CN114015569A - 用于高通量微生物学应用的高分辨率系统、试剂盒、设备和方法 - Google Patents

用于高通量微生物学应用的高分辨率系统、试剂盒、设备和方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于高通量微生物学应用的高分辨率系统、试剂盒、设备和方法。可以在微孔中加入一系列独特标签以鉴定一个或多个种类的细胞并定位其中培养每个种类的特定微孔。独特标签可以是核酸分子，其包含用于与靶标核酸片段退火的靶标特异性核苷酸序列和预先确定用于鉴定一个或多个微孔的位置特异性核苷酸序列。可以孵育装置以生长多个细胞，其可以分为分析部分和保留部分。描述了用于培养、筛选和测定来自样品的细胞的相对和/或绝对丰度的高通量方法。

Description

用于高通量微生物学应用的高分辨率系统、试剂盒、设备和 方法
本案是申请日为2016年04月21日、申请号为201680023316.X、发 明名称为“用于高通量微生物学应用的高分辨率系统、试剂盒、设 备和方法”的专利申请的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求于2016年2月24日提交的名称为“使用高密度微 加工阵列的生物库细胞”的美国临时专利申请第62/299,088号、于 2016年2月5日提交的名称为“用于分离、培养、筛选和鉴定细胞 的系统、设备和方法”的美国临时专利申请第62/292,091号和于2015年4月21日提交的名称为“用于分离、培养、筛选和鉴定细胞的系 统、设备和方法”的美国临时专利申请第62/150,677号的优先权权 益，所述临时专利申请的每一个通过引用整体并入本文。
技术领域
本公开总体上涉及微生物学、微加工、化学、光学、机器人和 信息技术的创新。更具体地，本公开涉及用于高通量培养、筛选、 分离、取样和/或鉴定生物实体和/或营养物的系统、设备、试剂盒和 方法。
背景技术
用于培养来自环境和其他样品的生物实体的传统技术和工具通 常缓慢、费力且昂贵。即使使用这些技术和工具，细胞和其他生物 实体仍然常常不能培养成功，造成信息和/或产品机会的缺失。同样， 筛选用于特定代谢物、酶、蛋白质、核酸、表型、突变、代谢途径、 基因、适应性、能力和/或疗效的生物实体群具有挑战性，需要复杂 且昂贵的方法。例如，微生物生活在极其高风险的环境中。为了存 活，微生物已经发展出一套令人惊奇的生化工具，包括新的酶、独 特的代谢产物、创新的遗传途径，以及操控其环境和微生物邻居的策略，这些强有力的解决方案可以带来新的见解和产品(从拯救生 命的抗生素到改善食品生产和安全的肥料)。
发明内容
根据一些实施方案，本公开提供用于精简培养流程、支持高通 量筛选和/或开发新的见解和产品的根据一些实施方案的微生物学系 统、设备、试剂盒和方法。例如，设备可以包括用于接收含有一个 或多个细胞的样品的微加工装置。微加工装置是用于培养一个或多 个细胞的高密度微孔阵列。
在一些实施方案中，可以提供用于培养细胞的具有高密度微孔 阵列的装置。在进一步的实施方案中，可以提供一组用于放入各微 孔或一些微孔的独特标签。或者，所述装置可以提供有已经接种入 各微孔或一些微孔的独特标签。装置和/或独特标签可以单独提供， 或作为试剂盒的一部分提供。例如，试剂盒可以包括用于接收含有 一个或多个细胞的样品的微加工装置，所述微加工装置是用于培养 一个或多个细胞的高密度微孔阵列。试剂盒还可以包括一组用于放 入微孔的独特标签，以鉴别其中培养细胞种类的特定微孔。可以在 高密度微孔阵列的各微孔中一个或多个独特标签。试剂盒可以进一 步包括用于接种具有独特标签的微孔和/或使用独特标签来追踪培养 细胞回到培养它们的特定微孔的说明书。
在一些实施方案中，独特标签可以包括具有靶标特异性核苷酸 序列和用于鉴别微孔本身的位置特异性核苷酸序列的核酸分子，所 述靶标特异性核苷酸序列用于与可能存在于微孔中的细胞或细胞的 特定种类(例如生物体)的靶核酸片段退火。可以在特定微孔中放 入超过一个的独特标签，使得在该特定微孔中存在超过一个的位置 特异性核苷酸序列。即，可以在超过一个的微孔中发现位置特异性 核苷酸序列(例如，预先确定以鉴别高密度微孔阵列中微孔的维度)， 且独特标签可以是多维的。例如，一组独特标签可以是二维的，包 括具有第一位置特异性核苷酸序列的标签和具有第二位置特异性核 苷酸序列的标签，预先确定所述第一位置特异性核苷酸序列以识别 高密度微孔阵列中第一维度的微孔(例如，行)，预先确定所述第 二位置特异性核苷酸序列以识别高密度微孔阵列中第二维度的微孔 (例如，列)。第一位置特异性核苷酸序列和第二位置特异性核苷 酸序列一起鉴别高密度微孔阵列的特定微孔。因此，特定微孔中独 特标签的组合操作以鉴别该微孔。
在一些实施方案中，可以提供用于在装置(包括用于培养细胞 的高密度微孔阵列)的每个或一些微孔中生长和/或筛选细胞的一种 或多种营养物。可以提供一种或多种营养物用于放入全部或一些微 孔，例如直接放入微孔、通过膜和/或在渗透性或半渗透性膜上。或 者，所述装置可以提供有已经放入各微孔或一些微孔中的一种或多 种营养物。营养物可以单独提供、作为培养基的一部分提供，和/或 作为试剂盒的一部分提供。试剂盒可以包括用于为在装置的特定微 孔内培养的细胞提供一种或多种营养物的说明书。例如，试剂盒可 以进一步包括用于培养至少一个种类的至少一个细胞的至少一种营 养物。用于培养至少一个种类的至少一个细胞的至少一种营养物可 以包括或是：来自至少一个种类的至少一个细胞的天然环境的提取 物的成分，源自至少一个种类的至少一个细胞的天然环境的培养基， 配制的与至少一个种类的至少一个细胞的天然环境类似的培养基， 仅培养所述至少一个种类的至少一个细胞的选择培养基，和/或区分 所述至少一个种类的至少一个细胞的鉴别培养基。至少一个种类的 至少一个细胞的天然环境可以是生物组织、生物产品、微生物悬浮 液、空气、土壤、沉积物、活的有机物、饲料、石油、污水和/或水。
在一些实施方案中，可以提供用于将细胞保持在装置(包括用 于培养细胞的高密度微孔阵列)的每个或一些微孔内的膜(例如， 防止交叉污染)。可以用膜来密封一些或全部微孔。或者，所述装 置可以提供有已经密封一些或全部微孔的膜。膜例如可以是不可渗透的、仅气体可渗透的，或允许一种或多种营养物扩散至一个或多 个微孔。装置和/或膜可以单独提供，或作为试剂盒的一部分提供。 例如，试剂盒可以包括用于接收含有至少一个细胞的样品的微加工 装置。试剂盒还可以包括在样品加入微加工装置后，将至少一个细胞保留在高密度微孔阵列的至少一个微孔中的膜。试剂盒可以进一 步包括在微孔中加入样品和/或使用膜将培养细胞保持在培养它们的 特定微孔中的说明书。
在一些实施方案中，提供使用具有用于培养细胞的高密度微孔 阵列的装置来培养细胞的步骤。例如，方法可以包括获得界定用于 培养来自样品的至少一个细胞的高密度微孔阵列的微加工装置，其 可以包括将至少一个独特标签放入高密度微孔阵列的至少一个微 孔，在装置中加入包括一个或多个细胞的样品，和/或向全部或部分 装置应用膜以将细胞保留在其各自的微孔中。在一些实施方案中， 样品在加样前制备。例如，可以稀释样品，使得在高密度微孔阵列 的每个微孔中放入不超过一个细胞。方法还可以包括孵育装置以在 高密度微孔阵列的至少一个微孔中从至少一个细胞生长多个细胞。
在一些实施方案中，公开了用于复制和/或分割在高密度微孔阵 列中培养的细胞的步骤，使得可以修饰和/或破坏一部分细胞用于分 析(例如，扩增和测序)，而可以保留剩余细胞用于将来的取样和/ 或基于从分析获得的信息的用途。例如，方法可以包括将高密度微 孔阵列的至少一个微孔中的多个细胞分割成第一部分的多个细胞和 第二部分的多个细胞。至少一个独特标签可以保持与至少第一部分 的多个细胞一起。分割高密度微孔阵列的至少一个微孔中的多个细 胞包括从高密度微孔阵列的至少一个微孔移除膜，使得一些细胞保 留在高密度微孔阵列的至少一个微孔中，且一些细胞保留在膜上。 或者，可以将膜临时剥离以允许取样或穿过(即，穿孔)进行取样。
在一些实施方案中，公开了用于分析在高密度微孔阵列中培养 的全部或一些细胞的步骤。例如，方法可以包括分析第一部分的多 个细胞以确定至少一个目标种类。待分析的细胞可以处于培养它们 的同一微孔中，附着于覆盖培养它们的微孔的膜，和/或转移至另一 个位置(例如，具有相应的高密度微孔阵列的培养皿或第二装置)。 分析可以包括测定至少一个目标种类的存在或不存在，这可以基于 至少一个核酸和基因选择。例如，可以进行聚合酶链式反应(PCR)， 基于至少一个独特标签的靶标特异性核苷酸序列来扩增细胞中存在 的任何靶标核酸片段。分析可以进一步包括使用下一代测序(NGS) 或任何其他测序类型对任何PCR扩增的靶标核酸片段进行测序的步 骤。可以使用测序来鉴定细胞种类(例如，生物体)和/或在培养细 胞种类的初始高密度微孔阵列中的一个或多个位置。
在一些实施方案中，公开了用于鉴定和/或定位其中培养特定种 类的细胞的高密度微孔阵列的一个或多个微孔的步骤。例如，方法 可以包括基于至少一个独特标签鉴定其中培养至少一个目标种类的 高密度微孔阵列的至少一个微孔。基于对其中培养至少一个目标种 类的高密度微孔阵列的至少一个微孔的鉴定，方法可以包括在第二 部分的多个细胞中定位至少一个目标种类。
在一些实施方案中，公开了用于在培养多个细胞的高密度微孔 阵列中选取或取样一个或多个微孔的步骤。例如，方法可以包括从 特定微孔或与特定微孔相关的膜位置选取至少一个细胞。描述了用 于从超过一个微孔同时选取的装置和方法。
在一些实施方案中，公开了使用具有用于培养细胞的高密度微 孔阵列的装置来筛选细胞的方法。例如，方法可以包括筛选高密度 微孔阵列中培养的细胞以测定目标种类的存在或不存在。如果存在， 方法可以进一步包括从培养细胞的一个或多个微孔中选取一个或多 个目标种类的细胞。方法可以进一步包括基于细胞的代谢物、代谢 途径、酶、蛋白质、核酸、表型、基因、突变、适应性和/或能力进 行试验。如果使用独特标签，方法可以进一步包括使用一个或多个 位置特异性核苷酸序列来鉴定其中培养目标种类的一个或多个微孔。例如，靶标核酸片段可能存在于目标种类中，靶标核酸片段包 括涉及代谢物、代谢途径、酶、蛋白质、核酸、表型、基因、突变、 适应性和/或能力的遗传密码。
在一些实施方案中，公开了使用具有用于培养细胞的高密度微 孔阵列的装置来测定样品中目标种类的相对丰度和/或绝对丰度的方 法。例如，方法可以包括制备样品并将样品加入其中装有一组独特 标签的微孔中，制备样品使得高密度微孔阵列的每个微孔中装有至 少一种细胞的不超过一个细胞。培养后，方法可以包括使用标签来 测定具有至少一个细胞的微孔的第一数量，具有目标种类的微孔的 第二数量，并基于此测定样品中至少一个目标种类的相对丰度。方 法可以进一步包括测定来自样品的细胞总数，并基于总数测定样品 中至少一个目标种类的相对丰度和样品中至少一个目标种类的绝对 丰度。
总体而言，公开了使用界定实验单元的高密度阵列的微加工装 置来培养来自样品的生物实体的系统、设备、试剂盒和方法。生物 实体可以是生物体、细胞、细胞成分、细胞产物和病毒。在一些实 施方案中，超过一种生物实体可以存在于样品中，加入装置和/或加入实验单元。实验单元可以包括一种或多种生物实体和/或一个或多 个独特标签以鉴定与特定实验单元相关的空间信息。独特标签可以 包括结合分子，例如蛋白质、核酸、碳水化合物、脂质和/或药物。 例如，独特标签可以包括用于结合目标生物实体中存在的生物分子的靶标特异性成分。独特标签还可以包括用于鉴定与至少一个实验 单元相关的空间信息的位置特异性成分。可以孵育装置以在实验单 元的高密度阵列中生长多个生物实体。基于至少一个独特标签，可 以分析一种或多种培养的生物实体以鉴定一个或多个种类和/或与其 中培养实体的一个或多个实验单元相关的空间信息。
应当理解，预期上述概念和以下更详细讨论的其他概念(前提 是这些概念互相一致)的所有组合是本文公开的发明主题的一部分。 具体地，预期在本公开末尾出现的要求保护的主题的所有组合是本 文公开的发明主题的一部分。应当理解，本文明确采用的术语也可 以出现在通过引用并入的任何公开内容中，其应被赋予与本文公开 的特定概念最一致的含义。
通过检查以下附图和详细描述，其他系统、方法和特征对本领 域技术人员而言将是显而易见的。所有这些其他的系统、方法和特 征意欲包括于本说明书内，在本发明的范围内，且被所附的权利要 求所保护。
附图说明
本领域技术人员将理解，附图主要是说明性目的，而不意欲限 制本文描述的发明主题的范围。
附图不一定按比例绘制；一些情况下，本文公开的发明主题的 各个方面可能在附图中夸张或放大显示以促进对不同特征的理解。 在附图中，类似的参考字符一般是指类似的特征(例如，功能相似 和/或结构相似的元件)。
图1是说明根据一些实施方案的微加工装置或芯片的透视图。
图2A-2C分别是说明根据一些实施方案的微加工装置或芯片的 维度的顶视图、侧视图和端视图。
图3A和3B分别是说明根据一些实施方案的微加工装置或芯片 的分解视图和顶视图。
图4A和4B是说明根据一些实施方案的膜的示意图。图4C是根据 一些实施方案具有与孔阵列接触形成的印迹的膜表面的图像。
图5A是说明根据一些实施方案从样品分离细胞的方法的流程 图。图5B是说明根据一些实施方案从土壤样品分离细胞的方法的示 意图。
图6是说明根据一些实施方案从样品分离并培养细胞的方法的 流程图。
图7是说明根据一些实施方案从复杂样品分离并培养细胞的方 法的示意图。
图8A-8C是说明根据一些实施方案通过一个针或多个针选取的 示意图。
图9A-9D是示出根据一些实施方案选取孔的图像。
图10A-10D是说明根据一些实施方案用于选取芯片的工具的示 意图。
图11是已经通过薄层琼脂选取的孔的图像，说明根据一些实施 方案通过膜或密封层的选取。
图12是说明根据一些实施方案的芯片1200的横截面的示意图。
图13是说明根据一些实施方案用于筛选的方法的流程图。
图14是说明根据一些实施方案的筛选方法的示意图。
图15是一系列说明根据一些实施方案的筛选实例的图像。
图16A-16C是说明根据一些实施方案从筛选回收的图像。
图17A是说明根据一些实施方案的用于筛选的芯片的分解图。 图17B是根据一些实施方案筛选后的芯片的荧光图像。图17C是示 出了根据一些实施方案，筛选后从芯片选取样品的过程的图像。
图18是说明根据一些实施方案的计数方法的流程图。
图19是说明根据一些实施方案的计数方法的示意图。
图20是说明根据一些实施方案的索引系统的示意图。
图21A-21E是说明根据一些实施方案具有孔特异性化学物的芯 片的示意图。
具体实施方式
本公开整体上涉及用于分离、培养、适应性、取样和/或筛选生 物实体和/或营养物的系统、试剂盒、设备和方法。公开了用于接收 包含至少一个生物实体(例如，至少一个细胞)的样品的微加工装 置(或“芯片”)。术语“生物实体”可以包括但不限于生物体、 细胞、细胞成分、细胞产物和病毒，术语“种类”可以用于描述一 个分类单元，包括但不限于操作分类单元(OTU)、基因型、种系 型、表型、生态型、历史、行为或相互作用、产物、变体和进化上 显著的单元。
细胞可以是古生菌、细菌和真核生物(例如真菌)。例如，细 胞可以是微生物，例如好氧、厌氧或兼性好氧微生物。病毒可以是 噬菌体。其他细胞成分/产物可以包括但不限于蛋白质、氨基酸、酶、 多糖、三磷酸腺苷(ATP)、脂质、核酸(例如DNA或RNA)、核 苷、核苷酸、细胞膜/细胞壁、鞭毛、菌毛、细胞器、代谢物、维生 素、激素、神经递质和抗体。
营养物可以是确定的(例如化学上确定的或合成的培养基)或 不确定的(例如基础或复合培养基)。营养物可以包括或者是实验 室配制的和/或商业制造的培养基(例如，两种或多种化学物的混合 物)的成分。营养物可以包括或者是液体营养培养基(即营养肉汤)， 例如海生菌肉汤、溶菌肉汤(例如Luria肉汤)等的成分。营养物可 以包括或者是液体培养基的成分，其与琼脂混合以形成固体培养基 和/或可商购的制造琼脂板，例如血琼脂。
营养物可以包括或是选择性培养基的成分。例如，选择培养基 可用于只生长某些生物实体或仅具有某些性质(例如耐抗生素或合 成某些代谢物)的生物实体。营养物可以包括或是鉴别培养基的成 分，通过使用特定指示剂(例如中性红、苯酚红、曙红Y，或亚甲蓝)存在下的生化特征来区分一种生物实体与另一种生物实体或其 他种生物实体。
营养物可以包括或是源自天然环境的提取物或培养基的成分。 例如，营养物可以源自对特定类型的生物实体天然的环境，不同环 境或多个环境。环境可以包括但不限于一种或多种生物组织(例如 结缔组织、肌肉、神经、上皮、植物表皮、血管、基本组织等)、 生物流体或其他生物产物(例如羊水、胆汁、血液、脑脊液、耵聍、 渗出物、粪便物、胃液、组织间液、细胞内液、淋巴液、奶、粘液、 瘤胃内容物、唾液、皮脂、精液、汗液、尿液、阴道分泌物、呕吐 物等)、微生物悬浮液、空气(包括例如不同气体含量)、超临界 二氧化碳、土壤(包括例如矿物质、有机物、气体、液体、生物体 等)、沉积物(例如农业的、海洋的等)、活的有机物(例如植物、 昆虫、其他小生物体和微生物)、死的有机物、饲料(例如牧草、 豆类、青贮饲料、作物残渣等)、矿物、油或油产品(例如动物、 植物、石化)、水(例如天然来源的淡水、饮用水、海水等)和/或 污水(例如卫生、商业、工业和/或农业废水和地表径流)。
微加工装置可以界定用于培养至少一种生物实体的高密度微孔 阵列。术语“高密度”可以是指系统或方法在恒定区域内分布大量 实验的能力。例如，包含“高密度”实验单元的微加工装置可以包 括约150个微孔/cm2至约160,000个微孔或更多/cm2，如下进一步讨论。其他实施例示于表1。
表1
Figure BDA0003305145480000101
微加工装置可以包括具有一系列功能层的基底。所述系列的功 能层可以包括第一功能层，其界定第一阵列的实验单元(例如，孔) 和至少一个随后的功能层，其界定前述功能层的每个实验单元的随 后阵列的实验单元(例如微孔)。每个实验单元可以设置为接收和 培养和/或筛选生物实体和/或营养物。具体地，本文所述的系统、试 剂盒、设备和方法可用于自动化和/或高通量筛选针对高密度细胞矩 阵的不同条件。例如，本文所述的系统、试剂盒、设备和方法可用 于测试并比较一种或多种不同营养物对微生物生长的作用，和/或筛 选代谢物、酶活性、突变或其他细胞特征。
图1是说明根据一些实施方案的微加工装置或芯片的透视图。 芯片100包括以显微镜幻灯片格式成形的基底，其上表面102具有 注射成型特征。特征包括四个分开的微孔阵列(微阵列)104以及喷 射标记106。每个微阵列中的微孔以格子图案排列，在芯片100的边 缘周围和微阵列104之间具有无缝隙的边缘。
图2A-2C分别是说明根据一些实施方案的芯片100的维度的顶 视图、侧视图和端视图。图2A中，芯片100的顶面约为25.5mm乘 以75.5mm。图2B中，芯片100的末端约为25.5mm乘以0.8mm。 图2C中，芯片100的侧面约为75.5mm乘以0.8mm。
将样品加入微加工装置后，可以向至少一部分的微加工装置应 用膜。图3A是从根据一些实施方案的图3B中顶视图所示出的微加 工装置300的分解视图。装置300包括容纳例如土壤微生物的具有 孔302的阵列的芯片。膜304置于孔302阵列上方。垫片306置于 膜304上方。具有填充孔310的聚碳酸酯盖308置于垫片306上方。 最后，向盖308应用密封带312。
膜可以覆盖至少一部分的微加工装置，包括一个或多个实验单 元、孔或微孔。例如，将样品加入微加工装置后，可以向高密度微 孔阵列的至少一个微孔应用至少一张膜。可以向微加工装置的多个 部分应用多个膜。例如，可以向高密度微孔阵列的单独的分部应用 单独的膜。
可以将膜连接、附着、部分附着、固定、密封和/或部分密封至 微加工装置，以将至少一种生物实体保留在高密度微孔阵列的至少 一个微孔中。例如，可以使用层压将膜可逆地固定至微加工装置。 可以将膜刺破、剥离、分离、部分分离、移除和/或部分移除以获取高密度微孔阵列的至少一个微孔中的至少一种生物实体。
至少一个实验单元、孔或微孔中的一部分细胞群可以附着至膜 上(经由，例如吸附)。如果这样，可以通过剥离膜取样至少一个 实验单元、孔或微孔中的细胞群，使得至少一个实验单元、孔或微 孔中的所述部分细胞群仍然附着在膜上。
图4A和4B是说明根据一些实施方案的膜的示意图。图4A示 出了芯片400的侧视图，界定了填充有内容物的孔阵列和在孔阵列 上密封芯片400的膜402，使得当从芯片400剥离时，与芯片400 接触的膜402的表面具有各个孔的印迹且具有附着(例如黏住)于 其上的孔内容物的样品，如图4B所示。图4C是根据一些实施方案 具有与孔阵列接触形成的印迹的膜表面的图像。
膜可以是不可渗透的、半渗透的、选择性渗透的、差异性渗透 的和/或部分渗透的，以允许至少一种营养物扩散至高密度微孔阵列 的至少一个微孔中。例如，膜可以包括天然材料和/或合成材料。在 一些实施方案中，选择孔径足够小的膜以将至少一些或全部细胞保 留在微孔中。对于哺乳动物细胞，孔径可以是几微米，且仍然保留 细胞。然而，在一些实施方案中，孔径可以小于或等于约0.2μm，例 如0.1μm。膜直径和孔径取决于材料。例如，可以使用亲水性聚碳酸 酯膜，其直径可以为约10mm至约3000mm，孔径可以为约0.01μm至约30.0μm。不透性膜的孔径接近于0。在具有不透性膜的实施方 案中，任何营养物必须在用膜密封前提供于微孔中。气体可渗透但 液体不可渗透的膜可能允许氧气进入微孔，和二氧化碳从微孔出去。 膜可以具有复杂结构，其孔径可以确定或不确定。然而，孔可以是 纳米尺度。选择膜的其他因素可以包括成本、密封能力和/或灭菌能 力。
基底可以界定从第一表面延伸至与所述第一表面相对的第二表 面的微通道阵列。微通道可以具有在第一表面的第一开口和在第二 表面的第二开口。可以向至少一部分的第一表面应用第一膜，使得 至少一个微通道中的至少一些细胞群附着于第一膜。可以向至少一 部分的第二表面应用第二可拆卸膜，使得至少一个微通道中的至少 一些细胞群附着于第二膜。通过剥离第一膜取样至少一个微通道中 的细胞群，使得至少一个微通道中的至少一些细胞群仍然附着于第 一膜，和/或剥离第二膜，使得至少一个微通道中的至少一些细胞群 仍然附着于第二膜。
术语“高通量”可以是指系统或方法能够实现平行或顺序的大 量实验的快速执行的能力。“高通量”系统的实例可以包括具有细 胞生物学技术的自动化设备以制备、孵育和/或进行大量化学、遗传 性、药理学、光学和/或图像分析，从而筛选一种或多种生物实体的 至少一种代谢物、酶、蛋白质、核酸、表型、突变、代谢途径、基 因、适应性和能力，如本文所讨论。根据一些实施方案，“高通量” 可以是指规模为至少约96个实验至至少约10,000,000个实验的同时 或几乎同时的实验。
本文公开的系统、试剂盒、设备和方法可用于针对生物实体(例 如细胞)矩阵的不同条件的高通量筛选。“孔中孔”概念可以通过 制造(例如，微加工)任何需要或期望的水平的具有多层功能层的 基底或芯片来实现(即，在孔中的孔中的孔中的孔)。第一功能层 可以界定实验单元(例如孔)阵列。每个实验单元通过界定随后的 实验单元(例如微孔)阵列表示第二功能层。这允许在单个芯片上 同时进行多个实验或测试，从而允许高通量操作。
例如，在图3A和3B中，垫片306置于膜304上方，所述膜304 应用于根据一些实施方案的微加工装置300上的孔302的阵列。垫 片306仅具有一个开口。然而，在进一步的实施方案中，可以在装 置(具有或不具有膜)上方放置具有更小开口的多个较小垫片或具 有超过一个更小开口的单个垫片，从而形成位于其中的功能层或具 有随后功能层的较大实验单元阵列或随后的实验单元阵列(例如孔 302)。
使用多层功能层，例如可以同时或几乎同时测试超过一种营养 物或营养制剂。例如，可以使用相同格式来筛选代谢物或细胞的特 殊能力或避免使微生物相较于其他营养物依赖环境衍生的营养物。
实验单元是微加工装置表面的预定位点。例如，可以设计芯片 的表面以将细胞固定在第一阵列的预定位点中。这些预定位点可以 是孔、微孔、微通道和/或指定的固定位点。例如，可以制造表面以 界定微孔阵列。可以通过在基底确定壁或添加壁将阵列分成部分。 例如，可以制造表面以首先界定第一阵列的孔，其中又制造每个孔 的内表面以界定第二阵列的微孔、微通道或固定位点。在另一个实 例中，可以制造表面以界定微孔阵列，向该表面应用另一个基底(例 如琼脂、塑料或另一种材料)以将该表面和由其界定的微孔隔开。每个孔、微孔、微通道和/或固定位点可以设置为接收和生长至少一 个细胞；然而，在使用中，任何给定的孔、微孔、微通道或固定位 点实际上可以接收或不接收和/或生长一个或多个细胞。实验单元的 类型可交换。例如，本文明确描述微孔的实施方案也意欲公开其中 微孔至少部分替换为微通道、固定位点和/或其他类型的实验单元的 实施方案。
微加工装置的一个或多个部分可以用表面化学改性剂选择、处 理和/或涂层以具有特定的表面化学。例如，至少一个部分的基底表 面可以设置为具有第一表面特征或第二表面特征，所述第一表面特 征排斥细胞和/或减少细胞粘附在表面上的倾向，所述第二表面特征 吸引细胞和/或增加细胞粘附在表面上的倾向。根据靶细胞的类型， 材料和/或涂层可以是疏水和/或亲水的。可以处理基底的至少一部分 顶表面以具有第一表面特征，其排斥靶细胞和/或减少靶细胞粘附在 表面上的倾向。同时，可以处理各实验单元、孔或微孔的至少一部 分内表面以具有第二表面特征，其吸引靶细胞和/或增加靶细胞占据 实验单元、孔或微孔的倾向。基底表面可以具有多个部分，其具有 不同表面特征。
可以使用化学气相沉积、电穿孔、等离子体处理和/或电化学沉 积应用表面化学改性剂。表面化学改性剂可以控制表面电位、Lund 电位、ζ电位、表面形态、疏水性和/或亲水性。表面化学改性剂可 以包括盐水、聚电解质、金属、聚合物、抗体和/或等离子体。例如，表面化学改性剂可以包括十八烷基三氯硅烷。表面化学改性剂可以 包括动态共聚物，例如聚氧乙烯(20)失水山梨醇单月桂酸酯和/或 聚乙二醇P(1,13,3-四甲基丁基)-苯基醚。表面化学改性剂可以包 括静态共聚物，例如泊洛沙姆407、聚(L-赖氨酸)、和/或聚(乙 二醇)-聚(L-赖氨酸)嵌段共聚物。
用于筛选针对细胞矩阵的不同条件的设备可以包括具有界定微 孔阵列的表面的基底。微孔阵列的部分可以分成次阵列(例如通过 较大孔或壁)。基底可以微加工。每个微孔可以接收并生长至少一 种生物实体(例如细胞)。所得生物实体(例如细胞)的矩阵可以是生物实体的高密度矩阵。第一阵列和/或第二阵列可以是平面的、 基本上平面的，和/或多平面的(例如在滚轮上)。
术语“高分辨率”可以是指系统或方法区别大量可得实验的能 力。例如，“高分辨率”的系统或方法可以从包含高密度实验单元 的微加工装置选择一个实验单元，其中所述实验单元的直径为约 1nm至约800μm。微加工装置或芯片的基底可以包括约或超过 10,000,000个微孔。例如，微孔阵列可以包括至少96个位置、至少 1,000个位置、至少5，000个位置、至少10,000个位置、至少50,000 个位置、至少100,000个位置、至少500,000个位置、至少1,000,000 个位置、至少5,000,000个位置、或至少10,000,000个位置。
微孔的表面密度为约150个微孔/cm2至约160,000个微孔/cm2或更高。微加工装置或芯片的基底的微孔表面密度为至少150个微 孔/cm2、至少250个微孔/cm2、至少400个微孔/cm2、至少500个微 孔/cm2、至少750个微孔/cm2、至少1,000个微孔/cm2、至少2,500 个微孔/cm2、至少5,000个微孔/cm2、至少7,500个微孔/cm2、至少 10,000个微孔/cm2、至少50,000个微孔/cm2、至少100,000个微孔/cm2、 或至少160,000个微孔/cm2。
微孔的尺寸可以从纳米级(例如直径为约1至约100纳米)到 微米级或更大。例如，各微孔的直径可以为1μm至约800μm，直径 为约25μm至约500μm，或直径为约30μm至约100μm。微孔的直径 可以为约或小于1μm、约或小于5μm、约或小于10μm、约或小于25μm、约或小于50μm、约或小于100μm、约或小于200μm、约或 小于300μm、约或小于400μm、约或小于500μm、约或小于600μm、 约或小于700μm、或约或小于800μm。
微孔的深度可以为约500μm至约5000μm，深度为约1μm至约 500μm，或深度为约25μm至约100μm。微孔的深度可以为约1μm、 约5μm、约10μm、约25μm、约50μm、约100μm、约200μm、约 300μm、约400μm、约500μm、约600μm、约700μm、约800μm、 约1000μm、约1,500μm、约2,000μm、约3,000μm、或约5,000μm。
各微孔的开口可以是圆形、六角形或正方形。各微孔可以包括 侧壁。侧壁的横截面图可以是直的、斜的、和/或弯曲的。可以在高 密度微孔阵列的至少一个微孔中放入以下进一步描述的至少一种独 特的位置特异性标签以促进鉴定种类以及种类与高密度微孔阵列的 特定微孔的联系。至少一种独特标签可以放入和/或置于微孔底部和/ 或微孔的至少一侧。至少一种独特标签可以包括核酸分子，其具有 用于与至少一种生物实体的靶标核酸片段退火的具有靶标特异性核 苷酸序列的和用于鉴定高密度微孔阵列的至少一个微孔的位置特异 性核苷酸序列。
例如，微加工装置或芯片的基底可以具有尺寸为约4英寸乘以4 英寸的表面。表面可以界定约1亿个微孔的阵列。微孔阵列可以通 过壁分成约100个子部分和/或基底可以界定约100个孔的阵列，其 中各子部分或孔内界定的约100万个微孔总计约1亿个微孔。在测试不同营养物的使用情况下，可以在芯片上上样来自环境样品的微 生物，使得单个微生物或微生物簇分入芯片的微孔中，各微孔位于 较大孔的底部。每个较大孔可以包括实验单元，使得可以在同一芯 片上平行或顺序测试约100种不同营养物，其中每个孔提供多达100万个测试例。
靶细胞可以是古生菌、细菌和真核生物(例如真菌、植物或动 物)。例如，靶细胞可以是微生物，例如好氧、厌氧和/或兼性好氧 微生物。可以在靶细胞的组合物上平行或顺序测试不同营养物以分 析并比较例如对细胞群、细胞成分和/或细胞产物的生长或其他影响。 可以筛选靶细胞组合物的细胞成分、产物和/或能力，例如一个或多 个病毒(例如噬菌体)、细胞表面(例如细胞膜或细胞壁)、代谢 物、维生素、激素、神经递质、抗体、氨基酸、酶、蛋白质、多糖、 ATP、脂质、核苷、核苷酸、核酸(例如DNA或RNA)、表型、突 变、代谢途径、基因和适应性。
细胞组合物可以包括环境样品提取物和/或稀释剂。环境样品提 取物和/或稀释剂可以包括但不限于一种或多种生物组织(例如结缔 组织、肌肉、神经、上皮、植物表皮、血管、基本组织等)、生物 流体或其他生物产物(例如羊水、胆汁、血液、脑脊液、耵聍、渗 出物、粪便物、胃液、组织间液、细胞内液、淋巴液、奶、粘液、 瘤胃内容物、唾液、皮脂、精液、汗液、尿液、阴道分泌物、呕吐 物等)、微生物悬浮液、空气(包括例如不同气体含量)、超临界二氧化碳、土壤(包括例如矿物质、有机物、气体、液体、生物体 等)、沉积物(例如农业的、海洋的等)、活的有机物(例如植物、 昆虫、其他小生物体和微生物)、死的有机物、饲料(例如牧草、 豆类、青贮饲料、作物残渣等)、矿物、油或油产品(例如动物、 植物、石化)、水(例如天然来源的淡水、饮用水、海水等)和/或 污水(例如卫生、商业、工业和/或农业废水和地表径流)。
向微加工装置应用(例如上样)包含细胞的组合物之前，方法 可以包括通过组合细胞与环境样品提取物和/或稀释剂制备组合物。 方法可以进一步包括液化环境样品提取物和/或稀释剂。可以将组合 物中细胞的浓度调节至每个实验单元、孔或微孔一个细胞的靶标分 布。
如果样品包含细胞和/或病毒，可以在向微加工装置应用后将样 品中的细胞裂解以释放核酸分子。可以用化学处理例如碱暴露、洗 涤剂、超声波、酶蛋白酶K或溶菌酶暴露裂解细胞。也可以通过加 热裂解细胞。
图5A是说明根据一些实施方案从样品分离细胞的方法的流程 图。在步骤500中，获得样品。在步骤502中，用至少一种物理技 术(例如混合和/或超声处理)和化学技术(例如螯合剂、洗涤剂和/ 或酶)将样品均质化和/或分散。在步骤504中，使用例如
Figure BDA0003305145480000181
非颗粒介质(可从Progen Biotechnik GmbH,Heidelberg,Germany获得) 通过密度离心分离均质的和/或分散的样品中的细胞。
图5B是说明根据一些实施方案从土壤样品分离细胞的方法的 示意图。小图506示出了土壤样品。小图508示出了试管中的均质 的和/或分散的样品。小图510示出了离心后的样品，分成可溶碎片 512、细胞514、不可溶碎片516和
Figure BDA0003305145480000182
518。
图6是说明根据一些实施方案从样品分离并培养细胞的方法的 流程图。在步骤600中，获得样品。在步骤602中，从所得样品提 取至少一个细胞。在步骤604中，在微加工装置或芯片的至少一个 高密度微孔阵列中上样至少一个提取的细胞。步骤604可以包括用至少一个提取的细胞制备细胞浓缩物、选择至少一种营养物/培养基， 和/或选择至少一张膜。在步骤606中，用至少一张选择的膜密封至 少一部分的微孔阵列以将细胞浓缩物保留在微孔中。在步骤608中， 孵育芯片。步骤608可以包括选择温度、确定氛围(例如好氧或厌氧)，和/或孵育时间。在步骤610中，根据本文所述的方法，将芯 片分开和/或复制(使用例如选取器)，获得两个部分的培养细胞。 例如，可以剥离至少一张膜，使得一部分培养细胞仍然附着，或剥 离或刺破以取样培养细胞。在操作步骤612中，处死一部分培养细 胞用于鉴定。步骤612可以包括PCR、测序和/或各种数据分析。在 步骤614中，鉴定目标菌株。可以用例如目标菌株和/或剩余部分的 培养细胞进行进一步的培养、测试和/或鉴定。
图7是说明根据一些实施方案从复杂样品分离并培养细胞的方 法的示意图。小图700示出了复杂样品的实例，尤其是微生物群样 品702和土壤样品704。在小图706中，使用例如图5A和5B示出 的方案从样品提取至少一个细胞。在小图708中，将至少一个提取 的细胞(和任何环境提取物和/或稀释剂)上样到具有至少一个高密 度微孔阵列的微加工装置或芯片710。可以将芯片710和试剂盒712 放入孵育器714。试剂可用于添加液体以维持生长和/或各种筛选目 的的营养需求。小图716示出了输出：培养细胞的分离的菌株。
鉴定微孔中生长的细胞或微生物的种类或谱系分类需要包括但 不限于以下的技术：DNA测序、核酸杂交、质谱、红外光谱、DNA 扩增和抗体结合，以鉴定遗传元件或其他种类标识符。很多鉴定方 法和处理步骤杀死微生物，从而阻止目标微生物的进一步培养和研究。为了能够鉴定细胞或微生物，同时允许特定目标克隆的随后培 养、研究和进一步详尽阐释，设计进一步的实施方案用于取样基底 或芯片上的每个实验单元、孔或微孔，同时保持实验单元、孔或微 孔的微生物群的局部完整性和分离。
如上所述的基底可以允许使用进一步的系统、试剂盒、设备和 方法取样细胞群。例如，可以向基底的第一表面应用选取装置。该 装置可以包括面向第一表面的至少一个突起。所述至少一个突起的 直径小于各微孔、孔或实验单元的开口直径。可以将至少一个突起 插入容纳细胞群的至少一个微孔、孔或实验单元，使得至少一个微 孔、孔或实验单元中的一部分细胞群粘附和/或附着于所述至少一个 突起。可以通过从基底的第一表面移除装置取出至少一个微孔、孔 或实验单元中的细胞群样品，使得至少一个微孔、孔或实验单元中 的一部分细胞群粘附和/或附着于所述至少一个突起。各突起可以是 针或多个针的组配物。
图8A-8C是说明根据一些实施方案通过一个针或多个针选取的 示意图。提供芯片800用于经由显微镜802观察，并经由选取控制 装置804选取。在图8A中，选取控制装置804包含具有单个针的臂 806。在图8B中，示出了具有多个针的臂808。图8C是选取过程中 芯片的透视图。
图9A-9D是示出根据一些实施方案选取孔的图像。在图9A中， 孔是满的。在图9B中，将针移动至位置中。在图9C中，选取孔。 在图9D中，从孔中取出样品。
图10A-10D是示出根据一些实施方案用于选取芯片的工具的示 意图。在图10A中，将包含多个针的工具与具有多个孔的芯片对齐。 在图10B中，降低工具使得针浸入孔中。在图10C中，示出了具有 附着样品的针，并将样品转移至新的芯片。或者，在图10D中，快 速翻转工具使得样品可以保留在工具本身上。
图11是已经通过薄层琼脂选取的孔的图像，说明根据一些实施 方案通过膜或密封层的选取。
或者，当至少一个突起插入至少一个微孔、孔或实验单元时， 所述至少一个微孔、孔或实验单元中的一部分细胞群体积向上移位 且围绕至少一个突起，使得至少一些体积移位的部分是在基底的第 一表面上和/或至少一个微孔、孔或实验单元的内表面上。方法还包 括通过收集至少一些体积移位部分的细胞群在至少一个微孔中取样 细胞群。
可以向与基底的第一表面相对的第二表面应用类似的选取装 置。该装置可以包括面向第二表面的至少一个突起。所述至少一个 突起的直径约等于或小于至少一个微孔、孔或实验单元的直径。将 所述至少一个突起压靠在所述第二表面上与容纳细胞群的所述至少 一个微孔、孔或实验单元相对应的位置，和/或插入容纳细胞群的所 述至少一个微孔、孔或实验单元中，使得至少一个微孔、孔或实验 单元中的一部分细胞群移动至基底的第一表面和/或至少一个微孔、 孔或实验单元的内表面上。然后可以收集移动部分的细胞群。细胞 群可以位于至少一个实验单元、孔或微孔中的塞子(例如水凝胶或 其他软材料如琼脂)上，使得当将至少一个突起压靠在第二表面且 插入至少一个微孔时，塞子被移动，从而移动所述部分的细胞群。
可以将来自至少一个实验单元、孔或微孔的细胞群样品置于第 二位置。在进一步取样之前，可以将至少一个突起清洁和/或灭菌。 为了有利于细胞附着的表面特征，至少一个突起的至少一部分可以 由用表面化学改性剂处理和/或涂覆的材料构成。至少一个突起可以 是突起阵列。当向基底的第一表面应用装置时，该突起阵列可以插 入相应的实验单元、孔或微孔阵列。突起阵列中突起的数量可以对 应于第一阵列中实验单元的数量、一个第二微孔阵列中微孔的数量 或基底中微孔的总数。
用于取样基底中细胞群的另一个装置包括至少一个面向第一表 面的针和/或纳米吸管。至少一个针和/或纳米吸管的外直径小于各微 孔的开口直径，且其内直径能够容纳靶细胞直径。至少一个针和/或 纳米吸管插入容纳细胞群的至少一个实验单元、孔或微孔中。使用 压力将一部分细胞群从所述至少一个实验单元、孔或微孔引入装置 来取出所述至少一个实验单元、孔或微孔中的细胞群样品。
可以将来自至少一个实验单元、孔或微孔的细胞群样品置于第 二位置。在进一步取样之前，可以将至少一个针和/或纳米吸管清洁 和/或灭菌。至少一个针和/或纳米吸管可以是针和/或纳米吸管阵列。 当向微加工基底的第一表面应用装置时，该针和/或纳米吸管阵列可 以插入相应的实验单元、孔或微孔阵列。针和/或纳米吸管阵列中针 和/或纳米吸管的数量可以对应于第一阵列中实验单元的数量、一个 第二微孔阵列中微孔的数量或基底中微孔的总数。
用于取样基底中细胞群的另一种方法包括向容纳液体中的细胞 群的至少一个实验单元、孔或微孔应用聚焦的声波能量。可以以有 效从至少一个微孔喷射液滴的方式应用聚焦的声波能量，例如诸如 声音液滴喷射(ADE)(参见例如Sackmann等,"AcousticalMicro-and Nanofluidics:Synthesis,Assembly and Other Applications,"Proceedings of the 4th European Conference on Microfluidics(2014年 12月))。所述液滴可以包括至少一个实验单元、孔或微孔中细胞群 的样品。所述液滴可以导入第二容器或表面或基底。
基底可以包括至少第一片和第二片，所述第一片包括至少一部 分第一表面，所述第二片包括至少一部分第二表面。所述第一片和 第二片沿着至少一部分与所述第一表面和第二表面平行的平面可拆 卸连接。所述平面划分实验单元、孔或微孔。通过拆卸第一片和第 二片取样至少一个实验单元、孔或微孔中的细胞群，使得至少一个 实验单元、孔或微孔中的第一部分的细胞群仍然附着于第一片，且 至少一个实验单元、孔或微孔中的第二部分的细胞群仍然附着于第 二片。
图12是说明根据一些实施方案的芯片1200的横截面的示意图。 芯片1200包括界定填充有内容物1204的孔1202阵列的基底。基底 包含第一片1206和第二片1208。第一片1206和第二片1208沿着与 孔1202阵列平行且平分孔1202阵列的平面1210可拆卸连接。当第 一片1206和第二片1208拆卸时，孔1202及其内容物1204被分开， 造成两份内容物1204，其保留芯片1200上内容物1204的隔离和位 置。
各微孔、实验单元或微通道可以包括部分屏障，其将微孔、实 验单元或微通道部分分隔成第一部分和底部部分，使得细胞能够在 第一部分和底部部分两者中生长。在取样细胞群之前，上述方法可 以包括分散和/或降低细胞群中的细胞簇。分散和/或降低细胞群中的 细胞簇可以包括但不限于应用超声波、振荡和用小颗粒分散。
上述方法可以进一步包括将细胞群样品从至少一个实验单元、 孔或微孔沉积入第二位置。第二位置可以是相应的实验单元、孔或 微孔阵列。第二位置可以是单个容器。可以保留来自至少一个实验 单元、孔或微孔的细胞群样品用于随后培养。或者，可以保留来自 至少一个实验单元、孔或微孔的细胞群的剩余细胞用于随后培养。
上述方法可以进一步包括从细胞群样品和/或细胞群的剩余细胞 鉴定至少一个细胞。这可以包括进行DNA、cDNA和/或RNA扩增、 DNA和/或RNA测序、核酸杂交、质谱和/或抗体结合。或者或额外 的，这可以包括鉴定至少一个细胞来源的实验单元、孔或微孔。可 以用包含位置特异性核苷酸序列的独特标签标记每个实验单元、孔 或微孔。为鉴定实验单元、孔或微孔，可以在测序和/或扩增反应中 鉴定位置特异性核苷酸序列，且位置特异性核苷酸序列可能与至少 一个细胞来源的至少一个实验单元、孔或微孔相关。
如上所述的微加工装置能够使用进一步的系统、试剂盒、设备 和方法培养源自环境的样品中的细胞。例如，可以向基底的第一表 面应用样品，使得至少一个细胞占据至少一个微孔、孔或实验单元。 向至少一部分第一表面(例如，至少一部分实验单元或孔的内表面) 应用半渗透性膜，使得营养物可以扩散入至少一个微孔、孔或实验 单元。同时，防止和/或减轻占据细胞从至少一个微孔、孔或实验单 元逃离。半渗透性膜可以是例如水凝胶层。使用例如层压可以将半 渗透性膜可逆或不可逆地连接或固定至基底。因此，可以在具有至 少一种营养物的至少一个微孔、孔或实验单元中孵育占据细胞。使 用进行性部分交换，细胞可以在一段时间内从至少一种营养物逐渐 过渡到至少一种其他营养物或营养物制剂，从而经历驯化或适应。
可以使用源自环境的第一营养物孵育占据至少一个第一实验单 元、孔或微孔的细胞，和可以使用源自环境的第二营养物孵育占据 至少一个第二实验单元、孔或微孔的细胞。上述方法可以包括比较 占据至少一个第一实验单元、孔或微孔的细胞和占据至少一个第二 实验单元、孔或微孔的细胞，以分析第一营养物和第二营养物。
例如，方法可以包括一个或多个以下步骤：
·获得芯片，其在大量较大孔或流式细胞内界定1000至1000万 或更多个微孔，各微孔的直径为约1μm至约800μm，深度为约1μm 至约800μm，芯片进一步具有一种或多种设置为促进靶标微生物移 动至微孔的表面化学；
·向所述芯片应用环境样品或环境样品的衍生物，使得任何靶标 微生物位于微孔中；
·将一种或多种半渗透性滤纸、水凝胶层或其他屏障置于芯片上， 使得生成允许营养物扩散入微孔但防止和/或减轻微生物从微孔逃离 的屏障；
·用至少一种营养物(例如源自环境)孵育芯片；
·通过进行性部分交换逐渐用至少一种其他营养物(例如制剂) 替换所述营养来源；和
·检测微孔中微生物的任何生长。
靶细胞可以是古生菌、细菌或真核生物。靶标病毒可以是噬菌 体。当靶向病毒时，芯片的微孔还可以包括其中可以生长病毒的宿 主细胞。检测占据细胞或病毒的生长可以包括检测以下方面的变化： 生物质(例如DNA/RNA/蛋白质/脂质)、代谢物的存在或不存在、pH、营养物消耗，和/或气体消耗。检测占据细胞或病毒的生长可以 包括进行实时顺序成像、显微镜、光学密度、荧光显微镜、质谱、 电化学、扩增(DNA、cDNA和/或RNA)、测序(DNA和/或RNA)、 核酸杂交和/或抗体结合。
图13是说明根据一些实施方案用于筛选的方法的流程图。在步 骤1300中，获得样品。在步骤1302中，从所得样品提取至少一个 细胞。在步骤1304中，在微加工装置或芯片的至少一个高密度微孔 阵列中上样至少一个提取的细胞。步骤1304可以包括用至少一个提取的细胞制备细胞浓缩物、选择至少一种营养物/培养基，和/或选择 至少一张膜。在步骤1306中，用至少一张选择的膜密封至少一部分 的微孔阵列以将细胞浓缩物保留在微孔中。在步骤1308中，孵育芯 片。步骤1308可以包括选择温度、确定氛围(例如好氧或厌氧)， 和/或孵育时间。可以进行遗传筛选和/或功能筛选。在步骤1310中， 向芯片应用遗传筛选。在步骤1312中，根据本文所述的方法，将芯 片分开和/或复制(使用例如选取器)，获得两个部分的培养细胞。 例如，可以剥离至少一张膜，使得一部分培养细胞仍然附着，或剥 离或刺破以取样培养细胞。在操作步骤1314中，处死一部分培养细 胞用于鉴定。步骤1314可以包括PCR、测序和/或各种数据分析。 在步骤1316中，鉴定目标菌株。可以用例如目标菌株和/或剩余部分 的培养细胞进行进一步的培养、测试和/或鉴定。或者，在步骤1318 中，向芯片应用功能筛选。在步骤1320中，观察一种或多种变量， 在步骤1316中鉴定目标菌株。
图14是说明根据一些实施方案的筛选方法的示意图。小图1400 示出了复杂样品的实例，尤其是微生物群样品1402和土壤样品 1404。在小图1406中，使用例如图5A和5B示出的方案从样品提 取至少一个细胞。在小图1408中，将至少一个提取的细胞(和任何 环境提取物和/或稀释剂)上样到具有至少一个高密度微孔阵列的微 加工装置或芯片1410。可以将芯片1410和试剂盒1412放入孵育器 1414。试剂可用于添加液体以维持生长和/或各种筛选目的的营养需 求。小图1416示出了输出：筛选结果和培养细胞的分离的菌株。
图15是是一系列说明根据一些实施方案的筛选实例的图像。图 像示出了具有膜和其上应用有酸敏感层的芯片的一部分，以筛选低 pH。在图像1500中，可见超过1800个50μm微孔，9个清晰命中 1502。图像1504是框1504的放大图，图像1506是具有命中1502 的一个微孔的放大图。
图16A-16C是说明根据一些实施方案从筛选回收的图像。在图 16A中，使用显微镜和具有至少一个针的选取装置选取至少一个孔。 在图16B中，将针移除并在培养基中孵育。在图16C中，可见生长。
图17A是说明根据一些实施方案的用于筛选的芯片的分解图。 在图17A中，芯片1700包括微孔中具有例如土壤微生物的高密度微 孔阵列。向芯片1700应用膜1702。在膜1702上方向芯片1700应用 垫片1704。在垫片1704和膜1702上方向芯片应用具有荧光大肠杆 菌的琼脂1706。图17B和17C是说明根据一些实施方案的筛选实例 的图像。在该实例中，筛选清空区。图17B是筛选后芯片的荧光图 像，所述芯片如图17A中的芯片1700一样制备。图17C是示出了 从该芯片通过琼脂选取样品的过程的图像。
在一些实施方案中，设备中的位置可能与一部分(或一部分的 部分)样品从设备移除后在该位置处存在的所述一部分样品有关。 设备可以是微阵列或包括微阵列。微阵列可以包括用于施用样品的 多个位置，其中各位置用独特标签标记，所述独特标签用于鉴定在 一部分样品从微阵列移除后，该部分样品来自的位置。
本公开涉及用于鉴定在一部分样品从微阵列移除后，所述一部 分含有至少一个核酸分子的样品来自微阵列上的哪个位置的方法， 该方法包括以下步骤：(a)在微阵列的多个位置的一个或多个上施 用一个或多个部分的样品，其中各位置用包含核酸分子的独特标签 标记，所述独特标签包含：(i)位置特异性核苷酸序列；和(ii) 第一靶标特异性核苷酸序列；(b)允许至少一个部分的样品中发现 的靶标核酸分子与标记位置的标签退火；(c)对退火的核酸分子群 进行引物延伸、逆转录、单链连接或双链连接，从而将位置特异性核苷酸序列整合入每个通过引物延伸、逆转录、单链连接或双链连 接产生的核酸分子；(d)合并步骤(c)中产生的核酸分子群；(e) 测序合并的核酸分子群，从而获得一个或多个位置特异性核苷酸序 列的序列；和(f)将从合并的核酸分子群获得的至少一个位置特异 性核苷酸序列与用包含所述位置特异性核苷酸序列的标签标记的微 阵列上的位置相关联，从而鉴定包含至少一个核酸分子的一部分样 品来自微阵列的哪个位置。在一些实施方案中，样品可以包括至少 一个细胞，且在步骤(a)之后和步骤(b)之前从细胞释放一个或 多个核酸分子。样品可以包括至少一个细胞，且在步骤(a)之后和 步骤(b)之前所述至少一个细胞复制或分裂。在步骤(b)之前， 可以从至少一个位置移除一部分样品的一部分，且所述一部分样品 的一部分可以存储于与微阵列上所述一部分样品的初始位置相关的 单独容器中。关联或鉴定位置的方法可以进一步包括以下步骤：扩 增步骤(c)中产生的核酸分子或步骤(d)中产生的合并的核酸分 子群。扩增步骤可以包括聚合酶链式反应扩增、多重聚合酶链式反 应扩增、巢式聚合酶链式反应扩增、连接酶链式反应扩增、连接酶 检测反应扩增、链置换扩增、基于转录的扩增、基于核酸序列的扩 增、滚环扩增或超支化滚环扩增。可以在扩增反应中添加其他引物。 例如，PCR反应需要5'和3'引物两者。扩增反应中使用的一个引物可以与样品中的核苷酸序列互补。
在一些实施方案中，在向微加工装置施用组合物之前，可以用 核酸酶处理包括细胞和/或病毒的组合物，使得污染核酸分子在随后 步骤中不被扩增。
在公开的方法和设备中使用的测序可以是获得序列信息的任何 方法，包括杂交和使用序列特异性蛋白(例如酶)。测序可以包括 Sanger测序、通过杂交测序、通过连接测序、定量增量荧光核苷酸 加法测序(QIFNAS)、逐步连接和切割、荧光共振能量转移、分子信标、TaqMan报告基因探针消化、焦磷酸测序、荧光原位测序 (FISSEQ)、摆频测序、多重测序、聚合菌落(POLONY)测序(参 见例如美国专利申请公开号2012/0270740,其全文通过引用并入本 文)；纳米格滚环(ROLONY)测序(参见例如美国专利申请公开 号2009/0018024,其全文通过引用并入本文)、等位基因特异性寡聚 连接测定测序，或下一代测序(NGS)平台上的测序。NGS平台的 非限制性实例包括来自以下的系统：
Figure BDA0003305145480000271
(San Diego,California) (例如,MiSeqTM/NextSeqTM/HiSeqTM和HiSeq XTM)、Life Technologies(Carlsbad,California)(例如,Ion TorrentTM),和Pacific Biosciences (Menlo Park,California)(例如,
Figure BDA0003305145480000272
RS II)。
生物体或种类可以通过比较获得自该生物体的核酸序列和含有 生物体序列的各种数据库来鉴定。例如，核糖体RNA序列数据可从 SILVA rRNA数据库项目(Max PlanckInstitute for Marine Microbiology,Bremen,Germany(www.arb-silva.de)；参见例如,Quast 等,"The SILVA Ribosomal RNA Gene Database Project:Improved DataProcessing and Web-Based Tools,"41Nucl.Acids Res. D590-D596(2013),和Pruesse等,"SINA:Accurate High-Throughput Multiple Sequence Alignment of RibosomalRNA Genes,"28 Bioinformatics 1823-1829(2012),两者全文均通过引用并入本文)获得。其他核糖体RNA序列数据库包括核糖体数据库项目(Michigan State University,EastLansing,Michigan(www.rdp.cme.msu.edu)；参 见例如,Cole等,"Ribosomal DatabaseProject:Data and Tools for High Throughput rRNA Analysis"42Nucl.AcidsRes.D633-D642(2014), 其全文通过引用并入本文)和Greengenes(Lawrence BerkeleyNational Laboratory,Berkeley,California(www.greengenes.lbl.gov)；参见例如,DeSantis等,"Greengenes,a Chimera-Checked 16S rRNA Gene Database and WorkbenchCompatible with ARB,"72Appl.Environ. Microbiol.5069-72(2006),其全文通过引用并入本文)。
Figure BDA0003305145480000281
遗 传序列数据库包括公众可得的几乎260,000个正式描述的物种的核 苷酸序列(National Institutes of Health,Bethesda,Maryland(www.ncbi.nlm.nih.gov)；参见例如,Benson等,"GenBank,"41Nucl. Acids Res.D36-42(2013)。
用于匹配和鉴定的序列可以包括16S核糖体区域、18S核糖体区 域或提供鉴定信息的任何其他区域。所需变体可以是基因型(例如 单核苷酸多态性(SNP)或其他类型的变体)或包含特定基因序列(例 如编码酶或蛋白质的序列)的种类。生物体或种类还可以通过将其 序列与定制内部序列数据库匹配来鉴定。在一些情况中，如果从某 个位置的一部分样品获得的序列与从该种类或微生物获得的已知 DNA、cDNA或RNA序列具有至少特定百分比的同一性(例如至少 90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至 少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性)，可以断 定在微阵列的该位置发现所述种类或微生物。
本公开进一步涉及用于制造包括用于施用样品的多个位置的微 阵列的方法，其中至少一个位置用独特标签标记，所述方法包括以 下步骤：(a)合成多个标签，其中每个标签包含核酸分子，所述核 酸分子包含：(i)位置特异性核苷酸序列；和(ii)靶标特异性核苷酸序列；和(b)将标签置于微阵列上的多个位置的至少一个位置 上。在另一个实施方案中，本公开涉及用于制造包括用于施用样品 的多个位置的微阵列的方法，其中至少一个位置用独特标签标记， 所述方法包括以下步骤：(a)合成多个标签，其中每个标签包含核 酸分子，所述核酸分子包含靶标特异性核苷酸序列且不包含位置特 异性核苷酸序列；和(b)将标签置于微阵列上的多个位置的至少一 个位置上。微阵列每个位置上的靶标特异性序列可以相同。在任一 上述实施方案中，步骤(a)可以在步骤(b)之前进行。放置步骤 (b)可以包括通过液体操作程序(例如，移液、用实心针头点样、 用中空针头点样或用喷墨装置沉积)将标签置于各个位置。至少一 个标签可以包括预先合成的核酸分子或核酸分子的一部分。步骤(a) 可以与步骤(b)同时进行。在一些实施方案中，至少一个标签包含 合成的核酸分子，其在各个位置通过原位合成。合成步骤(a)可以 包括喷墨打印合成或光刻合成。
微阵列上的各个位置可以设置为接收一部分样品。可以用核酸 分子(例如寡核苷酸)标签或标记位置，所述核酸分子包含至少一 种：(i)位置特异性核苷酸序列(条码)；和(ii)靶标特异性核 苷酸序列。靶标特异性核苷酸序列可以与样品中发现的核苷酸序列 互补或基本上互补。核酸分子中从5'末端至3'末端的核苷酸序列的 顺序可以是(i)位置特异性核苷酸序列；和(ii)靶标特异性核苷 酸序列。或者，核酸分子中从5'末端至3'末端的核苷酸序列的顺序 可以是(2)然后(1)。核酸分子可以在其5'末端连接至微阵列。 设备(例如微阵列)上的一个或多个位置可以无标签或未标记。
术语“互补”或“基本上互补”可以是指核苷酸或核酸之间， 例如诸如双链DNA分子的两条链之间或寡核苷酸引物和单链核酸 上的引物结合位点之间的杂交、碱基配对或形成双链体。通常，互 补核苷酸是A和T/U，或C和G。当最佳比对和比较且具有适当核 苷酸插入或缺失的一条链的核苷酸与另一条链的至少约80％，通常 至少约90％-95％，更优选约98-100％的核苷酸配对时，两个单链RNA 或DNA分子称为基本上互补。或者，当RNA或DNA链将在选择性 杂交条件下与其补体杂交时，存在基本的互补性。通常，当在一段 至少14-25个核苷酸上存在至少约65％互补性、至少约75％或至少 约90％互补性时，将发生选择性杂交。
术语“选择性杂交”是指可检测的特异性结合。多核苷酸、寡 核苷酸及其片段在大量与非特异性核酸的可检测结合最小化的杂交 和洗涤条件下与核酸链选择性杂交。可以使用“高严格”条件来实 现本领域已知的本文讨论的选择性杂交条件。“高严格”条件的实例是用一种多核苷酸孵育另一种多核苷酸的方法，其中一个多核苷 酸可以在杂交温度42℃下在杂交缓冲液(6x SSPE或SSC、50％甲 酰胺、5x Denhardt试剂、0.5％SDS、100μg/ml变性的片段化鲑鱼 精子DNA)中固定至固体表面(例如膜)12-16小时，然后用洗涤 缓冲液(1xSSC、0.5％SDS)在55℃洗涤两次。
作为位置标签一部分的核酸分子可以包含至少一个脱氧核糖核 苷酸或至少一个核糖核苷酸。核酸分子可以是单链或双链。核酸分 子可以是具有单链悬端的双链分子。
在一些实施方案中，位置标签可用于扩增与其退火的核酸分子。 因此，位置标签可以包含进一步含有扩增引物结合位点的核酸序列。 扩增引物结合位点的长度可以是至少16个、至少17个、至少18个、 至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个、至少27个、至少28个、至少29 个或至少30个核苷酸。核酸分子中从5'末端至3'末端的核苷酸序列 的顺序可以是例如：(1)扩增引物结合位点；(2)位置特异性核 苷酸序列；和(3)靶标特异性核苷酸序列。
在一些实施方案中，核酸分子可以包含靶标特异性核苷酸序列 而不包含位置特异性核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸分子可 以包含靶标特异性核苷酸序列而不包含位置特异性核苷酸序列或扩 增结合位点序列。在进一步的实施方案中，核酸分子可以仅包含靶 标特异性核苷酸序列。在甚至进一步的实施方案中，核酸分子可以 仅包括靶标特异性核苷酸序列。扩增引物结合位点能够结合聚合酶 链式反应引物、多重聚合酶链式反应引物、巢式聚合酶链式反应引 物、连接酶链式反应引物、连接酶检测反应引物、链置换引物、基 于转录的引物、基于核酸序列的引物、滚环引物或超支化滚环引物。 扩增反应期间可以向微阵列加入其它引物。例如，PCR反应需要5'和 3'引物两者。靶标特异性核苷酸序列可以在含有靶标核酸分子的位置 扩增，且可以通过例如qPCR、终点PCR和/或检测扩增核酸分子的 染料来检测。
期望将与位置标签退火的核酸分子或基于这种核酸分子的扩增 产物进行测序。位置标签可以包含进一步含有适配子核苷酸序列的 核酸序列。在某些实施方案中，适配子核苷酸序列不存在于位置标 签中，但在二次PCR反应中或通过连接添加至样品核酸分子。适配 子核苷酸序列可以是通用适配子或特定测序平台(例如
Figure BDA0003305145480000311
或 IonTorrentTM)的适配子。适配子核苷酸序列可以包括测序引物结合 位点。测序引物结合位点能够结合用于以下的引物：Sanger测序、 通过杂交测序、通过连接测序、定量增量荧光核苷酸加法测序 (QIFNAS)、逐步连接和切割、荧光共振能量转移、分子信标、 TaqMan报告基因探针消化、焦磷酸测序、荧光原位测序(FISSEQ)、 摆频测序、多重测序、聚合菌落(POLONY)测序(参见例如美国 专利申请公开号2012/0270740,其全文通过引用并入本文)；纳米格滚环(ROLONY)测序(参见例如美国专利申请公开号2009/0018024, 其全文通过引用并入本文)、等位基因特异性寡聚连接测定测序、 NGS平台上的测序或任何适合的测序程序。NGS平台的非限制性实 例包括来自以下的系统：
Figure BDA0003305145480000313
(San Diego,California)(例如,MiSeqTM/NextSeqTM/HiSeqTM和HiSeq XTM)、Life Technologies (Carlsbad,California)(例如,Ion TorrentTM),和Pacific Biosciences (Menlo Park,California)(例如,
Figure BDA0003305145480000314
RS II)。
位置特异性核苷酸序列(例如条码)的长度为至少2个、至少3 个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9 个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、 至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少 20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25 个、至少26个、至少27个、至少28个、至少29个或至少30个核 苷酸。
靶标特异性核苷酸序列的长度为至少10个、至少11个、至少 12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17 个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、 至少23个、至少24个、至少25个核苷酸、至少26个、至少27个、 至少28个、至少29个、至少30个、至少40个、至少50个、至少 75个或至少100个核苷酸。
微阵列上的至少一个位置可以进一步用独特分子标识符标签标 记。独特分子标识符可用于定量生长(例如在该位置微生物菌落的 生长或细胞复制)。独特分子标识符可以是随机核苷酸序列。现有 技术已经描述了使用独特分子标识符的方法和独特分子标识符的实 例，参见例如其全文通过引用并入本文的WO 2013/173394。例如， 独特分子标识符标签的核苷酸序列可以为 NNNANNNCNNNTNNNGNNNANNNCNNN(SEQ ID NO:1)，其中 Ns(ACGT的等量随机混合)产生大的编码空格，使得扩增的每个 分子获得独特(特定)DNA序列条码(该实例中是4^N个条码,或 4^21～40亿)。该序列可以计数，而不受来自扩增偏好或其他技术 问题的干扰。SEQ ID NO：1中的固定碱基(A、C、G、T)有助于 准确读取条码，例如处理indel。
本公开涵盖使用位置特异性标签来监测样品中超过一个靶标特 异性核苷酸序列的存在或含量(例如，多重)。微阵列上的至少一 个位置可以进一步用包含核酸分子第二独特标签标记，所述核酸分 子包含例如：(i)扩增引物结合位点：(ii)位置特异性核苷酸序列；和(iii)靶标特异性核苷酸序列。
在一些实施方案中，核酸分子可以包含靶标特异性核苷酸序列 而不包含位置特异性核苷酸序列。在某些实施方案中，核酸分子可 以包含靶标特异性核苷酸序列而不包含位置特异性核苷酸序列或扩 增结合位点序列。在进一步的实施方案中，核酸分子可以仅包含靶 标特异性核苷酸序列。在甚至进一步的实施方案中，核酸分子可以 仅包括靶标特异性核苷酸序列。靶标特异性核苷酸序列的长度可以 为至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至 少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20 个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个核 苷酸、至少26个、至少27个、至少28个、至少29个、至少30个、 至少40个、至少50个、至少75个或至少100个核苷酸。在某些实 施方案中，微阵列中每个位置的靶标特异性序列可以相同。可以监 测其他靶标特异性核苷酸序列。例如，可以用至少10个、至少25 个、至少50个、至少75个或至少100个独特标签标记一个或多个 位置，其中每个标签包含与该位置标签中其他靶标特异性核苷酸序 列不同的靶标特异性核苷酸序列。
任何目标基因位置可以提供靶标特异性核苷酸序列。例如以下 序列：细菌16S核糖体RNA(rRNA)、18S核糖体RNA、聚(A) RNA、RNA聚合酶基因、DNA聚合酶基因、RecA基因、转座酶基 因、核糖体内部转录间隔区(ITS)序列、编码酶的基因、控制区 DNA序列、结合位点DNA序列，或可以作为靶标特异性核苷酸序 列的任何这些序列的一部分。公开的系统、试剂盒、设备或方法可 以使用在以下中描述的一个或多个细菌16S rRNA引物：Sundquist 等,"Bacterial Flora-Typing with Targeted,Chip-Based Pyrosequencing,"7:108BMCMicrobiology(2007)和Wang等, "Conservative Fragments in Bacterial 16S rRNAGenes and Primer Design for 16S Ribosomal DNA Amplicons in MetagenomicStudies,"4: 10PLoS ONE e7401(2009)，其全文通过引用并入本文。
在公开的设备和方法中使用的样品可以包含多个核酸分子。样 品可以包含至少一个DNA分子或至少一个RNA分子。样品可以包 含至少一个由限制性酶消化形成的核酸分子。样品可以包含至少一 个细胞(例如古细菌细胞、真细菌细胞、真菌细胞、植物细胞和/或动物细胞)。样品可以包含至少一种微生物。样品可以包含一个或 多个病毒(例如噬菌体)，对此可能需要提供宿主细胞。微阵列上 一个位置的一部分样品可以是单个细胞或从单个细胞生长的菌落。 例如，可以将单独的微生物或细胞置于微孔中且允许所述单独的微 生物或细胞分裂或复制，使得菌落在各微孔中生长，且其中具有单 独的微生物或细胞。因此，微阵列上的位置可以包含单个微生物种 类或彼此支持生长的微生物菌株的混合群体。样品可以包含任何合 适的稀释剂。在非限制性实例中，样品包含土壤、污水、粪便物、 体腔内容物、生物流体、活的有机物、死的有机物、微生物悬浮液、 天然淡水、饮用水、海水、废水、超临界二氧化碳、矿物、气体、 缓冲液、酒精、有机溶剂和/或油。在一些实施方案中，在将一部分 样品置于微阵列的至少一个位置前，将包含以下的核酸分子置于该 位置：(a)(i)位置特异性核苷酸序列和(ii)一个或多个靶标特 异性核苷酸序列；或(b)一个或多个靶标特异性核苷酸序列(即， 不包含位置特异性核苷酸序列)。在其他实施方案中，在将一部分 样品置于微阵列的至少一个位置后，将包含以下的核酸分子置于该 位置：(a)(i)位置特异性核苷酸序列和(ii)一个或多个靶标特 异性核苷酸序列；或(b)一个或多个靶标特异性核苷酸序列(即， 不包含位置特异性核苷酸序列)。在一个实例中，将样品或一部分 样品置于微阵列上并孵育，然后将包含至少一种以下的核酸分子置 于微阵列上：(i)位置特异性核苷酸序列和(ii)靶标特异性核苷 酸序列。在一些实施方案中，将所述一部分样品的一部分从微阵列 上的至少一个位置移除，并储存在单独的容器中，或在将核酸分子 置于微阵列上的至少一个位置之前或之后将微阵列分开。
至少一个位置特异性标签可以包含预先合成且通过液体操作程 序置于该位置的核酸分子或核酸分子的一部分。例如，液体操作程 序可以是移液、用实心针头点样、用中空针头点样或用喷墨装置沉 积。可以使用预先单独合成的多个核酸分子在位置产生标签。至少 一个标签可以包含通过原位合成(例如通过喷墨打印合成或光刻合 成)在该位置合成的核酸分子。
种类的数字计数
本文描述了包含具有高密度微孔的表面的高密度芯片装置。可 以将来自微生物群样品的微生物稀释并向装置施用，使得孔包含约 一个微生物/占据孔。然后，孵育芯片使得微生物在孔内复制。进一 步，本文描述了基于DNA的位置索引系统，以测定各孔中存在什么 种类。该索引系统可能涉及将PCR引物预先上样到各孔，所述PCR 引物含有鉴定孔的寻址条码和靶向微生物基因组中的特定基因序列 (例如16S)的提供种类信息或靶向所需基因序列的引物序列。孵育 后，释放微生物DNA，PCR引物扩增靶标细菌DNA区域，并收集 来自芯片上各个孔的扩增子，然后通过下一代测序读取。
本文所述的系统、试剂盒、设备和方法可用于进行样品中各微 生物种类或变体的数量的绝对计数。每个孔可以代表一个数字事件， 其表示原始稀释样品中单个微生物的存在。位置索引系统允许用户 测定孔中是什么细菌种类。测量单位可以是“孔中存在细菌种类”， 且可以与孔中细菌的数量无关。
在一个实例中，微生物的混合样品包含50％的种类1、30％的种 类2和20％的种类3。稀释样品，然后向芯片施用，使得各占据的孔 (大部分)具有一种微生物。微生物复制。注意，不同种类的复制 速度可能不同。然后，加工芯片，使得将孔中来自微生物的DNA释 放，且将16S或一些其他靶标序列扩增。可以收集来自各孔的DNA 扩增产物，并用下一代测序进行测序。可以分析下一代测序数据以 测定对于每个孔，在各占据孔中的是什么种类。很多孔可能根本不 被占据。可以通过以下测定各种类的丰度：各种类占据的孔的总数 除以占据孔的总数。可以通过以下测定绝对丰度：将来自步骤的各 种类的丰度％乘以原始样品中微生物的总数。可以将测序数据与公众 可得的序列数据库相比较，以测定各占据孔中是什么种类。例如， 核糖体RNA序列数据可从上述SILVA rRNA数据库获得。其他核糖 体RNA序列数据库还包括上述核糖体数据库项目、Greengenes和
Figure BDA0003305145480000351
遗传序列数据库。
目前用于估计样品中微生物种类的丰度的方法涉及使用传统技 术，例如显微镜、染色、选择性培养基、代谢/生理筛选和用培养皿 培养。这些方法通常由于缺乏特异性(显微镜、染色、选择性培养 基)或缺乏计数样品中所有种类的能力(选择性培养基、培养)而不精确，而很多种类用传统方法生长不好或根本不生长。
目前用于测定微生物群样品中微生物种类相对丰度的分子方法 涉及从样品提取微生物DNA、对提供种类或其他信息的16S或一些 其他DNA区域进行PCR扩增，然后对所得PCR产物进行下一代测 序(NGS)。从NGS数据中种类特异性DNA序列的相对频率推测 原始样品中各种类的相对丰度。文献有关于这类分析的很多实例， 该方法为很多微生物群研究打下基础。
目前方法的问题是它不控制以下：存在于不同微生物中的16S 基因的数量可能不同，PCR偏好(其中不同微生物种类的序列可能 以不同速率扩增)和测序偏好(其中不同微生物种类的序列可能以 不同速率被测序)。结果是，用目前方法获得的相对丰度数据的准确度有很多不确定性。
不同种类的计数可以基于单个孔中种类的存在。这与上样期间 分入孔中的来自原始样品的单个微生物直接相关。只有PCR/NGS可 用于鉴定各孔中存在什么微生物。鉴定的序列的数量不是来自一部 分计算。因此，方法中PCR、NGS或靶标序列拷贝数变化或偏好不 重要。
一些实施方案可以在以下具有应用：微生物群研究、微生物产 品开发和发展、临床诊断、和其中需要精确计数样品中的微生物种 类的任何其他领域。
因此，一些实施方案可以提供微生物群样品中各种类相对丰度 精确得多的测量以及将该相对丰度测量转化为绝对丰度或原始样品 中各种类的直接计数的能力(通过计算稀释和/或结合原始样品中微 生物总数的测量)。一些实施方案可以为高密度微加工芯片提供新 应用(除了培养和筛选微生物)。
图18是说明根据一些实施方案的计数方法的流程图。在步骤 1800中，获得样品。在步骤1802中，从所得样品提取至少一个细胞。 在步骤1804中，在微加工装置或芯片的至少一个高密度微孔阵列中 上样至少一个提取的细胞。步骤1804可以包括用至少一个提取的细 胞制备细胞浓缩物、选择至少一种营养物/培养基，和/或选择至少一 张膜。在步骤1806中，用至少一张选择的膜密封至少一部分的微孔 阵列以将细胞浓缩物保留在微孔中。在步骤1808中，孵育芯片。步 骤1808可以包括选择温度、确定氛围(例如好氧或厌氧)，和/或孵 育时间。在步骤1810中，处死一部分培养细胞用于鉴定。步骤1810 可以包括PCR、测序和/或各种数据分析。在步骤1812中，可以评 估和/或测定关于样品的信息(例如，微生物群体结构)。
图19是说明根据一些实施方案的计数方法的示意图。小图1900 示出了复杂样品的实例，尤其是微生物群样品1902和土壤样品 1904。在小图1906中，使用例如图5A和5B示出的方案从样品提 取至少一个细胞。在小图1908中，至少一个提取的细胞(和任何环 境提取物和/或稀释剂)上样到具有至少一个高密度微孔阵列的微加 工装置或芯片1910。可以将芯片1910和试剂盒1912放入孵育器 1914。试剂可用于添加液体以维持生长和/或各种筛选目的的营养需 求。小图1916示出了输出：序列和培养细胞的相对丰度。
基于液滴的平台
基于离散液滴的平台可以用于分离、培养和/或筛选，其与使用 芯片的方式基本相同。液滴是微孔类似物，用作纳米或皮升容器。 液滴产生方法，尤其当与芯片上细胞分拣器型仪器组合时，可用于 从复杂环境样品分离出微生物。液滴添加可用于饲喂微生物。液滴 分裂可用于测序或其他破坏性试验，同时留下活样品。测序所需的 所有准备工作也可以液滴形式进行。
一些实施方案可用于将微生物从复杂环境取出来，变成液滴。 例如，用于制备含有细胞悬浮液的液滴的调控系统可以包括一个或 少量细胞。可以将水滴悬浮于不混溶的液体，使它们彼此保持分离， 并防止接触或污染任何表面。可以在各微通道中在例如30Hz产生液 滴，每天转化为几百万。
基于液滴的微流体系统可以封装、操纵和/或孵育小液滴(例如， 约30pL)。注意到细胞存活和增殖与主体溶液中的对照实验类似。 可以在数百Hz产生液滴，意味着可以在几个小时内产生数百万液 滴。简单的基于芯片的装置可用于产生液滴，且液滴可以工程化以包含单个细胞。
一些实施方案可用于筛选液滴中的细胞。在芯片上可以以例如 每秒500个液滴的速率荧光筛选孵育后的液滴。液滴可以流过在可 以设置为用于多种不同测量的落射荧光显微镜的焦点处的通道。这 可能是筛选代谢物特别有效的方法，因为由于局限于非常小的液滴， 所以局部浓度相当高。
一些实施方案可用于分拣液滴。一旦细胞被分离、生长和/或筛 选，可以分拣它们使得获得有用的样品。可以以与常用的FACS机 器类似的方式对液滴进行分拣。
一些实施方案可用于分裂液滴。一些实施方案可能需要获取样 品并将其分裂的能力，从而将一部分送去测序(破坏性方法)，而 保留作为活培养物的另一部分。目前有很多分裂液滴的不同方法， 包括但不限于用仔细计算的尺寸构造T形交叉，导致在流动或电润 湿时产生液滴分裂(注意不要用太高的电压造成细胞裂解)。
一些实施方案可用于合并液滴和/或向液滴添加试剂。例如，细 胞的长时间孵育(例如几周)需要添加液体的能力，以维持生长的 营养需求。为各种筛选目的而添加试剂也是有用的。液滴筛选依赖 于能够将含有化合物密码的液滴与含有单个细胞的液滴合并。然后 可以孵育液滴，和/或将其返回分析芯片以通过其密码鉴定化合物。 这可能需要根据需要精确合并液滴的能力。
一些实施方案可用于在液滴中进行PCR。PCR可用于最终测序 特定遗传元件(例如16S区域)，从而鉴定微生物。这可以用来测 定在各孔中生长的是什么类型的微生物。在基于液滴的系统中，该 方法可用于测定各液滴中存在的是什么微生物，只要设计了扩增基因组正确区域的正确引物序列。
一些实施方案可用于从液滴测序DNA(例如在PCR步骤中产 生)，和/或制备DNA文库。
用于高密度芯片的位置特异性标签
可以使用具有高密度微孔的表面的高密度芯片装置。可以将来 自微生物群样品的微生物稀释并向装置施用，使得孔包含约一个微 生物/占据孔。可以孵育芯片使得微生物在孔内复制，所得群体代表 单个种类。基于DNA的位置索引系统可用于测定各孔中存在什么种 类。该索引系统可能涉及将PCR引物预先上样到各孔，所述PCR引 物含有鉴定孔的寻址条码和提供种类信息的靶向特定遗传元件的引 物序列(例如微生物基因组的16S)。孵育后，释放微生物DNA， PCR引物扩增靶标细菌DNA区域，收集来自芯片上各个孔的扩增 子，然后通过下一代测序读取。
上述位置索引系统可能涉及将不同位置密码加入微芯片的各个 孔，或将多个位置密码加入各个孔，使得编码特定数量的孔所需的 密码总数减少。例如，如果芯片上有100个孔，如果每个孔一个密 码，则需要100个密码。如果从每个孔读取两个密码，同一芯片可以仅用20个密码编码(即，10个编码网格的x轴，10个编码y轴)。
表2提供了每个孔加入两个密码的PCR策略的实例。
表2
Figure BDA0003305145480000391
表3提供了每个孔加入三个密码的PCR策略的实例。
表3
Figure BDA0003305145480000392
三个寡聚引物用于制造单个PCR产物。该系统使用两个寡核苷 酸在分子的一端放置多个分条码的优点可以包括例如减少所需寡核 苷酸的最大长度或者制造超长条码。
该方法可以概括为每个反应加入n个条码。该方法也可以有不 同实施，使得条码在靶标序列区域的同一侧。可以使用NGS测序适 配子，并使用下一代测序读取条码PCR产物群的全部序列。
在另一种实施中，可以加入固定条码以指示样品数量或板数量， 并允许在两个条码的运行中汇集多个样品/板，如表4所示。
表4
Figure BDA0003305145480000401
在另一种实施中，可以加入固定条码以指示样品数量或板数量， 并允许在三个条码的运行中汇集多个样品/板，如表5所示。
表5
Figure BDA0003305145480000402
注意，在所有情况下，条码在序列中的位置传达信息，因此 CODE1、CODE2和CODE3条码在特定孔中不一定彼此不同。
制备寡聚核苷酸并用单码编码系统打印芯片成本较高。例如， 10,000个孔的芯片需要10,000个单个条码和10,000个单独打印循环 以将这些条码置入芯片上的孔中。如果使用双码系统，可能只需要 200个条码和200个打印循环以制造芯片。这意味着大量节约了寡核 苷酸成本、打印时间和打印资本投入。
使用双重条码PCR引物，随后进行扩增和测序分析，以提供随 机分配到微加工芯片上的DNA或含DNA部分的位置数据可能具有 很高的实用性和相对较低的成本。
图20是说明根据一些实施方案的索引系统的示意图。微孔芯片 2000具有N行和M列，从而产生NxM个独特索引。可以认为芯片 2000中微孔的位置具有坐标(N,M)。每列具有常用的反向引物序 列(例如,R1、R2、R3..RM)，和每行具有常用的正向引物序列(例如, F1、F2、F3..FN)。例如，靶标例如16S核糖体核苷酸(rRNA)中 特定遗传元件的独特标签可以包括正向引物序列F515和反向引物序 列R806。将芯片2000进行PCR后，可以基于正向引物序列和反向 引物序列的存在，将靶标遗传元件的存在映射回独特的原始微孔。 例如，F515和R806的存在将用户导向芯片2000中具有坐标 (515,806)的微孔。
含有细菌的微孔的PCR扩增产物的变异性降低
可以使用基于DNA的位置索引系统来测定各孔中存在什么种 类。该索引系统可能涉及将PCR引物预先上样到各孔，所述PCR引 物含有鉴定孔的寻址条码和靶向微生物基因组的特定遗传元件(例 如16S)的提供种类信息的引物序列。孵育后，释放微生物DNA， PCR引物扩增靶标细菌DNA区域，收集来自芯片上各个孔的扩增 子，然后通过下一代测序读取。
限制孔之间PCR产物的量的变异的一些实施方案可以包括在制 造芯片期间限制孔中PCR引物的量，使得对于大多数可能的样品 DNA浓度而言，DNA扩增反应中PCR引物的量是有限的，从而产 生的PCR产物的量在各孔之间的差异将更小。
限制孔之间PCR产物的量的变异的一些实施方案可以包括将芯 片上PCR的循环数限制为少于3个循环，或少于5个循环，或少于 10个循环，或少于15个循环，或少于20个循环，或少于25个循环， 或少于30个循环，使得相对于全循环PCR扩增方案，产生的PCR 产物的量在各孔之间的差异将更小。
限制孔之间PCR产物的量的变异的一些实施方案可以包括限制 反应混合物中的核苷酸的量，使得与原始样品中DNA的量相比，产 生的PCR扩增子的数量与核苷酸的量更相关。具有大量靶标DNA 的微孔将在循环过程早期耗尽核苷酸，而具有少量靶标DNA的微孔将在循环过程后期耗尽核苷酸，但产生几乎相同量的扩增产物。
限制孔之间PCR产物的量的变异的一些实施方案可以包括限制 在孔中生长的微生物可利用的营养物的量，使得细胞复制，直到耗 尽培养基然后停止复制。
限制孔之间PCR产物的量的变异的一些实施方案可以包括在各 孔中放入鉴定PCR产物的染料，使得产生的PCR产物越多，信号越 亮。可以监测各PCR循环期间染料的强度，一旦观察到所需的信号 强度，从孔中取出样品。
限制孔之间PCR产物的量的变异的一些实施方案可以包括使用 杂交小珠的混合物以与来自各孔的扩增DNA选择性杂交，所述杂交 小珠覆盖有与各孔特异性条码互补的寡核苷酸。一旦小珠饱和，洗 掉未结合DNA，从小珠释放结合DNA。然后可以将各孔的DNA的 量归一化至小珠的饱和极限。
限制孔之间PCR产物的量的变异的一些实施方案可以包括将芯 片孵育长时间，使得生长快的微生物快速填满孔并停止复制，生长 慢的微生物逐渐填满孔，且一旦孔中具有大约相同数量的细胞则停 止生长。
在一些实施方案中，在芯片格式和方法中使用条码引物和下一 代测序(NGS)可以用来鉴定哪个种类在高密度微芯片上的哪个孔 中生长。当大约相等数量的细菌占据芯片上的每个微孔时，NGS数 据中来自每个孔的信号大约相同。
例如，在一个产生1200万个序列读段的典型NGS运行中，如 果该运行中测序24张芯片，每张具有10,000个微孔且每个孔中细菌 数量相同，则平均每个孔50个读段。
然而，不同细菌生长速度不同，因此一些孔可能具有很少的细 菌，而一些孔具有很多细菌。这可能使NGS的运行变得糟糕，因为 NGS分析中没有检测到细菌很少的孔。
因此，在一个产生1200万个序列读段的典型NGS运行的实例 中，每次运行测序24张芯片，每张具有10,000个微孔，其中一半具 有的细菌比另一半多100倍。生长慢的孔中的细菌被检测到的概率 显著降低。这种情况下：
(10,000 x 24)/2 x 100＝12,000,000 (1)
(10,000 x 24)72＝120,000 (2)
低频率孔占总数的1％。因此，在一次NGS运行的12,000,000 个读段中，120,000个将来自低频率孔，即平均每个孔1个读段。
为使这种现象最小化，需要开发新的方法来使孔之间的PCR产 物的量相等，从而NGS运行检测到所有孔。
用于微生物分离、生长、筛选和分析的硅基微孔芯片
替代或除塑料、玻璃和/或聚合物之外，微加工装置或芯片可以 由至少一部分硅构成，以允许在逐孔基础上的电学测量。例如，可 以分开每个孔的壁以产生微电容。在另一个实例中，每个孔中FET 使得门表面暴露于孔的内容物。代替纯的硅基芯片，可以通过电镀、 气相沉积、和/或电弧/火焰喷涂在已有芯片顶部上产生薄的金属层。 这可以为芯片添加更多的功能性，使用更便宜和/或更清洁的另一种 制造方法，和/或允许手持或便携式设备的小型化。
一些实施方案可以允许通过电学测量监测生长。可以应用阻抗 监测来测量微生物(例如细菌)的生长。例如，在其全文通过引用 并入本文的Ur等,"Impedance Monitoringof Bacterial Activity,"8:1J. Med.Microbiology 19-28(1975)中，将含有大肠杆菌的试管的阻抗与 其细胞计数相比较。也可以对其他类型的细菌(包括假单胞菌属、 克雷伯菌属和链球菌属)进行测量以证明效果是普遍的。可以用不 同培养基填充孔以测试不同制剂的生长条件。
一些实施方案可以允许通过电学测量筛选。可以在逐孔的基础 上进行电学测量，以便进行筛选。一个实例将是pH。有许多不同方 式在孔中从一个设备的门上获得pH依赖性反应，包括但不限于 ISFET和pH计。带有嵌入式pH传感器的孔阵列可以电学测定那些 包含产生酸性或碱性代谢物的微生物的孔。一个简单的实例是从乳 糖筛选乳酸的产生。将细菌在孔中稀释、生长，然后用乳糖喂饲。 记录pH下降的孔含有能够将乳糖代谢为乳酸的微生物。
一些实施方案可以允许电学测量氧化还原探针。另一种利用电 学测量的方法是观察孔中的细菌如何影响已知的氧化还原探针。基 本上，可以在细菌存在下测量有明确反应的系统，与预期性质的偏 差可以归因于细菌样品。典型的氧化还原探针类似铁氰化物：[Fe(CN)6]3-/4-。铁氰化物还原为亚铁氰化物已经被详细表征，使得 性质上的小变化，尤其是电极周围的电子转移可以被发现。该系统 是“无标签”的，因为它不需要直接改变细菌本身即可检测。
可以将能够识别微生物(例如大肠杆菌)的抗体固定在ITO电 极上。可以从电极测量含有铁氰化物的溶液的电子转移的电阻。大 肠杆菌结合至电极表面，与表面上大肠杆菌的浓度成比例地增加电 阻。这是可以使用氧化还原探针来检测特定类型的微生物或代谢物 的一类测量方法的一个实例。
在硅(或至少金属或金属化塑料)中工作提供的优势包括但不 限于：生产芯片较便宜(例如，通过改进现有技术)；允许小型和/ 或便携式版本的综合检测能力；在其他材料(例如LCR、CV等)中 没有的额外的测量能力；在现有装置中整合新发现的基于芯片的检 测方法；以及与电学测量和测序的组合。这些优势对使用干扰检测 的任何消费者而言是有益的。
保护芯片上的孔特异性化学物的可释放屏障
图21A-21E是说明根据一些实施方案具有孔特异性化学物的芯 片的示意图。图21A示出了具有多个微孔的微加工装置或芯片。在 图21B中，在芯片的各微孔中加入了微孔特异性化学物。在图21C 中，在芯片各孔中的微孔特异性化学物上应用密封剂，从而防止化学物与孔中的其他添加物相互作用。在图21D中，加入样品，在微 孔中对样品进行实验。在图21E中，触发剂(例如热)释放微孔特 异性化学物，与孔中的样品相互作用。
可以制造或清洁微孔芯片，和/或处理其表面。特异性化学物可 以分开制备，然后例如使用允许将一组特异性化学物导入特定的一 个或多个孔的方法和/或装置加入孔中。然后可以施用密封剂以保护 各种化学物不被环境污染，和/或用一些明确的外部触发剂将其移除/ 释放/发放。
可以将微加工装置或芯片制造为特定设计，例如清洁的和/或表 面处理的以促进润湿。可以将PCR引物打印或针点入特定孔。可以 允许芯片干燥，然后通过从乙醇溶液蒸发沉积蜡层。最佳浓度为约 1％v/v。可以直接施用熔融蜡，或喷雾水性或醇蜡溶液。或者，可以使用旋涂或气相沉积。可以使用各种蜡，包括但不限于：含有和 不含聚乙二醇的硬脂酸甘油酯、鲸蜡硬脂醇、1-十六醇、硬脂酸甘油 酯、单硬脂酸甘油酯、鲸蜡硬脂醇聚醚-10(CAS登记号68439-49-6) 和一些商业产品，包括但不限于LotionproTM165(可从
Figure BDA0003305145480000451
Eastsound,Washington获得)和PolawaxTM(可从Croda,Inc.,Edison,New Jersey获得)。之后通过例如加热直到蜡融化来释放下面的化学 物。对于这些组合物，将为50℃-70℃。重要的是它足够低而不损坏 任何化学成分或煮沸我们的水性溶液。
关键概念是孔特异性化学物，其在芯片上被隔离直到实验者触 发释放。该方法可以用于孔的编码，但它也可以更广泛地用于一系 列不同的问题。可用于密封芯片的不同化学物包括但不限于抗生素、 荧光素、染料、PCR引物、溶解促进剂、抗体和/或测试的各种代谢 产物。尽管蜡是密封东西的好方法且之后能够通过加热释放，可以 使用其他材料密封，其当暴露于光、超声和/或一些其他触发剂时被 释放。相比于向芯片简单地添加试剂，该方法的优势之一是基于逐 孔(well-by-well)上的控制。进行微生物实验后通过将化学物打印 入孔中可以实现类似的效果，但这随着时间会产生问题(打印运行 可以长达一天)，事实是，如果微生物在芯片上后分别填充每个孔， 每个孔不可能在相同的时间内暴露。使用释放机制，每个孔能够在 相同时间暴露。在一个实例中，可以通过溶剂浇铸沉积蜡。
简单和/或控制相对丰度的分离微孔
高密度芯片装置可以包含具有高密度微孔的表面。可以将来自 微生物群样品的微生物或其他细胞类型稀释并施用于装置，使得孔 包含约一个微生物或细胞/占据孔。可以用半渗透性膜密封这些微孔， 所述半渗透性膜允许营养物扩散入微孔，但防止全部或至少一些微 生物或细胞从微孔中移动出来。
可以制备微生物或细胞样品，然后用不可渗透的或仅气体可渗 透的膜将其密封入芯片。在芯片或膜上没有液体储库，因此密封时 只有孔中的营养物可用于支持微孔中微生物或细胞的生长。该特征 的两个原因包括：(1)构建和工作流程简单，因为装置不需要半渗 透性膜或储库，不需要添加营养物，且污染可能性较小；(2)通过 限制快生型获取营养物来检查其相对丰度。对于包含一些快生型和 一些慢生型的样品，快生型在其各自微孔中将很快被限制资源，停 止生长或生长缓慢，同时慢生型继续生长。与其中快生型没有被限制营养物的量的情况相比，这使得慢生型在芯片上的微生物群体中 占较高的相对丰度。当对芯片上的一切进行测序时，这对于下游处 理非常重要。这也为稀有种类提供更好的检测极限，因为在某个点 稀有种类不会被生长快的种类超越，从而限制系统检测它们的能力。
目前的方法试图让所有种类生长，无论它们本质上生长快或慢。 这样不可避免的结果是，快生型主导群落且仅相对丰度随时间增加。 很多类型的下游分析，例如测序或荧光筛选无法分辨给定群体中的 每个种类，而是仅能分辨高于某一限制相对丰度的那些。如果目标 是保留多样性并检测稀有种类，需要以某种方式限制快生型。
举个例子说明该想法，考虑一个简单的情况，样品包含两个种 类：一种每天翻倍，另一种每周翻倍，如表6所示。如果慢生型在 开始时是稀有的(相对丰度为5％)，随着两个种类的生长，它很快 变得非常稀有。
表6
Figure BDA0003305145480000471
如果通过生长的营养和/或物理空间的竞争来限制快生型，在过 一段时间后，慢生型的相对丰度将开始增加，如表7所示。
表7
限制 第0天 第1天 第2天 第3天 第7天 第14天
快生型 19 38 50 50 50 50
慢生型 1 1 1 1 2 3
总计 20 39 51 51 52 53
快生型的相对丰度 0.950 0974 0.980 0.980 0.962 0.943
慢生型的相对丰度 0.050 0.026 0.020 0.020 0.038 0.057
用于生物库细胞的高密度微加工阵列
设计生物库以使研究人员获取来自大群体的大量样本，以便开 展某些类型的研究，例如与疾病相关的生物标志物发现。生物储存 领域的现有技术提供的样品储存在试管或低密度板格式中，例如96 孔或384孔板。当待存储的样品数量相对较少并且样品本身是离散 的分离群体时，这样是有用的。当存储以下样品(如微生物群样品) 时：其中样品数量可能较高且各样品中不同种类或变体的数量可能 从每个样品数百到数千或数百万个，目前的生物储存方法变得非常 繁琐。使用目前的方法，必须进行费力的分离方案，以便在存储步 骤之前或之后分离出单个种类或变体，以便获得期望的种类或变体。
本文所述的系统、试剂盒、设备和方法可用于生物储存(biobank) 细胞、微生物、病毒和其他生物实体。由具有高密度微孔的表面组 成的高密度芯片装置可能具有每芯片数千个、数十万个或数百万个 微孔。例如，可以将来自微生物群样品的微生物(或另一种生物实 体，如不同类型的细胞或病毒)稀释并施用至装置，使得孔包含约1 个微生物/占据孔。然后，孵育芯片使得微生物在孔内复制，所得群 体代表单个种类。基于核酸的位置索引系统可用于测定各孔中存在 什么种类。该索引系统可能涉及将PCR引物预先上样到各孔。所述 PCR引物含有鉴定孔的寻址条码和提供种类信息或靶向目标遗传序 列的靶向微生物基因组中的特定遗传元件(例如16S)的引物序列。 孵育后，释放微生物DNA，PCR引物扩增靶标细菌DNA区域。收 集来自芯片上各个孔的扩增子，然后通过下一代测序读取。
使用高密度微加工芯片进行生物储存使得各样品内的很多种类 或变体能作为单独的群体存储，而不需要在存储之前或之后进行费 力的分离方案。使用基于DNA的位置索引系统或定制分析允许更简 单的通用的方法来鉴定各微孔内容物的遗传签名或特征，以提供信 息，例如种类信息。此外，芯片装置提供一种非常空间有效的存储 细胞分离物的方法。例如，具有100,000个孔的单个显微镜玻片大小 的芯片占据的空间显著低于相应的传统存储格式。芯片格式还可以 通过使一个芯片包含来自单个受试者的许多不同样品来适当地归档 和策划样本和/或管理受试者(例如，患者)信息数据库。
为使用该设备来储存细胞，可以将细胞加入和/或置于该装置的 微孔中。可以处理微孔中的细胞以减轻存储的影响，然后将其置于 合适的存储条件。例如，可以用试剂例如甘油处理细胞以减轻冷冻 的影响。然后，可以将芯片置于合适的存储条件例如冰箱中。可以 将细胞脱水、冻干，和/或冷冻干燥，且可以将芯片置于合适的条件 以保护干燥的细胞。可以向芯片加入额外的结构以进一步促进其作 为存储装置的用途。例如，可以在芯片上放置膜或另一种结构元件， 以便在存储前密封至少一些孔。
芯片可以装载有细胞，使得芯片上的一部分微孔各自被每个大 约一个细胞占据。孵育芯片以允许细胞复制。复制芯片，使用原始 芯片或复制的芯片来鉴定芯片的各孔中存在的细胞或种类或基因签 名(通过例如使用上述的位置索引系统)。将芯片处理，和/或存储 在合适条件下。复制步骤和/或鉴定步骤可以在存储之后而不是存储 之前进行。
可以将来自预先存在的一组分离菌株的每个菌株的一个或多个 细胞置于芯片上的分离的微孔中。可以记录各个菌株或细胞类型放 置的微孔位置，并处理芯片，和/或将其存储在合适条件下。
可以制造一种芯片的版本，其中将防腐化学物隔离在每个孔中 的蜡屏障之下。允许分离物在芯片内密封生长，之后在储存前通过 热诱导释放防腐剂来保存。
此类设备可用于存储/生物储存混合的微生物群样品，例如来自 土壤、人肠道、海水、口腔、皮肤等的微生物群样品。芯片可用于 存储其他类型的生物实体，例如真菌、古细菌、人细胞(包括增殖 细胞)、动物细胞和病毒。
DNA位置索引系统适用于所有生物实体类型，以产生关于各孔 内容物的信息。可以使用定制分析(例如基于抗体或底物的分析) 筛选整个芯片以获得期望活性。例如，可以筛选具有储存的T细胞 群的芯片以获得特定的免疫活性。
在一个说明性实例中，可以从研究参与者收集人粪便微生物群 样品。可以将来自每个个体的粪便微生物生物储存在芯片上，以保 留该个体微生物群的记录以及之后用作靶标微生物来源的微生物群 样品。在另一个实例中，在临床或研究期间或作为治疗工作流程的 一部分(例如，使用离体处理细胞的细胞疗法)，可以从个体取样T 细胞或其他免疫细胞的混合群体。还在另一个实例中，可以将土壤 生物群落与种子库一起存储。
高分辨率选取
可以设计高精度/精确的选取设备或系统以在上述微加工芯片上 执行从和/或到微孔的各种选取功能。靶标基底或芯片可以是在一个 表面上具有注射成型特征的显微镜玻片格式(大约25mm x 75mm x 1mm)。微孔可以网格模式排列，在芯片的边缘周围具有约4-8mm 的无孔边缘。可以基于选取器的能力确定孔的大小和间隔。微孔可 以是沿着各边大小为约25μm至约200μm的正方形，孔边缘之间的 间隔为约25μm至约100μm。微孔可以是圆形或六边形。孔的深度可 以为约25μm至约100μm。例如，75mm x 25mm的玻片具有7mm的 边缘，100μm的正方形孔，边与边的间隔为100μm，具有约16,775 个微孔。
可以设计高精度/精确的选取系统以在上述微加工芯片上执行从 和/或到对应于微孔的一部分膜的各种选取功能。膜可以是之前用于 将生长的细菌密封入微孔的薄片。当从芯片剥离时，膜可以在从芯 片分离后在其表面上保留微孔阵列的印迹以及细菌样品。因此，剥 离的膜可以作为在芯片中生长的细菌的复制物。
高分辨率选取器可以从用户接收数据输入。输入可以包括至少 一对芯片微孔坐标，使得选取器从至少一对输入的坐标和/或选取到 至少一对输入的坐标。在循环之间可以进行灭菌程序。高分辨率选 取器能够在厌氧箱中操作。
高分辨率选取器系统可以接收芯片，并例如使用基准标志物和/ 或参考孔将选取器与芯片对齐。例如，选取器可以选取芯片上的微 孔中生长的细胞至含有生长培养基的96孔或384孔板。选取器可以 包括单个选取针或多个选取针。
高分辨率选取器系统可以接收膜，并例如使用膜上的参考孔标 志物将选取器与膜对齐。例如，选取器可以从膜选取细胞至含有生 长培养基的96孔或384孔板。选取针可以具有不同形状(例如蘑菇 形)和/或表面(例如纹理)以便从膜选取。系统还可以包括一个或多个保持和/或展平膜的机制(例如漂浮针和/或真空)。
高分辨率选取器系统能够经由芯片到芯片的转移复制芯片。基 于基准标志物和/或参考孔，选取器可以接收并对齐第一芯片。基于 基准标志物和/或参考孔，选取器还可以接收并对齐第二芯片。例如， 选取器可以将在第一芯片上的微孔中生长的细胞转移至第二芯片的 微孔。
用于自动选取在微加工装置中培养的至少一种生物实体的多个 种类的靶标种类的高通量系统可以包括用于接收微加工装置的接 口。微加工装置界定高密度微孔阵列。高密度微孔阵列的每个微孔 设制为分离并培养至少一种生物实体的至少一个种类，且包括多个 独特标签的至少一个标签。所述多个独特标签的每个标签包括核酸 分子和与高密度微孔阵列的至少一个微孔相关的位置特异性核苷酸 序列，所述核酸分子包括与所述至少一种生物实体退火的靶标特异 性核苷酸序列。系统还包括具有至少一个突起的高分辨率选取设备， 其用于从高密度微孔阵列的至少一个微孔选取至少一种生物实体。 系统进一步包括用于接收至少一种靶标特异性核苷酸序列指示的输 入装置，和与输入装置和高分辨率选取设备通信偶联的至少一个处 理器。所述至少一个处理器获取来自输入装置的至少一个靶标特异 性核苷酸序列的指示，将所述至少一个靶标特异性核苷酸序列与多 个独特标签比较，基于比较结果确定包含靶标种类的高密度微孔阵 列的至少一个微孔，并控制高分辨率选取设备从高密度微孔阵列的 至少一个确定的微孔选取至少一种生物实体。
公开了用于自动选取在微加工装置中培养的至少一种生物实体 的多个种类的靶标种类的高通量系统。微加工装置界定高密度微孔 阵列，高密度微孔阵列的每个微孔与多个独特引物的至少一个独特 引物相关。系统包括用于接收从微加工装置移除的膜的接口，所述 膜密封高密度微孔阵列的各个微孔以将至少一种生物实体保留在高 密度微孔阵列中，使得移除膜后，对应于高密度微孔阵列的至少一 种生物实体的一部分仍然附着于膜上。系统还包括高分辨率选取设 备，其包括：至少一个突起，用于从对应于高密度微孔阵列的至少 一个微孔的至少一个膜位置选取至少一种生物实体；输入装置，用 于接收与靶标种类相关的至少一个靶标特异性核苷酸序列的指示； 和与输入装置和高分辨率选取设备通信偶联的至少一个处理器。所 述至少一个处理器获取来自输入装置的至少一个靶标特异性核苷酸 序列的指示，将所述至少一个靶标特异性核苷酸序列与多个独特标 签比较，基于比较结果确定包含靶标种类的对应于高密度微孔阵列 的至少一个微孔的至少一个膜位置，并控制高分辨率选取设备从至 少一个确定的膜位置选取至少一种生物实体的一部分。
上述实施方案可以各种方式实现。例如，可以使用硬件、软件 或其组合实现实施方案。当用软件实现时，软件代码可以在任何适 当的处理器或处理器集合(无论是在单个计算机中提供，还是分布 于多个计算机中)上执行。
此外，应当理解，计算机可以多种形式来体现，例如机架式计 算机、台式计算机、笔记本计算机或平板计算机。此外，计算机可 以嵌入在一般不被视为计算机但具有适当处理能力的装置中，包括 个人数字助理(PDA)、智能电话或任何其他合适的便携式或固定 电子设备。
并且，计算机可以具有一个或多个输入和输出装置。这些装置 可用于呈现用户界面。可用于提供用户界面的输出装置的实例包括 打印机或用于输出的视觉呈现的显示屏和扬声器或用于输出的声音 呈现的其他声音产生装置。可用于提供用户界面的输入装置的实例 包括键盘、指向装置如鼠标、触摸板和数字化平板。作为另一个实 例，计算机可以通过声音识别或其他声音形式接收输入信息。
这种计算机可以以任何适当形式通过一个或多个网络互连，包 括诸如企业网络、智能网(EST)或因特网之类的局域网或广域网。 这种网络可以基于任何适当的技术，且可以根据任何适当的方案操 作，且可以包括无线网络、有线网络或光纤网络。
本文列出的各种方法或过程可以编码为软件，其可以在使用各 种操作系统或平台的任意之一的一个或多个处理器上执行。此外， 这种软件可以用任何各种合适的编程语言和/或编程或脚本工具编 写，也可以编译为在框架或虚拟机上执行的可执行机器语言代码或 中间代码。
进一步的实例
微加工装置可以包括具有一系列功能层的基底。所述系列的功 能层包括界定第一阵列实验单元(例如孔)的第一功能层和在之前 功能层的各实验单元中界定随后实验单元阵列(例如微孔)的至少 一个随后功能层。各实验单元可以设置为接收和生长至少一个细胞、 进行至少一次筛选，和/或测试至少一种营养物。
在一个实施方案中，用于筛选针对细胞基质的不同条件的设备 包括基底。基底包括第一表面。所述表面界定第一阵列的孔。各孔 包括内表面。各内表面界定第二阵列的微孔。各微孔设置为接收并 生长至少一个细胞。
在一个实施方案中，用于筛选针对细胞基质的不同条件的设备 包括具有一系列功能层的基底。所述系列的功能层包括：第一功能 层，其界定第一阵列的实验单元，和至少一个随后的功能层，其界 定前述功能层的每个实验单元的随后阵列的实验单元。各实验单元 设置为接收并生长至少一个细胞。
在一个实施方案中，公开了用于在包括第一表面的基底中分离 细胞的方法。第一表面界定第一阵列的实验单元。各实验单元设置 为接收至少一个细胞。至少每个实验单元的一部分设置为具有第一 表面特征，其包括吸引细胞和/或增加细胞占据实验单元的倾向。或 者或此外，至少第一表面的一部分设置为具有第二表面特征，其包 括排斥细胞和/或减少细胞粘附在第一表面上的倾向。方法还包括向 第一表面施用包括细胞的组合物，使得至少一个细胞占据至少一个 实验单元。
在一个实施方案中，用于取样基底中的细胞群的方法包括通过 向基底的第一表面应用选取装置在至少一个微孔中取样细胞群。所 述装置包括至少一个面对第一表面的突起。所述至少一个突起的直 径小于各微孔的开口直径。所述至少一个突起插入容纳细胞群的至 少一个微孔中，使得至少一个微孔中的一部分细胞群附着和/或粘附 于至少一个突起。方法还包括通过从基底的第一表面移除装置来取 出至少一个微孔中的细胞群样品，使得至少一个微孔中的一部分细 胞群仍然附着和/或粘附于至少一个突起。
在一个实施方案中，用于取样基底中的细胞群的方法包括通过 向基底的第一表面应用选取装置在至少一个实验单元中取样细胞 群。所述装置包括至少一个面对第一表面的突起。所述至少一个突 起的直径小于各微孔的开口直径。所述至少一个突起插入容纳细胞 群的至少一个实验单元中，使得至少一个实验单元中的一部分细胞 群附着和/或粘附于至少一个突起。方法还包括通过从基底的第一表 面移除装置来取出至少一个实验单元中的细胞群样品，使得至少一 个试验单元中的一部分细胞群仍然附着和/或粘附于至少一个突起。
在一个实施方案中，用于取样在包括第一表面和与第一表面相 对的第二表面的基底中的细胞群的方法包括向基底的第二表面应用 选取装置，所述第一表面界定第一阵列的微孔。所述装置包括至少 一个面对第二表面的突起。所述至少一个突起的直径约等于或小于 各微孔的开口直径。所述至少一个突起被压靠在所述第二表面上与 容纳细胞群的至少一个微孔相对应的位置，和/或插入容纳细胞群的 至少一个微孔中，使得至少一个微孔中的一部分细胞群移动至孔的 内表面上和/或基底的第一表面上。方法还包括通过收集移动部分的 细胞群来取样至少一个微孔中的细胞群。
在一个实施方案中，用于取样在包括第一表面和与第一表面相 对的第二表面的基底中的细胞群的方法包括向基底的第二表面应用 选取装置，所述第一表面界定第一阵列的实验单元。所述装置包括 至少一个面对第二表面的突起。所述至少一个突起的直径约等于或 小于至少一个实验单元的开口直径。所述至少一个突起被压靠在所 述第二表面上与容纳细胞群的至少一个实验单元相对应的位置，和/ 或插入容纳细胞群的至少一个实验单元中，使得至少一个实验单元 中的一部分细胞群移动至基底的第一表面上。方法还包括收集移动 部分的细胞群。
在一个实施方案中，用于取样包括第一表面的基底中的细胞群 的方法包括向微加工基底的第一表面应用选取装置，所述第一表面 界定第一阵列的孔，各孔的内表面界定第二阵列的微孔，各微孔具 有开口直径。所述装置包括至少一个面对第一表面的突起。所述至 少一个突起的直径小于各微孔的直径。所述至少一个突起插入容纳 细胞群的至少一个微孔中，使得至少一个微孔中的一部分细胞群体 积移动到孔的内表面和基底的第一表面的至少一个上。方法还包括 通过收集体积移动部分的细胞群来取样至少一个微孔中的细胞群。
在一个实施方案中，用于取样包括第一表面的基底中的细胞群 的方法包括向微加工基底的第一表面应用选取装置，所述第一表面 界定第一阵列的实验单元。所述装置包括至少一个面对第一表面的 突起。所述至少一个突起的直径小于至少一个实验单元的直径。所 述至少一个突起插入容纳细胞群的至少一个实验单元中，使得至少 一个实验单元中的一部分细胞群体积移动至基底的第一表面上。方 法还包括通过收集体积移动部分的细胞群来取样至少一个实验单元 中的细胞群。
在一个实施方案中，用于取样包括第一表面的基底中的细胞群 的方法包括通过向基底的第一表面应用选取装置来取样至少一个微 孔中的细胞群，所述第一表面界定第一阵列的孔，各孔包括内表面， 各内表面界定第二阵列的微孔，各微孔具有开口直径。所述装置包 括面对第一表面的至少一个针和/或纳米吸管。所述至少一个针和/ 或纳米吸管的外直径小于各微孔的开口直径，且其内直径能够容纳 靶细胞直径。至少一个针和/或纳米吸管插入容纳细胞群的至少一个 微孔中。方法还包括通过使用压力将一部分细胞群从至少一个微孔 引入装置来取出所述至少一个微孔中的细胞群样品。
在一个实施方案中，用于取样包括第一表面的基底中的细胞群 的方法包括通过向基底的第一表面应用选取装置来取样至少一个微 孔中的细胞群，所述第一表面界定第一阵列的实验单元。所述装置 包括面对第一表面的至少一个针和/或纳米吸管。所述至少一个针和/ 或纳米吸管的外直径小于各微孔的开口直径，且其内直径能够容纳 靶细胞直径。至少一个针和/或纳米吸管插入容纳细胞群的至少一个 实验单元中。方法还包括通过使用压力将一部分细胞群从至少一个 实验单元引入装置来取出所述至少一个实验单元中的细胞群样品。
在一个实施方案中，用于取样包括第一表面的基底中的细胞群 的方法包括通过向在液体中容纳细胞群的至少一个微孔应用聚焦的 声学能量来取样至少一个微孔中的液体中的细胞群，所述第一表面 界定第一阵列的孔，各孔包括界定第二阵列的微孔的内表面。聚焦 的声波能量以有效从至少一个微孔喷射液滴的方式应用。液滴包括 至少一个微孔中的细胞群样品。
在一个实施方案中，用于取样包括第一表面的基底中的细胞群 的方法包括通过向在液体中容纳细胞群的至少一个实验单元应用聚 焦的声学能量来取样至少一个实验单元中的液体中的细胞群，所述 第一表面界定第一阵列的实验单元，聚焦的声波能量以有效从至少 一个实验单元喷射液滴的方式应用。液滴包括至少一个实验单元中 的细胞群样品。
在一个实施方案中，基底包括第一表面和第二表面。第一表面 界定第一阵列的孔。各孔具有界定第二阵列的微孔的内表面。基底 包括至少第一片和第二片，所述第一片包括至少一部分第一表面， 所述第二片包括至少一部分第二表面。所述第一片和第二片沿着至 少一部分与所述第一表面和第二表面平行的平面可拆卸连接。所述 平面划分第二阵列的微孔。第一阵列和/或第二阵列可以是基本上平 面的。用于取样至少一个微孔中的细胞群的方法包括拆卸第一片和 第二片，使得至少一个微孔中的第一部分的细胞群仍然附着于第一 片，且至少一个微孔中的第二部分的细胞群仍然附着于第二片。
在一个实施方案中，基底包括第一表面和第二表面。第一表面 界定第一阵列的实验单元。基底包括至少第一片和第二片，所述第 一片包括至少一部分第一表面，所述第二片包括至少一部分第二表 面。所述第一片和第二片沿着至少一部分与所述第一表面和第二表 面平行的平面可拆卸连接。所述平面划分第一阵列的实验单元。第 一阵列可以是基本上平面的。实验单元可以是孔。用于取样至少一 个实验单元中的细胞群的方法包括拆卸第一片和第二片，使得至少 一个实验单元中的第一部分的细胞群仍然附着于第一片，且至少一 个实验单元中的第二部分的细胞群仍然附着于第二片。
在一个实施方案中，基底包括界定第一阵列的孔的第一表面， 各孔包括内表面，各内表面界定第二阵列的微孔。向至少一个内表 面的至少一部分应用可拆卸膜，使得至少一个微孔中的一部分细胞 群附着于所述可拆卸膜。用于取样至少一个微孔中的细胞群的方法 包括剥离所述可拆卸膜，使得至少一个微孔中的一部分细胞群仍然 附着于所述可拆卸膜。
在一个实施方案中，基底包括界定第一阵列的实验单元的第一 表面。向至少一部分第一表面应用可拆卸膜，使得至少一个实验单 元中的一部分细胞群附着于所述可拆卸膜。用于取样至少一个实验 单元中的细胞群的方法包括剥离所述可拆卸膜，使得至少一个实验 单元中的一部分细胞群仍然附着于所述可拆卸膜。
在一个实施方案中，基底包括第一表面和第二表面。第一表面 界定第一阵列的孔。各孔具有内表面，各内表面界定第二阵列的微 通道。各微通道具有在第一表面的第一开口和在第二表面的第二开 口。向至少一个内表面的至少一部分应用第一可拆卸膜，使得至少 一个微通道中的至少一些细胞群附着于第一可拆卸膜。向至少一部 分的第二表面应用第二可拆卸膜，使得至少一个微通道中的至少一 些细胞群附着于第二可拆卸膜。用于取样至少一个微通道中的细胞 群的方法包括剥离第一可拆卸膜，使得至少一个微通道中的至少一 些细胞群仍然附着于第一可拆卸膜，和/或剥离第二可拆卸膜，使得 至少一个微通道中的至少一些细胞群仍然附着于第二可拆卸膜。
在一个实施方案中，基底包括第一表面和第二表面。第一表面 界定第一阵列的实验单元。各实验单元具有在第一表面的第一开口 和在第二表面的第二开口。向至少一部分第一表面应用第一可拆卸 膜，使得至少一个实验单元中的至少一些细胞群附着于第一可拆卸 膜。向至少一部分的第二表面应用第二可拆卸膜，使得至少一个实 验单元中的至少一些细胞群附着于第二可拆卸膜。用于取样至少一 个实验单元中的细胞群的方法包括剥离第一可拆卸膜，使得至少一 个实验单元中的至少一些细胞群仍然附着于第一可拆卸膜，和/或剥 离第二可拆卸膜，使得至少一个实验单元中的至少一些细胞群仍然 附着于第二可拆卸膜。
在一个实施方案中，用于培养源自环境的样品中的细胞的方法 包括：向基底的第一表面应用样品，使得至少一个细胞占据至少一 个微孔、孔或实验单元；向至少一部分第一表面应用半渗透性膜， 使得营养物可以扩散入至少一个微孔、孔或实验单元，并防止和/或 减轻至少一个占据细胞从至少一个微孔、孔或实验单元逃离；并在 具有至少一种营养物的至少一个微孔、孔或实验单元中孵育所述至 少一个占据细胞。
在一个实施方案中，用于在基底中培养和适应源自环境的样品 中的细胞的方法包括：向基底的第一表面应用样品，使得至少一个 细胞占据至少一个微孔、孔或实验单元；向至少一部分第一表面应 用半渗透性膜，使得营养物可以扩散入至少一个微孔、孔或实验单 元，并防止和/或减轻至少一个占据细胞从至少一个微孔、孔或实验 单元逃离；在具有至少一种营养物的至少一个微孔、孔或实验单元 中孵育所述至少一个占据细胞；使用进行性部分交换在一段时间内 从所述至少一种营养物逐渐过渡到至少一种其他营养物制剂；并检 测在至少一个微孔、孔或实验单元中的至少一个占据细胞的生长。
在一个实施方案中，可以将合并的分子分析数据元素分配和/或 相关回原始的各个位置。在一个实施方案中，微阵列包括用于施用 样品的多个位置。微阵列上的各位置可以设置为接收一部分样品。 各位置用独特标签标记，所述独特标签用于鉴定在一部分样品从微 阵列移除后，该部分样品来自的位置。
在一个实施方案中，用于鉴定在含有至少一个核酸分子的一部 分样品从微阵列移除后，所述部分样品来自微阵列上的哪个位置的 方法包括步骤(a)在微阵列的多个位置的一个或多个上施用一个或 多个部分的样品。各位置用包含核酸分子的独特标签标记。所述核 酸分子包含：(i)位置特异性核苷酸序列；和(ii)第一靶标特异 性核苷酸序列。该方法还包括步骤(b)允许至少一部分样品中发现 的核酸分子与标记位置的标签退火。该方法进一步包括步骤(c)对 退火的核酸分子群进行引物延伸、逆转录、单链连接或双链连接，从而将位置特异性核苷酸序列整合入每个通过引物延伸、逆转录、 单链连接或双链连接产生的核酸分子。该方法进一步包括步骤(d) 合并步骤(c)中产生的核酸分子群；(e)测序合并的核酸分子群， 从而获得一个或多个位置特异性核苷酸序列的序列；和(f)将从合 并的核酸分子群获得的至少一个位置特异性核苷酸序列的序列与用 包含位置特异性核苷酸序列的标签标记的微阵列上的位置相关联， 从而鉴定包含至少一个核酸分子的一部分样品来自微阵列的哪个位 置。样品可以包括至少一个细胞，且细胞可以在步骤(a)之后和步 骤(b)之前复制。在步骤(b)之前，可以从至少一个位置移除一 部分样品的一部分，且所述一部分样品的一部分可以存储于与微阵 列上所述一部分样品的初始位置相关的单独容器中。
在一个实施方案中，用于制造包括用于施用样品的多个位置的 微阵列的方法包括步骤(a)合成多个标签，其中至少一个位置用独 特标签标记。每个标签包含核酸分子，所述核酸分子包含：(i)位 置特异性核苷酸序列；和(ii)第一靶标特异性核苷酸序列。该方法进一步包括步骤(b)将标签置于微阵列的多个位置的至少一个位置 上。独特标签可以包含核酸分子，所述核酸分子包含：(i)位置特 异性核苷酸序列；和(ii)第一靶标特异性核苷酸序列。标签可以进 一步包括扩增引物结合位点和/或适配子核苷酸序列。
可以使用环烯烃聚合物经由注射成型来制造微加工芯片。基底 或芯片可以具有基本上平坦的表面，大小为约1英寸乘约3英寸。 表面可以进一步界定约200,000个孔，各孔的直径为约50μm。或者， 表面可以界定约800,000个微孔，各微孔的直径为约25μm。可以用电晕等离子体处理来处理表面使其更亲水。
可以将从土壤分离的微生物(例如细菌)稀释到土壤提取营养 物，并向芯片表面施用。然后，可以向芯片表面应用膜。例如，膜 可以是水凝胶层。可是使用例如层压将膜可逆或不可逆地连接或固 定至芯片。接着，可以先在膜和芯片表面上放置第二装置，以将芯片表面分成分区。表面的各分区中具有一些亚组的孔或微孔。
在芯片上的适应中，各分区可以装载有源自环境的营养培养基。 在孵育期间，可以监测芯片以观察细菌生长，例如使用光学系统来 检测随着细胞生长微孔中的差异。可以随时间缓慢调节营养培养基， 直到它是可用于在实验室环境生长细菌的全配制培养基。
在芯片上的适应中，可以取样其中观察到细菌生长的任何孔或 微孔。可以将细菌样品转移至，例如平板、第二芯片或传统工具例 如培养皿，以适应配制的培养基。
一些实施方案可用于优化培养基。例如，可以向芯片表面施用 单个种类的细菌。然后，可以向芯片表面应用膜。例如，膜可以是 水凝胶层。可是使用例如层压将膜可逆或不可逆地连接或固定至芯 片。接着，可以在膜和/或芯片表面上放置第二装置，以将膜和/或芯 片表面分成分区。膜和/或表面的各分区中具有一些亚组的孔或微孔， 其在膜下面和/或表面上面。各分区可以装载有不同培养基(例如， 源自不同环境)。孵育期间，可以监测芯片以观察在具有不同营养 制剂的孔或微孔中的生长率。
一些实施方案可用于筛选溶解磷酸盐的微生物，尤其是用于农 业应用。磷是植物的主要必需大量营养素。可以管理土壤磷以优化 作物产量，并且以磷肥的形式向土壤施用磷。然而，大量的作为化 学肥料施用于土壤的可溶性无机磷酸盐被迅速固定，使植物无法利 用。溶磷细菌菌株可从不溶性化合物中水解有机磷和无机磷，并可 用于提高植物生长和产量。包括微生物的样品可以源自环境，例如 土壤(尤其是从环境中的不溶化合物有效水解有机磷和无机磷)。 根据一个实施方案，可以将样品上样到具有至少一个阵列的实验单 元的基底的表面上，使得至少一些微生物占据多个实验单元。可以 在具有不同形式的磷的多个实验单元中孵育占据的微生物，并比较/ 筛选它们水解不同形式的磷的能力。
一些实施方案可用于筛选具有较高生长率的突变体。微生物(例 如细菌)样品可以源自已经用诱变剂处理的单个实验室培养物。根 据一个实施方案，可以将样品上样到具有至少一个阵列的实验单元 的基底的表面上，使得至少一些细菌占据多个实验单元。可以在具 有至少一种营养物的多个实验单元中孵育占据的细菌，并观察/比较 以鉴定具有较高生长率的实验单元。
一些实施方案可用于鉴定例如新的抗生素、抗真菌剂或抗病毒 化合物。包括微生物(例如细菌)的样品可以源自环境。根据一个 实施方案，可以将样品上样到具有至少一个阵列的实验单元的基底 的表面上，使得至少一些细菌占据多个实验单元。在多个实验单元中生长占据的细菌一段时间，然后在第一占据细菌上生长一层指示 菌(这可能需要琼脂薄层)。在指示菌层中产生透明斑的实验单元 表明产生抗生素。
一些实施方案可用于筛选特定的酶活性。根据一个实施方案， 可以将包括细胞的样品上样到具有至少一个阵列的实验单元的基底 的表面上，使得至少一种细胞占据多个实验单元。在多个实验单元 中生长占据的细胞一段时间，然后加入当被酶切割时产生颜色的底 物。产生这种颜色反应的实验单元表明所需的酶活性。
一些实施方案可用于筛选执行生物修复的微生物，尤其是用于 环境清洁应用。污染和环境污染是复杂的。例如，溢油或其他液体 石油烃释放到环境中的影响取决于许多因素。在海洋环境中，油的 类型、水的温度和海岸线的类型均影响清洁。包括微生物的样品可以来自环境，例如含油的岩石形成。根据一个实施方案，可以将样 品上样到具有至少一个阵列的实验单元的基底的表面上，使得至少 一些微生物占据多个实验单元。可以在具有不同类型油的多个实验 单元中孵育占据的微生物，并比较/筛选它们去除或中和油的能力。
结论
尽管本文描述并说明了各种发明实施方案，本领域技术人员容 易想到各种其他方式和/或结构来执行本文所述的功能和/或获得本 文所述的结果和/或一个或多个优势，这种变体和/或修改的每一个认 为是本文所述的发明实施方案的范围内。更一般地，本领域技术人 员将容易理解，本文所述的所有参数、尺寸、材料和构造意在是示 例性的，实际参数、尺寸、材料和/或构造将取决于使用本发明的教 导的具体一个或多个应用。本领域技术人员将认识到或能够使用不 超过常规实验来确定本文所述的具体的发明实施方案的许多等同 物。因此，应当理解，前述实施方案仅以实例的方式表示，且在所 附权利要求及其等同物的范围内，发明实施方案可以除具体描述和 要求保护之外进行。本公开的发明实施方案要求保护本文所述的每 个单独的特征、系统、物件、材料、试剂盒和/或方法。此外，如果 这种特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法没有互相矛盾，两 个或多个这种特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法的任何组 合包括在本公开的发明范围内。
并且，各种发明概念可以体现在已经提供实例的一种或多种方 法。作为方法的一部分进行的动作可以任何合适的方式排序。因此， 可以构建其中以不同于图示的顺序执行动作的实施方案，包括同时 执行一些动作，尽管在示例性实施方案中是顺序动作的。
本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献的全 文均通过引用并入本文。
本文定义并使用的所有定义应当理解为控制字典定义，通过引 用并入的文献中的定义和/或定义术语的普通含义。
除非另有清楚说明，在说明书和权利要求中使用的不定冠词 “一”和“一个”应当理解为“至少一个”。
在说明书和权利要求中使用的短语“和/或”应该理解为是指连 接的元素“任一个或两者”，即，元素在一些情况下结合存在，其 他情况下分别存在。用“和/或”列举的多个元素应当以相同方式理 解，即，结合“一个或多个”元素。除了用“和/或”定语特定指出 的元素外，任选存在其他元素，无论其与那些特定指出的元素相关 或不相关。因此，作为非限制性实例，当与开放式语言例如“包括” 一起使用时，“A和/或B”在一个实施方案中，仅指A(任选包含 除B之外的元素)；在另一个实施方案中，仅指B(任选包含除A 之外的元素)；还在另一个实施方案中，指A和B两者(任选包含 其他元素)；等等。
如在说明书和权利要求中所用，“或”应当理解为与上述“和/ 或”具有相同含义。例如，当分离列表中的项目时，“或”或“和/ 或”应当解释为包含的，即，包含大量或一系列元素的至少一个， 但也包含超过一个，和任选的其他未列出的项目。仅当术语明确指 示相反时，例如“仅一个”或“只有一个”或“由……组成”(当 在权利要求中使用时)是指仅包含大量或一系列元素的一个元素。 通常，当之前是排他性术语(例如“任一个”、“其中一个”、“仅 一个”或“只有一个”)时，本文所用的术语“或”应当仅仅理解 为表示排他性选择(即，“一个或另一个，但不是两者”)。当在 权利要求中使用时，“基本上由……组成”应当具有其在专利法领 域使用时的通常含义。
如在说明书和权利要求中所用，当指代一个或多个元素的列表 时，短语“至少一个”应当理解为是指从所述元素列表的任何一个 或多个元素选择的至少一个元素，而不一定包括在元素列表中具体 列举的每个元素，且不排除元素列表中的元素的任何组合。该定义 还允许任选存在除短语“至少一个”所指的元素列表内特定指出的 元素之外的元素，无论其与特定指出的那些元素相关或不相关。因 此，作为非限制性实例，“A和B中的至少一个”(或等同地，“A 或B中的至少一个”，或等同地，“A和/或B中的至少一个”)在 一个实施方案中，是指至少一个(任选包括超过一个)A而B不存 在(且任选包括除B之外的元素)；在另一个实施方案中，是指至 少一个(任选包括超过一个)B而A不存在(且任选包括除A之外 的元素)；还在另一个实施方案中，是指至少一个(任选包括超过 一个)A和至少一个(任选包括超过一个)B(任选包括其他元素)； 等等。
在权利要求和上述说明书中，所有过渡短语例如“包含”、“包 括”、“携带”、“具有”、“含有”、“涉及”、“容纳”、“由…… 构成”等应理解为开放式，即，是指包括但不限于。仅有过渡短语 “由……组成”和“基本上由……组成”应分别理解为封闭式或半 封闭式过渡短语，如美国专利局，专利审查程序手册，第2111.03 小节所示。
本发明包括以下实施方案：
1.一种方法，包括：
获得用于培养来自样品的至少一个细胞的界定高密度微孔阵列 的微加工装置，所述高密度微孔阵列的至少一个微孔包含所述至少 一个细胞和至少一个独特标签，所述至少一个独特标签用于鉴定其 中培养至少一个种类的至少一个细胞的高密度微孔阵列的至少一个 微孔，所述至少一个独特标签包含核酸分子，所述核酸分子包含：
靶标特异性核苷酸序列，用于与至少一个目标种类的至少一 个细胞中存在的靶标核酸片段退火；和
位置特异性核苷酸序列，用于鉴定所述高密度微孔阵列的所 述至少一个微孔；
孵育所述微加工装置以从所述高密度微孔阵列的至少一个微孔 中的至少一个细胞生长多个细胞；
将所述高密度微孔阵列的至少一个微孔中的多个细胞分割成第 一部分的多个细胞和第二部分的多个细胞，所述至少一个独特标签 保持与所述至少第一部分的多个细胞在一起；
分析所述第一部分的多个细胞，以：
测定所述至少一个目标种类；和
基于所述至少一个独特标签鉴定其中培养所述至少一个目 标种类的高密度微孔阵列的至少一个微孔；和
基于鉴定的其中培养所述至少一个目标种类的高密度微孔 阵列的至少一个微孔，在所述第二部分的多个细胞内定位所述至少 一个目标种类。
2.实施方案1所述的方法，进一步包括从所述第二部分的多个 细胞选取所述至少一个目标种类的至少一个细胞。
3.实施方案1所述的方法，其中：
所述至少一个独特标签包含第一独特标签和第二独特标签；
所述第一独特标签包含预先确定的第一位置特异性核苷酸序 列，以鉴定所述高密度微孔阵列中的微孔的第一维度；
所述第二独特标签包含预先确定的第二位置特异性核苷酸序 列，以鉴定所述高密度微孔阵列中的微孔的第二维度；和
所述第一位置特异性核苷酸序列和所述第二位置特异性核苷酸 序列一起鉴定所述高密度微孔阵列的至少一个微孔。
4.实施方案3所述的方法，其中：
所述第一独特标签包含含有正向聚合酶链式反应(PCR)引物的 第一靶标特异性核苷酸序列；和
所述第二独特标签包含含有反向PCR引物的第二靶标特异性核 苷酸序列。
5.实施方案1所述的方法，其中获得所述微加工装置包括将所 述至少一个独特标签加入所述高密度微孔阵列的至少一个微孔。
6.实施方案1所述的方法，其中获得所述微加工装置包括将包 含至少一个细胞的样品上样到所述微加工装置。
7.实施方案1所述的方法，其中获得所述微加工装置包括施用 膜以将所述至少一个细胞保留在所述高密度微孔阵列的至少一个微 孔中。
8.实施方案7所述的方法，其中所述膜是仅气体可渗透和不可 渗透中的至少一种。
9.实施方案7所述的方法，其中所述膜允许营养介质扩散入所 述高密度微孔阵列的至少一个微孔。
10.实施方案7所述的方法，其中分割所述高密度微孔阵列的至 少一个微孔中的多个细胞包括从所述高密度微孔阵列的至少一个微 孔移除所述膜，使得所述第一部分的多个细胞仍然在所述高密度微 孔阵列的至少一个微孔中，且所述第二部分的多个细胞仍然与所述 膜的表面连接。
11.实施方案10所述的方法，其中在所述第二部分的多个细胞 内定位所述至少一个目标种类包括鉴定与其中培养所述至少一个目 标种类的高密度微孔阵列的至少一个微孔相对应的所述膜的表面上 的区域。
12.实施方案7所述的方法，其中分割所述高密度微孔阵列的至 少一个微孔中的多个细胞包括从所述高密度微孔阵列的至少一个微 孔移除所述膜，使得所述第一部分的多个细胞仍然与所述膜的表面 连接，且所述第二部分的多个细胞仍然在所述高密度微孔阵列的至 少一个微孔中。
13.实施方案1所述的方法，其中分析所述第一部分的多个细胞 以测定所述至少一个目标种类存在或不存在包括对所述第一部分的 多个细胞进行聚合酶链式反应(PCR)以基于所述至少一个独特标 签的靶标特异性核苷酸序列来扩增在所述第一部分的多个细胞中存 在的任何靶标核酸片段。
14.实施方案13所述的方法，其中分析所述第一部分的多个细 胞以测定所述至少一个目标种类存在或不存在进一步包括将任何 PCR扩增的靶标核酸片段进行测序。
15.实施方案14所述的方法，其中所述测序包括进行下一代测 序(NGS)。
16.实施方案1所述的方法，进一步包括补充用于培养至少一个 种类的至少一个细胞的至少一种营养物。
17.实施方案16所述的方法，其中所述用于培养至少一个种类 的至少一个细胞的至少一种营养物包含以下的至少一种：
来自所述至少一个种类的至少一个细胞的天然环境的提取物；
源自所述至少一个种类的至少一个细胞的天然环境的培养基；
配制的与所述至少一个种类的至少一个细胞的天然环境类似的 培养基；
仅培养所述至少一个种类的至少一个细胞的选择培养基；和
区分所述至少一个种类的至少一个细胞的鉴别培养基。
18.实施方案17所述的方法，其中所述至少一个种类的至少一 个细胞的天然环境可以是以下的至少一种：生物组织、生物产品、 微生物悬浮液、空气、土壤、沉积物、活的有机物、饲料、石油、 污水和水。
19.实施方案1所述的方法，其中所述至少一个细胞包括以下的 至少一种：古细菌细胞、细菌细胞和真核细胞。
20.实施方案1所述的方法，其中所述至少一个目标种类基于核 酸和基因中的至少一种选择。
21.一种方法，包括：
获得用于培养来自样品的至少一个细胞的界定高密度微孔阵列 的微加工装置，所述高密度微孔阵列的至少一个微孔包含所述至少 一个细胞；
孵育所述微加工装置以从所述高密度微孔阵列的至少一个微孔 中的至少一个细胞生长多个细胞；
筛选所述多个细胞以测定至少一个目标种类的多个细胞的存在 或不存在；和
如果所述至少一个目标种类存在，从其中培养所述至少一个目 标种类的高密度微孔阵列的至少一个微孔选取所述至少一个目标种 类的至少一个细胞。
22.实施方案21所述的方法，其中将所述多个细胞筛选到至少 一个目标种类包括基于以下的至少一种进行分析：代谢物、代谢途 径、酶、蛋白质、核酸、表型、基因、突变、适应性和能力。
23.实施方案21所述的方法，其中：
所述高密度微孔阵列的至少一个微孔进一步包含至少一个独特 标签，以鉴定其中培养至少一个种类的至少一个细胞的高密度微孔 阵列的至少一个微孔，所述至少一个独特标签包含核酸分子，所述 核酸分子包含：
靶标特异性核苷酸序列，用于与所述至少一个目标种类中存 在的靶标核酸片段退火；和
位置特异性核苷酸序列，用于鉴定所述高密度微孔阵列的所 述至少一个微孔；
该方法进一步包括，如果存在至少一个目标种类，使用所述位 置特异性核苷酸序列来鉴定其中培养所述至少一个目标种类的高密 度微孔阵列的至少一个微孔。
24.实施方案23所述的方法，其中所述至少一个目标种类包含 其中存在所述靶标核酸片段的至少一个细胞，其中所述靶标核酸片 段包括涉及以下至少一种的遗传密码：代谢物、代谢途径、酶、蛋 白质、核酸、表型、基因、突变、适应性和能力。
25.实施方案21所述的方法，其中：
所述方法进一步包括，在筛选所述多个细胞以测定至少一个目 标种类的多个细胞的存在或不存在之前，将所述高密度微孔阵列的 至少一个微孔中的多个细胞分割成第一部分的多个细胞和第二部分 的多个细胞；
筛选所述多个细胞包括仅筛选所述第一部分的多个细胞以测定 至少一个目标种类的多个细胞的存在或不存在；和
选取所述至少一个目标种类的至少一个细胞包括从所述第二部 分的多个细胞选取所述至少一个目标种类的至少一个细胞。
26.一种方法，包括：
获得用于培养来自样品的至少一个细胞的界定高密度微孔阵列 的微加工装置，所述高密度微孔阵列的至少一个微孔包含至少一个 独特标签，以鉴定其中培养至少一个种类的至少一个细胞的高密度 微孔阵列的至少一个微孔，所述至少一个独特标签包含核酸分子， 所述核酸分子包含：
靶标特异性核苷酸序列，用于与至少一个目标种类的至少一 个细胞中存在的靶标核酸片段退火；和
位置特异性核苷酸序列，用于鉴定所述高密度微孔阵列的所 述至少一个微孔；
制备样品并将其上样到所述微加工装置，使得将所述至少一种 细胞的不超过一个细胞加入多数高密度微孔阵列的各个微孔中；和
基于所述至少一个独特标签，测定：
包含至少一个细胞的高密度微孔阵列的微孔的第一数量；
包含来自样品的至少一个目标种类的高密度微孔阵列的微 孔的第二数量；和
基于所述第一数量和第二数量，测定样品中至少一个目标种 类的相对丰度。
27.实施方案26所述的方法，进一步包括测定：
来自样品的细胞的总数；和
基于样品中细胞的总数和样品中至少一个目标种类的相对丰 度，测定样品中至少一个目标种类的绝对丰度。
28.一个试剂盒，包括：
用于接收含有至少一个细胞的样品的微加工装置，所述微加工 装置界定用于培养所述至少一个细胞的高密度微孔阵列；
用于加入高密度微孔阵列的至少一个微孔的至少一个独特标 签，其用于鉴定其中培养至少一个种类的至少一个细胞的高密度微 孔阵列的至少一个微孔，所述至少一个独特标签包含核酸分子，所 述核酸分子包含：
靶标特异性核苷酸序列，用于与至少一个细胞的靶标核酸片 段退火；和
位置特异性核苷酸序列，用于鉴定所述高密度微孔阵列的所 述至少一个微孔。
29.实施方案28所述的试剂盒，其中所述至少一个独特标签置 于高密度微孔阵列的至少一个微孔中。
30.实施方案28所述的试剂盒，进一步包括膜，用于在将样品 上样到所述微加工装置后将所述至少一个细胞保留在高密度微孔阵 列的至少一个微孔中。
31.实施方案30所述的试剂盒，其中所述膜允许至少一种营养 物扩散入所述高密度微孔阵列的至少一个微孔。
32.实施方案30所述的试剂盒，其中所述膜是仅气体可渗透的 和不可渗透的至少一种。
33.实施方案28所述的试剂盒，进一步包括用于培养至少一个 种类的至少一个细胞的至少一种营养物。
34.实施方案33所述的试剂盒，其中所述用于培养至少一个种 类的至少一个细胞的至少一种营养物包含以下的至少一种：
来自所述至少一个种类的至少一个细胞的天然环境的提取物；
源自所述至少一个种类的至少一个细胞的天然环境的培养基；
配制的与所述至少一个种类的至少一个细胞的天然环境类似的 培养基；
仅培养所述至少一个种类的至少一个细胞的选择培养基；和
区分所述至少一个种类的至少一个细胞的鉴别培养基。
35.实施方案34所述的试剂盒，其中所述至少一个种类的至少 一个细胞的天然环境可以是以下的至少一种：生物组织、生物产品、 微生物悬浮液、空气、土壤、沉积物、活的有机物、饲料、石油、 污水和水。
36.一种试剂盒，包括：
用于接收含有至少一个细胞的样品的微加工装置，所述微加工 装置界定用于培养所述至少一个细胞的高密度微孔阵列；
膜，用于在将样品上样到所述微加工装置后将所述至少一个细 胞保留在高密度微孔阵列的至少一个微孔中。
37.实施方案36所述的试剂盒，其中所述膜允许至少一种营养 物扩散入所述高密度微孔阵列的至少一个微孔。
38.实施方案36所述的试剂盒，用于培养至少一个种类的至少 一个细胞的至少一种营养物。
39.实施方案38所述的试剂盒，其中所述用于培养至少一个种 类的至少一个细胞的至少一种营养物包含以下的至少一种：
来自所述至少一个种类的至少一个细胞的天然环境的提取物；
源自所述至少一个种类的至少一个细胞的天然环境的培养基；
配制的与所述至少一个种类的至少一个细胞的天然环境类似的 培养基；
仅培养所述至少一个种类的至少一个细胞的选择培养基；和
区分所述至少一个种类的至少一个细胞的鉴别培养基。
40.实施方案39所述的试剂盒，其中所述至少一个种类的至少 一个细胞的天然环境可以是以下的至少一种：生物组织、生物产品、 微生物悬浮液、空气、土壤、沉积物、活的有机物、饲料、石油、 污水和水。
41.实施方案36所述的试剂盒，进一步包括用于加入高密度微 孔阵列的至少一个微孔的至少一个独特标签，从而鉴定其中培养至 少一个种类的至少一个细胞的高密度微孔阵列的至少一个微孔，所 述至少一个独特标签包含核酸分子，所述核酸分子包含：
靶标特异性核苷酸序列，用于与至少一个细胞的靶标核酸片 段退火；和
位置特异性核苷酸序列，用于鉴定所述高密度微孔阵列的所 述至少一个微孔。
42.一种方法，包括：
获得用于培养来自样品的至少一种生物实体的界定高密度实验 单元阵列的微加工装置，所述高密度实验单元阵列的至少一个实验 单元包含所述至少一种生物实体和至少一个独特标签，所述独特标 签用于鉴定与其中培养至少一个类型的至少一种生物实体的高密度 实验单元阵列的至少一个实验单元相关的空间信息，所述至少一个 独特标签包含第一结合分子，所述第一结合分子包含：
靶标特异性成分，用于结合至少一个目标类型的至少一种生 物实体中存在的生物分子；和
位置特异性成分，用于鉴定与高密度实验单元阵列的至少一 个实验单元相关的空间信息，
其中所述至少一种生物实体是以下的至少一种：生物体、细 胞、细胞成分、细胞产物和病毒，和
其中所述第一结合分子是蛋白质、核酸、碳水化合物、脂质 和药物中的至少一种；
孵育所述微加工装置以从所述高密度实验单元阵列的至少一个 实验单元中的至少一种生物实体生长多个生物实体；和
分析所述高密度实验单元阵列的至少一个实验单元中的多个生 物实体，以：
测定所述至少一种生物实体的至少一个目标类型；和
基于所述至少一个独特标签鉴定与其中培养至少一个目标 类型的至少一种生物实体的高密度实验单元阵列的至少一个实验单 元相关的空间信息。
43.一种试剂盒，包括：
用于接收含有至少一种生物实体的样品的微加工装置，所述微 加工装置界定用于培养所述至少一种生物实体的高密度实验单元阵 列；
用于加入高密度实验单元阵列的至少一个实验单元的至少一个 独特标签，从而鉴定与其中培养至少一个目标类型的至少一种生物 实体的高密度实验单元阵列的至少一个实验单元相关的空间信息， 所述至少一个独特标签包含第一结合分子，所述第一结合分子包含：
靶标特异性成分，用于结合至少一个目标类型的至少一种生 物实体中存在的生物分子；和
位置特异性成分，用于鉴定与高密度实验单元阵列的至少一 个实验单元相关的空间信息，
其中所述至少一种生物实体是以下的至少一种：生物体、细 胞、细胞成分、细胞产物和病毒，和
其中所述第一结合分子是蛋白质、核酸、碳水化合物、脂质和 药物中的至少一种。

Claims (20)

1.一种使用微加工装置培养和筛选至少一种生物实体的方法，所述装置具有限定表面密度为至少500个微孔/cm2的微孔阵列的顶面，所述方法包括：
将样品上样到所述微加工装置上，使得所述微孔阵列的至少一个微孔包括至少一个细胞和一定量的营养物；
将膜施用于所述微加工装置以将所述至少一个细胞和所述营养物保留在所述微孔阵列的至少一个微孔中；
在所述微孔阵列的所述至少一个微孔中培养来自所述至少一个细胞的多个细胞；以及
分析所述多个细胞以确定样品中感兴趣的生物实体的存在或不存在。
2.权利要求1所述的方法，其中所述膜是仅气体可渗透的。
3.权利要求1所述的方法，其中所述膜是不可渗透的。
4.权利要求1所述的方法，其进一步包括：
将至少一个细胞，但不是多个细胞的全部，从所述微孔阵列的至少一个选定的微孔转移到目标位置，其中分析所述多个细胞包括分析转移到所述目标位置的所述至少一个细胞。
5.权利要求1所述的方法，其进一步包括：
将至少一个细胞，但不是多个细胞的全部，从所述微孔阵列的至少一个选定的微孔转移到目标位置，其中分析所述多个细胞包括分析所述多个细胞中尚未转移到所述目标位置的那些细胞。
6.权利要求1所述的方法，其中分析所述多个细胞在所述微加工装置上原位进行，所述方法进一步包括：
如果确定存在至少一种生物实体，则从所述微孔阵列的所述至少一个微孔中挑选至少一个细胞并将挑选的所述至少一个细胞转移到目标位置。
7.权利要求1所述的方法，其中所述微孔阵列的至少一个微孔包括独特标签，所述独特标签包含：
一种核酸分子，其包括：(1)靶标特异性核苷酸序列，其用于与可能存在于微孔中的感兴趣生物实体的靶核酸片段退火，以及(2)位置特异性核苷酸序列，其用于识别所述微加工装置上所述微孔的位置。
8.权利要求1所述的方法，其进一步包括：
将所述微孔阵列的所述至少一个微孔中的所述多个细胞分割成第一部分的多个细胞和第二部分的多个细胞。
9.权利要求8所述的方法，其中分割所述多个细胞包括从所述微加工装置剥离所述膜，使得所述第二部分的多个细胞连接到所述被剥离的膜。
10.权利要求8所述的方法，其进一步包括：
从所述第一部分或所述第二部分的多个细胞挑选至少一个细胞并将所述至少一个细胞转移到目标位置。
11.权利要求1所述的方法，其中分析所述多个细胞包括进行基于代谢物、代谢途径、酶、蛋白质、核酸、表型、基因、突变、适应性和能力中的至少一种的分析。.
12.权利要求1所述的方法，其中每个微孔具有约25μm至约500μm的直径。
13.权利要求1所述的方法，其中每个微孔具有底部。
14.权利要求1所述的方法，其中在不向其中包含所述至少一个细胞的所述至少一个微孔中提供额外营养物的情况下进行所述多个细胞的培养。
15.权利要求1所述的方法，其中所述微加工芯片的微孔阵列具有至少750个微孔/cm2的表面密度。
16.权利要求1所述的方法，其中所述至少一个细胞包括至少一种细菌细胞。
17.一种方法，其包括：
将样品上样到具有限定微孔阵列的顶面的微加工装置上，使得所述微孔阵列的至少一个微孔包括至少一个细胞，其中所述微孔阵列具有至少500个微孔/cm2的表面密度，并且其中每个微孔具有底部，
将膜施用到所述微加工装置以将所述至少一个细胞和至少一定量的营养物保留在至少一个微孔中；
在不提供额外营养物的情况下，在所述微孔阵列的所述至少一个微孔中培养来自所述至少一个细胞的多个细胞；以及
从来自所述微孔阵列的选定微孔的多个细胞中挑选至少一个细胞并将挑选的所述至少一个细胞转移到目标位置。
18.权利要求17所述的方法，其进一步包括：
基于分析在所述微加工装置中生长的多个细胞来确定至少一种感兴趣的生物实体的存在或不存在，其中用于所述挑选的选定微孔是基于微孔包括感兴趣的生物实体的肯定确定来选定的。
19.权利要求17所述的方法，其进一步包括：
基于分析转移到所述目标位置的所述至少一个细胞来确定至少一种感兴趣的生物实体的存在或不存在。
20.权利要求17所述的方法，其中每个微孔具有约25μm至约500μm的直径。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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US10865434B2 (en) 2015-04-21 2020-12-15 General Automation Lab Technologies Inc. High resolution systems, kits, apparatus, and methods for screening microorganisms and other high throughput microbiology applications
US10788452B2 (en) 2015-04-21 2020-09-29 General Automation Lab Technologies Inc. High resolution systems, kits, apparatus, and methods for bacterial community relationship determination and other high throughput microbiology applications
CN114015569A (zh) * 2015-04-21 2022-02-08 通用自动化实验技术公司 用于高通量微生物学应用的高分辨率系统、试剂盒、设备和方法
DK3314007T3 (da) 2015-06-25 2024-04-22 Native Microbials Inc Fremgangsmåder, apparater og systemer til analyse af mikroorganismestammer fra komplekse heterogene miljøer til forudsigelse og identificering af funktionelle forbindelser og interaktioner derimellem og udvælgelse og syntese af mikrobielle ensembler baseret derpå
US9938558B2 (en) 2015-06-25 2018-04-10 Ascus Biosciences, Inc. Methods, apparatuses, and systems for analyzing microorganism strains from complex heterogeneous communities, predicting and identifying functional relationships and interactions thereof, and selecting and synthesizing microbial ensembles based thereon
US10851399B2 (en) 2015-06-25 2020-12-01 Native Microbials, Inc. Methods, apparatuses, and systems for microorganism strain analysis of complex heterogeneous communities, predicting and identifying functional relationships and interactions thereof, and selecting and synthesizing microbial ensembles based thereon
US9993507B2 (en) 2016-01-07 2018-06-12 Ascus Biosciences, Inc. Methods of improving milk production and compositional characteristics
US10672601B2 (en) * 2016-06-07 2020-06-02 The Regents Of The University Of California Detecting compounds in microfluidic droplets using mass spectrometry
WO2018005390A1 (en) 2016-06-30 2018-01-04 General Automation Lab Technologies, Inc. High resolution systems, kits, apparatus, and methods using lateral flow for high throughput microbiology applications
US11313000B2 (en) 2016-08-04 2022-04-26 Duke University Compositions and methods for measuring bacterial growth
JP2019531730A (ja) * 2016-09-28 2019-11-07 ジェネラル オートメーション ラボ テクノロジーズ インコーポレイテッド 細菌群の関係決定及び他のハイスループット微生物学適用高分解能システム、キット、装置、並びに方法
JP2019535245A (ja) * 2016-10-19 2019-12-12 ジェネラル オートメーション ラボ テクノロジーズ インコーポレイテッド ハイスループット微生物学適用高分解能システム、キット、装置、並びに微生物その他のスクリーニング方法
EP3562954A1 (en) 2016-12-28 2019-11-06 Ascus Biosciences, Inc. Methods, apparatuses, and systems for analyzing complete microorganism strains in complex heterogeneous communities, determining functional relationships and interactions thereof, and identifying and synthesizing bioreactive modificators based thereon
CN110520738A (zh) * 2017-04-12 2019-11-29 通用自动化实验技术公司 用于采拾生物样品的装置和方法
WO2018201049A1 (en) 2017-04-28 2018-11-01 Ascus Biosciences, Inc. Methods for supporting grain intensive and/or energy intensive diets in ruminants with a synthetic bioensemble of microbes
CN107287293B (zh) * 2017-06-13 2019-07-30 浙江大学 一种环境中微生物群落结构的绝对丰度测定方法
HRP20220615T1 (hr) 2017-06-30 2022-06-24 Inscripta, Inc. Postupci, moduli, instrumenti i sustavi za automatiziranu obradu stanica
US10738327B2 (en) 2017-08-28 2020-08-11 Inscripta, Inc. Electroporation cuvettes for automation
CN111213051A (zh) * 2017-09-08 2020-05-29 哈佛学院院长及董事 用于确定分析物的纳米传感器方法和装置
US10443074B2 (en) 2017-09-30 2019-10-15 Inscripta, Inc. Modification of cells by introduction of exogenous material
EP3775159A4 (en) 2018-03-29 2022-01-19 Inscripta, Inc. AUTOMATED REGULATION OF CELL GROWTH RATES FOR INDUCTION AND TRANSFORMATION
WO2019200004A1 (en) 2018-04-13 2019-10-17 Inscripta, Inc. Automated cell processing instruments comprising reagent cartridges
US10526598B2 (en) 2018-04-24 2020-01-07 Inscripta, Inc. Methods for identifying T-cell receptor antigens
WO2019209926A1 (en) 2018-04-24 2019-10-31 Inscripta, Inc. Automated instrumentation for production of peptide libraries
US10858761B2 (en) 2018-04-24 2020-12-08 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided editing of exogenous polynucleotides in heterologous cells
US11142740B2 (en) 2018-08-14 2021-10-12 Inscripta, Inc. Detection of nuclease edited sequences in automated modules and instruments
IL292273B2 (en) 2018-08-14 2023-10-01 Inscripta Inc Devices, modules and methods for improved detection of edited sequences in living cells
US10532324B1 (en) 2018-08-14 2020-01-14 Inscripta, Inc. Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells
US10752874B2 (en) 2018-08-14 2020-08-25 Inscripta, Inc. Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells
US11519033B2 (en) 2018-08-28 2022-12-06 10X Genomics, Inc. Method for transposase-mediated spatial tagging and analyzing genomic DNA in a biological sample
CA3108892A1 (en) 2018-08-30 2020-04-23 Inscripta, Inc. Improved detection of nuclease edited sequences in automated modules and instruments
SG11202105824RA (en) 2018-12-10 2021-06-29 10X Genomics Inc Imaging system hardware
CN113543882A (zh) * 2018-12-31 2021-10-22 本-古里安大学B.G.内盖夫技术和应用公司 捕获流测定装置和方法
US11926867B2 (en) 2019-01-06 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
US11649485B2 (en) 2019-01-06 2023-05-16 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
EP3962653A4 (en) * 2019-05-01 2023-09-13 Massachusetts Institute Of Technology MASSIVELY PARALLEL ON-CHIP CONSTRUCTION OF SYNTHETIC MICROBIAL COMMUNITIES
EP3962650A1 (en) * 2019-05-02 2022-03-09 General Automation Lab Technologies Inc. Microfabricated device with hydrophilic microwells and hydrophobic interstitial space
US20200360922A1 (en) * 2019-05-16 2020-11-19 General Automation Lab Technologies Inc. Method for assaying biological sample on microfabricated chip
EP3976820A1 (en) 2019-05-30 2022-04-06 10X Genomics, Inc. Methods of detecting spatial heterogeneity of a biological sample
US10907125B2 (en) 2019-06-20 2021-02-02 Inscripta, Inc. Flow through electroporation modules and instrumentation
CN114008070A (zh) 2019-06-21 2022-02-01 因思科瑞普特公司 导致大肠杆菌赖氨酸产量增加的全基因组合理设计的突变
US10927385B2 (en) 2019-06-25 2021-02-23 Inscripta, Inc. Increased nucleic-acid guided cell editing in yeast
US11427865B2 (en) * 2019-07-12 2022-08-30 California Institute Of Technology Absolute quantification of nucleic acids and related methods and systems
EP3891300B1 (en) 2019-12-23 2023-03-29 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using rna-templated ligation
US10689669B1 (en) 2020-01-11 2020-06-23 Inscripta, Inc. Automated multi-module cell processing methods, instruments, and systems
US11732299B2 (en) 2020-01-21 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Spatial assays with perturbed cells
US11702693B2 (en) 2020-01-21 2023-07-18 10X Genomics, Inc. Methods for printing cells and generating arrays of barcoded cells
WO2021154706A1 (en) 2020-01-27 2021-08-05 Inscripta, Inc. Electroporation modules and instrumentation
US11821035B1 (en) 2020-01-29 2023-11-21 10X Genomics, Inc. Compositions and methods of making gene expression libraries
US11898205B2 (en) 2020-02-03 2024-02-13 10X Genomics, Inc. Increasing capture efficiency of spatial assays
US11732300B2 (en) 2020-02-05 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Increasing efficiency of spatial analysis in a biological sample
US11684914B2 (en) 2020-02-18 2023-06-27 Isolation Bio Inc. Method of transferring material from microfabricated device
US11891654B2 (en) 2020-02-24 2024-02-06 10X Genomics, Inc. Methods of making gene expression libraries
WO2021216708A1 (en) 2020-04-22 2021-10-28 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using targeted rna depletion
US20210332388A1 (en) 2020-04-24 2021-10-28 Inscripta, Inc. Compositions, methods, modules and instruments for automated nucleic acid-guided nuclease editing in mammalian cells
US11787841B2 (en) 2020-05-19 2023-10-17 Inscripta, Inc. Rationally-designed mutations to the thrA gene for enhanced lysine production in E. coli
EP4153775A1 (en) 2020-05-22 2023-03-29 10X Genomics, Inc. Simultaneous spatio-temporal measurement of gene expression and cellular activity
EP4153776A1 (en) 2020-05-22 2023-03-29 10X Genomics, Inc. Spatial analysis to detect sequence variants
WO2021242834A1 (en) 2020-05-26 2021-12-02 10X Genomics, Inc. Method for resetting an array
WO2021252499A1 (en) 2020-06-08 2021-12-16 10X Genomics, Inc. Methods of determining a surgical margin and methods of use thereof
EP4165207A1 (en) 2020-06-10 2023-04-19 10X Genomics, Inc. Methods for determining a location of an analyte in a biological sample
WO2021263111A1 (en) 2020-06-25 2021-12-30 10X Genomics, Inc. Spatial analysis of dna methylation
US11981960B1 (en) 2020-07-06 2024-05-14 10X Genomics, Inc. Spatial analysis utilizing degradable hydrogels
US11761038B1 (en) 2020-07-06 2023-09-19 10X Genomics, Inc. Methods for identifying a location of an RNA in a biological sample
US11981958B1 (en) 2020-08-20 2024-05-14 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using DNA capture
US11926822B1 (en) 2020-09-23 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Three-dimensional spatial analysis
US11827935B1 (en) 2020-11-19 2023-11-28 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using rolling circle amplification and detection probes
WO2022140028A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and systems for capturing probes and/or barcodes
CN112553064A (zh) * 2020-12-24 2021-03-26 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心） 一种高通量筛选具有潜在生物防腐功能活性菌株的装置及方法
CN113083383B (zh) * 2021-03-18 2022-10-25 华中农业大学 微流控芯片装置、制备方法及土壤微生物群落培养方法
EP4196605A1 (en) 2021-09-01 2023-06-21 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and kits for blocking a capture probe on a spatial array
WO2023065174A1 (zh) * 2021-10-20 2023-04-27 深圳华大生命科学研究院 筛选药物的方法
US20240141278A1 (en) 2022-11-02 2024-05-02 Fujifilm Corporation Pattern forming device and pattern forming method

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102046773A (zh) * 2008-05-30 2011-05-04 康宁股份有限公司 具有不同微孔外形的细胞培养装置
US20110237445A1 (en) * 2008-10-10 2011-09-29 Picovitro Ab Genetic analysis in microwells
CN102665916A (zh) * 2009-11-23 2012-09-12 3M创新有限公司 微孔阵列制品及使用方法
US20130190206A1 (en) * 2010-07-13 2013-07-25 Dublin City University Direct Clone Analysis and Selection Technology
WO2015031691A1 (en) * 2013-08-28 2015-03-05 Cellular Research, Inc. Massively parallel single cell analysis

Family Cites Families (67)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE8137962U1 (de) * 1981-12-28 1982-06-16 Biotest-Serum-Institut Gmbh, 6000 Frankfurt Mikrotiterplatte zur blutgruppendiagnostik
US4634676A (en) 1984-06-06 1987-01-06 Becton, Dickinson And Company Replica plating device
US4717667A (en) * 1984-07-11 1988-01-05 Fmc Corporation Colony replicating device
US5061621A (en) 1989-06-22 1991-10-29 Brandeis University Replica plating device with an integral marking element
AUPN154295A0 (en) 1995-03-06 1995-03-30 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Nucleic acid molecule encoding a protein with avian gamma-interferon activity
US5587322A (en) 1994-11-23 1996-12-24 Replicatech, Inc. Replica plating device
US5985594A (en) 1995-11-14 1999-11-16 Idexx Laboratories, Inc. Method for quantification of biological material in a sample
US6972183B1 (en) 1997-06-16 2005-12-06 Diversa Corporation Capillary array-based enzyme screening
US20030215798A1 (en) 1997-06-16 2003-11-20 Diversa Corporation High throughput fluorescence-based screening for novel enzymes
US6103479A (en) 1996-05-30 2000-08-15 Cellomics, Inc. Miniaturized cell array methods and apparatus for cell-based screening
US5882922A (en) 1997-03-19 1999-03-16 Becton Dickinson And Company Culture vessel assembly
US7019827B2 (en) 1997-06-16 2006-03-28 Diversa Corporation GigaMatrix holding tray having through-hole wells
US20050070005A1 (en) 1997-06-16 2005-03-31 Martin Keller High throughput or capillary-based screening for a bioactivity or biomolecule
US5858770A (en) 1997-09-30 1999-01-12 Brandeis University Cell culture plate with oxygen and carbon dioxide-permeable waterproof sealing membrane
US6900055B1 (en) 1998-10-28 2005-05-31 Cellon S.A. Preparation of porous silicone rubber for growing cells or living tissue
US6455310B1 (en) * 1999-03-23 2002-09-24 Biocrystal Ltd. Cell culture apparatus and method for culturing cells
CA2319205A1 (en) 2000-03-13 2001-09-13 The State Of Oregon Acting By And Through The State Board Of Higher Educ Ation On Behalf Of Oregon State University High-throughput microbial culturing
US6638730B2 (en) 2001-03-06 2003-10-28 Council Of Scientific & Industrial Research Composition for qualitative screening of phosphate solubilizing microorganisms and a qualitative method for screening microorganisms
US7011957B2 (en) 2001-09-26 2006-03-14 Northeastern University Isolation and cultivation of microorganisms from natural environments and drug discovery based thereon
WO2003046508A2 (en) 2001-11-09 2003-06-05 Biomicroarrays, Inc. High surface area substrates for microarrays and methods to make same
US20050147959A1 (en) * 2002-03-25 2005-07-07 Frondoza Carmelita G. Tissue analogs for in vitro testing and method of use therefor
JP2005528102A (ja) 2002-06-03 2005-09-22 パムジーン ビー．ブイ． 多用途の生存マイクロアレイを用いる、細胞に基づく高処理量アッセイのための方法
DE50211100D1 (de) * 2002-09-16 2007-11-29 Pan Biotech Gmbh Zellkulturkammer für ein zellkultursystem
JP3723882B2 (ja) * 2002-11-14 2005-12-07 篤 村口 抗原特異的リンパ球検出用マイクロウェルアレイチップ、抗原特異的リンパ球の検出法及び製造方法
US20070072187A1 (en) 2003-11-28 2007-03-29 Blok Herman J Novel methods and apparatus for cell based microarray assays
US20060030036A1 (en) 2004-05-28 2006-02-09 Victor Joseph Chips for multiplex analyses
EP1877533A2 (en) 2005-04-18 2008-01-16 Dsm Ip Assets B.V. Biochip and process for the production of a biochip
US7745209B2 (en) 2005-07-26 2010-06-29 Corning Incorporated Multilayered cell culture apparatus
WO2007035633A2 (en) * 2005-09-16 2007-03-29 President & Fellows Of Harvard College Screening assays and methods
WO2007120208A2 (en) 2005-11-14 2007-10-25 President And Fellows Of Harvard College Nanogrid rolling circle dna sequencing
DE102006030068A1 (de) * 2006-06-28 2008-01-03 M2P-Labs Gmbh Vorrichtung und Verfahren zur Zu- und Abfuhr von Fluiden in geschüttelten Mikroreaktoren Arrays
JP2010518855A (ja) 2007-02-22 2010-06-03 コーニング インコーポレイテッド 細胞培養に有用な基体およびそれを製造し、使用する方法
CN102046809A (zh) * 2008-04-05 2011-05-04 单细胞科技公司 筛选产生生物活性剂的单细胞的方法
JP2011521640A (ja) 2008-05-30 2011-07-28 コーニング インコーポレイテッド 超音波細胞除去方法
WO2010093766A1 (en) 2009-02-11 2010-08-19 The University Of North Carolina At Chapel Hill Method and device for cell selection and collection in an isolated culturing environment
WO2011044437A2 (en) 2009-10-09 2011-04-14 Stc.Unm Polony sequencing methods
US9234229B2 (en) 2009-12-08 2016-01-12 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University High throughput system for isolation, growth, and detection of lipid inclusions in bacteria
CA2789761C (en) 2010-02-16 2019-05-14 The University Of North Carolina At Chapel Hill Array of micromolded structures for sorting adherent cells
US20130115606A1 (en) * 2010-07-07 2013-05-09 The University Of British Columbia System and method for microfluidic cell culture
US9732319B2 (en) 2010-12-22 2017-08-15 Fate Therapeutics, Inc. Cell culture platform for single cell sorting and enhanced reprogramming of iPSCs
US9095852B2 (en) 2011-08-22 2015-08-04 The Regents Of The University Of California Multilayer high density microwells
CA2852631A1 (en) * 2011-10-28 2013-05-02 Itek Ventures Pty Ltd A gene and mutations thereof associated with seizure and movement disorders
WO2013134261A1 (en) 2012-03-05 2013-09-12 President And Fellows Of Harvard College Systems and methods for epigenetic sequencing
US20130295551A1 (en) 2012-03-29 2013-11-07 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Microfluidic device and method for modulating a gas environment of cell cultures and tissues
CA2873585C (en) 2012-05-14 2021-11-09 Cb Biotechnologies, Inc. Method for increasing accuracy in quantitative detection of polynucleotides
ES2774165T3 (es) 2012-06-15 2020-07-17 Univ Texas Secuenciación de alto rendimiento de múltiples transcritos de una única célula
US9657290B2 (en) * 2012-07-03 2017-05-23 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Scalable bio-element analysis
BR112015003354A8 (pt) * 2012-08-14 2018-01-16 10X Genomics Inc métodos e composições de microcápsula
CN104884605B (zh) 2012-08-24 2018-05-18 耶鲁大学 用于高通量多重检测的系统、装置和方法
PT2925782T (pt) * 2012-12-03 2020-04-22 Novimmune Sa Anticorpos anti-cd47 e métodos de utilização destes
WO2014124336A2 (en) 2013-02-08 2014-08-14 10X Technologies, Inc. Partitioning and processing of analytes and other species
EP2805769A1 (en) * 2013-05-24 2014-11-26 European Molecular Biology Laboratory Methods for nano-scale single cell analysis
US20160122753A1 (en) 2013-06-12 2016-05-05 Tarjei Mikkelsen High-throughput rna-seq
US20150017714A1 (en) 2013-07-02 2015-01-15 Miltenyi Biotec Gmbh Centrifugation chamber with gas permeable membrane layers for cell cultivation
CA2868703A1 (en) 2013-10-25 2015-04-25 Ponnambalam Selvaganapathy Method and device for detecting metabollically active cells
ES2895750T3 (es) 2014-09-15 2022-02-22 Abvitro Llc Secuenciación de alto rendimiento de colecciones de nucleótidos
US20170247652A1 (en) 2014-10-20 2017-08-31 Northeastern University Device and Method for High Throughput Bacterial Isolation
WO2016134370A1 (en) 2015-02-22 2016-08-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Micro-screening apparatus, process, and products
PL3261761T3 (pl) 2015-02-27 2022-07-11 Corning Incorporated Dopasowana pokrywka do wielodołkowej płytki
US20180023045A1 (en) * 2015-04-21 2018-01-25 General Automation Lab Technologies, Inc. High resolution systems, kits, apparatus, and methods using combinatorial media strategies for high throughput microbiology applications
US10712356B2 (en) * 2015-04-21 2020-07-14 General Automation Lab Technologies Inc. Apparatus and method for picking biological sample
US10788452B2 (en) * 2015-04-21 2020-09-29 General Automation Lab Technologies Inc. High resolution systems, kits, apparatus, and methods for bacterial community relationship determination and other high throughput microbiology applications
CN114015569A (zh) * 2015-04-21 2022-02-08 通用自动化实验技术公司 用于高通量微生物学应用的高分辨率系统、试剂盒、设备和方法
US10865434B2 (en) * 2015-04-21 2020-12-15 General Automation Lab Technologies Inc. High resolution systems, kits, apparatus, and methods for screening microorganisms and other high throughput microbiology applications
US10590461B2 (en) * 2015-04-21 2020-03-17 General Automation Lab Technologies Inc. High resolution systems, kits, apparatus, and methods using magnetic beads for high throughput microbiology applications
US10677793B2 (en) 2015-04-21 2020-06-09 General Automation Lab Technologies Inc. High resolution systems, kits, apparatus, and methods using lateral flow for high throughput microbiology applications
US10934538B2 (en) 2016-01-12 2021-03-02 Cleveland State University 3D-printed miniature biological constructs

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102046773A (zh) * 2008-05-30 2011-05-04 康宁股份有限公司 具有不同微孔外形的细胞培养装置
US20110237445A1 (en) * 2008-10-10 2011-09-29 Picovitro Ab Genetic analysis in microwells
CN102665916A (zh) * 2009-11-23 2012-09-12 3M创新有限公司 微孔阵列制品及使用方法
US20130190206A1 (en) * 2010-07-13 2013-07-25 Dublin City University Direct Clone Analysis and Selection Technology
WO2015031691A1 (en) * 2013-08-28 2015-03-05 Cellular Research, Inc. Massively parallel single cell analysis

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
马文丽: "分子生物学实验手册", 北京：人民军医出版社, pages: 146 - 149 *

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