CN111041563B - 一种靶向序列捕获及pcr建库方法 - Google Patents

一种靶向序列捕获及pcr建库方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种靶向序列捕获及建库技术，本发明无需探针设计和链霉亲和素富集目标序列，只需要用普通引物，无需修饰。两步PCR即可同时对多样本进行靶向序列捕获与NGS文库制备，是一种比较经济、快速、准确的靶向序列捕获和建库技术。同时，本发明可有效地避免Overlap区域过度扩增，可检测未知的基因融合和罕见、低频突变位点检测，也适合于微量DNA的靶向序列捕获和NGS文库构建。

Description

一种靶向序列捕获及PCR建库方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种靶向序列捕获及PCR建库方法。
背景技术
靶向序列捕获技术主要基于探针杂交捕获技术或者基于多重PCR两大类。
探针杂交捕获技术是指把特异性探针合成在固相或液相芯片上，从基因组文库中将靶基因序列捕获出来，主要产品如Nimble Gen Seq Cap Hybrid Capture(Roche)、SureSelect Hybrid Capture(Agilent)、TurSeq Capture(Illumina)和IDT Capture(IDT)为代表。
锚定多重PCR技术则以PCR为基础，在同一PCR反应体系中加入多对引物，同时扩增出多个靶基因序列的PCR反应，主要产品如Halo Plex(Agilent)、AmpliSeq(Ion Torrent)、TruSeq Amplicon(Illumina)、Gene Read(Qiagen)、Clean Plex(Paragon)、Variant ProOne-step Capture PCR Technology(联川生物)、SLIM amp(Stem Loop InhibitionMediated Amplification，真固生物)为代表。
一方面，探针杂交捕获技术存在以下问题：1)对DNA起始量要求高，DNA量少时，会影响数据质量，甚至影响实验结果准确性，因此不适合稀有样本检测；2)探针合成需要生物素标记，后续实验还需要用昂贵的链霉亲和素磁珠进行靶序列富集，成本高，富集靶基因序列后仍需要post-PCR扩增；3)实验流程繁琐、费时费力、成本高；4)并且捕获新发的基因融合片段序列成功率不高，容易在洗涤过程中丢失；5)不能检测未知的基因融合变异。
另一方面，锚定多重PCR的捕获技术均存在缺陷。比如，部分多重PCR技术不能有效避免引物二聚体的形成与扩增，如Variant Pro、Ampliseq；部分多重PCR技术不能有效抑制非特异扩增，如CleanPlex(Paragon)；部分多重PCR技术不能有效避免连续基因序列扩增时引物Overlap区域的过度扩增，如CleanPlex(Paragon)；部分多重PCR技术在PCR时才添加UID分子标签，不能及时标记原始DNA模板，影响了超罕见、超低频基因突变的检测，如VariantPro、Ampliseq、SLIMamp等技术。而且多重PCR技术，需要对每个样本分别进行PCR扩增和建库，成本较高。
根据以上问题，研制新的一种靶向序列捕获及建库技术成为亟需解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种靶向序列捕获及建库方法。
本发明所采取的技术方案是：
本发明第一个方面，提出了一种多样本靶基因序列捕获及NGS文库构建方法。根据本发明的实施例，所述方法包括以下步骤：
1)根据需要捕获的靶基因区域设计特异性引物，特异性引物的5’端含有第一核酸序列；
2)使用转座酶复合物对基因组DNA、互补DNA进行片段化，所述转座酶复合物由第二核酸序列、转座酶识别序列与转座酶组成；
3)将上述片段化的DNA进行等量pooling，均一化样本捕获建库；
4)锚定多重PCR，对上述已经pooling的样本进行多重PCR，捕获和扩增靶基因序列；
5)PCR建库；通过PCR使所述靶基因序列添加完整的测序接头与二级Barcode，形成NGS文库。
根据本发明的实施例，步骤1)所述特异性引物的设计可以选择PP5/PP6/Oligo6或多重PCR引物设计软件，引物Tm值在63±3℃；模拟PCR时，无明显非特异扩增，无明显Hairpin和Dimer。
根据本发明的实施例，步骤1)所述特异性引物5’端含有第一核酸序列；所述第一核酸序列为部分测序接头序列，可以根据相应的基因测序仪测序接头进行调整，该序列为通用序列，如illumina平台则用P7端部分接头，如MGISEQ平台则用部分MGIAd_barcode序列，如IonTorrent平台则用部分A端接头序列；所述MGISEQ平台，第一核酸序列可用，但不限于：
5’-AGACCGCTTGGCCTCCGACTT-3’。
根据本发明的实施例，步骤2)所述转座酶复合物的第二核酸序列包括通用引物、一级Barcode和UID标签序列。
根据本发明的实施例，所述通用序列为一端测序接头的部分序列，如illumina平台则用P5端部分接头，如MGISEQ平台则用部分MGIAd_Bottom序列，如IonTorrent平台则用部分P端接头序列；所述通用序列的3’端含有一级Barcode和UID标签序列，所述一级barcode由6-12个序列已知的N碱基组成，所述UID标签序列由6-15个序列未知的N碱基组成；所述MGISEQ测序平台，第二核酸序列的核苷酸序列如下：
5'-CGACATGGCTACGATCCGACTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNAGATGTGTATAAGA GACAG-3’。
根据本发明的实施例，步骤2)所述转座酶识别序列核苷酸序列为：
5'-CTGTCTCTTATACACATCT-3’。
根据本发明的实施例，所述转座酶可为Tn5转座酶或具有相似功能的转座酶；优选的，所述转座酶为Tn5转座酶。
根据本发明的实施例，步骤4)所述多重PCR扩增体系：
和
根据本发明的实施例，步骤4)所述多重PCR扩增程序：
根据本发明的实施例，步骤5)所述PCR扩增体系：
。
根据本发明的实施例，步骤5)所述PCR扩增程序：
本发明首先利用转座酶将gDNA或cDNA片段化，在片段化DNA的同时添加第二核酸序列，有异于常规的转座酶建库，常规方法需要用2种接头序列，制备而成的转座酶复合物有3种。并且，常规转座酶片段化DNA会产生9bp的gap，往往需要DNA聚合酶进行gap修复，本发明不需要进行gap修复，然后对片段化DNA即可进行qubit定量，多样本pooing。
随后进行多重PCR扩增，扩增引物为GP primer和用于靶序列捕获的特异性引物，特异性引物序列5’端包含第一核酸序列，即使只有单端特异性引物与模板DNA结合，也可捕获成功。
最后，进行第2轮PCR，以第二核酸序列中的GP primer序列和特异性引物中的第一核酸序列作为锚定PCR序列，引入完全的NGS测序接头及二级Barcode，一步PCR即完成NGS文库构建，至此，同时完成了多个样本的靶基因序列捕获和文库构建。
使用本发明制备的转座酶复合物片段化DNA时，得到的片段DNA都含有该通用序列，多重PCR捕获时，可以与单端特异性引物一起捕获并放大目标基因片段，因此，与常规多重PCR每个目标基因片段分别需要1对正反向特异性引物进行序列捕获和放大不同。
本发明的有益效果是：
1)本发明提供一种核苷酸引物，无须修饰以及使用昂贵的链霉亲和素磁珠富集。
2)用转座酶对gDNA或cDNA进行了片段化，片段化的同时插入了一级barocde和UID分子标签，因此，后续可以对多样本进行pooling后，多样本同时进行靶基因序列捕获和文库构建，大大降低了生产成本，提高生产效率。另外，核酸样本的片段化，可以同时进行多重PCR，有效避免了连续基因序列的捕获时overlap区域的过度扩增和非特异扩增。
3)添加了UID分子标签，对原始DNA样本分别添加独特的分子标记，为准确检测更罕见或低频的基因突变提供了保障。
通过转座酶介导的锚定多重PCR技术，可以同时对多样本进行靶基因序列捕获和测序文库构建，只需要2步PCR，即可完成靶序列捕获和建库，实验流程大大缩短，仅需要3h即可完成。
附图说明
图1为本发明转座酶复合物的结构，含Barcode及UID(以NNNNNNNNN表示)。
图2本发明的PCR靶向捕获及建库技术流程图。
图3均一化样本捕获建库。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整的说明，但并不局限于此。
实施例1
本实施例以靶向捕获DMD(假肥大性肌营养不良)基因27kb外显子区域，并构建华大智造MGISeq SE400测序文库为例进行说明。
1.特异性引物设计。
根据目的基因DMD基因27kb外显子区域设计特异性引物，引物Tm值在63±3℃，模拟PCR时，无明显非特异扩增，无明显Hairpin和Dimer。特异性引物序列5’端含有第一核酸序列，为了后续PCR建库时起着锚定作用。
特异性引物的核苷酸序列为：
5’-AGACCGCTTGGCCTCCGACTT-3’(SEQ ID NO.1)。
2.转座酶复合物制备。
1)转座子DNA退火
Tn5(Epicentre)转座酶绑定序列的5’端添加第二核酸序列，第二核酸序列包括GPprimer、一级Barcode以及UID分子标签。其中GP primer在锚定多重PCR和PCR建库中起重要作用，一级Barcode(序列已知，用于区分不同样本，以NNNNNNN表示)和UID分子标签(以随机N碱基组成)，第二核酸序列的核苷酸序列为：5'-CGACATGGCTACGATCCGACTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNAGATGTGTATAAGAGACA G-3’(SEQ ID NO.2)；
转座酶识别序列：
5'PHO-CTGTCTCTTATACACATCT-3’(SEQ ID NO.3)；
将2条引物(第二核酸序列以及转座酶识别序列)取等摩尔量混合，使用OligoAnnealing Buffer进行退火。退火完成后使用Agilent 2100DNA1000 Kit进行质检，要求片段单一，无明显杂峰。
2)转座酶复合物制备
取等量的退火好的转座子DNA与Tn5转座酶(Epicentre)，室温孵育30分钟，制备成转座酶复合物，转座酶复合物结构如图1。
3.gDNA片段化。
反应体系如表1：4℃进行操作。
表1
组分 体积(μL)/反应
50ng gDNA x
5×Reaction Buffer 6
转座酶复合物 8
无核酸酶水r 补足30μL
轻轻吹打，短暂离心，置于PCR仪，反应程序为：55℃10min，95℃10min，4℃hold，热盖on。
4.多样本pooling。
每个片段化DNA样本各取10μL进行均一化，混匀成Tag fragment DNA Mix(图3)。
5.多重PCR。
多重PCR反应体系(表2和表3)，4℃配制。SP Primer序列5’端是第一核酸序列通用序列。
表2
组分 体积(μL)/反应
Tag fragment DNA Mix 20
Forward SP Primer mix 3
第二核酸序列通用序列 3
5×Multiplex PCR Master Mix 10
Nuclease-free water 14
总体积 50μL
或
表3
吹打混匀，短暂离心，进行PCR实验，PCR程序如表4。
表4
6.PCR结束后，短暂离心，取2μL PCR产物进行PCR建库。
7.PCR建库。
使用MGI-PCR-1primer mix与MGI-PCR-Barcode引物进行PCR扩增，往多重PCR产物引入完全的测序接头与Barcode，形成NGS测序文库。
其中，MGI-PCR-1引物的核苷酸序列为：
/5Phos/GAACGACATGGCTACGATCCGACTT(SEQ ID NO.4)和/5Phos/GAACGACATGGCTACGA(SEQ ID NO.5)；
MGI-PCR-Barcode引物的核苷酸序列为：
5’-TGTGAGCCAAGGAGTTGNNNNNNNNNNTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTT-3’(SEQID NO.6)，
其中NNNNNNNNNN对应Barcode标签序列，和5’-TGTGAGCCAAGGAGTTG-3’。
PCR反应体系与PCR程序(表5、6)进行PCR扩增反应。
表5
表6
8.扩增产物磁珠纯化。
将PCR扩增产物用Nuclease-free water补至50μL，添加45μL XP磁珠进行纯化，80％乙醇漂洗2次，最后用30μL Elution Buffer洗脱，至止完成PCR建库。
9.文库质检、环化、Make DNB及MGI2000 SE400测序。
10.数据分析。
检测结果统计信息见表7，结果表明本方法实现了DMD基因27kb外显子的完全覆盖(靶基因区域覆盖度100％)，并且捕获效率高(中靶率>94.5％)与主流多重PCR捕获技术相当，均一性较好(≥0.2x平均测序深度的靶基因区域覆盖度>95％)与主流多重PCR捕获技术(表现优秀的方法0.2x平均测序深度的靶基因区域覆盖度在90％-98％范围内)相当。所有样本的数据产出较均一，说明多样本同时捕获的效果也比较理想。
表7
综上，本靶向序列捕获与建库技术，检测性能与多重PCR靶向捕获和建库技术准确度一样。本发明可对多样本同时进行靶向捕获与建库，二步PCR即可完成，是一种快速、经济、有效的靶向捕获与建库技术。
实施例2
本实施例以靶向捕获肺癌70基因，并构建华大智造MGISeq PE150测序文库为例进行说明。
1.样本信息。为验证本方法可以检测罕见突变及基因融合，从A公司多重PCR技术检测结果中，挑选几个已知突变的阳性DNA样本，和89个阴性样本，其中阳性样本信息如下(表8)：
表8
样本ID 变异信息
Lung-011 EGFR,T790M,突变率5％
Lung-015 PIK3CA,E545K,突变率1.5％
Lung-023 KRAS,G12D,突变率3.5％
Lung-032 EGFR,L858R,突变率8％
Lung-035 ELM4-ALK基因融合
2.转座酶复合物制备。同实施例1。
3.gDNA/cDNA片段化、多样本pooling、锚定多重PCR、PCR建库以及MGISeq2000PE150测序，操作参考实施例1。
4.数据分析。
检测结果如表9，检测结果与实验设计高度吻合，证明本方法适合检测罕见突变与基因融合变异。此外，本方法检验时发现了一例假阴性样本，检出de novo变异，后续经RT-qPCR实验设计和Sanger测序，验证了该样本的de novo变异。
阳性样本检测结果与A公司检测结果比较如下：
本技术检测结果中，突变率比A公司低的原因，是本发明给原始DNA模板添加了UID分子标签才进行PCR扩增，可以定量原始DNA模板量与基因突变频。而A公司是PCR扩增时才添加UID分子标签，只能对扩增子添加UID分子标签，扩增子是否来源于相同的原始DNA模板是未知的。因此，本发明能更真实反应待检测样本的突变情况。
表9
样本ID A公司检测结果 本技术检测结果
Lung-011 EGFR,T790M,突变率5％ EGFR,T790M,突变率4.5％
Lung-015 PIK3CA,E545K,突变率1.5％ PIK3CA,E545K,突变率1.2％
Lung-023 KRAS,G12D,突变率3.5％ KRAS,G12D,突变率3.0％
Lung-032 EGFR,L858R,突变率8％ EGFR,L858R,突变率6.6％
Lung-035 ELM4-ALK基因融合 ELM4-ALK基因融合
阴性样本检测结果统计，89例阴性样本，使用本发明方法得到的检测结果有88例，1例新发罕见基因融合变异，后续经RT-PCR和Sanger验证了该变异的存在，证明了本方法的准确度。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州精科医学检验所有限公司
<120> 一种靶向序列捕获及PCR建库方法
<130>
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agaccgcttg gcctccgact t 21
<210> 2
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(40)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 2
cgacatggct acgatccgac ttnnnnnnnn nnnnnnnnnn agatgtgtat aagagacag 59
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ctgtctctta tacacatct 19
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gaacgacatg gctacgatcc gactt 25
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gaacgacatg gctacga 17
<210> 6
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(27)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 6
tgtgagccaa ggagttgnnn nnnnnnnttg tcttcctaag accgcttggc ctccgactt 59

Claims (9)

1.一种靶基因序列捕获及PCR建库方法，包括以下步骤：
1)根据需要捕获的靶基因区域设计特异性引物，特异性引物的5’端含有第一核酸序列；
2)使用转座酶复合物对基因组DNA、互补DNA进行片段化，所述转座酶复合物由第二核酸序列、转座酶识别序列与转座酶组成；
3)将上述片段化的DNA进行等量pooling，均一化样本捕获建库；
4)锚定多重PCR，对上述已pooling的样本进行多重PCR，捕获和扩增靶基因序列；
5)PCR建库：通过PCR使所述靶基因序列添加完整的测序接头与二级Barcode，形成NGS文库；所述第一核酸序列为部分测序接头序列，该序列为通用序列，如illumina平台则用P7端部分接头；如MGISEQ平台则用部分MGIAd_barcode序列；如IonTorrent平台则用部分A端接头序列；所述MGISEQ平台，第一核酸序列可用，但不限于：5’-AGACCGCTTGGCCTCCGACTT-3’；步骤2)所述转座酶复合物的第二核酸序列包括通用引物、一级Barcode和UID标签序列。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，通用序列为一端测序接头的部分序列，如illumina平台则用P5端部分接头，如MGISEQ平台则用部分MGIAd_Bottom序列，如IonTorrent平台则用部分P端接头序列；所述通用序列3’端含有一级Barcode和UID标签序列，所述一级barcode由6-12个序列已知的N碱基组成，所述UID标签序列由6-15个序列未知的N碱基组成；所述MGISEQ测序平台，第二核酸序列的核苷酸序列如下：
5'-CGACATGGCTACGATCCGACTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNAGATGTGTATAAGAGACAG-3’。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤2)所述转座酶识别序列核苷酸序列为：
5'PHO-CTGTCTCTTATACACATCT-3’。
4.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述转座酶为Tn5转座酶或具有相似功能的转座酶。
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述转座酶为Tn5转座酶。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤4)所述多重PCR扩增体系：
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤4)所述多重PCR扩增程序：
8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤5)所述PCR扩增体系：
9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤5)所述PCR扩增程序：
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