JP6324962B2 - 標的rna枯渇化組成物を調製するための方法およびキット - Google Patents
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Description
a)1つ以上のグループのプローブ分子と初期RNA含有組成物を接触させ、そして標的RNAおよびプローブ分子の間で二本鎖ハイブリッドを生成するステップであって、あるグループのプローブ分子が、以下:
i)グループが、100nt以下の長さを有する2つ以上の異なるプローブ分子を含む;
ii)前記グループにおいて含まれるプローブ分子が、標的RNA中に存在する標的領域に対して相補的である;
iii)前記標的領域に対してハイブリダイズする場合、2つ以上の異なるプローブ分子が、形成される二本鎖ハイブリッドにおいて互いに隣接して位置する;
との特徴を有する、ステップ;
b)二本鎖ハイブリッドに結合する結合剤を使用することによって二本鎖ハイブリッドを捕捉し、それによって、ハイブリッド/結合剤複合体を形成するステップ;
c)組成物からハイブリッド/結合剤複合体を分離し、それによって、標的RNA枯渇化組成物を提供するステップ
を含む。
a)好ましくはサンプルから全RNAを単離することによって、RNA含有組成物を得るステップ;
b)第1の態様による方法を使用して、好ましくは全RNAであるRNA含有組成物から望まれない標的RNAを枯渇させ、それによって、標的RNA枯渇化組成物を提供するステップ;
c)任意選択で、非結合プローブ分子を除去するステップ;
d)標的RNA枯渇化組成物において含まれるRNA分子を配列決定するステップ
を含む。
a)標的RNAを枯渇させるための1つ以上のグループのプローブ分子であって、あるグループのプローブ分子が、以下:
i)グループが、100nt以下の長さを有する2つ以上の異なるプローブ分子を含む;
ii)前記グループにおいて含まれるプローブ分子が、標的RNAの標的領域に対して相補的である;
iii)前記標的領域に対してハイブリダイズする場合、2つ以上の異なるプローブ分子が、形成される二本鎖ハイブリッドにおいて互いに隣接して位置する;
との特徴を有する、1つ以上のグループのプローブ分子:ならびに
b)プローブ分子および標的RNAの間で形成される二本鎖ハイブリッドに結合するのに適した結合剤
を含む。
第1の態様によれば、初期RNA含有組成物から標的RNA枯渇化組成物を調製するための方法が提供され、この方法は、以下:
a)1つ以上のグループのプローブ分子と初期RNA含有組成物を接触させ、そして標的RNAおよびプローブ分子の間で二本鎖ハイブリッドを生成するステップであって、あるグループのプローブ分子が、以下:
i)グループが、100nt以下の長さを有する2つ以上の異なるプローブ分子を含む;
ii)前記グループにおいて含まれるプローブ分子が、標的RNAの標的領域に対して相補的である;
iii)前記標的領域に対してハイブリダイズする場合、2つ以上の異なるプローブ分子が、形成される二本鎖ハイブリッドにおいて互いに隣接して位置する;
との特徴を有する、ステップ;
b)二本鎖ハイブリッドに結合する結合剤を使用することによって二本鎖ハイブリッドを捕捉し、それによって、ハイブリッド/結合剤複合体を形成するステップ;
c)組成物からハイブリッド/結合剤複合体を分離し、それによって、標的RNA枯渇化組成物を提供するステップ
を含む。
ステップa)において、初期RNA含有組成物、たとえば全RNAを、1つ以上のグループのプローブ分子と接触させる。したがって、1つのグループのプローブ分子が使用されてもよいまたは2つ以上のグループのプローブ分子が使用されてもよい。あるグループのプローブ分子は、2つ以上の異なるプローブ分子を含む。グループにおいて含まれるプローブ分子の特異的な設計は、それが本発明により達成される優れた特異性に寄与するので、本発明の重要な特徴となる。
ステップb)において、生成された二本鎖核酸ハイブリッドは、形成された二本鎖核酸ハイブリッドに対して結合し、多くの形成されたハイブリッドにそれぞれ結合する分子によって捕捉される。そのような分子は、本明細書において抗ハイブリッド結合剤と呼ばれる。それによって、ハイブリッド/結合剤複合体が形成され、そのような複合体は、少なくとも1つの抗ハイブリッド結合剤が結合する、少なくとも1つの二本鎖ハイブリッドを含んでいてもよい。本明細書において記載されるように、2つ以上の抗ハイブリッド結合剤分子もまた、1つの二本鎖ハイブリッドに対して結合してもよい。ステップa)およびb)は、同時に実行されてもよい(実施例もまた参照されたい)または別々に実行されてもよい。
二本鎖ハイブリッドの結合、したがって捕捉後に、捕捉されたハイブリッドは、組成物の残りから分離され、それによって、標的RNA枯渇化組成物を提供する。それぞれ、形成されたハイブリッド/結合剤複合体の抗ハイブリッド結合剤が固体支持体上に固定される場合、分離は、特に容易である。適した固体支持体は、上記に記載され、また、当業者に入手可能でもあり、そのうえ、残りのサンプルから固体支持体を分離するのを可能にする、適した分離手順となる。上記に記載されるように、抗ハイブリッド抗体は、たとえば、固相にカップリングされてもよく、次いで、標的RNA枯渇化組成物を提供するために、固体支持体に対して結合したハイブリッド/結合剤複合体を、残りのサンプルから分離してもよい。たとえば、抗ハイブリッド抗体は、磁性粒子にカップリングされてもよく、これは、磁石を使用することによって、ろ過によって、分離することができる。この実施形態は、それが確立された手動またはロボットシステムと適合性であるので、好ましい。磁場を使用することによって磁性粒子を処理するために、ハイブリッド/結合剤複合体が結合する磁性粒子を処理するために本発明に関連して使用することができる様々なシステムが、先行技術において存在する。一実施形態によれば、磁性粒子が、反応容器の底または側面に収集され、残りの液体サンプルが、反応容器から除去され、ハイブリッド/結合剤複合体が結合した、収集された磁性粒子を残す。標的RNA枯渇化組成物に相当する残りのサンプルの取り出しは、たとえばデカンテーションまたは吸引によって行うことができる。そのようなシステムは、先行技術においてよく知られており、したがって、ここで詳細な説明を必要としない。磁性粒子の処理で知られている代替のシステムにおいて、カバーまたは外被によって通常カバーされる磁石は、磁性粒子を収集するために反応容器の中に沈められている(plunge)。次いで、結合したハイブリッド/結合剤複合体を持つ磁性粒子は、除去し、標的RNA枯渇化組成物を残すことができる。それぞれのシステムが先行技術においてよく知られており、また市販で入手可能でもあるので(たとえばQIASYMPHONY(登録商標);QIAGEN)、それらはここでいかなる詳細な説明をも必要としない。磁性粒子の処理で知られているさらに代替のシステムにおいて、磁性粒子を含むサンプルは、ピペットチップの中に吸引することができ、磁性粒子は、たとえばピペットチップの側面に磁石を適用することによって、ピペットチップ中に収集することができる。次いで、標的RNA枯渇化組成物に相当する残りのサンプルは、ピペットチップから放出させることができるが、結合したハイブリッド/結合剤複合体を持つ、収集された磁性粒子は、磁石により、ピペットチップ中に残る。そのようなシステムもまた、先行技術においてよく知られており、また、市販で入手可能であり(たとえばBioRobot EZ1、QIAGEN)、したがって、ここでいかなる詳細な説明をも必要としない。しかしながら、磁性粒子はまた、任意の他の粒子のように、ろ過などのような他の手段によって分離されてもよい。ろ過はまた、自動化されたシステム(たとえばQIAcube、QIAGEN)を使用して実行することもできる。
標的RNAは、初期RNA組成物中に存在する任意の望まれないRNAであってもよい。標的RNAは、プローブ分子の配列特異的な設計を可能にするために、任意の配列を、それが関心のある残るRNA集団からその配列によって識別が可能な限り、含んでいてもよい。標的RNAは、配列、機能、またはその組み合わせによってを含む、任意の基準で選ばれてもよい。本明細書において示されるように、複数の標的RNAは、本発明の方法を使用して、初期RNA含有組成物から同時に枯渇させることができる。
任意選択のステップd)において、非結合プローブ分子は、除去されてもよい。たとえば、標的RNA枯渇化組成物は、さらに精製されてもよい。それぞれの精製ステップは、たとえば、短い非結合プローブ分子、バッファー構成成分、およびその他同種のものを除去するためにならびに/またはRNAを濃縮するために有用になり得る。それぞれの精製方法についての例は、抽出、固相抽出、ポリケイ酸に基づく精製、シリカカラムまたは磁性シリカビーズを使用する単離、磁性粒子に基づく精製、フェノールクロロホルム抽出、陰イオン交換クロマトグラフィー(陰イオン交換表面を使用)、ゲル電気泳動、沈殿、たとえばアルコール沈殿、およびその組み合わせを含むが、これらに限定されない。さらに、当業者によって知られている任意の他の核酸を単離する技術を使用することができる。一実施形態によれば、標的RNA枯渇化組成物が、少なくとも1つのカオトロピック剤および少なくとも1つのアルコールの存在下において固相に対してRNAを結合させることによってさらに精製される。好ましくは、RNAは、ケイ素を含む固相、好ましくはポリケイ酸ガラス繊維に対して結合させることによって単離される。適した方法およびキットはまた、RNeasyシステム、特にRNeasy MinElute Cleanup Kitおよび他のRNA調製キットなどのように、市販で入手可能でもある。ここで、さらに、QIAsymphonyシステム、EZ1機器、QIAcube(QIAGEN)、またはMagNApureシステム(Roche)上で試行するものなどのような自動化されたプロトコールが利用可能である。非結合プローブ分子はまた、他の適した手段によって、たとえばDNアーゼ消化によってまたはタグ付きプローブ分子が使用される場合、親和性除去によって、除去されてもよい。さらに、記載されるように、プローブ分子は、それらが配列決定ライブラリーにおいて示されるのを予防するために修飾することができる。
標的RNA枯渇化組成物が続く配列決定反応のために調製される場合、本発明による方法は、好ましくは、
e)標的RNA枯渇化組成物において含まれるRNAを配列決定するステップを含む。
i)超並列配列決定に適した配列決定ライブラリーを調製するステップ、
ii)配列決定ライブラリーにおいて含まれる分子を並列に配列決定するステップを含む。
a)好ましくはサンプルから全RNAを単離することによって、RNA含有組成物を得るステップ;
b)第1の態様による方法を使用して、好ましくは全RNAであるRNA含有組成物から望まれない標的RNAを枯渇させ、それによって、標的RNA枯渇化組成物を提供するステップ;
c)任意選択で、たとえば標的RNA枯渇化組成物を精製することによって、非結合プローブ分子を除去するステップ;
d)標的RNA枯渇化組成物において含まれるRNA分子を配列決定するステップ、を含む。
a)標的RNAを枯渇させるための1つ以上のグループのプローブ分子であって、あるグループのプローブ分子が、以下:
i)グループが、100nt以下の長さを有する2つ以上の異なるプローブ分子を含む;
ii)前記グループにおいて含まれるプローブ分子が、標的RNAの標的領域に対して相補的である;
iii)前記標的領域に対してハイブリダイズする場合、2つ以上の異なるプローブ分子が、形成される二本鎖ハイブリッドにおいて互いに隣接して位置する;
との特徴を有する、1つ以上のグループのプローブ分子、ならびに
b)プローブ分子および標的RNAの間で形成される二本鎖ハイブリッドに結合するのに適した結合剤、を含む。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
(項目1)
初期RNA含有組成物から標的RNA枯渇化組成物を調製する方法であって、前記方法は、以下:
a)1つ以上のグループのプローブ分子と前記初期RNA含有組成物を接触させ、そして前記標的RNAおよび前記プローブ分子の間で二本鎖ハイブリッドを生成するステップであって、ここで、あるグループのプローブ分子が、以下:
i)前記グループが、100nt以下の長さを有する2つ以上の異なるプローブ分子を含む;
ii)前記グループにおいて含まれる前記プローブ分子が、標的RNAの標的領域に対して相補的である;
iii)前記標的領域に対してハイブリダイズする場合、2つ以上の前記異なるプローブ分子が、形成される前記二本鎖ハイブリッドにおいて互いに隣接して位置する、
との特徴を有するステップ;
b)前記二本鎖ハイブリッドに結合する結合剤を使用することによって前記二本鎖ハイブリッドを捕捉し、それによって、ハイブリッド/結合剤複合体を形成するステップ;
c)前記組成物から前記ハイブリッド/結合剤複合体を分離し、それによって、標的RNA枯渇化組成物を提供するステップ、
を含む、方法。
(項目2)
前記標的領域に対してハイブリダイズする場合、グループの2つ以上のプローブ分子が、形成された前記二本鎖ハイブリッドにおいて互いに連続しているまたはグループのすべてのプローブ分子が、形成された前記二本鎖ハイブリッドにおいて互いに連続している、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記プローブ分子が、35nt以下、30nt以下、または25nt以下から選択される長さを有し、好ましくは、10nt〜35ntまたは15nt〜30ntの範囲にある長さを有する、項目1または2に記載の方法。
(項目4)
プローブセットが、特異的な標的RNAの枯渇のために使用され、プローブセットが、2つ以上のグループのプローブ分子を含み、前記プローブセットにおいて含まれるプローブ分子のそれぞれのグループが、前記標的RNAにおける異なる標的領域を標的にする、項目1〜3の一項以上に記載の方法。
(項目5)
特異的な標的RNAにおいて、前記標的領域が、500nt以下、450nt以下、400nt以下、350nt以下、300nt以下、250nt以下、200nt以下、または150nt以下の距離内に位置する、項目4に記載の方法。
(項目6)
プローブセットにおいて含まれる前記プローブ分子の少なくとも85%、少なくとも90%、または少なくとも95%が、それらのグループメンバーに対して連続している、項目4または5に記載の方法。
(項目7)
以下:
i)前記標的領域が、前記標的RNAの完全長に実質的に相当する;
ii)前記標的領域が、前記標的RNAにおいて保存される領域である;
iii)前記標的領域が、異なる種において保存される領域である;
iv)前記標的領域が、前記標的RNAにおいて保存され、そして少なくとも種ヒト、マウス、およびラットにおいて保存される領域である;
v)グループの前記プローブ分子がハイブリダイズする前記標的領域が、50nt〜500nt、50nt〜350、50nt〜250nt、75nt〜225nt、100nt〜200nt、および100nt〜175ntから選択されるサイズを有する;
vi)プローブセットが、特異的な標的RNAの枯渇のために使用され、プローブセットが、2つ以上のグループのプローブ分子を含み、それぞれのグループのプローブ分子が、前記標的RNAにおける異なる標的領域を標的にし、前記標的領域が、前記標的RNAの全長にわたって分布する;ならびに/または
vii)標的RNA枯渇効率が、少なくとも95%、好ましくは少なくとも98%、好ましくは少なくとも99%、より好ましくは少なくとも99.5%、そして最も好ましくは少なくとも99.9%である、
との特徴のうち1つ以上を有する、項目1〜6の一項以上に記載の方法。
(項目8)
複数の標的RNAが、前記初期RNA含有組成物から枯渇される、項目1〜7の一項以上に記載の方法。
(項目9)
以下:
i)少なくとも1つのタイプのrRNAが、標的RNAとして枯渇される;ならびに/または
ii)28S rRNA、18S rRNA、5.8S rRNA、5S rRNA、ミトコンドリア12S rRNA、およびミトコンドリア16S rRNAから選択される少なくとも1つのタイプのrRNAが、枯渇され、好ましくは少なくとも3つ、より好ましくは少なくとも4つ、そして最も好ましくはすべての前記rRNAタイプが枯渇される;ならびに/または
iii)複数のグループのプローブ分子および/もしくはプローブセットが、前記初期RNA含有組成物から、28S rRNA、18S rRNA、5.8S rRNA、5S rRNA、ミトコンドリア12S rRNA、およびミトコンドリア16S rRNAのうちの3つ以上、好ましくは4つ以上、最も好ましくはすべてを枯渇させるために使用される、
との特徴のうち1つ以上を有する、項目1〜8の一項以上に記載の方法。
(項目10)
以下:
aa)28S rRNAが標的RNAとして枯渇される場合、28S rRNAプローブセットであって、以下:
i)前記28Sプローブセットにおいて含まれるプローブ分子の長さが、50nt以下、好ましくは35nt以下、またはより好ましくは30nt以下である;
ii)前記28S rRNAプローブセットにおいて含まれるプローブ分子の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、少なくとも4つ、少なくとも6つ、最も好ましくはすべてのグループが、2つ以上の連続したプローブ分子を含む;
iii)前記28S rRNAプローブセットにおいて含まれる、少なくとも75%、少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、もしくは最も好ましくは少なくとも95%のプローブ分子が、それらのグループメンバーに対して連続している;および/または
iv)前記28S rRNAプローブセットが、前記28S rRNAプローブセットについて表1において示されるプローブ分子のグループの少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、少なくとも4つ、少なくとも6つ、より好ましくは少なくとも8つ、少なくとも10を含み、そして最も好ましくはすべてを含む
との特徴のうち、1つ以上、好ましくはすべてを有する28S rRNAプローブセットが、使用される、ならびに/または
bb)18S rRNAが標的RNAとして枯渇される場合、18S rRNAプローブセットであって、以下:
i)前記18Sプローブセットにおいて含まれるプローブ分子の長さが、50nt以下、好ましくは35nt以下、またはより好ましくは30nt以下である;および/または
ii)前記18S rRNAプローブセットにおいて含まれるプローブ分子の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、より好ましくは少なくとも3つ、少なくとも4つ、そして最も好ましくはすべてのグループが、2つ以上の連続したプローブ分子を含む;
iii)前記18S rRNAプローブセットにおいて含まれる、少なくとも75%、少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%のプローブ分子が、それらのグループメンバーに対して連続している;および/または
iv)前記18S rRNAプローブセットが、前記18S rRNAプローブセットについて表1において示されるプローブ分子のグループの少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、より好ましくは少なくとも3つ、少なくとも4つ、そして最も好ましくはすべてを含む;
との特徴のうち、1つ以上、好ましくはすべてを有する18S rRNAプローブセットが、使用される;ならびに/または
cc)5.8S rRNAが標的RNAとして枯渇される場合、少なくとも1つのグループのプローブ分子であって、以下:
i)前記プローブ分子が、50nt以下、好ましくは35nt以下、より好ましくは30nt以下の長さを有する;および/または
ii)前記グループにおいて含まれる前記プローブ分子の少なくとも2つ、好ましくは少なくとも3つ、より好ましくはすべてが、連続したプローブ分子である;および/または
iii)前記5.8S rRNAグループが、5.8S rRNAについて表1において示される1つ以上のプローブ分子を含む
との特徴のうち、1つ以上、好ましくはすべてを有する少なくとも1つのグループのプローブ分子が、使用される;ならびに/または
dd)5S rRNAが標的RNAとして枯渇される場合、少なくとも1つのグループのプローブ分子であって、以下:
i)前記プローブ分子が、50nt以下、好ましくは35nt以下、より好ましくは30nt以下の長さを有する;および/または
ii)前記グループにおいて含まれる前記プローブ分子の少なくとも2つ、好ましくは少なくとも3つ、より好ましくはすべてが、連続したプローブ分子である;および/または
iii)前記5S rRNAグループが、5S rRNAについて表1において示される1つ以上のプローブ分子を含む;
との特徴のうち、1つ以上、好ましくはすべてを有する少なくとも1つのグループのプローブ分子が、使用される、ならびに/または
ee)ミトコンドリア12S rRNAが標的RNAとして枯渇される場合、プローブセットであって、以下:
i)前記12SミトコンドリアrRNAプローブセットにおいて含まれるプローブ分子の長さが、50nt以下、好ましくは35nt以下、またはより好ましくは30nt以下である;および/または
ii)前記12SミトコンドリアrRNAプローブセットにおいて含まれるプローブ分子の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、最も好ましくはすべてのグループが、2つ以上の連続したプローブ分子を含む;および/または
iii)前記12SミトコンドリアrRNAプローブセットにおいて含まれる、少なくとも75%、少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%のプローブ分子が、それらのグループメンバーに対して連続している;
との特徴のうち、1つ以上、好ましくはすべてを有するプローブセットが、使用される、ならびに/または
ff)ミトコンドリア16S rRNAが標的RNAとして枯渇される場合、プローブセットであって、以下:
i)前記16SミトコンドリアrRNAプローブセットにおいて含まれるプローブ分子の長さが、50nt以下、好ましくは35nt以下、より好ましくは30nt以下である;および/または
ii)前記16SミトコンドリアrRNAプローブセットにおいて含まれるプローブ分子の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、最も好ましくはすべてのグループが、2つ以上の連続したプローブ分子を含む;および/または
iii)前記16SミトコンドリアrRNAプローブセットにおいて含まれる、少なくとも75%、少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%のプローブ分子が、それらのグループメンバーに対して連続している;
との特徴のうち、1つ以上、好ましくはすべてを有するプローブセットが、使用される、ならびに/または
gg)aa)において定められる28S rRNAプローブセットおよびbb)において定められる18S rRNAプローブセットが、標的RNAとして28S rRNAおよび18S rRNAが枯渇された標的RNA枯渇化組成物を提供するために使用され、任意選択で、cc)において定められる5.8S rRNAグループ、dd)において定められる5S rRNAグループ、ee)において定められる12SミトコンドリアrRNAプローブセット、およびff)において定められる16SミトコンドリアrRNAプローブセットが、標的RNAとして5.8S rRNA、5S rRNA、ミトコンドリア12S rRNA、およびミトコンドリア16S rRNAをさらに枯渇させるために使用される、
との特徴のうち1つ以上を有する、項目8または9に記載の方法。
(項目11)
以下:
i)大量のタンパク質コードmRNAが、標的RNAとして枯渇され、前記大量のタンパク質コードmRNAが、好ましくはグロビンRNAである;
ii)前記抗ハイブリッド結合剤が、RNA/DNAハイブリッドに対して特異的な抗ハイブリッド抗体である;
iii)使用される前記抗ハイブリッド結合剤が、固体支持体に対して固定されるもしくは前記抗ハイブリッド結合剤が、溶液において遊離しており、そして固体支持体に対して固定された第2の結合剤が、前記抗ハイブリッド結合剤に結合し、したがって形成された前記ハイブリッド/結合剤複合体を捕捉するために使用される;
iv)ステップa)およびb)が同時に実行される、ならびに/または
v)任意選択で修飾されたDNA分子が、プローブ分子として使用され、二本鎖RNA/DNAハイブリッドが形成される、
との特徴のうち1つ以上を有する、項目1〜10の一項以上に記載の方法。
(項目12)
a)1つ以上のグループのプローブ分子と全RNAを接触させ、そして前記標的rRNAおよび前記プローブ分子の間で二本鎖ハイブリッドを生成するステップであって、あるグループのプローブ分子が、以下:
i)前記グループが、35nt以下の長さを有する2つ以上の異なるプローブ分子を含む;
ii)前記グループにおいて含まれる前記プローブ分子が、標的RNAの標的領域に対して相補的であり、前記標的RNAが、rRNAである;
iii)前記標的領域に対してハイブリダイズする場合、前記異なるプローブ分子のうちの2つ以上、好ましくはすべてが、形成された前記二本鎖ハイブリッドにおいて互いに連続して位置する;
との特徴を有する、ステップ;
b)前記二本鎖ハイブリッドに結合する抗ハイブリッド抗体を使用することによって前記二本鎖ハイブリッドを捕捉し、それによって、ハイブリッド/結合剤複合体を形成するステップ;
c)前記組成物から前記ハイブリッド/結合剤複合体を分離し、それによって、標的rRNA枯渇化組成物を提供するステップ
を含む、項目1〜11の一項以上に記載の方法。
(項目13)
d)任意選択で、好ましくは前記標的RNA枯渇化組成物を精製することによって、非結合プローブ分子を除去するステップ;および
e)前記標的RNA枯渇化組成物において含まれるRNAを配列決定するステップを含む、項目1〜12の一項以上に記載の方法。
(項目14)
配列決定するステップが、次世代配列決定によって実行される、項目13に記載の方法。
(項目15)
前記RNAを配列決定するステップが、
i)超並列配列決定に適した配列決定ライブラリーを調製するステップ;
ii)前記配列決定ライブラリーにおいて含まれる前記分子を並列に配列決定するステップ
を含む、項目14に記載の方法:
(項目16)
サンプルにおいて含まれる関心のあるRNA分子を配列決定するための方法であって、前記方法は、以下:
a)好ましくは前記サンプルから全RNAを単離することによって、RNA含有組成物を得るステップ;
b)項目1〜12の一項以上に記載の方法を使用して、好ましくは全RNAである前記RNA含有組成物から望まれない標的RNAを枯渇させ、それによって、標的RNA枯渇化組成物を提供するステップ;
c)任意選択で、非結合プローブ分子を除去するステップ;
d)前記標的RNA枯渇化組成物において含まれるRNA分子を配列決定するステップ、
を含む、方法。
(項目17)
i)ステップc)において、前記標的RNA枯渇化組成物が、精製されるおよび/もしくはDNアーゼ消化が実行される;ならびに/または
ii)配列決定するステップが、超並列配列決定に適した配列決定ライブラリーを調製するステップおよび前記配列決定ライブラリーにおいて含まれる前記分子を並列に配列決定するステップ
を含む、項目16に記載の方法。
(項目18)
RNA含有組成物から標的RNAを枯渇させるのに適したキットであって、前記キットは、以下:
a)標的RNAを枯渇させるための1つ以上のグループのプローブ分子であって、あるグループのプローブ分子は、以下:
i)前記グループが、100nt以下の長さを有する2つ以上の異なるプローブ分子を含む;
ii)前記グループにおいて含まれる前記プローブ分子が、標的RNAの標的領域に対して相補的である;
iii)前記標的領域に対してハイブリダイズする場合、2つ以上の前記異なるプローブ分子が、形成される二本鎖ハイブリッドにおいて互いに隣接して位置する、
との特徴を有する、1つ以上のグループのプローブ分子;および
b)前記プローブ分子および標的RNAの間で形成される前記二本鎖ハイブリッドに結合するのに適した結合剤
を含む、キット。
(項目19)
以下:
i)前記標的領域に対してハイブリダイズする場合、グループの前記異なるプローブ分子のうちの2つ以上、好ましくはすべてが、形成された前記二本鎖ハイブリッドにおいて互いに連続している;
ii)前記キットにおいて含まれるプローブ分子が、35nt以下、30nt以下、もしくは25nt以下から選択される長さを有し、10nt〜35ntもしくは15nt〜30ntの範囲にあるプローブ長を好ましくは有する;
iii)前記キットが、特異的な標的RNAを枯渇させるためのプローブセットを含み、プローブセットが、2つ以上のグループのプローブ分子を含み、前記プローブセットにおいて含まれるプローブ分子のそれぞれのグループが、標的RNAにおける異なる標的領域を標的にし、任意選択で、特異的な標的RNAにおいて、前記標的領域が、500nt以下、450nt以下、400nt以下、350nt以下、300nt以下、250nt以下、200nt以下、または150nt以下の距離内に位置する;
iv)前記キットが、2つ以上のグループのプローブ分子を含むプローブセットを含み、前記プローブセットにおいて含まれるプローブ分子のそれぞれのグループが、標的RNAにおける異なる標的領域を標的にし、前記プローブセットにおいて含まれる前記プローブ分子の少なくとも少なくとも85%、少なくとも90%、または少なくとも95%が、それらのグループメンバーに対して連続している;
v)前記標的領域が、前記標的RNAの完全長に実質的に相当する;
vi)前記標的領域が、前記標的RNAにおいて保存される領域である;
vii)前記標的領域が、異なる種において保存される領域である;
viii)前記標的領域が、前記標的RNAにおいて保存され、そして少なくとも種ヒト、マウス、およびラットにおいて保存される領域である;
ix)グループの前記プローブ分子がハイブリダイズする前記標的領域が、50nt〜500nt、50nt〜350、50nt〜250nt、75nt〜225nt、100nt〜200nt、および100nt〜175ntから選択されるサイズを有する;
x)前記キットが、特異的な標的RNAを枯渇させるためのプローブセットを含み、プローブセットが、2つ以上のグループのプローブ分子を含み、それぞれのグループのプローブ分子が、前記標的RNAにおける異なる標的領域を標的にし、前記標的領域が、前記標的RNAの全長にわたって分布する、
xi)前記キットにおいて含まれる前記プローブ分子が、任意選択で修飾されたDNA分子である;
xii)前記抗ハイブリッド結合剤が、RNA/DNAハイブリッドに対して特異的な抗ハイブリッド抗体である;
xiii)あるグループのプローブ分子が、2〜10、3〜8、もしくは4〜6のプローブ分子を含む;ならびに/または
xiv)前記キットが、複数の標的RNAを枯渇させるために1つ以上のグループのプローブ分子および/もしくはプローブセットを含む、
との特徴のうち1つ以上を有する、項目18に記載のキット。
(項目20)
i)標的RNAとして少なくとも1つのタイプのrRNAを枯渇させる;ならびに/または
ii)28S rRNA、18S rRNA、5.8S rRNA、5S rRNA、ミトコンドリア12S rRNA、およびミトコンドリア16S rRNAから選択される、少なくとも1つのタイプのrRNAを枯渇させる、好ましくは、前記rRNAタイプのうち、少なくとも3つ、より好ましくは少なくとも4つ、最も好ましくはすべてを枯渇させる;ならびに/または
iii)28S rRNA、18S rRNA、5.8S rRNA、5S rRNA、ミトコンドリア12S rRNA、およびミトコンドリア16S rRNAのうち、3つ以上、好ましくは4つ以上、最も好ましくはすべてを枯渇させる
ための、1つ以上のグループのプローブ分子ならびに/または1つ以上のプローブセットを含む、項目18または19に記載のキット。
(項目21)
aa)28S rRNAプローブセットであって、以下:
i)前記28Sプローブセットにおいて含まれるプローブ分子の長さが、50nt以下、好ましくは35nt以下、またはより好ましくは30nt以下である;
ii)前記28S rRNAプローブセットにおいて含まれるプローブ分子の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、少なくとも4つ、少なくとも6つ、最も好ましくはすべてのグループが、2つ以上の連続したプローブ分子を含む;
iii)前記28S rRNAプローブセットにおいて含まれる、少なくとも75%、少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、もしくは最も好ましくは少なくとも95%のプローブ分子が、それらのグループメンバーに対して連続している;および/または
iv)前記28S rRNAプローブセットが、前記28S rRNAプローブセットについて表1において示されるプローブ分子のグループの少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、少なくとも4つ、少なくとも6つ、より好ましくは少なくとも8つ、少なくとも10を含み、そして最も好ましくはすべてを含む
との特徴のうち、1つ以上、好ましくはすべてを有する28S rRNAプローブセット、ならびに/または
bb)18S rRNAプローブセットであって、以下:
i)前記18Sプローブセットにおいて含まれるプローブ分子の長さが、50nt以下、好ましくは35nt以下、またはより好ましくは30nt以下である;および/または
ii)前記18S rRNAプローブセットにおいて含まれるプローブ分子の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、より好ましくは少なくとも3つ、少なくとも4つ、そして最も好ましくはすべてのグループが、2つ以上の連続したプローブ分子を含む;
iii)前記18S rRNAプローブセットにおいて含まれる、少なくとも75%、少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%のプローブ分子が、それらのグループメンバーに対して連続している;および/または
iv)前記18S rRNAプローブセットが、前記18S rRNAプローブセットについて表1において示されるプローブ分子のグループの少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、より好ましくは少なくとも3つ、少なくとも4つ、そして最も好ましくはすべてを含む;
との特徴のうち、1つ以上、好ましくはすべてを有する18S rRNAプローブセット、ならびに/または
cc)5.8S rRNAを枯渇させるための少なくとも1つのグループのプローブ分子であって、以下:
i)前記プローブ分子が、50nt以下、好ましくは35nt以下、より好ましくは30nt以下の長さを有する;および/または
ii)前記プローブ分子の少なくとも2つ、好ましくは少なくとも3つ、より好ましくはすべてが、連続したプローブ分子である;および/または
iii)前記5.8S rRNAグループが、5.8S rRNAについて表1において示される1つ以上のプローブ分子を含む;
との特徴のうち、1つ以上、好ましくはすべてを有する少なくとも1つのグループのプローブ分子、ならびに/または
dd)5S rRNAを枯渇させるための少なくとも1つのグループのプローブ分子であって、以下:
i)前記プローブ分子が、50nt以下、好ましくは35nt以下、より好ましくは30nt以下の長さを有する;および/または
ii)前記プローブ分子の少なくとも2つ、好ましくは少なくとも3つ、より好ましくはすべてが、連続したプローブ分子である;および/または
iii)前記5S rRNAグループが、5S rRNAについて表1において示される1つ以上のプローブ分子を含む;
との特徴のうち、1つ以上、好ましくはすべてを有する少なくとも1つのグループのプローブ分子、ならびに/または
ee)ミトコンドリア12S rRNAプローブセットであって、以下:
i)前記12SミトコンドリアrRNAプローブセットにおいて含まれるプローブ分子の長さが、50nt以下、好ましくは35nt以下、またはより好ましくは30nt以下である;および/または
ii)前記12SミトコンドリアrRNAプローブセットにおいて含まれるプローブ分子の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、最も好ましくはすべてのグループが、2つ以上の連続したプローブ分子を含む;および/または
iii)前記12SミトコンドリアrRNAプローブセットにおいて含まれる、少なくとも75%、少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%のプローブ分子が、それらのグループメンバーに対して連続している;
との特徴のうち、1つ以上、好ましくはすべてを有する、ミトコンドリア12S rRNAプローブセット、ならびに/または
ff)ミトコンドリア16S rRNAプローブセットであって、以下:
i)前記16SミトコンドリアrRNAプローブセットにおいて含まれるプローブ分子の長さが、50nt以下、好ましくは35nt以下、またはより好ましくは30nt以下である;および/または
ii)前記16SミトコンドリアrRNAプローブセットにおいて含まれるプローブ分子の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、最も好ましくはすべてのグループが、2つ以上の連続したプローブ分子を含む;および/または
iii)前記16SミトコンドリアrRNAプローブセットにおいて含まれる、少なくとも75%、少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%のプローブ分子が、それらのグループメンバーに対して連続している;
との特徴のうち、1つ以上、好ましくはすべてを有する、ミトコンドリア16S rRNAプローブセット、ならびに/または
gg)aa)において定められる28S rRNAプローブセットおよびbb)において定められる18S rRNAプローブセットならびに任意選択でさらに、cc)において定められる5.8S rRNAグループ、dd)において定められる5S rRNAグループ、ee)において定められる12SミトコンドリアrRNAプローブセット、およびff)において定められる16SミトコンドリアrRNAプローブセットを含む、
を含む、項目18〜20の一項以上に記載のキット。
(項目22)
大量のタンパク質コードmRNA、tRNA、snoRNA、snRNA、および色素体rRNAから選択される標的RNAを枯渇させるための1つ以上のグループもしくはプローブ分子および/または1つ以上のプローブセットを含む、項目18〜21の一項以上に記載のキット。
(項目23)
前記大量のタンパク質コードmRNAが、グロビンRNAである、項目22に記載のキット。
(項目24)
前記抗ハイブリッド結合剤が、抗ハイブリッド抗体、好ましくはRNA/DNAハイブリッドに対して特異的な抗ハイブリッド抗体である、項目18〜23の一項以上に記載のキット。
(項目25)
前記抗ハイブリッド結合剤が、固体支持体上に固定される、項目18〜24の一項以上、特に項目24に記載のキット。
(項目26)
前記抗ハイブリッド結合剤が、固体支持体上に固定されず、そして前記キットが、前記抗ハイブリッド結合剤に結合することができる第2の結合剤を含み、前記第2の結合剤が、固体支持体上に固定される、項目18〜25の一項以上に記載のキット。
(項目27)
前記キットが、ハイブリダイゼーション溶液を含む、項目18〜26の一項以上に記載のキット。
(項目28)
あるグループのプローブ分子が、2〜10、3〜8、または4〜6のプローブ分子を含む、項目18〜27の一項以上に記載のキット。
I.材料および方法
1. 5S、5.8S、18S、28Sに対するDNAオリゴヌクレオチドプローブ
プローブは、ヒト、マウス、およびラットリボソームRNAについての参照配列を採用し、ClustalW2(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)においてそれらをアライメントすることによって設計した。結果として生じるファイルを、3つの種の間で100%相同性な領域について分析し、プローブを適宜設計した。ヒト、マウス、およびラットを主な設計基準として使用するが、これらのプローブは、種々様々の他の種におけるrRNAに対して相同性が高く、最も高度な相同性は他の哺乳動物の間で生じるが、有意な相同性はまた、すべての真核生物においても見つけられる。したがって、グループのプローブ分子およびプローブセットは、ここで実証されるよりもより多くの種について同時に設計することができる。植物、細菌、および他の生物はすべて、等しく有効であろう、設計された特異的なプローブセットを有することができる。プローブはまた、枯渇が関心のある、任意の特異的な核酸配列、たとえばグロビンRNA(たとえば全血調製物において)について設計することもできる。ミトコンドリアおよび色素体rRNAは、同じ手段で枯渇させることができる。
抗ハイブリッド抗体により官能性をもたせた磁気ビーズ(hcビーズ)として、カルボキシル化ビーズにカップリングされた抗ハイブリッド抗体の1%固体溶液を使用した。代替的に、抗ハイブリッド抗体を溶液において遊離して使用し、次いで、抗体に対する親和性を有する結合剤、実施例において、BioMag Protein Gビーズなどのような、プロテインGにより官能性をもたせた磁気ビーズによって捕捉した。
20×SSCをハイブリダイゼーションのために追加した。10μl 20×SSCを100μl組成物に対して追加し、それによって、2×SSCハイブリダイゼーション溶液にした。ハイブリダイゼーション溶液は、RNアーゼ阻害剤、ここでは抗RNアーゼ抗体を含んだ。
マニュアルのプロトコールは、特に指定のない限り、精製全RNAサンプルから出発して、以下のように実行した。
この実施例は、原理の証拠を実証するために実行した。それは、本発明による方法が標的にされたリボソームRNAの非常に効率的で特異的な除去を可能にすることを示す。ヒト、マウス、およびラット18SリボソームRNA配列から設計したDNAプローブ分子を使用した。6×50塩基長(赤線)または12×25塩基長(青線)を、標的RNAとして18S RNAを標的にするために使用し、プローブは、それぞれ100ntの3つのグループで配置し、18S配列にわたって均等に分布した。グループのプローブ分子を全RNAと接触させ、18S標的RNAに対するプローブ分子のハイブリダイゼーションを可能にした。それらの表面上に抗ハイブリッド抗体を持つ様々な量の磁性粒子(hcビーズ)を、形成されたRNA/DNAハイブリッドを捕捉するために使用した。形成されたハイブリッド/結合剤複合体が結合した磁性粒子を、磁場を適用することによって収集し、残りのサンプルから分離し、18S rRNA枯渇化RNA組成物がもたらされ、これを次いで分析した。
この実施例において、本発明による方法を先行技術の方法(RiboMinus(Invitrogen))と比較した。全RNAを出発物質として使用し、5S、5.8S、18S、および28S rRNAを両方の方法を使用して同時に枯渇させた。2つの方法によって得た標的rRNA枯渇化RNA組成物を、qPCRによって分析し、同じ方法に従って処理したポジティブコントロールと比較して定量化した。
標的RNAの一般的な例として分解されたrRNAを除去するための本発明による方法の効率を試験するために、RNAを30分間にわたって80℃で分解した。rRNAは、本発明による方法を使用して、0分、10分、20分、および30分でそれぞれのRNA含有組成物から枯渇させた。表3は、それぞれの時点についてコントロールに対して正規化した、rRNA枯渇化RNAのPCR分析によって得られた結果を示す。インキュベーション時間が長いほど、減少しているRNAの完全性についての数値(RNA integrity number)(RIN)から導き出すことができるようにRNA分解が高度になる。高度に分解されたRNAサンプル(RIN 3.7)の場合でさえ、97%を上回る枯渇効率が長い28S RNAに対してでさえ達成された。これは、本発明による方法がまた、分解され、したがって断片化されたRNAの場合にも、非常に効率的であることを実証する。
標的RNA枯渇の後に、クリーンアップステップをライブラリー構築前に実行することができる。それによって、非結合プローブ分子を除去することができる。QIAcubeで容易に自動化することができる方法であるRNeasy MinEluteは、この目的のために使用することができる。さらに、本発明のハイブリッド捕捉方法もまた、自動化に非常に適しており、2つの温度でのインキュベーション(一方は好ましくは振盪させながら)および捕捉された複合体の分離を必要とするだけである。これらのステップもまた、自動化することができる。一実施形態によれば、ハイブリダイゼーション混合物が、調製されてもよく、RNA組成物を、70℃でオフラインで変性させることができる。次いで、それぞれ調製されたサンプルは、QIAcube上のヒーター/振盪機に移動され、ここで、ビーズが追加され、ハイブリダイゼーションおよび捕捉が行われる。次いで、反応物を中央のQIAcube位置のスピンカラムへ移し、これにより、ビーズをろ過し、それによってハイブリッド/結合剤複合体を除去する。除去されるrRNAを有するフィルタースピンを廃棄し、rRNA枯渇化RNA組成物を含むフロースルーを、QIAcubeでRNeasy Mineluteプロセスによって直接処理する。QIAcubeで処理した後に得られたCt値を、様々なフィルター材料で分析した。QIAcube機で処理されたサンプルはすべて、手作業で処理されたサンプルと性能において等価であり、磁気ビーズは、磁場を使用することによって除去し、関連するポジティブコントロールよりも10〜12サイクル好適であった(99.9%よりも大きな枯渇と等しい)。ベータアクチンは、特異性コントロールとして果たした。
枯渇を上記に記載されるように実行したが、12Sミトコンドリア(mt)rRNAおよび16Sミトコンドリア(mt)rRNAを枯渇させるためのプローブもまた含んだ。表4は、本明細書において記載される方法を使用して標的RNAとして同時に枯渇させたリボソームRNAのそれぞれについて、本発明により達成されたデルタCt値および対応する除去%を示す。5S、5.8S、18S、および28Sを枯渇させるために、材料において記載されるようなグループおよびプローブセット(表1を参照されたい)を使用し、さらに、対応して設計されたプローブセットを、12Sおよび16SミトコンドリアrRNAを枯渇させるために使用した。測定はqPCRによって実行した。
rRNAを、様々な先行技術の方法および本発明の方法を使用して全RNAサンプルから枯渇させた。全RNAを出発物質として使用し、5S、5.8S、18S、および28S rRNAをすべての方法により枯渇させた。さらに、12Sおよび16SミトコンドリアrRNAは、本発明によるプローブ設計を使用して枯渇させた。先行技術の方法として、ポリA濃縮、Ribo−Zero(Epicentre)、およびRibo−Minus(Invitrogen)を、メーカーの指示に従って使用した。ミトコンドリアrRNAもまた、第2の実験において使用したRibo−Zero Goldキットを使用して枯渇させる。
上記に議論されるように、ハイブリダイゼーションによる枯渇が実行される場合、望ましいRNAの非特異的枯渇は、危険である。本発明による方法および先行技術の枯渇方法の相対的な性能を測定するために、3つの枯渇方法すべてからのタンパク質をコードするリードを、ポリ(A)ライブラリーと比較した。枯渇の後に、サンプルをライブラリーにし、およそ100万リード/サンプルの深さ(depth)までIllumniaプラットフォームで配列決定した。タンパク質コード遺伝子に対応するリードを、サンプルにおいてmRNAの通常のレプリゼンテーション(representation)を示すと思われるポリA濃縮サンプルからなるライブラリーと比較した。結果はすべて、MiSeq実験からのものであった。遺伝子数を正規化し、散布図、それぞれのライブラリー対ポリ(A)としてプロットした。高度な一致は、タンパク質をコードする遺伝子のレプリゼンテーションが、ポリAライブラリーにおいて見られるものから外れていないことを示す。
RNAサンプルは、ハイブリッド捕捉抗体およびスタックした短いrRNAプローブのセットを使用してrRNAを枯渇させた。プローブは、プローブ当たり10、15、20、または25ヌクレオチドの長さを有し、100nm、1μM、または10μMの濃度で使用した。以下のグループを使用した:4×25塩基長、5×20塩基長、7×15塩基長、および10×10塩基長。rRNA枯渇後に、サンプルは、5S RNA(表5)およびβ−アクチンmRNA(表6)のリアルタイムPCR検出によって分析した。二連のアッセイから導き出した平均Ct値および標準偏差を、下記の表に示す。
18Sおよび28S rRNAは、本発明による方法を使用して、様々な濃度(1μg、0.25μg、0.1μg、0.025μg、および0.01μg)で全RNAから枯渇させた。枯渇後に、サンプルは、18S rRNA、28S rRNA、およびβ−アクチンmRNAについてリアルタイムPCRによって分析する。ΔCt値は、サンプル対ポジティブコントロールの比を使用して計算する。
rRNA枯渇に対するプローブ数およびプローブ連続性の効果を分析するために、標的rRNA内の300bpまたは600bpに対して互いに隣接してまたは隣接しないでアニールする短い12/13塩基長プローブを設計した。rRNA枯渇は、抗ハイブリッド抗体を使用して実行し、枯渇化サンプルは、18S rRNAの検出のために定量的リアルタイムPCRによって分析した。2つの隣接および4つの隣接の間の差異は、単一のまたはペアで隣接する25塩基長と似ている。8つの隣接は、四つ組の25塩基長に似ている。図8は、定量的RT−PCRの結果を示す。したがって、デルタCt値に頼るよりも、どれだけ残されたかを正確に定量化することができた。実験は、隣接したプローブを使用することによって達成することができる高度な連続性が、ハイブリッド捕捉戦略を使用するrRNA枯渇に対して有益であることを示す。さらに、隣接した結合プローブの数を増加させることもまた、rRNA枯渇のための効率を増加させる。
以下の実験は、抗ハイブリッド抗体が特異的であり、完全にマッチした配列でさえその短い領域を認識しないであろうということを示す。
Claims (29)
- 初期RNA含有組成物から標的RNA枯渇化組成物を調製する方法であって、前記方法は、以下:
a)1つ以上のグループのプローブ分子と前記初期RNA含有組成物を接触させ、そして前記標的RNAおよび前記プローブ分子の間で二本鎖ハイブリッドを生成するステップであって、ここで、あるグループのプローブ分子が、以下:
i)前記グループが、35nt以下の長さを有する2つ以上の異なるプローブ分子を含む;
ii)前記グループにおいて含まれる前記プローブ分子が、標的RNAの標的領域に対して相補的である;
iii)前記標的領域に対してハイブリダイズする場合、2つ以上の前記異なるプローブ分子が、形成される前記二本鎖ハイブリッドにおいて互いに離れた間隔が20nt以下で互いに隣接して位置し、前記グループの前記2つ以上のプローブ分子は形成される前記二本鎖ハイブリッドにおいて互いに連続している、
との特徴を有するステップ;
b)前記二本鎖ハイブリッドに結合する結合剤を使用することによって前記二本鎖ハイブリッドを捕捉し、それによって、ハイブリッド/結合剤複合体を形成するステップであって、ここで前記結合剤は、形成される前記ハイブリッドに特異的に結合することができる、抗ハイブリッド抗体またはその断片である、ステップ;
c)前記組成物から前記ハイブリッド/結合剤複合体を分離し、それによって、標的RNA枯渇化組成物を提供するステップ、
を含む、方法。 - 前記標的領域に対してハイブリダイズする場合、グループのすべてのプローブ分子が、形成された前記二本鎖ハイブリッドにおいて互いに連続している、請求項1に記載の方法。
- 前記プローブ分子が、10nt〜35ntの範囲にある長さを有する、請求項1または2に記載の方法。
- プローブセットが、特異的な標的RNAの枯渇のために使用され、プローブセットが、2つ以上のグループのプローブ分子を含み、前記プローブセットにおいて含まれるプローブ分子のそれぞれのグループが、前記標的RNAにおける異なる標的領域を標的にする、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 特異的な標的RNAにおいて、前記標的領域が、500nt以下の距離内に位置する、請求項4に記載の方法。
- プローブセットにおいて含まれる前記プローブ分子の少なくとも85%が、それらのグループメンバーに対して連続している、請求項4または5に記載の方法。
- 以下:
i)前記標的領域が、前記標的RNAの完全長に相当する;
ii)前記標的領域が、前記標的RNAにおいて保存される領域である;
iii)前記標的領域が、異なる種において保存される領域である;
iv)前記標的領域が、前記標的RNAにおいて保存され、そして少なくとも種ヒト、マウス、およびラットにおいて保存される領域である;
v)グループの前記プローブ分子がハイブリダイズする前記標的領域が、50nt〜500ntから選択されるサイズを有する;
vi)プローブセットが、特異的な標的RNAの枯渇のために使用され、プローブセットが、2つ以上のグループのプローブ分子を含み、それぞれのグループのプローブ分子が、前記標的RNAにおける異なる標的領域を標的にし、前記標的領域が、前記標的RNAの全長にわたって分布する;ならびに/または
vii)標的RNA枯渇効率が、少なくとも95%である、
との特徴のうち1つ以上を有する、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。 - 複数の標的RNAが、前記初期RNA含有組成物から枯渇される、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 以下:
i)少なくとも1つのタイプのrRNAが、標的RNAとして枯渇される;ならびに/または
ii)28S rRNA、18S rRNA、5.8S rRNA、5S rRNA、ミトコンドリア12S rRNA、およびミトコンドリア16S rRNAから選択される少なくとも1つのタイプのrRNAが、枯渇される;ならびに/または
iii)複数のグループのプローブ分子および/もしくはプローブセットが、前記初期RNA含有組成物から、28S rRNA、18S rRNA、5.8S rRNA、5S rRNA、ミトコンドリア12S rRNA、およびミトコンドリア16S rRNAのうちの3つ以上を枯渇させるために使用される、
との特徴のうち1つ以上を有する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。 - 以下:
aa)28S rRNAが標的RNAとして枯渇される場合、28S rRNAプローブセットであって、以下:
i)前記28Sプローブセットにおいて含まれるプローブ分子の長さが、30nt以下である;
ii)前記28S rRNAプローブセットにおいて含まれる、少なくとも75%のプローブ分子が、それらのグループメンバーに対して連続している;および/または
iii)前記28S rRNAプローブセットが、前記28S rRNAプローブセットについて表1において示されるプローブ分子のグループの少なくとも1つを含む
との特徴のうち、1つ以上を有する28S rRNAプローブセットが、使用される、ならびに/または
bb)18S rRNAが標的RNAとして枯渇される場合、18S rRNAプローブセットであって、以下:
i)前記18Sプローブセットにおいて含まれるプローブ分子の長さが、30nt以下である;および/または
ii)前記18S rRNAプローブセットにおいて含まれる、少なくとも75%のプローブ分子が、それらのグループメンバーに対して連続している;および/または
iii)前記18S rRNAプローブセットが、前記18S rRNAプローブセットについて表1において示されるプローブ分子のグループの少なくとも1つを含む;
との特徴のうち、1つ以上を有する18S rRNAプローブセットが、使用される;ならびに/または
cc)5.8S rRNAが標的RNAとして枯渇される場合、少なくとも1つのグループのプローブ分子であって、以下:
i)前記プローブ分子が、30nt以下の長さを有する;および/または
ii)前記5.8S rRNAグループが、5.8S rRNAについて表1において示される1つ以上のプローブ分子を含む
との特徴のうち、1つ以上を有する少なくとも1つのグループのプローブ分子が、使用される;ならびに/または
dd)5S rRNAが標的RNAとして枯渇される場合、少なくとも1つのグループのプローブ分子であって、以下:
i)前記プローブ分子が、30nt以下の長さを有する;および/または
ii)前記5S rRNAグループが、5S rRNAについて表1において示される1つ以上のプローブ分子を含む;
との特徴のうち、1つ以上を有する少なくとも1つのグループのプローブ分子が、使用される、ならびに/または
ee)ミトコンドリア12S rRNAが標的RNAとして枯渇される場合、プローブセットであって、以下:
i)前記12SミトコンドリアrRNAプローブセットにおいて含まれるプローブ分子の長さが、30nt以下である;および/または
ii)前記12SミトコンドリアrRNAプローブセットにおいて含まれる、少なくとも75%のプローブ分子が、それらのグループメンバーに対して連続している;
との特徴のうち、1つ以上を有するプローブセットが、使用される、ならびに/または
ff)ミトコンドリア16S rRNAが標的RNAとして枯渇される場合、プローブセットであって、以下:
i)前記16SミトコンドリアrRNAプローブセットにおいて含まれるプローブ分子の長さが、30nt以下である;および/または
ii)前記16SミトコンドリアrRNAプローブセットにおいて含まれる、少なくとも75%のプローブ分子が、それらのグループメンバーに対して連続している;
との特徴のうち、1つ以上を有するプローブセットが、使用される、ならびに/または
gg)aa)において定められる28S rRNAプローブセットおよびbb)において定められる18S rRNAプローブセットが、標的RNAとして28S rRNAおよび18S rRNAが枯渇された標的RNA枯渇化組成物を提供するために使用され、cc)において定められる5.8S rRNAグループ、dd)において定められる5S rRNAグループ、ee)において定められる12SミトコンドリアrRNAプローブセット、およびff)において定められる16SミトコンドリアrRNAプローブセットが、標的RNAとして5.8S rRNA、5S rRNA、ミトコンドリア12S rRNA、およびミトコンドリア16S rRNAをさらに枯渇させるために使用される、
との特徴のうち1つ以上を有する、請求項8または9に記載の方法。 - 以下:
i)大量のタンパク質コードmRNAが、標的RNAとして枯渇される、
ii)グロビンRNAが標的RNAとして枯渇される;
iii)前記抗ハイブリッド結合剤が、RNA/DNAハイブリッドに対して特異的な抗ハイブリッド抗体である;
iv)使用される前記抗ハイブリッド結合剤が、固体支持体に対して固定されるもしくは前記抗ハイブリッド結合剤が、溶液において遊離しており、そして固体支持体に対して固定された第2の結合剤が、前記抗ハイブリッド結合剤に結合し、したがって形成された前記ハイブリッド/結合剤複合体を捕捉するために使用される;
v)ステップa)およびb)が同時に実行される、ならびに/または
vi)修飾されたDNA分子が、プローブ分子として使用され、二本鎖RNA/DNAハイブリッドが形成される、
との特徴のうち1つ以上を有する、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。 - a)1つ以上のグループのプローブ分子と全RNAを接触させ、そして前記標的rRNAおよび前記プローブ分子の間で二本鎖ハイブリッドを生成するステップであって、前記グループにおいて含まれる前記プローブ分子が、標的RNAの標的領域に対して相補的であり、前記標的RNAが、rRNAである、ステップ;
b)前記二本鎖ハイブリッドに結合する抗ハイブリッド抗体を使用することによって前記二本鎖ハイブリッドを捕捉し、それによって、ハイブリッド/結合剤複合体を形成するステップ;
c)前記組成物から前記ハイブリッド/結合剤複合体を分離し、それによって、標的rRNA枯渇化組成物を提供するステップ
を含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。 - d)非結合プローブ分子を除去するステップを含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- e)前記標的RNA枯渇化組成物において含まれるRNAを配列決定するステップを含む、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 配列決定するステップが、次世代配列決定によって実行される、請求項14に記載の方法。
- 前記RNAを配列決定するステップが、
i)超並列配列決定に適した配列決定ライブラリーを調製するステップ;
ii)前記配列決定ライブラリーにおいて含まれる前記分子を並列に配列決定するステップ
を含む、請求項15に記載の方法: - サンプルにおいて含まれる関心のあるRNA分子を配列決定するための方法であって、前記方法は、以下:
aaa)RNA含有組成物を得るステップ;
bbb)請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法を使用して、前記RNA含有組成物から望まれない標的RNAを枯渇させ、それによって、標的RNA枯渇化組成物を提供するステップ;
ccc)非結合プローブ分子を除去するステップ;
ddd)前記標的RNA枯渇化組成物において含まれるRNA分子を配列決定するステップ、
を含む、方法。 - i)ステップccc)において、前記標的RNA枯渇化組成物が、精製されるおよび/もしくはDNアーゼ消化が実行される;ならびに/または
ii)配列決定するステップが、超並列配列決定に適した配列決定ライブラリーを調製するステップおよび前記配列決定ライブラリーにおいて含まれる前記分子を並列に配列決定するステップ
を含む、請求項17に記載の方法。 - RNA含有組成物から標的RNAを枯渇させるのに適したキットであって、前記キットは、以下:
a)標的RNAを枯渇させるための1つ以上のグループのプローブ分子であって、あるグループのプローブ分子は、以下:
i)前記グループが、35nt以下の長さを有する2つ以上の異なるプローブ分子を含む;
ii)前記グループにおいて含まれる前記プローブ分子が、標的RNAの標的領域に対して相補的である;
iii)前記標的領域に対してハイブリダイズする場合、2つ以上の前記異なるプローブ分子が、形成される二本鎖ハイブリッドにおいて互いに離れた間隔が20nt以下で互いに隣接して位置し、グループの2つ以上のプローブ分子は形成される前記二本鎖ハイブリッドにおいて互いに連続している、
との特徴を有する、1つ以上のグループのプローブ分子;および
b)前記プローブ分子および標的RNAの間で形成される前記二本鎖ハイブリッドに結合するのに適した結合剤であって、形成される前記ハイブリッドに特異的に結合することができる、抗ハイブリッド抗体またはその断片である、結合剤
を含む、キット。 - 以下:
i)前記標的領域に対してハイブリダイズする場合、グループの前記異なるプローブ分子のうちの2つ以上が、形成された前記二本鎖ハイブリッドにおいて互いに連続している;
ii)前記キットにおいて含まれるプローブ分子が、10nt〜35ntの範囲にある長さを有する;
iii)前記キットが、特異的な標的RNAを枯渇させるためのプローブセットを含み、プローブセットが、2つ以上のグループのプローブ分子を含み、前記プローブセットにおいて含まれるプローブ分子のそれぞれのグループが、標的RNAにおける異なる標的領域を標的にする;
iv)前記キットが、特異的な標的RNAを枯渇するためのプローブセットを含み、前記標的領域が500nt以下の距離内に位置する;
v)前記キットが、2つ以上のグループのプローブ分子を含むプローブセットを含み、前記プローブセットにおいて含まれるプローブ分子のそれぞれのグループが、標的RNAにおける異なる標的領域を標的にし、前記プローブセットにおいて含まれる前記プローブ分子の少なくとも少なくとも85%が、それらのグループメンバーに対して連続している;
vi)前記標的領域が、前記標的RNAの完全長に相当する;
vii)前記標的領域が、前記標的RNAにおいて保存される領域である;
viii)前記標的領域が、異なる種において保存される領域である;
ix)前記標的領域が、前記標的RNAにおいて保存され、そして少なくとも種ヒト、マウス、およびラットにおいて保存される領域である;
x)グループの前記プローブ分子がハイブリダイズする前記標的領域が、50nt〜500ntから選択されるサイズを有する;
xi)前記キットが、特異的な標的RNAを枯渇させるためのプローブセットを含み、プローブセットが、2つ以上のグループのプローブ分子を含み、それぞれのグループのプローブ分子が、前記標的RNAにおける異なる標的領域を標的にし、前記標的領域が、前記標的RNAの全長にわたって分布する、
xii)前記キットにおいて含まれる前記プローブ分子が、修飾されたDNA分子である;
xiii)前記抗ハイブリッド結合剤が、RNA/DNAハイブリッドに対して特異的な抗ハイブリッド抗体である;
xiv)あるグループのプローブ分子が、2〜10のプローブ分子を含む;ならびに/または
xv)前記キットが、複数の標的RNAを枯渇させるために1つ以上のグループのプローブ分子および/もしくはプローブセットを含む、
との特徴のうち1つ以上を有する、請求項19に記載のキット。 - i)標的RNAとして少なくとも1つのタイプのrRNAを枯渇させる;ならびに/または
ii)28S rRNA、18S rRNA、5.8S rRNA、5S rRNA、ミトコンドリア12S rRNA、およびミトコンドリア16S rRNAから選択される、少なくとも1つのタイプのrRNAを枯渇させる;ならびに/または
iii)28S rRNA、18S rRNA、5.8S rRNA、5S rRNA、ミトコンドリア12S rRNA、およびミトコンドリア16S rRNAのうち、3つ以上を枯渇させる
ための、1つ以上のグループのプローブ分子ならびに/または1つ以上のプローブセットを含む、請求項19または20に記載のキット。 - aa)28S rRNAプローブセットであって、以下:
i)前記28Sプローブセットにおいて含まれるプローブ分子の長さが、30nt以下である;
ii)前記28S rRNAプローブセットにおいて含まれる、少なくとも75%のプローブ分子が、それらのグループメンバーに対して連続している;および/または
iii)前記28S rRNAプローブセットが、前記28S rRNAプローブセットについて表1において示されるプローブ分子のグループの少なくとも1つを含む
との特徴のうち、1つ以上を有する28S rRNAプローブセット、ならびに/または
bb)18S rRNAプローブセットであって、以下:
i)前記18Sプローブセットにおいて含まれるプローブ分子の長さが、30nt以下である;および/または
ii)前記18S rRNAプローブセットにおいて含まれる、少なくとも75%のプローブ分子が、それらのグループメンバーに対して連続している;および/または
iii)前記18S rRNAプローブセットが、前記18S rRNAプローブセットについて表1において示されるプローブ分子のグループの少なくとも1つを含む;
との特徴のうち、1つ以上を有する18S rRNAプローブセット、ならびに/または
cc)5.8S rRNAを枯渇させるための少なくとも1つのグループのプローブ分子であって、以下:
i)前記プローブ分子が、30nt以下の長さを有する;および/または
ii)前記プローブ分子の少なくとも2つが、連続したプローブ分子である;および/または
iii)前記5.8S rRNAグループが、5.8S rRNAについて表1において示される1つ以上のプローブ分子を含む;
との特徴のうち、1つ以上を有する少なくとも1つのグループのプローブ分子、ならびに/または
dd)5S rRNAを枯渇させるための少なくとも1つのグループのプローブ分子であって、以下:
i)前記プローブ分子が30nt以下の長さを有する;および/または
ii)前記5S rRNAグループが、5S rRNAについて表1において示される1つ以上のプローブ分子を含む;
との特徴のうち、1つ以上を有する少なくとも1つのグループのプローブ分子、ならびに/または
ee)ミトコンドリア12S rRNAプローブセットであって、以下:
i)前記12SミトコンドリアrRNAプローブセットにおいて含まれるプローブ分子の長さが、30nt以下である;および/または
ii)前記12SミトコンドリアrRNAプローブセットにおいて含まれる、少なくとも75%のプローブ分子が、それらのグループメンバーに対して連続している;
との特徴のうち、1つ以上を有する、ミトコンドリア12S rRNAプローブセット、ならびに/または
ff)ミトコンドリア16S rRNAプローブセットであって、以下:
i)前記16SミトコンドリアrRNAプローブセットにおいて含まれるプローブ分子の長さが、30nt以下である;および/または
ii)前記16SミトコンドリアrRNAプローブセットにおいて含まれる、少なくとも75%のプローブ分子が、それらのグループメンバーに対して連続している;
との特徴のうち、1つ以上を有する、ミトコンドリア16S rRNAプローブセット、ならびに/または
gg)aa)において定められる28S rRNAプローブセットおよびbb)において定められる18S rRNAプローブセットならびにさらに、cc)において定められる5.8S rRNAグループ、dd)において定められる5S rRNAグループ、ee)において定められる12SミトコンドリアrRNAプローブセット、およびff)において定められる16SミトコンドリアrRNAプローブセットを含む、
を含む、請求項19〜21のいずれか一項に記載のキット。 - 大量のタンパク質コードmRNA、tRNA、snoRNA、snRNA、および色素体rRNAから選択される標的RNAを枯渇させるための1つ以上のグループもしくはプローブ分子および/または1つ以上のプローブセットを含む、請求項19〜22のいずれか一項に記載のキット。
- 前記大量のタンパク質コードmRNAが、グロビンRNAである、請求項23に記載のキット。
- 前記抗ハイブリッド結合剤が、抗ハイブリッド抗体である、請求項19〜24のいずれか一項に記載のキット。
- 前記抗ハイブリッド結合剤が、固体支持体上に固定される、請求項19〜25のいずれか一項に記載のキット。
- 前記抗ハイブリッド結合剤が、固体支持体上に固定されず、そして前記キットが、前記抗ハイブリッド結合剤に結合することができる第2の結合剤を含み、前記第2の結合剤が、固体支持体上に固定される、請求項19〜26のいずれか一項に記載のキット。
- 前記キットが、ハイブリダイゼーション溶液を含む、請求項19〜27のいずれか一項に記載のキット。
- あるグループのプローブ分子が、2〜10のプローブ分子を含む、請求項19〜28のいずれか一項に記載のキット。
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