CN113638055B

CN113638055B - 一种制备双链rna测序文库的方法

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Publication number: CN113638055B
Application number: CN202110906228.7A
Authority: CN
Inventors: 谈忠鸣; 聂俊伟; 瞿志鹏; 董晨; 韩锦雄; 江明扬; 叶廷跃
Original assignee: Vazyme Biotech Nanjing Co ltd; Jiangsu Center For Disease Control And Prevention (jiangsu Institute Of Public Health)
Current assignee: Vazyme Biotech Nanjing Co ltd; Jiangsu Center For Disease Control And Prevention (jiangsu Institute Of Public Health)
Priority date: 2020-05-22
Filing date: 2020-05-22
Publication date: 2023-07-07
Anticipated expiration: 2040-05-22
Also published as: CN111560651A; CN113638055A; CN111560651B

Abstract

本发明公开一种制备双链RNA测序文库的方法，以及该方法在生物遗传分析中的应用；该方法包含1)随机打断：将待测双链RNA进行随机打断处理，得到双链RNA片段；2)任选地，末端修复：将步骤1)中得到的双链RNA片段进行末端修复，得到末端修复的双链RNA片段；3)连接接头：将步骤2)中的双链RNA片段与接头连接得到两端包含接头的双链RNA片段，所述接头包含；4)扩增及纯化：以步骤3)中两端包含接头的双链RNA片段为模板，扩增得到双链DNA产物并纯化，即为测序文库。本发明的文库构建方法简便快捷，更节省原料。

Description

一种制备双链RNA测序文库的方法

本申请为申请日为2020年05月22日，申请号为2020104423157，发明名称为一种制备双链RNA测序文库的方法的中国发明专利的分案申请。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种双链RNA测序文库的构建方法。

背景技术

RNA病毒是病毒的一种，如：丙型肝炎病毒，乙型脑炎病毒，全部流感病毒等。通常RNA病毒的遗传物质(核糖核酸)是单链的(ssRNA,single-stranded RNA)，也有遗传物质是双链的(dsRNA,double-stranded RNA)。双链RNA病毒因其核酸为互补的双链RNA而得名。dsRNA病毒有两个特点：一是病毒基因组多为10-12个节段的双链RNA分子；二是病毒具有双层衣壳，没有包膜。病毒的双链RNA在病毒自身依赖RNA多聚酶作用下转录出mRNA，然后再翻译出早期蛋白或晚期蛋白。双链RNA在复制时，必须先以其原负链为模板复制出正链RNA，再由正链RNA复制出新的负链，构成子代RNA。双链RNA(dsRNA)病毒大部分属于呼肠病毒科。例如禽呼肠孤病毒(avian reovirus，ARV)，ARV属呼肠病毒科、正呼肠病毒属，基因组为线性双链RNA。

目前国内外很多品牌的试剂盒都可以实现单链RNA建库从而进行高通量测序，但是针对一些含有双链RNA的样本，市面上暂无实现方便快捷的双链RNA建库从而进行高通量测序的方案。Qi Zheng等(Genome-Wide Double-Stranded RNA Sequencing Reveals theFunctional Significance of Base-Paired RNAs in Arabidopsis，2010)公开了一种双链RNA测序文库的构建方法，该方法将双链RNA片段化后使RNA单链化，后在单链RNA的两端先后连接测序接头，之后通过逆转录反应得到DNA测序文库，该方法需要对RNA单链化处理后先后在3’端和5’分别加接头，步骤相对较多，建库耗时较长。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术存在的不足，提供一种制备双链RNA测序文库的方法，本发明的方法相对于现有技术省去了RNA单链化和先后在3’端和5’端加接头的步骤，而是通过一步反应在片段化的双链RNA两端连接接头，更便捷高效。

在一个方面，本发明提供一种制备双链RNA测序文库的方法，包括下述步骤：

1)随机打断：将待测双链RNA进行随机打断处理，得到双链RNA片段；

2)任选地，将步骤1)中得到的双链RNA片段进行末端修复，得到末端修复的双链RNA片段；

3)连接接头：将步骤1)或2)中得到的双链RNA片段或末端修复的双链RNA片段与接头连接得到两端包含接头的双链RNA片段；

4)纯化步骤3)得到的两端包含接头的双链RNA片段；和

5)扩增：以步骤4)中两端包含接头的双链RNA片段为模板，扩增得到双链DNA产物；任选地，将所述双链DNA产物进行纯化得到所述双链RNA测序文库。

在一些实施方案中，所述方法步骤2)中采用逆转录酶对双链RNA片段进行末端修复。

在另一些实施方案中，所述步骤3)中所述双链RNA片段或末端修复的双链RNA片段与所述接头在包含连接酶的反应体系中进行连接反应，所述连接酶选自DNA连接酶和RNA连接酶的至少一种。

在又一些实施方案中，所述反应体系中还包含DNA聚合酶，其中所述的DNA聚合酶具有使DNA链5’至3’方向延长的功能，优选的DNA聚合酶为DNA聚合酶I。

在一些实施方案中，所述DNA连接酶为T4 DNA连接酶；所述RNA连接酶为T4 RNA连接酶。

在另一些实施方案中，所述步骤3)所述反应体系中还包含甜菜碱、PEG和酶反应缓冲液。

在一些实施方案中，所述步骤5)中所述扩增包含逆转录PCR和PCR两步反应。

在另一些实施方案中，所述方法包括下述步骤：

2)末端修复：将步骤1)中得到的双链RNA片段进行末端修复，得到末端修复的双链RNA片段；

3)连接接头：将步骤2)中得到的末端修复的双链RNA片段与接头连接得到两端包含接头的双链RNA片段，所述接头包含

4)纯化步骤3)得到的两端包含接头的双链RNA片段；和

5)扩增及纯化：以步骤4)中两端包含接头的双链RNA片段为模板，扩增得到双链DNA产物，将所述双链DNA产物进行纯化得到所述双链RNA测序文库；

其中，

所述步骤2)中采用逆转录酶对双链RNA进行末端修复；

所述步骤3)中所述双链RNA片段与所述接头在包含DNA聚合酶I、T4 DNA连接酶和T4 RNA连接酶的反应体系中进行连接反应；

使用逆转录酶和DNA聚合酶进行所述步骤5)中的扩增反应。

在一些实施方案中，所述步骤3)所述末端修复的双链RNA片段与接头连接的反应体系中还包含甜菜碱、PEG。

在一些实施方案中，所述随机打断选自通过酶法打断、机械打断和化学打断中的至少一种。

在另一方面，本发明还提供前述方法在生物遗传分析中的应用；优选的，在双链RNA病毒的生物遗传分析中的应用。

发明详述

本文中的“双链RNA测序文库”指的是用于对双链RNA基因序列进行高通量测序所需要的文库，在本发明的一个实施例中，该文库为DNA文库。

本文中“双链RNA片段”或“打断的双链RNA片段”包含突出的末端，即双链RNA片段的末端存在部分单链RNA，可以采用本领域公知的任何方法是将双链RNA突出的末端平端化。

本文中“随机打断”指在双链RNA的任意位置打断使其片段化，片段化的RNA仍然为双链结构，末端为单链结构；随机打断的方式可以是本领域任意已知的方式，例如酶法打断、机械打断和化学打断中任意一种或一种以上，优选采用机械打断或化学打断的方法，其中机械打断可以使用用于DNA或RNA片段化的现有的装置，适宜应用用于DNA或RNA片段化的条件进行，基于机械打断例子如：超声波打断、毛细管或孔的流体力学的剪切处理、喷雾化的处理等。

本文的“任选”、“任选的”或“任选地”是指随后所述的事件或情况可以发生，或可以不发生，而且该这种叙述包括所述事件或情况发生的情形和不发生的情形。

本文的“待测双链RNA”表示经过提取处理的双链RNA，本领域技术人员可以理解的是，本文的双链RNA的获得可采取任何本领域已知的提取及纯化手段获得。

本文中的“末端修复”指对打断后获得的双链RNA片段的突出的单链末端进行修复的操作，以使打断后的双链RNA片段平端化或无5’端突出。

本发明的一些实施例中，片段化的RNA连接的接头根据不同的测序平台而不同，根据连接接头的类型不同，可选的对片段化的RNA进行平端化或部分平端化，平端化指两条RNA单链完全互补，部分平端化指存在5’端的突出。

本文的“连接接头”指在经过末端修复或未修复的双链RNA片段的两端分别连接接头；本文中一些实施例中，在双链RNA片段的两条链的5’端分别连接第一接头，在双链RNA的两条链3’端分别连接第二接头，其中第一接头和第二接头序列不同；在一些优选的实施例中，双链RNA片段的两条链的5’端和3’端在一步反应中同时与接头连接。

本文的“接头”指在DNA片段两端加上一段核苷酸，该核苷酸包含一段序列其能够与测序仪器匹配进行测序(例如与芯片引物互补配对)，例如适用于illumina平台，IonTorrent平台或MGI平台。

示例性的接头如图1所示，图1两个接头序列不同，图示只是为了区分不同的接头，对接头的序列长度差异没有特别限制，可接受的两个接头序列的长度差异在0-10个碱基范围内。

在一些实施例中，所述的接头是单链或双链RNA，或部分双链RNA。

在一些实施例中，所述的接头是单链或双链DNA，或部分双链DNA。

在一些实施例中，所述的第一接头包含标签序列，用于区分不同的样本。

在一些实施例中，所述的第一接头还包含与测序平台的第一芯片探针结合的序列；例如本发明的一个实施例中第一接头包含P7序列，P7序列与illumina测序平台的芯片探针结合。

本文中的“芯片引物”和“芯片探针”表示相同的含义。

在一些实施例中，所述的第一接头还包含测序引物结合序列，其与illumina测序平台测序过程中添加的测序引物互补结合或部分互补结合。

在一些实施例中，所述的第二接头包含与测序平台的第二芯片探针结合的序列；例如本发明的一个实施例中第一接头包含P5序列，P5序列与illumina测序平台的芯片探针结合。

在一些实施例中，所述的第二接头还包含测序引物结合序列，其与illumina测序平台测序过程中添加的测序引物互补结合或部分互补结合。

可选的，所述第二接头包含另一标签序列，以提高样本区分准确度。

在一些实施例中，所述第一接头序列为5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’。

在一些实施例中，所述第二接头序列为5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACnnnnnnnnATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’。

nnnnnnnn表示8bp标签序列。

本文中“芯片探针”指固定在测序仪器芯片上的一段核苷酸序列，其能够捕获文库中的DNA序列实现高通量测序。本文中的“第一芯片探针”与“第二芯片探针”序列不同，优选illumina测序平台的芯片探针。

在一些实施例中，通过RNA连接酶将第一接头分别与片段化的双链RNA两条链的5’端连接，第二接头分别与片段化的双链RNA两条链的3’端连接。

在另一些实施例中，通过DNA连接酶将第一接头分别与片段化的双链RNA两条链的5’端连接，第二接头分别与片段化的双链RNA两条链的3’端连接。

在有一些实施例中，通过RNA连接酶和DNA连接酶将第一接头分别与片段化的双链RNA两条链的5’端连接，第二接头分别与片段化的双链RNA两条链的3’端连接。

在一些实施例中，还需要进一步包含DNA聚合酶，优选DNA聚合酶I实现第一接头和/或第二接头与片段化双链RNA的连接。例如，P7和P5接头与双链RNA连接时，需要DNA聚合酶补平缺口。

在一些实施例中，对步骤3)获得的两端包含接头的双链RNA片段进行纯化，优选的纯化方法为磁珠纯化方法。

本文中“扩增”或“扩增的”或“富集”指制备特定核酸的拷贝的体外方法，所述特定核酸诸如靶核酸或加标签的核酸。扩增核酸的很多方法是本领域已知的，并且扩增反应包括但不限于聚合酶链式反应、连接酶链式反应、链置换扩增反应、滚环扩增反应。扩增的核酸可以是DNA或RNA。不管起始核酸是DNA、RNA或两者，从一个核酸分子或更多个核酸分子(“扩增产物”)的扩增得到的产物都可以是DNA或RNA、或DNA和RNA核苷或核苷酸两者的混合物，或者它们可包括修饰的DNA或RNA核苷或核苷酸。

本文中，步骤5)扩增产物可以采用本领域已知的任何可实现的方法进行纯化获得测序用文库。

本文中，步骤2)的末端修复，除采用逆转录酶外，还可以采用本领域普通技术人员公知其它手段实现平端化。

本文中“连接酶”指催化核酸链的5'-磷酸末端和3'-羟基末端之间的磷酸二酯键的分子内和分子间形成的核酸修饰酶。

本文中，通过DNA连接酶和RNA连接酶实现在双链RNA片段的末端添加接头序列，通过DNA聚合酶I实现缺口的补平。

在一些实施例中，采用T4 DNA连接酶，T4 RNA连接酶和DNA聚合酶I完成接头与双链RNA片段的连接，该反应体系中配套有适合于上述三种酶完成上述连接反应的缓冲液。

在一些实施例中，连接反应体系中还包含甜菜碱。

在一些实施例中，连接反应体系进一步包含PEG，即聚乙二醇，可以是细胞工程中常用的使细胞发生融合形成杂种细胞的常用聚合度，例如PEG 200、PEG 400、PEG 600、PEG800、PEG1000、PEG1500、PEG2000、PEG4000、PEG6000、PEG8000、PEG10000等。

本文中，以两端包含接头的双链RNA片段为模板得到双链DNA产物，其通过逆转录PCR获得cDNA之后，经过PCR获得富集的双链DNA，进一步，双链DNA经过纯化后获得测序文库。

在一些实施例中，所述双链RNA片段与所述接头连接的反应体系中包含末端修复的双链RNA片段，接头,T4 DNA ligase(T4 DNA连接酶),T4 RNAligase(T4 RNA连接酶),DNApolI(DNA聚合酶I)，PEG，甜菜碱，T4 RNA Ligase Reaction Buffer(T4 RNA连接酶反应缓冲液)，其余为DEPC水。

在一些实施例中，所述双链RNA片段与所述接头连接的反应体系中包含末端修复的双链RNA片段占反应体系总体积的30％-70％，接头0.2-0.6μM,T4 DNA ligase(T4 DNA连接酶)7-15U/μl,T4 RNA ligase(T4 RNA连接酶)7-15U/μl,DNA polI(DNA聚合酶I)0.2-0.4U/μl，PEG 5％-9％，甜菜碱500mM-650mM，T4 RNA Ligase Reaction Buffer(T4 RNA连接酶反应缓冲液)，其余为DEPC水。

优选的，35μl接头连接体系中包括：末端修复的产物18μl，接头0.4μM,T4 DNAligase400U,T4 RNA ligase 400U,DNA polI10U，PEG 2.5μl，甜菜碱0.6M，T4 RNA LigaseReaction Buffer(T4 RNA连接酶反应缓冲液)2μl，其余为DEPC水。本领域技术人员能够领会，可根据上述反应体系的比例进行任意的放大或缩小体系，以实现反应。

在一些实施例中，本发明所述的接头连接反应条件为35～38℃反应3～5h，优选37℃反应4h。

本发明的一个实施例中，双链RNA打断缓冲液包含如下成分：

组分	体积
		1M Tris-HCl(PH7.5)	1ml
1M MgCl₂	50μl
		1M KCl	500μl
100％DMSO	300μl
		50％PEG	200μl
10mg/ml BSA	10μl
		DEPC水	加至10ml

本发明的一个实施例中，在15μl的打断体系里，上述缓冲液与双链RNA的体积比为1：1。

本发明的一个实施例中，打断后的双链RNA经过末端修复，修复反应于42℃反应30min，修复体系如下所示：

组分	体积
		打断的双链RNA片段	15μl
dNTP 10mM	1.5μl
		逆转录酶200U/μl	1.5μl
总体积	18μl

本发明的一个实施例中，经过末端修复的双链RNA片段，于37℃反应4h，进行接头连接。接头连接体系如下所示：

在一个实施例中，所述的接头如下所示：

常规接头序列：

5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’。

带标签的接头序列：

5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACnnnnnnnnATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’。

nnnnnnnn表示8bp标签序列。

本发明的有益效果：

本发明的方法在打断的双链RNA片段两端通过一步反应直接连接接头，后续通过逆转录PCR及PCR得到包含接头的DNA，可作为待测双链RNA的测序文库，与现有技术相比反应步骤少，节省时间成本和原料成本。

附图说明

图1示例性的片段化双链RNA两端连接接头序列；

图2是禽呼肠孤病毒S1基因检测的电泳图；

图3是用Agilent 2100Bioanalyzer评价文库质量图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，凡在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于本发明的保护范围之内。下面实施例未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1：构建双链RNA测序文库

1、双链RNA提取与检测

本实验提取的是禽呼肠孤病毒中的双链RNA，禽呼肠孤病毒感染(Avian reovirusinfection)是鸡的一种传染性疾病，可引起鸡多种疾病，包括病毒性关节炎、矮小综合征、呼吸道疾病、肠道疾病和所谓吸收不良综合征。参考《微生物样本采集手册》取致病鸡的上呼吸道样本(鼻咽拭子)，利用以下方法提取双链RNA(试剂取自Vazyme#RM101)：

(1)在1.5ml Nuclease-free低吸附EP管中加入200μl待提取样本(不足200μl样品可使用生理盐水补齐)，然后加入20μl蛋白酶K，轻微涡旋或上下颠倒混匀后加入20μl磁珠和600μl裂解液，涡旋震荡混匀15sec，室温裂解5min，期间上下颠倒混匀两次。

(2)瞬时离心，将EP管置于磁力架上，静置1min，用移液器移除上清。

(3)洗涤：将上述样品取下磁力架，加入700μl洗涤液，涡旋15sec混匀，瞬时离心，将EP管放上磁力架，静置1min，除尽上清。

(4)漂洗：将上述样品取下磁力架，加入700μl漂洗液，涡旋15sec混匀，瞬时离心，将EP管放上磁力架，静置1min，除尽上清。

(5)瞬时离心后重新放上磁力架，移尽残留上清。开盖室温晾置3～5min，直至磁珠表面无反光。

(6)加入50μl洗脱液，温和混匀15sec，室温静置3min，期间震荡混匀2次。

(7)瞬时离心至EP管底后将样品重新置于磁力架上，静置1min后，吸取上清至新的Nuclease-free离心管中，用于后续检测或置于-30～-15℃以下短期保存或置于-70℃以下长期保存。

本实施例所用的双链RNA的提取方法，也可以为本领域的其他常规方法。

在禽呼肠孤病毒S1基因部分片段298bp上设计一对引物，利用可以直接检测RNA的试剂盒进行检测确认该双链RNA取自禽呼肠孤病毒(比如Vazyme的货号为P611或P612的检测试剂盒)，引物序列如下：

上游引物：5’ATGCTGCGTATGCCTCCCGGT 3’。

下游引物：5’TCAAACGTCGTTATGGCGGA 3’。

用上述引物和常规PCR扩增试剂(Vazyme#P112)进行扩增，1％琼脂糖跑电泳，得到如图2结果，其中泳道M是5000bp的Marker，泳道1是PCR产物，可见：PCR产物的条带大小是298bp，我们所提取的确实是禽呼肠孤病毒的RNA。

2、双链RNA(dsRNA)打断

本实施例所用的打断缓冲液(Buffer2)，配方如表1所示：

【表1】

按照表2进行混样，于95℃反应15min，4℃保存备用。

【表2】

组分	体积
		Buffer2	7.5μl
dsRNA	7.5μl

3、末端修复

按照表3配制反应体系，于42℃反应30min，进行末端修复。

【表3】

4、接头连接

接头来源Vazyme#N801，DNA pol I来源Vazyme#N105。

按照表4配制反应体系，于37℃反应4h，进行接头连接。

【表4】

常规接头序列：

5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’。

带标签的接头序列：

5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACnnnnnnnnATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’。

nnnnnnnn表示8bp标签序列。

5、产物纯化

1)颠倒或旋涡振荡使VAHTS RNA Clean Beads(Vazyme#N412)充分混匀，吸35μl(1×)加入到连接产物中，使用移液器轻轻吸打10次充分混匀。

2)室温孵育10min，使RNA结合到磁珠上。

3)将样品置于磁力架上，待溶液澄清后，小心移除上清。

4)保持样品处于磁力架上，加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠(注意不要吹散磁珠)，室温孵育30sec，小心移除上清。

5)重复步骤4)一次。

6)保持样品处于磁力架上，在室温下开盖干燥磁珠约5-10min。

7)将样品从磁力架上取出，加入21.5μl Nuclease-free H₂O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吸打充分混匀，室温静置2min后置于磁力架上，待溶液澄清后，小心吸取19μl上清至一个新的Nuclease-free PCR管中，立刻进行PCR。

6、文库扩增

按照表5配制反应体系，按照表6的程序进行反应。

【表5】

【表6】

7、PCR产物纯化

1)颠倒或旋涡振荡使VAHTS DNA Clean Beads充分混匀，吸取45μl(0.9×)加入到PCR产物中，使用移液器轻轻吸打10次充分混匀。

2)室温孵育10min，使DNA结合到磁珠上。

3)将样品置于磁力架上，待溶液澄清后，小心移除上清。

4)保持样品处于磁力架上，加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育30sec，小心移除上清。

5)重复步骤4)一次。

6)保持样品处于磁力架上，在室温下开盖干燥磁珠约5-10min。

7)将样品从磁力架上取出，加入25μl Nuclease-free H₂O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吸打充分混匀，室温静置2min后置于磁力架上，待溶液澄清后，小心吸取22.5μl上清至一个新的Nuclease-free PCR管中。

8、用Agilent 2100Bioanalyzer评价文库质量

取1μl纯化后的PCR产物，用Agilent DNA 1000kit(Agilent,Cat.No.5067-1504)分析，得到下图3所示结果，从图中可知，我们得到的文库质量和文库大小在300-500bp区间。

9、Illumina平台上机测序，并进行数据分析，得到表7数据，L1_15_10和L1_15_15是两个重复。禽呼肠孤病毒物种的双链RNA序列GC含量在50％附近，从表7可见，本方案得到的文库测序数据中Clean_GC为50.33％和50.24％，与禽呼肠孤病毒物种的双链RNA序列GC含量相符。表7中Total mapped ratio表示本方案测序结果与禽呼肠孤病毒核酸序列比对后有97.31％和96.76％的序列是吻合的，说明本发明的文库构建方案可行。

【表7】

注：Samples：样品名称；Clean_reads：过滤后的下机数据；Clean-GC:过滤后数据中碱基的GC含量；Clean_Q20：表示质量值≧20的碱基所占百分比；Clean_Q30表示质量值≧30的碱基所占百分比；Dup rate：重复率；Adapter：接头残留率；Total mapped ratio：比对率。

Claims

1.一种制备双链RNA测序文库的方法，包括下述步骤：

2)将步骤1)中得到的双链RNA片段进行末端修复，得到末端修复的双链RNA片段；

3)连接接头：将步骤2)中得到的末端修复的双链RNA片段与接头连接得到两端包含接头的双链RNA片段；

4)纯化步骤3)得到的两端包含接头的双链RNA片段；和

5)扩增：以步骤4)中两端包含接头的双链RNA片段为模板，扩增得到双链DNA产物，将所述双链DNA产物进行纯化得到所述双链RNA测序文库；

其中，步骤3)所述接头选自单链DNA或双链DNA或部分双链DNA，所述末端修复的双链RNA片段与所述接头在包含连接酶的反应体系中进行连接反应，所述连接酶选自DNA连接酶和RNA连接酶的至少一种。

2.权利要求1所述的方法，所述步骤2)中采用逆转录酶对双链RNA片段进行末端修复。

3.权利要求1所述的方法，所述步骤4)纯化为磁珠纯化。

4.权利要求1所述的方法，所述反应体系中还包含DNA聚合酶，其中所述的DNA聚合酶具有使DNA链5’至3’方向延长的功能。

5.权利要求4所述的方法，所述DNA聚合酶为DNA聚合酶I。

6.权利要求4所述的方法，所述DNA连接酶为T4 DNA连接酶；所述RNA连接酶为T4RNA连接酶。

7.权利要求6所述的方法，所述步骤3)所述反应体系中还包含甜菜碱、PEG和酶反应缓冲液。

8.权利要求1-7任一项所述的方法，所述步骤5)中所述扩增包含逆转录PCR和PCR两步反应。

9.权利要求1-7任一项所述的方法，所述随机打断选自通过酶法打断、机械打断和化学打断中的至少一种。

10.权利要求1-9任一项所述的方法在非疾病诊断目的的生物遗传分析中的应用。

11.权利要求10所述的应用，其特征在于是在非疾病诊断目的的双链RNA病毒的生物遗传分析中的应用。