CN112553064A - 一种高通量筛选具有潜在生物防腐功能活性菌株的装置及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种高通量筛选抑菌活性菌株的装置，包括一个透明器皿(1)和一个多孔细胞培养板(2)，所述细胞培养板均匀分布有培养深孔，所述培养深孔的底部(3)中空，所述多孔细胞培养板(2)放置于透明器皿(1)中，细胞培养板底部(3)与透明器皿内壁底部之间保留距离，二者之间相互不接触；所述透明器皿用于盛装含有指示菌的固体培养基(4)，所述多孔细胞培养板用于盛装待测菌株的培养上清液；当透明器盛装含有指示菌的琼脂培养基时，所述多孔细胞培养板的底部(3)与所述固体培养基(4)表面相接触。本发明装置中的多孔细胞培养板可同时高通量的用于多个菌株的抑菌活性检测，不限于细胞培养板的孔数，可根据实际需要制备多个培养孔，每个孔检测一个待测菌株。本发明还可以灵活的更换指示菌，快速的检测出待测菌的抗菌谱。

Description

一种高通量筛选具有潜在生物防腐功能活性菌株的装置及 方法
技术领域
本发明涉及微生物检测领域，具体涉及一种高通量筛选具有潜在生物防腐功能活性菌株的装置及方法。
背景技术
随着社会的发展，食品安全问题成为当今社会关注的重点问题之一。食品在加工、运输、贮存的过程中不可避免的容易滋生各种微生物，食品中的黄曲霉、黑曲霉、桔青霉等腐败真菌以及大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌等致病细菌对人类的健康都会造成有害的影响。开发高效、安全、健康的天然防腐剂代替如今广泛在食品中添加的传统化学合成类防腐剂(如苯甲酸钠、山梨酸钾)，是当今世界各国食品工业研究的重点方向。其中，微生物源防腐剂以其丰富的菌种资源，活性代谢产物易提取，更适于工业化大规模生产，经济成本容易控制，符合作为天然防腐剂高效、安全、健康的要求等一系列突出优点，成为未来食品工业中天然防腐剂发展最具前景的发展方向。在微生物资源中，具有丰富的活性代谢菌株，尤其以放线菌为代表，是产生抗生素以及其它重要次级代谢产物最多的一类微生物资源，与人类的生产和生活具有密切的关系。目前，放线菌的活性代谢产物应用于食品防腐剂的有那他霉素和聚赖氨酸。因此，针对自然界中丰富的放线菌资源，筛选具有潜在生物防腐活性菌株的方法就显得尤为重要。
传统对放线菌中活性菌株的筛选常用的方法有：牛津杯法、琼脂块法和纸片法。牛津杯法是指将无菌不锈钢小牛津杯放置于涂有指示菌的培养平板中，并向牛津杯中加入一定量的待测菌株上清液，培养一段时间后，观测抑菌圈的大小，确定抑菌能力。琼脂块法是利用打孔器将在固体培养平板中生长良好的待测菌株琼脂块转移到涂布有指示菌的培养平板上，培养一段时间后，观测琼脂块周围是否形成抑菌圈，确定待测菌株是否具有抑菌能力。纸片法是将直径为5.0mm左右的圆形无菌滤纸片浸入待测菌株的发酵液或者其提取物溶解形成的待测液体中，沥干溶液后贴在涂布有指示菌的培养平板上，培养一段时间后，观测抑菌圈的大小，确定抑菌能力。
通常情况下，利用以上常规方法进行潜在生物防腐功能活性菌株筛选的时候，一个平板上能够测试5株左右的菌株。如附图1中A、B、C分别为牛津杯法、琼脂块法、纸片法进行活性菌株筛选。但在实际操作中，对采到的环境样品进行单菌落的分离时候，能够获得大量的菌株，对这些成百上千株菌株进行大批量筛选操作时，仍然利用这些传统的筛菌方法就显得费时费力，又浪费材料。因此，在食品防腐领域中筛选具有潜在生物防腐功能活性菌株的过程中，开发高通量筛选的方法和装置具有抑菌活性的菌株就显得尤为重要。
传统药物筛选常用到96孔板法，将待测目标物液体加入到含有一定浓度的靶标菌液的普通96孔板中，通过酶标仪测定每个孔板中靶标菌液培养过程吸光度的变化来确定待测液体是否具有抑菌作用的方法中，由于筛选出来的大部分放线菌都会产生不同的色素类物质，严重干扰了该方法的运用。附图2，在选择培养平板上筛选出来的放线菌株，培养后期分别产生红色、蓝色和黄色的色素类物质，因此，影响了放线菌抑菌活性的检测结果。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种高通量筛选抑菌活性菌株的装置，该装置可同时筛选多种具有抑菌活性菌株，省时省力，方便快捷。
本发明通过以下技术方案实现本发明的目的；
一种高通量筛选抑菌活性菌株的装置，包括一个透明器皿(1)和一个多孔细胞培养板(2)，所述细胞培养板均匀分布有培养深孔，所述培养深孔的底部(3)中空，所述多孔细胞培养板(2)放置于透明器皿(1)中，细胞培养板底部(3)与透明器皿内壁底部之间保留一截距离，二者之间相互不接触；所述透明器皿用于盛装含有指示菌的固体培养基(4)，所述多孔细胞培养板用于盛装待测菌株的培养上清液；当透明器盛装含有指示菌的琼脂培养基时，所述多孔细胞培养板的底部(3)与所述固体培养基(4)表面相接触。
本发明装置中的多孔细胞培养板可同时高通量的用于多个菌株的抑菌活性检测，且不限于细胞培养板的孔数，可根据实际需要制备n个培养孔，n＝自然数，每个孔检测一个待测菌株；而透明器皿根据实际使用的细胞培养板调整其尺寸，唯一需要满足的条件是能够将所述多孔细胞培养放置于所述透明器皿内。本发明还可以灵活的更换指示菌，快速的检测出待测菌的抗菌谱。
优选地，所述多孔细胞培养板的培养深孔为中空的锥形管。由于锥形管呈“V”型，能使得培养液更加集中，不容易外溢。更优选地，所述每个V型孔底部为直径为2-3mm的中空圆孔。
优选地，所述细胞培养板底部3与透明器皿内壁底部之间的距离为0.2～1cm。细胞培养板底部3与透明器皿内壁底部之间保留的空间是为了盛装含有指示菌的固体培养基，培养基的厚度在0.2～1cm范围，获得较好的抑菌圈，如果培养基太厚指示菌浓度或高，不能形成抑菌圈，培养基过薄，在培养过程中固体培养基容易干裂。
优选地，所述透明器皿可以是任何透明材质制备的器皿。更优选地，所述透明器皿为玻璃器皿。
优选地，所述多孔细胞培养板为96孔细胞培养板，且底部中空。
优选地，所述高通量筛选抑菌活性菌株的装置还包括一个上盖5。上盖可以在培养过程防止其他杂质进入装置。
优选地，所述固定培养基中的指示菌通过涂布的方式或在其凝固前将指示菌加入。
本发明还提供一种高通量筛选抑菌活性菌株的方法，包括以下步骤：
(1)制备含有指示菌的固体琼脂培养基，在其凝固前倒入本发明所述装置的透明器皿1中，待其凝固；
(2)挑取待测菌株单菌落进行纯培养，获得培养液，离心，取上清液；
(3)吸取步骤(2)的上清液加入到本发明所述装置的多孔细胞培养板2中，然后将整个装置置于适宜温度下培养，观察是否在指示菌上形成抑菌圈；若形成抑菌圈表示该菌株具有抑菌活性，若没有抑菌圈表示该菌株没有针对该指示菌的抑菌活性。
优选地，所述高通量筛选抑菌活性菌株的方法，还包括步骤(4)：将权利要求6所述的上盖盖在透明器皿1上。
优选地，所述待测菌包括放线菌。
优选地，所述放线菌培养基为高氏一号培养基或海藻糖酪蛋白培养基或棉子糖培养基或腐殖酸培养基或酵母粉-麦芽膏培养基。
优选地，所述指示菌包括食源性致病菌、食源性腐败菌、致病性细菌和可引起食品腐败变质的真菌。
优选地，所述食源性致病菌包括大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、副溶血性弧菌(Vibrio Parahemolyticus)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。
优选地，所述食源性腐败菌包括黑曲霉(Aspergillus niger)、黄曲霉(Aspergillus flavus)和桔青霉(Penicillium citrinum)。
优选地，所述指示菌的培养基包括NA培养基、LB培养基和马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基。
本发明的有益效果为：本发明的高通量筛选抑菌活性菌株的装置可同时高通量的检测多个不同菌株的抑菌活性，并适用于各种指示菌的检测，可快速的获得待测菌的抗菌谱。在实施例中同时对300株放线菌进行筛选，最终获得26株菌株对大肠杆菌具有抑菌活性，35株菌株对金黄色葡萄球菌具有抑菌活性，33株菌株对黑曲霉具有抑菌活性的放线菌。本发明的方法能快速的从环境样品中筛选出具有潜在生物防腐功能的活性的菌株，并有目的分离出相应的菌株，且不限于待测菌的种类，适用于各类菌株的活性检测，为食品工业中微生物源防腐剂的开发提供重要菌株来源。
附图说明
图1为现有技术中抑菌活性菌株筛选方法示意图，A：为牛津杯法；B为琼脂块法；C为纸片法进行。
图2为在固体选择平板上筛选出来的放线菌株在培养后期分别产生红色、蓝色和黄色的色素类物质影响示意图。
图3为本发明高通量筛选抑菌活性菌株的装置正面图(1为透明器皿；2为多孔细胞培养板；3为多孔细胞培养板的底部；4为固体培养基；5为上盖)。
图4为本发明高通量筛选抑菌活性菌株的装置俯视图；
图5为本发明使用所述高通量筛选抑菌活性菌株的装置进行筛选的流程图。
具体实施方式
为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例和附图详细说明本发明的技术方案。
实施例1
本实施例详细介绍使用本发明高通量筛选装置筛选抑菌活性的菌株的过程，具体如下：
步骤1：获得不同待测菌株的纯培养发酵上清液；
步骤2：将含有指示菌的还未凝固的琼脂培养基倒入所述装置的透明器皿1中，待其凝固；
或者，步骤2：将还未凝固的琼脂培养基倒入所述装置的透明器皿1中，待其凝固后，涂布一定浓度的指示菌；
步骤3：将多孔细胞培养板2放置于透明器皿1中，此时，所述底部3与固体培养基4表面接触；吸取20-50μl不同菌株发酵上清液分别加入到所述装置的多孔细胞培养板2的各个底部3；
步骤4：盖上上盖5将整个所述装置置于培养箱中培养48h后，由于所述底部3与固体培养基4表面接触，故待测菌上清液则与固定培养基表面接触，如若待测菌分泌抑菌活性物质，则可在固定培养基上形成抑菌圈，通过透明器皿1可观察到抑菌圈。
实施例2高通量筛选对大肠杆菌具有抑菌活性的放线菌株
采集广州白云山土壤样品，称取10g土样混匀在100ml的无菌水中，并依次梯度稀释103、104、105倍。将土壤样品的稀释液涂布在放线菌的选择平板上培养，用无菌接种环挑取在选择固体培养基上生长良好的多个疑似放线菌单菌落；分别接种于含有10ml高氏一号液体培养基的50mL的无菌离心管中；将接种好的菌株放置于28℃，160r/min的摇床中培养7天左右；在50mL离心管中培养好的菌株发酵液置于离心机中8000r/min离心，获得菌株的发酵上清液；分别用移液器吸取20-50μl不同菌株发酵上清液加入到高通量筛选装置中，并放置在适宜条件下培养48h后，通过透明器皿底部观测是否具有抑菌圈的形成确定待测放线菌株的抗菌活性。
上述实验结果：从广州白云山土壤中共分离出300株菌株，并利用本发明高通量筛选方法，在下层培养基中共发现26株菌株对大肠杆菌具有抑菌活性。
实施例2高通量筛选对金黄色葡萄球菌具有抑菌活性的放线菌株
采集广州白云山土壤样品，称取10g土样混匀在100ml的无菌水中，并依次梯度稀释103、104、105倍。将土壤样品的稀释液涂布在放线菌的选择平板上培养，挑取单菌落，按照图5的流程步骤进行液体培养，离心取发酵上清液，在石英器皿的底部倒入20ml的NA培养基，待其凝固后涂布菌浓度在105-6cfu/ml的金黄色葡萄球菌菌液200μl，放置96中空孔板，并在每个孔板中加入不同待筛选菌株的发酵上清液50μl，盖上石英器皿的上盖，放置于37℃的培养基过夜培养后，通过观测透明器皿底部抑菌圈的大小来确定筛选菌株的活性。
上述实验结果：在广州白云山土壤中分离出300株菌株中，共发现35株菌株对金黄色葡萄球菌具有抑菌活性。
实施例3高通量筛选对黑曲霉具有抑菌活性的放线菌株
采集广州白云山土壤样品，称取10g土样混匀在100ml的无菌水中，并依次梯度稀释103、104、105倍。将土壤样品的稀释液涂布在放线菌的选择平板上培养，挑取单菌落，按照图5的流程步骤进行液体培养，离心取发酵上清液，在石英器皿的底部倒入20ml的PDA培养基，待其凝固后涂布菌浓度在105-6cfu/ml的黑曲霉菌液200μl，放置96中空孔板，并在每个孔板中加入不同待筛选菌株的发酵上清液50μl，盖上石英器皿的上盖，放置于37℃的培养基过夜培养后，通过观测石英器皿底部抑菌圈的大小来确定筛选菌株的活性。
上述实验结果：在广州白云山土壤中分离出300株菌株中，共发现33株菌株对黑曲霉具有抑菌活性。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种高通量筛选抑菌活性菌株的装置，其特征在于，包括一个透明器皿(1)和一个多孔细胞培养板(2)，所述细胞培养板均匀分布有培养深孔，所述培养深孔的底部(3)中空，所述多孔细胞培养板(2)放置于透明器皿(1)中，细胞培养板底部(3)与透明器皿内壁底部之间保留一截距离，二者之间相互不接触；所述透明器皿用于盛装含有指示菌的固体培养基(4)，所述多孔细胞培养板用于盛装待测菌株的培养上清液；当透明器盛装含有指示菌的琼脂培养基时，所述多孔细胞培养板的底部(3)与所述固体培养基(4)表面相接触。
2.如权利要求1所述的高通量筛选抑菌活性菌株的装置，其特征在于，所述多孔细胞培养板的培养深孔为中空的V型锥形管。
3.如权利要求1所述的高通量筛选抑菌活性菌株的装置，其特征在于，所述细胞培养板底部(3)与透明器皿内壁底部之间的距离为0.2～1cm。
4.如权利要求1所述的高通量筛选抑菌活性菌株的装置，其特征在于，所述透明器皿(1)为玻璃器皿。
5.如权利要求1所述的高通量筛选抑菌活性菌株的装置，其特征在于，所述多孔细胞培养板(2)为96孔细胞培养板，且底部中空。
6.如权利要求1所述的高通量筛选抑菌活性菌株的装置，其特征在于，所述高通量筛选抑菌活性菌株的装置还包括一个上盖(5)。
7.如权利要求1所述的高通量筛选抑菌活性菌株的装置，其特征在于，所述固定培养基(4)中的指示菌通过涂布的方式或在其凝固前将指示菌加入。
8.一种高通量筛选抑菌活性菌株的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备含有指示菌的固体琼脂培养基，在其凝固前倒入如权利要求1或4所述装置的透明器皿(1)中，待其凝固；
(2)挑取待测菌株单菌落进行纯培养，获得培养液，离心，取上清液；
(3)吸取步骤(2)的上清液加入到如权利要求1～3或5任一项所述装置的多孔细胞培养板(2)中，然后将整个装置置于适宜温度下培养，观察是否在指示菌上形成抑菌圈；若形成抑菌圈表示该菌株具有抑菌活性，若没有抑菌圈表示该菌株没有针对该指示菌的抑菌活性。
9.如权利要求8所述的高通量筛选抑菌活性菌株的方法，其特征在于，所述待测菌包括放线菌。
10.如权利要求8所述的高通量筛选抑菌活性菌株的方法，其特征在于，所述指示菌包括食源性致病菌、食源性腐败菌、致病性细菌和可引起食品腐败变质的真菌。
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