CN111471754B

CN111471754B - 一种通用型高通量测序接头及其应用

Info

Publication number: CN111471754B
Application number: CN202010407833.5A
Authority: CN
Inventors: 曹彦东; 周洋; 扶媛媛; 杨颖�; 张丽婷
Original assignee: Beijing Anzhiyin Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Anzhiyin Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-05-14
Filing date: 2020-05-14
Publication date: 2021-01-29
Anticipated expiration: 2040-05-14
Also published as: CN111471754A; WO2021227129A1

Abstract

本发明涉及一种通用型高通量测序接头及其应用。本发明所述的通用型高通量测序接头包含双链互补区和单链自由臂，采用本发明所述测序接头能够兼容于多种测序平台，包括Ion Torrent和Illumina平台等，适于临床检测和成本节约，同时还能应用于低频突变的真实性判读。

Description

一种通用型高通量测序接头及其应用

技术领域

本发明涉及基因测序领域，具体涉及一种测序建库过程中的通用型高通量测序接头及其应用。

背景技术

随着基因测序技术的发展，高通量测序技术(High-Throughput Sequencing)在临床实践中应用越来越广泛，如在高危疾病的新生儿筛查、遗传疾病的诊断和基因携带的检测以及基因药物检测用于个体化用药剂量、选择和药物反应等诸多方面。高通量测序技术(High-Throughput Sequencing)又名下一代测序技术Next Generation Sequencing，NGS)，是相对于传统的桑格尔测序技术(Sanger Sequencing)而言的。Sanger测序原理是通过DNA聚合酶使人工合成的短寡核酸引物延伸，与单链DNA模板杂交，合成新的DNA片段，通过聚丙烯酰胺电泳分离不同片段达到读取DNA序列的技术。在Sanger测序出现以后的时间里，由于其读长长、数据准确性高，一直被认为是DNA测序的金标准。至今也是用于下一代测序结果的验证的金标准。但Sanger测序数据通量低，在进行较多基因较多位点的同时检测时费时费力。

NGS测序通常采用大规模平行测序技术(Massively parallel sequencing，MPS)，可实现多样本多位点的同时测序，大大提高了测序通量。目前，高通量测序技术在临床基因检测中被证实具有很高的准确度和灵敏度，然而受到文库构建过程及测序过程中的各种噪音及错误的影响，使得测序结果中出现低频突变时，很难区分其真实性。如由于标签跳跃(index hopping)引入的数据污染，相比桥式扩增，在排他性扩增(ExclusionAmplification，ExAmp)方式下，标签跳跃的比例可高达2％(illumina.Effects of indexmisassignment on multiplexing and downstream[Z]Analysis)。

目前应用广泛的NGS测序平台主要为Ion Torrent和Illumina，但由于测序技术原理不同，不同平台在文库构建时采用技术流程不同，进而造成文库不通用，即适用于IonTorrent平台的文库不可在Illumina平台产生测序数据，反之亦然。这就对临床应用产生了极大的限制，因此有必要去寻求一种通用型文库进而适用不同的测序平台。

文库构建是NGS测序中的重要组成部分，其中测序接头研究则是文库研究中的重点，目前关于测序接头设计主要包括两个方向，一个是试图改进接头形状，如Y型接头或U型接头，以减少或避免接头二聚体的出现，提高可用测序数据量；另一个是在接头结构中加入特定的分子标签用于识别文库构建过程中产生的错误。不过目前现有技术中，通过以上两个研究方向制备的测序文库仍然只能针对固定的测序平台使用，不能同时在主流的测序平台如Ion Torrent和Illumina中使用。Ion Torrent平台及Illumina平台由于其测序原理不同，构建测序模板的方式也完全不同，Ion Torrent平台采用乳液PCR进行测序模板的构建；Illumina平台采用桥式扩增或排他性扩增方式进行测序模板的构建。根据模板构建方式Ion Torrent普遍采用直链接头；Illumina普通采用Y型接头进行文库构建。鉴于以上目前常规高通量测序接头均为单一适用接头，不能适用Ion Torrent及Illumina双平台。

有鉴于此，提出本发明。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术中的高通量测序接头无法实现不同测序平台的兼容性通用，适用性不强等缺陷。

因此，本发明的第一目的是寻求一种适用于多种测序平台的通用型高通量测序接头；

本发明的第二目的是寻求一种适用于多种测序平台的通用型高通量测序接头的制备方法；

本发明的第三目的是寻求一种通用型高通量测序接头的应用；

本发明的第四目的是寻求一种基因低频突变的检测方法。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

本发明提供了一种单链接头，其特征在于，所述单链接头依次连接

1)自由臂，

2)双链互补区，其中，

所述自由臂包含文库扩增引物结合区和载体结合区；

所述双链互补区中包含两种或两种以上测序平台的测序引物结合区。

在一些实施方式中，所述双链互补区中还包含标签序列。

优选的，所述标签序列位于双链互补区远离自由臂一端。

在一些实施方式中，所述标签序列由6～12个随机碱基组成。

在一些实施方式中，所述单链接头的自由臂长度为为30-56bp，所述双链互补区长度为40-58bp。

在一些具体的实施方式中，

所述自由臂可由如下序列构成：

5’-NNNNNNNNNNNNNNNACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC-3’；

所述双链互补区域可由如下序列构成：

5’-GCTCTTCCGATNNNNNNNNNNNNCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGATXXXXXX-3’；

其中，所述“XXXXXX”表示6～12个随机碱基组成的标签序列；

所述“N”表示A、T、C、G任意碱基，或者表示NA(无碱基)。

在一些实施方式中，所述自由臂中还包含标签序列，且标签序列与双链互补区标签序列一致。

在一些具体的实施方式中，

所述自由臂可由如下序列构成：

5’-ACGTCTGAACTCCAGTCACXXXXXXATCTCGTATGNNNNNNNNNNNNNNN-3’，

所述“XXXXXX”表示6～12个随机碱基组成的标签序列；

所述“N”表示A、T、C、G任意碱基，或者表示NA(无碱基)。

本发明还提供了一种Y型高通量测序接头，其特征在于，所述测序接头包括第一单链和第二单链；

所述第一单链和第二单链分别包含：

1)自由臂，

2)双链互补区，其中，

所述自由臂包含文库扩增引物结合区和载体结合区；

在一些实施方式中，所述第一单链和第二单链的自由臂序列不互补，所述第一单链和第二单链经退火可形成Y型结构双链。

在一些实施方式中，所述双链互补区中包含标签序列，所述标签序列位于双链互补区远离自由臂一端。

在一些实施方式中，所述测序平台包括但不限于Illumina、Ion Torrent、PacBio、Roche、Helicos、ABI平台；优选的，所述测序平台为Ion Torrent和Illumina平台。

在一些实施方式中，所述第二单链自由臂中还包含标签序列。

在一些优选实施方式中，所述自由臂中的标签序列与双链互补区中标签序列相同；更优选的，所述自由臂中标签序列靠近双链互补区端。

在一些实施方式中，所述第一单链和第二单链的双链互补区长度为40-58bp；所述第一单链自由臂长度为30-45bp，所述第二单链自由臂长度为35-56bp；所述标签序列为6～12bp的随机碱基组成。

在一些实施方式中，所述第一或第二单链的自由臂3’末端进行稳定性修饰；

优选的，进行硫代修饰；

更优选的，在3’末端最后3个碱基间的磷酸二酯键由硫代磷酸酯代替。

在一些实施方式中，所述第一单链序列如下：

自由臂序列：

5’-NNNNNNNNNNNNNNNACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC-3’；

双链互补区域序列：

所述“XXXXXX”表示6～12个随机碱基组成的标签序列；

5’-GCTCTTCCGATNNNNNNNNNNCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTAXXXXXX-3’

所述“N”表示A、T、C、G任意碱基，或者表示NA(无碱基)。

在一些优选的实施方式中，所述第一单链为自由臂和双链互补区依次5’-3’方向连接。

在一些实施方式中，所述第二单链序列如下：

自由臂序列：

5’-ACGTCTGAACTCCAGTCACXXXXXXATCTCGTATGNNNNNNNNNNNNNNN-3’；

双链互补区域序列：

5’-XXXXXXTAGCTGAGTCGGAGACACGCAGGNNNNNNNNNNATCGGAAGAGC-3’；

所述“XXXXXX”表示6～12个随机碱基组成的标签序列；

所述“N”表示A、T、C、G任意碱基，或者表示NA(无碱基)。

在一些优选的实施方式中，所述第二单链为双链互补区和自由臂依次5’-3’方向连接。

本发明还提供了一种高通量测序接头组，其特征在于，所述测序接头组包括上述所述的高通量测序接头。

在一些实施方式中，所述高通量测序接头组还包括如下另一种Y型高通量测序接头：所述Y型高通量测序接头包含第三和第四单链；

该另一种Y型高通量测序接头序列与上述Y型高通量测序接头序列类似，仅双链互补区序列不同；

其中，所述第三单链的双链互补区域序列如下：

5’-GCTCTTCCGATNNNNNNNNNNNNCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGATXXXXXX-3’；

所述第四单链的双链互补区序列与第三单链双链互补区序列互补；

所述“XXXXXX”表示6～12个随机碱基组成的标签序列；

所述“N”表示A、T、C、G任意碱基，或者表示NA(无碱基)。

在一些优选的实施方式中，所述第三、第四单链的自由臂和双链互补区序列之间的连接顺序与第一、第二单链相同。

在一些优选的实施方式中，所述Y型高通量测序接头的单链序列分别如下：

第一单链序列(SEQ ID NO.1)：

5’-ACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTAXXXXXX-3’；

第二单链序列(SEQ ID NO.2)：

5’-XXXXXXTAGCTGAGTCGGAGACACGCAGGATCGGAAGAGCACGTCTGAACTCCAGTCACXXXXXXATCTCGTATG-3’；

第三单链序列(SEQ ID NO.3)：

5’-ACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGATXXXXXX-3’

第四单链序列(SEQ ID NO.4)：

5’-XXXXXXATCACCGACTGCCCATAGAGAGGATCGGAAGAGCACGTCTGAACTCCAGTCACXXXXXXATCTCGTATG-3’。

在另一些优选的实施方式中，所述Y型高通量测序接头的单链序列分别如下：

第一单链序列(SEQ ID NO.5)：

5’-CAAAGAGCGAGGACACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATTCTCCATCCACCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTAXXXXXX-3’；

第二单链序列(SEQ ID NO.6)：

5’-XXXXXXTAGCTGAGTCGGAGACACGCAGGTGGATGGAGAATCGGAAGAGCACGTCTGAACTCCAGTCACXXXXXXATCTCGTATGGTCCTCGCTCTTTG-3’；

第三单链序列(SEQ ID NO.7)：

5’-CAAAGAGCGAGGACACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCCGCTTTCGC CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGATXXXXXX-3’

第四单链序列(SEQ ID NO.8)：

5’-XXXXXXATCACCGACTGCCCATAGAGAGGGCGAAAGCGGAGATCGGAAGAGCACGTCTGAACTCCAGTCACXXXXXXATCTCGTATG GTCCTCGCTCTTTG-3’。

鉴于序列表生成问题，序列表中的SEQ ID NO.1-8不包含“XXXXXX”。

本发明还提供一种组合物，其特征在于，所组合物包含上述的高通量测序接头或接头组。

本发明还提供一种复合物，其特征在于，所复合物连接于上述的高通量测序接头或接头组。

本发明还提供一种试剂盒，其特征在于，所组合物包含上述的高通量测序接头或接头组。

在一些实施方式中，所述试剂盒为高通量测序建库试剂盒或基因序列富集试剂盒。

本发明还提供上述高通量测序接头的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1分别合成第一链和第二链单链序列；

S2将S1所述两条单链序列进行特异性退火，得到所述高通量测序接头。

本发明还提供一种测序文库的构建方法，其特征在于，

S1制备待测样本目标片段；

S2将上述高通量测序接头或接头组连接于S1的目标片段获得连接产物；

S3扩增S1连接产物，纯化后获得所述待测样本的测序文库。

本发明还提供一种基因低频突变的检测方法，且特征在于，包括如下步骤：

S1制备上述高通量测序接头或接头组，针对同一样本，所述标签序列相同；

S2对待测样本进行目标片段扩增，消化引物；

S3将S2所述消化产物连接S1所述中高通量测序接头或接头组，获得连接产物，扩增连接产物，纯化后获得测序文库；

S4将S3所述测序文库进行测序，根据高通量测序接头的标签序列校正所述测序数据，基于矫正后的测序数据进行突变分析。

在一些实施方式中，所述步骤S4中的突变分析为：基于某一特定突变在同一读段的正义链和反义链均出现则判定为真低频突变。

在一些优选的实施方式中，所述待测样本为基因组DNA。

本发明还提供一种上述高通量测序接头、接头组、组合物、复合物或试剂盒的如下应用：

a、在测序文库构建中或制备测序文库的产品中的应用；

b、在高通量测序中或在制备高通量测序产品中的应用；

c、在基因低频突变中或在制备基因低频突变中的应用；

d、在制备体外诊断产品中的应用；

e、在用于目标基因或扩增富集中的应用。

本发明的有益技术效果：

1)利用本发明的通用高通量测序接头或其试剂盒构建文库，可在主流测序平台Ion Torrent及Illumina所有型号测序平台上进行，产生测序数据。使得文库构建试剂盒及方法不受已有测序平台的限制。满足日益多样的临床需求。对一个特定的检测需求，只需要开发一种建库试剂盒即可在Ion Torrent及Illumina所有型号测序平台产生测序数据，也节约了应用企业的开发成本及周期。

2)本发明提供的通用高通量测序接头包含配对的双链互补区和不配对的单链自由臂。配对双链部分远端含有标签序列，两个自由臂的非自由端含有标签序列。同一样本带有的标签序列碱基构成一致，根据标签序列的一致性可判断在建库过程中是否存在交叉污染。在使用Illumina测序平台部分型号测序仪进行测序后，测序数据的分析可根据相同读段的标签序列碱基构成是否一致来判断是否出现index hopping情况。

3)本发明提供的通用高通量测序接头包含配对的双链互补区和不配对的单链自由臂。配对双链部分远端含有标签序列，同一读段正义链、反义链应带有的标签序列碱基构成相同。某一特定突变需在同一读段的正义链，反义链均出现方可判定为真突变。若某读段只在正义链或反义链出现突变，则可判定为文库构建或测序过程中的错误，不可计入突变进行后续分析流程，避免了假阳性。

4)本发明提供的通用高通量测序接头中包含的标签序列，只利用一段标签序列，通过特定突变需在正义链、反义链同时存在；样本的标签序列碱基构成应和读段内的标签序列碱基构成相同。当某一样本的标签序列与读段内标签序列不相同时，可说明此读段不属于此样本，即出现了标签跳跃情况。利用本发明设计能够有效克服测序部分平台自身固有的标签跳跃问题，可实现低频突变的真实性判读。

5)本发明提供的通用高通量测序接头包含配对的双链互补区和不配对的单链自由臂。示例性的，通用高通量测序接头包含PN接头和AN接头；PN接头双链互补区域由40～58个碱基构成；AN接头双链互补区域由40～58个碱基构成；PN接头或AN接头5’自由臂由30～45个碱基构成；PN接头或AN接头3’自由臂由35～56个碱基构成；标签序列由6～12个碱基构成，从而实现至少构建114048个通用高通量测序接头。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1.实施例1所示的通用高通量测序接头的结构示意图；

图2.实施例2中通用高通量文库2100质控图谱，含通用高通量测序接头文库2100质控图谱(样本R19054232)；

图3.实施例2中通用高通量文库2100质控图谱，含通用高通量测序接头文库2100质控图谱(样本R20005128)；

图4.实施例4中技术线路图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下术语或定义仅仅是为了帮助理解本发明而提供。这些定义不应被理解为具有小于本领域技术人员所理解的范围。

除非在下文中另有定义，本发明具体实施方式中所用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。虽然相信以下术语对于本领域技术人员很好理解，但仍然阐述以下定义以更好地解释本发明。

如本发明中所使用，术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”为包含性的(inclusive)或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。术语“由…组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中某一组被定义为包含至少一定数目的实施方案，这也应被理解为揭示了一个优选地仅由这些实施方案组成的组。

在提及单数形式名词时使用的不定冠词或定冠词例如“一个”或“一种”，“所述”，包括该名词的复数形式。

本发明中的术语“大约”、“大体”表示本领域技术人员能够理解的仍可保证论及特征的技术效果的准确度区间。该术语通常表示偏离指示数值的±10％，优选±5％。

此外，说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)以及诸如此类，是用于区分相似的元素，不是描述顺序或时间次序必须的。应理解，如此应用的术语在适当的环境下可互换，并且本发明描述的实施方案能以不同于本发明描述或举例说明的其它顺序实施。

本发明中的术语“核酸”或“核酸序列”指包含核糖核酸、脱氧核糖核酸或其类似物单元的任何分子、优选聚合分子。所述核酸可为单链的或双链的。单链核酸可为变性双链DNA的一条链的核酸。或者，单链核酸可为不来源于任何双链DNA的单链核酸。

本文所使用的术语“互补”涉及核苷酸碱基G、A、T、C和U之间的氢键碱基配对，以使得当两种给定的多核苷酸或多核苷酸序列彼此退火时，在DNA中A与T配对、G与C配对，在RNA中G与C配对、A与U配对。

其它术语在本发明各个方面的描述中进行定义。

本发明中所述的“测序接头”是指：连接在待测序目标片段两端的一段双链核苷酸序列，该双链寡核苷酸序列可以是双链完全互补，也可以是部分双链互补，比如因末端部分序列不互补而形成的“Y型”接头，本发明的测序接头优选为这种“Y型”接头。另外测序接头的核苷酸序列的构成与所适用测序平台相关，例如构成上，可以包括文库扩增引物序列，样本标签序列，测序引物序列等；而测序接头的序列长度也与测序平台相关，本领域可以进行选择，比如本发明的一些实施方式中，所述的接头长度具体可为：3’自由臂序列为35～56bp，5’自由臂序列长度为30～45bp，双链互补区序列长度为40～58bp。

示例性的，如图1为本发明的一种优选的通用高通量测序“Y型”接头，其包括PN接头及AN接头，其可分别位于目标序列的任一端。所述PN接头及AN接头均包含双链互补区、单链5’自由臂和单链3’自由臂。在一些实施方式中，通用高通量测序接头的PN接头及AN接头的双链互补区均包含标签序列，所述标签序列为由6～12个碱基组成。在一些优选的实施方式中，所述高通量测序接头的AN接头单链3’自由臂非自由端还包含与标签序列相同的碱基构成，上述通用高通量测序接头的PN接头单链3’自由臂非自由端包含与标签序列相同的碱基构成。在一些实施方式中，为增强接头稳定性，防止水解，通用高通量测序接头AN接头及PN接头的3’-自由臂的3’末端进行硫代修饰；优选的，在最后3个碱基间的磷酸二酯键由硫代磷酸酯代替。示例性的，可通过连接酶将通用高通量测序接头AN接头与PN接头的双链互补端与原始基因片段通过连接反应进行连接。而AN接头的5’自由臂及PN接头的3’自由臂由于为非互补配对单链而不能与原始基因片段相连，从而能够保障通用高通量测序接头与DNA片段的连接效率。

本发明说明书中所述的“PN接头”和“AN接头”分别是指：包含双链互补区及单链3’/5’自由臂的部分双链结构片段(Y型结构)，其在文库构建时分别连接于目标序列的一端，两者核苷酸序列优选不同。

本发明中所述的“自由臂”是指：接头序列中碱基不互补配对的区域，比如本发明PN接头或AN接头的非配对区域，因此，即便不明确自由臂间序列不互补，本领域也应该理解到两者序列不互补，在一些情况下能够形成Y型结构。另外，在一些实施方式中，本发明的自由臂中包括文库扩增引物区；在另一些实施方式中，本发明的3’自由臂还包含标签序列。

本发明中所述的“双链互补区”是指：包含于测序接头中的双链互补的区域，该区域通常包含测序引物序列，本发明所双链互补区包含至少两个测序平台的测序引物序列。

本发明中所述的“标签序列”是指：6～12bp碱基长度的核苷酸序列，用于识别不同文库样本。

本发明中所述的“非自由端”是指：PN接头或AN接头双链互补区域与单链3’或5’自由臂相连的一端。

本发明中所述的“自由端”是指：PN接头或AN接头的单链3’自由臂的3’端或单链5’自由臂的5’端。

本发明所述的“高通量测序平台”是指：诸如Ion Torrent、Illumina、Roche454和ABI等测序平台，虽然本发明优选所述测序平台为Ion Torrent和Illumina，但并不对其进行限制。本领域清楚，基于本发明的发明构思，可以针对任意两个或多个平台进行引物序列选择，将其构建与接头序列中，进而制备出本发明的兼容性高通量测序接头。另外，对于不同测序平台下的测序仪，考虑到同类型测序平台下测序仪的测序原理基本相同，因此本发明的方法适用于相同平台下的所有机型，比如，所述Ion Torrent测序平台内所有型号，包括但不限于Ion GeneStudio^TM S5 Plus、PGM、Proton等；Illumina测序平台内所有型号，包括但不限于Miseq DX、MiniSeq、NextSeq等都适于本发明。

本发明中所述的“低频突变”是指：基因突变频率低于5％的突变情况，包括低于5％，低于4％，低于3％，低于2％，低于1％等各种突变情况。

本发明通过附图和如下实施例进一步描述，所述的附图和实施例只是为了例证本发明的特定实施方案，不应理解为以任何方式限制本发明范围之意。除非另外说明，本发明中所公开的实验方法均采用本技术领域常规技术，通用高通量测序接头由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，实施例中所用的试剂和原材料均可由市场购得。

实施例1高通量测序接头设计和制备

根据图1所示结构组成，设计两组通用高通量测序接头AN1/PN1和AN2/PN2。其中，AN1/PN1为一组序列较短的通用高通量测序接头，AN2/PN2为另一组序列较长的通用高通量测序接头。

具体制备方法如下：

制备以下序列1-4所示测序接头，将序列1与2退火形成AN1接头，将序列3与4退火形成AN2接头。

序列1：

5’-XXXXXXTAGCTGAGTCGGAGACACGCAGGATCGGAAGAGCACGTCTGAACTCCAGTCACXXXXXXATCTCGTA*T*G-3’；(3’自由臂链)

序列2：

5’-ACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTAXXXXXX-3’；(5’自由臂链)

序列3：

5’-XXXXXXTAGCTGAGTCGGAGACACGCAGGTGGATGGAGAATCGGAAGAGCACGTCTGAACTCCAGTCACXXXXXXATCTCGTATGGTCCTCGCTCTT*T*G-3’；(3’自由臂链)

序列4：

5’-CAAAGAGCGAGGACACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATTCTCCATCCACCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTAXXXXXX-3’；(5’自由臂链)

制备以下序列5-8所示测序接头，将序列5与6退火形成PN1，序列7与8退火形成PN2接头。

序列5：

序列6：

5’-XXXXXXATCACCGACTGCCCATAGAGAGGATCGGAAGAGCACGTCTGAACTCCAGTCACXXXXXXATCTCGTA*T*G-3’

序列7：

序列8：

5’-XXXXXXATCACCGACTGCCCATAGAGAGGGCGAAAGCGGAGATCGGAAGAGCACGTCTGAACTCCAGTCACXXXXXXATCTCGTATG GTCCTCGCTCTT*T*G-3’

其中，AN接头双链互补区末端包含标签序列，其中标签序列为6～12个随机碱基“X”。AN接头3’自由臂也包含标签序列为6～12个随机碱基“X”，并连接于AN接头3’自由臂的非自由端。PN接头双链互补区末端包含标签序列，其中标签序列为6～12个随机碱基“X”。PN接头3’自由臂也包含标签序列为6～12个随机碱基“X”，并连接于PN接头3’自由臂的非自由端。*代表硫代修饰位点，具体的，为增强接头稳定性，防止水解，通用高通量测序接头AN接头及PN接头的3’自由臂的3’末端最后3个碱基间的磷酸二酯键由硫代磷酸酯代替。

实施例2主动脉相关基因通用高通量测序文库制备

分别采用实施例1制备的通用高通量测序接头AN1/PN1和AN2/PN2用于实验。

其中，通用高通量测序接头数目对应待测样本的数量。例如，待测样本的数量为10，则对应制备10组通用高通量测序接头组，每组通用高通量测序接头组中均包含PN1接头及AN1接头。同组PN1接头与AN1接头中标签序列碱基序列构成相同，不同接头组中标签序列碱基序列构成不同。

连接待测目的片段与上述测序接头组，获得连接产物；其中，同一样本来源的所述基因片段连接同一组所述通用高通量测序接头组；扩增所述连接产物得到扩增产物，纯化后获得所述待测样本的通用高通量测序文库。

具体步骤如下：

1、DNA提取及质检

(1)样本基因组DNA提取：取外周血样本1和2(分别对应R190542432和R20005128)分别进行基因组DNA提取。样本DNA的提取按照北京安智因生物技术有限公司生产的核酸提取试剂(DR181003-48)操作说明进行提取。

(2)利用NanodropOne进行DNA纯度测定，利用Qubit 4.0进行双链DNA浓度测定。将DNA稀释至5ng/ul备用。

2、文库构建

待检目标区域为ACTA2，COL3A1，FBN1，MYH11，MYLK，SMAD3，TGFBR1，TGFBR2基因的全编码区和可变剪切区(外显子向内含子外延20bp)。目标检测区域的多重PCR引物池，基于Ion Ampliseq Designer设计，由Thermo Fisher公司进行合成并提供。

(1)目标片段扩增，具体实施如下：

组分	反应体积
		多重PCR master mix	2uL
引物池1/2	5uL
		基因组DNA(5ng/uL)	2uL
无核酸酶水	1uL
		总体积	10uL

反应条件

(2)消化反应，具体实施如下：

将同一样本引物池1与引物池2扩增产物混合，体积为20uL，加入2uL消化反应预混液，反应条件见下：

反应温度	反应时间
		50℃	10min
55℃	10min
		60℃	20min
10℃	保持

(3)利用连接酶将样本1和2分别连接通用高通量测序接头AN1/PN1和AN2/PN2，连接酶为上海翊圣生物科技有限公司生产的Fast T4 DNA Ligase，连接缓冲液为上海翊圣生物科技有限公司生产的5×Fast Ligation Buffer。具体实施如下：

按照下表配置连接反应液：

组分	反应体积
		连接酶	2uL
连接缓冲液	4uL
		通用高通量测序接头PN接头(10uM)	1uL
通用高通量测序接头AN接头(10uM)	1uL
		酶切后的PCR产物	22uL
总体积	30uL

反应条件

反应温度	反应时间
		22℃	30min
68℃	5min
		72℃	5min
10℃	保持

(4)纯化及扩增，具体实施如下：

利用Ampure磁珠纯化连接后产物，对纯化后的产物进行PCR扩增。

反应体系

组分	反应体积
		PCR MIX	25uL
上游引物(5uM)	5uL
		下游引物(5uM)	5uL
纯化后连接产物	20uL
		总体积	50uL

反应条件

(5)文库纯化及定量，具体实施如下：

利用Ampure磁珠对扩增后的文库进行纯化，纯化后文库利用Agilent 2100及QUBIT4.0对文库进行质检及定量。文库2100质检图谱见图2和图3，显示文库长度片段主峰在400bp附近且文库主峰呈单一尖锐单峰，结果表明原始基因片段两端已连接通用高通量测序接头。根据稀释倍数计算得到文库浓度，文库浓度高于1ng/uL可进行后续实验步骤，低于1ng/uL建库失败。

实施例3基于Ion Torrent平台和Illumina平台的测序分析

本实施例分别采用Ion Torrent平台和Illumina平台对上述高通量文库进行测序验证，具体如下：

1、Ion Torrent平台Ion GeneStudio^TM S5 Plus测序仪上机测序，具体实施步骤如下：

将上述纯化并质检后文库稀释，利用Ion 520^TM&Ion 530^TM Kit–OT，按照试剂盒操作规程进行，在IonTouch 2仪器上进行模板制备后，Ion GeneStudio^TM S5 Plus基因测序仪上进行测序及数据分析。

2、Illumina平台Miseq DX测序仪上机测序，具体实施步骤如下：

将上述纯化并质检后文库稀释，利用Miseq DX Reagent Kit v3，按照试剂盒操作规程进行，在Miseq DX基因测序仪上进行测序及数据分析。

如下进行测序数据结果分析，具体如下：

对于Ion GeneStudio^TM S5 Plus平台：

1、分析通用高通量测序文库浓度，文库片段长度分布浓度满足测序后续要求；

2、分析Ion GeneStudio^TM S5 Plus平台下机结果，主要包含≥Q20碱基数，读段数，读段平均读长，On Target，Uniformity。具体见下表：

3、以上两个样本读段平均长度≥200bp，表明样本所有样本均读通即待测目标片段首尾之间的碱基均可识别；Mean depth(平均测序深度)均≥500×，表明待测目标片段均被测序500次以上；On Target(中靶率)均≥95％，表明所测得碱基序列中有95％可比对到待测目标区域范围内；Uniformity(均一性)均≥90％，表明待测目标区域中每个读段扩增效率及连接通用高通量接头效率相近。以上参数均表明两样本待测目标区段两端成功连接通用高通量测序接头，且测序成功；表明连接通用高通量测序接头的文库可在IonGeneStudio^TM S5 Plus基因测序仪进行测序。

对于Miseq DX平台：

1、分析Miseq DX平台下机结果，主要包含数据产量，Reads数量，Q30百分比。见下表所示。

标签编号	样本名	数据产量(Gb)	Reads(M)	Q30(％)
					AN1/PN1	R190542432	0.573	3.82	89.52
AN2/PN2	R20005128	1.192	7.95	76.37

2、以上两样本数据产量均≥0.5G，Reads数据均≥3M，Q30占比≥75％，表明两样本测序成功；表明两样本待测目标区段两端成功连接通用高通量测序接头，且连接通用高通量测序接头的文库可在Miseq DX基因测序仪进行测序。

综上所述，利用本发明制备的测序接头建库，能够同时满足Ion GeneStudio^TM S5Plus平台和Miseq DX平台的测序要求，即同时满足Ion Torrent平台和Illumina平台两种主流测序平台的要求，因此，本发明的测序接头具备通用型建库接头属性。

另外，由于Ion Torrent测序平台内所有型号测序原理及过程一致，适用于IonGeneStudio^TM S5 Plus测序仪的文库即可适用Ion Torrent平台其他型号测序仪，如PGM、Proton等。同理，Illumina测序平台内所有型号测序原理及过程一致，适用于Miseq DX基因测序仪的文库即可适用于Illumina平台其他型号测序仪，MiniSeq、NextSeq等。因此，可以明确，连接本发明的通用测序接头的文库可适用于Ion Torrent平台及Illumina平台所有型号测序仪。

实施例4、低频突变真实性判断

本实施例进一步验证本发明测序接头在低频检测中的应用，具体提供一种低频突变真实性判断的检测方法，可校正index hopping引入的测序错误。技术线路图见图4所示，具体包含以下步骤：

1、样本稀释

(1)样本为商品化肿瘤SNV 5％gDNA标准品(GW-OGTM005),利用商品化人基因组DNA(G304A)梯度稀释至突变频率为2.5％，1.25％，0.5％，命名为样本1，样本2，样本3，样本4。

(2)利用Qubit 4.0进行双链DNA浓度测定。将DNA稀释至5ng/ul备用。

2、文库构建

待检目标区域为EGFR(L858R/T790M/△E746_△A750)/PIK3CA(E545K)/KRAS(G12D/G13D/A146T)/NRAS(Q61K)基因指定热点区域。目标检测区域的多重PCR引物池，采用Thermo Fisher公司的Ampliseq colon&lung panel。每个样本3重复。

(1)目标片段扩增，具体实施如下：

组分	反应体积
		多重PCR master mix	4uL
引物池	10uL
		基因组DNA(5ng/uL)	2uL
无核酸酶水	4uL
		总体积	20uL

反应条件

(2)消化反应，具体实施如下：

在上述PCR产物中加入2uL消化反应预混液，反应条件见下：

反应温度	反应时间
		50℃	10min
55℃	10min
		60℃	20min
10℃	保持

(3)连接通用高通量测序接头：

I.制备通用高通量测序接头组：所述高通量测序接头组采用实施例1所述的PN1/AN1和PN2/AN2，如下以PN2/AN2试验数据为例，制备4组接头组，其中样本序列标签分别为ATCACG；CGATGT；TTAGGC；TGACCA，具体制备方法参见实施例1。

II.连接通用高通量测序接头，具体实施如下：

反应体系

反应条件

反应温度	反应时间
		22℃	30min
68℃	5min
		72℃	5min
10℃	保持

(4)纯化及扩增，具体实施如下：

反应体系

反应条件

(5)文库纯化及定量，具体实施如下：

利用Ampure磁珠对扩增后的文库进行纯化，纯化后文库利用QUBIT 4.0进行定量。

根据稀释倍数计算得到文库浓度，文库浓度高于1ng/uL可进行后续实验步骤，低于1ng/uL建库失败。

3、Illumina平台Miseq DX测序仪上机测序，具体实施步骤如下：

4、测序数据分析，主要包含以下内容：

(1)利用标签序列识别同一样本来源的数据，将具有相同标签序列的测序数识别为同一样本来源的数据；

(2)对于上述归入同一样本来源的测序数据，进一步利用测序标签序列与通用高通量测序接头AN接头双链端标签序列碱基序列构成一致识别样本交叉污染及标签跳跃(index hopping)引入的测序错误。

(3)对于上述归入同一样本来源的测序数据，进一步利用突变位点正义链，反义链应含有相同碱基构成的标签序列，即AN端与PN端应含有相同碱基构成的标签序列。

具体结果见下表：

样本1(预期突变频率5％)

基因	突变位点	突变频率	正向读段数	负向读段数
					EGFR	L858R	5％	198	201
EFGR	T790M	5.5％	213	187
					EGFR	ΔE746_A750	4.7％	217	168
PIK3CA	E545K	6.8％	204	196
					KRAS	G12D	5.3％	199	200
KRAS	G13D	4.5％	184	216
					KRAS	A146T	7％	214	186
NRAS	Q61K	4.3％	204	193

样本2(预期突变频率2.5％)

样本3(预期突变频率1.25％)

基因	突变位点	突变频率	正向读段数	负向读段数
					EGFR	L858R	1.5％	216	180
EFGR	T790M	2.5％	245	152
					EGFR	ΔE746_A750	1％	249	143
PIK3CA	E545K	2％	225	175
					KRAS	G12D	1.3％	199	199
KRAS	G13D	1.8％	192	208
					KRAS	A146T	1％	203	197
NRAS	Q61K	1.8％	194	204

样本4(预期突变频率0.5％)

基因	突变位点	突变频率	正向读段数	负向读段数
					EGFR	L858R	1.5％	216	181
EFGR	T790M	0.5％	245	155
					EGFR	ΔE746_A750	0.3％	227	154
PIK3CA	E545K	1％	218	182
					KRAS	G12D	0.5％	182	218
KRAS	G13D	1.5％	200	200
					KRAS	A146T	0.8％	205	195
NRAS	Q61K	0.5％	217	182

在文库构建过程中采用通用高通量测序接头，测序完成后，对得到的测序数据进行分析。首先利用标签序列识别同一样本来源数据，将样本拆分为4个突变频率的样本1，样本2，样本3，样本4。然后识别读段接头双链部分标签序列与样本标签序列是否相同，排除index hopping问题。而后通过对带有同一标签序列的正向读段及负向读段是否带有相同的突变位点进一步识别突变位点的真实性。而对于只存在正向读段或负向读段的突变或读段内标签序列与样本标签不一致的突变加以排除，从而实现低频突变的正确识别。

5、结果表明：通过采用本发明的通用高通量测序接头进行建库测序，能够有效检测频率低于5％的低频突变，对于突变频率为0.5％的低频突变也可有效检出，进一步降低了低频突变的检测限。

以上对本申请具体实施方式的描述并不限制本申请，本领域技术人员可以根据本申请做出各种改变或变形，只要不脱离本申请的精神，均应属于本申请所附权利要求的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京安智因生物技术有限公司

<120> 一种通用型高通量测序接头及其应用

<130> 2020

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

accgagatct acactctttc cctacacgac gctcttccga tcctgcgtgt ctccgactca 60

gcta 64

<210> 2

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tagctgagtc ggagacacgc aggatcggaa gagcacgtct gaactccagt cacatctcgt 60

atg 63

<210> 3

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

accgagatct acactctttc cctacacgac gctcttccga tcctctctat gggcagtcgg 60

tgat 64

<210> 4

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atcaccgact gcccatagag aggatcggaa gagcacgtct gaactccagt cacatctcgt 60

atg 63

<210> 5

<211> 88

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

caaagagcga ggacaccgag atctacactc tttccctaca cgacgctctt ccgattctcc 60

atccacctgc gtgtctccga ctcagcta 88

<210> 6

<211> 87

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tagctgagtc ggagacacgc aggtggatgg agaatcggaa gagcacgtct gaactccagt 60

cacatctcgt atggtcctcg ctctttg 87

<210> 7

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

caaagagcga ggacaccgag atctacactc tttccctaca cgacgctctt ccgatctccg 60

ctttcgccct ctctatgggc agtcggtgat 90

<210> 8

<211> 89

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atcaccgact gcccatagag agggcgaaag cggagatcgg aagagcacgt ctgaactcca 60

gtcacatctc gtatggtcct cgctctttg 89

Claims

1.一种高通量测序接头组，其特征在于，所述测序接头组包括如下Y型高通量测序接头：

所述Y型高通量测序接头包含第一、第二、第三和第四单链；

所述第一单链和第二单链的自由臂序列不互补，所述第一单链和第二单链经退火形成Y型结构双链；

所述第三单链和第四单链的自由臂序列不互补，所述第三单链和第四单链经退火形成Y型结构双链；

所述第一单链序列如下：

自由臂序列：

5’-NNNNNNNNNNNNNNNACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC-3’；

双链互补区域序列：

5’-GCTCTTCCGATNNNNNNNNNNCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTA XXXXXX-3’；

所述第二单链序列如下：

自由臂序列：

5’-ACGTCTGAACTCCAGTCACXXXXXXATCTCGTATGNNNNNNNNNN NNNNN-3’；

双链互补区域序列与第一单链的双链互补区序列互补；

所述第三单链序列如下：

自由臂序列：

5’-NNNNNNNNNNNNNNNACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC-3’；

双链互补区域序列：

5’-GCTCTTCCGATNNNNNNNNNNNNCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT XXXXXX-3’；

所述第四单链序列如下：

自由臂序列：

5’-ACGTCTGAACTCCAGTCACXXXXXXATCTCGTATGNNNNNNNNNN NNNNN-3’；

双链互补区序列与第三单链双链互补区序列互补；

所述“XXXXXX”表示6～12个随机碱基组成的标签序列；

所述“N”表示A、T、C、G任意碱基，或者表示无碱基；

所述自由臂序列与双链互补区域序列依次连接。

2.权利要求1所述的高通量测序接头组，其特征在于，所述Y型高通量测序接头的单链序列分别如下：

第一单链序列：

5’-ACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTAXXXXXX - 3’；

第二单链序列：

5’-XXXXXXTAGCTGAGTCGGAGACACGCAGGATCGGAAGAGCACGTCTGAACTCCAGTCACXXXXXXATCTCGTATG- 3’；

第三单链序列：

5’-ACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGATXXXXXX-3’；

第四单链序列：

3.权利要求1所述的高通量测序接头组，其特征在于，所述Y型高通量测序接头的单链序列分别如下：

第一单链序列：

5’-CAAAGAGCGAGGACACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGC TCTTCCGATTCTCCATCCACCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTAXXXXXX - 3’；

第二单链序列：

5’-XXXXXXTAGCTGAGTCGGAGACACGCAGGTGGATGGAGAATCGGA AGAGCACGTCTGAACTCCAGTCACXXXXXXATCTCGTATGGTCCTCGCTCTTTG - 3’；

第三单链序列：

5’-CAAAGAGCGAGGACACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGC TCTTCCGATCTCCGCTTTCGCCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGATXXXXXX-3’；

第四单链序列：

5’-XXXXXXATCACCGACTGCCCATAGAGAGGGCGAAAGCGGAGATC GGAAGAGCACGTCTGAACTCCAGTCACXXXXXXATCTCGTATGGTCCTCGCTCTTTG-3’。

4.一种组合物，其特征在于，所述组合物包含权利要求1-3任一所述的高通量测序接头组。

5.一种复合物，其特征在于，所述复合物包含权利要求1-3任一所述的高通量测序接头组。

6.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1-3任一所述的高通量测序接头组。

7.权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为高通量测序建库试剂盒或基因序列富集试剂盒。

8.一种测序文库的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1 制备待测样本目标片段；

S2 将权利要求1-3任一所述的高通量测序接头组连接于S1的目标片段获得连接产物；

S3 扩增S1连接产物，纯化后获得所述待测样本的测序文库。

9.一种基因低频突变的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1 制备权利要求1-3任一所述的高通量测序接头组，针对同一样本，所述标签序列相同；

S2 对待测样本进行目标片段扩增，消化引物；

S3 将S2所述消化产物连接S1所述高通量测序接头组，获得连接产物，扩增连接产物，纯化后获得测序文库；

S4 将S3所述测序文库进行测序，根据高通量测序接头组的标签序列校正所述测序数据，基于矫正后的测序数据进行突变分析；所述步骤S4中的突变分析为：基于某一特定突变在同一读段的正义链和反义链均出现则判定为真低频突变；

所述检测方法为非疾病诊断目的。

10.权利要求9所述的基因低频突变的检测方法，其特征在于，所述待测样本为基因组DNA。

11.权利要求1-3任一所述的高通量测序接头组，权利要求4所述组合物，权利要求5所述复合物或权利要求6-7任一所述的试剂盒的如下应用：

a、在测序文库构建中或制备测序文库的产品中的应用；

b、在高通量测序中或在制备高通量测序产品中的应用；

c、在基因低频突变检测中或在制备基因低频突变检测产品中的应用，所述应用为非疾病诊断目的；

d、在制备体外诊断产品中的应用；

e、在用于目标基因扩增富集中的应用，所述应用为非疾病诊断目的。