CN101870739A - 多粘类芽孢杆菌胞外多糖及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种多粘类芽孢杆菌胞外多糖及其应用，该胞外多糖不仅对硅藻土、高岭土、碳酸钙具有很强的助悬浮作用，而且对活菌还具有保护作用。该多粘类芽孢杆菌胞外多糖在农药、医药、食品、石油开采、水处理、微生物活菌制剂的加工及使用方面具有广阔的应用前景。

Description

多粘类芽孢杆菌胞外多糖及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种多粘类芽孢杆菌胞外多糖及其应用，该胞外多糖不仅对硅藻土、高岭土、碳酸钙具有很强的助悬浮作用，而且对活菌还具有保护作用。该多粘类芽孢杆菌胞外多糖在农药、医药、食品、石油开采、水处理、微生物活菌制剂的加工以及使用方面具有广阔的应用前景。

背景技术

多粘类芽孢杆菌被广泛的应用于农业、工业和水处理等领域。近几年，国内外对多粘芽孢杆菌胞外多糖的应用研究较多，主要集中在絮凝性、对金属离子的吸附和浸出、选矿等方面。如湖南大学的杨朝晖、中国科学院生态环境研究中心的宫小燕等对多粘类芽孢杆菌产絮凝剂进行了研究，Santhiya等利用多粘类芽孢杆菌胞外多糖对闪锌矿和方铅矿进行了吸附实验。

虽然多粘类芽孢杆菌胞外多糖的应用研究较多，但有关其作为助悬浮和活菌保护方面的应用还未见报道。

该多粘类芽孢杆菌胞外多糖的助悬浮作用，可以应用在食品、农药、医药、石油开采、水处理等方面，用以提高产品的悬浮性或有效成分分布的均匀性等。

微生物活菌制剂产品，如以活菌为有效成分的微生物农药和微生物肥料等，在加工和使用过程中，活菌容易死亡，多糖的加入对活菌起到保护作用，这样，不仅可以减少微生物活菌制剂在加工过程中的死亡率，而且，可以提高产品在使用中的存活率和活性。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有助悬浮和活菌保护作用的多糖。

本发明对多粘类芽孢杆菌进行培养，获得高粘度的发酵液(粘度高，则胞外多糖含量也高)，然后通过醇沉淀、离心、脱色、除蛋白、柱层析、冷冻干燥等步骤得到多粘类芽孢杆菌胞外多糖的粗品。研究了该胞外多糖的助悬浮和活菌保护作用，从而完成了本发明。本发明涉及的多粘类芽孢杆菌胞外多糖，可以在食品、农药、医药、石油开采、水处理、微生物活菌制剂的加工以及使用等方面应用。

本发明第一方面提供了多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)高粘度培养的工艺，以期获得合适的含胞外多糖的多粘类芽孢杆菌发酵液。

本发明第二方面提供了一种制备多粘类芽孢杆菌胞外多糖的方法，该方法包括：将高粘度的多粘类芽孢杆菌发酵液和乙醇以1∶1～5的比例(体积比)混合，搅拌后静置12～36h，离心或过滤得到胞外多糖的粗品，该粗品重新溶解在水中利用透析或添加活性炭的方式脱色，得到的较为澄清的液体利用Sevag法除蛋白，再结果柱层析进行进一步的分离纯化，冷冻干燥后即可得到多粘类芽孢杆菌胞外多糖。

本发明第三方面涉及本发明的多粘类芽孢杆菌胞外多糖在助悬浮和活菌保护方面的应用研究。

本发明首次将多粘类芽孢杆菌胞外多糖在助悬浮和活菌保护方面进行了应用研究。这有利于将该胞外多糖应用在农药、医药、食品、石油开采、水处理、微生物活菌制剂的加工以及活菌制剂的使用上。

具体实施方式

本发明第一方面提供了一种多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)高粘度培养工艺。在合适的培养基中，通过合适的培养工艺，在发酵结束时，得到的发酵液粘度大于100cp，最高可达100万cp。在一个较佳的实施方案中，所述培养基选自农副产品或工业产品等，碳源可以是淀粉、糊精、甘油、葡萄糖、蔗糖、大米粉、糖蜜、高粱等。氮源可以是蚕蛹粉、大豆粉、花生饼粉、蛋白粉、肉膏、米糖、麦皮、酵母粉、玉米浆、铵盐以及其它有机或无机含氮化合物。另外，培养基中还可适当加入一些无机盐类，如氯化钠、磷酸盐如磷酸氢二钾和磷酸二氢钾、硫酸铵、硫酸锰、硫酸镁、碳酸钙等金属盐。通常可采用各种已知的常规培养基，如LB琼脂培养基、营养琼脂培养基、葡萄糖酵母膏琼脂培养基和牛肉浸汁琼脂培养基等。在另一个较佳的培养工艺实施方案中，所述多粘类芽孢杆菌在通气比为1∶0.5～3、搅拌转速为50～500r/min、培养温度为25～40℃、培养时间为24～72h、接种量为0.1％～10％、罐压0.01～0.1MPa的情况下进行培养，得到的高粘度发酵液可以用来分离多粘类芽孢杆菌的胞外多糖。

本发明第二方面提供了多粘类芽孢杆菌胞外多糖分离纯化的步骤和工艺。

本发明第三方面提供了多粘类芽孢杆菌胞外多糖在助悬浮和活菌保护方面的的应用。

本发明的内容、优点和目的可从下文进一步详细描述中清楚地得知。

实施例1多粘类芽孢杆菌高粘度培养工艺

本实施例通过培养基成分的优化和改变培养条件来实现多粘类芽孢杆菌的高粘度培养工艺。

方法：

(1)培养基的优化

本实施例从淀粉、糊精、甘油、葡萄糖、蔗糖、大米粉、糖蜜、高粱等中筛选出合适的碳源。从蚕蛹粉、大豆粉、花生饼粉、蛋白粉、肉膏、米糖、麦皮、酵母粉、玉米浆、铵盐等中筛选出合适的氮源。从氯化钠、磷酸盐、硫酸铵、硫酸锰、硫酸镁、碳酸钙等金属盐中筛选出合适的无机盐。

以发酵液的粘度和胞外多糖的含量高低为筛选标准。

本实施例的筛选步骤如下：先采用单因子试验进行碳、氮源的筛选，再采用正交试验进行选定碳、氮源浓度的筛选。上述的单因子试验和正交试验为本领域技术人员通常熟知且承认的培养基优化的方法。

(2)培养工艺的优化

本实施例通过改变如下发酵参数来调节多粘类芽孢杆菌高粘度发酵过程中的胞外多糖含量：通气量、转速、培养时间、接种量等。

结果与分析

(1)培养基的优化

本部分发明考察了几种常用的碳、氮源和无机盐对多粘类芽孢杆菌高粘度发酵的影响。

不同碳源对多粘类芽孢杆菌培养后的粘度和胞外多糖含量影响见表1。由表可见，淀粉、大米粉、糖蜜是比较合适的碳源。

表1不同碳源对多粘类芽孢杆菌高粘度发酵及胞外多糖含量的影响

从蚕蛹粉、大豆粉、花生饼粉、蛋白粉、肉膏、米糖、麦皮、酵母粉、玉米浆、铵盐中选出几种氮源，考察不同氮源对多粘类芽孢杆菌高粘度培养和胞外多糖含量的影响，部分结果见表2。由表可见，花生饼粉、大豆粉是比较合适的氮源。

表2不同氮源对多粘类芽孢杆菌高粘度发酵及胞外多糖含量的影响

由上面的单因子试验结果，选出淀粉、大米粉、糖蜜、花生饼粉、大豆粉作为碳、氮源作进一步的筛选，通过正交试验确定碳氮源合适的使用浓度，综合考虑发酵液粘度和胞外多糖的含量，最后得到的比较合适的碳氮源重量百分含量为：淀粉：0.1％～5％；大米粉0.1％～10％；糖蜜：0.01％～5％；花生饼粉0.05％～5％；大豆粉0.02％～5％。

(2)培养工艺的优化

本部分发明考察了通气量、转速的改变来改变DO以及培养时间的延长对多粘类芽孢杆菌高粘度培养的影响。

发酵结果表明，当多粘类芽孢杆菌在上述优化后的培养基中发酵时，气液比(每小时通气量(m³)与发酵液体积(m³)的比)由0.5∶1调整为3∶1时，发酵不同时间后发酵液的粘度如下表3。

表3不同通气量对发酵液的粘度(cp)影响

发酵罐搅拌速度对多粘类芽孢杆菌发酵液的粘度影响见表4。由该表可见，在其它发酵条件不变的情况下，当搅拌转速逐渐升高时，发酵液中的粘度逐渐提高。由此可见，提高搅拌速度可以提高发酵液粘度。

表4不同搅拌转速对发酵液粘度的影响

综合该部分的结果，多粘类芽孢杆菌芽孢培养工艺为：培养基中除了基本的无机盐外，其它的成分及其重量百分含量为：淀粉：0.1％～5％；大米粉0.1％～10％；糖蜜：0.01％～5％；花生饼粉0.05％～5％；大豆粉0.02％～5％。通气量控制在气液比为0.5∶1～3∶1，转速控制在50～500r/min，培养时间大于24h。

实施例2多粘类芽孢杆菌胞外多糖的分离纯化

本实施例通过对多粘类芽孢杆菌高粘度发酵液进行醇沉淀、离心、脱色、除蛋白、柱层析，最后再冷冻干燥得到较纯的多糖。

多粘类芽孢杆菌按照实施例1所述的培养工艺进行培养，得到高粘度的多粘类芽孢杆菌发酵液。然后将上述发酵液逐步经过醇沉淀(发酵液∶乙醇＝1∶1～5的比例(体积比)混合，充分搅拌后静置12～36h)、离心(5000r/min以上离心，取沉淀)或过滤(减压过滤)、脱色(活性炭吸附脱色或/和透析(可以通过分子量为1000左右的透析袋))、除蛋白(Sevag法等)、柱层析(DE52、Sephdex G-200等)、冷冻干燥，则得到较纯的多糖。

上述的分离纯化方法皆为本领域技术人员通常熟知且承认的稀方法。

实施例3多粘类芽孢杆菌胞外多糖的应用研究

(一)助悬浮作用

利用本施例2中得到的多粘类芽孢杆菌胞外多糖，按照悬浮率的测定方法，考察了胞外多糖的助悬浮作用，其具体数据见表5、表6和表7。

表5以高岭土为试验对象测定的助悬浮作用

表6以碳酸钙为试验对象测定的助悬浮作用

表7以硅藻土为试验对象测定的助悬浮作用

由上述表5、6、7的数据可知，多粘类芽孢杆菌胞外多糖的添加，明显能促进高岭土、碳酸钙、硅藻土的悬浮率，即多粘类芽孢杆菌胞外多糖具有明显的助悬浮作用。这有利于将该胞外多糖应用在农药、医药、食品、石油开采和水处理上。

(二)活菌保护作用

利用本施例2中得到的多粘类芽孢杆菌胞外多糖，考察了胞外多糖对活菌的保护作用。在未形成芽孢的多粘类芽孢杆菌发酵液中，添加一定量的多粘类芽孢杆菌胞外多糖，然后在一定温度下处理一段时间，考察其死亡率，具体数据见表8。在此基础上，研究了多粘类芽孢杆菌胞外多糖对海洋芽孢杆菌的保护作用，具体数据见表9。

表8多糖对多粘类芽孢杆菌活菌的保护作用

表9多糖对海洋芽孢杆菌活菌的保护作用

由上述表8和表9的数据可知，多粘类芽孢杆菌的代谢产物--胞外多糖不仅对该多糖的产生菌-多粘类芽孢杆菌具有保护作用，而且，对其它芽孢杆菌-海洋芽孢杆菌也具有保护作用。这有利于将该多糖应用在微生物活菌制剂的加工和使用上。

尽管上面已经描述了本发明的具体例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。

Claims (5)

1.一株保藏号为CGMCC No.0829的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)产生的胞外多糖。

2.如权利要求1所述的胞外多糖，其特征在于，所述多粘类芽孢杆菌胞外多糖不仅对硅藻土、高岭土、碳酸钙具有很强的助悬浮作用，而且对活菌具有保护作用。

3.如权利要求1所述的胞外多糖，其特征在于该胞外多糖由多粘类芽孢杆菌高粘度发酵后得到的发酵液经过分离纯化得到。

4.如权利要求1所述的胞外多糖，是由权利要求3所得到的多粘类芽孢杆菌发酵液，经过醇沉淀、离心或过滤、脱色、除蛋白、柱层析、冷冻干燥等分离纯化后得到的。

5.权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌胞外多糖，具有如权利要求2所述的作用，故可以应用在农药、医药、食品、石油开采、水处理、微生物活菌制剂的加工以及使用上。