CN109957562B - 一种快速构建转录组测序文库的方法及试剂盒 - Google Patents

一种快速构建转录组测序文库的方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速构建转录组测序文库的方法及试剂盒，将DNA第一链反转录、DNA第二链反转录以及反转录形成的双链cDNA片段进行末端补平通过一个合成体系完成，所述合成体系包括cDNA合成缓冲液(cDNA synthesize buffer)和cDNA合成酶体系(cDNA synthesize Enzyme)。本发明所述方法将传统的3)第一链cDNA反转录；4)第二链cDNA反转录；5)纯化；6)双链cDNA片段末端补平四个步骤整合在一步完成，大大减少了建库步骤，缩短了建库时间。

Description

一种快速构建转录组测序文库的方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种快速构建转录组测序文库的方法及试剂盒。
背景技术
转录组即某个物种或特定细胞在某一功能状态下产生的所有RNA的总和，是研究细胞表型和功能的一个重要手段。同一细胞在不同的生长时期及生长环境下，其基因表达情况是不完全相同的。转录组测序是指利用第二代高通量测序技术进行cDNA测序，全面快速地获取某一物种特定器官或组织在某一状态下的几乎所有转录本。随着高通量测序技术的快速发展，转录组测序已经成为研究基因表达与转录调控的重要手段。高通量转录组测序技术被广泛的应用于转录本结构研究，如：基因边界鉴定、可变剪切研究等，转录本变异研究，如：基因融合、编码区SNP研究等，非编码区域功能研究，如：Non-coding RNA研究、microRNA前体研究等，基因表达水平研究以及全新转录本发现。
转录组文库构建常规流程包括(图1)：1)mRNA的分离和纯化，包括poly(A)法富集mRNA和去除核糖RNA(rRNA)；2)富集后的RNA进行打断；3)第一链cDNA反转录；4)第二链cDNA反转录；5)纯化；6)双链cDNA片段末端补平；7)双链cDNA片段3’端加A尾；8)双链cDNA片段加接头；9)连接产物纯化和片段大小分选；10)PCR扩增；11)纯化；12)检测转录组文库的质量；13)上机测序。通过该流程构建转录组测序文库耗时7.5小时(不包括检测转录组文库的质量)，耗时较长，步骤较多，每一步反应需要加样、关盖、上机反应、开盖等过程十分繁琐。
专利申请号为201810562835.4，名称为一种构建转录组测序文库的方法及相应的接头序列和试剂盒的专利中所提到的NEB、Illumina等品牌的RNA建库试剂盒用于RNA建库，但也存在步骤繁多、耗时长等缺点。
发明内容
本发明目的是针对现有技术存在的步骤繁多、耗时长的问题，提供一种快速构建转录组测序文库的方法及试剂盒，所述方法将传统的3)第一链cDNA反转录；4)第二链cDNA反转录；5)纯化；6)双链cDNA片段末端补平四个步骤整合在一步完成，大大减少了建库步骤，缩短了建库时间。
本发明所述的一种快速构建转录组测序文库的方法，将DNA第一链反转录、DNA第二链反转录以及反转录形成的双链cDNA片段进行末端补平通过一个合成体系完成，所述合成体系包括cDNA合成缓冲液(cDNA synthesize buffer)和cDNA合成酶体系(cDNAsynthesize Enzyme)。
本发明所述的方法，DNA第一链反转录、DNA第二链反转录和反转录形成的双链cDNA片段进行末端补平之间不需要进行纯化。大大节约了操作步骤。
进一步的，本发明所述的cDNA合成缓冲液包括：Tris-HCl 80～100mM、MgCl2 3～7mM、KCl 50～100mM、DTT 5～15mM、dNTP 4～6mM、ATP 80～120mM、随机引物(Randomprimers)0.5～2μg、DMSO 10～20％，pH 8.0～8.5。
进一步优选的，本发明所述的cDNA合成缓冲液包括：Tris-HCl 85～95mM、MgCl24～6mM、KCl 60～80mM、DTT 8～12mM、dNTP 4～6mM、ATP 90～110mM、随机引物(Randomprimers)0.5～2μg、DMSO 10～20％，pH 8.0～8.5。
在一种优选的实施例中，本发明所述的cDNA合成缓冲液包括：Tris-HCl 90mM、MgCl2 5mM、KCl 70mM、DTT 10mM、dNTP 5mM、ATP 100mM、随机引物1μg、DMSO15％，pH 8.3。
进一步的，本发明所述的cDNA合成酶体系包括：AMV逆转录酶(AMV ReverseTranscriptase)75～125U、RNase H 7.5～12.5U、T4DNA聚合酶(T4 DNA polymerase)30～60U、T4PNK 10～20U、Klen Taq 30～40U、BSA 0.05～0.2μg。
进一步优选的，本发明所述的cDNA合成酶体系包括：AMV逆转录酶(AMV ReverseTranscriptase)80～120U、RNase H 9～11U、T4DNA聚合酶(T4DNA polymerase)40～50U、T4PNK 10～20U、Klen Taq 30～40U、BSA 0.05～0.2μg。
在一种优选的实施例中，本发明所述的cDNA合成酶体系包括：AMV逆转录酶(AMVReverse Transcriptase)100U、RNase H 10U、T4DNA聚合酶(T4DNA polymerase)45U、T4PNK15U、Klen Taq 35U、BSA 0.1μg。
本发明还提供一种合成体系，所述体系能够在这个一个体系中不经纯化操作进行DNA第一链反转录、DNA第二链反转录以及反转录形成的双链cDNA片段进行末端补平，所述合成体系包括cDNA合成缓冲液(cDNA synthesize buffer)和cDNA合成酶体系(cDNAsynthesize Enzyme)。
关于cDNA合成缓冲液(cDNA synthesize buffer)和cDNA合成酶体系(cDNAsynthesize Enzyme)同上所述。
本发明还提供了所述合成体系在基因工程领域的应用。
本发明还提供了所述合成体系在构建转录组测序文库中的应用。
本发明还提供一种快速构建转录组测序文库的试剂盒，所述试剂盒中包括：cDNA合成缓冲液(cDNA synthesize buffer)和cDNA合成酶体系(cDNA synthesize Enzyme)。
关于cDNA合成缓冲液(cDNA synthesize buffer)和cDNA合成酶体系(cDNAsynthesize Enzyme)同上所述。
本发明还提供一种cDNA合成缓冲液，包括：Tris-HCl 80～100mM、MgCl2 3～7mM、KCl 50～100mM、DTT 5～15mM、dNTP 4～6mM、ATP 80～120mM、随机引物(Random primers)0.5～2μg、DMSO 10～20％，pH 8.0～8.5。
进一步优选的，本发明所述的cDNA合成缓冲液包括：Tris-HCl 85～95mM、MgCl24～6mM、KCl 60～80mM、DTT 8～12mM、dNTP 4～6mM、ATP 90～110mM、随机引物(Randomprimers)0.5～2μg、DMSO 10～20％，pH 8.0～8.5。
在一种优选的实施例中，本发明所述的cDNA合成缓冲液包括：Tris-HCl 90mM、MgCl2 5mM、KCl 70mM、DTT 10mM、dNTP 5mM、ATP 100mM、随机引物1μg、DMSO15％，pH 8.3。
本发明还提供一种cDNA合成酶体系，包括：AMV逆转录酶(AMV ReverseTranscriptase)75～125U、RNase H 7.5～12.5U、T4DNA聚合酶(T4DNA polymerase)30～60U、T4PNK 10～20U、Klen Taq 30～40U、BSA 0.05～0.2μg。
进一步优选的，本发明所述的cDNA合成酶体系包括：AMV逆转录酶(AMV ReverseTranscriptase)80～120U、RNase H 9～11U、T4DNA聚合酶(T4DNA polymerase)40～50U、T4PNK 10～20U、Klen Taq 30～40U、BSA 0.05～0.2μg。
在一种优选的实施例中，本发明所述的cDNA合成酶体系包括：AMV逆转录酶(AMVReverse Transcriptase)100U、RNase H 10U、T4DNA聚合酶(T4DNA polymerase)45U、T4PNK15U、Klen Taq 35U、BSA 0.1μg。
若无特别说明，本发明中所用定义含义如下：
高通量测序技术：又称为第二代测序技术、下一代测序技术，可简写为NGS。是指一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定的技术，其测定序列长度一般较短。
转录组：指单个生物物种的个体，或者该个体的特定组织或特定细胞类型，在特定的环境条件下，或者实验处理条件下所产生的所有转录本的集合。
DTT表示二硫苏糖醇。
RNase H表示核糖核酸酶H。
T4PNK表示T4多聚核苷酸激酶。
Klen Taq是一种具有5’→3’聚合酶活性，但不具有5’→3’外切酶活性的DNA聚合酶。
BSA表示牛血清蛋白。
本发明的有益效果：
(1)本发明提供的一种快速构建转录组测序文库的方法，该方法将第一链cDNA反转录，第二链cDNA反转录，纯化，双链cDNA片段末端补平这四个步骤整合在一步完成，原先四步耗时3.5小时，整合成一步之后耗时只需1小时，将RNA建库总耗时从7.5小时缩短至5小时，使整个建库流程耗时缩短了约36％的时间，大大降低了转录组建库所需的时间，并且简化了反应步骤，使得建库流程更加简单。
(2)在缩短转录组建库所需的时间的基础上，保证了建库效果，优化后的转录组建库流程得到的文库质量和传统建库相当。
附图说明
图1：传统的RNA建库流程图；
图2：优化后的RNA建库流程；
图3：传统建库流程1μg RNA投入量，所得文库浓度为35.6ng/μl；
图4：传统建库流程100ng RNA投入量，所得文库浓度为21.3ng/μl；
图5：优化建库流程1μg RNA投入量，所得文库浓度为36.2ng/μl；
图6：优化建库流程100ng RNA投入量，所得文库浓度为20.7ng/μl。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，凡在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于本发明的保护范围之内。下面实施例未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段。
实施例1：
本实施例RNA从293细胞用常规方法提取。
对照：本实施例传统流程建库的方案为：选用普通RNA建库试剂盒-Vazyme的VAHTSmRNA-seq V3Library Prep Kit for Illumina(货号：NR611，可通过市面购买)作为对照，对照组的建库流程如图1，参考NR611说明书。
本实施例的构建RNA文库的方法：用cDNA合成缓冲液(cDNA synthesize buffer)和cDNA合成酶体系(cDNA synthesize Enzyme)进行DNA第一链反转录、DNA第二链反转录以及反转录形成的双链cDNA片段进行末端补平，其他步骤和方法可以为构建RNA文库领域的常规方法，所用试剂可以为构建RNA文库领域的常规试剂，例如可以通过市面购买的转录组建库试剂盒中获得其他试剂。
本实施例中cDNA合成缓冲液(cDNA synthesize buffer)和cDNA合成酶体系(cDNAsynthesize Enzyme)的配比如下：
cDNA synthesize buffer包括：Tris-HCl(90mM)、MgCl2(5mM)、KCl(70mM)、DTT(10mM)、dNTP(5mM)、ATP(100mM)、随机引物(1μg)、DMSO(15％)，pH 8.3；
cDNA synthesize Enzyme包括：AMV逆转录酶(100U)、RNase H(10U)、T4DNA聚合酶(45U)、T4PNK(15U)、Klen Taq(35U)、BSA(0.1μg)。
本实施例除了步骤2、cDNA合成之外的其他步骤和其他步骤中的试剂，本实施例中均是用的Vazyme NR611试剂盒中相应方法和试剂。但是，需要说明的是，除了步骤2、cDNA合成之外的其他步骤和其他步骤中的试剂也可以为其他本领域常规的方法和其他本领域常规的用于RNA建库的相应的试剂。本发明选用Vazyme NR611试剂盒中相应方法和试剂，仅仅为了便于与本实施例选用的对比例(传统流程建库)进行对比，并不对本发明起到任何的限定作用。
本实施例的构建RNA文库的方法流程如下：
1、mRNA分离与片段化
(1)将提取好的总RNA分别溶解于Nuclease-free H2O至总体积50μl，冰上放置备用；试剂静置使其平衡至室温备用。
(2)缓慢颠倒使mRNA Capture Beads充分混匀，吸取50μl加入到准备好的RNA样品中，使用移液器轻轻吸打10次充分混匀。
(3)在PCR仪中进行第一次mRNA结合，反应程序：65℃5min；25℃5min。
(4)置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，小心移除上清。
(5)将样品从磁力架上取出，加入200μl Beads Wash Buffer重悬磁珠，使用移液器轻轻吸打10次充分混匀并置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，小心移除上清。
(6)将样品从磁力架上取出，加入50μl Tris Buffer重悬磁珠，使用移液器轻轻吸打10次充分混匀。
(7)在PCR仪中进行mRNA洗脱，反应程序：80℃2min；25℃Hold。
(8)加入50μl Beads Binding Buffer，使用移液器轻轻吸打10次充分混匀。
(9)室温放置5min，使mRNA结合到磁珠上。
(10)置于磁力架上，使mRNA与总RNA分离，待溶液澄清后(约5min)，小心移除上清。
(11)将样品从磁力架上取出，加入200μl Beads Wash Buffer重悬磁珠，使用移液器轻轻吸打10次充分混匀并置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，小心移除上清。
(12)将样品从磁力架上取出，加入19.5μl Frag/Prime Buffer重悬磁珠，使用移液器轻轻吸打10次充分混匀。将样品置于PCR仪中，根据插入片段大小的需要，选择片段化条件如下：
插入片段大小(bp) 温度 时间
250-450bp 85℃ 6min；4℃Hold
(13)将样品置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，小心吸取17μl上清至一个新的Nuclease-free PCR管中，并立刻进行cDNA合成反应。
该步骤也可以为本领域的其他的常规的mRNA分离与片段化方法。
2、cDNA合成(优化步骤)
将上一步得到的片段化的RNA进行如下表所示的混样，后在PCR仪中进行cDNA合成，反应程序：25℃10min；42℃25min；65℃15min；4℃Hold。此过程同时完成了第一链cDNA反转录，第二链cDNA合成，纯化，双链cDNA片段末端补平。
组分 体积
Frage/PrimerBuffer片段化RNA 20μl
cDNA synthesize Enzyme 15μl
cDNA synthesize buffer 30μl
3、接头连接
(1)将RNA Adapter从-20℃取出，解冻后颠倒混匀。
(2)将Rapid Ligation buffer解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。
(3)在PCR管中配制如下表反应体系，在PCR仪中进行连接反应，反应程序：热盖105℃，20℃15min；4℃hold。
组分 体积
上一步产物 65μl
Rapid Ligation buffer 25μl
Rapid DNA Ligase 5μl
RNA Adapter 2.5μl
Nuclease-free H<sub>2</sub>O 2.5μl
该步骤也可以为本领域的其他的常规的接头连接方法。
4、连接产物纯化和片段大小分选
用6中的方法进行产物纯化，后用两轮VAHTS DNA Clean Beads进行片段大小分选，85℃6min打断，插入片段约350-450bp。
(1)颠倒或旋涡振荡使VAHTS DNA Clean Beads充分混匀，吸取60μl(0.6×)加入到纯化过的连接产物中，使用移液器轻轻吸打10次充分混匀。
(2)室温孵育10min，使DNA结合到磁珠上。
(3)将样品置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，保持样品始终处于磁力架上，吸取155μl上清至一个新的Nuclease-free PCR管中。
(4)加入10μl(0.1×)VAHTS DNA Clean Beads，使用移液器轻轻吸打10次充分混匀。
(5)室温孵育10min，使DNA结合到磁珠上。
(6)将样品置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，小心移除上清；保持样品始终处于磁力架上，加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育30sec，小心移除上清。
(7)重复步骤(6)一次。
(8)保持样品始终处于磁力架上，在室温下干燥磁珠约5-10min。
(9)将样品从磁力架上取出，加入22.5μl Nuclease-free H2O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吸打充分混匀，室温静置2min置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，小心吸取20μl上清至一个新的Nuclease-free PCR管中。
该步骤也可以为本领域的其他的常规的连接产物纯化和片段大小分选方法。
5、文库扩增
(1)将PCR Primer Mix，Amplification Mix 1从-20℃取出，解冻后颠倒混匀，在PCR管中配制如下表反应体系，在PCR仪中进行文库扩增反应，反应程序：105℃热盖；98℃预变性30sec；98℃变性10sec；60℃退火30sec；72℃延伸30sec；12/14个循环；72℃完全延伸5min；4℃hold。
组分 体积
上一步产物 20μl
PCR Primer Mix 5μl
Amplification Mix 1 25μl
(2)RNA起始量和扩增循环数。
RNA起始量 扩增循环数
1μg 12个循环
100ng 14个循环
该步骤也可以为本领域的其他的常规的文库扩增方法。
6、PCR产物纯化
(1)将VAHTS DNA Clean Beads提前30min从2-8℃取出，静置使其温度平衡至室温。
(2)颠倒或旋涡振荡使VAHTS DNA Clean Beads充分混匀，吸取50μl(1×)加入到PCR产物中，使用移液器轻轻吸打10次充分混匀。
(3)室温孵育10min，使DNA结合到磁珠上。
(4)将样品置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，小心移除上清。
(5)保持样品处于磁力架上，加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育30sec，小心移除上清。
(6)重复步骤(5)一次。
(7)保持样品处于磁力架上，在室温下开盖干燥磁珠约5-10min。
(8)将样品从磁力架上取出，加入25μl Nuclease-free H2O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吸打充分混匀，室温静置2min后置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，小心吸取22.5μl上清至一个新的Nuclease-free PCR管中。
该步骤也可以为本领域的其他的常规的PCR产物纯化方法。
7、用Agilent 2100Bioanalyzer评价文库质量
取1μl纯化后的PCR产物，用Agilent DNA 1000kit(Agilent,Cat.No.5067-1504)进行分析，得到下图3-图6所示结果，根据2100图和所得文库浓度可见，优化后的转录组建库流程，所得文库浓度和2100峰型与传统建库所得文库的一致。
该步骤也可以为本领域的其他的评价方法。
8、Illumina平台上机测序，并进行数据分析，得到表1和表2数据。
表1：具体的测序数据情况
表2：基因比对情况统计
表1、表2中样本1、2、3、4分别表示：传统流程建库RNA投入量为1μg、传统流程建库RNA投入量为100ng、优化流程建库RNA投入量为1μg、优化流程建库RNA投入量为100ng。表中1和3的数据对比，2和4的数据对比，从Reads数、GC含量、Q20、Q30、冗余度、上靶率、rRNA残留率、表达基因数等信息来看，优化后的转录组建库流程得到的文库质量和传统建库的一致。

Claims (14)

1.一种快速构建转录组测序文库的方法，其特征在于，将DNA第一链反转录、DNA第二链反转录以及反转录形成的双链cDNA片段进行末端补平通过一个合成体系完成，所述合成体系包括cDNA合成缓冲液和cDNA合成酶体系；
所述的cDNA合成缓冲液包括：Tris-HCl 80～100mM、MgCl2 3～7mM、KCl 50～100mM、DTT5～15mM、dNTP 4～6mM、ATP 80～120mM、随机引物0.5～2μg、DMSO 10～20％，pH 8.0～8.5；
所述的cDNA合成酶体系包括：AMV逆转录酶75～125U、RNase H 7.5～12.5U、T4 DNA聚合酶30～60U、T4 PNK 10～20U、Klen Taq 30～40U、BSA 0.05～0.2μg。
2.根据权利要求1所述的快速构建转录组测序文库的方法，其特征在于，DNA第一链反转录、DNA第二链反转录和反转录形成的双链cDNA片段进行末端补平之间不需要进行纯化。
3.根据权利要求1所述的快速构建转录组测序文库的方法，其特征在于：所述的cDNA合成缓冲液包括：Tris-HCl 85～95mM、MgCl2 4～6mM、KCl 60～80mM、DTT 8～12mM、dNTP 4～6mM、ATP 90～110mM、随机引物0.5～2μg、DMSO 10～20％，pH 8.0～8.5。
4.根据权利要求3所述的快速构建转录组测序文库的方法，其特征在于，所述的cDNA合成缓冲液包括：Tris-HCl 90mM、MgCl2 5mM、KCl 70mM、DTT 10mM、dNTP 5mM、ATP 100mM、随机引物1μg、DMSO 15％，pH 8.3。
5.根据权利要求1所述的快速构建转录组测序文库的方法，其特征在于，所述的cDNA合成酶体系包括：AMV逆转录酶80～120U、RNase H 9～11U、T4 DNA聚合酶40～50U、T4 PNK 10～20U、Klen Taq 30～40U、BSA 0.05～0.2μg。
6.根据权利要求5所述的快速构建转录组测序文库的方法，其特征在于，所述的cDNA合成酶体系包括：AMV逆转录酶100U、RNase H 10U、T4 DNA聚合酶45U、T4 PNK 15U、Klen Taq35U、BSA 0.1μg。
7.一种合成体系，其特征在于，所述体系能够在这个一个体系中不经纯化操作进行DNA第一链反转录、DNA第二链反转录以及反转录形成的双链cDNA片段进行末端补平，所述合成体系包括cDNA合成缓冲液和cDNA合成酶体系；
所述的cDNA合成缓冲液包括：Tris-HCl 80～100mM、MgCl2 3～7mM、KCl 50～100mM、DTT5～15mM、dNTP 4～6mM、ATP 80～120mM、随机引物0.5～2μg、DMSO 10～20％，pH 8.0～8.5；
所述的cDNA合成酶体系包括：AMV逆转录酶75～125U、RNase H 7.5～12.5U、T4 DNA聚合酶30～60U、T4 PNK 10～20U、Klen Taq 30～40U、BSA 0.05～0.2μg。
8.根据权利要求7所述的合成体系，其特征在于，所述的cDNA合成缓冲液包括：
Tris-HCl 85～95mM、MgCl2 4～6mM、KCl 60～80mM、DTT 8～12mM、dNTP 4～6mM、ATP 90～110mM、随机引物0.5～2μg、DMSO 10～20％，pH 8.0～8.5。
9.根据权利要求8所述的合成体系，其特征在于，所述的cDNA合成缓冲液包括：Tris-HCl 90mM、MgCl2 5mM、KCl 70mM、DTT 10mM、dNTP 5mM、ATP 100mM、随机引物1μg、DMSO15％，pH 8.3。
10.根据权利要求7所述的合成体系，其特征在于，所述的cDNA合成酶体系包括：AMV逆转录酶80～120U、RNase H 9～11U、T4 DNA聚合酶40～50U、T4 PNK 10～20U、Klen Taq 30～40U、BSA 0.05～0.2μg。
11.根据权利要求10所述的合成体系，其特征在于，所述的cDNA合成酶体系包括：AMV逆转录酶100U、RNase H 10U、T4 DNA聚合酶45U、T4 PNK 15U、Klen Taq 35U、BSA 0.1μg。
12.权利要求7～11任一项所述的合成体系在基因工程领域的应用。
13.权利要求7～11任一项所述的合成体系在构建转录组测序文库中的应用。
14.包含权利要求7～11任一项所述的合成体系的试剂盒。
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