CN104911243A - 一种接种大量液体标本的固体培养基及培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种接种大量液体标本的固体培养基及培养方法，该固体培养基具有培养层，所述培养层至少包含液体标本吸附层；所述液体标本吸附层为吸水膜层、和/或吸水粉层。上述固体培养基能吸附液体标本中的液体，可直接接种大量液体标本进行培养，然后在固体培养基上根据目的，进行进一步的计数、观察、分离或鉴定。本发明的大量液体标本微生物的固体培养方法，将大量液体标本直接倒入固体培养基中进行固体培养，不需要先进行液体培养再进行固体培养，可根据需要将培养和分离合二为一，在培养的同时可进行微生物的定量、分离出单个菌落，提高了培养的微生物的阳性率，简化了培养的程序和节省了培养的时间，提高了时效性。

Description

一种接种大量液体标本的固体培养基及培养方法

技术领域

本发明涉及一种接种大量液体标本的固体培养基及培养方法，属于微生物培养技术领域。

背景技术

微生物培养方法因培养基不同分为固体培养方法和液体培养方法；其中，常用的培养基为固体培养基和液体培养基。固体培养基为固体形态，微生物在培养基表面进行生长，广泛用于微生物的分离、鉴定、保藏、计数及菌落特征的观察等。液体培养基因营养物质分布均匀，与微生物表面接触充分，能大量溶解微生物的代谢产物，还可以接种大量的标本，培养的微生物阳性率高；但是液体培养基不易定量和分离细菌，所以液体培养基广泛用于微生物的生理、代谢研究以及大规模的生产。

固体培养和液体培养各有优缺点，在实际应用中根据不同的需要进行选择或相互补充，配合使用。在微生物实验室的工作中会有大量液体标本微生物检测，如医学上的临床血液细菌检测或鉴定、生活或环境中食品、药品、水和物体表面的细菌检测。在进行大量液体标本微生物检测时，首先需要在液体培养基中进行培养使细菌增殖，之后再将增殖后的细菌接种到固体培养基上，最后在固体培养基上进行分离、鉴定和观察。通过上述方法，有效地利用了液体培养基在液体环境中营养物质分配均匀、促使微生物快速增殖、阳性率高的优点，但是因为液体培养基不易于进行分离、鉴定和观察，所以不得不接种到固体培养基上进一步进行后续的检测，最终导致上述接种的方法比较复杂，培养时间较长。

但是在实际应用中，如果直接将大量液体标本接种到现有的琼脂培养基上，虽然标准的琼脂固体培养基也能吸收少量液体，但由于琼脂固体培养基已经大量吸水膨胀，再吸收液体的能力很小，通常小于起始凝胶体积的5％，琼脂培养基中会存在大量的液体，微生物在大量的液体中不易于和固体培养基表面接触，不能很好地利用固体培养基上的营养物质，从而影响了微生物的生长、增殖和分离，最终导致检测结果的精确度降低。

发明内容

为此，本发明解决了现有技术中大量液体标本先进行液体培养再进行固体培养的方法中整个过程时间较长、操作较繁琐、时效性差的问题，进而提供了一种可适用于大量液体标本直接培养、便于分离、计数和观察、时效性强、操作简单的固体培养基及培养方法。

为了达到上述目的，本发明的技术方案为：

一种固体培养基，具有培养层，所述培养层至少包含液体标本吸附层；所述液体标本吸附层为吸水膜层、和/或吸水粉层。

上述固体培养基中，在所述液体标本吸附层的表面或者底面设置有琼脂培养基层。

上述固体培养基中，所述琼脂培养基为营养性培养基、选择性培养基或鉴定性琼脂培养基。

上述固体培养基中，所述液体标本吸附层厚度为1-4mm。

上述固体培养基中，所述吸水膜层或吸水粉层包含高吸水性材料。

上述固体培养基中，所述高吸水性材料为魔芋胶、明胶、黄原胶、瓜豆胶、琼脂、琼脂糖、壳多糖、角叉菜胶、聚丙烯酸盐、聚乙烯酸盐、膨润土、藻酸盐、胶原蛋白、熔融的硅酸盐、水溶性淀粉、改性纤维素、聚乙二醇、聚氧乙烯、聚乙烯醇、葡聚糖、聚丙烯酰胺中的一种或几种。

上述固体培养基中，所述吸水层还含有微生物生长所需营养物质、微生物生长调节剂、溶血剂、裂解剂、抗生素中和剂、细菌选择生长剂中的一种或几种。

其中，所述溶血剂或裂解剂使标本中血细胞或其它人体组织物质溶解或裂解，便于水分的吸收。常用的溶血剂为：皂素、毛地黄皂苷、吐温、月桂酸单甘酯或其他表面活性剂；裂解剂可为蛋白酶。

微生物生长调节剂可以为细菌的各种生长因子，例如：胰蛋白胨、大豆胨、蛋白胨、麦芽提取物、葡萄糖、氯化血红素、胱氨酸、二硫化物、甲萘醌、辅酶I。

抗生素中和剂可以祛除标本中抗生素对细菌培养的影响，提高和/或加快测试样品中微生物的培养。例如：各种树脂、树胶、碳基材料(如活性炭)、抗生素降解酶(如β-内酰胺酶)。

细菌选择生长剂，在进行选择培养时选择加入：如大肠杆菌可加入乳糖、胆盐、K₂HPO₄、MgSO₄、硫酸镁、二硫化物、SDS；真菌和其他耐酸微生物，可加入：葡萄糖、酵母提取物、NHSiCl₄，柠檬酸或酒石酸。

上述固体培养基中，还含有微孔膜层，微孔膜层位于所述固体培养基的最上层，所述微孔膜层为纤维素膜、再生纤维素膜、超细玻璃纤维滤膜、聚氯乙烯膜或聚四氟乙烯膜。

一种大量液体标本微生物的培养方法，其包括以下步骤：

(1)用高吸水性材料制备吸水膜层、吸水粉层或吸水膜层和吸水粉层的结合层，然后得到液体标本吸附层；

(2)用上述液体标本吸附层、或者在上述液体标本吸附层底面或表面设置琼脂培养基层制备培养层，制备培养层，然后得到固体培养基；

(3)将大量液体标本直接接种于固体培养基中，吸附大量液体标本中的液体，使大量液体标本中的微生物接触固体培养基表面，将固体培养基放入培养箱培养，然后再进行进一步的检测。

上述固体培养方法中，将高吸水性材料于水中溶解、凝固，或进一步干燥制备吸水膜层；将高吸水性材料干粉均匀覆盖制备吸水粉层；将所述吸水膜层或透明胶带粘附高吸水性材料干粉得到吸水膜层和吸水粉层的结合层。

上述固体培养方法中，所述接种的方法为：将大量液体标本直接倒入液体标本吸附层或将大量液体标本直接倒入琼脂培养基加强层再覆盖液体标本吸附层，大量液体标本接种量为1-20mL。

上述固体培养方法中，所述高吸水性材料为魔芋胶、明胶、黄原胶、瓜豆胶、琼脂、琼脂糖、壳多糖、角叉菜胶、聚丙烯酸盐、聚乙烯酸盐、角叉菜胶、膨润土、藻酸盐、胶原蛋白、熔融的硅酸盐、水溶性淀粉、改性纤维素、聚乙二醇、聚氧乙烯、聚乙烯醇、葡聚糖、聚丙烯酰胺中的一种或几种。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1、本发明的固体培养基，设置了液体标本吸附层吸附液体标本中的液体，不需要先进行液体培养再进行固体培养，直接将大量液体标本接种于本发明的固体培养基，然后在固体培养基上根据目的进行进一步的计数、观察、分离或鉴定，提高了培养的微生物的阳性率，简化了培养的程序和节省了培养的时间，提高了时效性。

2、本发明的固体培养基，将高吸水性材料引入液体标本吸附层，一方面形成了对大量液体的吸附作用层，同时也利用了高吸水性材料的成膜性能，吸水后成凝胶状态，透明度较好，形状可控，对微生物的生长不造成影响。在液体标本吸附层之上或之下设置琼脂培养基层，在液体标本吸附层在琼脂培养基层之上时，液体标本吸附层的厚度设置在1-4mm，以保证细菌菌落在培养基表面，便于分离和观察。在单独设置液体标本吸附层时，加入微生物生长所需营养物质制成固体培养基，由高吸水性材料制成的凝胶基质孔径足够小，可过滤或拦截细菌在固体培养基表面，并以足够快的速度充分吸收从样品的多余的液体，时间通常从几分钟到几小时，促使细菌形成离散的菌落。

3、本发明的固体培养基，吸水迅速，吸水量较大，90mm直径平板培养基最大可以吸附20mL液体，而普通琼脂培养基30分钟只能吸收0.2ml液体。

4、本发明的大量液体标本微生物的固体培养方法，将大量液体标本直接倒入固体培养基中进行固体培养，不需要先进行液体培养再进行固体培养，可根据需要将培养和分离合二为一，在培养的同时可进行微生物的定量、分离出单个菌落，随后可直接进行细菌鉴定和细菌药敏试验，过程中省去需要许多试管进行大量试验操作，如膜过滤等。

5、本发明的大量液体标本微生物的固体培养方法，培养时间短，一般不超过3天，绝大多数18小时内，临床工作中，如血液，胸水，腹水，关节积液，心包积液等，液体培养常规为5-7天。

具体实施方式

本发明中所述的琼脂培养基加强层中的琼脂培养基为常规的琼脂培养基，可以根据培养目的不同进行选择，如营养性培养基(营养琼脂培养基、羊血琼脂培养基等)、选择性培养基(麦康凯琼脂培养基、SS琼脂培养基等)、鉴定性琼脂培养基，其制备方法为常规方法。

实施例1

(1)按照常规方法配制琼脂培养基，注平板，作为琼脂培养基加强层，将1ml液体样本倒入到琼脂培养基加强层中，再均匀覆盖一层1mm的魔芋胶干粉作为液体标本吸附层；

(2)将接种后的培养基表面向上，放入37℃培养箱，培养18小时，然后再进行进一步的检测。

白魔芋胶干粉吸水后为透明胶体，便于观察细菌菌落生长情况，菌落计数或挑取单个菌落进行进一步试验。

本实施例中液体标本吸附层的吸水粉层还可为脱乙酰度为90％以上的壳聚糖、羧甲基纤维素、明胶、黄原胶、瓜豆胶、角叉菜胶、聚乙二醇中的一种或几种组合，上述材料吸水后为透明，对温度稳定。

实施例2

(1)将羧甲基纤维素溶解于水中配制成0.5wt％的溶液，高压灭菌，铺膜，厚为1mm，制备液体标本吸附层，备用。

(2)制备琼脂培养基加强层，将12ml液体样本倒入到琼脂培养基加强层中，然后覆盖上述液体标本吸附层，培养基表面向上，放入37℃培养箱，培养18小时，然后再进行进一步的检测

本实施例中液体标本吸附层还可为脱乙酰度为90％以上的壳聚糖、琼脂糖、明胶、黄原胶、瓜豆胶、聚乙二醇中的一种或几种组合，上述材料吸水后为透明，对温度稳定。

实施例3

(1)配制0.45wt％琼脂，8wt％明胶，0.6wt％魔芋胶的溶液，加入6wt％微生物生长所需营养物质，高压灭菌，注平板，厚为4mm，制备液体标本吸附层。

(2)将5ml液体样本倒入到液体标本吸附层中，培养基表面向上，放入37℃培养箱，培养18小时，然后再进行进一步的检测。

本实施例中还可加入微生物生长调节剂、溶血剂、裂解剂、抗生素中和剂、细菌选择生长剂中的一种或几种，用于促进微生物生长或者去除液体标本中可能影响微生物生长的物质。

上述液体标本吸附层，由高吸水性材料制成的凝胶基质孔径足够小，可过滤或拦截细菌在固体培养基表面，并以足够快的速度充分吸收从样品的多余的液体，时间通常从几分钟到几小时，促使细菌形成离散的菌落。

实施例4

(1)将明胶于水中加热溶解，配制8wt％明胶溶液，放置温度降于40℃后，注入平板制膜，厚2mm。先放烘干箱初步烘干，再放入室温阴干。在膜上均匀喷加少量水，使明胶膜保有粘性，粘附白魔芋胶干粉，再抖去多余胶粉，制备液体标本吸附层，备用。

(2)制备琼脂培养基加强层，将10ml液体标本倒入琼脂培养基加强层中，将上述制作的液体标本吸附层覆盖接种液体的培养皿上，培养基表面向上，放入37℃培养箱72小时，然后再进行进一步的检测。

由于明胶膜，在37℃培养箱中，接触水后溶解为透明液体，魔芋胶吸水后为透明胶体，易于菌落的观察、分离和计数。

实施例5

(1)将透明胶带粘附白魔芋胶干粉，再抖去多余胶粉，制备液体标本培养层，备用。

(2)制备琼脂培养基加强层，将10ml液体标本倒入琼脂培养基加强层中，将上述制作液体标本吸附和处理层覆盖在接种液体的培养皿上，培养基表面向上，放入37℃培养箱72小时，然后再进行进一步的检测。

透明胶带粘附吸水性物质，膜平整、透明，吸水能力良好，便于试验操作，利于菌落观察，吸水能力可根据要求调整变化，透气性能可控，利于需氧菌生长，也可进行厌氧菌培养。为方便菌落观察，和需氧菌生长，可将透明胶带切成各种图案。

实施例4-5中的固体培养基的制备方法中，高吸水性材料干粉还可为脱乙酰度为90％以上的壳聚糖、羧甲基纤维素、明胶、黄原胶或瓜豆胶。

实施例6

(1)配制8wt％明胶，0.4wt％羧甲基纤维素溶液，高压灭菌，注平板，制备液体标本吸附层。然后在上述液体标本吸附层上设置一层琼脂培养基加强层，然后在琼脂培养基加强层再覆盖一层再生纤维素膜，制备培养基。

(2)将8ml液体标本倒入上述养基中，培养基表面向上，放入37℃培养箱72小时，然后再进行进一步的检测。由于明胶膜，在37℃培养箱中，接触水后溶解为液态，膜较平整，膜透明度好。

实施例7

(1)将明胶加水加热溶解，制备质量浓度2wt％明胶，0.4wt％羧甲基纤维素,1wt％琼脂的水溶液，然后水溶液质量5wt％的微生物生长所需营养物质，高压灭菌，注平板，厚为4mm，制备液体标本吸附层。

(2)将7ml液体标本倒入上述液体标本吸附层中，表面向上，放入37℃培养箱72小时，然后再进行进一步的检测。

实施例8

(1)配制0.45wt％琼脂，8wt％明胶，0.6wt％魔芋胶，10wt％淀粉的溶液，高压灭菌，注平板，厚为2mm，制备液体标本吸附层，然后液体标本吸附层表面设置琼脂培养基加强层。

(2)将20ml液体样本倒入到琼脂培养基加强层中，培养基表面向上，放入37℃培养箱，培养18小时，然后再进行进一步的检测。

本发明的固体培养基，吸水迅速，吸水量较大，90mm直径平板培养基可以吸附1-20mL，尤其适用于5-10ml的大量液体液体，而普通琼脂培养基在30分钟只能吸收0.2ml液体。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种固体培养基，具有培养层，其特征在于，所述培养层至少包含液体标本吸附层；所述液体标本吸附层为吸水膜层、和/或吸水粉层。

2.根据权利要求1所述的固体培养基，其特征在于，在所述液体标本吸附层的表面或者底面设置有琼脂培养基层。

3.根据权利要求2所述的固体培养基，其特征在于，所述液体标本吸附层厚度为1-4mm。

4.根据权利要求1-3任一项所述的固体培养基，其特征在于，所述吸水膜层或吸水粉层包含高吸水性材料。

5.根据权利要求4所述的固体培养基，其特征在于，所述高吸水性材料为魔芋胶、明胶、黄原胶、瓜豆胶、琼脂、琼脂糖、壳多糖、角叉菜胶、聚丙烯酸盐、聚乙烯酸盐、膨润土、藻酸盐、胶原蛋白、熔融的硅酸盐、水溶性淀粉、改性纤维素、聚乙二醇、聚氧乙烯、聚乙烯醇、葡聚糖、聚丙烯酰胺中的一种或几种。

6.根据权利要求1-5任一项所述的固体培养基，其特征在于，所述吸水层还含有微生物生长所需营养物质、微生物生长调节剂、溶血剂、裂解剂、抗生素中和剂、细菌选择生长剂中的一种或几种。

7.根据权利要求1-6任一项所述的固体培养基，其特征在于，还含有微孔膜层，微孔膜层位于所述固体培养基的最上层，所述微孔膜层为纤维素膜、再生纤维素膜、超细玻璃纤维滤膜、聚氯乙烯膜或聚四氟乙烯膜。

8.一种大量液体标本微生物的培养方法，其特征在于，其包括以下步骤：

(1)用高吸水性材料制备吸水膜层、吸水粉层或吸水膜层和吸水粉层的结合层，然后得到液体标本吸附层；

(2)用上述液体标本吸附层、或者在上述液体标本吸附层底面或表面设置琼脂培养基层制备培养层，制备培养层，然后得到固体培养基；

(3)将大量液体标本直接接种于固体培养基中，吸附大量液体标本中的液体，使大量液体标本中的微生物接触固体培养基表面，将固体培养基放入培养箱培养，然后再进行进一步的检测。

9.根据权利要求8所述的固体培养方法，其特征在于，将高吸水性材料于水中溶解、凝固，或进一步干燥制备吸水膜层；将高吸水性材料干粉均匀覆盖制备吸水粉层；将所述吸水膜层或透明胶带粘附高吸水性材料干粉得到吸水膜层和吸水粉层的结合层。

10.根据权利要求8或9所述的固体培养方法，其特征在于，所述接种的方法为：将大量液体标本直接倒入液体标本吸附层或将大量液体标本直接倒入琼脂培养基加强层再覆盖液体标本吸附层，大量液体标本接种量为1-20mL。

11.根据权利要求8-10任一项所述的固体培养方法，其特征在于，所述高吸水性材料为魔芋胶、明胶、黄原胶、瓜豆胶、琼脂、琼脂糖、壳多糖、角叉菜胶、聚丙烯酸盐、聚乙烯酸盐、角叉菜胶、膨润土、藻酸盐、胶原蛋白、熔融的硅酸盐、水溶性淀粉、改性纤维素、聚乙二醇、聚氧乙烯、聚乙烯醇、葡聚糖、聚丙烯酰胺中的一种或几种。