前将抗体阳性的血清与相关、或不相关的人工多肽混合在一起，然后加入预先包被的同样人工多肽的培养液中，即在实验前预先分别加入0、0.5、5、10、25μg作为对照，以观察混合不同浓度人工多肽的阳性血清标本与包被同样人工多肽的结合情况，来分析其特异性。特异性抗体检测结果显示（图1）：预前抗体阳性的血清可与不同量的同源人工多肽结合，但不与不相关的人工多肽结合。虽然数据表示的是抗URG4（图1A）和URG11（图1B），但是相同的数据在ELISA的URG7和URG12，以及URG19、DRG2中均可得到。由此证明我们建立的ELISA方法具有特异性（图1C）。

另外，将URG4，URG7，URG11，URG12，URG19，DRG2全长cDNA分别被亚克隆到pcDNA3。每个重组体在体外成线性转录，然后在兔网织红细胞裂解物中翻译（Promega, Madison, WI），用³⁵S蛋氨酸标记和³⁵S半胱氨酸（Amersham, Piscataway, NJ）标记结合用放射自显影SDS/PAGE检测。在放射免疫沉淀反应时，将先前用ELISA方法检测到阳性与阴性血清5μl与放射标记（5×10⁴计数/分钟）体外翻译蛋白一起放在37℃孵化1h，然后与2μl Sepharose 4B-Protien G beads（P HARMACIA, Piscataway, NJ）之余冰上15min，在网织红细胞裂解物抗体缓冲液（100mmol/L NaCl, 0.1 mol/L Tris-HCl(PH8.0),1%NP40）洗3次，然后用SDS/PAGE（12%胶）电泳，进行放射自显影。放射免疫沉淀反应结果显示在ELISAs中是阳性的标本，在免疫沉淀中也显示为阳性，反之，则为阴性。另外在没有人血清的情况下，Sepharose 4B-Protien G beads不结合任何体外放射蛋白，提示没有非特异性结合。

（四）慢性HBV感染患者乙肝相关的肝癌前抗体检测的应用

患者与分组：所有检测的血清标本皆来自于中国深圳的居民与美国东岸的韩国移民，共730人。其中深圳居民305人，韩国移民425人；男性496人，女性234人，年龄20~65岁。

    分为6组（表2）。组1，HBsAg阴性（或anti-HBs阳性）、丙氨酸转氨酶（ALT）正常者，共416例（韩国316例，深圳100例）；组2，HBsAg阳性、ALT正常者（即乙肝病毒携带者），共52例（韩国21例，深圳31例）；组3，HBsAg阳性、ALT>40U/L者（即慢性乙型肝炎），共139例（韩国40例，深圳99例）；组4，乙肝肝硬化者71例（韩国28例，深圳43例）；组5，药物肝炎或其它肝炎（排出HCV），共16例，皆是深圳居民；组6，为HCC患者（不包括HCV阳性），共36例（韩国20例，深圳16例）。还设有HCV所致HCC、其他肿瘤（胸部肿瘤、结肠肿瘤、头颈部肿瘤、前列腺肿瘤--）、希腊、冰岛血清（--）作为对照组。所有的诊断有血生化和CT、核共振（MRI）依据，这些病人在年龄、种族、性别方面分布是一致（P>0.05）。

在检测前所有的标本储存在-80℃，所有的标本按编号排列，按盲法，检测者不知道标本的有关信息。

统计学处理：采用SPSS 10.0软件进行统计学分析。对不同组6个肝癌前抗体检测，不同组肝癌前抗体数目的阳性率用X²检验，对不同数目抗体患者的存活时间均差，以及对肝癌组与肝硬化再生或不良结节组患者抗体数的均差进行方差检验，而对所检测到的6种不同的肝癌前抗体数目阳性率用X²检验。

应有结果：ELISA检测不同患者血清肝癌病变前标志物抗体情况。6组患者及对照组血清肝癌前6个抗体检测结果：在36例肝癌患者有29例（80%），71例肝硬化患者有46例（65%），139例慢性肝炎患者有62例（45%），检测到血清肝癌病变前标志物抗体阳性，而在416例正常人群与52例乙肝病毒携带者分别是62例、12例（15%,35%）。用卡方检验各组抗体阳性发生率，与HBsAg（-）组相比，乙肝病毒携带者组、其他肝炎、其他肿瘤对照皆无统计学意义，而乙型肝炎、肝硬化、肝癌组皆在统计学意义，且显著性也随肝炎-肝硬化-肝癌变化而升高。冰岛是全球HBV感染率最低的国家，检测结果也说明这点。HBsAg（-）组中，有20例（15+5）出现2个以上抗体阳性，此可能存在交叉反应。

     比较冰岛与中国、韩国的正常人群，冰岛正常人能检测到HCC相关抗体为0.64%（1/156），而中国与韩国分别是12%（12/100，P=0.001）与16%（50/316，P=0.0000）。比较欧洲与亚洲，HBV携带者、乙肝肝炎患者、希腊人检测到抗体的有7%（4/56），而在中国和韩国为40%（74/191，P=0.000）；但是，乙肝肝硬化与HCC患者检测出抗体阳性率韩国是79%（38/48），中国是63%（37/59），希腊是57%（13/23），没有统计学意义。由此可见，抗体阳性率，在低危人群中，差异可能与HBV感染率以及垂直感染有关，但在高危患者中，与不同的国家，地区，人种无差异。

所述的试剂盒在检测乙肝肝癌前病变标志物的应用。

本发明相对于现有技术的有益效果是：在慢性乙型肝炎自然史，虽然多出现于肝硬化后期，但肝癌可发生慢性乙型肝炎自然史的任何阶段，而AFP的持续升高，即为肝癌已形成，所以AFP不能作为肝癌前病变的诊断指标。对高危病人血清用这种简单ELISA方法，可以在肝癌发生数年或数月前，可检测到一种或多种抗体的表达。一旦在慢性乙型肝炎患者中检测到多个抗体，尤其是URG11和URG19出现，提示患者可能在数月或数年后发生肝癌，因而密切加强随访与监测（包括影像与组织学），为更早期的干预提供了诊断依据。

由于这种特异的ELISA方法，将可用于临床肝癌前抗体诊断，可使血清AFP早期肝癌的诊断提前到癌前病变。

附图说明

图1为 ELISAs的特异性与免疫沉淀反应图，图中，横坐标是指4个不同的病人，1A，是抗URG4检测；1B，是抗URG11的检测；每例加入0、0.5、5、10、25ug，以及对照25ug人工多肽，纵坐标是所见酶标仪上450nm光波的读数。1C，是³⁵S标记在体外翻译URG7（Mr：10,700；泳道1和2）、URG（Mr：10,400；泳道3和4）、URG12（Mr：14,300；泳道5和6）、DRG2（Mr：13,300；泳道7和8）、URG11（Mr：68,000；泳道9和10）、URG19（Mr：170，000；泳道11和12）。放射免疫沉淀法与ELISAs检测的结果是一致，即人血清阳性标本（泳道1、3、5、7、9、11），和人血清阴性标本（泳道2、4、6、8、10、12）。A，吸光度。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。

实施例１

A    patient #10

Months        0      2      5      7      16      23      50    expired

HCC Dx                                                     *     mo.56

Tx                                                        TACE

Anti-DRG2     -      -      -      -       -       -       - 

Anti-URG4     -      -      +      +       +       +       + 

Anti-URG7     -      -      -      -       +       +       +

Anti-URG11    -      -      +      +       +       +       +

Anti-URG12    -      -      -      -       -       -       +

Anti-URG19    -      -      +      +       +       +       +

AFP>400ug/ml  -      -      -      -       -       -       +

B     patient #26

Months        0      1      4      5      6     7    9     12    expired

HCC Dx               *                                             mo.18

Tx                  PCEI

Anti-DRG2     -      -      -      -       -    -     +     - 

Anti-URG4     -      -      -      -       -    -     -     -

Anti-URG7     -      +      +      +       +    -     -     +

Anti-URG11    +      +      +      -       -    -     -     -

Anti-URG12    -      -      -      -       -    -     -     -

Anti-URG19    +      +      -      -       -    -     -     -

AFP>100ug/ml  +      +      -      -       -    -     -     -

C  patient #28

Months        0    1     2    4     6    10    14    26   30       expired

HCC Dx        *                           *           *              mo.36

Tx            PCEI                       RITA       RITA

Anti-DRG2     -     -    +     +     +     +    -     -    -     

Anti-URG4     -     -    -     -     -     -    -     -    -     

Anti-URG7     -     -    -     -     -     -    -     -    -    

Anti-URG11    +     +    -      +    -     +    -     +    -    

Anti-URG12    +     +    +      +    +     +    +     +    +     

Anti-URG19    +     -    -      -    +     +    -     +    -

AFP>400ug/ml  +     +    -      -    -     +    -     +    -   

观察期间，HBV患者发展成HCC典型病例。* 指的是及时诊断为HCC，请看一下每个病人的附加信息结果部分。（DX：指诊断，TA：指治疗，TACE：指经动脉化学栓塞，PCEI：经皮酒精注射，RITA：射频消融术）

下面通过临床观察试验，进一步阐述发明的有益效果：

1．临床资料

我们对 305 例慢性HBV 感染者中部分病例进行了3～5 年的临床观察，其中发现有28

例发生肝癌，25 例发生乙肝再生或发育不良结节，没有发生肝癌。我们将前者归为乙肝肝

癌组，后者归为乙肝肝硬化组。这2 组患者临床特征，过程相似，年龄、性别等没有统计学

差异（P>0.1）

2．方法

2．1 检测方法：ELASA 方法检测6 个肝癌前抗体

2．2统计学处理：统计分析 对于计量资料，两个或多个独立组间的比较采用Mann-Whitney

和Kruskal-Wallis ANOVA 检验，对于计数资料，采用卡方检验，由我院DME 专业人员采用

SPSSSAS 6.12 版统计分析软件进行统计学处理（检验水平α 取0.05）。

2．3结果

53 例中发生肝癌的28 例与未发生肝癌的肝硬化25 例，两组平均抗体数（6 个抗体，可单一阳性，也可同时2 个以上抗体阳性）两组有差异（P=0.0148）。肝癌组在肝癌诊断前AFP>20μg/L 只有9 例（32%），而抗体阳性患者为26 例（92%），两种方法比较P=0.0000。28 例HCC 中（其中26 例抗体是阳性），在确诊肝癌前连续血清观察检测显示：有16/28（57%）例发生肝癌的患者，可检测到4 个以上肝癌前抗体阳性，19 例（57%，有2 例肝癌发生时未检测到肝癌前抗体，7 例在肝癌前没有保存血清，到发生肝癌时才第一次检测肝癌前抗体）可检测到1 个以上的抗体阳性，距确诊肝癌前平均月份为23.2（2～51）个月，即抗体阳性可在HCC 发生前2 年出现。

在所检测的6 个抗体中，抗URG11 和抗URG19 发生率最高，有16 例这2 个抗体皆是阳性（与其它4 个抗体2 个或以上同时阳性是8 例，比较P=0.0308）。在首次检测到的抗体中，抗URG11 是17 例，抗URG19 是15 例；而抗URG4 只有9 例患者，抗URG7 有8 例患者，抗URG12 有5 例，抗DRG2 有4 例，URG11 出现率与URG4 比较P=0.0321，有统计学意义。

 

序列表 SEQUENCE  LISTING

<110> 深圳市中医院

<120> 一种检测乙肝肝癌前病变标志物ELISA试剂盒及其应用

<140> 201110286614.7

<141> 2011-09-23

<160> 6

<210> 1

<211> 3606

<212> DNA

<213> 未知

<400> 1

1 cctcgctgcg ctcatggcgt cgcccgggca ttcagatttg ggagaagtag ccccagaaat

       61 aaaagcatca gagagacgaa cagctgtggc cattgcagat ttggaatgga gagaaatgga

      121 aggagatgat tgcgagttcc gttatggaga tggtacaaat gaggctcagg acaatgattt

      181 tccaacagtg gagagaagca ggcttcaaga aatgctgtca cttttgggcc tagagacgta

      241 ccaggtccag aaactcagcc tccaggactc tctgcagatc agttttgaca gtatgaagaa

      301 ctgggcccct caggttccca aagacttgcc ctggaatttc ctcaggaagt tgcaggccct

      361 caatgctgat gccaggaata ccactatggt gctggacgtg ctcccagacg ccaggcctgt

      421 ggagaaggag agccagatgg aagaggagat catctactgg gacccagctg atgaccttgc

      481 tgccgacatt tattcctttt ctgagctgcc cacccctgat acgccagtga accccttaga

      541 ccttctctgt gccctgctgc tctcctcaga cagtttcctg caacaagaaa tagcgttgaa

      601 aatggccctc tgccagtttg cactcccact cgtgttgcct gactcggaga accactacca

      661 tacatttctg ctgtgggcca tgcggggcat tgtgaggaca tggtggtccc agcccccaag

      721 gggcatgggg agcttccggg aagacagcgt ggtcttgtcc agggcgcccg ccttcgcctt

      781 cgtgcgcatg gacgtcagta gcaactccaa gtcccagctt ctcaacgccg tcctcagccc

      841 gggccacagg cagtgggact gcttctggca tcgggacctc aacttgggca ccaatgcccg

      901 ggagatttcg gatgggttgg tagaaatttc ctggtttttt cccagcggaa gggaggactt

      961 ggacattttc ccagaacctg tggcctttct gaacctgaga ggtgacatcg ggtctcactg

     1021 gctgcagttt aagctcttga cagaaatctc ctccgctgtg tttatattga ctgacaatat

     1081 cagtaagaag gaatacaaat tgctgtactc catgaaggag tcaaccacaa aatactactt

     1141 catcctgagt ccctaccgtg ggaagcgcaa cacaaacctg agatttctga ataagttaat

     1201 tcctgtgctg aaaatagacc actcacatgt cctggtaaag gtcagcagca ctgacagcga

     1261 cagcttcgtg aagaggatcc gggccatcgt tgggaatgtg ctgcgggcac cctgcaggcg

     1321 ggtatctgtg gaggacatgg cgcacgcagc ccgcaaactg ggcctaaagg tcgacgagga

     1381 ctgtgaggag tgtcagaaag cgaaagaccg gatggagagg attaccagga aaatcaaaga

     1441 ctcggatgcc tacagaaggg acgagctgag gctgcagggg gacccctgga gaaaggcagc

     1501 ccaagtggag aaggagttct gccagctcca gtgggccgtg gacccccctg agaagcacag

     1561 ggctgagctg aggcggcggc tgctagaact tcgaatgcag cagaacggcc atgattcctc

     1621 ctcgggggtg caggagttca tctcggggat cagcagcccc tccttgagtg agaagcagta

     1681 cttcctgagg tggatggagt ggggcctggc acgggtggcc cagccgcgac tgagacagcc

     1741 tccggagacg cttctcaccc tgagaccaaa gcacgggggc accacagacg tgggggagcc

     1801 gctctggcct gagcccctag gggtggaaca cttcttgcgg gagatgggac agttttatga

     1861 ggctgagagc tgtcttgtgg aggcagggag gctgccggca ggccagaggc gttttgccca

     1921 cttcccaggc ttggcctcgg agctgctgct gacagggctg cctctggagc taatcgatgg

     1981 gagcacgctg agcatgcccg tccgctgggt cacagggctc ctgaaggagc tgcacgtccg

     2041 actggagaga cggtcaaggc tggtggttct gtcaaccgtc ggggtgccag gcacgggcaa

     2101 gtccacactc ctcaacacca tgtttgggct gcggtttgcc acagggaaga gctgcggtcc

     2161 tcgaggggcc ttcatgcagc tcatcacagt ggctgagggc ttcagccagg acctgggctg

     2221 tgaccacatc ctggtgatag actccggggg cttgataggt ggggccttga cgtcagctgg

     2281 ggacagattt gagctggagg cttccttggc cactctgctc atgggactga gcaatgtcac

     2341 cgtgatcagt ctagctgaaa ccaaggacat tccagcagct attctgcatg catttctgag

     2401 gttagaaaaa acggggcaca tgcccaacta ccagtttgta taccagaacc ttcatgatgt

     2461 atctgttccc ggccctaggc ccagagacaa gagacagctc ctggatccac ctggtgacct

     2521 gagcagggct gcagcccaga tggagaaaca gggcgacggc ttccgggcac tggcaggcct

     2581 ggccttctgc gaccctgaga agcagcacat ctggcacatc ccaggcctgt ggcacggagc

     2641 acctcccatg gccgcagtga gcttggccta cagtgaagcc atatttgaat tgaagagatg

     2701 cctactcgaa aacatcagga acggcttgtc gaaccaaaac aaaaacatcc agcagctcat

     2761 tgagctggtg agacggctgt gagtgtgcag agaaacccag ttcaggtgta ggaggctgct

     2821 gtgggcagcc ctgtctgatg gggcacccgt gtggggctgt gctctggtgc ctgagaatgg

     2881 ctggtgccca atcgacatga gaagacgagc agaagacaga gggtttggag tctcctcaac

     2941 agtgttaaaa gaggaagtga cctcacagac cagctcagag atgttaccaa gaatatcaca

     3001 gcccccaggg tagggagaca agcagcagtt tgttctgtct cagctcctgt caaggatcct

     3061 gcggggtggg ccctctgtat agctgctctc tgtcactggc ccctggagtg ggagcagcgt

     3121 ccttagtcac tgcaggccca ggcgggcagg tggtcccagg acagaggtgg ggaagttgtc

     3181 ctgaggaagc agaagtaggc cttgctcccg cccaacccaa gggcctccag tggaccagca

     3241 ttcaagatgt gagtgcccgt ggtgtgcaag gcactcccat ggcaccgtat ttattgactg

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     3421 ttacatgtct gtccccccag actgtgagct ccttgagggc agggactgta cattctccag

     3481 ctctgtgtcc ccagggcctg gcacattgta gacgcttaat aaatgtctgt taaatgaaaa

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<212> DNA

<213> 未知

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1 cttaccgaca gacagacgct gggacccacg acgacagaag gcgccgatgg ccgcgcctgc

       61 tgagccctgc gcggggcagg gggtctggaa ccagacagag cctgaacctg ccgccaccag

      121 cctgctgagc ctgtgcttcc tgagaacagc aggggtctgg gtacccccca tgtacctctg

      181 ggtccttggt cccatctacc tcctcttcat ccaccaccat ggccggggct acctccggat

      241 gtccccactc ttcaaagcca agatggtagc tgccatccct gggagcctgg aaccaggcaa

      301 tgttcggggg aggcagggga caggctggaa cctggtgaag tcttaaagta gactcctcct

      361 atcggggtgt agaagggaat ctgttaatca aacagagcaa tattagaaag gctacagagg

      421 tcaactcagt ggaacatggt tctcccaaac agattttgta attccgaaaa tccacgcatg

      481 cgcaaacata cgcatacact cccatgttcc tggacagttt atagctacca taacctggca

      541 ttttccaaaa cataccatgt agactcttgg atacacaagg taattttagg gccacattag

      601 gatgaacctt ttaaaaggtt atgcatttat ttttatgttt ccccactagc tgtattatag

      661 gacaattttt atatgtgata tgtatttacc ttagtgtgtt aaataaacac tggcatttca

      721 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa

<210> 3

<211> 3076

<212> DNA

<213> 未知

<400> 3

1 ttcggctgtg ggagtggcat ctgcatcgct cccaatgtcc gctcctgcca ggatggagag

       61 caaggggcca cctgcccaga aacccatgga ccatgtgggg agtacggctg tgaccttacc

      121 tgcaaccatg gaggctgtca ggaggcggcc cgagtgtgcc ccgtgggctt ctcgatgacg

      181 gagacagctg ttggcatcag gtgtacagac attgacgaat gtgtaacctc ctcctgcgag

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      481 tgtcaccatt cctgccacaa caccgtgggc agcttcctat gcacatgccg acctggcttc

      541 aggctccgag ctgaccgcgt gtcctgtgaa gctttcccga aagccgtgct ggccccatct

      601 gccatcctgc aaccccggca acacccgtcc aagatgcttc tgttgcttcc tgaggccggc

      661 cggcctgccc tgtccccagg acatagccct ccttctgggg ctccagggcc cccagccgga

      721 gtcaggacca cccgcctgcc atctcccacc ccacgactac ccacatcctc cccttctgcc

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      841 aacctcagac ccccctcact ccttcagggg gaggtgatgg ggaccccttc ctcacccagg

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     1201 gtgtcctgca tctctcctga gtgtccttct ggcccctgtc agaccccccc acagacggat

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     1321 gtgttcagtg ggggtggtga cgagtgtacc acctgtgttt gccagaatgg ggaggtggag

     1381 tgctccttca tgccctgccc tgagctggcc tgcccccgag aagagtggcg gctgggccct

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     1741 atctgcctgc tgggctcagt ggcctgttcc cccgtggact gccccatcac ctgtacctac

     1801 cctttccacc ctgacgggga gtgctgcccc gtgtgccgag actgcaacta cgagggaagg

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<212> DNA

<213> 未知

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1 gccacaatgg tgcgcatgaa tgtcctggca gatgctctca agagtatcaa caatgccgaa

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<212> DNA

<213> 未知

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1 cccacgcgca gcggccggag atgcagcggg gcgccgcgct gtgcctgcga ctgtggctct

       61 gcctgggact cctggacggc ctggtgagtg actactccat gacccccccg accttgaaca

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      181 agcaccccct cgagtgggct tggccaggag ctcaggaggc gccagccacc ggagacaagg

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      361 agtacatcaa ggcacgcatc gagggcacca cggccgccag ctcctacgtg ttcgtgagag

      421 actttgagca gccattcatc aacaagcctg acacgctctt ggtcaacagg aaggacgcca

      481 tgtgggtgcc ctgtctggtg tccatccccg gcctcaatgt cacgctgcgc tcgcaaagct

      541 cggtgctgtg gccagacggg caggaggtgg tgtgggatga ccggcggggc atgctcgtgt

      601 ccacgccact gctgcacgat gccctgtacc tgcagtgcga gaccacctgg ggagaccagg

      661 acttcctttc caaccccttc ctggtgcaca tcacaggcaa cgagctctat gacatccagc

      721 tgttgcccag gaagtcgctg gagctgctgg taggggagaa gctggtcctc aactgcaccg

      781 tgtgggctga gtttaactca ggtgtcacct ttgactggga ctacccaggg aagcaggcag

      841 agcggggtaa gtgggtgccc gagcgacgct cccaacagac ccacacagaa ctctccagca

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     3421 tgagggcccc ggagctggcc actcccgcca tacgccacat catgctgaac tgctggtccg

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1 aggattcagc agcctccccc ttgagccccc tcgcttcccg acgttccgtt cccccctgcc

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     1321 aaaaaaacct gcccgggcgg ccgctcgagc

<110> 深圳市中医院

<120> 一种检测乙肝肝癌前病变标志物ELISA试剂盒及其应用

<140> 201110286614.7

<141> 2011-09-23

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      361 caatgctgat gccaggaata ccactatggt gctggacgtg ctcccagacg ccaggcctgt

      421 ggagaaggag agccagatgg aagaggagat catctactgg gacccagctg atgaccttgc

      481 tgccgacatt tattcctttt ctgagctgcc cacccctgat acgccagtga accccttaga

      541 ccttctctgt gccctgctgc tctcctcaga cagtttcctg caacaagaaa tagcgttgaa

      601 aatggccctc tgccagtttg cactcccact cgtgttgcct gactcggaga accactacca

      661 tacatttctg ctgtgggcca tgcggggcat tgtgaggaca tggtggtccc agcccccaag

      721 gggcatgggg agcttccggg aagacagcgt ggtcttgtcc agggcgcccg ccttcgcctt

      781 cgtgcgcatg gacgtcagta gcaactccaa gtcccagctt ctcaacgccg tcctcagccc

      841 gggccacagg cagtgggact gcttctggca tcgggacctc aacttgggca ccaatgcccg

      901 ggagatttcg gatgggttgg tagaaatttc ctggtttttt cccagcggaa gggaggactt

      961 ggacattttc ccagaacctg tggcctttct gaacctgaga ggtgacatcg ggtctcactg

     1021 gctgcagttt aagctcttga cagaaatctc ctccgctgtg tttatattga ctgacaatat

     1081 cagtaagaag gaatacaaat tgctgtactc catgaaggag tcaaccacaa aatactactt

     1141 catcctgagt ccctaccgtg ggaagcgcaa cacaaacctg agatttctga ataagttaat

     1201 tcctgtgctg aaaatagacc actcacatgt cctggtaaag gtcagcagca ctgacagcga

     1261 cagcttcgtg aagaggatcc gggccatcgt tgggaatgtg ctgcgggcac cctgcaggcg

     1321 ggtatctgtg gaggacatgg cgcacgcagc ccgcaaactg ggcctaaagg tcgacgagga

     1381 ctgtgaggag tgtcagaaag cgaaagaccg gatggagagg attaccagga aaatcaaaga

     1441 ctcggatgcc tacagaaggg acgagctgag gctgcagggg gacccctgga gaaaggcagc

     1501 ccaagtggag aaggagttct gccagctcca gtgggccgtg gacccccctg agaagcacag

     1561 ggctgagctg aggcggcggc tgctagaact tcgaatgcag cagaacggcc atgattcctc

     1621 ctcgggggtg caggagttca tctcggggat cagcagcccc tccttgagtg agaagcagta

     1681 cttcctgagg tggatggagt ggggcctggc acgggtggcc cagccgcgac tgagacagcc

     1741 tccggagacg cttctcaccc tgagaccaaa gcacgggggc accacagacg tgggggagcc

     1801 gctctggcct gagcccctag gggtggaaca cttcttgcgg gagatgggac agttttatga

     1861 ggctgagagc tgtcttgtgg aggcagggag gctgccggca ggccagaggc gttttgccca

     1921 cttcccaggc ttggcctcgg agctgctgct gacagggctg cctctggagc taatcgatgg

     1981 gagcacgctg agcatgcccg tccgctgggt cacagggctc ctgaaggagc tgcacgtccg

     2041 actggagaga cggtcaaggc tggtggttct gtcaaccgtc ggggtgccag gcacgggcaa

     2101 gtccacactc ctcaacacca tgtttgggct gcggtttgcc acagggaaga gctgcggtcc

     2161 tcgaggggcc ttcatgcagc tcatcacagt ggctgagggc ttcagccagg acctgggctg

     2221 tgaccacatc ctggtgatag actccggggg cttgataggt ggggccttga cgtcagctgg

     2281 ggacagattt gagctggagg cttccttggc cactctgctc atgggactga gcaatgtcac

     2341 cgtgatcagt ctagctgaaa ccaaggacat tccagcagct attctgcatg catttctgag

     2401 gttagaaaaa acggggcaca tgcccaacta ccagtttgta taccagaacc ttcatgatgt

     2461 atctgttccc ggccctaggc ccagagacaa gagacagctc ctggatccac ctggtgacct

     2521 gagcagggct gcagcccaga tggagaaaca gggcgacggc ttccgggcac tggcaggcct

     2581 ggccttctgc gaccctgaga agcagcacat ctggcacatc ccaggcctgt ggcacggagc

     2641 acctcccatg gccgcagtga gcttggccta cagtgaagcc atatttgaat tgaagagatg

     2701 cctactcgaa aacatcagga acggcttgtc gaaccaaaac aaaaacatcc agcagctcat

     2761 tgagctggtg agacggctgt gagtgtgcag agaaacccag ttcaggtgta ggaggctgct

     2821 gtgggcagcc ctgtctgatg gggcacccgt gtggggctgt gctctggtgc ctgagaatgg

     2881 ctggtgccca atcgacatga gaagacgagc agaagacaga gggtttggag tctcctcaac

     2941 agtgttaaaa gaggaagtga cctcacagac cagctcagag atgttaccaa gaatatcaca

     3001 gcccccaggg tagggagaca agcagcagtt tgttctgtct cagctcctgt caaggatcct

     3061 gcggggtggg ccctctgtat agctgctctc tgtcactggc ccctggagtg ggagcagcgt

     3121 ccttagtcac tgcaggccca ggcgggcagg tggtcccagg acagaggtgg ggaagttgtc

     3181 ctgaggaagc agaagtaggc cttgctcccg cccaacccaa gggcctccag tggaccagca

     3241 ttcaagatgt gagtgcccgt ggtgtgcaag gcactcccat ggcaccgtat ttattgactg

     3301 atctgtgaag gcttccctga cccctgccca ggaagagttc actggtcgct ctgttgtgcc

     3361 ccacagcact ttgttatacc tctgccacac acttcacgca gcgcgttgta actcatgtgt

     3421 ttacatgtct gtccccccag actgtgagct ccttgagggc agggactgta cattctccag

     3481 ctctgtgtcc ccagggcctg gcacattgta gacgcttaat aaatgtctgt taaatgaaaa

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     3601 aaaaaa

 

<210> 2

<211> 745

<212> DNA

<213> 未知

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1 cttaccgaca gacagacgct gggacccacg acgacagaag gcgccgatgg ccgcgcctgc

       61 tgagccctgc gcggggcagg gggtctggaa ccagacagag cctgaacctg ccgccaccag

      121 cctgctgagc ctgtgcttcc tgagaacagc aggggtctgg gtacccccca tgtacctctg

      181 ggtccttggt cccatctacc tcctcttcat ccaccaccat ggccggggct acctccggat

      241 gtccccactc ttcaaagcca agatggtagc tgccatccct gggagcctgg aaccaggcaa

      301 tgttcggggg aggcagggga caggctggaa cctggtgaag tcttaaagta gactcctcct

      361 atcggggtgt agaagggaat ctgttaatca aacagagcaa tattagaaag gctacagagg

      421 tcaactcagt ggaacatggt tctcccaaac agattttgta attccgaaaa tccacgcatg

      481 cgcaaacata cgcatacact cccatgttcc tggacagttt atagctacca taacctggca

      541 ttttccaaaa cataccatgt agactcttgg atacacaagg taattttagg gccacattag

      601 gatgaacctt ttaaaaggtt atgcatttat ttttatgttt ccccactagc tgtattatag

      661 gacaattttt atatgtgata tgtatttacc ttagtgtgtt aaataaacac tggcatttca

      721 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa

 

<210> 3

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<212> DNA

<213> 未知

<400> 3

1 ttcggctgtg ggagtggcat ctgcatcgct cccaatgtcc gctcctgcca ggatggagag

       61 caaggggcca cctgcccaga aacccatgga ccatgtgggg agtacggctg tgaccttacc

      121 tgcaaccatg gaggctgtca ggaggcggcc cgagtgtgcc ccgtgggctt ctcgatgacg

      181 gagacagctg ttggcatcag gtgtacagac attgacgaat gtgtaacctc ctcctgcgag

      241 ggccactgtg tgaacacaga aggtgggttt gtgtgcgagt gtgggccggg catgcagctg

      301 tctgccgacc gccacagctg ccaagacact gacgaatgcc tagggactcc ctgtcagcag

      361 agatgtaaaa acagcattgg cagctacaag tgttcctgtc gaactggctt caccttcatg

      421 gcaaccggca ctcctgtgta gatgtaaacg agtgtcggag gccattggag aggcgaagtc

      481 tgtcaccatt cctgccacaa caccgtgggc agcttcctat gcacatgccg acctggcttc

      541 aggctccgag ctgaccgcgt gtcctgtgaa gctttcccga aagccgtgct ggccccatct

      601 gccatcctgc aaccccggca acacccgtcc aagatgcttc tgttgcttcc tgaggccggc

      661 cggcctgccc tgtccccagg acatagccct ccttctgggg ctccagggcc cccagccgga

      721 gtcaggacca cccgcctgcc atctcccacc ccacgactac ccacatcctc cccttctgcc

      781 cctgtgtggc tgctgtccac cctgctggcc accccagtgc ctactgcctc cctgctgggg

      841 aacctcagac ccccctcact ccttcagggg gaggtgatgg ggaccccttc ctcacccagg

      901 ggccctgagt ccccccgact ggcagcaggg ccctctccct gctggcacct gggagccatg

      961 catgaatcaa ggagtcgctg gacagagcct gggtgttccc agtgctggtg cgaggacggg

     1021 aaggtgacct gtgaaaaggt gaggtgtgaa gctgcttgtt cccacccaat tccctccaga

     1081 gatggtgggt gctgcccatc gtgcacaggc tgttttcaca gtggtgtcgt ccgagctgaa

     1141 ggggatgtgt tttcacctcc caatgagaac tgcaccgtct gtgtctgtct ggctggaaac

     1201 gtgtcctgca tctctcctga gtgtccttct ggcccctgtc agaccccccc acagacggat

     1261 tgctgtactt gtgttccagt gagatgctat ttccacggcc ggtggtacgc agacggggct

     1321 gtgttcagtg ggggtggtga cgagtgtacc acctgtgttt gccagaatgg ggaggtggag

     1381 tgctccttca tgccctgccc tgagctggcc tgcccccgag aagagtggcg gctgggccct

     1441 gggcagtgtt gcttcacctg ccaggagccc acaccctcga caggctgctc tcttgacgac

     1501 aacggggttg agtttccgat tggacagatc tggtcgcctg gtgacccctg tgagttatgc

     1561 atctgccagg cagatggctc ggtgagctgc aagaggacag actgtgtgga ctcctgccct

     1621 cacccgatcc ggatccctgg acagtgctgc ccagactgtt cagcaggctg cacctacaca

     1681 ggcagaatct tctataacaa cgagaccttc ccgtctgtgc tggacccatg tctgagctgc

     1741 atctgcctgc tgggctcagt ggcctgttcc cccgtggact gccccatcac ctgtacctac

     1801 cctttccacc ctgacgggga gtgctgcccc gtgtgccgag actgcaacta cgagggaagg

     1861 aaggtggcga atggccaggt gttcaccttg gatgatgaac cctgcacccg gtgcacgtgc

     1921 cagctgggag aggtgagctg tgagaaggtt ccctgccagc gggcctgtgc cgaccctgcc

     1981 ctgcttcctg gggactgctg ctcttcctgt ccagattgcc ctgtctcctc tggaagaaaa

     2041 gcaggggctc tcccctcacg gaaaatgtgg cattcagcaa agctggtcgg gagcctgcat

     2101 ggagacactg aggcccctgt caactgtagc tcctgtcctg ggcccccgac agcatcaccc

     2161 tcgaggccgg tgcttcatct cctccagctc cttttaagaa cgaacttgat gaaaacacag

     2221 actttaccta caagcccggc aggagctcat ggtccacact cactcgcttt ggggctgaca

     2281 gccactttcc cagggggagc ctggggcctc ccctcgactc tcaccagggc cttcgacccc

     2341 tccaggagcc cccactctac ctctagcttc cccaggggct cctcagccac ctcctgtgac

     2401 tccagagcgc tcgttctcag cctctggggc ccagatagtg tccaggtggc ctcctctgcc

     2461 tggcaccctc ctgacggaag cttcagcact ttccatgatg gaccccagcc cctcgaagac

     2521 cccatcaccc tcctcgggcc tcgcgtgctt tctcccacca cctctagact ctccacagcc

     2581 cttgcagcca ccacccaccc tggcccccag cagcccccag tgggggcttc tcggggggaa

     2641 gagtccacca tgtaaggagg tcactgtgtc cgggagactc tggagagagg acctctgcca

     2701 gtggcccagg gtgtgtgcag ggcacctcca aggatgaacc tggtggggat gcctgggctc

     2761 cctcctgcac gggccctggt gaggatggaa gacccccaag gctggatgta accttgttcc

     2821 caagaagtgt ttggaatgtg ctgtaagaat ggaggaagtc gtttccactg tcagcatcct

     2881 cccctggacc gcgtggctgg ctcatctttt gagaagggtt gggactgcca agttttcctg

     2941 gaggaagagt tgcgtccggc tgggattcca ctcactggga ctgtaccgcc aggtgtcatg

     3001 cgtctttctg aggtttcctg attaaaggtt gtttcggttt cctaaaaaaa aaaaaaaaaa

    3061 aaaaaaaaaa aaaaaa

 

<210> 4

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<212> DNA

<213> 未知

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1 gccacaatgg tgcgcatgaa tgtcctggca gatgctctca agagtatcaa caatgccgaa

       61 aagagaggca aacgccaggt gcttattagg ccgtgctcca aagtcatcgt ccggtttctc

      121 actgtgatga tgaagcatgg ttacattggc gaatttgaaa tcattgatga ccacagagct

      181 gggaaaattg ttgtgaacct cacaggcagg ctaaacaagt gtggggtgat aagccccaga

      241 tttgacgtgc aactcaaaga cctggaaaaa tggcagaata atctgcttcc atcccgccag

      301 tttggtttca ttgtactgac aacctcagct ggcatcatgg accatgaaga agcaagacga

      361 aaacacacag gagggaaaat cctgggattc tttttctagg gatgtaatac atatatttac

      421 aaataaaatg cctcatggac tctggtgctt ccaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa

      481 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaattaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa

 

<210> 5

<211> 4475

<212> DNA

<213> 未知

<400> 5

1 cccacgcgca gcggccggag atgcagcggg gcgccgcgct gtgcctgcga ctgtggctct

       61 gcctgggact cctggacggc ctggtgagtg actactccat gacccccccg accttgaaca

      121 tcacggagga gtcacacgtc atcgacaccg gtgacagcct gtccatctcc tgcaggggac

      181 agcaccccct cgagtgggct tggccaggag ctcaggaggc gccagccacc ggagacaagg

      241 acagcgagga cacgggggtg gtgcgagact gcgagggcac agacgccagg ccctactgca

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      361 agtacatcaa ggcacgcatc gagggcacca cggccgccag ctcctacgtg ttcgtgagag

      421 actttgagca gccattcatc aacaagcctg acacgctctt ggtcaacagg aaggacgcca

      481 tgtgggtgcc ctgtctggtg tccatccccg gcctcaatgt cacgctgcgc tcgcaaagct

      541 cggtgctgtg gccagacggg caggaggtgg tgtgggatga ccggcggggc atgctcgtgt

      601 ccacgccact gctgcacgat gccctgtacc tgcagtgcga gaccacctgg ggagaccagg

      661 acttcctttc caaccccttc ctggtgcaca tcacaggcaa cgagctctat gacatccagc

      721 tgttgcccag gaagtcgctg gagctgctgg taggggagaa gctggtcctc aactgcaccg

      781 tgtgggctga gtttaactca ggtgtcacct ttgactggga ctacccaggg aagcaggcag

      841 agcggggtaa gtgggtgccc gagcgacgct cccaacagac ccacacagaa ctctccagca

      901 tcctgaccat ccacaacgtc agccagcacg acctgggctc gtatgtgtgc aaggccaaca

      961 acggcatcca gcgatttcgg gagagcaccg aggtcattgt gcatgaaaat cccttcatca

     1021 gcgtcgagtg gctcaaagga cccatcctgg aggccacggc aggagacgag ctggtgaagc

     1081 tgcccgtgaa gctggcagcg taccccccgc ccgagttcca gtggtacaag gatggaaagg

     1141 cactgtccgg gcgccacagt ccacatgccc tggtgctcaa ggaggtgaca gaggccagca

     1201 caggcaccta caccctcgcc ctgtggaact ccgctgctgg cctgaggcgc aacatcagcc

     1261 tggagctggt ggtgaatgtg cccccccaga tacatgagaa ggaggcctcc tcccccagca

     1321 tctactcgcg tcacagccgc caggccctca cctgcacggc ctacggggtg cccctgcctc

     1381 tcagcatcca gtggcactgg cggccctgga caccctgcaa gatgtttgcc cagcgtagtc

     1441 tccggcggcg gcagcagcaa gacctcatgc cacagtgccg tgactggagg gcggtgacca

     1501 cgcaggatgc cgtgaacccc atcgagagcc tggacacctg gaccgagttt gtggagggaa

     1561 agaataagac tgtgagcaag ctggtgatcc agaatgccaa cgtgtctgcc atgtacaagt

     1621 gtgtggtctc caacaaggtg ggccaggatg agcggctcat ctacttctat gtgaccacca

     1681 tccccgacgg cttcaccatc gaatccaagc catccgagga gctactagag ggccagccgg

     1741 tgctcctgag ctgccaagcc gacagctaca agtacgagca tctgcgctgg taccgcctca

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     1861 atctgttcgc cacccctctg gccgccagcc tggaggaggt ggcacctggg gcgcgccacg

     1921 ccacgctcag cctgagtatc ccccgcgtcg cgcccgagca cgagggccac tatgtgtgcg

     1981 aagtgcaaga ccggcgcagc catgacaagc actgccacaa gaagtacctg tcggtgcagg

     2041 ccctggaagc ccctcggctc acgcagaact tgaccgacct cctggtgaac gtgagcgact

     2101 cgctggagat gcagtgcttg gtggccggag cgcacgcgcc cagcatcgtg tggtacaaag

     2161 acgagaggct gctggaggaa aagtctggag tcgacttggc ggactccaac cagaagctga

     2221 gcatccagcg cgtgcgcgag gaggatgcgg gaccgtatct gtgcagcgtg tgcagaccca

     2281 agggctgcgt caactcctcc gccagcgtgg ccgtggaagg ctccgaggat aagggcagca

     2341 tggagatcgt gatccttgtc ggtaccggcg tcatcgctgt cttcttctgg gtcctcctcc

     2401 tcctcatctt ctgtaacatg aggaggccgg cccacgcaga catcaagacg ggctacctgt

     2461 ccatcatcat ggaccccggg gaggtgcctc tggaggagca atgcgaatac ctgtcctacg

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     2581 gcgccttcgg gaaggtggtg gaagcctccg ctttcggcat ccacaagggc agcagctgtg

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     2701 tgtcggagct caagatcctc attcacatcg gcaaccacct caacgtggtc aacctcctcg

     2761 gggcgtgcac caagccgcag ggccccctca tggtgatcgt ggagttctgc aagtacggca

     2821 acctctccaa cttcctgcgc gccaagcggg acgccttcag cccctgcgcg gagaagtctc

     2881 ccgagcagcg cggacgcttc cgcgccatgg tggagctcgc caggctggat cggaggcggc

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     3061 ttgtctgcta cagcttccag gtggccagag ggatggagtt cctggcttcc cgaaagtgca

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     3181 gtgactttgg ccttgcccgg gacatctaca aagaccccga ctacgtccgc aagggcagtg

     3241 cccggctgcc cctgaagtgg atggcccctg aaagcatctt cgacaaggtg tacaccacgc

     3301 agagtgacgt gtggtccttt ggggtgcttc tctgggagat cttctctctg ggggcctccc

     3361 cgtaccctgg ggtgcagatc aatgaggagt tctgccagcg cgtgagagac ggcacaagga

     3421 tgagggcccc ggagctggcc actcccgcca tacgccacat catgctgaac tgctggtccg

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     3541 agggcagggg cctgcaagag gaagaggagg tctgcatggc cccgcgcagc tctcagagct

     3601 cagaagaggg cagcttctcg caggtgtcca ccatggccct acacatcgcc caggctgacg

     3661 ctgaggacag cccgccaagc ctgcagcgcc acagcctggc cgccaggtat tacaactggg

     3721 tgtcctttcc cgggtgcctg gccagagggg ctgagacccg tggttcctcc aggatgaaga

     3781 catttgagga attccccatg accccaacga cctacaaagg ctctgtggac aaccagacag

     3841 acagtgggat ggtgctggcc tcggaggagt ttgagcagat agagagcagg catagacaag

     3901 aaagcggctt caggtagctg aagcagagag agagaaggca gcatacgtca gcattttctt

     3961 ctctgcactt ataagaaaga tcaaagactt taagactttc gctatttctt ctactgctat

     4021 ctactacaaa cttcaaagag gaaccaggag gacaagagga gcatgaaagt ggacaaggag

     4081 tgtgaccact gaagcaccac agggaggggt taggcctccg gatgactgcg ggcaggcctg

     4141 gataatatcc agcctcccac aagaagctgg tggagcagag tgttccctga ctcctccaag

     4201 gaaagggaga cgccctttca tggtctgctg agtaacaggt gccttcccag acactggcgt

     4261 tactgcttga ccaaagagcc ctcaagcggc ccttatgcca gcgtgacaga gggctcacct

     4321 cttgccttct aggtcacttc tcacaatgtc ccttcagcac ctgaccctgt gcccgccgat

     4381 tattccttgg taatatgagt aatacatcaa agagtagtat taaaagctaa ttaatcatgt

     4441 ttataaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa

 

<210> 6

<211> 1350

<212> DNA

<213> 未知

<400> 6

1 aggattcagc agcctccccc ttgagccccc tcgcttcccg acgttccgtt cccccctgcc

       61 cgccttctcc cgccaccgcc gccgccgcct tccgcaggcc gtttcccacc gaggaaaagg

      121 aatcgtatcg tatgtccgct atccagaacc tccactcttt cgaccccttt gctgatgcaa

      181 gtaagggtga tgacctgctt cctgctggca ctgaggatta tatccatata agaattcaac

      241 agagaaacgg caggaagacc cttactactg tccaagggat cgctgatgat tacgataaaa

      301 agaaactagt gaaggcgttt aagaaaaagt ttgcctgcaa tggtactgta attgagcatc

      361 cggaatatgg agaagtaatt cagctacagg gtgaccaacg caagaacata tgccagttcc

      421 tcgtagagat tggactggct aaggacgatc agctgaaggt tcatgggttt taagtgcttg

      481 tggctcactg aagcttaagt gaggatttat ttcccttgca atgagtagaa tttcccttct

      541 ctcccttgtc acaggtttaa aaacctcaca gcttgtataa tgtaaccatt tggggtccgc

      601 ttttaacttg gactagtgta actccttcat gcaataaact gaaaagagcc atgctgtcta

      661 gtcttgaagt ccctcattta aacagaggtc aagcaatagg cgcctggcag tgtcaagcct

      721 gaaaccaagc aataccgtca tgtttcagcc aagcccagag ccctaagatt acaaacaact

      781 atggccggaa cctccgcagc tctccctctg cagagttccc taccctaaga gaatgttacc

      841 acctgaacag tcctcggtga atctgagagg agaggatggg gtaaggcaga agcaccagct

      901 gtactactag aagggagctt ttggtggtag atcccctggt gtctccaacc tgactaggtg

      961 gacagagctc aaagaggccc tcttaccgct agcgaggtga taggacatct ggcttgccac

     1021 aaaggtctgt tcgaccagac atatcctagc taagggatgt ccaaacatca gaatgtgagg

     1081 ccaaccttct atcagagtta aacttttgac aagggaacaa atctcaaact gatccatcag

     1141 tcatgtagct agctgtagag cttgcaactt aatagcagca gctgcccaat gccatgtgaa

     1201 gtaacaaact ggtttttggt ttttttttcc ccttcagttt taatgttatg tgtaatgtat

     1261 ttaaaccctt atttaaataa aacttgtttt cagaaataaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa

     1321 aaaaaaacct gcccgggcgg ccgctcgagc

Claims (3)

1.一种检测乙肝肝癌前病变标志物的ELISA试剂盒，其特征在于：该试剂盒是采用固相免疫试验ELISA来检测肝癌前病变抗体，在X基因阳性与阴性的HepG2细胞系中，通过抑制性cDNA差减杂交，克隆出异常表达的基因片段URG4、URG7、URG11、URG12、URG19和DRG2，并选择亲水端序列，固相合成人工多肽，作为包被抗原，制成检测乙肝肝癌前病变标志物的ELISA试剂盒，URG4、URG7、URG11、URG12、URG19和DRG2的基因序列见序列表。

2.一种检测乙肝肝癌前病变标志物的ELISA试剂盒的建立方法，其特征在于：该试剂盒的建立方法包括下列步骤：

（一）建立HBX和CAT的HepG2系

   将HBX基因转染到HepG2中，对照组用氯霉素乙酰转移酶CAT转染到HepG2，建立HepG2-X细胞和HepG2-CAT两个细胞系，培养，传代，观察其表达；首先提取HepG 2-X 和HepG 2-CAT总RNA及mRNＡ，ＲＴ－ＰＣＲ反转录建立ｃＤＮＡ文库，用抑制性ｃＤＮＡ差减杂交，ｃＤＮＡ探针的克隆及测序；

   （二）建立ELISAs检测方法

从HepG2-X细胞和HepG2-CAT细胞系克隆出6个基因蛋白：URG4、URG7、URG11、   URG12、URG19和DRG2，ELISA检测每一个基因蛋白相对应的抗体，称之为肝癌前病变抗体；方法是采用固相合成的人工多肽，序列选择跨越亲水区域，人工多肽由分子生物实验室合成，多肽分别用载体蛋白钥孔戚血兰素偶连，配成一定浓度的人工多肽；

建立一定方法的ELISA：分实验组与对照组，实验组包被用人工多肽，对照组用PBS：Phosphate Buffered Saline，检测中设立阳性对照与阴性对照，阳性对照是用专门的兔抗人工合成多肽血清，阴性血清是从公司购买；

（三）特异性及放射免疫沉淀检测

    为检测建立的ELISA方法的特异性，在ELISA实验前将抗体阳性的血清与相关、或不相关的人工多肽混合在一起，然后加入预先包被的同样人工多肽的培养液中，以观察混合不同浓度人工多肽的阳性血清标本与包被同样人工多肽的结合情况，来分析其特异性；

将URG4、URG7、URG11、URG12、URG19和DRG2全长cDNA分别被亚克隆到pcDNA3；每个重组体在体外成线性转录，然后在兔网织红细胞裂解物中翻译，用35S蛋氨酸标记和35S半胱氨酸标记结合用放射自显影SDS/PAGE检测。

3.一种检测乙肝肝癌前病变标志物ELISA试剂盒的应用，其特征在于：所述的试剂盒在检测乙肝肝癌前病变标志物的应用。

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