CN111979298A - 一种用于mgi/bgi平台ngs文库制备的接头及其应用 - Google Patents

一种用于mgi/bgi平台ngs文库制备的接头及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111979298A
CN111979298A CN202010678669.1A CN202010678669A CN111979298A CN 111979298 A CN111979298 A CN 111979298A CN 202010678669 A CN202010678669 A CN 202010678669A CN 111979298 A CN111979298 A CN 111979298A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
platform
mgi
bgi
joint
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010678669.1A
Other languages
English (en)
Inventor
李真真
王家庭
曹振
宋东亮
周其好
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yeasen Biological Technology Shanghai Co ltd
Original Assignee
Yeasen Biological Technology Shanghai Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yeasen Biological Technology Shanghai Co ltd filed Critical Yeasen Biological Technology Shanghai Co ltd
Priority to CN202010678669.1A priority Critical patent/CN111979298A/zh
Publication of CN111979298A publication Critical patent/CN111979298A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
    • C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种可用于MGI/BGI平台NGS文库制备的接头，其由具有如SEQ NO.1所示序列的DNA单链和具有如SEQ NO.2所示序列的DNA单链部分互补配对而成。还公开了该接头所对应的扩增引物组合，包括具有如SEQ NO.3所示序列的上游引物和具有如SEQ NO.4所示序列的下游引物。与现有技术相比，本发明的新型接头具有有效连接效率高、建库产量高、制备成本较低、接头连接产物片段区分度高的优点，便于连接效果的分析与评估。

Description

一种用于MGI/BGI平台NGS文库制备的接头及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及二代测序技术，尤其涉及一种用于MGI/BGI平台NGS文库制备的接头及其应用。
背景技术
NGS接头是二代测序中必不可少的一个组分，是待测DNA片段与Flow-cell的连接桥梁。接头本质上是一段短的核酸序列，基本包括Read 1测序引物结合序列、Read2测序引物结合序列、index以及index测序引物结合序列。目前Illumina测序平台市场上常用的接头有Y型接头-Illumina以及U型接头-NEB。而华大智造针对自主研发的MGISEQ平台，研发出自己的MGI接头-单端index接头，由于其形状类似泡沫所以又称泡状接头(bubble-shapedAdapter)，其结构如图1所示。
这种泡状接头由于其特殊的二级结构，采用T4 DNA连接酶进行接头连接，未连接的标准片段占比较高；改用上海翌圣生物科技有限公司研发的Fast T4 DNA连接酶，其连有接头的片段占比增加。但相比于其它类型接头，该类型接头的标准连接产物较为多样；其中包含未连接的标准品、单端连有接头单体的片段、双端连有接头单体或单端连有接头二聚体的片段、双端分别连有接头单体和接头二聚体的片段、双端连有接头二聚体的片段，除以上片段外，还有其它杂带，影响连接效果的分析和判断。另外，与Illumina接头相比，这种泡状接头建库产量低。
发明内容
为了提高NGS文库产量，本发明人提供了一种可用于MGI/BGI平台NGS文库制备的新型NGS接头。
本发明首先提供了一种可用于MGI/BGI平台NGS文库制备的接头，其由具有如SEQNO.1所示序列的DNA单链和具有如SEQ NO.2所示序列的DNA单链部分互补配对而成：
5’-GAACGACATGGCTACGATCCGACTTGATCT-3’(SEQ NO.1)
5’-p-GATCAAGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGACAA-3’(SEQ NO.2)。
其中，5’-p-表示5’末端核苷酸为磷酸化修饰的核苷酸。
在本发明的一种实施方式中，上述接头的制备方法为：分别合成接头序列SEQNO.1和SEQ NO.2，等浓度混合两条序列后退火。
进一步，本发明还提供了一种可用于MGI/BGI平台NGS文库制备的接头及扩增引物组合，其包括如前所述的接头以及具有如下两组序列的扩增引物组：
5’-p-GAACGACATGGCTACGA-3’(SEQ NO.3)
5’-TGTGAGCCAAGGAGTTGNNNNNNNNNNTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCC-3’(SEQ NO.4)
其中，下划线处为BGI/MGI平台barcord序列的互补序列。
本发明还提供了一种用于MGI/BGI平台NGS文库制备的试剂盒，其包括：由具有SEQNO.1所示序列的DNA单链和由具有SEQ NO.2所示序列的DNA单链部分互补配对而成的接头。
优选地，上述用于MGI/BGI平台NGS文库制备的试剂盒还包括扩增引物组，其中包括具有如SEQ NO.3所示序列的上游引物和具有如SEQ NO.4所示序列的下游引物。
优选地，上述用于MGI/BGI平台NGS文库制备的试剂盒还包括T4 DNA连接酶，特别优选为Fast T4 DNA连接酶。
优选地，上述用于MGI/BGI平台NGS文库制备的试剂盒还包括磁珠。
进一步，本发明还提供了一种用于MGI/BGI平台的NGS文库的制备方法，包括以下步骤：
1)对待测的DNA片段进行末端修复；
2)连接本发明所述的可用于MGI/BGI平台NGS文库制备的接头；
3)接头连接结束后，通过DNA磁珠纯化获得接头连接产物；
4)用前述的扩增引物组对连接产物进行扩增。
优选地，步骤1)中所述末端修复的反应条件为：30±2℃，20±5min；70±2℃15±5min。
优选地，步骤2)中所述接头连接使用的酶为Fast T4 DNA连接酶，连接的反应条件为：20±2℃，15±5min。
优选地，步骤4)中所述扩增的反应条件为：98℃1min，1个循环；98℃10sec，60℃30sec，72℃30sec，8-13个循环；72℃5min，1个循环。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1.本发明的新型接头有效连接(双端均有接头)效率高；
2.本发明的新型接头及其扩增引物的制备成本低；
3.本发明的新型接头建库产量高；
4.本发明的新型接头连接产物片段区分度高，便于连接效果的分析与评估。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是泡状接头的结构示意图；
图2是两种NGS接头300bp标准片段连接产物的电泳图，泳道1-泡状接头300bp连接产物，泳道2-新型接头300bp连接产物；
图3是泡状接头300bp连接产物2100分析图；
图4是新型接头300bp连接产物2100分析图；
图5是两种NGS接头建库电泳图；其中，
A：Ultima DNA Library Prep Kit for
Figure BDA0002584464390000034
文库电泳图，泳道1-泡状接头2ng13个循环；泳道2-泡状接头50ng 8个循环；泳道3-新型接头2ng 13个循环；泳道4-新型接头50ng 8个循环；B：OnePotTM II DNALibraryPrep Kit for
Figure BDA0002584464390000033
文库电泳图，泳道1-泡状接头10ng 10个循环；泳道2-泡状接头50ng 8个循环；泳道3-新型接头10ng 10个循环；泳道4-新型接头50ng 8个循环；
图6是两种NGS接头不同起始量的文库产量对比图。
具体实施方式
实施例1设计新型接头及对应的扩增引物
设计用于MGI/BGI平台NGS文库制备的接头(下文中称为“新型接头”)及其扩增引物序列如表1所示：
表1
Figure BDA0002584464390000031
*下划线处为BGISEQ/MGISEQ平台barcord序列的互补序列。
相对应的泡状接头及扩增引物序列如表2所示：
表2
Figure BDA0002584464390000032
Figure BDA0002584464390000041
*下划线处为BGISEQ/MGISEQ平台barcord序列的互补序列。
实施例2制备新型接头及连接效率分析
1、新型接头制备：
合成的新型接头序列(HD Bottom 1和HD Bottom 2)分别用1×TEN buffer溶解至100μM后，等浓度混合，经退火(25℃，2小时)后，形成新型接头；之后用TE buffer稀释至10μM，与泡状接头浓度保持一致。
2.连接效率分析：
在本实施例中，300bp标准片段为测试模板，样品投入量为100ng。
采用Ultima DNA Library Prep Kit for MGI分别对样品进行末端修复/加A(60uL体系，反应条件：30℃20min，72℃20min，4℃∞)。
接头连接：利用Fast T4 DNA连接酶，分别连接两种NGS接头(total体系-100uL，反应条件：20℃15min，4℃∞)；连接反应结束后，用HieffNGSTM DNA Selection Beads磁珠对连接产物进行回收，0.8×，即80μL Beads进行回收，最后用10μL TE buffer洗脱接头连接产物。分别用2％的琼脂糖凝胶电泳以及2100生物分析仪检测连接产物分布，结果如图2、图3和图4所示。各取1uL连接产物进行扩增(98℃1min，1个循环；98℃10sec，60℃30sec，72℃30sec，8-13个循环；72℃5min，1个循环；4℃保持)，通过扩增产量分析两种有效连接效率，结果见表3。
表3两种NGS接头连接产物PCR扩增产量比较
Figure BDA0002584464390000042
结果显示：
泡状接头(图3)：除单端连有接头单体的片段(394bp)、双端连有接头单体或单端连有接头二聚体的片段(512bp)、双端连有接头二聚体的片段外，还有未连接接头残留及大片段，影响连接效果的分析及评估。
新型接头(图4)：单端连有接头单体的片段(351bp)、双端连有接头单体或单端连有接头二聚体的片段(404bp)及双端连有接头二聚体的片段，只有这3种片段且均是单一独立的片段峰，区分度高，无其它杂带影响分析判断，可以有效用于连接效果的分析和评估。
两种接头连接产物，相同扩增条件，所得PCR产物通过Hieff NGSTM DNA SelectionBeads磁珠，按试剂说明纯化回收；新型接头PCR产量是泡状接头的1.35倍，进而说明本发明的新型接头的有效连接效率较高。
实施例3两种NGS接头建库测试
在本实施例中，以小牛胸腺(calfthymus)gDNA为样本，分别采用Ultima DNALibrary Prep Kit for
Figure BDA0002584464390000051
及OnePotTM II DNA Library Prep Kit for
Figure BDA0002584464390000052
建库试剂盒，比较两种NGS接头的文库产出，结果见图5和图6。
结果显示：
A、Ultima DNA Library Prep Kit for
Figure BDA0002584464390000054
建库试剂盒，Input量为2ng时，新型接头文库产量可达1.6μg，同时泡状接头仅有0.95μg，1.65倍之差；50ng Input量也有1.31倍差距。
B、OnePotTM II DNA Library Prep Kit for
Figure BDA0002584464390000053
试剂盒，相同建库条件下，Input量10ng与50ng，新型接头文库产量分别是泡状接头的2.44、139倍。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
序列表
<110> 翌圣生物科技（上海）有限公司
<120> 一种用于MGI/BGI平台NGS文库制备的接头及其应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaacgacatg gctacgatcc gacttgatct 30
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(1)
<223> 磷酸化
<400> 2
gatcaagtcg gaggccaagc ggtcttagga agacaa 36
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(1)
<223> 磷酸化
<400> 3
gaacgacatg gctacga 17
<210> 4
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(27)
<223> barcord序列的互补序列
<400> 4
tgtgagccaa ggagttgnnn nnnnnnnttg tcttcctaag accgcttggc c 51
<210> 5
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttgtcttcct aaggaacgac atggctacga tccgactt 38
<210> 6
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(1)
<223> 磷酸化
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(41)
<223> barcord序列的互补序列
<400> 6
agtcggaggc caagcggtct taggaagaca aatgcatcta acaactcctt ggctcaca 58
<210> 7
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tgtgagccaa ggagttg 17

Claims (10)

1.一种可用于MGI/BGI平台NGS文库制备的接头，其特征在于，由具有如SEQ NO.1所示序列的DNA单链和具有如SEQ NO.2所示序列的DNA单链部分互补配对而成。
2.如权利要求1所述的可用于MGI/BGI平台NGS文库制备的接头，其特征在于，制备方法为：分别合成接头序列SEQ NO.1和SEQ NO.2，等浓度混合两条序列后退火。
3.一种可用于MGI/BGI平台NGS文库制备的接头及扩增引物组合，其特征在于，包括如权利要求1所述的接头以及具有如SEQ NO.3和SEQ NO.4所示两组序列的扩增引物组。
4.一种用于MGI/BGI平台NGS文库制备的试剂盒，其特征在于，包括：由具有SEQ NO.1所示序列的DNA单链和由具有SEQ NO.2所示序列的DNA单链部分互补配对而成的接头。
5.如权利要求4所述的用于MGI/BGI平台NGS文库制备的试剂盒，其特征在于，还包括扩增引物组，其中包括具有如SEQ NO.3所示序列的上游引物和具有如SEQ NO.4所示序列的下游引物。
6.如权利要求5所述的用于MGI/BGI平台NGS文库制备的试剂盒，其特征在于，还包括Fast T4 DNA连接酶。
7.一种用于MGI/BGI平台的NGS文库的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)对待测的DNA片段进行末端修复；
2)连接如权利要求1所述的可用于MGI/BGI平台NGS文库制备的接头；
3)接头连接结束后，通过DNA磁珠纯化获得接头连接产物；
4)用如权利要求3所述的扩增引物组对连接产物进行扩增。
8.如权利要求7所述的用于MGI/BGI平台的NGS文库的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述末端修复的反应条件为：30±2℃，20±5min；70±2℃，15±5min。
9.如权利要求7所述的用于MGI/BGI平台的NGS文库的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述接头连接使用的酶为Fast T4 DNA连接酶，连接的反应条件为：20±2℃，15±5min。
10.如权利要求7所述的用于MGI/BGI平台的NGS文库的制备方法，其特征在于，步骤4)中所述扩增的反应条件为：98℃1min，1个循环；98℃10sec，60℃30sec，72℃30sec，8-13个循环；72℃5min，1个循环。
CN202010678669.1A 2020-07-14 2020-07-14 一种用于mgi/bgi平台ngs文库制备的接头及其应用 Pending CN111979298A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010678669.1A CN111979298A (zh) 2020-07-14 2020-07-14 一种用于mgi/bgi平台ngs文库制备的接头及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010678669.1A CN111979298A (zh) 2020-07-14 2020-07-14 一种用于mgi/bgi平台ngs文库制备的接头及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111979298A true CN111979298A (zh) 2020-11-24

Family

ID=73439485

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010678669.1A Pending CN111979298A (zh) 2020-07-14 2020-07-14 一种用于mgi/bgi平台ngs文库制备的接头及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111979298A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112708619A (zh) * 2020-12-30 2021-04-27 纳昂达(南京)生物科技有限公司 Mgi平台的建库用接头、试剂盒及建库方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040219580A1 (en) * 2002-04-01 2004-11-04 Dunn John J. Genome signature tags
CN110331187A (zh) * 2019-08-12 2019-10-15 天津华大医学检验所有限公司 组合标签、组合标签接头及其应用
CN111041563A (zh) * 2019-12-31 2020-04-21 广州精科医学检验所有限公司 一种靶向序列捕获及pcr建库方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040219580A1 (en) * 2002-04-01 2004-11-04 Dunn John J. Genome signature tags
CN110331187A (zh) * 2019-08-12 2019-10-15 天津华大医学检验所有限公司 组合标签、组合标签接头及其应用
CN111041563A (zh) * 2019-12-31 2020-04-21 广州精科医学检验所有限公司 一种靶向序列捕获及pcr建库方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
孙朝晖等: "cDNA文库法在HCV-1b检测芯片研制中的应用性研究", 第十届全军检验医学学术会议论文汇编 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112708619A (zh) * 2020-12-30 2021-04-27 纳昂达(南京)生物科技有限公司 Mgi平台的建库用接头、试剂盒及建库方法
CN112708619B (zh) * 2020-12-30 2022-05-17 纳昂达(南京)生物科技有限公司 Mgi平台的建库用接头、试剂盒及建库方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105734048A (zh) 一种基因组DNA的PCR-free测序文库制备方法
CN105506125A (zh) 一种dna的测序方法及一种二代测序文库
CN105671644A (zh) 一种基因组混样测序文库的制备方法
CN105986015B (zh) 一种基于高通量测序的多样本的一个或多个靶序列的检测方法和试剂盒
CN109593757B (zh) 一种探针及其适用于高通量测序的对目标区域进行富集的方法
CN111363783B (zh) 一种基于特有识别序列的t细胞受体库高通量测序文库构建及测序数据分析方法
EP3674413A1 (en) Probe and method for high-throughput sequencing targeted capture target region used for detecting gene mutations as well as known and unknown gene fusion types
CN110878334B (zh) 用于扩增子测序的引物及两步pcr建库方法
EP4303313A1 (en) Liquid-phase hybrid capture method and test kit thereof
CN113005121A (zh) 接头元件、试剂盒及其相关应用
CN111471754A (zh) 一种通用型高通量测序接头及其应用
CN111269909A (zh) 一种转录组建库的方法、试剂和应用
WO2012037881A1 (zh) 核酸标签及其应用
CN110734967A (zh) 一种接头组合物及其应用
CN105401222A (zh) 一种构建测序用dna文库的方法
CN113337501B (zh) 一种发卡型接头及其在双端index建库中的应用
CN111471746A (zh) 检测低突变丰度样本的ngs文库制备接头及其制备方法
CN111979298A (zh) 一种用于mgi/bgi平台ngs文库制备的接头及其应用
CN111005075B (zh) 用于双样本共建测序文库的y型接头和双样本共建测序文库的方法
CN111662970B (zh) 一种bcr免疫组库全长扩增的三代建库测序方法
CN109136217B (zh) 一种测序文库构建的方法、建库试剂及其应用
CN113584135B (zh) 一种混样检测rna修饰并实现精准定量的方法
CN116083423B (zh) 一种靶向富集核酸的探针
CN116463408A (zh) 一种abo基因扩增引物、扩增体系、扩增方法、测序文库构建方法及测序方法
CN109517889B (zh) 一种基于高通量测序分析寡核苷酸序列杂质的方法及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20201124