CN111118001A - 一种多测序平台通用接头、适用于多测序平台的文库构建方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种多测序平台通用接头、适用于多测序平台的文库构建方法及试剂盒,基于多测序平台通用接头的设计及配套快速建库流程的开发,通过一步反应完成DNA片段化、末端修复和dA尾添加,然后在DNA片段两端连接上多测序平台通用接头,所构文库即可同时在多个测序平台上进行高通量测序。该法解决了因测序平台差异造成需多次构建不同测序平台文库的临床难题,大幅缩减了建库时长和成本,同时单次建库的低起始模板量需求也大大节约了临床样本的消耗。
Description
技术领域
本发明涉及高通量测序领域,特别是涉及一种多测序平台通用接头、适用于多测序平台的文库构建方法及试剂盒。
背景技术
随着高通量测序技术的发展,各种生物科学领域的研究和临床机构的检测都涉及到测序文库的构建及高通量测序服务。临床应用的推广带动了高通量测序市场的发展,也对文库构建和测序效率产生了更高要求,文库制备环节的时间和成本已成为广泛推广高通量测序应用的关键因素。高通量DNA文库样本的制备,是将待测序的DNA片段两端连接上与测序平台相匹配的接头序列,即将待测DNA装到一个特定测序载体中的过程。
常规的测序文库制备只能在待测序的DNA片段两端连接一个特定测序平台接头,所得文库也只能在特定匹配的测序平台上进行上机检测。比如连接了Ion Torrent接头的测序文库只能在Ion Torrent高通量测序仪上运行,而无法在Illumina测序平台或其他测序平台上展开检测。同样,基于Illumina接头构建的测序文库只能在Illumina测序平台上运行而无法在Ion Torrent测序平台或其他测序平台上展开测试。因此,目前科研机构或临床单位在进行高通量测序时,必须针对所用测序平台,谨慎选择合适的测序方法或匹配的试剂盒。当遇到需要在多个不同测序平台上展开试验时,则需要针对同一样本构建多个适用于不同测序平台的文库,如图1所示,造成了时间和人力物力成本的浪费。当遇到样本稀缺无法满足多次建库时,极大阻碍了进一步的深入检测研究。
发明内容
基于此,有必要提供一种适用于多测序平台的文库构建方法及试剂盒。
一种适用于多测序平台的文库构建方法,基于多测序平台通用接头的设计及配套快速建库流程的开发,通过一步反应完成DNA片段化、末端修复和dA尾添加,然后在DNA片段两端连接上多测序平台通用接头,所构文库即可同时在多个测序平台上进行高通量测序。
该多测序平台通用接头,包括第一测序平台探针结合序列、第二测序平台探针结合序列、第一测序平台引物结合序列、第二测序平台引物结合序列、第一互补序列和第二互补序列;所述第一互补序列和所述第二互补序列反向互补,所述第一测序平台探针结合序列、所述第二测序平台探针结合序列、所述第一测序平台引物结合序列和所述第二测序平台引物结合序列中的至少两条序列分别与所述第一互补序列和所述第二互补序列连接。
在其中一个实施例中,第一测序平台为Illumina高通量测序平台,所述第一测序平台探针结合序列为P5序列和P7序列;第二测序平台为Ion Torrent高通量测序平台,所述第二测序平台探针结合序列为P1序列;所述第一测序平台引物结合序列为Seq-read1序列和Seq-read2序列,所述第二测序平台引物结合序列为特异A序列。
在其中一个实施例中,包括第一接头序列和第二接头序列;所述第一接头序列从5’端到3’端依次包括P5序列、特异A序列、Seq-read1序列和第一互补序列,所述第二接头序列从5’端到3’端依次包括第二互补序列、Seq-read2序列、P1序列和P7序列;所述第一互补序列和所述第二互补序列完全互补,且在所述第一互补序列的3’末端有一个凸出的T碱基。
在其中一个实施例中,所述第一接头序列的5’末端与所述第二接头序列的3’末端通过尿嘧啶连接。
在其中一个实施例中,多测序平台通用接头包括第一接头序列、第二接头序列、第一扩增引物和第二扩增引物。所述第一接头序列从5’端到3’端依次包括部分特异A序列、Seq-read1序列和第一互补序列,所述第二接头序列从5’端到3’端依次包括第二互补序列、Seq-read2序列和部分P1序列;所述第一扩增引物从5’端到3’端依次包括P5序列和部分特异A序列,所述第二扩增引物从5’端到3’端依次包括P7序列和部分P1序列。所述第一互补序列和所述第二互补序列完全互补,且在所述第一互补序列的3’末端有一个凸出的T碱基。所述第一扩增引物上的特异A序列和所述第一接头序列上的特异A序列有15~25bp的交叠,所述第二扩增引物上的P1序列和所述第二接头序列上的P1序列有15~25bp的交叠。
在其中一个实施例中,多测序平台通用接头包括第一接头序列、第二接头序列、第三接头序列和第四接头序列。所述第一接头序列从5’端到3’端依次包括P5序列、Seq-read1序列和第一互补序列,所述第二接头序列从5’端到3’端依次包括第二互补序列和P1序列,所述第三接头序列从5’端到3’端依次包括第二互补序列、Seq-read2序列和P7序列,所述第四接头序列从5’端到3’端依次包括特异A序列和第一互补序列。所述第一互补序列和所述第二互补序列完全互补,且在所述第一互补序列的3’末端有一个凸出的T碱基。所述第一接头序列的第一互补序列和所述第四接头序列的第一互补序列其碱基信息可以不同,所述第二接头序列的第二互补序列和第三接头序列的第二互补序列其碱基信息可以不同。
在其中一个实施例中,所述第一接头序列的5’末端与所述第二接头序列的3’末端通过尿嘧啶连接,所述第三接头序列的3’末端与所述第四接头序列的5’末端通过尿嘧啶连接。
本发明提供一种适用于多测序平台的文库构建方法,在完成DNA片段化、末端修复以及dA尾添加后将DNA片段与上述任一多测序平台通用接头连接。
在其中一个实施例中,所述通用多测序平台的文库构建方法为:在一个反应管中将DNA样本与快速酶混合液、快速缓冲液混合,一步完成DNA片段化、末端修复以及dA尾添加;然后DNA片段两端与多测序平台通用接头连接,所构文库即可同时在多个测序平台上进行高通量测序;所述快速酶混合液中含有DNA切刻内切酶I、DNA切刻内切酶II、切口消化酶、T4 DNA聚合酶、T4多聚核酸激酶、Klenow大片段、Klenow片段3’→5’exo-和rTaq DNA聚合酶中的多种或全部;所述快速缓冲液中含有Tris-HCl、MgCl2、NaCl、dNTPs、ATP、DTT、BSA和Triton X-100中的多种或全部。
在其中一个实施例中,所述快速酶混合液的工作浓度为:DNA切刻内切酶I 0.2U/μL~1.0U/μL、DNA切刻内切酶II 0U/μL~1.0U/μL、切口消化酶1U/μL~5U/μL、T4 DNA聚合酶0.1U/μL~2U/μL、T4多聚核酸激酶1U/μL~5U/μL、Klenow大片段0.1U/μL~1U/μL、Klenow片段3’→5’exo-0.5U/μL~2.0U/μL和rTaq DNA聚合酶0.1U/μL~1U/μL;
所述快速缓冲液的工作浓度为:Tris-HCl 10mM~80mM、MgCl210mM~50mM、NaCl20mM~80mM、dNTPs 0.1mM~0.8mM、ATP 0.5mM~2.0mM、DTT 5mM~20mM、BSA0.05mg/ml~0.2mg/ml和Triton X-100质量百分比0.1%~0.5%。
本发明还提供了一种用于文库构建的试剂盒,包括上述多测序平台通用接头、快速酶混合液以及快速缓冲液。
本发明的多测序平台通用接头中,在高温变性接头退火时,第一互补序列和第二互补序列完全互补形成局部稳定的双链结构,且在第一互补序列的3’末端有一个凸出的T碱基,便于和dA尾DNA片段互补相连。第一测序平台探针结合序列可以和第一测序平台上的锚定探针互补结合;第二测序平台探针结合序列可以和第二测序平台上的锚定探针互补结合;第一测序平台引物结合序列可以和第一测序平台的测序引物结合,定位测序起始信息;第二测序平台引物结合序列可以和第二测序平台的测序引物结合,定位测序起始信息。如此,该测序接头可兼容多种测序平台的测序要求,包含此接头的DNA文库片段可以在多种测序平台上兼容测序。如图2所示,通过该多测序平台通用接头,使得仅通过一次文库构建,即可获得能够同时在多种高通量测序平台上兼容测序的文库,解决了因测序平台不同造成多次构建不同测序平台文库的临床难题,大幅缩减了建库时长和成本,另外低起始模板量需求也大大节约了临床样本消耗。将构建好的文库在多种高通量测序平台上分析,显示具有良好的平台兼容性和出色的性能表现。
附图说明
图1为传统单一平台文库构建方法的示意图;
图2为采用本发明的多测序平台通用接头的文库构建方法的示意图;
图3为一实施例的多测序平台通用接头的结构示意图;
图4为另一实施例的多测序平台通用接头的结构示意图;
图5为另一实施例的多测序平台通用接头的结构示意图;
图6为另一实施例的多测序平台通用接头的结构示意图;
图7为另一实施例的多测序平台通用接头的结构示意图。
具体实施方式
为了便于理解本发明,下面将对本发明进行更全面的描述,并给出了本发明的较佳实施例。但是,本发明可以以许多不同的形式来实现,并不限于本文所描述的实施例。相反地,提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明一实施例的多测序平台通用接头,包括第一测序平台探针结合序列、第二测序平台探针结合序列、第一测序平台引物结合序列、第二测序平台引物结合序列、第一互补序列和第二互补序列。其中,第一互补序列和第二互补序列反向互补,第一测序平台探针结合序列、第二测序平台探针结合序列、第一测序平台引物结合序列和第二测序平台引物结合序列中的至少两条序列分别与第一互补序列和第二互补序列连接。
可以理解,第一互补序列和第二互补序列中一个序列的3’末端具有一个突出碱基T,以便在反向互补时一端形成粘性末端用于与DNA片段连接,而第一互补序列和第二互补序列的远离DNA片段的一端则分别与第一测序平台探针结合序列、第二测序平台探针结合序列、第一测序平台引物结合序列、第二测序平台引物结合序列中的任意两条序列连接。当各探针结合序列和引物结合序列均分别与第一互补序列或第二互补序列连接时,则多测序平台通用接头仅包括接头序列;当各探针结合序列和引物结合序列中部分与第一互补序列或第二互补序列连接时,其他序列以引物的形式在建库中的PCR扩增步骤带入,则多测序平台通用接头包括接头序列和扩增引物。因此,各探针结合序列和引物结合序列的具体连接方式具有多种组合方式,支持并不限于Illumina测序平台、Ion Torrent测序平台。
多测序平台通用接头的接头序列在合成时可以做一定的修饰,包括但不限于5’磷酸化修饰、3’磷酸化修饰、甲基化修饰、硫代修饰、氨基修饰、生物素修饰及其修饰组合,这些修饰可以出现在接头序列的5’端、中间端和3’端任一位置。
本发明适用的测序样本材料可以是单细胞、基因组DNA或者扩增的DNA产物。其中单细胞样本类型可以是极体细胞、卵裂球细胞、滋养外胚层细胞、单个肿瘤细胞、循环肿瘤细胞、外周血白细胞、血浆或羊水细胞等。其中基因组DNA样品可以是任意组织或细胞来源样本提取的DNA或获得的微量DNA,微量DNA可以是血浆游离DNA、胚胎培养液游离DNA、其他生物液中含有的游离DNA等。其中扩增的DNA产物可以是单细胞全基因组扩增产物,也可以是WGA中的预扩增产物,也可以是扩增中途任意相关产物。
本发明的多测序平台通用接头中,第一互补序列和第二互补序列完全互补形成局部稳定的双链结构,且在第一互补序列的3’末端有一个凸出的T碱基,便于和dA尾DNA片段互补相连。第一测序平台探针结合序列可以和第一测序平台上的锚定探针互补结合;第二测序平台探针结合序列可以和第二测序平台上的锚定探针互补结合;第一测序平台引物结合序列可以和第一测序平台的测序引物结合,定位测序起始信息;第二测序平台引物结合序列可以和第二测序平台的测序引物结合,定位测序起始信息。如此,该测序接头可兼容多种测序平台的测序要求,包含此接头的DNA文库片段可以在多种测序平台上兼容测序。通过该多测序平台通用接头,使得仅通过一次文库构建,即可获得能够同时在多种高通量测序平台上兼容测序的文库,解决了因测序平台不同造成多次构建不同测序平台文库的临床难题,大幅缩减了建库时长和成本,另外低起始模板量需求也大大节约了临床样本消耗。将构建好的文库在多种高通量测序平台上分析,显示具有良好的平台兼容性和出色的性能表现。
在一个具体示例中,第一测序平台为Illumina测序平台,第二测序平台为IonTorrent测序平台,相应的,第一测序平台探针结合序列为P5序列和P7序列,第二测序平台探针结合序列为P1序列,第一测序平台引物结合序列为Seq-read1序列和Seq-read2序列,第二测序平台引物结合序列为A序列(特异A序列),序列信息如下表所示。
序列名称 | 序列(5’-3’) |
P5序列 | AATGATACGGCGACCACCGAGATCT |
A序列 | CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGGAT |
Seq-read1序列 | ACACTCTTTCCCTACACGAC |
第一互补序列 | GCTCTTCCGATC |
P7序列 | ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG |
P1序列 | ATCACCGACTGCCCATAGAGAGG |
Seq-read2序列 | ACACGTCTGAACTCCAGTCAC |
第二互补序列 | GATCGGAAGAGC |
可选地,特异A序列的内部含有barcode标签序列,可以被Ion Torrent测序平台识别并标记,Seq-read2序列末端连接有index标签序列,可以被Illumina测序平台识别并标记,如下表所示。在很多情况下,我们需要把多个样本混合在一起,在同一个通道里完成测序。像转录组测序、miRNA测序、lncRNA测序、ChIP测序等等,通常每个样本所需要的数据量都比较少,远少于HiSeq一个通道的产出能力,混合样本是普遍作法。因此,通过接头中的index标签序列或barcode标签序列对文库进行标记,便能够把测序数据按样本分离,保证多个测序文库可以在同一个通道上进行混合测序。可以理解,标签序列可以根据需要进行添加,不需要进行混合测序时可以不添加标签序列。
序列名称 | 序列(5’-3’) |
P5序列 | AATGATACGGCGACCACCGAGATCT |
特异A序列 | CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG[Barcode]GAT |
Seq-read1序列 | ACACTCTTTCCCTACACGAC |
第一互补序列 | GCTCTTCCGATC |
P7序列 | ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG |
P1序列 | ATCACCGACTGCCCATAGAGAGG |
Seq-read2序列 | ACACGTCTGAACTCCAGTCAC[index] |
第二互补序列 | GATCGGAAGAGC |
可选地,barcode或index标签序列的长度为6bp~15bp。优选地,barcode标签序列长8bp~12bp,index标签序列长6bp~10bp。
在一个具体示例中,如图3所示,多测序平台通用接头包括第一接头序列和第二接头序列,第一接头序列从5’端到3’端依次包括P5序列、A序列、Seq-read1序列和第一互补序列;第二接头序列从5’端到3’端依次包括第二互补序列、Seq-read2序列、P1序列和P7序列。其中,P5序列、P7序列可以和Illumina测序平台上的锚定探针互补结合,P1序列可以和IonTorrent测序平台上的锚定探针互补结合;A序列可以和Ion Torrent平台的测序引物结合,定位测序起始信息,A序列的内部含有barcode标签,可以被Ion Torrent测序平台识别并标记;Seq-read1序列和Seq-read2序列可以和Illumina测序平台的测序引物结合,定位测序起始信息,Seq-read2序列附近的index序列可以被Illumina测序平台识别并标记。
在一个具体示例中,如图4所示,第一接头序列的5’末端与第二接头序列的3’末端通过尿嘧啶连接,从而形成环形接头,在建库过程中,接头连接后,可使用User酶37℃酶切去除尿嘧啶碱基。
在一个具体示例中,如图5所示,多测序平台通用接头包括第一接头序列、第二接头序列、第一扩增引物和第二扩增引物。第一接头序列从5’端到3’端依次包括部分A序列、Seq-read1序列和第一互补序列,第二接头序列从5’端到3’端依次包括第二互补序列、Seq-read2序列和部分P1序列,第一扩增引物从5’端到3’端依次包括P5序列和部分A序列,第二扩增引物从5’端到3’端依次包括P7序列和部分P1序列。该测序接头中P5序列和部分A序列以引物的形式,在建库中的PCR扩增步骤带入;P7序列和部分P1序列也以引物的形式,在建库中的PCR扩增步骤带入。A序列在引物和接头上互相留有15bp~25bp的相同序列,以保证PCR扩增时的特异互补,P1序列在引物和接头上互相留有15bp~25bp的相同序列,以保证PCR扩增时的特异互补。
在一个具体示例中,如图6所示,多测序平台通用接头包括第一接头序列、第二接头序列、第三接头序列和第四接头序列,第一接头序列从5’端到3’端依次包括P5序列、Seq-read1序列和第一互补序列,第二接头序列从5’端到3’端依次包括第二互补序列和P1序列,第三接头序列从5’端到3’端依次包括第二互补序列、Seq-read2序列和P7序列,第四接头序列从5’端到3’端依次包括A序列和第一互补序列。序列信息如下表所示,可选地,Seq-read2序列中的Barcode’序列和Barcode序列互补,作为结构辅助性序列。
在一个具体示例中,如图7所示,第一接头序列的5’末端与第二接头序列的3’末端通过尿嘧啶连接,第三接头序列的3’末端与第四接头序列的5’末端通过尿嘧啶连接,从而形成环形接头,在建库过程中,接头连接后,使用User酶37℃酶切,可去除尿嘧啶碱基。可以理解,本发明不局限于上述具体示例,通过简并多种测序平台的任何可能接头形式或组合方式,均是本发明的衍生。
本发明一实施例的适用于多测序平台的文库构建方法,包括以下步骤:将DNA样本进行片段化、末端修复以及dA尾添加得到DNA片段,无需纯化,然后将DNA片段与上述多测序平台通用接头连接。
在一个具体示例中,将DNA样本进行片段化、末端修复以及dA尾添加的步骤如下:将DNA样本与快速酶混合液、快速缓冲液混合,然后在热循环仪上进行如下反应:2℃~6℃条件下0.5min~1.5min,30℃~35℃条件下12min~18min,63℃~67℃条件下25min~35min。
可选地,快速酶混合液中含有DNA切刻内切酶I(0.2~1.0U/μL)、DNA切刻内切酶II(0~1.0U/μL)、切口消化酶(1~5U/μL)、T4 DNA聚合酶(0.1~2U/μL)、T4多聚核酸激酶(1~5U/μL)、Klenow大片段(0.1~1U/μL)、Klenow片段3’→5’exo-(0.5~2.0U/μL)和rTaq DNA聚合酶(0.1~1U/μL)中的多种或全部。
可选地,快速缓冲液中含有Tris-HCl(10~80mM)、MgCl2(10~50mM)、NaCl(20~80mM)、dNTPs(0.1~0.8mM)、ATP(0.5~2.0mM)、DTT(5~20mM)、BSA(0.05~0.2mg/ml)和Triton X-100(0.1%~0.5%)中的多种或全部,pH为7.5。
以下为具体实施例。
实施例1已知变异细胞系基因组DNA建库测序
1、样本准备
选择已知核型的人类淋巴细胞系样本9例,包括非整倍体,片段缺失/重复大小不同的样本(其中最小为1.5Mb左右),以及正常对照样本。将其复苏活化扩大培养,提取足量细胞系基因组DNA作为试验样本。
每例样本取100ng的DNA采用本发明图2所示的多测序平台通用接头进行文库构建。每例样本取100ng的DNA用Thermo Fisher公司官方网站公布的标准文库构建方法(传统文库构建方法)完成,作为对照,具体方法步骤参见Thermo Fisher公司官方网站(https://www.thermofisher.com)。每例样本取100ng的DNA用Illumina公司官方网站公布的标准文库构建方法(传统文库构建方法)完成,作为对照,具体方法步骤参见Illumina公司官方网站(https://www.illumina.com/)。
2、基因组DNA的快速片段化/末端修复/dA尾添加
将各试剂置于冰上,在一个新的PCR管中参照下表配制反应体系,此步于冰上操作。
组分 | 量 |
基因组DNA | 10ng~1000ng |
快速缓冲液 | 2.5μL |
NF水(无核酸酶水) | to 20μL |
配置好的反应体系经轻柔吸打混匀,注意不要涡旋震荡。然后向该PCR管中加入5μL快速酶混合液,轻柔吸打混匀6~8次。瞬时离心,立刻置于已预冷至4℃的PCR仪中,并启动如下反应程序:4℃2min,30℃20min,65℃30min,4℃hold(热盖温度设置为70℃)。快速酶混合液的配方为DNA切刻内切酶I(0.8U/μL)、DNA切刻内切酶II(0.8U/μL)、切口消化酶(2U/μL)、T4 DNA聚合酶(2U/μL)、T4多聚核酸激酶(1U/μL)、Klenow大片段(0.5U/μL)、Klenow片段3’→5’exo-(0.5U/μL)和rTaq DNA聚合酶(1U/μL)。快速缓冲液的配方为Tris-HCl(80mM)、MgCl2(50mM)、NaCl(20mM)、dNTPs(0.5mM)、ATP(1mM)、DTT(10mM)、BSA(0.2mg/ml)和TritonX-100(质量百分比0.3%)。
3、DNA片段末端加接头
将接头连接试剂置于冰上溶解,根据下表在管中依次加入试剂,涡旋5秒,使溶液混匀,离心机低速离心数秒,使管壁和盖子上无明显液滴。加入多测序平台通用接头时反复核对,每次只开一个管盖,谨防特异性接头之间交叉污染。
组分 | 体积 |
已添加dA尾DNA | 25μL |
连接缓冲液 | 5μL |
多测序平台通用接头 | 5μL |
连接酶 | 3μL |
NF水 | to 50μL |
涡旋混匀,20℃15min,4℃hold。立即使用Agencourt AMPure XP beads进行DNA纯化,操作步骤参产品说明书。
4、上机测序
文库产物经检测合格后,使用多种主流高通量测序平台(Ion Torrent/llumina)进行上机测序。
5、测序后信息分析
将所有样本上述流程得到的数据,同时按照统一生物信息学分析流程进行分析,主要步骤包括提取有效数据、序列比对、Y染色体判断、窗口划分、GC含量校正、断点筛查、数据过滤及可视化等。
6、结果分析
将所有试验样本经过上述生物信息学分析后获得结果如下表所示。可见,9例细胞株100ng起始量检测,采用本发明多测序平台通用接头的结果与已知结果及常规接头建库得到的结果完全一致。
实施例2已知变异细胞系单细胞样本建库测序
1、样本准备
选择已知核型的人类淋巴细胞系样本10例,包括非整倍体,片段缺失/重复大小不同的样本(其中最小为1.5Mb左右),以及正常对照样本。将其复苏活化培养至最佳状态时,挑取单个细胞作为单细胞检测样本。单细胞样本先用PicoPlex法进行全基因组扩增,然后以扩增产物进行高通量建库测序。具体PicoPlex方法步骤参见TaKaRa公司官网(https://www.takarabio.com/)。
2、基因组DNA的快速片段化/末端修复/dA尾添加
将各试剂置于冰上,在一个新的PCR管中参照下表配制反应体系,此步于冰上操作。
组分 | 量 |
基因组DNA | 10ng-1000ng |
快速缓冲液 | 2.5μL |
NF水 | to 20μL |
配置好的反应体系经轻柔吸打混匀,注意不要涡旋震荡。然后向该PCR管中加入5μL快速酶混合液,轻柔吸打混匀6~8次。瞬时离心,立刻置于已预冷至4℃的PCR仪中,并启动如下反应程序:4℃2min,30℃20min,65℃30min,4℃hold(热盖温度设置为70℃)。
3、DNA片段末端加接头
将接头连接试剂置于冰上溶解,根据下表在管中依次加入试剂,涡旋5秒,使溶液混匀,离心机低速离心数秒,使管壁和盖子上无明显液滴。加入测序接头时反复核对,每次只开一个管盖,谨防特异性接头之间交叉污染。
组分 | 体积 |
已添加dA尾DNA | 25μL |
连接缓冲液 | 5μL |
多测序平台通用接头 | 5μL |
连接酶 | 1μL |
NF水 | to 50μL |
涡旋混匀,20℃15min,4℃hold。立即使用Agencourt AMPure XP beads进行DNA纯化,操作步骤参产品说明书。
4、PCR扩增DNA片段
1)将PCR相关试剂置于冰上溶解。
2)根据下表在PCR管中依次加入试剂,涡旋振荡5秒,使溶液混匀,用离心机低速离心数秒,使管壁和盖子上无明显液滴。
组分 | 体积 |
已连接接头的DNA | 15μL |
2×PCR混合液 | 25μL |
PCR引物混合液 | 2μL |
NF水 | To 50μL |
3)将PCR管放入PCR仪按以下条件进行反应:98℃30s;(98℃10s,60℃30s,65℃45s)*8个循环;65℃5min;4℃保存。如果DNA上样量为10ng,则设置为10个循环;如果DNA质量较差(降解严重),则在原有基础上增加1~3个循环。
4)根据样品数准备1.5mL EP管,编好相应的编号,PCR结束之后,取下PCR管,离心2秒,将PCR管中样品转移到对应编号的EP管中。立即使用Agencourt AMPure XP beads进行DNA纯化,操作步骤参产品说明书。
5)将建好的文库样品暂存于4℃冰箱中,等待文库定量。
5、上机测序
文库产物经检测合格后,使用多种主流高通量测序平台(Ion Torrent/llumina)进行上机测序。
6、测序后信息分析
将所有样本上述流程得到的数据,同时按照统一生物信息学分析流程进行分析,主要步骤包括提取有效数据、序列比对、Y染色体判断、窗口划分、GC含量校正、断点筛查、数据过滤及可视化等。
7、结果分析
经过上述生物信息学分析后获得结果如下表所示,结果表明,使用本发明的多测序平台通用接头对≥4Mb CNV正确检出率为100%。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (11)
1.一种多测序平台通用接头,其特征在于,包括第一测序平台探针结合序列、第二测序平台探针结合序列、第一测序平台引物结合序列、第二测序平台引物结合序列、第一互补序列和第二互补序列;所述第一互补序列和所述第二互补序列反向互补,所述第一测序平台探针结合序列、所述第二测序平台探针结合序列、所述第一测序平台引物结合序列和所述第二测序平台引物结合序列中的至少两条序列分别与所述第一互补序列和所述第二互补序列连接。
2.根据权利要求1所述的多测序平台通用接头,其特征在于,第一测序平台为Illumina高通量测序平台,所述第一测序平台探针结合序列为P5序列和P7序列;第二测序平台为IonTorrent高通量测序平台,所述第二测序平台探针结合序列为P1序列;所述第一测序平台引物结合序列为Seq-read1序列和Seq-read2序列,所述第二测序平台引物结合序列为特异A序列。
3.根据权利要求2所述的多测序平台通用接头,其特征在于,包括第一接头序列和第二接头序列;所述第一接头序列从5’端到3’端依次包括P5序列、特异A序列、Seq-read1序列和第一互补序列,所述第二接头序列从5’端到3’端依次包括第二互补序列、Seq-read2序列、P1序列和P7序列;所述第一互补序列和所述第二互补序列完全互补,且在所述第一互补序列的3’末端有一个凸出的T碱基。
4.根据权利要求3所述的多测序平台通用接头,其特征在于,所述第一接头序列的5’末端与所述第二接头序列的3’末端通过尿嘧啶连接。
5.根据权利要求2所述的多测序平台通用接头,其特征在于,包括第一接头序列、第二接头序列、第一扩增引物和第二扩增引物;所述第一接头序列从5’端到3’端依次包括部分特异A序列、Seq-read1序列和第一互补序列,所述第二接头序列从5’端到3’端依次包括第二互补序列、Seq-read2序列和部分P1序列;所述第一扩增引物从5’端到3’端依次包括P5序列和部分特异A序列,所述第二扩增引物从5’端到3’端依次包括P7序列和部分P1序列;所述第一互补序列和所述第二互补序列完全互补,且在所述第一互补序列的3’末端有一个凸出的T碱基;所述第一扩增引物上的特异A序列和所述第一接头序列上的特异A序列有15~25bp的交叠,所述第二扩增引物上的P1序列和所述第二接头序列上的P1序列有15~25bp的交叠。
6.根据权利要求2所述的多测序平台通用接头,其特征在于,包括第一接头序列、第二接头序列、第三接头序列和第四接头序列;所述第一接头序列从5’端到3’端依次包括P5序列、Seq-read1序列和第一互补序列,所述第二接头序列从5’端到3’端依次包括第二互补序列和P1序列,所述第三接头序列从5’端到3’端依次包括第二互补序列、Seq-read2序列和P7序列,所述第四接头序列从5’端到3’端依次包括特异A序列和第一互补序列;所述第一互补序列和所述第二互补序列完全互补,且在所述第一互补序列的3’末端有一个凸出的T碱基。
7.根据权利要求6所述的多测序平台通用接头,其特征在于,所述第一接头序列的5’末端与所述第二接头序列的3’末端通过尿嘧啶连接,所述第三接头序列的3’末端与所述第四接头序列的5’末端通过尿嘧啶连接。
8.一种适用于多测序平台的文库构建方法,其特征在于,在完成DNA片段化、末端修复以及dA尾添加后将DNA片段与权利要求1~7任一项所述的多测序平台通用接头连接。
9.根据权利要求8所述的文库构建方法,其特征在于,在一个反应管中将DNA样本与快速酶混合液、快速缓冲液混合,一步完成DNA片段化、末端修复以及dA尾添加;然后DNA片段两端与多测序平台通用接头连接,所构文库即可同时在多个测序平台上进行高通量测序;所述快速酶混合液中含有DNA切刻内切酶I、DNA切刻内切酶II、切口消化酶、T4 DNA聚合酶、T4多聚核酸激酶、Klenow大片段、Klenow片段3’→5’exo-和rTaq DNA聚合酶中的多种或全部;所述快速缓冲液中含有Tris-HCl、MgCl2、NaCl、dNTPs、ATP、DTT、BSA和Triton X-100中的多种或全部。
10.根据权利要求9所述的文库构建方法,其特征在于,所述快速酶混合液的工作浓度为:DNA切刻内切酶I 0.2U/μL~1.0U/μL、DNA切刻内切酶II 0U/μL~1.0U/μL、切口消化酶1U/μL~5U/μL、T4 DNA聚合酶0.1U/μL~2U/μL、T4多聚核酸激酶1U/μL~5U/μL、Klenow大片段0.1U/μL~1U/μL、Klenow片段3’→5’exo-0.5U/μL~2.0U/μL和rTaq DNA聚合酶0.1U/μL~1U/μL;
所述快速缓冲液的工作浓度为:Tris-HCl 10mM~80mM、MgCl210mM~50mM、NaCl 20mM~80mM、dNTPs 0.1mM~0.8mM、ATP 0.5mM~2.0mM、DTT 5mM~20mM、BSA0.05mg/ml~0.2mg/ml和Triton X-100质量百分比0.1%~0.5%。
11.一种用于文库构建的试剂盒,其特征在于,包括权利要求1~7任一项所述的多测序平台通用接头、权利要求9~10中所提及的快速酶混合液以及快速缓冲液。
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