CN104726606B - 一种pcr酶联双杂交法检测病原微生物检测方法 - Google Patents

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Abstract

PCR酶联双杂交法检测病原微生物属于临床医学微生物检测技术领域，具体为一种多种微生物同步定性和定量检测方法。本发明是结合应用DNA扩增，DNA杂交，和酶联免疫反应，采用固相表面包被技术，经过特异性保守片段的扩增，扩增产物与捕获探针结合，进一步吸附于固相表面，再经过酶联探针的远端杂交，经过特异性抗体识别,酶和底物的反应，产生可定量的颜色产物。所检测的病原微生物包括，EB病毒，巨细胞和胞病毒，单纯疱疹病毒1和单纯疱疹病毒2。本发明可实现对临床样本多种微生物同时检测，经过一个反应同时筛查四种病毒。具有节省时间和费用，应用灵活，重复性好、稳定性强、灵敏度及特异性高、简单易行的特点，适用于广泛的病原微生物检测；尤其适用于基层医疗机构。

Description

一种PCR酶联双杂交法检测病原微生物检测方法
技术领域
本发明涉及临床医学微生物检测、水及环境等微生物检测领域，具体涉及微生物定量、定性检测领域。
背景技术
临床医学微生物现阶段国内外检测方法主要有传统生化鉴定法、免疫学检测技术、核酸分子杂交技术、PCR技术、基因芯片技术等一些简单的分子生物学和免疫学方法。
传统的生化鉴定法需要对待测样本接种在培养基上进行分离培养，通过一系列繁琐的生理生化实验的特征、结果来甄别病原体种类，该方法虽然是微生物实验室中一种常用的、经典的鉴别方法，但其过程往往需要数天时间、耗费较大的人力物力、实验得到的表型特征可能还受到外界环境影响而出错，特别对于一些处于“活的不可培养状态”的微生物，传统的培养方法难以培养、甄别，留下重大隐患。
免疫学方法检测技术主要是采用酶联免疫分析(Enzyme-Linked ImmunosorbentAssay,E LISA),是把抗原、抗体免疫反应的特异性和酶的高校催化作用有机地结合起来的一种检测技术，既可以检测抗原也可以检测抗体；既可以进行定性也可以进行定量测定。ELISA技术简繁、方便，较传统检测技术快速，但存在交叉反应比较严重、假阳性多、灵敏度偏低等不足。
聚合酶链式反应(Ploymerase Chain Reaction,PCR)是分子生物学技术的一种，用于放大DNA片段，即生物体外进行的DNA扩增。一般的PCR需要经过预变性，变性、退火、延伸的25～35次循环，可将靶DNA序列扩增近百万倍。1988年Chamberian等提出了多重P CR的概念，同一PCR反应体系里加上二对以上引物，可同时扩增出多个核酸片段，适合多种微生物的同步分析与鉴定。但也存在扩增失败或非特异性产物，以及外源性污染出现假阳性结果。
基因芯片(DNA chip)又称为DNA微阵列(DNA microassay)或DNA芯片，是生物芯片的一种，是核酸分子杂交技术发展延伸而来的。通过微加工技术，将数以万计甚至百万计的基因探针即DNA片段有规律地排列成二维DNA探针阵列，固定到硅片、玻片等固态支持物上，与标记的样品分子进行核酸杂交，用于基因检测工作。其测序原理与核酸杂交一样，但解决了传统核酸杂交技术操作繁杂、检测效率低、自动化程度不高的缺点。基因芯片技术价格昂贵，同样还有些问题有待解决，如提高芯片的特异性和检测信号的敏感性，降低芯片的制作成本等，而且多数芯片都需要昂贵的检测仪器，这些问题使得基因芯片到目前主要局限于实验室研究而未能广泛应用于临床病原微生物的检测与鉴定。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术存在的不足，提出一种结合了PCR、DNA杂交和酶联免疫三项技术优势的多种微生物同步定性和定量检测方法。
本发明采用的技术方案：应用经亲和素包被的酶标孔板，特异性结合生物素化捕获探针，使其固定于孔板之上。PCR扩增系统包含数对特异性引物，TaqDNA聚合酶，和病人样本提取物，可以选择性扩增其含有的病原体基因片段。扩增产物一端与捕获探针杂交，另一端与酶标记的特异性探针杂交，经过清洗除去未结和的探针，经底物显色，停止反应，读取光密度，从而得知该样本是否含有相应病原微生物和其数量(见图1)。PCR酶联双杂交法本方法结合现有技术的优点，应用多联扩增PCR,Avidin-Biotin亲和固相连接，双探针杂交，保证了很高的敏感性和特异性，同时可检测多个常见病原，应用灵活，节省人力物力。
所述方法具体包括如下步骤：
1)亲和素(Avidin)包被聚苯乙烯板子的制备
链霉亲合素(Thermo)溶解在标准碳酸氢盐缓冲液(pH9.5)在室温下过夜，使其最终浓度为5mg/ml。该板包被前经UV光照射20分钟。另外，亲和素包被的板可以从生命技术公司购买。
2)样本来源
本检测应用人体标本，包括体液，如分泌物，咽拭子混悬液，脑脊液，血清等。
3)样本处理
待测样品反复冻融3次，每次都要涡旋混匀。
4)DNA模板提取和探针制备
DNA提取用从液体中纯化DNA的试剂盒。这个试剂盒适合于液体里含有核酸的提取和纯化，如：咽拭子混悬液,脑脊液，血清尿液，痰液等.按厂家推荐的操作程序操作。
5)多重PCR扩增目的片段
CMV检测
上游引物:5’-gttctcagccacaattactgag-3’
下游引物:5’-caagcggcctctgataaccaag-3’
捕获探针:5’-tcctcaatgcggcgcttcattacactgata-bio-3’
标记探针:5’-tcctcaatgcggcgcttcat tacactgataacctcaggct-dig-3’
EBV检测
上游引物:5’-gtcatcatcatccgggtctc-3’
下游引物:5’-ttcgggttggaacctccttg-3’
捕获探针:5’-aaaaggagggtggtttggaaagcatcgtggt-bio-3’
标记探针:5’-atccgggtctccaccgcgcaggccccctccaggtagaagg-dig-3’
HSV-1检测
上游引物:5’-ggccgtgtgacactatcgtcca-3’
下游引物:5’-gaggcccactatgacgacaaac-3’
捕获探针:5’-atgggggggactgccgccaggttgggggccgtgattttgt-bio-3’
标记探针:5’-tcgtccataccgaccacaccgacgaacccctaagggggag-dig-3’
HSV-2检测
上游引物:5’-ctcgtaaatgcttccctgct-3’
下游引物:5’-gttgggggcggaataccata-3’
捕获探针:5’-cgggccgcccgtggcgctcggtgcccccggtatggtattc-bio-3’
标记探针:5’-cttccctgctggtgccgatctgggaccgcgccgcggagac-dig-3’
PCR扩增体系：
3’端DNA标记使用Life Technology PierceTM Biotin 3'End DNA Labeling Kit试剂盒.
DNA探针地高辛标记Roche DNA标记试剂盒.
DNA提取用Qiagen QIAquick PCR Purification Kit.DNA样品以50-200纳克/μl溶解于无菌蒸馏水中.
5)PCR体系和扩增循环参数：
DNA变性温度根据7Oligo软件计算。
1cycle of 10min at 95℃
94℃45S,57℃60S,and 72℃40S共35Cycles
1Cycle for 10min at 72℃.
PCR产物以Qiagen PCRpurification kit提纯
1)双杂交酶联反应步骤
杂交和检测反应
生物素化的探针固定
在亲和素包被的微量滴定板孔中加入50微升含有1％吐温的磷酸缓冲盐水和0.5μM生物素化的探针的溶液,37℃下孵育30分钟。
用PBST将板在冰上洗涤三次,每次两分钟
PCR产物变性
将PCR产物加热到99℃10分钟，立即在冰上冷却。
杂交
100微升冰冷的杂交缓冲液：5×SSC〔1×SSC＝0.15M NaCl+0.015M柠檬酸钠,并含有1％封闭液(1％[wt/vol]封闭试剂[Boehringer],0.1％[wt/vol]十二烷基肌氨酸钠)〕,10ml PCR产物和0.5pM地高辛标记的探针在55℃孵育30分钟。
然后用PBST将板洗涤三次。
显色反应
读取数据
读取标记的PCR产物，根据为呈色深度与标记量成线性关系.抗地高辛抗体所携带的辣根过氧化物酶(HRP)催化PNPP底物反应生成黄色反应物,可在405nm波长处读取。
的结果解读：结果解释是基于阴性对照组平均值+3SD。任何读值高于此界限，则解读为阳性。根据高斯分布。此区间的准确率为99.99％。
有益效果：
1、本检测结合应用DNA扩增，DNA杂交，和酶联反应，使用方便灵活，适用于临床感染的病原学诊断。
2、本检测应用亲和素包被的孔板，可灵活固相联结任何生物素化探针，适应性强。
3、PCR反应体系中含有组合的多种微生物引物，经过选择性扩增，可以使相应病原体浓度达106扩增，与相应抗体杂交而产生可定量的呈色反应。
4、本检测具备重复性好、稳定性强、灵敏度及特异性高，与现有技术相比，可以极大的节省人工和试剂成本，一个反应可以诊断组合中所有的病原体。
5、实验不需要昂贵的仪器，试剂成本低廉等诸多优势，对微生物检测具有临床实际意义。
附图说明
图1PCR酶联双杂交检测技术原理
图2ELISA原理
图3PCR ELISA原理。
具体实施方式
本发明结合了PCR，DNA杂交，和酶联免疫三项技术的特点，采用固相表面包被技术，经过特异性保守片段的扩增，扩增产物与捕获探针结合，进一步吸附于固相表面，再经过酶联探针的远端杂交，经过酶和底物的反应，产生可定量的颜色产物。因为在线性段颜色深度和探针拷贝数呈线性关系，因而可以定量。本发明应用一个组合，在反应体系中含有组合中的所有引物，经过PCR反应，特异性扩增含有的病原体。PCR扩增产物而后分别加入含有特异性探针的不同孔中杂交，只有含有特异性扩增产物的孔可以产生呈色反应。因而可以实现对临床样本的多种微生物同步定性和定量检测，经过不同的探针-PCR组合，尤其适用于病因不明的疑似感染病人，可快速、有效筛查潜在感染病原微生物，具有广泛的应用前景。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件进行。定性检测原理见图2、图3。ELISA技术应用抗同一抗原的捕获抗体和酶标记抗体产生肉眼可见的呈色反应，进而达到蛋白性抗原的定性和定量。ELISA仅适用于蛋白质检测。PCR ELISA方法应用PCR技术，将地高辛掺入扩增产物，经亲和反应将扩增产物固定于固相表面，再经过HRP标记的抗地高辛抗体识别并与底物反应呈色，进而定量或定性。本检测仅适用于单一病原检测。
实施例1.EB病毒快速检测方法
EB病毒可在生命早期感染，一般10岁左右的孩子中70-80％都有被此病毒感染。HIV感染者和需要使用免疫抑制剂的器官移植病人都非常容易被感染。移植后淋巴增殖性疾病(PTL D)是造血干细胞移植和实体器官移植后一种少见但致命的并发症，死亡率高达40％～70％，造血干细胞移植后PTLD的早期死亡率高达90％。肾移植PTLD诱发率1％，心/肺移植达9％，胰脏移植高达12％。大部分PTLD与EB病毒感染有关，由于移植后多种原因导致效应T细胞的功能受抑制，EB病毒感染的B细胞失控性生长，从而形成异常的淋巴细胞高增殖性疾病或单克隆恶性肿瘤。
EB病毒DNA可以在病毒感染者的血液中检测出来，并且表明EB病毒DNA量直接跟3-4个月后患者是否能诱发PTLD呈高度正相关。血清阴性(EB病毒)的器官移植受者接受早期排斥反应的免疫抑制和抗淋巴细胞球蛋白OKT-3治疗与免疫正常个体但先前有EB病毒感染的相比，发展成PTLD的风险更高。
1.PCR扩增引物和探针设计
PCR引物和探针如图，通过PCR可以对EB病毒的EBNA1基因特异性的扩增，这个基因是EB病毒必须的成分，具有高度特异性。
2.临床样本的采集
收集被检测者外周血标本
3.病原微生物DNA抽提
病毒DNA使用Zymo病毒DNA抽提试剂盒，具体步骤按照说明书进行。
4.PCR参数
参照DNA扩增部分。
5.结果判读
最终结果判读依赖于阴性对照。如果样本的读数的三次重复的平均值大于阴性对照(已确定为阴性的人血清样本)可以定义为阳性样本。同时有已知的阳性EB病毒对照样本(Amplirun,Vircell,MBC065)。
实施例2.人巨细胞病毒快速检测方法
巨细胞病毒(Cytomegaoviyns，CMV)是一种疱疹病毒组DNA病毒，在自然界中广泛存，在人群中感染率非常高。病毒可侵入肺、肝、肾、唾液腺、乳腺其他腺体，以及多核白细胞和淋巴细胞，可长期或间隙地自唾液、乳汗血液、尿液、精液、子宫分泌物多处排出病毒。通常口腔，生殖道，胎盘，输血或器官移植等多途径传播。类似传染性单核细胞增多的疾病是巨细胞病毒感染免疫系统较弱病人最常见的表现。临床症状和表型包括：单核细胞增多症；巨细胞病毒感染在肠道会导致腹泻、发烧和腹痛、结肠炎和血便；可引起肝功能异常和不明原因的发烧；感染的神经系统后可引起各种神经系统并发症，包括脑炎；也能引起肺炎。
1.PCR扩增引物和探针设计
PCR引物和探针序列如图，通过PCR可以对巨细胞病毒基因特异性的扩增，这个基因是巨细胞病毒必须的成分，具有高度特异性。
2.临床样本的采集
测试样品是血液或棉签清洗液。
3.病原微生物DNA抽提
病毒DNA使用Zymo病毒DNA抽提试剂盒，具体步骤按照说明书进行。
4.PCR参数
参照DNA扩增部分。
5.结果判读
最终结果判读依赖于阴性对照。如果样本的读数的三次重复的平均值大于阴性对照可以定义为阳性样本。同时有已知的阳性巨细胞病毒对照样本(SeraCare A350-5334)。
实施例3.HSV-1/HSV-2病毒快速检测方法
单纯疱疹病毒(HSV)可以分为HSV-1和HSV-2两个亚型，主要经过皮肤、黏膜或破损处进入人体内，可能导致口腔或生殖器疱疹。HSV原发感染产生免疫力后，将部分病毒清除，部分病毒可沿神经髓鞘到达三叉神经节(HSV-1)和脊神经节(HSV-2)细胞中或周围星形神经胶质细胞内，以潜伏状态持续存在，与机体处于相对平衡，不引起临床症状。当机体发热、受寒、日晒、月经、情绪紧张，使用垂体或肾上腺皮质激素，遭受某些细菌病毒感染等，潜伏的病毒激活增殖，沿神经纤维索下行至感觉神经末梢，至附近表皮细胞内继续增殖，引起复发性局部疱疹。反复感染还可导致全身性感染，脱水，和营养不足。因为在免疫功能低下患者的机会性感染，如果不及时治疗，病毒感染可以引起严重的发病率和死亡率。60和80％实体器官移植的患者会引起HSV复发，超过80％的骨髓移植后患者会导致HSV的复发。当疱疹病毒存在时，通过增加HIV病毒载量显着提高了HIV的传播效率。
1.PCR扩增引物和探针设计
PCR引物和探针序列如图，通过PCR可以对疱疹病毒基因特异性的扩增，这个基因是巨细胞病毒高度保守也是必须的成分，具有高度特异性。
2.临床样本的采集
测试样品是血液或棉签清洗液。
3.病原微生物DNA抽提
病毒DNA使用Zymo病毒DNA抽提试剂盒，具体步骤按照说明书进行。
4.PCR parameters
参照DNA扩增部分。
5.结果判读
最终结果的判读依赖于阴性对照。如果样本的读数的三次重复的平均值大于阴性对照(已确定为阴性的人血清样本)可以定义为阳性样本。同时有已知的阳性疱疹病毒对照样本(SimplexaTM HSV 1&2Positive Control Pack,MOL2160)。

Claims (1)

1.一种多种微生物同步定性和定量检测试剂盒，其特征在于，其包括亲和素(Avidin)包被聚苯乙烯板、纯化DNA试剂和PCR扩增用引物及探针；
所述PCR扩增用引物及探针为：
CMV检测引物及探针：PCR上下游扩增引物为SEQ ID NO.1,2所示；捕获探针3’末端是生物素标记，序列为SEQ ID NO.3所示；标记探针3’是地高辛标记，序列为SEQ ID NO.4所示；
EBV检测引物及探针：PCR上下游扩增引物为SEQ ID NO.5,6所示；捕获探针3’末端是生物素标记，序列为SEQ ID NO.7所示；标记探针3’是地高辛标记，序列为SEQ ID NO.8所示；
HSV-1检测引物及探针：PCR上下游扩增引物为SEQ ID NO.9,10所示；捕获探针3’末端是生物素标记，序列为SEQ ID NO.11所示；标记探针3’是地高辛标记，序列为SEQ ID NO.12所示；
HSV-2检测引物及探针：PCR上下游扩增引物为SEQ ID NO.13,14所示；捕获探针3’末端是生物素标记，序列为SEQ ID NO.15所示；标记探针3’是地高辛标记，序列为SEQ ID NO.16所示。
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