KR20070044048A - 갑상선암의 검출방법 - Google Patents
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Abstract
대상의 신체 샘플로부터 핵산 샘플을 수득하는 단계 및 핵산 샘플이 적어도 하나의 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR) mRNA 또는 티로글로불린(Tg) mRNA를 함유하는지를 결정하는 단계를 포함하는, 대상에서 갑상선암의 검출방법이 개시된다.
갑상선암, 검출방법, 핵산, TSHR mRNA, Tg mRNA
Description
관련 출원
본 출원은 전체를 본 원에 참고로 포함하는 2004년 8월 11일 출원된 미국 가특허 출원 제 60/600,589호를 우선권으로 주장한다.
발명의 분야
본 출원은 대상에서 갑상선암의 검출방법 및 핵산에 기초한 분석법(assay)을 이용한 갑상선암의 검출방법에 관한 것이다.
발명의 배경
인구의 4-7%가 갑상선 결절을 가지고 있을 것으로 추정된다. 이들 결절의 5-30%가 악성이라고 문헌에 보고되었다. 이들 사례에서 주요한 진단학적 고려사항은 악성 종양의 고찰이다. 현재, 수술전 이들 결절의 성향을 예측하는데 최상의 방법은 병변을 가는 바늘로 흡인 생검(fine needle aspiration biopsy: FNA)하는 것이다. FNA의 사용 결과 갑상선 절제 시행 횟수가 줄었고 절제된 병소내 악성 종양의 양이 증가하였다. 그러나, 양성 및 악성 갑상선 신생물의 세포학적 양상의 중복 및 병소의 부적절한 샘플링은 이러한 기술의 피할 수 없는 취약점이다. FNA의 주요 취약점은 분화성 소포 암종과 양성 소포 샘종을 구분하지 못한다는 것이다. 소포 갑 상선 신생물을 가진 환자는 보통 갑상선 절제술을 경험하게 되며, 약 15%가 악성 병소를 지닌다. 양성 병소의 신뢰적인 수술전 진단이 불필요한 수술 횟수를 크게 줄일 수 있다.
암 세포는 원격 전이되기 전에 말초 혈액 및 림프관을 순환한다. 이들 세포의 검출은 암 및 그의 전이 가능성을 초기에 진단하는 수단이 된다. RT-PCR은 조직/종양 특이적 mRNA 전사물을 확인할 수 있는 능력에 기초해 순환계에서 특이적 세포 타입의 존재를 검출하기 위한 민감하면서 강력한 기술이다. 특이적 갑상선 마커, Tg의 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)이 갑상선암 세포의 순환을 검출하는데 이용되고 있다. 대부분의 연구자들은 정상 대상에서 순환 Tg mRNA를 검출하였으며, 따라서 그의 사용은 갑상선 절제 환자에서 잔류/재발 갑상선암을 검출하는 것으로만 제한된다. PCR에 기초한 분석법의 성공은 크게 하기 인자의 조합에 좌우된다: 샘플 처리 과정, RNA 순도, PCR 프라이머 위치, 순환 조건 및 시그널 검출 방법.
발명의 개요
본 발명의 일 측면은 대상에서 갑상선암의 검출방법에 관한 것이다. 이 방법은 대상의 신체 샘플로부터 핵산 샘플을 수득하는 단계; 및 핵산 샘플이 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR) mRNA를 함유하는지를 결정하는 단계를 포함한다. THSR mRNA는 핵산 샘플에서 TSHR mRNA 세그먼트를 증폭하고, TSHR mRNA의 증폭 부분의 존재를 검출하여 결정할 수 있다. 증폭은 TSHR mRNA 전사물에 상보적인 한쌍의 프라이머로 수행할 수 있다. 본 발명의 일 측면으로, 프라이머 쌍은 각각 서열 번호 1 및 서열 번호 2를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 대상에서 갑상선 신생물이 양성인지 혹은 악성인지를 결정하기 위한 수술전 분석법에 관한 것이다. 수술전 분석법은 대상의 신체 샘플로부터 핵산 샘플을 수득하는 단계 및 핵산 샘플이 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR) mRNA를 함유하는지를 결정하는 단계를 포함한다. THSR mRNA는 핵산 샘플에서 TSHR mRNA 세그먼트를 증폭하고, TSHR mRNA의 증폭 부분의 존재를 검출하여 결정할 수 있다. 증폭은 TSHR mRNA 전사물에 상보적인 한쌍의 프라이머로 수행할 수 있다. 본 발명의 일 측면으로, 프라이머 쌍은 각각 서열 번호 1 및 서열 번호 2를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 대상에서 갑상선암을 검출하기 위한 키트에 관한 것이다. 키트는 TSHR mRNA 세그먼트를 증폭시킬 수 있는 프라이머 쌍을 포함한다. 증폭 세그먼트는 적어도 TSHR mRNA의 엑손 6-9 부분을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 측면으로, 프라이머는 각각 서열 번호 1 및 서열 번호 2를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있는 적어도 10개의 인접 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 그밖의 다른 측면은 대상에서 갑상선 신생물이 양성인지 혹은 악성인지를 결정하기 위한 수술전 분석법에 관한 것이다. 수술전 분석법은 대상의 신체 샘플로부터 핵산 샘플을 수득하는 단계 및 핵산 샘플이 티로글로불린(Tg) mRNA를 함유하는지를 결정하는 단계를 포함한다. Tg mRNA는 핵산 샘플에서 Tg mRNA 세그먼트를 증폭하고, Tg mRNA의 증폭 부분의 존재를 검출하여 결정할 수 있다. 증폭은 Tg mRNA 전사물에 상보적인 한쌍의 프라이머로 수행할 수 있다. 본 발명의 일 측면으로, 프라이머 쌍은 각각 서열 번호 3 및 서열 번호 4를 포함하는 뉴클레오티 드 서열을 가질 수 있다.
본 발명의 그밖의 또 다른 측면은 대상에서 갑상선암을 검출하기 위한 키트에 관한 것이다. 키트는 Tg mRNA 세그먼트를 증폭시킬 수 있는 한쌍의 프라이머를 포함한다. 증폭 세그먼트는 적어도 Tg mRNA의 엑손 1-5 부분을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 측면으로, 프라이머는 각각 서열 번호 3 및 서열 번호 4를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있는 적어도 10개의 인접 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
첨부된 도면을 참조로 한 하기 설명에 따라 당업자들은 본 발명의 상기 및 다른 측면들을 알 수 있을 것이다.
도 1은 9명의 환자 샘플(레인 1-9), 1명의 음성 대조군(역 전사 없음; 레인 10) 및 1명의 양성 대조군(갑상선암 조직 RNA: 레인 11)에서 티로글로불린(Tg), TSHR 및 글리세르알데히드 3-포스페이트 데하이드로게나제(GAPDH)에 대한 RT-PCR 결과를 보여주는 겔 사진을 나타낸다. 레인 1, 5 및 6: 양성 갑상선 질환 환자; 레인 2 및 4: 질환 징후를 보이지 않는 갑상선암 환자; 레인 3, 7-9: 질환 징후를 보이는 갑상선암 환자.
도 2는 환자에서 Tg 및 TSHR에 대한 RT-PCR 결과를 보여주는 겔 사진을 나타낸다(레인 2-8). 양성 대조군은 레인 1이고, 음성 대조군은 레인 9이다.
도 3은 비진단 FNA 세포검사*, 2개의 갑상선염 및 하나의 콜로이드 결절을 가지는 18명의 환자에서 RT-PCR 결과를 나타낸다. FP, 가양성(증식 호산성 결절); HA, 휘르트레(Hurthle) 세포 샘종.
이하, 본 발명의 구체예에 대한 상세한 설명과 본 원에 포함된 실시예 및 서열목록을 참조로 하여 본 발명이 보다 용이하게 이해될 수 있을 것이다.
본 원에서 명세서 및 청구범위에 사용된 하기 용어들은 달리 명시되지 않으면 주어지는 의미를 가진다.
핵산 또는 핵산 단편과 관련하여 TSHR mRNA 또는 Tg mRNA에 대해 본 원에 사용된 "에 특이적인", "에 대해 특이적인" 및 "에 유일한" 이라는 문구는 다른 mRNA에 공통되지 않는 핵산 또는 핵산 단편을 의미한다.
핵산과 관련하여 본 원에 사용된 "단편" 이라는 용어는, 예를 들어 중합효소 연쇄반응(PCR) 또는 핵산을 다른 방식으로 특성화하는 경우 하이브리드화 프라이머로서 적절히 기능하기에 충분한 크기 및 구조를 가지는 핵산의 부분 서열(sub-sequence)을 의미한다.
"분리된" 이라는 용어는 사용할 수 있기에 충분히 순수하고 임상적 진단, 실험 또는 다른 절차, 예컨대 TSHR mRNA 또는 Tg mRNA에 대한 증폭 반응 또는 하이브리드화 분석법에서 적절히 기능할 핵산 또는 핵산 단편을 의미한다. 핵산, 핵산 단편 및 다양한 절차에 사용하기 전에 일반적으로 관련될 수 있는 물질을 정제하기 위한 많은 절차가 당업자들에게 공지되었다.
본 발명의 핵산 서열 또는 본 발명의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열과 관련하여 "실질적으로 유사한" 이란 용어는 본 발명의 핵산 서열 또는 본 발명의 핵산 서열에 상보적인 핵산 서열과 유사하고 이러한 핵산의 기능을 보유하지만 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 결실 및/또는 첨가, 및/또는 일부 다른 특장점의 도입으로 상기 핵산과 상이한 핵산을 말한다. 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 이들 비율이 100% 내지 80% 이거나, 또는 10개의 뉴클레오티드 서열에서 0개의 염기가 미스매치한 것으로부터 10개의 뉴클레오티드 서열에서 2개의 염기가 미스매치한 경우 핵산 서열과 실질적으로 유사하다. 일부 구체예에서, 이 비율은 100% 내지 85%이다. 다른 구체예에서, 이 비율은 90% 내지 100%이고; 또 다른 구체예에서, 이 비율은 95% 내지 100%이다.
본 발명은 대상에서 갑상선암의 검출방법을 제공한다. 이 방법은 대상의 갑상선 신생물이 양성인지 혹은 악성인지를 결정하기 위한 수술전 분석법(예: 갑상선 절제술 전)으로 이용될 수 있다. 이 방법은 또한 갑상선 절제술 후에 수술후 전이 갑상선암 재발을 모니터하기 위한 분석법으로도 이용될 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따라, 방법은 대상의 신체 샘플로부터 적절한 핵산 샘플을 수득하고, 핵산 샘플이 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR) mRNA를 함유하는지를 결정하여 대상의 신체 샘플에서 순환 갑상선 세포를 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
본 원에 개시된 "신체 샘플"은 핵산 샘플이 마커 서열을 함유하는지를 결정하기 위하여 핵산 샘플을 수득할 수 있는 대상의 신체로부터 얻은 임의의 신체 샘플(예: 체액)을 포함한다. 일례는 혈액, 특히 말초 혈액이다. 그러나, 당업자들은 샘플이 TSHR mRNA를 함유하는지를 결정하여 순환 갑상선 세포가 존재하는지를 결정할 수 있는 다른 신체 샘플, 예컨대 가는 바늘 흡인물 및 기관지액도 수득할 수 있다.
당업자들은 본 발명을 다양한 대상, 예를 들어 동물, 구체적으로 인간에 응용할 수도 있다.
TSHR mRNA의 존재는 TSHR mRNA의 표적 뉴클레오티드 서열을 검출하여 결정할 수 있다. TSHR을 코딩하는 DNA의 역 전사물에 상응하는 mRNA를 포함하는 핵산 서열의 적어도 일부가 갑상선 신생물의 검출 및 분화에 사용되는 핵산에 대한 표적 뉴클레오티드 서열로서 사용될 수 있는 것으로 밝혀졌다. "표적 뉴클레오티드 서열" 이라는 문구는 증폭, 검출, 또는 다르게 분석될 뉴클레오티드 영역을 의미한다. 예로, 본 발명에 따라 표적 뉴클레오티드 서열로 사용될 수 있는 TSHR mRNA를 포함하는 핵산 서열 부분은 TSHR mRNA의 엑손 6-9를 포함한다.
본 발명의 일 측면으로, 표적 뉴클레오티드 서열은 TSHR을 코딩하는 DNA의 역 전사물에 상응하는 mRNA를 포함하는 핵산 서열의 표적 뉴클레오티드 서열을 증폭시키고 증폭된 표적 서열을 검출함으로써 검출할 수 있다. 본 발명의 표적 뉴클레오티드 서열은 TSHR mRNA의 적어도 일부(또는 TSHR mRNA의 역 전사물)의 전사 및 복제를 촉진하는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 선택적으로 하이브리드화하여 증폭시킬 수 있다. 본 원에 사용된 "하이브리드화하다" 라는 용어는 완전(100%) 또는 완전 미만(100% 미만) 상보성 염기쌍화에 기인한 두개의 단일-스트랜드 핵산에 의한 듀플렉스 구조의 형성을 의미한다. 하이브리드화는 완전 내지 상보성 핵산 스트랜드들 사이에서 일어나거나, 하나 이상의 뉴클레오티드 치환, 결실 또는 첨가로 미스매치 영역을 함유하는 완전 미만의 상보성 핵산 스트랜드들 사이에서 일어날 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 프라이머 의존성 중합효소 활성의 작용을 위한 시동 위치 또는 개시 위치로 제공된다. 올리고뉴클레오티드 프라이머는 특이적인 TSHR mRNA이고 표적 뉴클레오티드 서열을 증폭시키기 위해 사용될 수 있는 핵산 서열을 포함한다. 표적 뉴클레오티드 서열은 TSHR mRNA의 엑손 6-9의 뉴클레오티드와 같이, TSHR mRNA의 인접 뉴클레오티드로 정의된다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 표적 뉴클레오티드 서열에 접한 뉴클레오티드 서열에 하이브리드화하여 중합효소, 예컨대 Taq 중합효소의 작용에 의한 합성을 두 프라이머 사이의 영역을 통해 진행시키는 한쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함할 수 있다. 이는 수회 하이브리드화 및 복제후 생성된 증폭된 표적 뉴클레오티드 서열의 말단이 프라이머를 하이브리드화하는 부위에 의해 한정되는 한정된 길이의 세그먼트이기 때문에 유리하다.
본 발명에 따라 TSHR mRNA에 특이적으로(선택적으로) 하이브리드화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머는 적어도 약 10개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예로, 올리고뉴클레오티드 프라이머는 약 10 내지 약 40개의 뉴클레오티드, 및 보다 특히 약 15 내지 약 35개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 프라이머는 의도하는 목적에 충분한 안정성을 가지는 듀플렉스 구조를 형성하기에 충분한 길이를 갖고 TSHR mRNA의 뉴클레오티드 서열 부분에 상보성일 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 프라이머는 중합화제가 중합 조건하에서 표적 서열을 가지는 안정한 듀플렉스 형태를 이루는 프라이머로부터 복제를 연속적으로 수행하기에 충분한 길이를 갖고 표적 TSHR mRNA에 상보적인 핵산 서열을 함유하여야 한다.
뉴클레오티드 프라이머 쌍을 위해 사용될 수 있는 한쌍의 핵산 서열의 일례는 서열 번호 1 및 2를 포함한다. 서열 번호 1은 5'GCTTTTCAGGGACTATGCAA-TGAA3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전방 프라이머이다. 서열 번호 2는 3'AGAGTTTGGTCAC-AGTGACGGGAA5'의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 후방 프라이머이다. 서열 번호 1 및 2는 올리고뉴클레오티드 프라이머로 사용되는 경우, TSHR mRNA의 엑손 6-9의 212 염기쌍 세그먼트를 증폭시킬 수 있다.
당업자들은 본 발명의 다른 올리고뉴클레오티드 프라이머가 서열 번호 1-2에 상보적인 핵산 서열, 서열 번호 1-2와 실질적으로 유사한 핵산 서열, 서열 번호 1-2에 상보적인 핵산 서열과 실질적으로 유사한 핵산 서열, TSHR mRNA에 특이적으로 하이브리드화하는 서열 번호 1-2의 단편, TSHR mRNA에 특이적으로 하이브리드화하는 서열 번호 1-2에 상보적인 핵산 서열 단편, TSHR mRNA에 특이적으로 하이브리드화하는 서열 번호 1-2와 실질적으로 유사한 핵산 서열 단편 및 TSHR mRNA에 특이적으로 하이브리드화하는 서열 번호 1-2에 상보적인 핵산 서열과 실질적으로 유사한 핵산 서열 단편을 포함할 수 있음을 알 수 있을 것이다. 핵산 서열이 TSHR mRNA에 특이적으로 하이브리드화하고, TSHR mRNA의 엑손 6-9를 특이적으로 증폭시키기만 한다면, 올리고뉴클레오티드 프라이머가 상기와 같은 다른 핵산 서열도 포함할 수 있음이 또한 이해될 것이다.
본 발명에 따른 TSHR mRNA 올리고뉴클레오티드 프라이머를 형성하기 위해 사용되는 핵산은 TSHR mRNA로부터 유래될 수 있다. 유래 핵산이 TSHR mRNA로부터 물리적으로 반드시 유래되어야 하는 것은 아니며, 예를 들어 화학 합성, DNA 복제, 역 전사 또는 전사를 포함한 임의 방식으로 생성될 수 있을 뿐만 아니라, RNA 및 펩티드 핵산(PNA)으로부터도 생성될 수 있다.
본 발명에 따른 TSHR mRNA 올리고뉴클레오티드 프라이머는 화학 합성 등과 같은 당업계에 공지된 방법으로 제조될 수 있다. TSHR mRNA 올리고뉴클레오티드 프라이머는 수동적으로 또는 기계로 합성될 수 있다. 이들은 또한 바이러스 및 박테리아 프로모터가 도입된 산물을 이용하여 재조합 방법으로도 합성될 수 있다.
TSHR mRNA 올리고뉴클레오티드 프라이머는 적어도 TSHR mRNA 부분을 검출하기 위한 증폭 분석법에 이용될 수도 있다. 본 발명의 일 측면으로, 올리고뉴클레오티드 프라이머는 중합효소 연쇄반응(PCR) 분석법에 사용될 수 있다. PCR 분석법에서, 신체 샘플의 핵산은 TSHR mRNA에 특이적이고 표적 뉴클레오티드 서열을 증폭시키기 위해 사용될 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머와 접촉된다. 표적 뉴클레오티드 서열은 예를 들어 TSHR mRNA의 엑손 6-9로부터 인접 뉴클레오티드로 한정될 수 있다. 그후, 존재할 경우, TSHR mRNA의 표적 뉴클레오티드 서열을 증폭시키기에 충분한 수의 열 사이클 및 온도 프로그램을 이용하여 생성된 혼합물에 대해 PCR 증폭을 수행한다. PCR 증폭은 상용화된 임의의 PCR 열 사이클링 장치를 이용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, PCR 증폭은 급속 온도 사이클링 기술을 이용하여 수행될 수도 있다. 급속 온도 사이클링 기술은 반응 증폭 샘플을 포함하기 위해 고 표면적-대-부피 샘플 컨테이너, 예를 들어 모세관을 사용한다. 고 표면적-대-부피 샘플 컨테이너의 사용은 샘플을 통한 신속 온도 반응 및 온도 균일성을 가능케 한다. 급속 온도 사이클링은 30 사이클의 증폭이 15분내에 완결되고, 생성된 PCR 증폭 산물이 보다 적은 부산물을 함유한다는 점에서 종래 온도 사이클링과 대비된다. 따라서, 급속 온도 사이클링 기술을 이용함으로써 증폭에 필요한 시간이 약 10배 감소되고, 특이성이 향상된다.
THSR mRNA 프라이머 및 TSHR mRNA 핵산에 상보적인 다른 핵산이 또한 RAPD 분석법 또는 다른 증폭 분석법과 같은 기타 분석법에도 사용될 수 있음을 당업자들은 알 것이다.
증폭된 표적 뉴클레오티드 서열이 존재하는 경우, 이는 공지 검출 기술을 이용하여 검출될 수 있다. 이들 검출 기술은 정성화 및/또는 정량화적일 수 있다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 검출 기술의 예는 겔 전기영동으로 결정되는 제한 효소 소화 패턴의 가시화, 증폭된 표적 뉴클레오티드 서열의 시퀀싱, 올리고뉴클레오티드 하이브리드화 프로브를 가지는 증폭된 뉴클레오티드 서열의 검출을 포함한다. 카피수 및 정량화는 서던 또는 노던 분석과 같은 표준 하이브리드화 절차에 의해 수행될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 하이브리드화 프로브가 검출을 위해 사용되는 경우, 올리고뉴클레오티드 하이브리드화 프로브는 형광 공명 에너지 전이(fluorescence resonance energy transfer: FRET) 쌍으로 표지되는 한쌍의 핵산 서열을 포함할 수 있다.
검출 방법(예: 융점 분석)이 올리고뉴클레오티드 프라이머에 의해 증폭된 표적 뉴클레오티드 서열이 존재한다는 것을 보여주는 결과를 나타내는 경우, 원형 샘플이 TSHR mRNA를 함유한다고 결론을 내릴 수 있다. 반대로, 표적 뉴클레오티드 서열의 검출 증거가 없는 경우에는, 샘플이 TSHR을 함유하지 않는다고 결론을 내릴 수 있다.
임의로, 방법의 중합효소 연쇄반응(PCR) 증폭 단계 및 검출 단계는 실질적으로 동시에 수행된다. 실질적인 동시 PCR 증폭 단계 및 검출 단계는 급속 온도 사이클러 요소 및 형광 검출 요소를 포함하는 장치에서 실시된다. 이러한 장치의 일례가 본 원에 참고로 포함되는 미국 특허 제 6,140,540호에 개시되었다. 급속 온도 사이클러 요소 및 형광 검출 요소를 포함하는 바람직한 장치는 로슈 몰레큘라 바이오케미컬사(Roche Molecular Biochemicals, 인디애나폴리스주 인디애나폴리스 소재)로부터 LIGHTCYCLER 명으로 시판되고 있다.
시험 대상으로부터 얻은 신체 샘플에서 검출된 TSHR mRNA의 수준을 예정값과 비교할 수 있다. 예정값은 인간 대상의 일반인 또는 선발인으로부터 얻은 견줄만한 샘플에서의 TSHR mRNA 수준을 기초로 할 수 있다. 예를 들어, 선발인은 외관상 건강한 대상으로 구성될 수 있다. 본 원에 사용된 "외관상 건강한"은 기존에 갑상선암과 같은 어떠한 질병의 존재 징후 또는 증상도 나타내지 않은 개체를 의미한다. 달리 말해, 이들 개체는 의학 전문가가 조사하였을 때 건강하고 질병 증상을 나타내지 않는다고 규정될 수 있다.
예정값은 시험 대상으로부터 얻은 신체 샘플의 TSHR mRNA 수준을 특정화하기 위해 사용된 값과 연관될 수 있다. 즉, TSHR mRNA 수준이 절대값인 경우, 예정값은 또한 인간 대상의 일반인 또는 선발인 개체의 TSHR mRNA 단위를 기초로 한다. 유사하게, TSHR mRNA 수준이 임의 단위와 같은 대표값인 경우, 예정값은 또한 대표값에 기초한다.
예정값은 다양한 형태를 취할 수 있다. 예정값은 단일 컷-오프값(cut-off 값), 예컨대 중간 또는 평균일 수 있다. 예정값은, 이를테면 하나의 규정 그룹에서의 전신 마커 수준(예: TSHR mRNA 수준)이 다른 규정 그룹에서의 전신 마커 수준의 두배가 되는 비교 그룹을 기초로 확립될 수 있다. 예정값은, 예를 들어 일반인이 균등하게(또는 비균등하게) 그룹 또는 사분면(quadrant)으로 분할되는 범위일 수 있으며, 이때 가장 낮은 사분면은 전신 마커가 가장 낮은 수준인 개체이며, 가장 높은 사분면은 전신 마커가 가장 높은 수준인 개체이다.
예정값은 일반인에서 TSHR mRNA 수준을 결정하여 유도할 수 있다. 별법으로, 예정값은 선발인에서 TSHR mRNA 수준을 결정하여 유도할 수도 있다. 따라서, 선택된 예정값은 개체가 속한 범주를 고려할 것이다. 당업자들에게서 벗어나지 않는 관례적인 실험으로 적절한 범위 및 범주가 선택될 수 있다.
TSHR mRNA의 예정값, 예컨대 평균 수준, 중간 수준 또는 "컷-오프" 수준은 일반인 또는 선발인에서 개체의 대형 샘플을 분석하고, 본 원에 참고로 포함되는 문헌 [Knapp, R.G., and Miller, M.C.(1992). Clinical Epidemiology and Biostatistics. William and Wilkins, Harual Publishing Co. Malvern, Pa.]에 기술된 바와 같이, 최적의 특이성(가장 높은 진음성률) 및 민감성(가장 높은 진양성률)을 규정하는 양성 기준 또는 수용체 작동 특성 곡선을 선택하기 위한 예측값 방법과 같은 통계 모델을 이용함으로써 확립된다. 분석된 각 전신 마커에 대해 "컷-오프" 값이 결정될 수 있다.
대상의 신체 샘플에서 검출된 TSHR mRNA의 수술전(즉, 갑상선 절제술 전) 수준은 대상에서 갑상선 신생물을 분류하여, 즉, 갑상선 신생물이 양성인지 혹은 악성인지, 그리고 질병 수준을 결정하기 위한 단일 예정값 또는 예정값 범위와 비교될 수 있다. 시험 대상의 신체 샘플에서 예정값 또는 예정값 범위보다 높은 TSHR mRNA의 수술전 수준은 대상이 악성 병소를 가진다는 지표일 수 있다. 시험 대상의 신체 샘플에서 예정값 또는 예정값 범위보다 낮은 TSHR mRNA의 수술전 수준은 대상이 소포 샘종과 관련된 것과 같은 양성 갑상선 신생물을 가진다는 지표일 수 있다.
대상의 신체 샘플에서 검출된 TSHR mRNA의 수술후 수준(즉, 갑상선 절제술 후)이 또한 갑상선암 재발에 대한 단일 예정값 또는 예정값 범위와 비교될 수 있다. 시험 대상의 신체 샘플에서 예정값 또는 예정값 범위보다 높은 TSHR mRNA의 수술후 수준은 갑상선암 재발/잔류의 지표일 수 있다. 시험 대상의 신체 샘플에서 예정값 또는 예정값 범위보다 낮은 TSHR mRNA의 수술후 수준은 갑상선암의 부재 및 대상으로부터 불필요한 수술 개입을 면할 수 있는 지표일 수 있다.
본 발명은 또한 핵산에 기초한 분석법에 의해 신체 샘플에서 TSHR mRNA를 확인 및 검출하기 위한 키트에 관한 것이다. 키트는 적어도 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함한다. 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍은 예를 들어 TSHR mRNA의 엑손 6-9로부터 인접 뉴클레오티드로 한정되는 표적 뉴클레오티드 서열을 증폭시키기 위해 사용될 수 있는 TSHR mRNA에 특이적인 핵산 서열을 포함할 수도 있다.
본 발명의 일례로, 키트는 한쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함한다. 올리고뉴클레오티드 프라이머는 TSHR mRNA의 엑손 6-9를 선택적으로 증폭시킬 수 있는 적어도 10개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 예로서, 올리고뉴클레오티드 프라이머는 서열 번호 1 및 2를 포함하는 핵산 서열을 가질 수 있다. 임의로, 키트는 또한 PCR 증폭 반응 및 올리고뉴클레오티드 프로브의 형광 검출을 개시하는데 필요한 시약의 하나 또는 전부를 함유할 수도 있다.
본 발명의 다른 측면에 따라, 대상에서 갑상선암의 검출방법은 대상의 신체 샘플로부터 적절한 핵산 샘플을 수득하여 대상의 신체 샘플에서 순환 갑상선 세포를 검출하는 단계 및 핵산 샘플이 티로글로불린(Tg) mRNA를 포함하는지를 결정하는 단계를 포함할 수 있다.
Tg mRNA의 존재는 Tg mRNA의 표적 뉴클레오티드 서열을 검출하여 결정할 수 있다. 예로서, 본 발명에 따른 표적 뉴클레오티드 서열로 사용될 수 있는 Tg mRNA를 포함하는 핵산 서열 부분은 Tg mRNA의 엑손 1-5를 포함한다.
본 발명의 일 측면으로, 표적 뉴클레오티드 서열은 Tg를 코딩하는 DNA의 역 전사물에 상응하는 mRNA를 포함하는 핵산 서열의 표적 뉴클레오티드 서열을 증폭시키고, 증폭된 표적 서열을 검출함으로써 검출할 수 있다. 본 발명의 표적 뉴클레오티드 서열은 적어도 Tg mRNA(또는 Tg mRNA의 역 전사물) 부분의 전사 및 복제를 촉진하는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 선택적으로 하이브리드화하여 증폭시킬 수도 있다.
본 발명에 따른 Tg mRNA에 특이적으로(또는 선택적으로) 하이브리드화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머는 적어도 약 10개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예로서, 올리고뉴클레오티드 프라이머는 약 10 내지 약 40개의 뉴클레오티드, 및 보다 특히 약 15 내지 약 35개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 프라이머는 의도하는 목적에 충분한 안정성을 가지는 듀플렉스 구조를 형성하기에 충분한 길이를 갖고 Tg mRNA의 뉴클레오티드 서열 부분에 상보성일 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 프라이머는 중합화제가 중합 조건하에서 표적 서열을 가지는 안정한 듀플렉스 형태를 이루는 프라이머로부터 복제를 연속적으로 수행하기에 충분한 길이를 갖고 표적 Tg mRNA에 상보적인 핵산 서열을 함유하여야 한다.
뉴클레오티드 프라이머 쌍을 위해 사용될 수 있는 한쌍의 핵산 서열은 서열 번호 3 및 4를 포함한다. 서열 번호 3은 5'AGGGAAACGGCCTTTCTGAA3'(서열 번호 3)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전방 프라이머이다. 서열 번호 4는 후방 3',CTTTAGC-AGC-AGAAGAGGTG5'(서열 번호 4)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 후방 프라이머이다. 서열 번호 3 및 4는 올리고뉴클레오티드 프라이머로 사용되는 경우, Tg mRNA의 엑손 1-5의 407 염기쌍 세그먼트를 증폭시킬 수 있다.
당업자들은 본 발명의 다른 올리고뉴클레오티드 프라이머가 서열 번호 3-4에 상보적인 핵산 서열, 서열 번호 3-4와 실질적으로 유사한 핵산 서열, 서열 번호 3-4에 상보적인 핵산 서열과 실질적으로 유사한 핵산 서열, Tg mRNA에 특이적으로 하이브리드화하는 서열 번호 3-4의 단편, Tg mRNA에 특이적으로 하이브리드화하는 서열 번호 3-4에 상보적인 핵산 서열 단편, Tg mRNA에 특이적으로 하이브리드화하는 서열 번호 3-4와 실질적으로 유사한 핵산 서열 단편 및 Tg mRNA에 특이적으로 하이브리드화하는 서열 번호 3-4에 상보적인 핵산 서열과 실질적으로 유사한 핵산 서열 단편을 포함할 수 있음을 알 수 있을 것이다. 핵산 서열이 Tg mRNA에 특이적으로 하이브리드화하고, Tg mRNA의 엑손 1-5를 특이적으로 증폭시키기만 한다면, 올리고뉴클레오티드 프라이머가 상기와 같은 다른 핵산 서열도 포함할 수 있음이 또한 이해될 것이다.
본 발명에 따른 Tg mRNA 올리고뉴클레오티드 프라이머를 형성하기 위해 사용되는 핵산은 Tg mRNA로부터 유래될 수 있다. 본 발명에 따른 Tg mRNA 올리고뉴클레오티드 프라이머는 당업계에 익히 공지된 방법, 예를 들어 화학 합성으로 생성될 수 있다. 프라이머는 수동적으로 또는 기계로 합성될 수 있다. 이들은 또한 바이러스 및 박테리아 프로모터가 도입된 산물을 이용하여 재조합 방법으로도 합성될 수 있다.
올리고뉴클레오티드 프라이머는 적어도 Tg mRNA 부분을 검출하기 위한 증폭 분석법에 이용될 수도 있다. 본 발명의 일 측면으로, 올리고뉴클레오티드 프라이머는 중합효소 연쇄반응(PCR) 분석법에 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 Tg mRNA 올리고뉴클레오티드 프라이머뿐 아니라 Tg mRNA 핵산에 상보적인 다른 핵산이 또한 RAPD 분석법 또는 다른 증폭 분석법과 같은 기타 분석법에서도 사용될 수 있음을 당업자들은 알 것이다.
증폭된 표적 뉴클레오티드 서열이 존재하는 경우, 이는 공지 정성화 및/또는 정량화 검출 기술, 예컨대 겔 전기영동으로 결정되는 제한 효소 소화 패턴의 가시화, 증폭된 표적 뉴클레오티드 서열의 시퀀싱, 올리고뉴클레오티드 하이브리드화 프로브를 가지는 증폭된 뉴클레오티드 서열의 검출을 이용하여 검출될 수 있다.
대상의 신체 샘플에서 검출된 Tg mRNA의 수술전(즉, 갑상선 절제술 전) 수준은 대상에서 갑상선 신생물을 분류하여, 즉, 갑상선 신생물이 양성인지 혹은 악성인지, 그리고 질병 수준을 결정하기 위한 단일 예정값 또는 예정값 범위와 비교될 수 있다. 시험 대상의 신체 샘플에서 예정값 또는 예정값 범위보다 높은 Tg mRNA의 수술전 수준은 대상이 악성 병소를 가진다는 지표일 수 있다. 시험 대상의 신체 샘플에서 예정값 또는 예정값 범위보다 낮은 Tg mRNA의 수술전 수준은 대상이 소포 샘종과 관련된 것과 같은 양성 갑상선 신생물을 가진다는 지표일 수 있다.
대상의 신체 샘플에서 검출된 Tg mRNA의 수술후 수준(즉, 갑상선 절제술 후)이 또한 갑상선암 재발에 대한 단일 예정값 또는 예정값 범위와 비교될 수 있다. 시험 대상의 신체 샘플에서 예정값 또는 예정값 범위보다 높은 Tg mRNA의 수술후 수준은 갑상선암 재발/잔류의 지표일 수 있다. 시험 대상의 신체 샘플에서 예정값 또는 예정값 범위보다 낮은 Tg mRNA의 수술후 수준은 갑상선암의 부재 및 대상으로부터 불필요한 수술 개입을 면할 수 있는 지표일 수 있다.
본 발명은 또한 핵산에 기초한 분석법에 의해 신체 샘플에서 Tg mRNA를 확인 및 검출하기 위한 키트에 관한 것이다. 키트는 적어도 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함한다. 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍은 예를 들어 Tg mRNA의 엑손 1-5로부터 인접 뉴클레오티드로 한정되는 표적 뉴클레오티드 서열을 증폭시키기 위해 사용될 수 있는 Tg mRNA에 특이적인 핵산 서열을 포함할 수도 있다.
본 발명의 일례로, 키트는 한쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함한다. 올리고뉴클레오티드 프라이머는 Tg mRNA의 엑손 1-5를 선택적으로 증폭시킬 수 있는 적어도 10개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 예로서, 올리고뉴클레오티드 프라이머는 서열 번호 3 및 4를 포함하는 핵산 서열을 가질 수 있다. 임의로, 키트는 또한 PCR 증폭 반응 및 올리고뉴클레오티드 프로브의 형광 검출을 개시하는데 필요한 시약의 하나 또는 전부를 함유할 수도 있다.
당업자들은 본 발명에 따른 방법에 변형이 가해질 수 있음을 이해하고 알 수 있을 것이다. 예를 들어, 본 발명의 방법이 FNA와 같은 당업계에 공지된 다른 검출 방법과 함께 이용될 수 있음이 이해될 것이다. 또한, 본 발명의 방법이 갑상선 암종을 치료하기 위해 사용되는 치료제의 효율을 모니터하기 위한 수단으로도 사용될 수 있음이 인정될 것이다. 이들 치료제는 갑상선 절제술 전, 후에 투여될 수 있다.
본 발명이 이후 실시예로 보다 상세히 설명된다. 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위해 제시된 것이고, 청구범위에 기술된 발명을 어떠한 방식으로도 제한할 의도는 없으며, 그렇게 해석되어서도 안된다.
실시예 1
갑상선 질환을 앓고 있는 환자의 말초 혈액내 TSH-수용체 mRNA 및 티로글로불린 mRNA 전사물의 검출: 갑상선에 대한 민감하고 특이적인 마커
정상 및 종양 갑상선 조직 둘 다에서의 티로글로불린 생산은 기능성 TSH 수용체(TSHR)의 존재에 좌우되며, TSH 수준에 영향을 받는다. 본 발명자들은 정상 대상과 갑상선암 및 양성 갑상선 질환 환자로부터의 말초 혈액에서 RT-PCR에 의한 TSHR-mRNA 및 Tg-mRNA 검출의 민감성 및 특이성을 조사하였다.
방법
대상
갑상선 질환 병력이 없는 51명의 정상 대상(여성:남성=1.7; 연령 범위 25-60세), 27명의 양성 갑상선 질환자(여성:남성=3.5; 연령 범위 18-77세) 및 75명의 분화된 갑상선암(DTC) 환자(여성:남성=3.2; 연령 범위 20-80세)를 포함한 총 153명의 환자를 평가하였다. 27명의 양성 갑상선 질환자중 3명의 환자가 갑상선염에 걸려 있고, 18명이 단발성 갑상선 결절 또는 다결정성 갑상선종에 걸려 있으며, 3명이 대치 T4 요법을 받고 있는 일차 갑상선 저하증에 걸려 있고, 3명이 그레이브스(Graves) 병에 걸려 있다.
DTC 환자중에서, mRNA 검사 적어도 1년전에 67(89%)명이 아전(near-total) 갑상선 절제술을 받았으며, 65(83%)명이 방사성 요오드(RAI) 절제를 받았다. 모두 유두상 갑상선암으로 새로이 진단된 나머지 8명의 환자가 갑상선 절제술 전에 검사를 받았다. 모든 DTC 환자는 클리브랜드 임상 재단의 내분비· 당뇨· 대사과에 외래환자로 방문하는 중에 평가되었다. 각 환자의 병력, 수술/병리학적 보고 및 실험실 및 방사선적 소견을 얻기 위하여 차트를 검토하였다.
75명의 갑상선암 환자의 병리적 상태, 질환 상태, 처치 상태 및 Tg 항체 상태를 표 1에 수록하였다.
| 처치 상태 | N | Tg Ab 양성 | 병리적 진단으로 조사된 환자수 (질환에 걸린 수) | ||
| 유두상 갑상선 암종 | 소포성 갑상선 암종 | 휘르트레 세포 갑상선 암종 | |||
| 치료: | |||||
| T4 요법 | 49 | 12 | 40(12) | 6(3) | 3(3) |
| T4 중단 | 7 | 2 | 6(1) | 1(0) | 0(0) |
| rhTSH 후 | 11 | 0 | 11(0) | 0(0) | 0(0) |
| 새로이 진단: | |||||
| 수술전 | 8 | 0 | 8(8) | 0 | |
| 총 | 75 | 14 | 65(21) | 7(3) | 3(3) |
T4 억제동안 49명, T4 중단후 7명 및 재조합 인간 TSH(rhTSH)(Thyrogen, Genzyme Transgenics Corp., Cambridge, MA)후 11명의 환자를 조사하였다. T4 요법중 평가된 49명의 환자중에서, 41명(86%)이 검사 당일로부터 12개월내에 진단학적 방사성-요오드 스캔을 받았고, 4명의 환자가 검사전 24-48개월내에 진단학적 방사성-요오드 스캔을 받았다; 이들은 모두 혈청 티로글로불린 측정으로 모니터되었으며, 스캔이 음성이고/이거나 Tg 수준이 검출가능하지 않다면 질병이 없는 것으로 간주되었다. 4명에게서는 스캔이 불가능하였으며, 이중 2명은 질환이 재발(1명은 폐로, 1명은 결절로 전이)되었고, 1명은 음성의 초음파검사 및 림프절 생검을 보였다; 나머지는 일련의 혈청 Tg 수준이 검출불가능하였으며 질환 징후를 보이지 않았다. 다른 영상화 절차 및 병리적 소견으로 질환이 전이된 것으로 밝혀진 3명을 제외하고, 마지막 전신-스캔(WBS)후 RAI 요법을 받은 환자는 없었다.
수술 당일로부터 다양한 간격으로 TSHR 및 Tg mRNA를 위한 혈액 샘플을 수집하였다. 면역-화학발광-측정 분석법(ICMA)로 TSH(Roche Diagnostics NJ) 및 Tg(Quest Diagnostics CA)의 동시 혈청 수준을 측정하였으며, 민감성은 1.0 ㎍/ℓ로 정해졌다. 효소 면역분석법(EIA; Tosoh Medics Inc. CA)에 의해 대부분의 환자에서 Tg 항체를 또한 측정하였다. T4 요법동안 검사된 환자에서 1.0 ㎍/ℓ 이상의 Tg 값 및 rh-TSH 투여후 또는 T4 중단후 검사를 받은 환자에서 2.0 ㎍/ℓ 이상의 Tg 값이 추적 WBS(24)에 대해 유의적인 지표로 간주되었다. T4 억제된 환자는 모두 TSH 값이 1.0 mU/ℓ 미만(61%는 TSH가 0.1 미만이었다)이었으나, 5명에서는 TSH가 1.0-2.8 mU/ℓ이었다. T4 중단후 조사된 모든 환자는 1명을 제외하고(TSH = 19 mU/ℓ), TSH 값이 30 mU/ℓ이었다.
RAI 스캐닝 절차는 추적량(lOO μCi)의 131I 투여 24 시간후 목 흡수 및 5 mCi 량의 131I 투여 48 시간후 수득한 진단 WBS의 측정을 포함하였다. rh-TSH(이틀간 근육내로 0.9 mg)후 검사된 환자에게 5 mCi 량의 131I를 투여하고, 24 시간후 이차량의 rhTSH를 투여한 다음, 48 시간후 WBS를 투여하였다. TSH/Tg mRNA 및 Tg 측정을 위한 혈액 샘플을 스캔전 동시에 채취하였다. 핵의학자가 스캔을 검토하고 갑상선 층에 흡수된 것이 가시화되고/되거나 131I가 정상적으로 흡수되지 않는 부위에 별개의 국소 흡수가 존재하는 경우 양성인 것으로 간주하였다. 양성 WBS 또는 병리로 진단되거나 다른 비방사성 요오드 영상화 양식으로 관찰된 질환을 가지는 경우, 환자를 질환 징후를 갖는 것으로 분류하였다.
RT-PCR
약 3-5 ㎖의 전혈(EDTA-처리된 튜브에 수집)을 동 부피의 pH 7.4 PBS와 혼합하고, 8 ㎖의 Ficoll(Pharmacia)을 층화한 후, 4 ℃에서 400 × g으로 20분동안 원심분리하였다. 단핵 세포층을 수집하여 세척하고, 펠렛화하였다. 제조자 지시에 따라 트리졸(Trizol) 시약(Invitrogen CA)을 이용하여 RNA를 분리하였다. A260/280의 광밀도비를 이용하여 분리된 RNA의 질 및 양을 평가하였다. Superscript 사전 신호증폭 시스템(Invitrogen CA)을 사용 설명서에 따라 이용하여 1-2 ㎍의 전체 RNA를 cDNA로 역전사시켰다.
선택한 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하였다. 프라이머 서열은 다음과 같다:
TSHR: 전방 5'GCTTTTCAGGGACTATGCAA-TGAA3'(서열 번호 1); 및 후방 3'AGAGTTTGGTCAC-AGTGACGGGAA5'(212bp)(서열 번호 2);
Tg: 전방 5'AGGGAAACGGCCTTTCTGAA3'(서열 번호 3); 후방 3',CTTTAGC-AGC-AGAAGAGGTG5(407 bp)'(서열 번호 4);
글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제(GAPDH)의 도처에서 발현되는 조절 유전자를 또한 분석하여 RNA 추출, 및 상술된 프라이머를 이용한 RT 및 PCR 반응의 성공여부를 확인하였다. PCR을 38 사이클(94 ℃에서 1 분(최초 사이클은 2 분), 62 ℃에서 1 분, 72 ℃에서 1 분(마지막 사이클은 10 분))로 수행하였다. RT-PCR 산물을 2% 겔 전기영동상에서 분리시키고, 에티듐 브로마이드 염색으로 가시화하였다. 갑상선암 조직 RNA를 정상 말초 혈액 단핵 세포로부터 얻은 RNA로 일련의 희석을 행하여 상기 분석법에 대한 추정 민감도를 조사하고, 약 10 암 세포/혈액 ㎖임을 확인하였다.
통계학적 분석
데이터를 재발/잔류 갑상선암의 검출을 위한 TSHR mRNA 및 Tg mRNA, 혈청 Tg 및 WBS의 진단 민감성 및 특이성에 대해 분석하였다. 피셔의 정밀 검증(Fisher Exact Test)을 이용하여 마커간의 민감성 및 특이성을 비교하였다. P<0.05를 유의적인 것으로 간주하였다.
결과
정상 대조군 및 양성 갑상선 질환에서 TSHR-mRNA:
결과를 표 2에 나타내었다. 51명의 모든 정상 대조군은 TSHR 및 Tg-mRNA 둘 다에 음성이었다. 양성 갑상선 질환자에서, 15명의 갑상선 결절 환자를 포함하여, 27명중 24명(89%)이 TSHR 및 Tg-mRNA 둘 다에 음성이었다. 3명의 양성 환자중에서, 2명이 광범위 폐쇄성 갑상선종(100 및 300 g, 10×8×3 cm 및 11×11×5 cm)에 걸렸고, 나머지 환자는 소포 샘종에 걸렸다. 3명의 모든 환자에 대한 진단을 외과 병리학으로 확인하였다.
| 대상 | N | 양성 수(%) | ||
| TSHR mRNA | Tg mRNA | 혈청 Tg* | ||
| 정상 양성 갑상선 질환자 질환 징후를 보이지 않는 TC 환자 | 51 27 48 | 0 3(11)** 1(2) | 0 3(11)** 4(8.5) | NA† NA† 2(4) |
| 총 양성/총(특이성%) | 4/125(97%) | 7/125(94%) | ---- | |
* T
4
요법시에 1 ㎍/ℓ 이상; T
4
중단 또는 rh TSH후 2 ㎍/ℓ 이상의 컷오프 이용.
** 2명의 광범위 폐쇄성 갑상선종 환자 및 1명의 소포 샘종 환자.
†NA = 적용 불가능
갑상선암 환자에서 TSHR mRNA
도 1은 9명의 갑상선암 환자, 1명의 정상 대상 및 양성 갑상선암 대조군에서 얻은 TSHR(212 bp), Tg(407 bp) 및 GAPDH(397 bp)를 위한 대표적인 RT-PCR 산물을 나타낸다. 표 3은 67명의 기존 처치된 DTC 환자 및 수술 절개전 DTC 검사를 받은 8명의 환자에서 얻은 결과를 나타낸다.
| 환자 | (N) | 양성 수(%) | |||
| TSHR mRNA | Tg mRNA | Tg | I131 스캔 | ||
| 처치: | |||||
| T4 억제시 - 원격 전이 - 국소 전이 - 질환없음 T4 중단후 - 국소 전이 - 질환없음 rh-TSH후 - 질환없음 | 8 10 31 1 6 11 | 8(100) 10(100) 0(0) 1(100) 1(17) 0(0) | 8(100) 10(100) 2(6) 1(100) 1(17) 1(9) | 8(100) 9(90) 0) 1(100) 1(17) 1(9) | 6(75) 6(75)** 0(0)*** 1(100) 0(0) 0(0) |
| 비처치: | |||||
| - 수술전 | 8 | 6(75) | 6(75) | NA† | NA† |
* T
4
요법시에 1 ㎍/ℓ 이상; T
4
중단 또는 rh TSH후 2 ㎍/ℓ 이상의 컷오프 이용.
** N = 8; *** N = 29; †NA = 적용 불가능
T4 요법동안 49명의 TC 환자가 검사를 받았다. 이들 환자중 8명이 원격 전이되었으며, 10명이 국소 재발되었거나, 목림프절 질환을 가졌으며, 나머지 31명은 질환을 보이지 않았다. 표 3은 TSHR-mRNA, Tg-mRNA, 혈청 Tg 수준 및 WBS로 얻은 양성%를 나타낸다. TSHR 및 Tg-mRNA는 둘 다 원격 전이 또는 국소 질환을 가진 모든 환자에서 양성이었다. 또한, T4 억제동안 질환이 재발된 1명을 제외한 모든 환자에서 혈청 Tg가 검출되었다. 7명의 소포 암 환자중 3명 및 질환 징후가 있는 3명의 모든 휘르트레 세포 암 환자는 TSHR 및 Tg-mRNA 둘 다에 양성이었다.
질환 징후를 보이지 않는 31명의 환자중에서, TSHR mRNA는 누구에게서도 검출되지 않았고, Tg-mRNA는 2명(6%)에게서 검출되었다. 이들 두 환자는 혈청 Tg 값 및 음성 WBS를 검출할 수 없었으며, 1년 추적후 질환이 없는 상태로 남아 있었다.
T4 중단후 7명의 환자가 검사를 받았다. 1명은 WBS 상에 국소 재발 징후를 보였으며, TSHR 및 Tg-mRNA 둘 다에 양성이었다. WBS 상에 징후가 없는 6명의 환자중에서, 1명이 TSHR 및 Tg-mRNA 둘 다에 양성이었으나, T4 중단후 혈청 Tg 값을 검출할 수 없었다. 다른 환자는 중단후 혈청 Tg 값이 55.5 ng/㎖(음성 항체; TSHR 및 Tg mRNA에 대해 음성)이었으나, T4 요법시 1년후 검출불가능한 Tg 값, 음성 WBS 및 음성 갑상선 초음파를 나타낸 것으로 밝혀졌다. 이와 같이 분리된 고 Tg 수준의 이유는 명확치 않다.
rh-TSH 후 11명의 환자가 검사를 받았다. 질환 징후를 보이는 환자는 없었다. 1명은 Tg-mRNA에 양성이었으나 TSHR mRNA 및 WBS에 음성이었다. 이 환자는 혈청 Tg 값이 rh-TSH 후 2.3 ng/㎖ 이었다. 1년후, 아무런 처치도 하지 않았음에도 불구하고 rh-TSH 후 혈청 Tg는 검출할 수 없었다. 갑상선 중단후 후속 WBS 및 3회 연속 Tg 수준은 그때까지 음성이었으며, 환자는 질환 징후를 보이지 않는 것으로 간주되었다.
항-Tg 항체를 가지는 환자에서 Tg-mRNA:
DTC 환자중 14명(21%)이 항-Tg 항체를 가졌다. 14명의 환자중 11명은 질환 징후를 보이지 않았으며; 모두에게서 혈청 Tg 수준은 검출할 수 없었고(측정된 값은 Tg 항체의 존재시에 거짓의 낮은 값을 나타내었다), 모두 TSHR mRNA에 대해 음성이었다. 3명의 국소 질환 환자는 혈청 Tg에 대해 음성인 1명을 포함하여, 모두 TSHR 및 Tg mRNA에 대해 양성이었다.
TSHR mRNA의 진단 성능
표 4에 TSHR mRNA의 진단 성능 특성을 요약하여 나타냈으며, 이들을 Tg mRNA, 혈청 Tg 수준 및 WBS와 비교하여 질환의 재발/전이를 검출하였다.
표 4
기존 처치된 갑상선암 환자에서 TSHR mRNA, Tg mRNA, 혈청 Tg 수준 및
131
I 흡수/WBS의 진단 성능
| 환자 | 양성 수/총 (%) | |||
| TSHR mRNA | Tg mRNA | 혈청 Tg | 131I 흡수/WBS | |
| 질환 증후 질환 증후 없음 | 19/19(100) 1/48(2) | 19/19(100) 4/48(8) | 18/19(95) 2/48(4) | 13/17(76) 0/46(0) |
| TSHR mRNA와 일치성 | 64/67(95) | 64/67(95) | 59/63(94) | |
| 진단 성능 | ||||
| TSHR mRNA | Tg mRNA | 혈청 Tg | 131I 흡수/WBS | |
| 민감성 특이성 PPV NPV 효율 | 100% 98% 95% 100% 98% | 100% 92% 83% 100% 94% | 95% 96% 90% 96% 94% | 83% 100% 100% 94% 95% |
이들 마커에는 통계적으로 유의적인 차가 없었으며, TSHR-mRNA 및 Tg-mRNA는 둘 다 질환 잔류/재발 검출에 대한 민감성이 동일하였다(P=0.209, 피셔의 정밀 검증). 2명의 NED 환자(음성 스캔후 검출불가능한 Tg 수준)에서 혈청 Tg 수준이 상승하였으나, T4 중단후 1명 및 rh-TSH후 다른 1명은 TSHR-mRNA 및 Tg-mRNA 둘 다에 음성이었다. WBS는 4명의 환자에게 수행되지 않았으며, 질환 징후가 있는 3명의 환자(2명은 폐로 전이, 1명은 결절로 전이됨)(민감성 = 82%)에서는 음성이었다. TSHR-mRNA와 Tg-mRNA 및 TSHR-mRNA와 혈청 Tg(Tg 항체 음성 환자에서) 사이에 일치성은 양자 모두 95% 이었다.
검토
본 발명의 보고에 따른 주요 결과는 혈액내 TSHR-mRNA 시그널의 존재가 갑상선암 환자에 특이적이며, 이는 건강한 대상 및 대부분의 양성 갑상선 질환자에서는 검출되지 않는다는 것이다. 또한, 본 발명자들은 면밀히 선택된 프라이머가 분석법에 사용되는 경우, 갑상선암에 대한 Tg-mRNA의 고 특이성을 입증하였다. 갑상선 암종은 기능성 TSH 수용체를 함유하는 것으로 알려졌다. 지금까지, 이 표적은 순환 암 세포 검출을 위해 모색되지 않았으며, 아마도 이는 말초 혈액 단핵 세포 및 다른 갑상선외 조직에서 TSHR-mRNA 전사물의 존재를 보여주는 기존의 보고 때문인 것으로 보인다. 갑상선외 조직내 이들 전사물의 발견은 TSHR 스플라이스 변이체로 설명될 수 있다. 따라서, 갑상선 세포에 특이적인 프라이머의 선택은 분석법에서 가장 중요하다.
본 시리즈에서 TSHR과 Tg mRNA 사이에 고도의 일치성이 있었다. 이들 Tg-mRNA 발견은 대부분의 정상 대상에서 Tg-mRNA 시그널을 검출하는 정성적 및 정량적 RT-PCR을 이용하는 다수의 기존 연구와 차이를 보인다. 상술한 바와 같이, 이러한 차이는 방법에서 분석법 민감성 또는 다른 변수의 차이라기 보다는 프라이머 쌍의 선택에 의한 것일 가능성이 가장 크다. 실제로, 본 발명자들은 문헌에 기술된 일부 프라이머 쌍을 사용하여서도 대조군에서 시그널을 검출하였다. 특정 프라이머 쌍을 이용하는 경우, 위유전자의 증폭은 가양성 결과를 제공할 가능성이 있다. 이러한 불일치를 설명할 수 있는 보다 가능성 있는 답변은 선택된 프라이머에 의해 증폭된 대안 스플라이스 변이체를 검출할 수 있는 능력에 PCR에 기초한 기술이 제한적이라는 것이다.
다른 연구자들이 양성 갑상선 질환자에서 Tg mRNA 양성도 발생율이 매우 높다고 보고한 반면(20-33%), 본 발명자들은 27명의 환자에서 3명(11%) 만이 가양성 결과를 보인다고 보고하였다. 이들 가양성자중 1명은 외과 병리학에서 소포 샘종을 가지는 것으로 밝혀진 환자였다. 소포 샘종과 소포 암종의 차이는 현재 수술 절제 및 표면적인 조직학적 검사후에나 가능하다. 소포 암과 마찬가지로, 상당한 수의 소포 샘종이 Ras 돌연변이를 지니고, 갈렉틴-3 면역-염색을 나타내기 때문에, 아직까지도, 소포 샘종과 확실한 암을 구분할 수 있는 것으로 알려진 마커는 없었다. 따라서, 소포 샘종 환자에서 순환 갑상선 세포의 발견은 일부 소포 샘종이 소포 암종의 악성전 단계를 나타낼 수 있다는 생각에 견주어지며, 이를 뒷받침 한다. 다른 두 가양성이 광범위 갑상선종 환자에 존재하였으며, 이는 이러한 환자가 순환 갑상선 세포를 가질 수도 있음을 제시하는 것이다. 또한, 잠재 DTC가 병리학적 조사에서 간과될 수도 있다. 여하튼, 대부부의 다른 양성 결절은 음성이고, 수술전 검사된 8명의 DTC 환자중 6명이 양성이었기 때문에, 이 검사는 수술전 양성 갑상선 결절로부터 암의 감별 진단에 사용될 여지가 있다.
우리의 결과는 RT-PCR에 의한 TSHR-mRNA가 재발 또는 전이 갑상선암을 위해 환자를 모니터하는데 매우 민감하면서 특이적인 마커로 사용된다는 것을 제시한다. 우리의 데이터는 또한 환자가 T4 억제 요법을 받는 동안 대부분의 재발 질환을 검출하기 위하여 혈청 Tg 수준이 고도로 민감하고 신뢰성이 있음을 보여준다. 따라서, RT-PCR 분석법이 제 일선의 검사 수단으로 혈청 Tg 수준에 대한 비용 효율적인 대안임을 입증할 수 없었다. 그의 값은 간섭 Tg 항체, 친화성 항체 또는 다른 인자의 존재로 인해, Tg 측정을 신뢰할 수 없는 환자에 집중되어 있다. 우리의 시리즈에서, TSHR mRNA 또는 Tg mRNA가 T4 요법동안 또는 갑상선 호르몬 중단후 검사된 국소 또는 원격 전이된 모든 환자에서 검출되었다. 이들 환자에서 혈청 Tg 수준은 양성 mRNA 검사로 WBS가 필요할 것으로 보이는 1명(Tg 항체 양성)을 제외한 모두에서 상승되었다(≥ 2.0 ng/㎖). 또한, 음성 TSHR 또는 Tg-mRNA 시그널의 관찰에 따라 두 Tg 양성 환자 및 질환 징후를 보이지 않는 모든 Tg 항체 양성 환자에서 WBS 시행을 막을 수 있다.
질환 징후를 보이지 않는 48명의 DTC 환자중에서, TSHR mRNA는 Tg mRNA(8%) 보다 덜 양성(2%)이었다. 혈청 Tg 수준 및/또는 WBS로 확인한 바, 1년 추적시 이들 양성 환자중 누구도 질환을 갖지 않았다. 그럼에도 불구하고, 이들 환자는 Tg-mRNA 분석법에 의해 초기 검출되는 현미경적 질환을 보유할 수도 있기 때문에, 주의하여 모니터할 필요가 있다.
유두상 암종 환자에서만 Tg mRNA가 발견되고 다른 조직학적 타입에서는 발견되지 않는다는 기존의 보고와 달리, 본 발명자들은 종양 조직학에 기초하여 Tg 또는 TSH mRNA 결과에 차이를 발견하지 못했다. 우리의 환자중에서, 7명의 소포 암종 환자중 3명 및 질환 징후를 보이는 3명의 모든 휘르트레 세포 암종 환자가 TSHR 및 Tg-mRNA 둘 다에 양성이었다.
요약하면, 말초 혈액내 TSHR-mRNA 또는 Tg mRNA의 존재는 잔류/재발 DTC 질환의 존재에 특이적이며, Tg 항체-음성 환자 모니터시에 혈청 Tg 만큼 민감하다. 그러나, 혈청 Tg 값을 신뢰할 수 없는 Tg 항체-양성 환자에서, TSHR-mRNA 또는 Tg mRNA 정보 조사는, mRNA 음성 환자에서 WBS의 필요성을 없앴기 때문에 보다 비용 효율적인 것으로 입증되었다. 더우기, 수술전 갑상선암을 검출할 수 있는 우리의 예비 지식과 mRNA 검사의 고도의 특이성을 조합할 수 있음은 갑상선 결절 환자를 스크리닝하는데 잠재적인 역할을 할 수 있음을 제시하는 것이다.
실시예 2
말초 혈액내 티로트로핀 수용체/티로글로불린 메신저 리보핵산 및 가는 바늘 흡인 세포검사: 갑상선암 검출의 진단 상승효과
환자 및 방법
환자
내분비 외과 진료소에 의뢰되어 양성 또는 악성 갑상선 질환으로 진단되거나, 아직 악성 가능성이 있는 것으로 결정되지 않은 총 72명의 연속 환자가 임상 시험 심사 위원회(Institutional Review Board)로부터 승인받아 연구에 등록되었다. 72명의 모든 환자로부터 수술전 실험실 검사동안 또는 수술 당일에 수술전 샘플을 채취하였다. 초음파 안내 FNA 생검을 관례적인 진단 후처리로서 72명의 환자중 46명에게서 실시하고, 본 연구소에서 실시되지 않는 경우에는, 세포검사 슬라이드를 입수하여 갑상선 세포검사에 전문적인 경험이 풍부한 병리학자가 검토하였다. FNA 샘플 적절성 기준은 충분한 수의 세포, 충분한 콜로이드, 및 각각 적어도 10개의 세포로 구성된 양성 소포 세포의 적어도 6 그룹의 존재를 포함한다. 결과를 최종 수술후 병리학적 진단과 비교하였다.
RT-PCR
상기 실시예 1에 상세히 기술된 방법이 이용되었다. 요약하면, 5 ㎖의 정맥 혈액을 수집하고, 수집 24시간후, 피콜 하이팩(Ficoll Hypaque) 구배를 이용하여 단핵 세포를 분리하였다. 피콜 분리후 즉시 트리졸 시약(Life Technologies, Carlsbad, CA)을 사용하여 단핵 세포로부터 RNA를 분리하고, 1 ㎍을 Superscript II 사전 신호증폭 시스템(Life Technologies)으로 역 전사시켰다. 상기 언급된 문헌에 기술된 바와 같이, 특이성(변칙적 전사 없음)에 기초해 면밀히 선택한 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하였다. PCR을 총 38 사이클(94 ℃에서 1 분(최초 사이클은 2 분), 62 ℃에서 1 분, 72 ℃에서 1 분(마지막 사이클은 10 분))로 수행하였다. 갑상선암 조직 및 말초 혈액 샘플(DTC 환자)로부터의 RNA와 함께 생성된 PCR 산물을 BigDye Terminator v3.1 시퀀싱 키트를 이용하여 ABI-PRISM 310 유전자 분석기(Applied Biosystems, Foster City, CA)로 시퀀싱하였다. 전사물의 서열이 TSHR mRNA 서열과 일치하여 진정 수용체 mRNA의 존재를 확인하였다. 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제를 성공적인 RNA 추출 및 전사와 PCR을 위한 대조군으로 사용하였다. RT-PCR 산물을 2% 겔 전기영동상에서 분리시키고, 에티듐 브로마이드 염색으로 가시화하였다. Gel-doc 1000(Bio-Rad, Hercules, CA) 시스템 및 소프트웨어를 이용하여 겔 이미지를 "촬영 모드" 자동화 세팅(조정/노출 시간, 0.2초)으로 캡쳐하였다.
데이터 분석
TSHR mRNA 및 FNA 결과를 최종 병리학적 진단과 비교하였다. TSHR/Tg mRNA 또는 FNA 단독 또는 이들의 조합으로 정확히 분류된(진단 정확성) 환자의 수를 산정하고, x 2 검정으로 비교하였다.
결과
총 72명의 환자가 조사에 참여하였다(61명의 여성 및 11명의 남성; 연령 범위, 18-88세; 평균 50세). 이들 환자중 46명은 수술전 FNA 생검이 실시되었다. 수술후 병리학적 진단을 이용하여 환자를 양성 및 악성 갑상선 질환 그룹으로 분류하였다(표 5). 초기 진단에 61명의 환자(25명 DTC 및 36명 양성)가 입회하였다(이전에 갑상선 수술을 받지 않음). 11명의 환자가 입회시에 재발 또는 잔류 악성 질환을 지녔고, 이들중 10명에는 방사성 요오드 절제가 실시되었다.
| 갑상선암 | 양성 갑상선 질환 | ||
| 암 병력/수술 | 양성/총 | 병리학적 진단 | 음성/총 |
| 유두상 갑상선 단일 갑상선 + LN LN/목 절개 소포 암종 갑상선 + LN LN/목 절개 양성/총(민감성%) | 26/33(79%) 9/13 7/10 10/10 3/3(100%) 2/2 1/1 29/36(80%) | 갑상선 샘종 소포성 휘르트레 세포 MNG/결절 그레이브스/갑상선염 음성/총(% 특이성) | 5/8(62.5%) 4/6 1/2 17/20(85%) 7/8(87.5%) 29/36(80%) |
LN, 림프절
Tg 및 TSHR mRNA에 대한 RT-PCR 결과는 100% 일치하였다. 도 1은 7명의 환자에서 TSHR(212 bp) 및 Tg(408 bp)에 대한 대표적인 RT-PCR 산물을 나타낸다. 36명중 29명(민감성 80%)의 암 환자 및 36명중 7명(특이성 80%)의 양성 질환 환자를 포함하여, 총 36명의 환자가 RT-PCR에 의해 양성을 나타내었다. 초기 진단된 25명의 환자중에서, RT-PCR에 의해 19명이 양성이었다(민감성 72%)(표 5). 모든 가음성은 유두상 갑상선 암종(PTC)의 병리학적 진단을 받았으며, 3명의 림프절 전이 환자를 포함하였다. 가양성은 2명의 소포 샘종 환자(FA), 1명의 휘르트레 세포 샘종 환자, 1명의 증식 호산성 결절 환자 및 3명의 매우 큰 다결정성 갑상선종(MNG) 환자를 포함하였다.
46명의 FNA 환자중에서, 22명이 외과적으로 확인된 DTC를 지녔다. 이들 22명중 18명(82%)이 PTC에 대한 명확한 FNA 결과를 가졌으며, MNG에서 2명의 PTC 및 2명의 소포 암종(FC)을 포함한 4명의 환자가 충분한 검체를 지녔으나, 확정적이지 않은 결과를 나타내었다. FNA를 거쳐 외과적으로 양성 질환으로 확인된 24명의 환자중에서, 9명은 명확히 양성(3명의 광범위 MNG 환자 포함)이었으며, 14명은 충분하지만 확정적이지는 않았다(표 6). 46명중 총 18명(39%)의 환자가 검체는 적당하지만, 확정적이지 않은/불확실한 FNA 생검 결과를 나타내었다. FNA의 진단 민감성은 82% 이었으나, 총 진단 정확성(효율)은 61% 밖에 되지 않았다. 결과를 표 6에 요약하여 나타내었다.
PPV, 양성 예측값; NPV, 음성 예측값.
α 적당한 샘플이나 비진단성 FNA.
b 음성군으로 4명의 불확실한 FNA 환자를 이용하여 계산.
c 많은 수의 비진단성 FNA로 인해 계산되지 않음.
세포학적 진단을 할만한 충분한 샘플에 대해 FNA가 불확실한 경우(18명의 환자), RT-PCR은 4명의 암 환자중 3명 및 14명의 양성 질환 환자중 11명을 정확히 분류하였다(민감성 75%; 특이성 78%). MNG에서 PTC 병소를 가지는 1명의 환자만이 음성이었다(가음성). FNA가 모호한 이들 18명의 환자에 대한 실제 FNA 결과 및 RT-PCR 결과를 도 3에 요약하였다. RT-PCR 및 FNA에 대한 조합 진단 민감성(95%) 및 진단 효율(89%)은 FNA 단독의 경우보다 유의적으로 높았다(P = 0.001).
검토
본 조사에서, FNA 생검물의 39%가 불확실하였다. 전술한 보고에 따라, 이들 대부분(78%)은 실제로 양성 조직학을 가지는 것으로 밝혀졌다. 이들 불확실한 갑상선 결절은 내분비학자 및 내분비 외과의를 상당히 좌절시키고 도전하게 하는 영역중 하나인 것으로 보인다. 대부분의 연구는 FNA에 의해 행해지는 진단 정확성을 개선시키기 위한 수단으로서 분자 마커 또는 마커 조합을 확인하기 위한 FNA 재료에 촛점을 맞추었다. 갑상선 결절을 나타내는 환자에서 수술전 악성 가능성을 판단할 수 있는 신뢰할만하면서 만족할만한 방법은 아직까지 제안되지 않았다.
본 발명의 결과는 순환 수술전 TSHR/Tg mRNA가 FNA의 진단 정확성을 향상시키기 위한 보조 검사로 작용하고, FNA가 불확실한 결절의 78%(14/18)를 정확하게 분류할 수 있음을 제안한다. 불확실한 FNA 그룹중에서 TSHR/Tg mRNA를 가지는 3명의 가양성 환자 및 1명의 가음성 환자만이 존재하였다. FNA 세포검사는 PTC에 고도의 민감성을 가지는 것으로 인정되고 있다. 또한, 본 시리즈에서 FNA는 모호한 결과를 가지는 단 2명의 환자를 제외하고는 모든 환자를 정확히 확인하였다. 이와 대조적으로, RT-PCR은 PTC에 상대적으로 낮은 민감성을 가지며, 림프절 전이를 포함하여, 7명의 환자에서 음성이었다. 이들 가음성 결과를 반영하는 요인은 현재 명확히 밝혀지지 않았으며, 기술적 오차 및 표본 문제를 포함할 수 있거나, 이들은 PCR의 비특이적인 저해제 또는 불충분한 역 전사와 관련이 있을 수 있다. 제 2 PCR을 이용하여 반복 분석이 동일한 결과를 제공하였기 때문에, 이들 요인중에서 기술적 오차는 덜 관여할 것으로 보인다. 역 전사 또는 PCR의 효율이 이 분석법에 제한 요인일 수 있는 것으로 보여, 이들 요인이 현재 우리 실험실에서 조사되고 있는 중이다.
한편, 기대한 바와 같이, FNA는 FC와 FA를 구분하지 못했다. 이 조사에는, 7명의 소포 신생물 환자가 포함되었으며, FNA는 1명을 제외한 모두에 비진단성이었다. 따라서, 소포 신생물은 불확실하거나 소포 패턴화 갑상선 병소로 함께 분류되기도 하며, 상당한 수의 FNA 및 불필요한 진단 갑상선 엽절제술을 요한다. 지금까지, 상당한 수의 FA가 FC와 마찬가지로 Ras 돌연변이를 보유하여 갈렉틴-3-면역 염색을 나타내기 때문에, 확실한 암으로부터 FA를 구분할 수 있는 마커는 알려지지 않았다. 일부 FA가 전암 단계의 FC를 나타낼 수도 있다고 제안되었다. 본 발명자들은 소포성 및 휘르트레 세포 암을 포함하여, 조직학적 타입에 관계없이 모든 DTC 환자에서 재발/잔류 질환을 검출하는데 순환 TSHR mRNA의 고도의 민감성을 입증하였다. 본 조사에서는, 이러한 검사로 양성군으로 FC 두 환자 및 음성군으로 5명의 FA중 3명을 검출하여 7명중 5명의 소포성 신생물을 정확히 분류하였다. 이 시리즈에서 소포 신생물 수가 적기는 하지만, 결과는 FA로부터 FC를 구분하고, 미래 조사에 다수의 환자를 확증하는 것에 대해 TSHR mRNA의 잠재력이 높음을 제시한다. 두 FA 외에, 다른 가양성군은 주로 휘르트레 세포 타입의 증식성 결절을 가진 1명의 MNG 및 매우 큰 MNG를 가지는 3명의 환자이었으며, 이는 이들 환자가 순환 갑상선 세포도 가질 수 있음을 제시하는 것이다. 이는 갑상선 결절에서 높은 증식 활성의 존재에 기인할 수 있거나, 또는 잠재 DTC가 존재하고 병리학적 조사에서 간과될 가능성도 있음을 나타낸다.
결론적으로, 본 결과는 순환 TSHR/Tg mRNA가 초기 진단에 FNA 보다 PTC를 검출하는데 민감성이 낮음을 보여준다. 그러나, TSHR/Tg mRNA는 FNA에 의해 종종 놓치는 FC 검출을 보장한다. 그의 가치는 모호한 FNA 환자중에서 양성 갑상선 질환을 확인하는데 있다. 종합적으로, 이는 양성 질환으로부터 갑상선암을 확인하는데 FNA에 유용한 보조물로 제공될 수 있다.
실시예 3
갑상선 결절 질환에 걸린 환자에서 악성 종양의 수술전 진단을 위한 말초 혈액내 TSHR mRNA에 대한 증강된 정성적 및 정량적 RT-PCR 분석법의 임상적 평가
본 조사에서는, 외과적 절개로 갑상선암으로 새로이 진단된 각 환자 및 갑상선 결절에 대한 FNA를 받은 연속 환자에 대해 수술전 및 수술후에 TSHR 수준을 검출하여 정량화하고, 보다 민감한 정성적 및 정량적 RT PCR 분석법을 이용하여 유망한 분자 마커의 임상 유용성을 알아보기 위한 연구를 계속하였다.
말초 혈액에서 TSH 수용체 mRNA의 보다 민감한 정량적 결정이 암 세포 검출을 보다 향상시킬 수 있다는 가설을 세웠다. 갑상선 FNA 생검과 조합되는 경우, 이는 갑상선 결절을 양성 및 악성 병소로 보다 정확히 분류하게 될 것이다. 또한, 정량적 수준은 수술전 질환 정도의 지표가 될 수 있으며, 수술후 질환의 잔류/전이에 대한 마커로 제공될 수 있다. 이는 갑상선 수술에 대한 환자의 선택성을 보강시키며, 이에 따라 많은 환자들로부터 불필요한 외과적 개입을 예방할 수 있도록 한다.
재료 및 방법
혈액 수집/단핵 세포 및 순환 상피 세포의 분리
6 ㎖ 정맥 혈액을 얼음에 놓인 EDTA-처리 튜브에 수집하고, 가능한 신속히 처리하였다. 전혈을 동 부피의 pH 7.4 PBS와 혼합하고, 15 ㎖ 폴리스티렌 튜브에서 8 ㎖의 Ficoll(Pharmacia)로 층화하였다. 샘플을 4 ℃에서 400 × g으로 20분동안 원심분리하였다. 단핵 세포층을 수집하여 pH 7.4 PBS로 세척하고, 펠렛화하였다.
RNA 추출
제조자 지시에 따라 트리졸 시약(Life Technologies)을 이용하여 RNA를 분리하였다. 요약하면, 트리졸 시약을 단핵 세포 펠렛에 첨가하고, 실온에서 5분간 인큐베이션하였다. 그후, 클로로포름 추출을 수행하였다. 수성상중의 RNA를 이소프로판올로 침전시키고, 75% 에탄올로 세척한 후, 건조시킨 다음, DEPC로 처리된 물에 재현탁시켰다. A260/280의 광밀도를 이용하여 분리한 RNA의 질 및 양을 평가하였다.
증강된 정성적 1 단계 역 전사(cDNA 합성) 및 PCR
Platinum® Taq DNA 중합효소(Invitogen Inc)와 Superscript III 1 단계 RT-PCR 시스템을 제조자의 지시에 따라 사용할 것이다. 예비데이터는 보다 효율적인 RT 시스템을 사용하는 경우 기존의 Superscript II 2 단계 절차 사용에 비해 민감성을 상당히 증진시킴을 보여준다. 요약하면, 1 ㎍의 전체 RNA, 10 μM의 프라이머, Superscript III RT/Platinum® Taq 고 정확성 효소 믹스(1 ㎕) 및 25 ㎕의 가압 멸균 증류수를 함유하는 25 ㎕ 반응 혼합물이 열순환기에 도입될 것이다. 1차 사이클은 cDNA 합성 및 사전변성을 위해 가동되며, 55 ℃에서 30분 및 이후 94 ℃에서 2분간으로 구성될 것이다. PCR은 94 ℃에서 15초동안 변성, 60 ℃에서 30초동안 어닐링 및 68 ℃에서 1분동안 확장의 40 사이클로 수행되며, 반응은 70 ℃에서 5분에 종결될 것이다.
실시간 PCR 분석법
1 단계 "Quantitech Syber Green RT-PCR" 절차 및 퀴아겐사(Qiagen Inc. CA)로부터 입수한 시약이 사용될 것이다. 요약하면, 25 ㎕의 SYBR Green RT-PCR 마스터 믹스, 2 μM(l ㎕)의 각 프라이머 및 500 ng(0.5 ㎕)의 RNA 템플레이트가 PCR 튜브에 첨가될 것이다. 열 순환기가 cDNA 합성을 위해 50 ℃에서 30분동안 가동되고, 95 ℃에서 15분동안 초기 불활성화 단계후, 94 ℃에서 15초동안 변성, 60 ℃에서 30초동안 어닐링 및 72 ℃에서 30초동안 확장의 총 40 사이클로 구성된 1차 PCR 사이클이 진행될 것이다. 특이성을 확인하고 RT-PCR 산물을 확인하기 위하여 RT-PCR 산물의 융점 곡선 분석이 행해질 것이다. 갑상선암 조직으로부터의 전체 RNA 제제가 표준 곡선을 작성하고 상대적인 정량화를 위해 기준 제제로 사용될 것이다. 또한, 동시에 GAPDH 살림 유전자가 내인성 대조군으로 측정될 것이며, RT-PCR 효율에 있어서 샘플 대 샘플 변형 및 RNA 적재량의 보정을 위해 사용될 것이다.
환자 모집단
1. 갑상선 결절을 나타내는 환자: FNA가 수행되는 갑상선 결절을 나타내는 100명의 연속 환자가 FNA 전에 검사를 받게 될 것이다.
2. 갑상선암으로 새로이 진단: 외과에서 갑상선암으로 새로이 진단된 50명의 환자가 수술전날 및 그 후에 검사를 받게 될 것이다.
3. 소아 갑상선암: FNA 생검을 요하는 갑상선 결절을 나타내는 18세 미만의 환자 10-20명이 수술전, 후에 검사를 받게 될 것이다.
통계적 분석(생물통계학과의 에드 마샤(Ed Mascha) 도움으로 완성)
샘플 크기 계산
덜 민감한 정성적 RT-PCR에 대한 기존의 경험에 기초해, 본 분석법으로 약 75% 민감성 및 약 90% 특이성을 얻었다. 외과로 옮겨진 50명의 환자(그룹 1) 및 내분비학으로 갑상선 결절을 나타내는 100명의 환자에서, 갑상선암 사례가 예상되는 수는 약 40-70명의 환자이며, 갑상선암을 갖지 않는 사례의 수는 약 80-110명의 환자이다. 약 0.66-0.90 폭의 95% 신뢰 구간(CI)을 가지는 민감성과 0.15-0.20 폭 또는 그 이상의 CI를 가지는 특이성의 정확한 추정치를 얻을 수 있었다.
계획적인 데이터 분석
모든 분석에 대해, 환자가 갑상선암 또는 양성 갑상선 질환을 가지는지를 결정하기 위한 표준 검사는 FNA 생검에 의한 조직학적 진단 또는 최종 조직 병리학을 기초로 할 것이다. 그룹 1 환자는 갑상선암(양성 또는 모호한 FNA)으로 새로이 진단된 사람들이다. 이들중에서, 약 60-100%가 RT-PCR 분석법에 의해 시험 양성을 보일 것이다. 이 그룹으로부터, 민감성을 평가하고, 95% 신뢰 구간을 얻을 것이다. 그룹 2는 갑상선 결절 평가를 위해 진료소를 방문하여 FNA 생검을 받는 환자일 것이다. 이 그룹중에서, 약 5-30%가 암에 대해 양성일 수 있는 것으로 추정한다. 이 그룹으로부터, 민감성을 평가하고, 95% 신뢰 구간을 얻을 것이다. 양 그룹으로부터의 데이터를 사용하여 갑상선암 검출에 대한 TSHR mRNA의 효율 및 양성 및 음성 예측값(PPV, NPV)을 산출할 것이다.
실시예 4
갑상선암 환자의 말초 혈액내 갑상선 자극 호르몬 수용체 메신저 RNA(TSHR-mRNA)의 정량적 역 전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR) 측정
갑상선 특이적 mRNA의 RT-PC에 기초한 분석 방법은 갑상선암 재발의 모니터링을 향상시킬 수 있다. 본 발명자들은 앞서 TSHR-mRNA에 대한 정성적 RT-PCR이 재발 갑상선암에 민감하고 특이적일 수 있음을 보여 주었다. 본 발명자들은 사이클 진행 형광 검출 시스템(SYBR Green 1; Rotorgene 3000TM)을 이용하여 정량적 RT-PCR 분석법을 개발하고 확인하였다. 다음과 같은 59명의 환자를 조사하였다; 15명의 건강한 대상, 19명의 양성 갑상선 질환자, 14명의 갑상선암으로 새로이 진단된 환자(13명 유두상, 1명 소포성) 및 11명의 재발 갑상선암 환자(모두 유두상). 수술전에 혈액 샘플을 채취하고, 모든 갑상선 질환 진단을 외과 병리학으로 확인하였다. 정맥 혈액으로부터 mRNA를 추출하고, 분광광도계로 정량화하였다. Quantitect SYBR Green 키트(Qiagen)에 대한 제조자 추천에 따라 1 단계 RT-PCR을 수행하고, PCR을 40 사이클로 실시하였다. 겔 전기영동으로 증폭 산물의 동질성을 확인하였다. 유두상 갑상선 암종의 외과적 검체로부터 추출한 전체 RNA를 일련적으로 희석하여 분석법을 분석하기 위한 표준 곡선을 작성하였다. 감지 시작 사이클(threshold cycle)에 대한 분석법내 분산 계수(CV)(n=8)는 1.4%이고, 평균 강도 CV(n=12)는 2.7% 이었다. 샘플을 각 반응 튜브에 로딩된 RNA의 양(1 g)에 대해 정규화하고, 갑상선암 RNA 표준 곡선을 이용하여 정량화하였다. 결과를 pg TSHR-mRNA/g 갑상선암 mRNA로 기록하였다(표 7). 이 결과는 갑상선암에 걸리지 않은(정상 환자/양성 갑상선 질환) TSHR-mRNA 수준이 갑상선암 환자(새로이 진단/재발)에 비해 유의적인 차가 있음을 제시한다.
| 그룹 | 중간 TSHR-mRNA (범위) | 정상 대상에 대한 유의성 (p) |
| 정상군 | 0.07(0-0.26) | - |
| 양성 갑상선 질환 | 0.1(0-31.76) | 0.57 |
| 새로이 진단된 갑상선암 | 32.54(5.85-69.75) | <0.0001 |
| 재발된 갑상선암 | 33.58(4.81-103.45) | <0.0001 |
환자 그룹간의 유의성을 윌콕슨 순위합 검정(Wilcoxon Rank Sum test)으로 조사하였다.
실시예 5
정성적 RT-PCR에 의한 말초 혈액내 TSH 수용체 mRNA의 측정: 갑상선암 환자를 모니터하는데 있어서 수술전 및 수술후 수준의 역할
TSHR-mRNA의 정성적 RT-PCR은 재발 갑상선암에 대한 민감하고 특이적인 마커이다. 수술후 환자를 모니터하는데 그의 값을 평가하기 위하여, 정량적 RT-PCR로 TSHR-mRNA 수준을 측정하였다. 총 71명의 대상(정상 26명; 양성 갑상선 질환 9명; 새로이 진단된 15명 및 재발 갑상선암 11명)을 조사하였다. 수술전 및 수술 다음날에 TSHR-mRNA 수준을 측정하였으며, 17명의 환자에 대해 추가로 후속 수준을 측정하였다(평균 추적 기간 19.1±10개월). 유발된 Tg 수준(ng/㎖) 및/또는 전신 I 131 스캔(WBS)으로 수술후 9-18개월에 잔류/전이 질환 상태를 평가하였다. 정상 대상(0.78 ng/㎍ 전체 RNA; 중간 0.12)의 상한으로 양성 mRNA 검사에 대한 컷오프 수준을 정하였다. 양성 질환, 새로이 진단된 환자 및 재발 암 환자에 대한 수술전/수술후 중간값(범위)은 각각 0.22(0-27.3)/0.23(0-0.57), 29.8(0.07-69.7)/0.03 (0.01-9.5) 및 33.58 (4.8-52.9)/0.15(0.03-1365) 이었다. 갑상선암으로 새로이 진단된 15명의 환자중에서, 14명은 수술후 TSHR-mRNA에 대해 음성이었다. 추적 조사에 따르면, 양성의 유발된 Tg 수준(13.6 ng/㎖)을 가지나 WBS 음성인 1명을 제외한 모두가 질병을 갖지 않으며, 추가의 영상화에 대해 임상적으로 관련된 질환은 없는 것으로 나타났다. 1명의 환자(Tg 항체 양성)는 수술후 양성으로 남아 있었고, 실제로 WBS 및 유발 Tg로 잡아내지 못하였으며, 병리학적으로 진단된 임상적 관련 질환을 나타내었다. 재발 갑상선암 환자 11명중에서, 7명이 수술후 분석법에 따라 음성으로 나타났으며; 이들중 4명은 추적 조사시 질환이 없는 것으로 나타났고 나머지 3명은 유발 Tg 수준(=<9.3 ng/㎖)이 증가하였으나, 음성의 WBS를 나타내어 추가 조치하지 않았다. 11명의 환자중 4명이 수술후 분석법에 따라 양성으로 나타났으며; 이들은 모두 질환이 전이되었고 Tg가 =>46 ng/㎖으로 상승하였으며, 양성의 WBS를 나타내었다. 유발 Tg와의 전체 일치율은 81%이고, WBS와의 전체 일치율은 96% 이었다.
본 조사의 결과는 TSHR-mRNA의 순환 수명이 짧고 갑상선암 환자의 수술후 수준이 잔류/전이 질환의 예측 기준이 됨을 제시한다.
SEQUENCE LISTING
<110> Gupta, Manjula
<120> METHOD OF DETECTING THYROID CANCER
<130> CCF-7230PV
<160> 4
<170> Patent In version 3.3
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Other nucleic acid
<400> 1
gcttttcagg gactatgcaa tgaa
24
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gtggagaaga cgacgatttc
20
Claims (23)
- 대상의 신체 샘플로부터 핵산 샘플을 수득하는 단계; 및핵산 샘플이 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR) mRNA를 함유하는지를 결정하는 단계를 포함하는,대상에서 갑상선암의 검출방법.
- 제1항에 있어서, THSR mRNA가 하기의 단계에 의해 결정되는 방법:핵산 샘플 내에서 TSHR mRNA 세그먼트를 증폭하는 단계; 및체액 샘플 내에서 상기 증폭된 TSHR mRNA 세그먼트의 존재를 검출하는 단계.
- 제2항에 있어서, 증폭이 TSHR mRNA에 상보적인 한쌍의 프라이머를 사용하여 수행되는 방법.
- 제3항에 있어서, 프라이머에 의해 증폭된 TSHR mRNA 세그먼트가 적어도 TSHR mRNA의 엑손 6-9 부분을 포함하는 방법.
- 제4항에 있어서, 적어도 하나의 프라이머가 서열 번호 1을 포함하는 방법.
- 제4항에 있어서, 적어도 하나의 프라이머가 서열 번호 2를 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 신체 샘플이 혈액을 포함하는 방법.
- 대상의 말초 혈액으로부터 핵산 샘플을 수득하는 단계; 및핵산 샘플이 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR) mRNA를 함유하는지를 결정하는 단계를 포함하는,대상내 갑상선 신생물이 양성인지 혹은 악성인지를 결정하기 위한 수술전 분석법(assay).
- 제8항에 있어서, THSR mRNA가 하기의 단계에 의해 결정되는 방법:핵산 샘플 내에서 TSHR mRNA 세그먼트를 증폭하는 단계; 및체액 샘플 내에서 상기 증폭된 TSHR mRNA 세그먼트의 존재를 검출하는 단계.
- 제9항에 있어서, 증폭이 TSHR mRNA에 상보적인 한쌍의 프라이머를 사용하여 수행되는 방법.
- 제10항에 있어서, 프라이머에 의해 증폭된 TSHR mRNA 세그먼트가 적어도 TSHR mRNA의 엑손 6-9 부분을 포함하는 방법.
- 제11항에 있어서, 적어도 하나의 프라이머가 서열 번호 1을 포함하는 방법.
- 제11항에 있어서, 적어도 하나의 프라이머가 서열 번호 2를 포함하는 방법.
- 대상의 신체 샘플로부터 핵산 샘플을 수득하는 단계;핵산 샘플 내에서 TSHR mRNA 세그먼트를 증폭하는 단계; 및체액 샘플 내에서 상기 증폭된 TSHR mRNA 세그먼트의 존재를 검출하는 단계를 포함하는,대상에서 갑상선암의 검출방법.
- 제14항에 있어서, 증폭이 TSHR mRNA에 상보적인 한쌍의 프라이머를 사용하여 수행되는 방법.
- 제15항에 있어서, 프라이머에 의해 증폭된 TSHR mRNA 세그먼트가 적어도 TSHR mRNA의 엑손 6-9 부분을 포함하는 방법.
- 제14항에 있어서, 프라이머가 서열 번호 1 또는 서열 번호 2 중의 적어도 하나를 포함하는 방법.
- 제14항에 있어서, TSHR mRNA가 겔 전기영동을 이용하여 검출되는 방법.
- 제14항에 있어서, TSHR mRNA의 검출이 악성 또는 전이성 갑상선암의 지표가 되는 방법.
- 대상의 신체 샘플로부터 핵산 샘플을 수득하는 단계;적어도 하나의 프라이머가 서열 번호 3 또는 서열 번호 4를 포함하는 한쌍의 프라이머를 사용하여 핵산 샘플 내에서 Tg mRNA 세그먼트를 증폭하는 단계; 및체액 샘플 내에서 상기 증폭된 Tg mRNA 세그먼트의 존재를 검출하는 단계를 포함하는,대상내 갑상선 신생물이 양성인지 혹은 악성인지를 결정하기 위한 수술전 분석법.
- 제20항에 있어서, Tg mRNA가 겔 전기영동을 이용하여 검출되는 방법.
- 제20항에 있어서, Tg mRNA의 검출이 악성 또는 전이성 갑상선암의 지표가 되는 방법.
- 제20항에 있어서, 신체 샘플이 말초 혈액을 포함하는 방법.
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