CN108220384A - 一种弧菌测试片及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种弧菌测试片，包括测试片主体、弧菌培养基以及水凝胶载体，弧菌培养基包括以质量百分数计算的以下组分：蛋白胨2.2‑3.5％、蔗糖1.5‑2.0％、牛胆粉0.2‑0.4％、硫代硫酸钠0.08‑0.15％、柠檬酸铁0.05‑0.12％、麝香草酚蓝0.002‑0.005％、酵母1.0‑1.5％、氯化钠0.8‑1.0％、去氧胆酸钠0.12‑0.2％、柠檬酸三钠0.5‑1.0％、溴麝香草酚蓝0.002‑0.004％、黄原胶0.1‑0.3％、纯水余量，弧菌培养基的pH值为9.0‑9.3。本发明还公开了弧菌测试片的制备方法。本发明便于水体样本在培养基中吸收和扩散，为弧菌的提供良好的生长环境。

Description

一种弧菌测试片及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，更具体地说，涉及一种弧菌测试片及其制备方法。
背景技术
弧菌是中国对虾育苗期间的常见菌，一旦虾塘水质恶化，很容易导致细菌性疾病的流行。如果能对养殖水体中的细菌含量提前进行监测，如副溶血弧菌，溶藻弧菌的数量等，通过提前检测，提前预警，及时采取措施，即可对弧菌的发病起到控制作用。
弧菌的检测方法研究较多，也较深入，其中环介导等温扩增(LAMP)技术、PCR(荧光定量、双重实时、EMA-PCR、巢氏PCR、Real-time PCR)检测技术主要用于其分子检测及基因分型的研究、ELISA方法(间接法、斑点法、双抗夹心法)，胶体金试纸条法均为基于其抗体的病原检测方法，传统的有细菌分离培养、生化鉴定等，但对致病菌的检测特异性不高、灵敏度低、操作烦琐耗时，也有利用快速酶促反应显色培养基、自动化微生物分析仪进行鉴定的方法。
基于增菌技术的弧菌检测片在食品的检验检疫中应用较多，主要用于水产品、海产品及其腌、熟制品、水产调味品等的快速检测，主要的生产厂家有美国3M公司，德国R-BIOPHARN公司，日本CHISSO公司，广州绿洲生化。但目前市场上未见针对检测水体内(池塘水、各类养殖水体)的弧菌的测试片，一种适用于监测水体中的弧菌(主要为副溶血弧菌和溶藻弧菌)，操作简便的测试片，从而为水体内弧菌含量的预警，用药前后效果比对提供技术手段。
现有测试片载体主要为滤纸，冷水可凝胶和无纺布三种，且对检测效果有重要影响。以滤纸为载体的测试片滤孔过大，容易上下层都长菌，影响计数结果；无纺布为载体的测试片虽然具有使样本扩散迅速的特点，但是无纺布的不透明性影响最终的计数结果。
发明内容
针对现有技术的上述缺陷，本发明的目的在于提供一种弧菌测试片；使弧菌培养基能长时间在室温环境下保存，便于水体样本在培养基中吸收和扩散，为弧菌的提供良好的生长环境，加快弧菌的生长速度。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
一种弧菌测试片，包括测试片主体、弧菌培养基以及水凝胶载体，所述弧菌培养基包括以质量百分数计算的以下组分：蛋白胨2.2-3.5％、蔗糖1.5-2.0％、牛胆粉0.2-0.4％、硫代硫酸钠0.08-0.15％、柠檬酸铁0.05-0.12％、麝香草酚蓝0.002-0.005％、酵母1.0-1.5％、氯化钠0.8-1.0％、去氧胆酸钠0.12-0.2％、柠檬酸三钠0.5-1.0％、溴麝香草酚蓝0.002-0.004％、黄原胶0.1-0.3％、纯水余量，所述弧菌培养基的pH值为9.0-9.3。
作为进一步的方案，本发明所述的测试片主体包括透明塑料底板和带格子的透明塑料薄膜片，所述透明塑料底板上设有培养槽，所述透明塑料薄膜片的一侧或一个角粘合固定在透明塑料底板表面，远离透明塑料薄膜片与透明塑料底板固定处透明塑料薄膜片的一端延伸出揭膜端。
作为进一步的方案，本发明所述的水凝胶载体为冷水可凝胶，所述冷水可凝胶为黄原胶和瓜尔胶的水凝胶。
作为进一步的方案，本发明所述的水凝胶的质量浓度为0.2-0.8％，其中黄原胶和瓜尔胶的质量比为1:(1-2)。
作为进一步的方案，本发明所述的弧菌培养基包括以质量百分数计算的以下组分：蛋白胨3.0％、蔗糖1.8％、牛胆粉0.3％、硫代硫酸钠1％、柠檬酸铁0.1％、麝香草酚蓝0.004％、酵母1.2％、氯化钠1％、去氧胆酸钠0.15％、柠檬酸三钠0.8％、溴麝香草酚蓝0.003％、黄原胶0.2％、纯水余量，所述弧菌培养基的pH值为9.2。
本发明的另一目的在于提供一种弧菌培养基的制备方法，通过该方法获得一种敏感性、特异性以及稳定性优良的弧菌测试片；具体方案如下：
一种弧菌测试片的制备方法，包括
制备弧菌培养基步骤：按比例将蛋白胨、牛胆粉、硫代硫酸钠、柠檬酸铁、麝香草酚蓝、酵母、氯化钠、溴麝香草酚蓝、去氧胆酸钠充分溶解于纯水后在沸水中加热3-8分钟取出，冷却至室温，调节pH值至9.0-9.3，然加入柠檬酸三钠和蔗糖，搅拌至完全溶解，再加入黄原胶搅拌至完全溶解，得到弧菌培养基；
制备水凝胶载体步骤：分别将黄原胶、瓜尔胶，过120-150目筛网，将黄原胶和瓜尔胶的按照质量比为1:(1-2)混合均匀，加入纯水配制成质量浓度为0.2-0.8％的凝胶，得到水凝胶载体；
制作测试片步骤：将上述水凝胶载体均匀涂在测试片主体的培养槽内，于恒温烘箱烘干，待冷却后将上述配制好的弧菌培养基加入到培养槽中，摇晃使弧菌培养基均匀分散在水凝胶载体上呈半凝固状，干燥后，得到弧菌测试片；
辐照灭菌：上述弧菌测试片包装入铝箔袋中，用采用Co-60γ射线辐照灭菌。
作为进一步的方案，本发明所述的制备弧菌培养基步骤中用3mol氢氧化钠溶液调节pH值。
作为进一步的方案，本发明所述的制作测试片步骤中，恒温烘箱的温度设置为65-75℃，烘干时间为1.5-2.5小时。
作为进一步的方案，本发明所述的测试片主体包括透明塑料底板和带格子的透明塑料薄膜片，所述透明塑料底板上设有培养槽，所述透明塑料薄膜片的一侧或一个角粘合固定在透明塑料底板表面，远离透明塑料薄膜片与透明塑料底板固定处透明塑料薄膜片的一端延伸出揭膜端。
作为进一步的方案，本发明所述的制备方法还包括在制作测试片步骤步骤的测试片组装步骤：在干燥后的弧菌测试片的透明塑料底板表面贴上透明塑料薄膜片，所述透明塑料薄膜片的一侧或一个角贴合固定在透明塑料底板表面盖住所述培养槽，所述透明塑料薄膜片上贴上标签纸。
相比现有技术，本发明具有以下有益效果：
1.本发明的所述的弧菌测试片有利于培养基长时间的室温保存，且水体样本更容易在培养基中吸收及扩散，极大改善了加样后样本产生的边缘效应，能为副溶血弧菌和溶藻弧菌的生长提供更好的环境；
2.本发明的所述的弧菌测试片进一步采用黄原胶和瓜尔胶的水凝胶作为培养基的载体，不仅能进一步加快样本的扩散速度，还使计数更为准确。
具体实施方式
下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述：
在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
一种弧菌测试片，包括测试片主体、弧菌培养基以及水凝胶载体，所述弧菌培养基包括以质量百分数计算的以下组分：蛋白胨2.2-3.5％、蔗糖1.5-2.0％、牛胆粉0.2-0.4％、硫代硫酸钠0.08-0.15％、柠檬酸铁0.05-0.12％、麝香草酚蓝0.002-0.005％、酵母1.0-1.5％、氯化钠0.8-1.0％、去氧胆酸钠0.12-0.2％、柠檬酸三钠0.5-1.0％、溴麝香草酚蓝0.002-0.004％、黄原胶0.1-0.3％、纯水余量，所述弧菌培养基的pH值为9.0-9.3。
在本发明中，蛋白胨、酵母、蔗糖为弧菌的生长提供氮源、维生素和生长因子，是维持弧菌生长的营养成分。牛胆粉、去氧胆酸钠、硫代硫酸钠和柠檬酸三钠能够有效抑制革兰氏阳性菌和大肠菌群，作为抑菌成分。柠檬酸铁、溴麝香草酚蓝、麝香草酚蓝作为显色成分，便于弧菌计数。在培养基中加入少量的黄原胶有利于培养基对水分的吸收和扩散，极大改善加样后样本产生的边缘效应。在本发明中，为了为副溶血弧菌培养提供更好的营养水平，需要控制蛋白胨、酵母、蔗糖的添加量；为了促使弧菌培养基于水凝胶载体融合，培养菌落生长过程中，减少抑菌剂对副溶血弧菌生长的影响，使其达到培养要求，需要对抑菌成分控制抑菌成分。作为优选的方案，本发明所述的弧菌培养基包括以质量百分数计算的以下组分：蛋白胨3.0％、蔗糖1.8％、牛胆粉0.3％、硫代硫酸钠1％、柠檬酸铁0.1％、麝香草酚蓝0.004％、酵母1.2％、氯化钠1％、去氧胆酸钠0.15％、柠檬酸三钠0.8％、溴麝香草酚蓝0.003％、黄原胶0.2％、纯水余量。
在本发明中，弧菌培养基的pH值也是影响弧菌生长的重要因素，过酸过碱的条件都会导致弧菌生长延迟期增加。在本发明的研究中发现，当pH值为9.0菌液的密度和OD值有一个很大的提升，当所述弧菌培养基的pH值为9.2，菌液的密度达到最大；而当pH值超过9.3之后弧菌菌液的密度变化不大，因此在本发明中适宜弧菌生长的pH值为9.0-9.3，其中最佳的pH值为9.2。
作为进一步的方案，本发明所述的测试片主体包括透明塑料底板和带格子的透明塑料薄膜片，所述透明塑料底板上设有培养槽，所述透明塑料薄膜片的一侧或一个角粘合固定在透明塑料底板表面，远离透明塑料薄膜片与透明塑料底板固定处透明塑料薄膜片的一端延伸出揭膜端。为了分辨所检样品的不同，记录时间在透明塑料薄膜片上设置有标签纸，标签纸上留有测试片日期和样品的填写栏。具体的方案中透明塑料底板长度为10cm，宽度为8cm，高度为0.7cm，培养槽直径为6cm，培养槽的深度为0.5cm；所述透明塑料薄膜片长度为9cm，宽度为8cm，厚度为0.05mm，透明塑料薄膜片上有1cm×1cm的正方形小格子。其中揭膜端可以方便揭开透明塑料薄膜片。
作为进一步的方案，本发明所述的水凝胶载体为冷水可凝胶，所述冷水可凝胶为黄原胶和瓜尔胶的水凝胶。用水凝胶作为培养基的载体，有利于培养基长时间的室温保存，且水体样本更容易在培养基中吸收及扩散，为副溶血弧菌和溶藻弧菌的生长提供更好的环境。具体的，本发明所述的水凝胶的质量浓度为0.2-0.8％，其中黄原胶和瓜尔胶的质量比为1:(1-2)。作为优选的方案，水凝胶的质量浓度为0.5％，黄原胶与瓜尔胶的质量比为1:1。
本发明的另一目的在于提供一种弧菌培养基的制备方法，通过该方法获得一种敏感性、特异性以及稳定性优良的弧菌测试片；具体方案如下：
一种弧菌测试片的制备方法，包括
制备弧菌培养基步骤：按比例将蛋白胨、牛胆粉、硫代硫酸钠、柠檬酸铁、麝香草酚蓝、酵母、氯化钠、溴麝香草酚蓝、去氧胆酸钠充分溶解于纯水后在沸水中加热3-8分钟取出，冷却至室温，调节pH值至9.0-9.3，然加入柠檬酸三钠和蔗糖，搅拌至完全溶解，再加入黄原胶搅拌至完全溶解，得到弧菌培养基；
制备水凝胶载体步骤：分别将黄原胶、瓜尔胶，过120-150目筛网，将黄原胶和瓜尔胶的按照质量比为1:(1-2)混合均匀，加入纯水配制成质量浓度为0.2-0.8％的凝胶，得到水凝胶载体；
制作测试片步骤：将上述水凝胶载体均匀涂在测试片主体的培养槽内，于恒温烘箱烘干，待冷却后将上述配制好的弧菌培养基加入到培养槽中，摇晃使弧菌培养基均匀分散在水凝胶载体上呈半凝固状，干燥后，得到弧菌测试片；
辐照灭菌：上述弧菌测试片包装入铝箔袋中，用采用Co-60γ射线辐照灭菌。
作为进一步的方案，本发明所述的制备弧菌培养基步骤中用3mol氢氧化钠溶液调节pH值。
作为进一步的方案，本发明所述的制作测试片步骤中，恒温烘箱的温度设置为65-75℃，烘干时间为1.5-2.5小时。
作为进一步的方案，本发明所述的测试片主体包括透明塑料底板和带格子的透明塑料薄膜片，所述透明塑料底板上设有培养槽，所述透明塑料薄膜片覆盖在培养槽上的透明塑料底板表面。
作为进一步的方案，本发明所述的制备方法还包括在制作测试片步骤步骤的测试片组装步骤：在干燥后的弧菌测试片的透明塑料底板表面贴上透明塑料薄膜片，所述透明塑料薄膜片的一侧或一个角贴合固定在透明塑料底板表面盖住所述培养槽，所述透明塑料薄膜片上贴上标签纸。
本发明所述的弧菌测试片的使用方法如下：
1)通过揭膜端揭开弧菌测试片的透明塑料薄膜片；
2)在培养槽的培养区域的中间滴加1ml样品液；
3)盖上塑料薄膜片，并持续轻轻晃动测试片1-2分钟，使样品液均匀分布4)在培养基上，静置2-3分钟；
4)放置在合适的温度环境里培养18-24h，根据菌落颜色，进行计数。
实施例1
一种弧菌测试片，包括测试片主体、弧菌培养基以及水凝胶载体，所述弧菌培养基包括以质量百分数计算的以下组分：蛋白胨2.2％、蔗糖2.0％、牛胆粉0.4％、硫代硫酸钠0.15％、柠檬酸铁0.05-0.12％、麝香草酚蓝0.005％、酵母1.5％、氯化钠1.0％、去氧胆酸钠0.2％、柠檬酸三钠1.0％、溴麝香草酚蓝0.004％、黄原胶0.3％、纯水余量；
所述的测试片主体包括透明塑料底板和带格子的透明塑料薄膜片，所述透明塑料底板上设有培养槽，所述透明塑料薄膜片的一侧或一个角粘合固定在透明塑料底板表面，远离透明塑料薄膜片与透明塑料底板固定处透明塑料薄膜片的一端延伸出揭膜端；
所述水凝胶载体为黄原胶和瓜尔胶的水凝胶，所述的水凝胶的质量浓度为0.2％，其中黄原胶和瓜尔胶的质量比为1:1；
其制备方法包括
制备弧菌培养基步骤：按比例将蛋白胨、牛胆粉、硫代硫酸钠、柠檬酸铁、麝香草酚蓝、酵母、氯化钠、溴麝香草酚蓝、去氧胆酸钠充分溶解于纯水后在沸水中加热3分钟取出，冷却至室温，用NaOH调节pH值至9.0，然加入柠檬酸三钠和蔗糖，搅拌至完全溶解，再加入黄原胶搅拌至完全溶解，得到弧菌培养基；
制备水凝胶载体步骤：分别将黄原胶、瓜尔胶，过120目筛网，将黄原胶和瓜尔胶的按比例混合均匀，加入纯水配制成质量浓度为0.2％的凝胶，得到水凝胶载体；
制作测试片步骤：将上述水凝胶载体均匀涂在培养槽内，于恒温烘箱烘干，待冷却后将上述配制好的弧菌培养基加入到培养槽中，摇晃使弧菌培养基均匀分散在水凝胶载体上呈半凝固状，干燥后，得到弧菌测试片；
辐照灭菌：将在上述弧菌测试片的透明塑料底板上贴透明塑料薄膜片，并在最下面多留出2mm宽度揭膜端，上述弧菌测试片包装入铝箔袋中，用采用Co-60γ射线辐照灭菌。
实施例2
一种弧菌测试片，包括测试片主体、弧菌培养基以及水凝胶载体，所述弧菌培养基包括以质量百分数计算的以下组分：蛋白胨3.0％、蔗糖1.8％、牛胆粉0.3％、硫代硫酸钠1％、柠檬酸铁0.1％、麝香草酚蓝0.004％、酵母1.2％、氯化钠1％、去氧胆酸钠0.15％、柠檬酸三钠0.8％、溴麝香草酚蓝0.003％、黄原胶0.2％、纯水余量；
所述的测试片主体包括透明塑料底板和带格子的透明塑料薄膜片，所述透明塑料底板上设有培养槽，所述透明塑料薄膜片的一侧或一个角粘合固定在透明塑料底板表面，远离透明塑料薄膜片与透明塑料底板固定处透明塑料薄膜片的一端延伸出揭膜端；
所述水凝胶载体为黄原胶和瓜尔胶的水凝胶，所述的水凝胶的质量浓度为0.5％，其中黄原胶和瓜尔胶的质量比为1:1；
其制备方法包括
制备弧菌培养基步骤：按比例将蛋白胨、牛胆粉、硫代硫酸钠、柠檬酸铁、麝香草酚蓝、酵母、氯化钠、溴麝香草酚蓝、去氧胆酸钠充分溶解于纯水后在沸水中加热5分钟取出，冷却至室温，用NaOH调节pH值至9.2，然加入柠檬酸三钠和蔗糖，搅拌至完全溶解，再加入黄原胶搅拌至完全溶解，得到弧菌培养基；
制备水凝胶载体步骤：分别将黄原胶、瓜尔胶，过150目筛网，将黄原胶和瓜尔胶的按比例混合均匀，加入纯水配制成质量浓度为0.5％的凝胶，得到水凝胶载体；
制作测试片步骤：将上述水凝胶载体均匀涂在培养槽内，于恒温烘箱烘干，待冷却后将上述配制好的弧菌培养基加入到培养槽中，摇晃使弧菌培养基均匀分散在水凝胶载体上呈半凝固状，干燥后，得到弧菌测试片；
辐照灭菌：将在上述弧菌测试片的透明塑料底板上贴透明塑料薄膜片，并在最下面多留出2mm宽度揭膜端，上述弧菌测试片包装入铝箔袋中，用采用Co-60γ射线辐照灭菌。
实施例3
一种弧菌测试片，包括测试片主体、弧菌培养基以及水凝胶载体，所述弧菌培养基包括以质量百分数计算的以下组分：蛋白胨3.5％、蔗糖1.5％、牛胆粉0.2％、硫代硫酸钠0.08％、柠檬酸铁0.05％、麝香草酚蓝0.002％、酵母1.0％、氯化钠0.8％、去氧胆酸钠0.12％、柠檬酸三钠0.5％、溴麝香草酚蓝0.002％、黄原胶0.1％、纯水余量；
所述的测试片主体包括透明塑料底板和带格子的透明塑料薄膜片，所述透明塑料底板上设有培养槽，所述透明塑料薄膜片的一侧或一个角粘合固定在透明塑料底板表面，远离透明塑料薄膜片与透明塑料底板固定处透明塑料薄膜片的一端延伸出揭膜端；
所述水凝胶载体为黄原胶和瓜尔胶的水凝胶，所述的水凝胶的质量浓度为0.2-0.8％，其中黄原胶和瓜尔胶的质量比为1:2；
其制备方法包括
制备弧菌培养基步骤：按比例将蛋白胨、牛胆粉、硫代硫酸钠、柠檬酸铁、麝香草酚蓝、酵母、氯化钠、溴麝香草酚蓝、去氧胆酸钠充分溶解于纯水后在沸水中加热8分钟取出，冷却至室温，用NaOH调节pH值至9.3，然加入柠檬酸三钠和蔗糖，搅拌至完全溶解，再加入黄原胶搅拌至完全溶解，得到弧菌培养基；
制备水凝胶载体步骤：分别将黄原胶、瓜尔胶，过120-150目筛网，将黄原胶和瓜尔胶的按照比例混合均匀，加入纯水配制成质量浓度为0.8％的凝胶，得到水凝胶载体；
制作测试片步骤：将上述水凝胶载体均匀涂在培养槽内，于恒温烘箱烘干，待冷却后将上述配制好的弧菌培养基加入到培养槽中，摇晃使弧菌培养基均匀分散在水凝胶载体上呈半凝固状，干燥后，得到弧菌测试片；
辐照灭菌：将在上述弧菌测试片的透明塑料底板上贴透明塑料薄膜片，并在最下面多留出2mm宽度揭膜端，上述弧菌测试片包装入铝箔袋中，用采用Co-60γ射线辐照灭菌。
性能及效果评价
1.弧菌测试片的敏感性验证
1)制备菌液：从-80℃取副溶血弧菌、溶藻弧菌质控菌液分别接种到5mlTSB培养基中，37℃摇床200rmp培养18-24h后，各取1ml菌液到无菌试管，并用0.9％生理盐水进行10倍梯度稀释成10-0、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、空白，每个梯度设置三个重复；
2)揭开弧菌测试的片塑料薄膜片，在培养槽培养区域的中间滴加所需稀释梯度1ml菌液，盖上塑料薄膜片，并持续轻轻晃动弧菌测试片1-2分钟，使样品液均匀分布在培养基上，静置2-3分钟；37℃培养20h，同时使用国标法的TCBS做比对；重复此方法操作各个稀释梯度；
3)观察结果并计数(表1、2)，绿色菌落为副溶血弧菌，黄色菌落为溶藻弧菌。
表1：两种测定方法测定菌液的副溶血弧菌数量
稀释梯度 空白 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7
测试片 0 / / / / / 93 13 1
TCBS 0 / / / / / 102 7 1
注：表格数值为平均数值；“/”表示数量太多，无法计数。单位：cfu/ml。
表2：两种测定方法测定菌液的溶藻弧菌数量
稀释梯度 空白 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7
测试片 0 / / / / 32 3 1 0
TCBS 0 / / / / 43 8 1 0
注：表格数值为平均数值；“/”表示数量太多，无法计数。单位：cfu/ml。
2.弧菌测试片的特异性验证
1)制备菌液：从-80℃取副溶血弧菌、溶藻弧菌、嗜水气单胞菌、无乳链球菌、大肠杆菌，金黄色葡萄球菌质控菌液分别接种到5mlTSB培养基中，37℃摇床200rmp培养18-24h后，各取1ml菌液到无菌试管中，并用0.9％生理盐水进行10倍梯度稀释至各菌液梯度为10-5，并设置两个重复；
2)取出弧菌测试片，分别测定上述6种菌液，揭开弧菌测试片的透明塑料薄膜片，在培养槽培养区域的中间滴加1ml菌液，盖上塑料薄膜片，并持续轻轻晃动弧菌测试片1-2分钟，使样品液均匀分布在培养基上，静置2-3分钟，37℃培养20h；观察结果并记录(表3)。
表3：特异性验证结果
菌种 培养结果
副溶血弧菌 生产良好，绿色菌落
溶澡弧菌 生长良好，黄色菌落
嗜水气单胞菌 无菌落生长
无乳链球菌 无菌落生长
大肠杆菌 无菌落生长
金黄色葡萄球菌 无菌落生长
3.弧菌测试片的稳定性验证
1)将做好的48个弧菌测试片，按照6个弧菌测试片为一包装，分为8个包装，置于37℃恒温箱；
2)从-80℃取副溶血弧菌、溶藻弧菌质控菌液接种到5mlTSB培养基中，37℃摇床200rmp培养18-24h后，各取1ml菌液到无菌试管中，并用0.9％生理盐水进行10倍梯度稀释至各菌液梯度为10-5，并设置3个重复；
3)按照步骤2.5测试片的使用方法进行操作，37℃培养20h；
4)每3天验证一次，每次做3个重复并记录结果如下表4；
5)质控菌液必须为同一批次；每个步骤，每次操作时间顺序都尽可能一致。
表4：稳定性验证结果
对本领域的技术人员来说，可如以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种弧菌测试片，其特征在于，包括测试片主体、弧菌培养基以及水凝胶载体，所述弧菌培养基包括以质量百分数计算的以下组分：蛋白胨2.2-3.5％、蔗糖1.5-2.0％、牛胆粉0.2-0.4％、硫代硫酸钠0.08-0.15％、柠檬酸铁0.05-0.12％、麝香草酚蓝0.002-0.005％、酵母1.0-1.5％、氯化钠0.8-1.0％、去氧胆酸钠0.12-0.2％、柠檬酸三钠0.5-1.0％、溴麝香草酚蓝0.002-0.004％、黄原胶0.1-0.3％、纯水余量，所述弧菌培养基的pH值为9.0-9.3。
2.如权利要求1所述的弧菌测试片，其特征在于，所述测试片主体包括透明塑料底板和带格子的透明塑料薄膜片，所述透明塑料底板上设有培养槽，所述透明塑料薄膜片的一侧或一个角粘合固定在透明塑料底板表面，远离透明塑料薄膜片与透明塑料底板固定处透明塑料薄膜片的一端延伸出揭膜端。
3.如权利要求1所述的弧菌测试片，其特征在于，所述水凝胶载体为冷水可凝胶，所述冷水可凝胶为黄原胶和瓜尔胶的水凝胶。
4.如权利要求3所述的弧菌测试片，其特征在于，所述水凝胶的质量浓度为0.2-0.8％，其中黄原胶和瓜尔胶的质量比为1:(1-2)。
5.如权利要求1-4任一项所述的弧菌测试片，其特征在于，所述弧菌培养基包括以质量百分数计算的以下组分：蛋白胨3.0％、蔗糖1.8％、牛胆粉0.3％、硫代硫酸钠1％、柠檬酸铁0.1％、麝香草酚蓝0.004％、酵母1.2％、氯化钠1％、去氧胆酸钠0.15％、柠檬酸三钠0.8％、溴麝香草酚蓝0003％、黄原胶02％、纯水余量，所述弧菌培养基的pH值为9.2。
6.一种如权利要求4所述的弧菌测试片的制备方法，其特征在于，包括
制备弧菌培养基步骤：按比例将蛋白胨、牛胆粉、硫代硫酸钠、柠檬酸铁、麝香草酚蓝、酵母、氯化钠、溴麝香草酚蓝、去氧胆酸钠充分溶解于纯水后在沸水中加热3-8分钟取出，冷却至室温，调节pH值至9.0-9.3，然加入柠檬酸三钠和蔗糖，搅拌至完全溶解，再加入黄原胶搅拌至完全溶解，得到弧菌培养基；
制备水凝胶载体步骤：分别将黄原胶、瓜尔胶，过120-150目筛网，将黄原胶和瓜尔胶的按照质量比为1:(1-2)混合均匀，加入纯水配制成质量浓度为0.2-0.8％的凝胶，得到水凝胶载体；
制作测试片步骤：将上述水凝胶载体均匀涂在测试片主体的培养槽内，于恒温烘箱烘干，待冷却后将上述配制好的弧菌培养基加入到培养槽中，摇晃使弧菌培养基均匀分散在水凝胶载体上呈半凝固状，干燥后，得到弧菌测试片；
辐照灭菌：上述弧菌测试片包装入铝箔袋中，用采用Co-60γ射线辐照灭菌。
7.如权利要求6所述的弧菌测试片，其特征在于，所述制备弧菌培养基步骤中用3mol氢氧化钠溶液调节pH值。
8.如权利要求6所述的弧菌测试片，其特征在于，所述制作测试片步骤中，恒温烘箱的温度设置为65-75℃，烘干时间为1.5-2.5小时。
9.如权利要求6-8任一项所述的弧菌测试片，其特征在于，所述测试片主体包括透明塑料底板和带格子的透明塑料薄膜片，所述透明塑料底板上设有培养槽，所述透明塑料薄膜片的一侧或一个角粘合固定在透明塑料底板表面，远离透明塑料薄膜片与透明塑料底板固定处透明塑料薄膜片的一端延伸出揭膜端。
10.如权利要求9所述的弧菌测试片，其特征在于，还包括在制作测试片步骤步骤的测试片组装步骤：在干燥后的弧菌测试片的透明塑料底板表面贴上透明塑料薄膜片，所述透明塑料薄膜片的一侧或一个角贴合固定在透明塑料底板表面盖住所述培养槽，所述透明塑料薄膜片上贴上标签纸。
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