CN116034166A - Dna甲基化的空间分析 - Google Patents

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Abstract

本文提供了鉴定生物样品中分析物的甲基化状态的方法。本文还提供了将鉴定甲基化状态与空间技术相结合来鉴定生物样品中甲基化状态的位置的方法。

Description

DNA甲基化的空间分析
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年6月25日提交的美国临时专利申请号63/044,042和2020年12月21日提交的美国临时专利申请号63/128,783的优先权。前述申请的全部内容通过引用并入本文。
背景技术
由于不同细胞内不同的分析物水平(例如，基因和/或蛋白质表达)，故受试者组织内的细胞在细胞形态和/或功能上具有差异。细胞在组织内的具体位置(例如，细胞相对于相邻细胞的位置或细胞相对于组织微环境的位置)可影响例如细胞的形态、分化、命运、活力、增殖、行为以及与组织中的其他细胞的信号传导和串扰。
先前研究空间异质性使用的技术仅提供完整组织或组织的一部分的背景下一小部分分析物的数据，或提供单个细胞的大量分析物数据，但未能提供关于单个细胞在亲本生物样品(例如，组织样品)中的位置的信息。
DNA甲基化是基因组的一种关键的表观遗传修饰，参与调节许多细胞过程。这些过程包括但不限于胚胎发育、转录、染色体活化、染色体稳定性，因此DNA甲基化以及异常DNA甲基化已与人类疾病相关联。
DNA甲基化是一种可通过多次细胞分裂遗传的表观遗传标记。然而，甲基化状态的变化也可发生在单个细胞(例如，癌细胞)中。因此，在病理环境中，每个DNA分子的甲基化状态都可能发生变化，使得其分析具有挑战性且繁琐。标准DNA测序技术中甲基化的胞嘧啶碱基与未甲基化的胞嘧啶碱基不可区分的事实使得这更加令人困惑。为了研究DNA甲基化，许多研究人员依赖于使用亚硫酸氢盐：一种将未甲基化的胞嘧啶转化为胸腺嘧啶而使甲基化的胞嘧啶完好无损的化学物质。理想地，亚硫酸氢盐转化可用于单细胞技术，然而，该化学品过于粗粝，会使DNA片段化，并且常常与下游步骤中所需的酶和试剂不相容。然而，由于与靶向DNA甲基化相关的诊断和治疗意义，仍然需要开发可靠且成本有效的方法来确定生物样品的空间位置处核酸的甲基化状态。
发明内容
本公开提供了空间分析的方法以及DNA甲基化状态的鉴定。本文提供的方法适用于正常生理学状况、发育和干细胞研究，以及病理生理学环境如癌症中。例如，在一个实施方案中，可在治疗性给药期间检查一种或多种特定分析物的DNA甲基化状态(及其变化)。并且，因为分析物(或其补体)的位置可使用如本文所公开的空间分析方法(例如，RNA模板化连接)来鉴定，故可鉴定分析物的位置和/或甲基化状态的变化。在一些情况下，本文公开的方法还可与提供图像的特定位置(例如，生物样品中肿瘤的位置)与该位置处的基因表达和甲基化状态两者之间的相关性的成像技术联用。因此，本公开提供了鉴定生物样品中甲基化的DNA的位置的有力方法。
因此，本文描述了一种用于鉴定生物样品中分析物的甲基化状态的方法，所述方法包括：(a)使生物样品与包括多个捕获探针的阵列接触，其中所述多个捕获探针中的捕获探针包含(i)空间条形码和(ii)包含至少一个甲基化胞嘧啶的捕获结构域；(b)使生物样品中的分析物脱氨；(c)使分析物与包括第一探针和第二探针的多个探针接触，其中所述第一探针包含(i)与分析物的至少第一序列互补的序列和(ii)与捕获结构域互补的序列；并且所述第二探针包含与分析物的至少第二序列互补的序列；(d)连接所述第一探针和所述第二探针，从而生成连接产物；(e)将所述连接产物与所述捕获探针杂交；(f)使用所述连接产物作为模板延伸所述捕获探针；从而生成延伸的捕获探针；以及(g)测定(i)空间条形码的全部或部分序列或其补体，和(ii)延伸的捕获探针的全部或部分序列或其补体，并且使用(i)和(ii)的测定序列来鉴定生物样品中分析物的甲基化状态。
在一些实施方案中，第一寡核苷酸和第二寡核苷酸在间隔至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个核苷酸的序列处与分析物杂交。
在一些实施方案中，本文描述的方法还包括在步骤(c)之后延伸第一寡核苷酸和/或第二寡核苷酸。在一些实施方案中，使用聚合酶延伸第一探针和/或第二探针。
在一些实施方案中，本文描述的方法还包括从分析物释放连接产物。在一些实施方案中，释放发生在连接产物与捕获探针杂交之前。
在一些实施方案中，所述方法还包括，在步骤(b)之前，使生物样品与透化试剂接触。
在一些实施方案中，第一探针和/或第二探针包含与分析物上不具有CG二核苷酸的序列结合的序列。
在一些实施方案中，所述方法还包括在步骤(b)和步骤(c)之间洗涤生物样品。
在另一个方面，本文描述了一种用于鉴定生物样品中DNA的甲基化状态的方法，所述方法包括：(a)向生物样品提供一个或多个转座体，其中所述转座体包含甲基化衔接子，条件是其中一个或多个甲基化衔接子被插入到DNA中，从而生成包含甲基化衔接子的标签化DNA片段；(b)使所述标签化DNA片段与包括多个捕获探针的阵列接触，其中所述多个捕获探针中的捕获探针包含空间条形码，其中如果捕获探针包含一个或多个胞嘧啶，则其中所述一个或多个胞嘧啶为甲基化胞嘧啶；(c)将包含所述标签化DNA片段和所述一个或多个甲基化衔接子的序列连接至捕获探针，从而产生连接产物；(d)使所述连接产物脱氨；以及(e)测定(i)空间条形码的全部或部分序列或其补体，和(ii)连接产物的全部或部分序列或其补体，并且使用(i)和(ii)的测定序列来鉴定生物样品中DNA或其一部分的甲基化状态。
在一些实施方案中，连接包括添加夹板寡核苷酸，所述夹板寡核苷酸包含(i)与捕获探针的一部分特异性结合的序列；和(ii)与连接产物的一部分特异性结合的序列。在一些实施方案中，夹板寡核苷酸包含与所述一个或多个甲基化衔接子的一部分特异性结合的序列。
在一些实施方案中，转座酶为Tn5转座酶或其功能衍生物或者Tn7转座酶或其功能衍生物。
在一些实施方案中，所述一个或多个甲基化衔接子包含第一甲基化衔接子和第二甲基化衔接子。
在一些实施方案中，本文描述的方法还包括将连接产物与末端转移酶和多个脱氧胞苷三磷酸(dCTP)分子一起孵育，从而在3′末端处延伸连接产物。
在一些实施方案中，本文描述的方法还包括扩增连接产物。在一些实施方案中，本文描述的方法还包括使用与聚-半胱氨酸序列互补的引物序列在连接产物的3′末端处扩增连接产物。
在一些实施方案中，连接包括酶促连接或化学连接。在一些实施方案中，酶促连接利用连接酶。在一些实施方案中，连接酶为SplintR连接酶、单链DNA连接酶或T4 DNA连接酶中的一种或多种。
在一些实施方案中，本文描述的方法还包括其中分析物迁移至基底的迁移步骤。在一些实施方案中，迁移步骤为主动迁移步骤，其包括向基因组DNA施加电场。在一些实施方案中，迁移步骤为被动迁移步骤。
在另一个方面，本文描述了一种在第一基底上鉴定生物样品中核酸的甲基化状态的方法，其包括：(a)使核酸脱氨；(b)将第一探针和第二探针与核酸杂交，其中：第一探针包含(i)与核酸的至少第一序列互补的序列和(ii)与阵列上的捕获探针的捕获结构域互补的序列；并且第二探针包含与核酸的至少第二序列互补的序列；(c)连接第一探针和第二探针以生成连接产物；(d)将第一基底与包含阵列的第二基底对准，使得生物样品的至少一部分与阵列的至少一部分对准，其中所述阵列包括多个捕获探针，其中所述多个捕获探针的捕获探针包含：(i)空间条形码和(ii)捕获结构域；(e)当生物样品与阵列的至少一部分对准时，(i)从分析物释放连接产物和(ii)将连接产物从生物样品迁移至阵列；以及(f)用捕获结构域捕获连接产物。
在一些实施方案中，本文描述的方法还包括测定(i)空间条形码的全部或部分序列或其补体和(ii)连接产物的全部或部分序列或其补体。
在一些实施方案中，本文描述的方法还包括使用(i)和(ii)的测定序列来鉴定生物样品中核酸的甲基化状态。
在一些实施方案中，第一探针与核酸至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％互补。在一些实施方案中，第一探针的长度为约15至约120个核苷酸。在一些实施方案中，第一序列的长度为约10至约60个核苷酸。
在一些实施方案中，第二探针与核酸至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％互补。在一些实施方案中，第二探针的长度为约15至约120个核苷酸。在一些实施方案中，第二序列的长度为约10至约60个核苷酸。
在一些实施方案中，第一序列和第二序列为相邻序列。
在一些实施方案中，至少一个脱氨核苷酸位于第一序列与第二序列之间。在一些实施方案中，至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或更多个脱氨核苷酸位于第一序列与第二序列之间。
在一些实施方案中，本文描述的方法还包括使用聚合酶生成延伸的第一探针和/或延伸的第二探针，其中所述延伸的第一探针或延伸的第二探针包含与第一序列和第二序列之间的序列互补的序列。
在一些实施方案中，至少一个脱氨核苷酸位于第一序列中。在一些实施方案中，至少一个脱氨核苷酸位于第二序列中。
在一些实施方案中，释放包括加热生物样品。在一些实施方案中，步骤(e)还包括使生物样品与包含透化试剂的试剂介质接触，任选地其中所述透化试剂包含蛋白酶。
在一些实施方案中，连接第一探针和第二探针包括经由连接酶连接第一探针和第二探针。在一些实施方案中，连接第一探针和第二探针包括经由连接酶连接：(a)第一探针和延伸的第二探针；或(b)延伸的第一探针和第二探针。在一些实施方案中，连接酶选自SplintR连接酶、单链DNA连接酶或T4 DNA连接酶。
在一些实施方案中，第一探针和第二探针在邻接的核酸上。在一些实施方案中，连接利用夹板寡核苷酸。在一些实施方案中，夹板寡核苷酸包含与第一探针基本上互补的第一夹板序列和与第二探针基本上互补的第二夹板序列。
在一些实施方案中，捕获连接产物包括将与捕获结构域互补的序列与捕获结构域杂交。在一些实施方案中，捕获连接产物包括将连接产物连接至捕获探针。
在一些实施方案中，本文描述的方法还包括使用连接产物作为模板延伸捕获探针；从而生成延伸的捕获探针。
在另一个方面，本文描述了一种在第一基底上鉴定生物样品中核酸的甲基化状态的方法，所述方法包括：(a)将甲基化衔接子连接至核酸，生成衔接的核酸片段；(b)使衔接的核酸片段脱氨；(c)将第一基底与包含阵列的第二基底对准，使得生物样品的至少一部分与阵列的至少一部分对准，其中所述阵列包括多个捕获探针，其中所述多个捕获探针的捕获探针包含：(i)空间条形码和(ii)捕获结构域；(d)当生物样品与阵列的至少一部分对准时，将衔接的核酸片段从生物样品迁移至阵列；以及(e)用捕获结构域捕获衔接的核酸片段。
在一些实施方案中，本文描述的方法还包括测定(i)空间条形码的全部或部分序列或其补体和(ii)连接产物的全部或部分序列或其补体。
在一些实施方案中，本文描述的方法还包括使用(i)和(ii)的测定序列来鉴定生物样品中核酸或其一部分的甲基化状态。
在一些实施方案中，甲基化衔接子通过标签化连接至核酸。在一些实施方案中，甲基化衔接子在核酸的5’末端处连接至核酸。在一些实施方案中，甲基化衔接子在核酸的3’末端处连接至核酸。
在一些实施方案中，甲基化衔接子的长度为至少约10个核苷酸至约50个核苷酸。
在一些实施方案中，甲基化衔接子包含至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或更多个甲基化胞嘧啶。
在一些实施方案中，空间条形码包含至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或更多个甲基化胞嘧啶。
在一些实施方案中，将甲基化衔接子连接至核酸包括使用与转座子复合的转座酶将一个或多个甲基化衔接子附接到核酸的5’和/或3’末端，其中所述转座酶为Tn5转座酶或其功能衍生物。
在一些实施方案中，捕获衔接的核酸片段包括将衔接的核酸片段与捕获结构域杂交。在一些实施方案中，捕获衔接的核酸片段包括将衔接的核酸片段与捕获结构域连接，其中所述连接包括酶促连接或化学连接。
在一些实施方案中，所述连接采用夹板寡核苷酸，任选地其中所述夹板寡核苷酸包含与衔接的核酸片段基本上互补的第一夹板序列和与捕获探针基本上互补的第二夹板序列。
在一些实施方案中，本文描述的方法还包括使用衔接的核酸片段作为模板延伸捕获探针；从而生成延伸的捕获探针。
在一些实施方案中，本文描述的方法还包括将衔接的核酸片段与末端转移酶和多个脱氧胞苷三磷酸(dCTP)分子一起孵育，从而生成延伸的衔接的核酸片段。
在一些实施方案中，本文描述的方法还包括扩增所述延伸的衔接的核酸片段。在一些实施方案中，本文描述的方法还包括使用与聚-半胱氨酸序列互补的引物序列在衔接的核酸片段的3′末端处扩增所述延伸的衔接的核酸片段。
在一些实施方案中，生物样品为癌症组织样品。在一些实施方案中，生物样品来自经用癌症疗法治疗的受试者。在一些实施方案中，核酸为DNA。在一些实施方案中，DNA为基因组DNA。
在一些实施方案中，生物样品为组织样品，任选地其中所述组织样品为固体组织样品，任选地其中所述组织样品为组织切片。在一些实施方案中，生物样品为固定样品、冷冻样品、新鲜样品或新鲜冷冻样品。在一些实施方案中，生物样品为福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样品。
在一些实施方案中，第一基底为载片。在一些实施方案中，第一基底为玻璃载片。在一些实施方案中，第一基底不包含捕获探针的阵列。
在一些实施方案中，脱氨包括使生物样品与包含亚硫酸氢钠的组合物接触。在一些实施方案中，脱氨包括用酶处理生物样品。在一些实施方案中，酶为胞苷脱氨酶或脱甲基酶。
在一些实施方案中，第二基底为玻璃载片。在一些实施方案中，捕获探针的5’末端附接到第二基底。
在一些实施方案中，阵列为珠阵列。在一些实施方案中，捕获探针的5’末端附接到珠阵列的珠。
在一些实施方案中，捕获探针还包含唯一分子标识符(UMI)。
在一些实施方案中，捕获探针还包含一个或多个功能结构域、唯一分子标识符、切割结构域及其组合。
在一些实施方案中，迁移是主动的。在一些实施方案中，迁移是被动的。
在一些实施方案中，使用聚合酶延伸捕获探针。
在一些实施方案中，所述测定包括对(i)核酸的全部或部分序列或其补体和(ii)空间条形码的全部或部分序列或其补体测序。
在一些实施方案中，甲基化状态包括鉴定约1％至约100％的胞嘧啶包含甲基基团。
在一些实施方案中，本文描述的方法还包括对生物样品成像。在一些实施方案中，成像在对生物样品脱氨之前进行。
在另一个方面，本文描述了一种试剂盒，其包含用于执行本文描述的方法中的任一种的零件和说明书。
在一些实施方案中，试剂盒包含包括多个捕获探针的基底，其中所述多个第一捕获探针的捕获探针包含(i)空间条形码和(ii)捕获结构域。
在一些实施方案中，试剂盒包含一种或多种酶。在一些实施方案中，所述一种或多种酶选自转座酶、连接酶、聚合酶；逆转录酶、胞苷脱氨酶和脱甲基酶。
在一些实施方案中，试剂盒还包含转座体复合物，所述转座体复合物包含转座酶、转座子序列和/或衔接子序列。
在另一个方面，本文描述了一种组合物，其包含用于执行本文描述的方法中的任一种的试剂。
在一些实施方案中，组合物包含包括多个捕获探针的基底，其中所述多个第一捕获探针的捕获探针包含(i)空间条形码和(ii)捕获结构域。
在一些实施方案中，组合物包含一种或多种酶。在一些实施方案中，所述一种或多种酶选自转座酶、连接酶、聚合酶；逆转录酶、胞苷脱氨酶和脱甲基酶。
在一些实施方案中，组合物还包含转座体复合物，所述转座体复合物包含转座酶、转座子序列和/或衔接子序列。
互联网上可得到的和本说明书中提到的所有出版物、专利、专利申请和信息都通过引用并入本文，其引用的程度犹如每个个别出版物、专利、专利申请或信息项被具体地和单独地指出通过引用并入。如果通过引用并入的出版物、专利、专利申请和信息项与本说明书中包含的公开内容相矛盾，则本说明书旨在取代和/或优先于任何此类矛盾的材料。
在以范围描述值的情况下，应理解，该描述包括公开这样的范围内所有可能的子范围，以及落入这样的范围内的具体数值，而不管明确陈述的是具体数值还是具体子范围。
在提及项目集合而使用时，术语“各”旨在识别集合中的单个项目但不一定是指集合中的每个项目，除非另有明确说明，或除非使用的上下文另有明确指示。
单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代，上下文另有明确规定除外。例如，术语“细胞”包括一个或多个细胞，包括它们的混合物。“A和/或B”在本文中的使用包括所有以下替代方案：“A”、“B”、“A或B”以及“A和B”。
本文描述了本公开的特征的各种实施方案。然而，应理解，这样的实施方案仅作为实例提供，并且本领域技术人员可想到许多变化、改变和取代而不偏离本公开的范围。还应理解，本文描述的具体实施方案的各种替代方案也在本公开的范围内。
附图说明
以下附图示意了本公开的特征和优点的某些实施方案。这些实施方案不旨在以任何方式限制附随的权利要求书的范围。附图中相同的参考符号指示相同的元件。
图1为示出如本文所述加条形码的捕获探针的一个实例的示意图。
图2为示意可切割捕获探针的示意图，其中被切割的捕获探针可进入到非透化细胞中并与样品内的目标分析物结合。
图3为一种示例性的加有多路复用空间条形码的特征的示意图。
图4为示出阵列内加有条形码的特征的布置的示意图。
图5为示意防扩散介质例如盖的侧视图的示意图。
图6A和6B为示意配置为朝向加有空间条形码的捕获探针阵列引导转录分析物的电泳转移系统的放大视图图6A和侧视图图6B的示意图。
图7为示意利用电泳转移系统的示例性工作流程的示意图。
图8A示出了其中在透化后执行分析物的电泳迁移的示例分析工作流程的示意图。
图8B示出了其中同时执行分析物的电泳迁移和透化的示例分析工作流程的示意图。
图9A示出了用于在电泳期间使用的示例垂直单载片配置。
图9B示出了用于在电泳期间使用的示例平行单载片配置。
图9C示出了用于在电泳期间使用的示例多载片配置。
图10示出了在生物样品中生成脱氨核酸和鉴定生物样品中脱氨核酸的甲基化状态的示例分析工作流程的示意图。
图11A示出了在生物样品中生成脱氨核酸的示例分析工作流程的示意图
图11B示出了鉴定生物样品中脱氨核酸的甲基化状态的示例分析工作流程的示意图。
图12示出了描绘示例性双载片空间阵列实施方案的示意图。
图13示出了提供福尔马林固定小鼠脑样品中每个斑点的中值基因数和每个斑点的中值唯一分子标识符(UMI)计数的表格。
图14示出了视觉热图结果，其示出对照单载片和双载片空间设置实施方案中的Log10 UMI计数。
图15示出了对照和双载片空间阵列实施方案中的空间聚类分析图像。
图16示出了在生物样品中生成脱氨核酸的示例分析工作流程的示意图。
图17示出了在生物样品中生成脱氨核酸的示例分析工作流程的示意图。
图18A示出了在空间基因表达载片上生物样品中DNA分子的标签化和标签化DNA片段的捕获的示例分析工作流程的示意图。
图18B示出了使用来自图18A的所捕获的标签化DNA片段生成用于全基因组甲基化分析(例如，全基因组亚硫酸氢盐测序)的文库的示例分析工作流程的示意图。
图19A示出了本文公开的空间脱氨方法的示例性实施方案。
图19B示出了在扩增之后且捕获在阵列上之前的脱氨核酸产物。
图20和21示出了捕获在阵列上之后经测序DNA分子的代表性电泳图。
图22示出了所捕获且脱氨的目标分析物的测序结果，给出了腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)和胸腺嘧啶(T)的代表性百分比。
具体实施方式
申请人已确定科学界需要在空间上确定生物样品的甲基化状态。特别地，由于生物样品中不均匀的细胞分布，故生物样品中细胞间甲基化核苷酸(例如，甲基化DNA)的分布可能会有所不同。DNA的甲基化是一种重要的表观遗传修饰。每个DNA分子的甲基化状态是可变的并且不同细胞中的DNA甲基化状态是可变的。这使得DNA甲基化的分析具有挑战性并且繁琐。标准DNA测序技术(例如，边合成边测序或Sanger测序)中甲基化的胞嘧啶碱基与未甲基化的胞嘧啶碱基不可区分的事实使得这更加令人困惑。
DNA甲基化是一种生物过程，通过该过程，甲基基团被加到DNA分子，从而在不改变基础DNA序列的情况下改变基因活性。在哺乳动物中，表观遗传修饰如DNA甲基化主要发生在胞嘧啶/鸟嘌呤(CG)二核苷酸处。DNA甲基化通常见于启动子区域(称为CpG岛)中并且与转录抑制相关联。例如，基因可以在开放染色质和乙酰化组蛋白的存在下被激活(例如，“开启”)。在这种情况下，核苷酸通常保持未甲基化。然而，在甲基化核苷酸(例如，甲基化胞嘧啶)的存在下，染色体可被缩合，导致基因表达的去激活(例如，表达被“关闭”)。因此，当位于基因启动子中时，DNA甲基化通常作用于阻遏基因转录。两个DNA碱基，胞嘧啶和腺嘌呤，可被甲基化。胞嘧啶甲基化在真核生物和原核生物中均广泛存在。胞嘧啶的甲基化形成5-甲基胞嘧啶发生在嘧啶环上DNA碱基胸腺嘧啶的甲基基团所位于的同一5′位置处；该同一位置将胸腺嘧啶与不具有甲基基团的类似RNA碱基尿嘧啶区分开来。5-甲基胞嘧啶的自发脱氨将其转化为胸腺嘧啶。这导致T：G错配，该错配可通过测序技术鉴定。
近几十年来，DNA甲基化一直是深入研究的主题，包括它是如何发生的以及它在哪里发生，并且已经发现甲基化是许多细胞过程的重要组成部分，包括胚胎发育、基因组印记、X-染色体失活和染色体稳定性的保持。DNA甲基化被用作各种环境中的区分标志物，包括癌症、神经病学、一些遗传疾病、发育、细胞分化、模式生物理解和在治疗(例如，药物治疗)期间。
鉴于甲基化参与的许多过程，甲基化中的错误也与各种各样的破坏性后果有关，包括若干人类疾病。
为了研究DNA甲基化，许多研究人员依赖于使用脱氨试剂亚硫酸氢盐：一种可在将未甲基化的胞嘧啶转化为胸腺嘧啶而使甲基化的胞嘧啶完好无损的过程中使用的化学物质。然而，亚硫酸氢盐在将使DNA片段化的严苛条件下使用，并且常常与各种应用所需的酶和试剂不相容。本文是用于确定生物样品的甲基化状态的成本有效且高效的技术。本文公开的方法和组合物结合了空间分析、多基底和甲基化鉴定技术。
用于空间分析的方法和组合物
本文描述的空间分析方法和组合物可以高空间分辨率提供生物样品内各种各样的分析物的大量分析物和/或表达数据，同时保留天然空间背景。空间分析方法和组合物可包括例如使用包含空间条形码(例如，提供关于分析物在细胞或组织样品(例如，哺乳动物细胞或哺乳动物组织样品)内的地点或位置的信息的核酸序列)和能够与由细胞产生的和/或存在于细胞中的分析物(例如，蛋白质和/或核酸)结合的捕获结构域的捕获探针。空间分析方法和组合物也可包括使用具有捕获中间剂的捕获结构域的捕获探针以间接检测分析物。例如，中间剂可包括与中间剂相关联的核酸序列(例如，条形码)。中间剂的检测因此指示细胞或组织样品中的分析物。
空间分析方法和组合物的非限制性方面见述于以下中：美国专利号10,774,374、10,724,078、10,480,022、10,059,990、10,041,949、10,002,316、9,879,313、9,783,841、9,727,810、9,593,365、8,951,726、8,604,182、7,709,198；美国专利申请公开号2020/239946、2020/080136、2020/0277663、2020/024641、2019/330617、2019/264268、2020/256867、2020/224244、2019/194709、2019/161796、2019/085383、2019/055594、2018/216161、2018/051322、2018/0245142、2017/241911、2017/089811、2017/067096、2017/029875、2017/0016053、2016/108458、2015/000854、2013/171621；WO 2018/091676、WO2020/176788；Rodriques等人，Science 363(6434)：1463-1467，2019；Lee等人，Nat.Protoc.10(3)：442-458，2015；Trejo等人，PLoS ONE 14(2)：e0212031，2019；Chen等人，Science 348(6233)：aaa6090，2015；Gao等人，BMC Biol.15：50，2017；和Gupta等人，Nature Biotechnol.36：1197-1202，2018；Visium空间基因表达试剂盒用户指南(例如，RevC，日期为2020年6月)和/或Visium空间组织优化试剂盒用户指南(例如，Rev C，日期为2020年7月)，二者均在10x Genomics Support Documentation网站提供，并可以任何组合在本文中使用。本文描述了空间分析方法和组合物的其他非限制性方面。
可用于本公开中的一些通用术语可见于WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(I)(b)节中。通常，“条形码”为传达或能够传达信息(例如，关于样品、珠和/或捕获探针中的分析物的信息)的标签或标识符。条形码可以是分析物的一部分，也可以独立于分析物。条形码可附接到分析物。特定条形码相对于其他条形码可以是唯一的。出于本公开的目的，“分析物”可包括待分析的任何生物物质、结构、部分或组分。术语“目标”可类似地指目的分析物。
分析物可广义地分为两组之一：核酸分析物和非核酸分析物。非核酸分析物的实例包括但不限于脂质、碳水化合物、肽、蛋白质、糖蛋白(N-连接或O-连接)、脂蛋白、磷蛋白、蛋白质的特定磷酸化或乙酰化变体、蛋白质的酰胺化变体、蛋白质的羟基化变体、蛋白质的甲基化变体、蛋白质的泛素化变体、蛋白质的硫酸化变体、病毒蛋白(例如，病毒衣壳、病毒包膜、病毒外壳、病毒辅助蛋白、病毒糖蛋白、病毒刺突等)、胞外和胞内蛋白、抗体和抗原结合片段。在一些实施方案中，分析物可位于亚细胞位置，包括例如细胞器，例如线粒体、高尔基体、内质网、叶绿体、胞吞小泡、胞泌小泡、液泡、溶酶体等。在一些实施方案中，分析物可以是肽或蛋白质，包括但不限于抗体和酶。分析物的另外的实例可见于WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(I)(c)节中。在一些实施方案中，可以间接检测分析物，如通过检测中间剂，例如连接产物或分析物捕获剂(例如，寡核苷酸缀合抗体)，如本文描述的那些。
“生物样品”通常从受试者获得，以使用多种技术中的任何一种进行分析，所述多种技术包括但不限于活检、外科手术和激光捕获显微镜法(LCM)，并通常包括来自受试者的细胞和/或其他生物材料。在一些实施方案中，生物样品可以是组织切片。在一些实施方案中，生物样品可以是固定和/或染色的生物样品(例如，固定和/或染色的组织切片)。染色剂的非限制性实例包括组织学染色剂(例如，苏木精和/或曙红)和免疫学染色剂(例如，荧光染色剂)。在一些实施方案中，可对生物样品(例如，固定和/或染色的生物样品)成像。生物样品也见述于WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(I)(d)节中。
在一些实施方案中，生物样品用一种或多种透化试剂透化。例如，生物样品的透化可促进分析物捕获。示例性的透化剂和条件见述于WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(I)(d)(ii)(13)节或示例性实施方案部分中。
基于阵列的空间分析方法涉及将一种或多种分析物从生物样品转移至基底上的特征阵列，其中每个特征与阵列上的唯一空间位置相关联。转移的分析物的后续分析包括确定分析物的身份和分析物在生物样品内的空间位置。分析物在生物样品内的空间位置基于分析物在阵列上结合(例如，直接地或间接地)的特征以及该特征在阵列内的相对空间位置来确定。
“捕获探针”是指能够捕获(直接地或间接地)和/或标记生物样品中的分析物(例如，目的分析物)的任何分子。在一些实施方案中，捕获探针为核酸或多肽。在一些实施方案中，捕获探针包含条形码(例如，空间条形码和/或唯一分子标识符(UMI))和捕获结构域)。在一些实施方案中，捕获探针可包括切割结构域和/或功能结构域(例如，引物结合位点，如用于下一代测序(NGS))。参见例如WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(II)(b)节(例如，第(i)-(vi)小节)。捕获探针的生成可通过任何适宜的方法实现，包括WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(II)(d)(ii)节中描述的那些。
图1为示出如本文所述的一个示例性捕获探针的示意图。如图所示，捕获探针102任选地通过切割结构域103如二硫连接子与特征101联接。捕获探针可包括对后续加工有用的功能序列104。功能序列104可包括测序仪特异性流动池附接序列(例如，P5或P7序列)的全部或部分、测序引物序列的全部或部分(例如，R1引物结合位点、R2引物结合位点)或其组合。捕获探针还可包括空间条形码105。捕获探针还可包括唯一分子标识符(UMI)序列106。虽然图1将空间条形码105示出为位于UMI序列106的上游(5’)，但应理解，其中UMI序列106位于空间条形码105的上游(5’)的捕获探针也适合用于任何本文描述的方法中。捕获探针还可包括捕获结构域107以便于目标分析物的捕获。捕获结构域可具有与核酸分析物的序列互补的序列。捕获结构域可具有与本文描述的连接产物互补的序列。捕获结构域可具有与分析物捕获剂中存在的捕获手柄序列互补的序列。捕获结构域可具有与夹板寡核苷酸互补的序列。除了具有与捕获探针的捕获结构域互补的序列外，这样的夹板寡核苷酸还可具有与核酸分析物的序列、本文描述的连接产物的一部分、本文描述的捕获手柄序列和/或本文描述的甲基化衔接子互补的序列。
功能序列通常可选择为与多种不同的测序系统例如Ion Torrent Proton或PGM、Illumina测序仪器、PacBio、Oxford Nanopore等中的任一种及其要求相容。在一些实施方案中，功能序列可选择为与非商业化测序系统相容。可使用合适的功能序列的此类测序系统和技术的实例包括(但不限于)Ion Torrent Proton或PGM测序、Illumina测序、PacBioSMRT测序和Oxford Nanopore测序。此外，在一些实施方案中，功能序列可选择为与其他测序系统相容，包括非商业化测序系统。
在一些实施方案中，空间条形码105和功能序列104对于附接到给定特征的所有探针是共有的。在一些实施方案中，附接到给定特征的捕获探针的UMI序列106不同于附接到该给定特征的不同捕获探针的UMI序列。
图2为示意可切割捕获探针的示意图，其中被切割的捕获探针可进入到非透化细胞中并与样品内的分析物结合。捕获探针201含有切割结构域202、细胞穿透肽203、报道分子204和二硫键(-S-S-)。205表示捕获探针的所有其他部分，例如空间条形码和捕获结构域。可切割捕获探针在WO2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663中有进一步描述，其各自通过引用整体并入本文。
对于附接到共同的阵列特征的多个捕获探针，所述多个捕获探针的一个或多个空间条形码序列可包括对于联接至该特征的所有捕获探针均相同的序列，和/或在联接至该特征的所有捕获探针间不同的序列。
图3为一种示例性的加有多路复用空间条形码的特征的示意图。在图3中，特征301可与多个加有空间条形码的捕获探针联接，其中特定特征的所述多个加有空间条形码的探针可具有相同的空间条形码，但具有设计为将该特征的空间条形码与多于一种目标分析物相关联的不同捕获结构域。例如，一个特征可与四种不同类型的加有空间条形码的捕获探针联接，每种类型的加有空间条形码的捕获探针都具有空间条形码302。与该特征相关联的一种类型的捕获探针包括空间条形码302与设计为捕获mRNA目标分析物的poly(T)捕获结构域303的组合。与该特征相关联的第二类型的捕获探针包括空间条形码302与用于gDNA分析的随机N-聚体捕获结构域304的组合。与该特征相关联的第三类型的捕获探针包括空间条形码302与和目的分析物捕获剂的捕获手柄序列互补的捕获结构域305的组合。与该特征相关联的第四类型的捕获探针包括空间条形码302与可与核酸分子特异性结合的捕获结构域306的组合，该捕获结构域可在CRISPR测定(例如，CRISPR/Cas9)中起作用。虽然图3中仅示出了四种不同的加有条形码的捕获探针构建体，但可定制加有条形码的捕获探针构建体来分析与核酸相关联并且能够与这样的构建体结合的任何给定分析物。例如，图3中示出的方案还可用于本文公开的其他分析物的并行分析，包括但不限于：(a)mRNA、谱系跟踪构建体、细胞表面或细胞内蛋白和代谢物、以及gDNA；(b)mRNA、可及的染色质(例如，ATAC-seq、DNase-seq和/或MNase-seq)细胞表面或细胞内蛋白和代谢物以及扰动剂(例如，如本文所述的CRISPR crRNA/sgRNA、TALEN、锌指核酸酶和/或反义寡核苷酸)；(c)mRNA、细胞表面或细胞内蛋白和/或代谢物、加有条形码的标记剂(例如，本文描述的MHC多聚体)和免疫细胞受体(例如，T-细胞受体)的V(D)J序列。在一些实施方案中，扰动剂可以是小分子、抗体、药物、适体、miRNA、物理环境(例如，温度变化)或任何其他已知的扰动剂。参见例如WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(II)(b)节(例如，第(i)-(vi)小节)。捕获探针的生成可通过任何适宜的方法实现，包括WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(II)(d)(ii)节中描述的那些。
附接到单个阵列特征的多个捕获探针可包括相同(或共有的)空间条形码序列、不同的空间条形码序列或两者的组合。附接到一个特征的多个捕获探针可包括多组捕获探针。给定组的捕获探针可包括相同的空间条形码序列。该相同的空间条形码序列可与另一组捕获探针的空间条形码序列不同。
所述多个捕获探针可包括与空间阵列上的特定位置相关联的空间条形码序列(例如，核酸条形码序列)。例如，第一多个捕获探针可基于第一区域内的捕获探针共有的空间条形码序列与第一区域相关联，第二多个捕获探针可基于第二区域内的捕获探针共有的空间条形码序列与第二区域相关联。第二区域可以与第一区域相关联或可以不与第一区域相关联。另外多个捕获探针可与其他区域内的捕获探针共有的空间条形码序列相关联。在一些实施方案中，空间条形码序列可在多个捕获探针分子间是相同的。
在一些实施方案中，多个不同的空间条形码被并入到单个阵列化捕获探针中。例如，一组混合但已知的空间条形码序列可通过提供位置身份的重复或独立确认来提供更强的地址或空间条形码向给定地点或位置的归属。在一些实施方案中，所述多个空间条形码代表特定阵列点的位置更多的特异性。
在一些实施方案中，可使用任何适宜的多路复用技术，如WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(IV)节中描述的那些，来检测(例如，同时地或顺序地)来自生物样品的多于一种分析物类型(例如，核酸和蛋白质)。
在一些实施方案中，可使用一种或多种分析物捕获剂来执行一种或多种分析物(例如，蛋白质分析物)的检测。如本文所用，“分析物捕获剂”是指与分析物(例如，生物样品中的分析物)和捕获探针(例如，附接到基底或特征的捕获探针)相互作用以鉴定分析物的试剂。在一些实施方案中，分析物捕获剂包括：(i)分析物结合部分(例如，与分析物结合的部分)，例如抗体或其抗原结合片段；(ii)分析物结合部分条形码；和(iii)分析物捕获序列或捕获手柄序列。如本文所用，术语“分析物结合部分条形码”是指与分析物结合部分相关联或以其他方式识别分析物结合部分的条形码。如本文所用，术语“分析物捕获序列”或“捕获手柄序列”是指配置为与捕获探针的捕获结构域杂交、结合、联接或以其他方式相互作用的区域或部分。在一些实施方案中，捕获手柄序列与捕获探针的捕获结构域互补。在一些情况下，分析物结合部分条形码(或其一部分)可能够从分析物捕获剂去除(例如，切割)。分析物捕获剂的另外的描述可见于WO 2020/176788的第(II)(b)(ix)节和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(II)(b)(viii)节中。
存在至少两种将空间条形码与一个或多个相邻细胞相关联的方法，使得空间条形码识别所述一个或多个细胞和/或所述一个或多个细胞的内容物，如与特定的空间位置相关联的。一种方法是促进分析物或分析物代替物(例如，中间剂)从细胞中出来并朝向加有空间条形码的阵列(例如，包括加有空间条形码的捕获探针)。另一种方法是从阵列切割加有空间条形码的捕获探针并促进加有空间条形码的捕获探针朝向和/或进入到生物样品中或到生物样品上。
在一些情况下，捕获探针可以配置为引发、复制和因此从模板(例如，DNA模板，如分析物或中间剂(例如，连接产物或分析物捕获剂)或其一部分)产生任选地加有条形码的延伸产物或其衍生物(参见例如WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(II)(b)(vii)节关于延伸的捕获探针)。在一些情况下，捕获探针可配置为与模板(例如，DNA模板，如分析物或中间剂，或其一部分)形成连接产物，从而产生充当模板的代替物的连接产物。
如本文所用，“延伸的捕获探针”是指具有添加到捕获探针的末端(例如，3’或5’末端)从而延长捕获探针的总长度的另外的核苷酸的捕获探针。例如，“延伸的3’末端”指示向捕获探针的最3’核苷酸添加另外的核苷酸以例如通过用于延伸核酸分子的聚合反应延伸捕获探针的长度，所述聚合反应包括由聚合酶(例如，DNA聚合酶或逆转录酶)催化的模板化聚合。在一些实施方案中，延伸捕获探针包括向捕获探针的3’末端添加与和捕获探针的捕获结构域特异性结合的分析物或中间剂的核酸序列互补的核酸序列。在一些实施方案中，使用逆转录延伸捕获探针。在一些实施方案中，使用一种或多种DNA聚合酶延伸捕获探针。延伸的捕获探针包括捕获探针的序列和捕获探针的空间条形码的序列。
在一些实施方案中，延伸的捕获探针被扩增(例如，在本体溶液中或在阵列上)以产生足以供下游分析(例如，经由DNA测序)的量。在一些实施方案中，延伸的捕获探针(例如，DNA分子)充当扩增反应(例如，聚合酶链反应)的模板。
WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(II)(a)节中描述了空间分析方法的其他变体，在一些实施方案中包括成像步骤。WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(II)(g)节中描述了所捕获的分析物(和/或中间剂或其部分)的分析，例如包括样品去除、捕获探针的延伸、测序(例如，被切割的延伸的捕获探针和/或与延伸的捕获探针互补的cDNA分子的测序)、阵列上的测序(例如，使用例如原位杂交或原位连接方法)、时序分析和/或邻近捕获。WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(II)(h)节中描述了一些质量控制措施。
空间信息可提供具有生物学和/或医学重要性的信息。例如，本文描述的方法和组合物可允许：鉴定疾病或病症的一种或多种生物标志物(例如，诊断生物标志物、预后生物标志物和/或用于确定治疗功效的生物标志物)；鉴定用于治疗疾病或病症的候选药物靶标；鉴定(例如，诊断)受试者患有某疾病或病症；鉴定受试者的疾病或病症的阶段和/或预后；鉴定受试者具有增加的发生某疾病或病症的可能性；监测受试者的疾病或病症的进展；确定受试者的疾病或病症的治疗功效；鉴定治疗对于疾病或病症有效的患者亚群；改进患有某疾病或病症的受试者的治疗；选择参与临床试验的受试者；和/或选择针对患有某疾病或病症的受试者的治疗。
空间信息可提供具有生物学重要性的信息。例如，本文描述的方法和组合物可允许：鉴定转录组和/或蛋白质组表达谱(例如，在健康和/或患病组织中)；鉴定紧邻的多种分析物类型(例如，最近邻分析)；确定患病组织中的上调和/或下调基因和/或蛋白质；表征肿瘤微环境；表征肿瘤免疫反应；表征细胞类型及其在组织中的共定位；和鉴定组织内的遗传变体(例如，基于与特定疾病或病症生物标志物相关联的基因和/或蛋白质表达谱)。
通常，对于基于空间阵列的方法，基底起到捕获探针与阵列的特征的直接或间接附接的支撑物的作用。“特征”为充当空间分析中使用的各种分子实体的支撑物或储库的实体。在一些实施方案中，阵列中的一些或全部特征被功能化以便分析物捕获。WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(II)(c)节中描述了示例性的基底。阵列的示例性特征和几何属性可见于WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(II)(d)(i)、(II)(d)(iii)和(II)(d)(iv)节中。
图4描绘了阵列内加有条形码的特征的示例性布置。从左到右，图4示出了(L)包括六个加有空间条形码的阵列的载片，(C)六个加有空间条形码的阵列中的一个的放大示意图，与生物样品相关地示出了加有条形码的特征的网格，(R)阵列的一个区段的放大示意图，示出了阵列内多个特征的具体身份标识(标记为ID578、ID579、ID560等)。
通常，当使生物样品与包括捕获探针的基底(例如，捕获探针嵌入、点状分布、印刷、制造在基底上的基底，或具有包括捕获探针的特征(例如，珠、孔)的基底)接触时，分析物和/或中间剂(或其部分)可被捕获。如本文所用，生物样品与基底“接触(contact/contacted/contacting)”是指任何接触(例如，直接或间接)使得捕获探针可与来自生物样品的分析物相互作用(例如，共价结合或非共价结合(例如，杂交))。捕获可主动地(例如，使用电泳)或被动地(例如，使用扩散)实现。WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(II)(e)节中进一步描述了分析物捕获。
图5为防扩散介质的示例性使用的图示。防扩散介质/盖502可与样品503接触。在图5中，玻璃载片504填充有加有空间条形码的捕获探针506，并且样品503、505与阵列504、506接触。可向样品503施加防扩散介质/盖502，其中样品503设置在防扩散介质502与涂覆了捕获探针的载片504之间。当向样品施加透化溶液501时，防扩散介质/盖502通过减少分析物扩散出到介质中来引导分析物505朝向近端捕获探针506迁移。或者，防扩散介质/盖可含有透化试剂。
在一些情况下，可通过将具有条形码(例如，空间条形码)的分子(例如，肽、脂质或核酸分子)附接和/或引入到生物样品(例如，到生物样品中的细胞)来执行空间分析。在一些实施方案中，将具有多个条形码(例如，多个空间条形码)的多个分子(例如，多个核酸分子)引入到生物样品(例如，到生物样品中的多个细胞)以用于空间分析。在一些实施方案中，在将具有条形码的分子附接和/或引入到生物样品之后，可将生物样品物理地分离(例如，解离)成单个细胞或细胞组以供分析。WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(III)节中描述了一些这样的空间分析方法。
在一些情况下，可通过检测与分析物杂交的多个寡核苷酸来执行空间分析。在一些情况下，例如，可使用RNA模板化连接(RTL)执行空间分析。先前已经描述了RTL的方法。参见例如Credle等人，Nucleic Acids Res.2017Aug 21；45(14)：e128。通常，RTL包括两个寡核苷酸与分析物(例如，RNA分子，如mRNA分子)上的相邻序列的杂交。在一些情况下，寡核苷酸为DNA分子。在一些情况下，寡核苷酸中的一个在3’末端处包括至少两个核糖核酸碱基和/或另一个寡核苷酸在5’末端处包括磷酸化核苷酸。在一些情况下，两个寡核苷酸中的一个包括捕获结构域(例如，poly(A)序列、非均聚序列)。在与分析物杂交之后，连接酶(例如，SplintR连接酶)将两个寡核苷酸连接在一起，产生连接产物。在一些情况下，两个寡核苷酸与彼此不相邻的序列杂交。例如，两个寡核苷酸的杂交在杂交的寡核苷酸之间产生间隙。在一些情况下，聚合酶(例如，DNA聚合酶)可在连接之前延伸寡核苷酸中的一个。连接后，从分析物释放连接产物。在一些情况下，使用核酸内切酶(例如，RNAse H)释放连接产物。然后，释放的连接产物可被阵列上的捕获探针捕获(例如，而不是直接捕获分析物)，任选地扩增和测序，从而确定生物样品中分析物的位置和任选地丰度。
在空间信息的分析过程中，获得与分析物相关联的空间条形码的序列信息，并且该序列信息可用于提供关于生物样品中分析物的空间分布的信息。可使用各种方法来获得空间信息。在一些实施方案中，特定的捕获探针和它们捕获的分析物与基底上特征的阵列中的特定位置相关联。例如，特定的空间条形码可在阵列制造之前与特定的阵列位置相关联，并且空间条形码的序列可与特定的阵列位置信息一起存储(例如，存储在数据库中)，以便每个空间条形码唯一地映射到一个特定的阵列位置。
或者，特定的空间条形码可在制造期间沉积在特征阵列中的预定位置处，使得在每个位置处仅存在一种类型的空间条形码，以便空间条形码唯一地与阵列的单个特征相关联。必要时，可使用任何本文描述的方法对阵列解码，使得空间条形码唯一地与阵列特征位置相关联，并且可如上所述存储此映射。
当在空间信息的分析期间获得关于捕获探针和/或分析物的序列信息时，可通过参考唯一地关联每个空间条形码与阵列特征位置的存储信息来确定捕获探针和/或分析物的位置。这样，特定的捕获探针和所捕获的分析物与特征的阵列中的特定位置相关联。每个阵列特征位置代表相对于阵列的坐标参考点(例如，阵列位置、基准标记)的位置。因此，每个特征位置在阵列的坐标空间中具有“地址”或位置。
WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的示例性实施方案部分中描述了一些示例性的空间分析工作流程。参见例如WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663中以“在本文描述的工作流程的一些非限制性实例中，可将样品浸入......”开头的示例性实施方案。另外参见例如Visium空间基因表达试剂盒用户指南(例如，Rev C，日期为2020年6月)和/或Visium空间组织优化试剂盒用户指南(例如，Rev C，日期为2020年7月)。
在一些实施方案中，可使用专用硬件和/或软件来执行空间分析，如WO 2020/176788和/或美国专利申请公开号2020/0277663的第(II)(e)(ii)和/或(V)节中描述的任何系统，或者WO 2020/123320的“用于成像的对照载片，使用对照载片和基底进行成像的方法，使用对照载片和基底进行成像的系统，和/或样品和阵列对准装置及方法，信息标签”部分中描述的装置或方法中的任何一种或多种。
用于执行空间分析的合适系统可包括部件如用于容纳生物样品的腔室(例如，流动池或可密封的、不透流体的腔室)。生物样品可例如安装在生物样品保持器中。一个或多个流体腔室可经由流体导管连接到腔室和/或样品保持器，并且流体可经由流体泵、真空源或联接至流体导管的其他装置递送到腔室和/或样品保持器中，所述其他装置产生压力梯度以驱动流体流。还可将一个或多个阀连接到流体导管以调节试剂从储存器向腔室和/或样品保持器的流动。
系统可任选地包括控制单元(其包括一个或多个电子处理器)、输入接口、输出接口(如显示器)和存储单元(例如，固态存储介质，如但不限于磁性、光学或其他固态、持久性、可写入和/或可重写存储介质)。控制单元可任选地经由网络连接到一个或多个远程装置。控制单元(及其部件)通常可执行任何本文描述的步骤和功能。在系统连接到远程装置的情况下，远程装置(或多个远程装置)可执行任何本文描述的步骤或特征。系统可任选地包括用于捕获图像的一个或多个检测器(例如，CCD、CMOS)。系统还可任选地包括用于照射样品的一个或多个光源(例如，基于LED的、基于二极管的、激光器)、具有特征的基底、捕获在基底上的来自生物样品的分析物以及各种控制和校准介质。
系统可任选地包括编码在一个或多个有形存储介质和硬件部件如专用集成电路中和/或在其中实现的软件指令。当由控制单元(特别地，电子处理器)或集成电路执行时，软件指令可使控制单元、集成电路或执行软件指令的其他部件执行任何本文描述的方法步骤或功能。
在一些情况下，本文描述的系统可检测(例如，配准图像)阵列上的生物样品。PCT申请号2020/061064和/或美国专利申请序列号16/951,854中描述了检测阵列上的生物样品的示例性方法。
在将分析物从生物样品转移到基底上的特征阵列之前，可将生物样品与阵列对准。生物样品与包括捕获探针的特征的阵列的对准可便于空间分析，所述空间分析可用于检测生物样品中不同位置内分析物的存在和/或水平的差异，例如以生成分析物的存在和/或水平的三维地图。PCT申请号2020/053655中描述了生成分析物的存在和/或水平的二维和/或三维地图的示例性方法，WO 2020/061108和/或美国专利申请序列号16/951,864中大体描述了空间分析方法。
在一些情况下，可使用一个或多个基准标记将分析物的存在和/或水平的地图与生物样品的图像对准，例如，放置在成像系统的视场中的物体，其出现在所产生的图像中，如WO 2020/123320、PCT申请号2020/061066和/或美国专利申请序列号16/951,843的“基底属性”部分、“用于成像的对照载片”部分中所述。基准标记可用作对准的参考点或测量标尺(例如，对准样品与阵列，对准两个基底，确定基底上样品或阵列相对于基准标记的位置)和/或用于尺寸和/或距离的定量测量。
核酸中甲基化状态的测定
本文公开了用于确定生物样品的甲基化状态的方法和组合物。可使用本领域已知的方法(例如，核酸的脱氨)来确定甲基化状态。本文公开的方法将甲基化状态与空间分析相结合来确定甲基化核酸(例如，DNA分子)在样品中的空间位置处的位置。此外，本文公开的方法允许放置在标准组织学基底例如标准载片上的生物样品的甲基化状态的空间分析。
在本文公开的示例性方法中，在第一基底上提供生物样品，第一基底可以是任何载片(例如，玻璃载片)，并且可在玻璃载片上原位执行脱氨步骤。探针(例如，第一探针、第二探针或甲基化衔接子)与生物样品的核酸相互作用。生物样品被透化并且含有探针的核酸迁移至第二基底，所述第二基底包括具有多个捕获探针的阵列。可确定含有探针的核酸的序列和位置，并且基于该序列，可确定特定位置处的甲基化状态。
鉴定生物样品中分析物的甲基化状态的方法
本文提供了用于鉴定生物样品中分析物的甲基化状态的方法。如本文所用，“甲基化状态”是指鉴定分析物中一个或多个甲基基团的存在或不存在。在一些情况下，所述一个或多个甲基基团在一个或多个胞嘧啶上。在一些情况下，本公开的特征在于一种用于鉴定生物样品中分析物的甲基化状态的方法，所述方法包括：(a)使生物样品与包括多个捕获探针的阵列接触，其中所述多个捕获探针中的捕获探针包含(i)空间条形码和(ii)包含至少一个甲基化胞嘧啶的捕获结构域；(b)使分析物脱氨；(c)使分析物与包括第一探针和第二探针的多个探针接触，其中所述第一探针包含(i)与分析物的至少第一序列互补的序列和(ii)与捕获结构域互补的序列；并且所述第二探针包含与分析物的至少第二序列互补的序列；(d)连接所述第一探针和所述第二探针，从而生成连接产物；(e)将所述连接产物与所述捕获探针杂交；(f)使用所述连接产物作为模板延伸所述捕获探针；从而生成延伸的捕获探针；(g)扩增所述延伸的捕获探针以产生多个核酸；和(h)测定(i)空间条形码的全部或部分序列或其补体，和(ii)分析物的全部或部分序列或其补体，并且使用(i)和(ii)的测定序列来鉴定生物样品中分析物的甲基化状态。
在另一个特征中，本文公开了一种方法，其包括：(a)使生物样品与阵列接触，其中所述阵列包括多个捕获探针，其中所述多个捕获探针的捕获探针包含：(i)空间条形码和(ii)捕获结构域；(b)使分析物脱氨；(c)使分析物与多个探针接触，其中所述多个探针中的探针包含(i)与分析物的至少一部分特异性结合的结合部分和(ii)突出序列(overhangsequence)；(d)使用分析物作为模板延伸探针，从而生成延伸的探针；(e)将延伸的探针与捕获探针杂交；(d)使用延伸的探针作为模板延伸捕获探针，从而生成延伸的捕获探针；(g)扩增所述延伸的捕获探针以产生多个核酸；和(h)测定(i)空间条形码的全部或部分序列或其补体，和(ii)分析物的全部或部分序列或其补体，并且使用(i)和(ii)的测定序列来鉴定生物样品中分析物的甲基化状态。
本文还提供了用于鉴定生物样品中分析物的甲基化状态的方法，所述方法包括：(a)使生物样品与阵列接触，其中所述阵列包括多个捕获探针，其中所述多个捕获探针中的捕获探针包含(i)空间条形码和(ii)捕获结构域；其中所述捕获结构域包含至少一个甲基化的胞嘧啶；(b)使分析物脱氨；(c)使分析物与多个探针接触，所述多个探针包括第一探针和第二探针，其中所述第一探针包含(i)与分析物的至少一部分特异性结合的第一结合部分和(ii)第一突出序列；所述第二探针包含(i)与分析物的至少一部分特异性结合的第二结合部分，所述分析物部分邻近与第一结合部分结合的分析物部分，和(ii)第二突出序列；和(d)使用分析物作为模板来延伸所述第一探针；(e)连接所述第一探针和所述第二探针，从而生成延伸的探针；(f)将所述延伸的探针与所述捕获探针杂交；(g)使用所述延伸的探针作为模板延伸所述捕获探针；从而生成延伸的捕获探针；(h)扩增所述延伸的捕获探针以产生多个核酸；和(i)测定(i)空间条形码的全部或部分序列或其补体，和(ii)分析物的全部或部分序列或其补体，并且使用(i)和(ii)的测定序列来鉴定生物样品中分析物的甲基化状态。在一些实施方案中，连接包括酶促连接或化学连接。在一些实施方案中，酶促连接利用连接酶。
本文还提供了鉴定生物样品中分析物例如核酸的甲基化状态的方法。如本文所用，“甲基化状态”是指鉴定分析物中(例如，胞嘧啶上)一个或多个甲基基团的存在或不存在。在一些情况下，甲基化状态可以是核酸中甲基化胞嘧啶或非甲基化胞嘧啶的绝对数目。在一些情况下，甲基化状态可以是核酸中甲基化或非甲基化的胞嘧啶的百分比。
在一些情况下，本公开的特征在于一种用于鉴定生物样品中核酸的甲基化状态的方法。在一些情况下，将生物样品放置在不包括捕获探针的基底上。这样，脱氨的所有步骤都在该基底上进行。本文提供的方法允许脱氨步骤与分析物例如核酸的空间分析分开。在一个示例性实施方案中，将生物样品放置在常规载片上，例如不具有捕获探针的玻璃载片上。因为脱氨与空间阵列上分子的捕获是分开的，所以空间阵列的捕获探针不受脱氨试剂的影响。
在一些示例性方法中，本文提供了在第一基底上鉴定生物样品中核酸的甲基化状态的方法。在一些情况下，所述方法包括(a)使核酸脱氨；(b)将第一探针和第二探针与核酸杂交，其中：第一探针包含(i)与核酸的至少第一序列互补的序列和(ii)与阵列上的捕获探针的捕获结构域互补的序列；并且第二探针包含与核酸的至少第二序列互补的序列；(c)连接第一探针和第二探针以生成连接产物；(d)将第一基底与包含阵列的第二基底对准，使得生物样品的至少一部分与阵列的至少一部分对准，其中所述阵列包括多个捕获探针，其中所述多个捕获探针的捕获探针包含：(i)空间条形码和(ii)捕获结构域；(e)当生物样品与阵列的至少一部分对准时，(i)从分析物释放连接产物和(ii)将连接产物从生物样品迁移至阵列；以及(f)用捕获结构域捕获连接产物。
在其他示例性方法中，本文提供了在第一基底上鉴定生物样品中核酸的甲基化状态的方法。在一些情况下，所述方法包括(a)将甲基化衔接子连接至核酸，生成衔接的(例如，标签化的)核酸片段；(b)使衔接的(例如，标签化的)核酸片段脱氨；(c)将第一基底与包含阵列的第二基底对准，使得生物样品的至少一部分与阵列的至少一部分对准，其中所述阵列包括多个捕获探针，其中所述多个捕获探针的捕获探针包含：(i)空间条形码和(ii)捕获结构域；(d)当生物样品与阵列的至少一部分对准时，将衔接的(例如，标签化的)核酸片段从生物样品迁移至阵列；以及(e)用捕获结构域捕获衔接的(例如，标签化的)核酸片段。
生物样品的制备
生物样品和分析物
如本文所用，生物样品可以是本文描述的或本领域已知的任何合适的生物样品。在一些实施方案中，生物样品为组织。在一些实施方案中，生物样品为组织切片。在一些实施方案中，组织被快速冷冻并切片。可使用本文描述的或本领域已知的任何合适的方法来快速冷冻组织样品和对组织样品切片。在一些实施方案中，生物样品，例如组织，在切片之前使用液氮快速冷冻。在一些实施方案中，使用冷冻切片来执行切片。在一些实施方案中，所述方法还在冷冻切片之后包括解冻步骤。在一些实施方案中，生物样品，例如组织样品，被固定在例如甲醇、丙酮、PFA中，或者是福尔马林固定和石蜡包埋的(FFPE)。
生物样品，例如组织样品，可在本文描述的方法的每个步骤之前、期间和/或之后染色并成像。可使用本文描述的或本领域已知的任何方法来对生物样品染色和/或成像。在一些实施方案中，成像在对样品脱氨之前进行。在一些实施方案中，使用H&E染色方法对生物样品染色。在一些实施方案中，对组织样品染色并成像约10分钟至约2小时(或本文描述的该范围的任何子范围)。不同类型的生物样品的染色和成像可能需要额外的时间。
组织样品可从受试者例如人类受试者的组织或器官中任何合适的位置获得。在一些实施方案中，组织样品从与参考位置相比DNA差异甲基化的位置获得。DNA差异甲基化的位置可以是例如患病细胞、组织或器官，感染的细胞、组织或器官，受损的细胞、组织或器官，癌细胞、组织或器官(例如，肿瘤细胞、组织或器官)，或者分化细胞、组织或器官(例如，干细胞或者包含一种或多种干细胞的组织或器官)。在一些实施方案中，其中DNA差异甲基化的位置为已被施用一种或多种药物例如治疗性药物的细胞、组织或器官。包括差异甲基化的DNA的其他位置是本领域已知的。
在一些实施方案中，生物样品为肿瘤细胞、组织或器官。本文描述的方法中的任何一种中提及的癌症的非限制性实例包括：肉瘤、癌、肾上腺皮质癌、与AIDS相关的癌症、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型畸胎瘤样/横纹肌样瘤、基底细胞癌、膀胱癌、脑干胶质瘤、脑肿瘤(包括脑干胶质瘤、中枢神经系统非典型畸胎瘤样/横纹肌样瘤、中枢神经系统胚胎肿瘤、星形细胞瘤、颅咽管瘤、成室管膜细胞瘤、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、髓上皮瘤、中分化松果体实质肿瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、成松果体细胞瘤)、乳腺癌、支气管肿瘤、原发部位不明癌症、类癌瘤、原发部位不明癌、中枢神经系统非典型畸胎瘤样/横纹肌样瘤、中枢神经系统胚胎肿瘤、子宫颈癌、儿童癌症、脊索瘤、结肠癌、结肠直肠癌、颅咽管瘤、内分泌胰岛细胞瘤、子宫内膜癌、成室管膜细胞瘤、室管膜瘤、食管癌、成感觉神经细胞瘤、尤因氏肉瘤、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞瘤、肝外胆管癌、胆囊癌、胃(gastric/stomach)癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质细胞瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、妊娠滋养细胞肿瘤、神经胶质瘤、头颈癌、心脏癌、下咽癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞瘤、卡波西肉瘤、肾癌，朗格汉斯细胞组织细胞增生症、喉癌、唇癌、肝癌、肺癌、恶性纤维组织细胞瘤、骨癌、成神经管细胞瘤、髓上皮瘤、黑色素瘤、Merkel细胞癌、Merkel细胞皮肤癌、间皮瘤、具有隐匿性原发性的转移性鳞状颈部癌、口腔癌(mouth cancer)、多发性内分泌肿瘤综合征、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤、蕈样肉芽肿、骨髓增生异常综合征、骨髓增生性肿瘤、鼻腔癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非黑色素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、口腔癌(oral cancer/oral cavity cancer)、口咽癌、骨肉瘤、其他脑和脊髓肿瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞瘤、卵巢低恶性潜在肿瘤、胰腺癌、乳头状瘤病、鼻旁窦癌、甲状旁腺癌、盆腔癌、阴茎癌、咽癌、中分化松果体实质肿瘤、成松果体细胞瘤、垂体瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性肝细胞肝癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、肾细胞(肾脏)癌、肾细胞癌、呼吸道癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、Sezary综合征、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、鳞状颈癌、胃(stomach/gastric)癌、幕上原始神经外胚层肿瘤、睾丸癌、咽喉癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺癌、移行细胞癌、肾盂和输尿管的移行细胞癌、滋养细胞肿瘤、输尿管癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、华氏巨球蛋白血症和肾母细胞瘤。
在一些实施方案中，生物样品为癌症样品。在一些实施方案中，可使用表观遗传学疗法(例如，低甲基化剂)治疗癌症。
在一些实施方案中，癌症为非小细胞肺癌(NSCLC)、微卫星稳定型结肠直肠癌(CRC)、头颈癌、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、黑色素瘤、急性骨髓性白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、胰腺导管腺癌(PDAC)、卵巢癌、原发性腹膜或输卵管癌、外周T-细胞淋巴瘤(PTCL)、卵巢癌II型或雌激素受体阳性和HER2-阴性乳腺癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、中枢神经系统(CNS)实体瘤、肺癌、肾癌、肝细胞癌、胰腺腺癌、胆管癌或慢性粒单核细胞白血病(CMML)。
关键标志物的甲基化被用于癌症诊断。这些关键标志物在例如以下文献中有述：Locke WJ等人，DNA Methylation Cancer Biomarkers：Translation to theClinic.Front.Genet.10：1150，2019；Nassiri，F.等人，Detection and discriminationof intracranial tumors using plasma cell-free DNA methylomes.Nat Med 26，1044-1047，2020；和Nuzzo，P.V.等人，Detection of renal cell carcinoma using plasma andurine cell-free DNA methylomes.Nat Med 26，1041-1043(2020)，其全部内容通过引用并入本文。
合适的药剂如低甲基化剂可用作治疗癌症的表观遗传学疗法。5-氮胞苷(5-Aza)5-氮杂-2’-脱氧胞苷(地西他滨)和SGI-110(瓜地西他滨(guadecitabine))是核苷胞苷的类似物，其将DNMT蛋白不可逆地螯合(sequester)到DNA，从而导致全局DNA低甲基化。
在一些实施方案中，癌症样品来自经用癌症疗法治疗的受试者。在一些实施方案中，癌症疗法为用核苷胞苷类似物的疗法。在一些实施方案中，癌症疗法为用5-氮胞苷(5-Aza)5-氮杂-2’-脱氧胞苷(地西他滨)或SGI-110(瓜地西他滨)的疗法。
分析物可以是本文描述的任何合适的分析物。在一些实施方案中，分析物为核酸。在一些实施方案中，分析物为DNA。在一些实施方案中，分析物为基因组DNA。在一些实施方案中，分析物为非基因组DNA。在一些实施方案中，DNA在基因的编码区域内。在一些实施方案中，DNA在基因的启动子区域内。在一些实施方案中，DNA在基因的编码区域外。在一些实施方案中，DNA跨越基因的编码区域和非编码区域。在一些实施方案中，DNA跨越多于一个基因的编码区域和/或非编码区域。
在一些实施方案中，DNA为甲基化的DNA，例如包含一个或多个甲基化的胞嘧啶的DNA。在一些实施方案中，DNA为未甲基化的DNA，例如不包含任何甲基化的胞嘧啶的DNA。在一些实施方案中，DNA为与参考位置相比在一个位置中差异甲基化的DNA。
分析物例如DNA的大小可以是生物样品中核酸分子的任何合适大小。在一些实施方案中，靶核酸的大小为约50个核苷酸至约100,000个核苷酸(例如，约50个核苷酸至约200个核苷酸、约200个核苷酸至约500个核苷酸、约500个核苷酸至约1,000个核苷酸、约1,000个核苷酸至约2,000个核苷酸、约2,000个核苷酸至约4,000个核苷酸、约4,000个核苷酸至约6,000个核苷酸、约6,000个核苷酸至约8,000个核苷酸、约8,000个核苷酸至约10,000个核苷酸、约10,000个核苷酸至约20,000个核苷酸、约20,000个核苷酸至约30,000个核苷酸、约30,000个核苷酸至约40,000个核苷酸、约40,000个核苷酸至约50,000个核苷酸、约50,000个核苷酸至约60,000个核苷酸、约60,000个核苷酸至约70,000个核苷酸、约70,000个核苷酸至约80,000个核苷酸、约80,000个核苷酸至约90,000个核苷酸、或约90,000个核苷酸至约100,000个核苷酸)。
在一些实施方案中，DNA包括肿瘤生物标志物基因的至少一部分。在一些实施方案中，肿瘤生物标志物为肿瘤抗原。示例性的肿瘤抗原包括但不限于黑色素瘤相关抗原(MAGE)系列抗原(例如，MAGE-C1(癌症/睾丸抗原CT7)、MAGE-B1抗原(MAGE-XP抗原、DAM10)、MAGE-B2抗原(DAM6)、MAGE-2抗原、MAGE-4a抗原和MAGE-4b抗原)、酪氨酸酶、糖蛋白100(gp100)、双唾液酸神经节苷脂GD-2、双唾液酸神经节苷脂O-乙酰化GD-3、神经节苷脂GM-2、表皮生长因子受体(EGFR)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、与黑色素瘤和结肠癌相关的突变B-Raf抗原、人表皮生长因子受体-2(HER-2/neu)抗原、由T细胞识别的黑色素瘤相关抗原(MART-1)(例如，MART-1 26-35肽或MART-1 27-35肽)、蛋白激酶C结合蛋白、逆转录酶蛋白、A激酶锚定蛋白(AKAP蛋白)、牛痘相关激酶丝氨酸/苏氨酸激酶1(VRK1)、岩藻糖基转移酶(T6-7)、锌指蛋白258(T11-6)、p53结合蛋白(T1-52)、T5-15(KIAA1735)、T5-13(Sos1)、T11-5(假设蛋白MGC4170)、T11-9(假设蛋白AF225417)、T11-3(陷阱锚蛋白重复序列)、T7-1(KIAA1288)、突变体或野生型RAS肽、Homo现代人端粒酶发酵产物(hTRT)、细胞角蛋白-19(CYFRA21-1)、鳞状细胞癌抗原1(SCCA-1)、蛋白T4-A、鳞状细胞癌抗原2(SCCA-2)、卵巢癌抗原CA125(1A1-3B)(KIAA0049)、细胞表面相关粘蛋白1(例如，肿瘤相关粘蛋白、癌相关粘蛋白、多形上皮粘蛋白、花生反应性尿粘蛋白、多形上皮粘蛋白(PEM)、PEMT、episialin、肿瘤相关上皮膜抗原、上皮膜抗原(EMA)、H23抗原(H23AG)、PUM和乳腺癌相关抗原DF3)、CTCL肿瘤抗原se1-1、CTCL肿瘤抗原se14-3、CTCL肿瘤抗原se20-4、CTCL肿瘤抗原se20-9、CTCL肿瘤抗原se33-1、CTCL肿瘤抗原se37-2、CTCL肿瘤抗原se57-1、CTCL肿瘤抗原se89-1、前列腺特异性膜抗原、5T4癌胚滋养细胞糖蛋白、Orf73卡波西肉瘤相关疱疹病毒、结肠癌抗原NY-CO-45、肺癌抗原NY-LU-12变体A、癌症相关表面抗原、腺癌抗原ART1、副肿瘤性相关脑-睾丸-癌抗原(肿瘤神经元抗原MA2；副肿瘤性神经元抗原)、神经肿瘤腹侧抗原2(NOVA2)、肝细胞癌抗原基因520、肿瘤相关抗原CO-029、肿瘤相关抗原MAGE-X2、滑膜肉瘤抗原、X断点2、由T细胞识别的鳞状细胞癌抗原、血清限定性结肠癌抗原1、血清限定性乳腺癌抗原NY-BR-15、血清限定性乳腺癌抗原NY-BR-16、嗜铬粒蛋白A、甲状旁腺分泌蛋白1、胰腺癌相关抗原(DUPAN-2)、碳水化合物抗原CA 19-9、碳水化合物抗原CA 72-4、碳水化合物抗原CA 195和癌胚抗原(CEA)。
在一些实施方案中，肿瘤抗原为BRCA1、CDKN2A(p16INK4a)、CDKN2B(p15INK4b)、GSTP1、MGMT、RASSF1A或SFRP2。
示例性第一基底和第二基底
在一些情况下，将生物样品放置(例如，安装或以其他方式固定)在第一基底上。第一基底可以是生物样品可安装在其上的任何固体或半固体支撑物。在一些情况下，第一基底为载片。在一些情况下，载片为玻璃载片。在一些实施方案中，基底由玻璃、硅、纸、水凝胶、聚合物整料或本领域已知的其他材料制成。在一些实施方案中，第一基底由惰性材料或基质组成(例如，玻璃载片)，所述基底已通过例如用包含将便于生物样品的安装的反应性基团的材料处理基底而官能化。
在一些实施方案中，第一基底不包括多个捕获探针(例如，阵列)，每个捕获探针包含空间条形码。
基底，例如第一基底和/或第二基底，通常可具有任何合适的形式或格式。例如，基底可以是平坦的、弯曲的，例如凸出或凹入弯曲的。例如，第一基底可朝向生物样品例如组织样品与第一基底之间发生相互作用的区域弯曲。在一些实施方案中，基底是平坦的，例如平面的、芯片(chip)或载片。基底可在第一基底内含有一个或多个图案化表面(例如，通道、孔、突起、脊、凹坑等)。
基底，例如第一基底和/或第二基底，可以是任何期望的形状。例如，基底通常可以是薄的平坦形状(例如，正方形或长方形)。在一些实施方案中，基底结构具有圆角(例如，以增加安全性或稳健性)。在一些实施方案中，基底结构具有一个或多个切角(例如，以与滑动夹具或十字工作台一起使用)。在其中基底结构平坦的一些实施方案中，基底结构可以是具有平坦表面的任何适宜类型的支撑物(例如，芯片或载片如显微镜载片)。
第一基底和/或第二基底可任选地包括各种结构，如但不限于突起、脊和通道。基底可被微图案化以限制分析物的横向扩散(例如，以提高空间分析的分辨率)。用这样的结构修饰的基底可被修饰以允许分析物、特征(例如，珠)或各个位点处的探针的关联。例如，其中用各种结构修饰基底的位点可与其他位点邻接或不邻接。
在一些实施方案中，第一基底和/或第二基底的表面使用技术如(但不限于)冲压、微蚀刻或模制技术进行修饰以包含一个或多个孔。在其中第一基底和/或第二基底包括一个或多个孔的一些实施方案中，第一基底可以是凹载片或腔载片。例如，可由第一基底和/或第二基底的表面上的一个或多个浅凹陷形成孔。在其中第一基底和/或第二基底包括一个或多个孔的一些实施方案中，可通过向第一基底结构的表面附接盒(例如，含有一个或多个腔室的盒)来形成孔。
在其中第一基底和/或第二基底被修饰为含有一个或多个结构(包括但不限于孔、突起、脊、特征或标记)的一些实施方案中，结构可包括物理改变的位点。例如，用各种结构修饰的第一基底和/或第二基底可包括物理性质，包括但不限于物理构造、磁力或压缩力、化学官能化位点、化学改变的位点和/或静电改变的位点。在其中第一基底被修饰为含有各种结构(包括但不限于孔、突起、脊、特征或标记)的一些实施方案中，结构以图案施加。或者，结构可以随机分布。
在一些实施方案中，第一基底在其表面上包括一个或多个标记，例如以提供在本文公开的夹层型过程期间将生物样品的至少一部分与第二基底上的多个捕获探针对准的指导。例如，第一基底可包括识别样品区域的样品区域指示符。在一些实施方案中，第一基底上的样品区域指示符与第二基底的包括多个捕获探针的区域对准。在一些实施方案中，第一基底和/或第二基底可包括基准标记。在一些实施方案中，第一基底和/或第二基底不包括基准标记。在一些实施方案中，第一基底不包括基准标记而第二基底包括基准标记。可使用包括但不限于印刷、喷砂和在表面上沉积的技术来制作这样的标记。
在一些实施方案中，可使用一个或多个基准标记即放置在成像系统的视场中的物体来执行成像，所述物体将出现在所产生的图像中。基准标记通常用作参考点或测量标尺。基准标记可包括但不限于可检测标签如荧光、放射性、化学发光和比色标签。例如，Carter等人，Applied Optics 46：421-427，2007)中描述了使用基准标记来稳定和定向生物样品，其全部内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，基准标记可以是物理颗粒(例如，纳米颗粒、微球、纳米球、珠、柱或本文描述的或本领域已知的任何其他示例性物理颗粒)。
在一些实施方案中，基准标记可存在于第一基底上以提供生物样品的定向。在一些实施方案中，可向第一基底联接微球以帮助生物样品的定向。在一些实例中，联接至第一基底的微球可产生光学信号(例如，荧光)。在一些实施方案中，可向第一基底联接量子点以帮助生物样品的定向。在一些实例中，联接至第一基底的量子点可产生光学信号。
在一些实施方案中，基准标记可以是可检测信号分子可与之相互作用而生成信号的固定分子。例如，可向当经受特定波长(或波长范围)的光时能够发荧光的化学部分连接或联接标记核酸。虽然不是必需的，但使用可使用用于检测标记的cDNA的相同条件(例如，成像条件)检测的标记可能是有利的。
在一些实施方案中，基准标记可随机放置在视场中。例如，含有荧光团的寡核苷酸可在第一基底上的随机位置处随机印刷、压印、合成或附接到第一基底(例如，玻璃载片)。可使组织切片与第一基底接触，使得含有荧光团的寡核苷酸接触或接近来自组织切片的细胞或细胞的组分(例如，mRNA或DNA分子)。可获得第一基底和组织切片的图像，并可确定荧光团在组织切片图像内的位置(例如，通过查看叠加了荧光团检测的组织切片光学图像)。在一些实施方案中，基准标记可精确地放置在视场中(例如，在第一基底上的已知位置处)。在这种情况下，基准标记可被压印、附接或合成在第一基底上并与生物样品接触。通常，拍摄样品和基准标记的图像，并可通过查看图像来确认基准标记在第一基底上的位置。
在一些实施方案中，基准标记可以是附接到第一基底的固定分子(例如，物理颗粒)。例如，基准标记可以是纳米颗粒，例如纳米棒、纳米线、纳米立方体、纳米金字塔或球形纳米颗粒。在一些实例中，纳米颗粒可由重金属(例如，金)制成。
多种不同的第一基底可用于前述目的。通常，第一基底可以是任何合适的支撑材料。示例性的第一基底包括但不限于玻璃、改性和/或官能化玻璃、水凝胶、膜(films/membranes)、塑料(包括例如丙烯酸类塑料、聚苯乙烯、苯乙烯和其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、TeflonTM、环烯烃、聚酰亚胺等)、尼龙、陶瓷、树脂、Zeonor、二氧化硅或基于二氧化硅的材料(包括硅和改性硅)、碳、金属、无机玻璃、光纤束以及聚合物如聚苯乙烯、环烯烃共聚物(COC)、环烯烃聚合物(COP)、聚丙烯、聚乙烯聚碳酸酯或其组合。
在上文讨论的第一基底材料的实例中，聚苯乙烯是适合于结合带负电荷的大分子的疏水性材料，因为它通常含有很少的亲水性基团。对于固定在玻璃载片上的核酸，通过增加玻璃表面的疏水性，可增加核酸的固定。这样的增强可允许相对更密堆积的形成(例如，提供改善的特异性和分辨率)。
在另一个实例中，第一基底可为流动池。流动池可由前述材料中的任何一种形成，并且可包括允许试剂、溶剂、特征和分析物通过流动池的通道。在一些实施方案中，将水凝胶包埋的生物样品组装在流动池中(例如，利用流动池将水凝胶引入到生物样品)。在一些实施方案中，不将水凝胶包埋的生物样品组装在流动池中。在一些实施方案中，可然后如本文所述制备和/或等长扩增(isometrically expanded)水凝胶包埋的生物样品。
WO 2020/123320中描述了类似于第一基底(例如，不具有捕获探针的基底)和/或第二基底的示例性基底，该文献通过引用整体并入本文。
生物样品的染色和成像
在将生物样品放置到第一基底上之后，可使用各种各样的染色剂和染色技术来对生物样品染色。在一些实施方案中，可使用任何数目的生物染色剂对样品染色，包括但不限于吖啶橙、俾斯麦棕、胭脂红、考马斯蓝、甲酚紫、DAPI、曙红、溴化乙锭、酸性品红、苏木精、Hoechst染色剂、碘、甲基绿、亚甲蓝、中性红、尼罗蓝、尼罗红、四氧化锇、碘化丙啶、罗丹明或番红。在一些情况下，本文公开的方法包括对生物样品成像。在一些情况下，对样品成像在对生物样品脱氨之前进行。
可使用已知的染色技术来对样品染色，包括Can-Grunwald、Giemsa、苏木精和曙红(H&E)、Jenner′s、Leishman、Masson’s trichrome、Papanicolaou、Romanowsky、银、苏丹染料、Wright’s和/或Periodic Acid Schiff(PAS)染色技术。PAS染色通常在福尔马林或丙酮固定之后执行。在一些情况下，染色剂为H&E染色剂。
在一些实施方案中，可使用如本文中别处所述的可检测标签(例如，放射性同位素、荧光团、化学发光化合物、生物发光化合物和染料)对生物样品染色。在一些实施方案中，仅使用一种类型的染色剂或一种技术来对生物样品染色。在一些实施方案中，染色包括生物染色技术如H&E染色。在一些实施方案中，染色包括使用荧光偶联抗体鉴定分析物。在一些实施方案中，使用两种或更多种不同类型的染色剂或者两种或更多种不同的染色技术来对生物样品染色。例如，可通过使用一种技术(例如，H&E染色和亮场成像)染色和成像来制备生物样品，然后使用另一种技术(例如，IHC/IF染色和荧光显微镜法)对同一生物样品染色和成像。
在一些实施方案中，可对生物样品脱色。使生物样品脱色或褪色的方法是本领域已知的，并通常取决于施加到样品的一种或多种染色剂的性质。例如，H&E染色可通过在HCl或任何其他酸(例如，硒酸、硫酸、氢碘酸、苯甲酸、碳酸、苹果酸、磷酸、草酸、琥珀酸、水杨酸、酒石酸、亚硫酸、三氯乙酸、氢溴酸、盐酸、硝酸、正磷酸、砷酸、亚硒酸、铬酸、柠檬酸、氢氟酸、亚硝酸、异氰酸、甲酸、硒化氢、钼酸、乳酸、乙酸、碳酸、硫化氢或其组合)中洗涤样品来脱色。在一些实施方案中，脱色可包括在酸(例如，HCl)中洗涤1、2、3、4、5次或更多次。在一些实施方案中，脱色可包括向下游溶液(例如，透化溶液)添加HCl。在一些实施方案中，脱色可包括将所公开的方法中使用的酶(例如，胃蛋白酶)溶解在酸(例如，HCl)溶液中。在一些实施方案中，在用酸对苏木精脱色之后，可向脱色溶液中添加其他试剂以升高pH以供用于其他应用。例如，可向酸脱色溶液中添加SDS以与单独的酸脱色溶液相比升高pH。作为另一个实例，在一些实施方案中，经由抗体偶联向样品施加一种或多种免疫荧光法染色剂。这样的染色剂可使用技术如经由用还原剂处理和洗涤剂洗涤、离液序列高的盐处理、用抗原回收溶液处理和用酸性甘氨酸缓冲液处理以切割二硫键来去除。用于多重染色和脱色的方法在例如以下文献中有述：Bolognesi等人，J.Histochem.Histochem.Cytochem.2017；65(8)：431-444，Lin等人，Nat Commun.2015；6：8390，Pirici等人，J.Histochem.Cytochem.2009；57：567-75，和Glass等人，J.Histochem.Cytochem.2009；57：899-905，其每一个的全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，可作为本文提供的示例性空间工作流程的一部分或作为其补充执行免疫荧光法或免疫组织化学法方案(直接和间接染色技术)。例如，可根据本文描述的方法固定组织切片。可将生物样品转移到阵列(例如，捕获探针阵列)，其中使用免疫荧光法方案探测分析物(例如，蛋白质)。例如，样品可被再水化、封闭和透化(3XSSC、2％BSA、0.1％Triton X、1U/μl RNAse抑制剂，4℃下10分钟)，然后用荧光一抗染色(1∶100，在3XSSC、2％BSA、0.1％Triton X、1U/μl RNAse抑制剂中，4℃下30分钟)。可根据本文描述的分析物捕获或空间工作流程洗涤、盖上盖玻片(在甘油+1U/μl RNAse抑制剂中)、成像(例如，使用共聚焦显微镜或其他能够进行荧光检测的设备)、洗涤和处理生物样品。
如本文所用，抗原回收缓冲液可改善IF/IHC方案中的抗体捕获。用于抗原回收的示例性方案可以是预热抗原回收缓冲液(例如，至95℃)、将生物样品浸入在经加热的抗原回收缓冲液中达预定的时间、然后从抗原回收缓冲液中取出生物样品并洗涤生物样品。
在一些实施方案中，优化透化可用于鉴定细胞内分析物。透化优化可包括透化剂的选择、透化剂的浓度和透化持续时间。组织透化在本文中别处讨论。
在一些实施方案中，在标记生物样品的制备中封闭阵列和/或生物样品将减少抗体与阵列和/或生物样品的非特异性结合(减少背景)。一些实施方案提供了可在标签的施加之前和/或期间施加的封闭缓冲液/封闭溶液，其中所述封闭缓冲液可包括封闭剂，以及任选地表面活性剂和/或盐溶液。在一些实施方案中，封闭剂可以是牛血清白蛋白(BSA)、血清、明胶(例如，鱼明胶)、牛奶(例如，脱脂奶粉)、酪蛋白、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、生物素封闭试剂、过氧化物酶封闭试剂、左旋咪唑、Carnoy’s溶液、甘氨酸、赖氨酸、硼氢化钠、滂胺天蓝、苏丹黑、台盼蓝、FITC封闭剂和/或乙酸。封闭缓冲液/封闭溶液可在对生物样品标签化(例如，施加荧光团缀合抗体)之前和/或期间施加到阵列和/或生物样品。
生物样品中核酸的脱氨
在一些实施方案中，本文描述的方法包括使分析物脱氨。在一些实施方案中，在脱氨之前或之后，本文描述的方法包括使生物样品透化的步骤。在一些情况下，透化步骤在使样品中的分析物脱氨之前进行。在一些情况下，透化包括使生物样品与透化试剂接触。可使用本文描述的任何合适的透化试剂。在一些实施方案中，透化试剂为肽链内切酶。可使用的肽链内切酶包括但不限于胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、胃蛋白酶、clostripan、谷氨酰肽链内切酶(GluC)、ArgC、肽基-Asp肽链内切酶(ApsN)、肽链内切酶LysC和肽链内切酶LysN。在一些实施方案中，肽链内切酶为胃蛋白酶。
在一些实施方案中，分析物的脱氨通过使分析物与一种或多种酶促或化学脱氨剂接触来实现。在一些情况下，脱氨剂使分析物(例如，DNA)片段化。任何合适的脱氨剂均可用于本文描述的方法中。在一些实施方案中，分析物(例如，DNA)在脱氨剂的处理之前变性为单链分子。在一些实施方案中，脱氨步骤包括使样品与包含亚硫酸氢盐的组合物接触。在一些实施方案中，亚硫酸氢盐为亚硫酸氢钠。
在一些情况下，脱氨步骤在一种或多种探针与分析物(例如，核酸分子)的杂交和空间阵列上连接的(例如，连接)探针的捕获之前执行。例如，将生物样品放置在没有捕获探针的常规载片(不同于空间阵列)上，并如本文所述对生物样品中的核酸分子脱氨。
在一些实施方案中，脱氨包括酶促处理样品。在一些实施方案中，用脱氨酶处理样品。本领域已知的任何合适的酶均可用于本文描述的方法中。在一些实施方案中，酶为真核DNA甲基转移酶(CG)。在一些实施方案中，酶为原核DNA(胞嘧啶-5)甲基转移酶。在一些实施方案中，酶为载脂蛋白B mRNA编辑酶，催化多肽样(APOBEC，胞苷脱氨酶)。在一些实施方案中，酶为十-十一易位(TET)家族脱甲基酶的酶。
在一些实施方案中，如果存在于样品中的分析物中，则未甲基化的胞嘧啶将被脱氨成尿嘧啶。在探针与脱氨的分析物结合之后，延伸探针，其中每个尿嘧啶(如果存在于分析物中)与腺嘌呤碱基配对。在一些实施方案中，延伸的探针在对应于样品中分析物中的未甲基化胞嘧啶的每个位置中包含腺嘌呤。在一些实施方案中，分析物中的所有未甲基化的胞嘧啶通过脱氨步骤转化为尿嘧啶。在一些情况下，甲基化的胞嘧啶不被转化为尿嘧啶。相反，甲基化的胞嘧啶保留为胞嘧啶。
在一些情况下，在添加下一节中描述的探针之前，用透化剂处理样品。在一些情况下，透化剂为稀释的透化剂。在一些情况下，稀释的透化剂包括但不限于有机溶剂(例如，丙酮、乙醇和甲醇)、交联剂(例如，多聚甲醛)、洗涤剂(例如，皂苷、Triton X-100TM、Tween-20TM或十二烷基硫酸钠(SDS))和酶(例如，胰蛋白酶、蛋白酶(例如，蛋白水解酶K)。在一些实施方案中，洗涤剂为阴离子洗涤剂(例如，SDS或N-月桂酰肌氨酸钠盐溶液)。示例性的透化试剂见述于PCT专利申请公开号WO 2020/123320中，该专利申请通过引用整体并入。在一些情况下，透化剂的稀释为约10倍、约50倍、约100倍、约200倍、约300倍、约400倍、约500倍或更高。
在一些实施方案中，所述方法还包括洗涤生物样品。在一些情况下，洗涤步骤在脱氨步骤与添加探针的步骤之间进行。在一些实施方案中，进行洗涤步骤以去除全部或部分脱氨剂。在一些实施方案中，洗涤步骤不去除生物样品中的分析物。在一些实施方案中，洗涤步骤去除微不足道的量的生物样品中的分析物。在一些情况下，洗涤步骤在杂交寡核苷酸之后进行。在一些情况下，该洗涤步骤去除任何未结合的寡核苷酸并可使用本文公开的或本领域已知的任何技术或溶液执行。在一些实施方案中，执行多个洗涤步骤来去除未结合的寡核苷酸。
向生物样品添加探针
添加第一探针和第二探针
脱氨之后，在一些情况下，向生物样品添加一个或多个探针。在一些情况下，所述一个或多个探针(例如，第一探针；第二探针)的长度为至少30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、至少约105、至少约110、至少约115、至少约120、至少约125、至少约135、至少约140或更多个核苷酸。在一些实施方案中，探针包括与分析物例如核酸互补或基本上互补的序列。基本上互补指的是探针与分析物中的序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％互补。在一些情况下，第一探针和第二探针与分析物上的相邻序列杂交。
在一些情况下，探针与长度为5至140个核苷酸(例如，长度为约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139或140个核苷酸)的序列杂交。在一些情况下，探针与长度为15至120个核苷酸的序列杂交。
在一些情况下，探针为DNA探针。在一些情况下，第一探针在3’末端处包含至少两个核糖核酸碱基，第二探针在5’末端处包含磷酸化核苷酸。
可使用本领域已知的方法设计探针(例如，第一探针和第二探针)。另外，探针可设计为使得(1)一个或两个探针直接与潜在甲基化区域杂交或(2)探针侧接潜在甲基化区域。
在一些情况下，本文使用的探针设计为与作为脱氨步骤(即，脱氨核酸)的结果突变(例如，从胞嘧啶突变为胸腺嘧啶)的序列杂交。在一些情况下，本文使用的探针设计为与未作为脱氨步骤的结果突变(例如，在脱氨步骤期间甲基化的胞嘧啶未突变)的序列杂交。在一些情况下，本文使用的探针设计为与包含至少一个作为脱氨步骤的结果突变的核苷酸的序列杂交。在一些情况下，本文使用的探针设计为与包含多于一个(例如，2、3、4、5个或更多个)作为脱氨步骤的结果突变的核苷酸的序列杂交。
在一些情况下，探针设计为侧接(即，环绕)为甲基化研究位点的序列。在一些情况下，其中探针杂交的分析物的两个区域之间的序列(即，中间序列)包含一个或多个在脱氨步骤期间突变(例如，从胞嘧啶突变为胸腺嘧啶)的核苷酸。在一些情况下，中间序列包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个在本文描述的脱氨步骤期间突变的核苷酸。例如，在一些情况下，第一探针可设计为与甲基化研究位点的位点5’杂交，第二探针可设计为与甲基化研究位点的位点5’杂交(或反之亦然)。一旦杂交，就可测定两个杂交位点之间的序列，从而提供关于特定核苷酸(例如，胞嘧啶)是否已甲基化的认知。在一些情况下，探针与隔开至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个核苷酸的序列杂交。在一些实施方案中，至少一个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)脱氨核苷酸位于杂交的探针之间的序列中。
在一些情况下，多于一个(例如，2、3、4、5个或更多个)探针与靶DNA分子杂交。在一些情况下，两个探针与彼此相邻的序列杂交。在一些情况下，探针是偶联的。在一些情况下，探针经由连接偶联。在一些情况下，因为探针与相邻的序列杂交，所以杂交后可在相邻的探针之间发生连接(即，不需要如本文所述的延伸步骤)。在一些情况下，两个探针与由至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95、约100、约125、约150、约175、约200、约250、约300、约350、约400、约450、约500、约600、约700、约800、约900或约1000个核苷酸分开的分析物序列杂交。在一些情况下，探针与脱氨后已被修饰(例如，包括突变)的序列杂交。在一些情况下，突变为胞嘧啶突变为胸腺嘧啶。在一些情况下，分析物包括多于一个作为脱氨步骤的结果的突变。在一些情况下，有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个突变为胸腺嘧啶的胞嘧啶(即，胞嘧啶未被甲基化)。在一些情况下，有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个未突变为胸腺嘧啶的胞嘧啶(即，胞嘧啶被甲基化)。在一些情况下，探针设计为检测一个或多个脱氨突变。
所述一个或多个探针包括与目标分析物上的序列特异性结合的序列。在一些实施方案中，结合部分包括与不具有CG二核苷酸的区域特异性结合的序列。在一些情况下，结合部分包括与包括AA、AT、AC、AG、CA、CT、CC、GA、GC、GT、GG、TA、TC、TG或TT二核苷酸的区域特异性结合的序列。在一些实施方案中，结合部分与目标分析物的结合不影响目标分析物的甲基化状态的鉴定。
在一些情况下，所述一个或多个探针(例如，第一探针；第二探针)还包括可与捕获探针序列(例如，在阵列上，如本文所述)杂交的序列。在一些情况下，与捕获探针杂交的序列为多腺苷酸化(poly(A))序列。在一些情况下，与捕获探针杂交的序列为简并(例如，随机)序列。在一些情况下，与捕获探针杂交的序列设计为是特异性序列，例如与DNA或RNA分子中的特异性靶序列互补的序列。
在一些实施方案中，使用聚合酶延伸探针中的至少一个。在一些情况下，本文公开的方法包括生成延伸的第一探针。在一些情况下，本文公开的方法包括生成延伸的第二探针。在一些情况下，延伸的第一探针或延伸的第二探针包括与第一序列和第二序列之间的序列互补的序列。在一些情况下，延伸探针中的一个以填充两个杂交探针之间的间隙。在一些实施方案中，使用聚合酶延伸捕获探针。在一些实施方案中，聚合酶为DNA聚合酶。在一些实施方案中，DNA聚合酶为热稳定的DNA聚合酶，包括但不限于DNA聚合酶如Phusion、HotStart Taq DNA聚合酶和
Figure BDA0004088438550000421
Hot Start Taq DNA聚合酶。
在一些情况下，探针(例如，第一探针和第二探针)连接在一起。在连接的情况下，任何合适的连接酶均可用于本文描述的方法中。在一些情况下，探针可使用连接酶(例如，T4 RNA连接酶2、splintR连接酶、单链DNA连接酶)进行酶促连接反应。在一些情况下，连接酶为T4 DNA连接酶。在一些情况下，连接酶为T4 RNA连接酶2，也称为Rnl2，其以双链结构将RNA的3’羟基末端与DNA的5’磷酸酯连接。T4 DNA连接酶为属于DNA连接酶酶家族的酶，其催化一个DNA分子上游离的3’羟基基团与第二分开的DNA分子的游离5’磷酸酯基团形成共价磷酸二酯键，从而将两个DNA链共价连接在一起以形成单个DNA链。在一些情况下，连接酶为splintR连接酶。SplintR连接酶，也称为PBCV-1 DNA连接酶或Chorella病毒DNA连接酶，有效地催化由互补的RNA链夹板化的相邻单链DNA寡核苷酸的偶联(例如，连接)。在一些情况下，连接酶为单链DNA连接酶。在一些实施方案中，连接酶为预活化的T4 DNA连接酶。美国公开号2010-0184618-A1中进一步公开了利用预活化的T4 DNA连接酶的方法，该文献通过引用整体并入。
在一些实施方案中，在连接反应期间添加三磷酸腺苷(ATP)。带切口的DNA底物的DNA连接酶催化密封首先通过ATP水解活化，其导致AMP基团共价添加到酶。在与DNA双链体中的切口位点结合之后，连接酶将此AMP转移到切口处的磷酸化5’末端，从而形成5’-5’焦磷酸键。最后，连接酶催化切口的3’末端处的OH基团对这种焦磷酸键的攻击，从而将其密封，随后释放连接酶和AMP。如果在3’攻击之前连接酶从底物脱离，例如由于酶的过早AMP重载，则5’AMP将留在5’末端处，从而封闭进一步的偶联(例如，连接)尝试。在一些情况下，在偶联(例如，连接)反应期间，以约1μM、约10μM、约100μM、约1000μM或约10000μM的浓度添加ATP。
在一些情况下，在连接过程期间添加有助于连接探针的辅因子。在一些情况下，辅因子包括镁离子(Mg2+)。在一些情况下，辅因子包括锰离子(Mn2+)。在一些情况下，以MgCl2的形式添加Mg2+。在一些情况下，以MnCl2的形式添加Mn2+。在一些情况下，MgCl2的浓度为约1mM、约10mM、约100mM或约1000mM。在一些情况下，MnCl2的浓度为约1mM、约10mM、约100mM或约1000mM。
在一些情况下，连接反应在约6.5至9.0、约6.5至8.0、约7.5至8.0、约7.5或约8.0的范围内的pH下进行。
在一些情况下，使用具有多个与核酸杂交的序列的单个探针。例如，在一些情况下，第一探针和第二探针在邻接的核酸上。在一些情况下，第一探针在邻接的核酸的3’末端上而第二探针在邻接的核酸的5’末端上(或反之亦然)。如上所述，在一些情况下，两个杂交序列可彼此相邻，或者它们可与在两个杂交位点之间具有间隙序列的序列杂交。在一些情况下，可形成并扩增环状核酸(例如，使用滚环扩增)。在一些情况下，可消化环状序列(例如，使用核酸内切酶)，从而产生可使用本文公开的两种载片方法捕获和鉴定的线状核酸。因此，在一些情况下，单个探针包括一个或多个限制性位点，其设计为对该探针是独有的并且在目的分析物中找不到。只要符合这些标准，就可以使用本领域已知的任何核酸内切酶。
在一些实施方案中，本文提供了用于扩增邻接的核酸的方法，其中所述邻接的核酸的扩增增加邻接的核酸的拷贝数。在其中扩增邻接的核酸的一些实施方案中，扩增通过滚环扩增执行。在一些实施方案中，待扩增的邻接的核酸包括使得能够进行滚环扩增的序列(例如，对接序列、功能序列和/或引物序列)。在一个实例中，邻接的核酸可包括能够与用于扩增的引物结合的功能序列。在另一个实例中，邻接的核酸可包括可与一个或多个用于滚环扩增的寡核苷酸杂交的对接序列(例如，第一对接序列和第二对接序列)(例如，锁式探针)。
如本文所用，“锁式探针”是指在其5’和3’末端处具有与在靶核酸序列上的相邻或邻近的靶序列(例如，对接序列)互补的序列的寡核苷酸。一旦与靶序列(例如，对接序列)杂交，就使锁式探针的两个末端接触或延伸一个末端直至两个末端接触，从而允许通过连接(例如，使用任何本文描述的方法连接)使锁式探针环化。在一些实施方案中，在寡核苷酸的环化之后，可使用滚环扩增来扩增连接产物，所述连接产物包括邻接的核酸。
在一些情况下，探针(例如，第一探针和第二探针)在夹板寡核苷酸的帮助下连接。在一些情况下，夹板寡核苷酸包括与第一探针或其一部分基本上互补的第一夹板序列和与第二探针或其一部分基本上互补的第二夹板序列。夹板寡核苷酸的长度可在10至100个核苷酸之间(例如，约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100个核苷酸)。在一些情况下，夹板寡核苷酸有助于第一探针和第二探针的连接。包括夹板寡核苷酸的方法已见述于美国专利公开号2019/0055594A1，该文献通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，在将探针与核酸杂交的步骤之后，执行洗涤步骤以去除未结合的探针。洗涤步骤可使用本文描述的洗涤方法和溶液中的任一种来执行。在一些实施方案中，在洗涤步骤之后，第一探针和第二探针与分析物结合(例如，杂交)，并且夹板寡核苷酸与第一寡核苷酸和第二寡核苷酸结合(例如，杂交)(例如，在未与分析物结合的第一探针和第二探针的部分处)。在一些实施方案中，第一探针、第二探针和/或夹板寡核苷酸同时添加至生物样品。在一些实施方案中，第一探针和第二探针在第一时间点添加，而夹板寡核苷酸在第二时间点添加至生物样品。
添加甲基化衔接子
本文提供了用于鉴定生物样品中DNA的甲基化状态的方法，所述方法包括：(a)在其中一个或多个甲基化衔接子插入到DNA中的条件下向生物样品提供一个或多个甲基化衔接子和转座酶；(b)使包含分析物和所述一个或多个甲基化衔接子的序列与包括多个捕获探针的阵列接触，其中所述多个捕获探针中的捕获探针包含空间条形码，其中如果捕获探针包含一个或多个胞嘧啶，则所述一个或多个胞嘧啶为甲基化胞嘧啶；(c)将包含分析物和所述一个或多个甲基化衔接子的序列连接至捕获探针，从而产生连接产物；(d)使所述连接产物脱氨；(e)测定(i)空间条形码的全部或部分序列或其补体，和(ii)连接产物的全部或部分序列或其补体，并且使用(i)和(ii)的测定序列来鉴定生物样品中分析物的甲基化状态。
在一些实施方案中，所述方法还包括在步骤(b)之前允许转座酶将DNA片段化并插入甲基化衔接子，从而生成包含分析物和所述一个或多个甲基化衔接子的序列。
本文还提供了在空间阵列上鉴定生物样品中核酸的甲基化状态的方法，所述方法包括：(a)将甲基化衔接子连接到片段化核酸的5’和/或3’末端上，从而生成衔接的核酸片段；(b)使衔接的核酸片段脱氨；(c)将衔接的核酸片段捕获到包括多个捕获探针的空间阵列上，其中捕获探针包含空间条形码；(d)测定(i)空间条形码的全部或部分序列或其补体，和(ii)甲基化衔接子/核酸的全部或部分序列或其补体，并且使用(i)和(ii)的测定序列来鉴定生物样品中分析物或其一部分的甲基化状态。
在一些情况下，甲基化衔接子在核酸的5’末端处连接至核酸。在一些情况下，甲基化衔接子在核酸的3’末端处连接至核酸。在一些情况下，甲基化衔接子在核酸的5’末端和3’末端处连接至核酸。在一些实施方案中，甲基化衔接子为甲基化的捕获手柄。
在一些情况下，甲基化衔接子的长度为10至75(例如，10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74或75)个核苷酸。在一些情况下，甲基化衔接子是单链的。在一些情况下，甲基化衔接子是双链的。在一些情况下，甲基化衔接子为DNA分子。
在一些情况下，甲基化衔接子包括一个或多个甲基化的胞嘧啶，其受到保护以免于脱氨期间引起的突变。例如，在一些实施方案中，甲基化衔接子包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个甲基化的胞嘧啶。
在一些情况下，甲基化衔接子通过标签化连接至核酸。
在一些实施方案中，步骤(a)还包括允许转座酶将分析物例如核酸片段化，并插入甲基化衔接子，从而生成一个或多个序列，每个序列包含核酸分析物和所述一个或多个甲基化衔接子(即，衔接的(例如，标签化的)核酸片段)。
使用转座酶进行空间转录组分析的方法见述于美国专利公开号WO 2020/047002中，该专利通过引用整体并入本文。
如本文所用，“标签化”是指DNA的转座酶介导片段化和加标签的过程。标签化通常涉及通过转座体复合物修饰DNA并导致“标签”或带标签的DNA片段的形成。
如本文所用，“转座体”或“转座体复合物”为转座酶与包含转座子末端序列(也称为“转座酶识别序列”或“嵌合末端”(ME))的DNA的复合物。
“转座酶”为与转座子的末端结合并通过剪切和粘贴机制或复制转座机制催化其移动到基因组的另一部分的酶。
与转座酶(即转座子或ME序列)形成复合物的DNA含有部分双链(例如，DNA)寡核苷酸，其中每个链含有形成寡核苷酸的双链部分的转座酶特异性序列。寡核苷酸的单链部分在寡核苷酸的5’末端处(即，形成5’突出)并且可以包含功能序列(例如，捕获探针结合位点、衔接子序列等)。因此，转座体中的部分双链寡核苷酸可以被视为可连接至片段化DNA的衔接子。转座体包含与一个或多个衔接子复合的转座酶，所述转座酶包含转座子末端序列(或嵌合末端)并且标签化导致DNA的同时片段化和衔接子与DNA双链体片段的两个末端的5’末端的连接(例如，加标签)。在一些实施方案中，衔接子是甲基化的(例如，包含一个或多个甲基化胞嘧啶)。
显而易见的是，可使用标签化来提供具有能够与本发明的捕获探针的捕获结构域杂交和/或连接的结构域的片段化DNA。此外，可以直接或间接地提供所述结构域。
例如，在一些实施方案中，转座体的衔接子包含可以配置为与捕获结构域的全部或一部分杂交的功能结构域或序列。功能结构域或序列可以是能够与本发明的捕获探针的捕获结构域杂交的结构域(例如，同聚序列，例如poly-A序列)。换言之，衔接子的单链部分包含能够与本发明的捕获探针的捕获结构域杂交的结构域。因此，标签化导致生物试样的DNA的片段化以及能够与本发明的捕获探针的捕获结构域杂交的结构域与生物试样的DNA的连接，即为生物试样的DNA提供与捕获探针捕获结构域直接互补的结构域。
在一个实施方案中，功能结构域或序列配置为通过点击化学附接到捕获结构域的一部分。如本文所用，术语“点击化学”通常是指模块化、范围宽、产率高、仅生成无害副产物如可通过非色谱方法去除的那些且是立体特异性(但不一定是对映选择性)的反应。参见例如Angew.Chem.Int.Ed.，2001，40(11)：2004-2021，此文献通过引用整体并入本文。在一些情况下，点击化学可描述可在温和的水性条件下选择性地彼此反应的官能团对。
在一些实施方案中，转座体的衔接子包含(i)能够(即，适合于)促进一个或多个点击化学部分的引入的结构域，所述一个或多个点击化学部分配置为与另外一个或多个点击化学部分相互作用，所述另外一个或多个点击化学部分可与本发明的捕获探针的捕获结构域相关联。
点击化学反应的一个实例可为叠氮化物和炔烃的Huisgen 1，3-偶极环加成，即叠氮化物与炔烃的铜催化反应形成称为1，2，3-三唑的5-元杂原子环。该反应也称为Cu(I)-催化的叠氮化物-炔烃环加成(CuAAC)、Cu(I)点击化学或Cu+点击化学。用于点击化学的催化剂可为Cu(I)盐，或通过用还原试剂将Cu(II)试剂还原为Cu(I)试剂而原位制备的Cu(I)盐(Pharm Res.2008，25(10)：2216-2230)。用于点击化学的已知Cu(II)试剂可包括但不限于Cu(II)-(TBTA)络合物和Cu(II)(THPTA)络合物。TBTA，即三-[(1-苄基-1H-1，2，3-三唑-4-基)甲基]胺，也称为三-(苄基三唑基甲基)胺，可以是Cu(I)盐的稳定配体。THPTA，即三-(羟丙基三唑基甲基)胺，可以是Cu(I)的稳定剂的另一个实例。也可以实现其他条件来使用无铜点击化学从叠氮化物和炔烃构建1，2，3-三唑环，如通过应变促进的叠氮化物-炔烃点击化学反应(SPAAC，参见例如Chem.Commun.，2011，47：6257-6259和Nature，2015，519(7544)：486-90)，这些文献中的每一个通过引用整体并入本文。
在另一个实施方案中，转座体的衔接子可以包含模板化通用衔接子与标签化DNA的连接的核苷酸序列。通用衔接子包含能够与本发明的捕获探针的捕获结构域杂交的结构域。因此，在一些实施方案中，标签化为生物试样的DNA提供能够与捕获探针的捕获结构域间接杂交的结构域。
在另一个实施方案中，转座体的衔接子可以包含为连接反应中的底物的核苷酸序列，所述连接反应将通用衔接子引入到标签化DNA，例如通用衔接子可以结合的结构域。例如，通用衔接子可以是具有第一链和第二链的部分双链寡核苷酸，所述第一链包含含有与和片段化(即，标签化)DNA连接的衔接子序列结合的结构域的单链部分，所述第二链包含与第一链结合的结构域和能够与本发明的捕获探针的捕获结构域结合(杂交)的结构域。通用衔接子与片段化(即，标签化)DNA的连接为标签化DNA提供与本发明的捕获探针的捕获结构域结合的结构域。因此，在一些实施方案中，标签化间接地为生物试样的DNA提供结合结构域。
由于标签化导致在生物试样的DNA的3’末端与衔接子的双链部分处的5’末端之间包含间隙(即，含有ME的衔接子的5’末端未与生物试样的片段化DNA的3’末端连接)的DNA，故为标签化DNA提供能够与本发明的捕获探针的捕获结构域结合(杂交)的结合结构域可能需要“间隙填充”标签化DNA的步骤。
间隙填充可以使用合适的聚合酶来实现，即DNA聚合酶(例如选自下表)。在这方面，使用标签化DNA的互补链作为模板来延伸标签化DNA的3’末端。一旦间隙已被填充，即通过连接步骤使用合适的连接酶将标签化DNA的3’末端联结至衔接子的5’末端。
在这方面应理解，含有ME的衔接子的5’末端被磷酸化以使得能够发生连接。转座体可以包含其中一个或两个5’末端被磷酸化的衔接子。在其中转座体包含其中含有ME的衔接子的5’末端未被磷酸化的衔接子的实施方案中，间隙填充过程可以包括磷酸化衔接子的5’末端的进一步步骤，例如使用激酶，如T4多核苷酸激酶。
在一些实施方案中，可以使用具有链置换活性的DNA聚合酶使用标签化DNA的互补链作为模板来延伸标签化DNA的3’末端。这导致未与片段化DNA连接的衔接子的链的置换和完全双链DNA分子的生成。可以通过任何合适的手段来为这些分子提供能够与捕获探针的捕获结构域结合的结构域，例如，衔接子的连接、用末端转移酶“加尾”等。
因此，在一些实施方案中，所述方法包括使用具有链置换活性的聚合酶延伸片段化(即，标签化)DNA的3’末端以产生完全双链DNA分子的步骤。
在一些实施方案中，完全双链DNA分子可以提供有能够与空间阵列上的捕获探针的捕获结构域结合的结合结构域。在一些实施方案中，可以通过将衔接子连接至双链DNA分子或经由使用末端转移酶活性酶引入多核苷酸尾来提供结合结构域，例如，在双链DNA分子的3’末端处引入同聚序列(例如，poly-A尾)。
转座酶Tn5是蛋白质的RNase超家族的成员。Tn5转座子是一种复合转座子，其中两个几乎相同的插入序列(IS50L和IS50R)侧接三个抗生素抗性基因。每个IS50含有两个反向19-bp末端序列(ES)、一个外端(OE)和一个内端(IE)。
Tn5转座酶的一种高活性变体能够在花约5分钟的反应中介导双链DNA的片段化和合成寡核苷酸(衔接子)在DNA的两个5’末端处的连接。然而，由于野生型末端序列具有相对低的活性，故优选在体外由高活性嵌合末端(ME)序列替换它们。因此，Tn5转座酶与19-bpME的复合物是发生转座所必需的，条件是介于中间的DNA足够长以将这些序列中的两个紧密靠在一起而形成活性Tn5转座酶同二聚体。
US2010/0120098和US2011/0287435中详细描述了用于处理核酸的方法、组合物和试剂盒，特别是使用转座子组合物片段化DNA和对DNA加标签的方法和组合物，这些文献通过引用整体并入本文。
因此，任何具有标签化活性即能够将DNA片段化并将寡核苷酸连接至片段化DNA的末端的转座酶都可以用于本发明的方法中。在一些实施方案中，转座酶为Tn5、Tn7或Mu转座酶或其功能变体或衍生物。
生物样品中核酸的标签化可在核酸的脱氨之前或之后执行。在一些实施方案中，在标签化之前对核酸脱氨。在一些实施方案中，在标签化之后对核酸脱氨。
在一些实施方案中，所述方法还包括洗涤生物样品。在一些情况下，洗涤步骤在脱氨步骤之前或之后进行。在一些实施方案中，进行洗涤步骤以去除全部或部分脱氨剂。在一些实施方案中，洗涤步骤不去除生物样品中的分析物。在一些实施方案中，洗涤步骤去除微不足道的量的生物样品中的分析物。在一些情况下，洗涤步骤在杂交寡核苷酸之后进行。在一些情况下，该洗涤步骤去除任何未结合的寡核苷酸并可使用本文公开的或本领域已知的任何技术或溶液执行。在一些实施方案中，执行多个洗涤步骤来去除未结合的寡核苷酸。
双载片法过程
在一些实施方案中，第一基底和第二基底的对准通过夹层化过程来促进。因此，本文描述了将如本文所述的第一基底与具有捕获探针的阵列的第二基底定位在一起的方法。
图12为描绘包含生物样品的第一基底(例如，在病理载片1203上的组织切片1202)和包含加有空间条形码的阵列的第二基底(例如，填充有加有空间条形码的捕获探针1206的载片1204、)之间的示例性夹层化过程1201的示意图。在示例性夹层化过程期间，第一基底与第二基底对准，使得生物样品的至少一部分与阵列的至少一部分对准(例如，与生物样品上或下的阵列区域对准)。如图所示，阵列化载片1204在病理载片1203的上方位置。在一些实施方案中，病理载片1203可以位于阵列化载片1204的上方。在一些实施方案中，第一基底和第二基底被对准为保持两个基底之间的间隙或分隔距离1207。当第一基底和第二基底对准时，一种或多种分析物从生物样品释放并主动或被动地迁移至阵列以便捕获。在一些实施方案中，当生物样品和阵列的对准部分与试剂介质1205接触时发生迁移。释放的一种或多种分析物可以主动或被动地经由试剂介质1205迁移穿过间隙1207朝向捕获探针1206，并被捕获探针1206捕获。
在一些实施方案中，在垂直于支承样品的第一基底的表面的方向上测得，第一基底与第二基底之间的间隙1207中的分隔距离保持在2微米与1mm之间(例如，2微米与800微米之间、2微米与700微米之间、2微米与600微米之间、2微米与500微米之间、2微米与400微米之间、2微米与300微米之间、2微米与200微米之间、2微米与100微米之间、2微米与25微米之间、2微米与10微米之间)。在一些情况下，所述距离为2微米。在一些情况下，所述距离为2.5微米。在一些情况下，所述距离为约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25微米。在一些实施方案中，将第二基底放置成与第一基底上的样品直接接触以确保没有扩散性空间分辨率损失。在一些实施方案中，分隔距离在垂直于支承生物样品的第一基底的表面的方向上测量。
在一些实施方案中，将第一基底和第二基底放置在配置为对准生物样品和阵列的基底保持器(例如，阵列对准装置)中。在一些实施方案中，所述装置包括样品保持器。在一些实施方案中，样品保持器包括分别接收第一基底和第二基底的第一构件和第二构件。所述装置可包括连接到构件中的至少一个并对准第一构件和第二构件的对准机构。因此，本公开的装置可有利地对准第一基底和第二基底以及可能在第一基底和第二基底的表面上的任何样品、加有条形码的探针或透化试剂。示例性的装置和示例性的样品保持器见述于PCT专利申请公开号WO 2020/123320中，该专利申请通过引用整体并入。
在一些实施方案中，试剂介质包含透化剂。用于此目的的合适试剂包括但不限于有机溶剂(例如，丙酮、乙醇和甲醇)、交联剂(例如，多聚甲醛)、洗涤剂(例如，皂苷、TritonX-100TM、Tween-20TM或十二烷基硫酸钠(SDS))和酶(例如，胰蛋白酶、蛋白酶(例如，蛋白水解酶K)。在一些实施方案中，洗涤剂为阴离子洗涤剂(例如，SDS或N-月桂酰肌氨酸钠盐溶液)。示例性的透化试剂见述于PCT专利申请公开号WO 2020/123320中，该专利申请通过引用整体并入。
在一些实施方案中，试剂介质包含裂解试剂。裂解溶液可包含离子表面活性剂，例如月桂酰肌氨酸钠和十二烷基硫酸钠(SDS)。更一般地，化学裂解剂可包括但不限于有机溶剂、螯合剂、去污剂、表面活性剂和离液序列高的试剂。示例性的裂解试剂见述于PCT专利申请公开号WO2020/123320中，该专利申请通过引用整体并入。
在一些实施方案中，试剂介质包含蛋白酶。示例性的蛋白酶包括例如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、弹性蛋白酶和蛋白水解酶K。示例性的蛋白酶见述于PCT专利申请公开号WO 2020/123320中，该专利申请通过引用整体并入。
在一些实施方案中，试剂介质包含去污剂。示例性的去污剂包括十二烷基硫酸钠(SDS)、月桂酰肌氨酸钠、皂苷、Triton X-100TM和Tween-20TM。示例性的去污剂见述于PCT专利申请公开号WO 2020/123320中，该专利申请通过引用整体并入。
在一些实施方案中，试剂介质包含核酸酶。在一些实施方案中，核酸酶包含RNase。在一些实施方案中，RNase选自RNase A、RNase C、RNase H和RNase I。在一些实施方案中，试剂介质包含十二烷基硫酸钠(SDS)、蛋白水解酶K、胃蛋白酶、N-月桂酰肌氨酸、RNAse及其钠盐中的一种或多种。
样品保持器与用于使生物样品和阵列的对齐部分与试剂介质接触以促进分析物捕获的多种不同方案相容。在一些实施方案中，试剂介质直接沉积在第二基底上(例如，形成包含透化试剂和特征阵列的试剂介质)，和/或直接沉积在第一基底上。在一些实施方案中，试剂介质沉积在第一基底和/或第二基底上，然后第一基底和第二基底以所公开的配置对准，使得试剂介质接触生物样品和阵列的对准部分。在一些实施方案中，试剂介质被引入到间隙1207中，同时第一基底和第二基底以所公开的配置对准。
在某些实施方案中，在接触样品和特征阵列之前，将经干燥的透化试剂施加或形成为第一基底或第二基底或两者上的层。例如，可将试剂以溶液沉积在第一基底或第二基底或两者上并然后干燥。干燥方法包括但不限于旋涂试剂的稀溶液并然后蒸发试剂中包含的溶剂或试剂本身。或者，在其他实施方案中，可将试剂以干燥形式直接施加到第一基底或第二基底或两者上。在一些实施方案中，可在分析工作流程之前完成涂布过程，并且第一基底和第二基底可以预涂布状态储存。或者，涂布过程可作为分析工作流程的一部分进行。在一些实施方案中，试剂为透化试剂。在一些实施方案中，试剂为透化酶、缓冲液、去污剂或其任何组合。在一些实施方案中，透化酶为胃蛋白酶。在一些实施方案中，试剂为干燥的试剂(例如，不含水分或液体的试剂)。在一些情况下，包含样品(例如，组织学组织切片)的基底是水合的。可通过使样品与试剂介质例如不包含透化试剂的缓冲液接触来水合样品。在一些实施方案中，在第一基底和第二基底以夹层式配置对准时执行水合。
在一些情况下，生物样品和阵列的对准部分与间隙1207中的试剂介质1205接触约1分钟。在一些情况下，生物样品和阵列的对准部分与试剂介质1205接触约5分钟。在一些情况下，生物样品和阵列的对准部分与间隙1207中的试剂介质1205接触约1分钟、约5分钟、约10分钟、约12分钟、约15分钟、约18分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约36分钟、约45分钟、或约一小时。在一些情况下，生物样品和阵列的对准部分与试剂介质1205接触约1-60分钟。在一些情况下，生物样品和阵列的对准部分与试剂介质1205接触约30分钟。
在一些实施方案中，在样品与透化剂之间的初始接触之后，可在完成样品的透化之前(例如，通过打开样品保持器)使透化剂脱离与样品的接触。例如，在一些实施方案中，仅一部分样品被透化，并且仅样品中的一部分分析物可以被特征阵列捕获。在一些情况下，被捕获并可用于检测的分析物的量的减少可通过样品的不完全透化导致的横向扩散的减少来抵消。一般来说，测定的空间分辨率由分析物在横向方向(即，与样品表面的法线方向正交)上的扩散程度决定。第一基底上的样品与第二基底上的特征阵列之间的距离越大，则横向方向上扩散的程度就越大，伴随的分辨率损失也越大。从最靠近特征阵列的样品部分释放的分析物具有较短的扩散路径，并因此不会像来自距离特征阵列最远的样品部分的分析物那样横向扩散那么远。因此，在一些情况下，可使用样品的不完全透化(通过减少透化剂与样品之间的接触时间)来在测定中保持足够的空间分辨率。
在一些情况下，装置配置为控制第一基底和第二基底的温度。在一些实施方案中，将第一构件和第二构件的温度降低到低于室温的第一温度(例如，25摄氏度)(例如，20摄氏度或更低、15摄氏度或更低、10摄氏度或更低、5摄氏度或更低、4摄氏度或更低、3摄氏度或更低、2摄氏度或更低、1摄氏度或更低、0摄氏度或更低、-1摄氏度或更低、-5摄氏度或更低)。在一些实施方案中，装置包括温度控制系统(例如，加热和冷却传导线圈)以控制样品保持器的温度。或者，在其他实施方案中，样品保持器的温度外部控制(例如，经由制冷或热板)。在第一步中，设置到或在第一温度下的第二构件接触第一基底，而设置到或在第一温度下的第一构件接触第二基底，从而降低第一基底和第二基底的温度至第二温度。在一些实施方案中，第二温度等于第一温度。在一些实施方案中，第一温度低于室温(例如，25摄氏度)。在一些实施方案中，第二温度在约-10摄氏度至约4摄氏度的范围内。在一些实施方案中，第二温度低于室温(例如，25摄氏度)(例如，20摄氏度或更低、15摄氏度或更低、10摄氏度或更低、5摄氏度或更低、4摄氏度或更低、3摄氏度或更低、2摄氏度或更低、1摄氏度或更低、0摄氏度或更低、-1摄氏度或更低、-5摄氏度或更低)。
在一个示例性实施方案中，使第二基底与透化试剂接触。在一些实施方案中，透化试剂是干燥的。在一些实施方案中，透化试剂为凝胶或液体。同样在示例性实施方案中，生物样品与缓冲液接触。将第一基底和第二基底两者都置于较低的温度下以减慢扩散和透化效率。或者，在一些实施方案中，样品可直接与液体透化试剂接触而不由于基底处于第二温度下而引起不希望的透化引发。在一些实施方案中，低温减慢或防止透化的引发。在第二步中，将样品保持器和基底保持在低温下(例如，第一或第二温度下)继续减慢或防止样品的透化。在第三步中，将样品保持器(和因此第一基底和第二基底)加热以引发透化。在一些实施方案中，将样品保持器加热到第三温度。在一些实施方案中，第三温度高于室温(例如，25摄氏度)(例如，30摄氏度或更高、35摄氏度或更高、40摄氏度或更高、50摄氏度或更高、60摄氏度或更高)。在一些实施方案中，从样品的透化组织释放的分析物扩散到第二基底的表面并被捕获在第二基底的阵列(例如，加有条形码的探针)上。在第四步中，将第一基底和第二基底分离(例如，拉开)并停止温度控制。
在一些实施方案中，在第一基底或第二基底(或两者)包括孔的情况下，可向一些或全部孔中引入透化溶液，并且可通过关闭样品保持器而使样品和特征阵列接触来进行样品的透化。在某些实施方案中，可将透化溶液浸泡到水凝胶膜中，所述水凝胶膜直接施加到样品，和/或浸泡到阵列的特征(例如，珠)中。当第一基底和第二基底以夹层型配置对准时，透化溶液将促进分析物从样品向阵列的迁移。
在某些实施方案中，可将不同的透化剂或不同浓度的透化剂注入到阵列特征(例如，珠)中或注入到如上所述水凝胶层中。通过局部改变一种或多种透化试剂的性质，可在空间上调节从样品捕获分析物的过程。
在一些情况下，分析物从生物样品向第二基底的迁移是被动的(例如，经由扩散)。或者，在某些实施方案中，分析物从生物样品的迁移是主动执行的(例如，通过施加电场以促进迁移的电泳)。在一些情况下，第一基底和第二基底可包括导电环氧树脂。来自电源的电线可连接到导电环氧树脂，从而允许用户施加电流并在第一基底和第二基底之间产生电场。在一些实施方案中，与在不施加电场的情况下(例如，经由两个基底的手动对准)随机扩散到匹配的基底上相比，电泳迁移导致更高的分析物捕获效率和被捕获分析物的更好空间保真度(例如，在特征阵列上)。示例性的电泳迁移方法，包括图6-9中示意的那些，见述于WO2020/176788中，包括图14A-14B、15、24A-24B和25A-25C，该文献通过引用整体并入本文。
当分析物从样品向特征阵列迁移并在大致平行于其上安装样品的第一基底的表面的横贯(例如，横向)方向上发生扩散迁移分量时可能发生空间分辨率的损失。为了解决这种分辨率损失，在一些实施方案中，可向样品或向特征阵列应用沉积在具有各向异性扩散的材料上或注入到具有各向异性扩散的材料中的透化剂。第一基底和第二基底由样品保持器对准并接触。包含注入到各向异性材料中的透化溶液的透化层位于第二基底上。
在一些实施方案中，特征阵列可构建在注入了透化剂的水凝胶层顶上。水凝胶层可安装在第二基底上，或替代地，水凝胶层本身可充当第二基底。当第一基底和第二基底对准时，透化剂扩散出水凝胶层并穿过特征阵列或围绕特征阵列到达样品。来自样品的分析物迁移至特征阵列。特征阵列与样品之间的直接接触有助于减少分析物的横向扩散，从而减轻如果分析物的扩散路径较长会发生的空间分辨率损失。
空间分析工作流程可包括本文描述的夹层型过程，例如，如图12中所述的过程。在一些实施方案中，工作流程包括提供包含生物样品的第一基底。在一些实施方案中，工作流程包括将生物样品安装到第一基底上。在其中生物样品为组织样品的一些实施方案中，工作流程包括组织样品的切片(例如，低温切片)。在一些实施方案中，工作流程包括固定步骤。在一些情况下，固定步骤可包括用甲醇固定。在一些情况下，固定步骤包括福尔马林(例如，2％的福尔马林)。
在一些实施方案中，使用任何本文描述的方法对第一基底上的生物样品染色。在一些情况下，对生物样品成像，从而捕获在染色步骤期间产生的染色图案。在一些情况下，生物样品然后在双载片过程1201之前被脱色。
可使用已知的染色技术来对生物样品染色，包括但不限于Can-Grunwald、Giemsa、苏木精和曙红(H&E)、苏木精、Jenner′s、Leishman、Masson’s trichrome、Papanicolaou、Romanowsky、银、苏丹染料、Wright’s和/或Periodic Acid Schiff(PAS)染色技术。PAS染色通常在福尔马林或丙酮固定之后执行。在一些实施方案中，可使用如本文中别处所述的可检测标签(例如，放射性同位素、荧光团、化学发光化合物、生物发光化合物和染料)对生物样品染色。在一些实施方案中，仅使用一种类型的染色剂或一种技术来对生物样品染色。在一些实施方案中，染色包括生物染色技术如H&E染色。在一些实施方案中，染色包括使用苏木精的生物染色。在一些实施方案中，染色包括使用荧光偶联抗体鉴定分析物，例如通过免疫荧光法。在一些实施方案中，使用两种或更多种不同类型的染色剂或者两种或更多种不同的染色技术来对生物样品染色。例如，可通过使用一种技术(例如，H&E染色和亮场成像)染色和成像来制备生物样品，然后使用另一种技术(例如，IHC/IF染色和荧光显微镜法)对同一生物样品染色和成像。在一些情况下，对第一基底上的生物样品染色。
在一些情况下，用于免疫荧光法的方法包括封闭步骤。封闭步骤可包括使用封闭探针来减少抗体的非特异性结合。封闭步骤可任选地还包括使生物样品与去污剂接触。在一些情况下，去污剂可包括Triton X-100TM。所述方法还可包括抗体孵育步骤。在一些实施方案中，抗体孵育步骤引起抗体与生物样品中的目的抗原的选择性结合。在一些实施方案中，抗体与寡核苷酸缀合(例如，如本文所述的寡核苷酸-抗体缀合物)。在一些实施方案中，抗体不与寡核苷酸缀合。在一些实施方案中，所述方法还包括抗体染色步骤。抗体染色步骤可包括免疫染色的直接方法，其中标记抗体与被染色的分析物直接结合。或者，抗体染色步骤可包括免疫染色的间接方法，其中第一抗体与被染色的分析物结合，而第二标记抗体与第一抗体结合。在一些实施方案中，抗体染色步骤在双载片空间阵列组装之前执行。在其中在抗体孵育步骤中使用寡核苷酸-抗体缀合物的一些实施方案中，所述方法不包括抗体染色步骤。
在一些情况下，所述方法包括对生物样品成像。在一些情况下，成像在双载片组装之前进行。在一些情况下，成像在组装双载片配置的同时进行。在一些情况下，成像在生物样品的透化期间进行。在一些情况下，使用高分辨率技术(例如，具有300每平方英寸点数(dpi)或更大)捕获图像。例如，可使用亮场成像(例如，在苏木精或H&E染色剂环境中)或使用荧光显微镜法检测附着的标记来捕获图像。在一些情况下，使用例如共聚焦显微镜法临时捕获高分辨率图像。在一些情况下，捕获低分辨率图像。可在工作流程的任何点处捕获低分辨率图像(例如，约72dpi并通常具有RGB颜色设置的图像)，包括但不限于染色、脱色、透化、双载片组装和分析物的迁移。在一些情况下，在生物样品的透化期间拍摄低分辨率图像。
在一些实施方案中，通过免疫荧光法确定生物样品中一种或多种分析物的位置。在一些实施方案中，一个或多个可检测标记(例如，荧光团标记的抗体)与由第一载片上的探针捕获(杂交到)的所述一种或多种分析物结合，并通过在合适的条件下检测标记来确定所述一种或多种分析物的位置。在一些实施方案中，使用一种或多种荧光团标记的抗体来缀合至与第一载片上的探针缔合的部分或与第一载片上的探针杂交的分析物。在一些情况下，当荧光团被合适波长的光激发时，通过对荧光团标记的抗体成像来确定所述一种或多种分析物的位置。在一些实施方案中，通过将免疫荧光法数据与生物样品的图像相关联来确定生物样品中所述一种或多种分析物的位置。在一些情况下，在整个透化步骤中对组织成像。
在一些情况下，可对生物样品脱色。在一些情况下，在生物样品的透化之前进行脱色。仅作为实例，H&E染色可通过在HCl中洗涤样品来脱色。在一些情况下，H&E染色剂的苏木精通过在HCl中洗涤样品来脱色。在一些实施方案中，脱色可包括在HCl中洗涤1、2、3次或更多次。在一些实施方案中，脱色可包括向下游溶液(例如，透化溶液)添加HCl。
在本文公开的任何方法之间，所述方法可包括洗涤步骤(例如，用SSC(例如，0.1xSSC))。洗涤步骤可执行一次或多次(例如，在本文公开的步骤之间执行1x、2x、3x)。在一些情况下，洗涤步骤执行约10秒、约15秒、约20秒、约30秒或约一分钟。在一些情况下，进行三次洗涤，每次20秒。在一些情况下，洗涤步骤在对样品染色之前、对样品脱色之后、使样品透化之前、使样品透化之后进行或其任何组合。
在一些情况下，在夹层型过程1201之后，分离第一基底和第二基底(例如，使得它们不再以夹层型配置对准)。在一些实施方案中，可在分离第一基底和第二基底之后对捕获的分析物执行后续分析(例如，cDNA合成、文库制备和测序)。
在一些实施方案中，将连接产物或含有甲基化衔接子的核酸从第一基底转移到第二基底的过程在本文中可互换地称为“夹层型或夹层式过程”或“双载片过程”。双载片过程进一步见述于PCT专利申请公开号WO2020/123320中，该专利申请通过引用整体并入。
脱氨核酸的释放、在阵列上的捕获和甲基化状态的确定
在一些实施方案中，本文描述的方法还包括使用本文描述的夹层型方法从第一基底上的分析物例如核酸释放连接产物并在第二基底上捕获。在一些实施方案中，释放发生在将连接产物捕获到空间阵列上的捕获探针之前。
在一些情况下，通过加热样品使连接产物与分析物去杂交。在一些情况下，连接产物在约50℃、约55℃、约60℃、约65℃、约70℃或约75℃下去杂交。在一些情况下，以电化学方式使连接产物与分析物去杂交。在一些情况下，使用包含碱的溶液使连接产物去杂交。在一些情况下，碱为氢氧化钾(KOH)。在一些情况下，碱为氢氧化钠(NaOH)。在一些情况下，为了在此步骤之后恢复中性pH，可添加pH低于7(例如，pH为5、5.5、6、6.5)的酸(例如，弱酸)。
如上所述，在连接产物的释放之后，其可(主动地或被动地)迁移至第二基底并可被第二基底上的阵列捕获。
在一些情况下，第二基底包含阵列。在一些情况下，阵列包括多个捕获探针，每个捕获探针包括捕获结构域和空间条形码。在一些实施方案中，捕获探针在5’末端处附加到基底。在一些实施方案中，所述多个捕获探针均匀地分布在基底的表面上。在一些实施方案中，所述多个捕获探针位于基底的表面上但不按照图案分布在基底上。在一些实施方案中，基底(例如，第二基底)包括多个捕获探针，其中所述多个捕获探针的捕获探针包含捕获结构域和空间条形码。
在一些实施方案中，捕获结构域包括与分析物或分析物衍生分子至少部分地互补的序列。在一些实施方案中，捕获探针的捕获结构域包括poly(T)序列。在一些实施方案中，捕获结构域包括功能结构域。在一些实施方案中，功能结构域包括引物序列。在一些实施方案中，捕获探针包括切割结构域。在一些实施方案中，切割结构域包括来自可光切割连接子、可UV切割连接子、可酶切割连接子或pH敏感的可切割连接子的可切割连接子。
阵列可以是本文描述的任何合适的阵列。在一些实施方案中，阵列包括载片。在一些实施方案中，阵列包括多个捕获探针。在一些实施方案中，所述多个中的捕获探针的5’末端附接到载片。在一些实施方案中，阵列为珠阵列。在一些实施方案中，捕获探针的5’末端附接到珠阵列的珠。在一些实施方案中，捕获探针还包含唯一分子标识符(UMI)。UMI可以是本文描述的任何合适的UMI。在一些实施方案中，UMI相对于捕获探针中的捕获结构域位于5’。在一些实施方案中，捕获探针还包含功能序列。在一些实施方案中，功能结构为引物序列。在一些实施方案中，使用引物序列来延伸捕获探针。
在一些实施方案中，捕获探针的捕获结构域包含与一个或多个探针的突出序列特异性结合的序列。空间条形码可以是本文描述的任何合适的空间条形码。
在一些实施方案中，本文提供的方法包括使生物样品与基底接触，其中捕获探针被附加到基底(例如，直接或间接地固定到基底)。在一些实施方案中，捕获探针包含空间条形码和捕获结构域。在一些实施方案中，连接产物的捕获探针结合结构域与捕获结构域特异性结合。在连接产物与捕获探针杂交之后，连接产物在3’末端处延伸以拷贝捕获探针的另外的组成部分(例如，空间条形码)。在一些实施方案中，如本文所提供的连接产物捕获方法包括生物样品的透化使得捕获探针可更容易地与连接产物杂交(即，与无透化相比)。
在一些情况下，在连接产物与捕获探针杂交之后，本文公开的方法包括使用连接产物作为模板延伸捕获探针；从而生成延伸的捕获探针。在一些情况下，捕获探针被延伸，其中每个腺嘌呤(如果在延伸的探针中存在)与胸腺嘧啶碱基配对。在一些实施方案中，延伸的捕获探针在对应于生物样品中分析物中的未甲基化胞嘧啶的每个位置中包含胸腺嘧啶。在一些实施方案中，甲基化的胞嘧啶，例如5-甲基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶，如果在样品中的分析物中存在，则保持不变。
在一些实施方案中，扩增试剂可添加到第二基底。与扩增试剂一起孵育可产生加有空间条形码的DNA序列。可向载片上的生物样品添加第二链试剂(例如，第二链引物、酶)以引发第二链DNA合成。
所得DNA可从捕获探针模板变性并转移(例如，至清洁的管)用于扩增和/或如本文所述文库构建。在文库构建之前，可经由PCR扩增加有空间条形码的全长DNA。然后可对DNA进行酶促片段化和大小选择，以优化DNA扩增子的大小。可经由末端修复、A-加尾、衔接子连接和PCR添加测序特异性核酸序列如P5、P7、样品索引如i7和i5以及测序引物序列如TruSeqRead 2(Illumina NGS测序工作流程中使用的示例性序列)。然后可使用双端测序对cDNA片段测序，使用TruSeq Read 1和TruSeq Read 2作为测序引物位点。在一些情况下，使用任何本文描述的方法对DNA文库测序。
在一些实施方案中，可对捕获探针、连接产物或其补体和/或分析物/甲基化衔接子测序。在一些情况下，这使用测定步骤执行。在一些情况下，测定步骤包括对(i)分析物的全部或部分序列或其补体和(ii)空间条形码的全部或部分序列或其补体测序。测序可使用本文描述的任何合适的方法执行。在一些实施方案中，测序为高通量测序。在一些实施方案中，测序为边杂交边测序。在一些实施方案中，测序为边合成边测序。在一些实施方案中，测序为边连接边测序。在一些实施方案中，测序为纳米孔型测序。
在一些实施方案中，本文描述的方法还包括将分析物转移至空间阵列(例如，基底上的空间阵列)。在一些实施方案中，所述方法还包括其中分析物迁移至基底的迁移步骤。在一些实施方案中，迁移为主动迁移步骤。例如，迁移通过微流体系统或试剂的浓度梯度进行。在一些实施方案中，主动迁移通过电泳手段实现。在一些实施方案中，迁移为被动迁移步骤。例如，迁移在重力下进行。在一些实施方案中，分析物为连接产物(例如，连接探针)。在一些实施方案中，分析物是衔接的(例如，标签化的)核酸片段。在一些实施方案中，所述衔接的(例如，标签化的)核酸片段是脱氨的。
在一些实施方案中，甲基化胞嘧啶的鉴定指示分析物例如核酸的甲基化状态。在一些实施方案中，分析物的甲基化状态由分析物中甲基化胞嘧啶占所有胞嘧啶的百分比指示。在一些实施方案中，本文描述的方法还包括将分析物的测定序列与分析物的参考序列例如未脱氨情况下的分析物序列进行比较。在一些实施方案中，所述比较包括鉴定分析物的测定序列中的胸腺嘧啶并与分析物的参考序列中的对应位置中的核苷酸进行比较，并且使用本文描述的方法确定测定序列中的一个或多个胸腺嘧啶是未甲基化的胞嘧啶。在一些实施方案中，分析物例如DNA中的一种或多种胞嘧啶可以是甲基化的胞嘧啶。在一些实施方案中，分析物的测定序列包含一种或多种胞嘧啶，其中所述一种或多种胞嘧啶为甲基化的胞嘧啶。在一些实施方案中，分析物中约0.0001％至约50％(例如，约0.0001％至约0.001％、约0.001％至约0.01％、约0.01至约0.1％、约0.1％至约0.2％、约0.2％至约0.3％、约0.3％至约0.4％、约0.4％至约0.5％、约0.5％至约0.6％、约0.6％至约0.7％、约0.7％至约0.8％、约0.8％至约0.9％、约0.9％至约1％、约1％至约2％、约2％至约3％、约3％至约4％、约4％至约5％、约5％至约6％、约6％至约7％、约7％至约8％、约8％至约9％、约9％至约10％、约10％至约15％、约15％至约20％、约20％至约25％、约25％至约30％、约30％至约35％、约35％至约40％、约40％至约45％、或约45％至约50％)的胞嘧啶是甲基化的。在一些实施方案中，分析物中没有胞嘧啶是甲基化的。
在一些情况下，可测定甲基化核苷酸的百分比或丰度并转换为图像如热图，如图11B中所示。在一些情况下，通过使用如测序结果所提供的捕获探针中空间条形码的位置来确定甲基化核苷酸(例如，胞嘧啶)的位置，基于甲基化核苷酸(例如，胞嘧啶)的百分比或甲基化核苷酸(例如，胞嘧啶)的丰度来生成地图。
在一些实施方案中，本文提供的方法包括将组织样品中某个位置处的分析物的甲基化状态与参考组织样品中参考位置的DNA甲基化状态进行比较。在一些实施方案中，参考位置为健康组织中的位置，例如对应于获得组织样品的组织的健康组织。在一些实施方案中，参考位置为非癌组织中的位置。在一些实施方案中，参考位置为非肿瘤组织中的位置。在一些实施方案中，参考位置为组织样品中没有异常如肿瘤、癌症或疾病的位置。在一些实施方案中，参考位置为样品中鉴定为患有癌症的位置。在一些情况下，参考位置是包括肿瘤的位置。
在一些实施方案中，组织样品中分析物的甲基化状态不同于参考组织样品中的参考位置中分析物的甲基化状态。在一些实施方案中，组织样品中分析物的甲基化高于参考位置中分析物的甲基化。在一些实施方案中，组织样品中分析物的甲基化低于参考位置中分析物的甲基化。在一些情况下，分析物的特定胞嘧啶的甲基化状态不同于参考位置处分析物中的胞嘧啶。在一些情况下，与参考位置中的相应胞嘧啶相比，甲基基团位于特定的胞嘧啶处。在一些情况下，与参考位置中胞嘧啶上存在的甲基基团相比，在特定的胞嘧啶处不存在甲基基团。在一些情况下，与参考位置中的相应胞嘧啶相比，分析物的甲基化状态包括至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个或更多个甲基基团。在一些情况下，与参考组织样品的参考位置中的相应胞嘧啶相比，分析物的甲基化状态不包括至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个或更多个甲基基团。
试剂盒和组合物
在一些实施方案中，本文还提供了试剂盒和组合物，其包含一种或多种试剂以检测生物样品中核酸的甲基化状态。
在一些情况下，试剂盒或组合物包含如本文所述的第一基底。在一些情况下，试剂盒或组合物包含如本文所述的第二基底。在一些情况下，试剂盒或组合物包含用于从生物样品释放一种或多种核酸和/或探针并允许所述一种或多种核酸和/或探针迁移至第二基底的手段。在一些实施方案中，试剂盒或组合物包含包括多个捕获探针的基底，其中所述多个第一捕获探针的捕获探针包含(i)空间条形码和(ii)捕获结构域。
在一些情况下，试剂盒或组合物包含一种或多种用于对核苷酸或核酸脱氨的混合物、试剂或溶液。在一些情况下，所述一种或多种混合物、试剂或溶液为亚硫酸氢钠。
在一些实施方案中，试剂可包括一种或多种抗体(和/或抗原结合抗体片段)、标记的杂交探针和引物。例如，在一些实施方案中，可使用抗体(和/或抗原结合抗体片段)来使组织样品的一个或多个特征可视化(例如，通过使用免疫荧光法或免疫组织化学法)。在一些实施方案中，抗体(和/或抗原结合抗体片段)可以是分析物结合部分，例如作为分析物捕获剂的一部分。例如，在一些实施方案中，试剂盒可包括抗-PMCH抗体，如产品编号HPA046055(Atlas Antibodies)，目录号PA5-25442、PA5-84521、PA5-83802(ThermoFisherScientific)，或产品编号AV13054(MilliporeSigma)。其他可用的可商购获得的抗体对于本领域技术人员将是显而易见的。
在一些实施方案中，标记的杂交探针可用于一种或多种生物标志物和/或候选生物标志物的原位测序中。在一些实施方案中，引物可用于所捕获寡核苷酸分析物的扩增(例如，克隆扩增)。
在一些实施方案中，试剂盒或组合物可包括用于对目标分析物执行DNA标签化的酶系统。酶系统可包括一种或多种转座酶、转座子序列、衔接子序列，单独地或组合到转座体复合物中。在一些实施方案中，所述酶选自转座酶、连接酶、聚合酶；逆转录酶、胞苷脱氨酶和脱甲基酶。
在一些实施方案中，试剂盒或组合物还可包括用于执行任何本文提供的方法或步骤的说明书。在一些实施方案中，试剂盒或组合物可包括具有一个或多个捕获探针的基底，所述捕获探针包含空间条形码和捕获核酸的捕获结构域。在一些情况下，所述方法包括用于对核酸测序的手段。在一些情况下，试剂盒包括用于检测分析物和对分析物测序的试剂。在一些实施方案中，试剂盒或组合物还包括但不限于一种或多种抗体(和/或抗原结合抗体片段)、标记的杂交探针、引物或其任何组合以使组织样品的一个或多个特征可视化。
实施例
实施例1：从载片安装的新鲜冷冻小鼠脑切片到空间阵列载片上的高效分析物捕获
在双载片和对照(非双载片)条件下证实分析物向加有空间条形码的阵列上的捕获和随后的测序。对于双载片条件，使用安装在标准玻璃载片上、含有苏木精/曙红染色的新鲜冷冻小鼠脑切片的存档组织。对于对照条件，使用基因表达阵列载片，其中苏木精/曙红染色的新鲜冷冻小鼠脑切片直接安装到阵列区域上。在这两种条件下，组织切片都经过苏木精脱色步骤。将根据双载片条件处理的载片于37℃短暂干燥，然后连同基因表达载片及包含月桂酰肌氨酸钠和蛋白水解酶K的透化缓冲液一起安装在仪器中。仪器关闭(例如，双载片以夹层型配置一起定位)后，将组织切片透化1分钟。对于根据对照条件处理的组织安装基因表达载片，使用相同的透化缓冲液将切片透化5分钟。对于这两种条件，透化后，将基因表达载片上的捕获的含polyA的mRNA转录物逆转录到cDNA中，然后进行标准测序文库制备和测序。
描绘每个斑点的中值基因和每个斑点的中值UMI计数的结果示出在图13中。
图14中示出了示出Log10 UMI的视觉热图结果。Log10 UMI计数的空间模式在双载片和对照条件间相似。
空间聚类分析(上行1505)和海马转录物Hpca的分析(下行1510)描绘于图15中。空间模式在双载片和对照条件间相当。
实施例2：鉴定分析物的甲基化状态的方法。
图10为用于鉴定生物样品的甲基化状态的本文所述方法的示例性工作流程。
具体而言，提供常规载片(例如，玻璃载片)。将生物样品(例如，组织)放置在载片上，染色并成像。将组织透化，并向组织施加亚硫酸氢盐试剂或脱氨酶。在脱氨过程中，当甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶时，双链DNA片段由于配对丧失而变成单链。在洗涤掉亚硫酸氢盐或脱氨试剂之后，将一个或多个靶向组织中分析物上的目的区域(如CpG岛)的探针与生物样品中的分析物杂交并延伸。探针设计为靶向不具有CG二核苷酸的区域(例如，与不具有CG二核苷酸的区域杂交)。它们还设计为包括与空间阵列上捕获探针的捕获结构域特异性杂交的突出端。在探针与分析物杂交之后，在此实施例中，使用聚合酶延伸探针中的一个，从而产生与杂交探针之间的区域互补的寡核苷酸。连接探针，产生包括与脱氨的目的分析物互补的序列的连接产物。连接产物(通过探针中的一个)包括与空间阵列上的捕获探针互补的序列(例如，突出序列)。
如图10的下方小图中所示，提供载片上的空间阵列，其包括多个具有位置UMI的捕获探针。使用本文描述的合适方法将连接产物转移到空间阵列载片上。使用连接产物的突出端，连接产物与空间阵列载片表面上的捕获探针杂交。使用连接产物作为模板延伸捕获探针。使连接产物变性，并且使用来自捕获探针的引物序列合成多个核酸，所述多个核酸包括UMI和空间条形码的序列或其补体以及分析物上目的区域的序列或其补体。
随后对所述多个核酸测序，测定全部或部分UMI和空间条形码的序列以及分析物上全部或部分目的区域的序列，并进行分析以确定目的区域中每个靶探针的甲基化片段的％(本实施例中为HPCA基因甲基化)。
实施例3：使用标签化样品鉴定分析物中甲基化状态的方法。
图11A-11B为本文描述的方法的示例性工作流程。
如图11A中所示，将生物样品(例如，组织切片)放置在没有捕获探针的常规载片上(在此实施例中，组织任选地被染色和成像)。将组织透化，由与包括甲基化衔接子的转座子复合的转座酶(Tn5)将分析物(例如，DNA)标签化，延伸并连接以产生标签化dsDNA。使用亚硫酸氢盐试剂或脱氨酶将标签化双链DNA脱氨并变性以形成单链标签化DNA。然后将单链标签化DNA转移至载片上的空间阵列，该空间阵列包括多个具有位置条形码和UMI的捕获探针。使用夹板寡核苷酸将转移的单链标签化DNA连接到载片上的捕获探针，以使标签化DNA的末端靠近捕获探针以便发生连接。然后用末端转移酶、dCTP和尿嘧啶友好聚合酶处理所捕获的DNA以向所捕获的DNA添加poly(C)尾，该poly(C)尾充当poly(G)引物的杂交位点以形成多个可扩增的核酸。
如图11B中所示，将这些核酸准备好进行测序，测序，并测定全部或部分UMI和空间条形码的序列以及分析物上全部或部分目的区域的序列。分析数据并在空间上确定DNA片段的甲基化百分比或程度(本实施例中为HPCA基因甲基化)。
实施例4：鉴定分析物的甲基化状态的方法。
图16为本文描述的方法的示例性工作流程。
具体而言，提供包括多个具有位置UMI的甲基化捕获探针(即，甲基化胞嘧啶)的在载片上的阵列。因为捕获探针包括甲基化胞嘧啶，所以捕获探针在脱氨剂的存在下保持完好无损。如图16中所示，将样品(例如，组织)放置在载片上，染色并成像。将组织透化，并向组织施加亚硫酸氢盐试剂或脱氨酶。在脱氨过程中，当甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶时，双链DNA片段由于配对丧失而变成单链。在洗涤掉亚硫酸氢盐或脱氨试剂之后，将一个或多个靶向组织中分析物上的目的区域(如CpG岛)的探针与生物样品中的分析物杂交并延伸。探针设计为靶向不具有CG二核苷酸的区域(例如，与不具有CG二核苷酸的区域杂交)。它们还设计为包括与载片表面上捕获探针的捕获结构域特异性杂交的突出端。在探针与分析物杂交之后，在此实施例中，使用聚合酶延伸探针中的一个，从而产生与杂交探针之间的区域互补的寡核苷酸。连接探针，产生包括与脱氨的目的分析物互补的序列的连接产物。连接产物(通过探针中的一个)包括与阵列上的捕获探针互补的序列(例如，突出序列)。
使用该突出端，连接产物与载片表面上的捕获探针结合。使用连接产物作为模板延伸捕获探针。使连接产物变性，并且使用来自捕获探针的引物序列合成多个核酸，所述多个核酸包括UMI和空间条形码的序列或其补体以及分析物上目的区域的序列或其补体。
随后对这些核酸测序，测定全部或部分UMI和空间条形码的序列以及分析物上全部或部分目的区域的序列，并进行分析以确定目的区域中每个靶探针的甲基化片段的％(本实施例中为HPCA基因甲基化)。
实施例5：使用标签化样品鉴定分析物中甲基化状态的方法。
图17为本文描述的方法的示例性工作流程。
具体而言，提供包括多个具有位置条形码和UMI的甲基化捕获探针(即，甲基化胞嘧啶)的在载片上的阵列。因为捕获探针包括甲基化胞嘧啶，所以捕获探针在脱氨剂的存在下保持完好无损。如图17中所示，将样品(例如，组织)放置在载片上(本实施例中任选地被染色和成像)。将组织透化，由转座酶(与包括甲基化衔接子的转座子复合的Tn5)将分析物(例如，DNA)标签化，延伸并连接以产生标签化dsDNA。使标签化双链DNA变性以形成单链标签化DNA。使用夹板寡核苷酸将单链标签化DNA连接到载片上的捕获探针，以使标签化DNA的末端靠近捕获探针以便发生连接。使用亚硫酸氢盐试剂或脱氨酶对连接产物脱氨。然后用末端转移酶、dCTP和尿嘧啶友好聚合酶处理所捕获的DNA以向所捕获的DNA添加poly(C)尾，该poly(C)尾充当poly(G)引物的杂交位点以形成多个可扩增的核酸。
将这些核酸准备好进行测序，测序，并测定全部或部分UMI和空间条形码的序列以及分析物上全部或部分目的区域的序列。然后分析数据并确定DNA片段的甲基化百分比或程度(本实施例中为HPCA基因甲基化)。
实施例6.使用空间基因表达平台和在液滴中进行全基因组甲基化分析
图18A-18B示出了本文描述的标签化方法的示例性工作流程。
具体而言，使用转座酶(例如，Tn5、Tn7、Mu、Mariner、睡美人等)介导的标签化添加甲基化衔接子或使用酶系链方法进行更有针对性的标签化，来在空间基因表达载片或液滴上实现DNA甲基化分析，例如，通过将转座酶融合至无活性限制性酶比如MspI(识别位点：CCGG，用于简并代表性亚硫酸氢盐测序(RRBS)中，或至Dnmt1，维护甲基转移酶)。
如图18A中所示，通过例如Tn5、MspI-Tn5融合或Dnmt1-Tn5融合经由标签化过程对生物样品中的分析物(例如，DNA)进行片段化和加标签。向DNA片段的3’和/或5’末端添加甲基化R2手柄。
将生物样品(例如，组织样品)透化并通过例如使用夹板寡核苷酸将手柄(例如，X2或R2手柄)连接到DNA片段和载片表面上或液滴中的固体表面上的捕获探针上，使标签化DNA分子与基因表达载片或液滴中的固体支撑物上的捕获探针阵列结合。
使用包括5’甲基CTP的dNTP混合物延伸连接的DNA片段，并且使用变性试剂(例如，KOH)使延伸的DNA片段变性并从载片或液滴中的固体支撑物移除。
用脱氨试剂(例如，亚硫酸氢盐试剂)处理变性的DNA片段。手柄和捕获探针上的条形码经过预甲基化，因此它们不会受到脱氨过程的影响。对于靶向捕获，使用探针组来富集差异甲基化区域(DMR)。市售探针组如Agilent SureSelect XT Human Methyl-Seq panel(Agilent，Santa Clara，CA)可用于本文描述的方法中。
用合适的聚合酶如Takara EpiTaq HS(Takara，Mountain View，CA)使用索引化PCR(indexing PCR)扩增脱氨DNA片段。任选地，在测序之前捕获扩增的DNA片段并去除线粒体DNA。
实施例7：鉴定分析物中甲基化状态的方法。
图19A示出了本文使用的示例性工作流程。特别地，将小鼠脑组织样品切片并放置在显微镜载片上。固定组织切片1901，用H&E染色，并成像。在用HCl脱色之后，在室温下用在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的蛋白酶透化样品15分钟。在室温下用包含RNAse的溶液处理组织切片15分钟以便去除可能与DNA竞争以与阵列上的捕获探针杂交的任何RNA。然后用无核酸酶的水洗涤样品，并进行酶促脱氨(New England
Figure BDA0004088438550000691
Inc.)。具体而言，将Tet甲基胞嘧啶双加氧酶2(TET2)在溶液中混合至1x浓度，并将样品于37℃孵育1小时。然后在1x SSC中洗涤样品。之后，将样品在20％甲酰胺中于85℃孵育10分钟。将样品用载脂蛋白B mRNA编辑酶、催化多肽(APOBEC)于37℃处理4小时以便将脱氨胞嘧啶转化为尿嘧啶。在用2x SSC的洗涤步骤之后，使用DNA聚合酶和引物1902扩增样品中的核酸1903，引物包含随机六聚体(例如，随机子(randomer))和多胸腺嘧啶(n＝30胸腺嘧啶核苷酸)突出端。将图19B中示出并包含脱氨序列、随机子序列、poly-A尾和模板转换寡核苷酸(TSO)的扩增核酸用KOH的溶液变性5分钟。
将包括具有带多胸腺嘧啶序列的捕获结构域的捕获探针的阵列夹在样品上1904。将组织切片透化并将变性核酸捕获在阵列上，于37℃保持30分钟。使用DNA聚合酶来延伸捕获探针1905，使用所捕获的核酸作为模板。之后，执行qPCR；将所得扩增产物片段化、编索引并测序1906。
图20和21提供了两个样品的电泳图概要。在图20中，在DNA扩增和1X固相可逆固定(SPRI)清理之后对小鼠脑组织样品脱氨，电泳图证实了如所预期的来自基于随机子的扩增的扩增产物范围。图21示出了在1∶10稀释最终文库之后的电泳图，并进行了额外的SPRI清理，由此聚焦于约400个碱基对片段的测序文库。经由测序，图20和21中的曲线图示出获得了范围为400-700个碱基对的序列。此外，如图22中所示，测序数据显示腺嘌呤核苷酸的增加以及胞嘧啶和鸟嘌呤的减少。这些数据证实了一个概念验证，即可对生物样品脱氨并且可将来自生物样品的核酸捕获在空间阵列上，测序并分析。因此，使用这里的方法，可以在空间上检查生物样品中的甲基化模式。

Claims (102)

1.一种用于鉴定生物样品中分析物的甲基化状态的方法，所述方法包括：
(a)使所述生物样品与包括多个捕获探针的阵列接触，其中所述多个捕获探针中的捕获探针包含(i)空间条形码和(ii)包含至少一个甲基化胞嘧啶的捕获结构域；
(b)使所述生物样品中的所述分析物脱氨；
(c)使所述分析物与包括第一探针和第二探针的多个探针接触，其中
所述第一探针包含(i)与所述分析物的至少第一序列互补的序列和(ii)与所述捕获结构域互补的序列；并且
所述第二探针包含与所述分析物的至少第二序列互补的序列：
(d)连接所述第一探针和所述第二探针，从而生成连接产物：
(e)将所述连接产物与所述捕获探针杂交：
(f)使用所述连接产物作为模板延伸所述捕获探针：从而生成延伸的捕获探针：以及
(g)测定(i)所述空间条形码的全部或部分序列或其补体，和(ii)所述延伸的捕获探针的全部或部分序列或其补体，并且使用(i)和(ii)的测定序列来鉴定所述生物样品中所述分析物的甲基化状态。
2.根据权利要求1所述的方法，其中第一寡核苷酸和第二寡核苷酸在间隔至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个核苷酸的序列处与所述分析物杂交。
3.根据权利要求1或2所述的方法，所述方法还包括在步骤(c)之后延伸所述第一寡核苷酸和/或所述第二寡核苷酸。
4.根据权利要求3所述的方法，其中使用聚合酶延伸所述第一探针和/或第二探针。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括从所述分析物释放所述连接产物。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述释放发生在所述连接产物与所述捕获探针杂交之前。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括，在步骤(b)之前，使所述生物样品与透化试剂接触。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一探针和/或所述第二探针包含与所述分析物上不具有CG二核苷酸的序列结合的序列。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在步骤(b)和步骤(c)之间洗涤所述生物样品。
10.一种用于鉴定生物样品中DNA的甲基化状态的方法，所述方法包括：
(a)向所述生物样品提供一个或多个转座体，其中所述转座体包含甲基化衔接子，条件是其中一个或多个甲基化衔接子被插入到DNA中，从而生成包含甲基化衔接子的标签化DNA片段；
(b)使所述标签化DNA片段与包括多个捕获探针的阵列接触，其中所述多个捕获探针中的捕获探针包含空间条形码，其中如果所述捕获探针包含一个或多个胞嘧啶，则其中所述一个或多个胞嘧啶为甲基化胞嘧啶；
(c)将包含所述标签化DNA片段和所述一个或多个甲基化衔接子的序列连接至所述捕获探针，从而产生连接产物；
(d、)使所述连接产物脱氨；以及
(e)测定(i)所述空间条形码的全部或部分序列或其补体，和(ii)所述连接产物的全部或部分序列或其补体，并且使用(i)和(ii)的测定序列来鉴定所述生物样品中DNA或其一部分的甲基化状态。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述连接包括添加夹板寡核苷酸，所述夹板寡核苷酸包含
(i)与所述捕获探针的一部分特异性结合的序列；和
(ii)与所述连接产物的一部分特异性结合的序列。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述夹板寡核苷酸包含与所述一个或多个甲基化衔接子的一部分特异性结合的序列。
13.根据权利要求10-12中任一项所述的方法，其中转座酶为Tn5转座酶或其功能衍生物或者Tn7转座酶或其功能衍生物。
14.根据权利要求10-13中任一项所述的方法，其中所述一个或多个甲基化衔接子包含第一甲基化衔接子和第二甲基化衔接子。
15.根据权利要求10-14中任一项所述的方法，所述方法还包括将所述连接产物与末端转移酶和多个脱氧胞苷三磷酸(dCTP)分子一起孵育，从而在3′末端处延伸所述连接产物。
16.根据权利要求15所述的方法，所述方法还包括扩增所述连接产物。
17.根据权利要求15或16所述的方法，所述方法还包括使用与聚-半胱氨酸序列互补的引物序列在所述连接产物的3’末端处扩增所述连接产物。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述连接包括酶促连接或化学连接。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述酶促连接利用连接酶。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述连接酶为SplintR连接酶、单链DNA连接酶或T4 DNA连接酶中的一种或多种。
21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括其中所述分析物迁移至基底的迁移步骤。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述迁移步骤为主动迁移步骤，所述主动迁移步骤包括向基因组DNA施加电场。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述迁移步骤为被动迁移步骤。
24.一种在第一基底上鉴定生物样品中核酸的甲基化状态的方法，所述方法包括：
(a)使所述核酸脱氨；
(b)将第一探针和第二探针与所述核酸杂交，其中：
所述第一探针包含(i)与所述核酸的至少第一序列互补的序列和(ii)与阵列上的捕获探针的捕获结构域互补的序列；并且
所述第二探针包含与所述核酸的至少第二序列互补的序列；
(c)连接所述第一探针和所述第二探针以生成连接产物；
(d)将所述第一基底与包含所述阵列的第二基底对准，使得所述生物样品的至少一部分与所述阵列的至少一部分对准，其中所述阵列包括多个捕获探针，其中所述多个捕获探针的捕获探针包含：(i)空间条形码和(ii)所述捕获结构域；
(e)当所述生物样品与所述阵列的至少一部分对准时，(i)从分析物释放所述连接产物和(ii)将所述连接产物从所述生物样品迁移至所述阵列；以及
(f)用所述捕获结构域捕获所述连接产物。
25.根据权利要求24所述的方法，所述方法还包括测定(i)所述空间条形码的全部或部分序列或其补体和(ii)所述连接产物的全部或部分序列或其补体。
26.根据权利要求25所述的方法，所述方法还包括使用(i)和(ii)的测定序列来鉴定所述生物样品中所述核酸的甲基化状态。
27.根据权利要求24-26中任一项所述的方法，其中所述第一探针与所述核酸至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％互补。
28.根据权利要求24-27中任一项所述的方法，其中所述第一探针的长度为约15至约120个核苷酸。
29.根据权利要求24-28中任一项所述的方法，其中所述第一序列的长度为约10至约60个核苷酸。
30.根据权利要求24-29中任一项所述的方法，其中所述第二探针与所述核酸至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％互补。
31.根据权利要求24-20中任一项所述的方法，其中所述第二探针的长度为约15至约120个核苷酸。
32.根据权利要求24-31中任一项所述的方法，其中所述第二序列的长度为约10至约60个核苷酸。
33.根据权利要求24-32中任一项所述的方法，其中所述第一序列和所述第二序列为相邻序列。
34.根据权利要求29所述的方法，其中至少一个脱氨核苷酸位于所述第一序列与所述第二序列之间。
35.根据权利要求29所述的方法，其中至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或更多个脱氨核苷酸位于所述第一序列与所述第二序列之间。
36.根据权利要求29或30所述的方法，所述方法还包括使用聚合酶生成延伸的第一探针和/或延伸的第二探针，其中所述延伸的第一探针或所述延伸的第二探针包含与所述第一序列和所述第二序列之间的序列互补的序列。
37.根据权利要求24-36中任一项所述的方法，其中至少一个脱氨核苷酸位于所述第一序列中。
38.根据权利要求24-37中任一项所述的方法，其中所述至少一个脱氨核苷酸位于所述第二序列中。
39.根据权利要求24-38中任一项所述的方法，其中所述释放包括加热所述生物样品。
40.根据权利要求24-39中任一项所述的方法，其中(e)还包括使所述生物样品与包含透化试剂的试剂介质接触，任选地其中所述透化试剂包含蛋白酶。
41.根据权利要求24-35或37-40中任一项所述的方法，其中连接所述第一探针和所述第二探针包括经由连接酶连接所述第一探针和所述第二探针。
42.根据权利要求36-40中任一项所述的方法，其中连接所述第一探针和所述第二探针包括经由连接酶连接：
(a)所述第一探针和所述延伸的第二探针；或
(b)所述延伸的第一探针和所述第二探针。
43.根据权利要求41或42所述的方法，其中所述连接酶选自splintR连接酶、单链DNA连接酶或T4 DNA连接酶。
44.根据权利要求24-43中任一项所述的方法，其中所述第一探针和所述第二探针在邻接的核酸上。
45.根据权利要求24-44中任一项所述的方法，其中所述连接利用夹板寡核苷酸。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述夹板寡核苷酸包含与所述第一探针基本上互补的第一夹板序列和与所述第二探针基本上互补的第二夹板序列。
47.根据权利要求24-46中任一项所述的方法，其中捕获所述连接产物包括将与捕获结构域互补的序列与所述捕获结构域杂交。
48.根据权利要求24-47中任一项所述的方法，其中捕获所述连接产物包括将所述连接产物连接至所述捕获探针。
49.根据权利要求24-48中任一项所述的方法，所述方法还包括使用所述连接产物作为模板延伸所述捕获探针；从而生成延伸的捕获探针。
50.一种在第一基底上鉴定生物样品中核酸的甲基化状态的方法，所述方法包括：
(a)将甲基化衔接子连接至核酸，生成衔接的核酸片段；
(b)使所述衔接的核酸片段脱氨；
(c)将所述第一基底与包含阵列的第二基底对准，使得所述生物样品的至少一部分与所述阵列的至少一部分对准，其中所述阵列包括多个捕获探针，其中所述多个捕获探针的捕获探针包含：(i)空间条形码和(ii)捕获结构域；
(d)当所述生物样品与所述阵列的至少一部分对准时，将所述衔接的核酸片段从所述生物样品迁移至所述阵列；以及
(e)用所述捕获结构域捕获所述衔接的核酸片段。
51.根据权利要求50所述的方法，所述方法还包括测定(i)所述空间条形码的全部或部分序列或其补体和(ii)所述连接产物的全部或部分序列或其补体。
52.根据权利要求51所述的方法，所述方法还包括使用(i)和(ii)的测定序列来鉴定所述生物样品中所述核酸或其一部分的甲基化状态。
53.根据权利要求50-52中任一项所述的方法，其中所述甲基化衔接子通过标签化连接至所述核酸。
54.根据权利要求50-53中任一项所述的方法，其中所述甲基化衔接子在所述核酸的5’末端处连接至所述核酸。
55.根据权利要求50-54中任一项所述的方法，其中所述甲基化衔接子在所述核酸的3’末端处连接至所述核酸。
56.根据权利要求50-55中任一项所述的方法，其中所述甲基化衔接子的长度为至少约10个核苷酸至约50个核苷酸。
57.根据权利要求50-56中任一项所述的方法，其中所述甲基化衔接子包含至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或更多个甲基化胞嘧啶。
58.根据权利要求50-57中任一项所述的方法，其中所述空间条形码包含至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或更多个甲基化胞嘧啶。
59.根据权利要求50-58中任一项所述的方法，其中将所述甲基化衔接子连接至所述核酸包括使用与转座子复合的转座酶将一个或多个甲基化衔接子附接到所述核酸的5’和/或3’末端，其中所述转座酶为Tn5转座酶或其功能衍生物。
60.根据权利要求50-59中任一项所述的方法，其中捕获所述衔接的核酸片段包括将所述衔接的核酸片段与所述捕获结构域杂交。
61.根据权利要求50-60中任一项所述的方法，其中捕获所述衔接的核酸片段包括将所述衔接的核酸片段与所述捕获结构域连接，其中所述连接包括酶促连接或化学连接。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述连接采用夹板寡核苷酸，任选地其中所述夹板寡核苷酸包含与所述衔接的核酸片段基本上互补的第一夹板序列和与所述捕获探针基本上互补的第二夹板序列。
63.根据权利要求50-62中任一项所述的方法，所述方法还包括使用所述衔接的核酸片段作为模板延伸所述捕获探针；从而生成延伸的捕获探针。
64.根据权利要求50-63中任一项所述的方法，所述方法还包括将所述衔接的核酸片段与末端转移酶和多个脱氧胞苷三磷酸(dCTP)分子一起孵育，从而生成延伸的衔接的核酸片段。
65.根据权利要求64所述的方法，所述方法还包括扩增所述延伸的衔接的核酸片段。
66.根据权利要求64或65所述的方法，所述方法还包括使用与聚-半胱氨酸序列互补的引物序列在所述衔接的核酸片段的3′末端处扩增所述延伸的衔接的核酸片段。
67.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物样品为癌症组织样品。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述生物样品来自经用癌症疗法治疗的受试者。
69.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述核酸为DNA。
70.根据权利要求69所述的方法，其中所述DNA为基因组DNA。
71.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物样品为组织样品，任选地其中所述组织样品为固体组织样品，任选地其中所述组织样品为组织切片。
72.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物样品为固定样品、冷冻样品、新鲜样品或新鲜冷冻样品。
73.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物样品为福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样品。
74.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一基底为载片。
75.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一基底为玻璃载片。
76.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一基底不包括捕获探针的阵列。
77.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述脱氨包括使所述生物样品与包含亚硫酸氢钠的组合物接触。
78.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述脱氨包括用酶处理所述生物样品。
79.根据权利要求52所述的方法，其中所述酶为胞苷脱氨酶或脱甲基酶。
80.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二基底为玻璃载片。
81.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述捕获探针的5’末端附接到所述第二基底。
82.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述阵列为珠阵列。
83.根据权利要求82所述的方法，其中所述捕获探针的5’末端附接到所述珠阵列的珠。
84.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述捕获探针还包含唯一分子标识符(UMI)。
85.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述捕获探针还包含一个或多个功能结构域、唯一分子标识符、切割结构域及其组合。
86.根据权利要求24-85中任一项所述的方法，其中所述迁移是主动的。
87.根据权利要求24-85中任一项所述的方法，其中所述迁移是被动的。
88.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中使用聚合酶延伸所述捕获探针。
89.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述测定包括对(i)所述核酸的全部或部分序列或其补体和(ii)所述空间条形码的全部或部分序列或其补体测序。
90.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述甲基化状态包括鉴定约1％至约100％的胞嘧啶包含甲基基团。
91.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括对所述生物样品成像。
92.根据权利要求91所述的方法，其中所述成像在对所述生物样品脱氨之前进行。
93.一种试剂盒，所述试剂盒包含用于执行根据前述权利要求中任一项所述的方法的零件和说明书。
94.根据权利要求93所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含包括多个捕获探针的基底，其中多个第一捕获探针的捕获探针包含(i)空间条形码和(ii)捕获结构域。
95.根据权利要求93或94所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含一种或多种酶。
96.根据权利要求95所述的试剂盒，其中所述一种或多种酶选自转座酶、连接酶、聚合酶；逆转录酶、胞苷脱氨酶和脱甲基酶。
97.根据权利要求93-96中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含转座体复合物，所述转座体复合物包含转座酶、转座子序列和/或衔接子序列。
98.一种组合物，所述组合物包含用于执行根据前述权利要求中任一项所述的方法的试剂。
99.根据权利要求93所述的组合物，其中所述组合物包含包括多个捕获探针的基底，其中多个第一捕获探针的捕获探针包含(i)空间条形码和(ii)捕获结构域。
100.根据权利要求98或99所述的组合物，其中所述组合物包含一种或多种酶。
101.根据权利要求100所述的组合物，其中所述一种或多种酶选自转座酶、连接酶、聚合酶；逆转录酶、胞苷脱氨酶和脱甲基酶。
102.根据权利要求98-101中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含转座体复合物，所述转座体复合物包含转座酶、转座子序列和/或衔接子序列。
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