CN110642958B - 一种桑黄多糖的提取方法及应用 - Google Patents

一种桑黄多糖的提取方法及应用 Download PDF

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Abstract

本公开涉及一种桑黄多糖的提取方法及应用，包括：(1)将成熟的桑黄子实体粉碎，过筛，制备培养基；(2)将纤维素降解菌和多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa接种至步骤(1)中的培养基中，发酵一定时间；(3)发酵结束后，固液分离菌体和不溶于水的杂质，得到溶有多糖的发酵液；洗涤固液分离的沉淀，将洗涤液合并至溶有多糖的发酵液中；(4)将步骤(3)获到的混合液进行超滤；(5)采用乙醇溶液沉淀，得到桑黄多糖产品。采用本公开的方法得到的桑黄多糖产品得率和纯度均比较高，而且抗氧化能力较高。

Description

一种桑黄多糖的提取方法及应用
技术领域
本公开涉及一种桑黄多糖的提取方法及应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本公开的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
桑黄是一种十分珍贵的药用真菌，对增强人体免疫功能及治疗疾病等方面具有突出的效果。真菌多糖是真菌中具有生物活性的主要有效成分之一，且来源于真菌多糖的部分产品已经进入临床研究之中，因而桑黄多糖的开发和利用也被广泛关注。
成熟的桑黄子实体成分复杂，质地较硬，其粗纤维含量高达60～70％，这就使得桑黄多糖的高效提取以及分离纯化难以实现。目前，桑黄子实体多糖提取方法，主要包括溶剂(热水、稀酸、稀碱)浸提法、酶提取法、微波提取法、超声波提取法和盐提取法等，其中，溶剂浸提法、超声波提取法和盐提取法适用于批量工业生产，但是多糖得率低、提取温度较高、容易破坏多糖结构等；而酶提取法和微波提取法虽然多糖得率高，但是多糖纯度较低以及成本方面不易控制，不适合工业化生产。
发明内容
针对以上背景技术，本公开提出一种桑黄多糖的提取方法，该方法得到的桑黄多糖产量大、纯度高。
具体的，本公开采用以下技术方案：
在本公开的第一个方面，提供一种桑黄多糖的提取方法，该方法包括以下步骤：
(1)将成熟的桑黄子实体粉碎，过筛，加蔗糖和水，制备培养基；
(2)将纤维素降解菌和多粘类芽孢杆菌Paenibacilluspolymyxa接种至步骤(1)中的培养基中，发酵一定时间；
(3)发酵结束后，固液分离菌体和不溶于水的杂质，得到溶有多糖的发酵液；洗涤固液分离的沉淀，将洗涤液合并至溶有多糖的发酵液中；
(4)将步骤(3)获到的混合液进行超滤去除盐、小分子杂质及色素，得到含有多糖的浓缩液；向浓缩液中加入浓缩液体积的2～4倍的水，混合均匀；
(5)采用乙醇溶液沉淀，得到桑黄多糖产品。
步骤(1)中，优选的，所述桑黄的种类包括Phellinus linteus、Phellinus baumii和Phellinus igniarius等。在本公开的一个或多个实施例中，所述桑黄的种类为桑黄火木层孔菌Phellinus igniarius，采用干桑黄子实体，水分含量≤1.5w/w％。
步骤(1)中，优选的，过100～120目筛。研磨的粒度适中，有利于菌种利用其中的营养成分。
步骤(1)中，优选的，过筛后的桑黄粉、蔗糖和水的加入量为(3～6)kg：(0.5～3)kg：(5～8)L。
基于桑黄子实体的高含量粗纤维、成分复杂和质地较硬的特点，使得桑黄子实体中的多糖成分不易高效提取，基于此，本发明人首先采用纤维素降解菌，纤维素降解菌利用蔗糖以及子实体中自身含有的氮源，分泌纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶等，高效降解桑黄子实体中的粗纤维和细胞壁，使得粗纤维降解成可供多粘类芽孢杆菌利用的低分子糖(如葡萄糖)等，还可使得细胞壁破碎，释放出胞内多糖，综上作用，纤维素降解菌能够破坏桑黄子实体较硬的结构，使得多糖更容易溶出，提高了多糖得率。其次，本发明人采用多粘类芽孢杆菌Paenibacilluspolymyxa，该菌种不仅能与纤维素降解菌共生，还能分泌抗肿瘤或抗活性的物质，增强了最终多糖物质的活性和产量，并且合理有效利用了资源，避免了资源浪费。
步骤(2)中，所述纤维素降解菌为复合菌或单一菌，从桑黄粗纤维的降解效果上来看，优选为复合菌。本发明人针对桑黄筛选和优化了复合菌的种类和数量比例，得到的复合菌为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、地衣芽胞杆菌Bacillus licheniformis和炭黑曲霉Aspergillus carbonarius的混合物。
其中，所述枯草芽孢杆菌、地衣芽胞杆菌和炭黑曲霉均为产纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶的菌种，可通过常规的商业途径获得。在本公开的一个或多个实施方式中，枯草芽孢杆菌的编号为CICC 10088，地衣芽胞杆菌的编号为CICC 10831，炭黑曲霉的编号为CICC 41254。
步骤(2)中，多粘类芽孢杆菌为产抗肿瘤活性多糖或抗氧化活性多糖的菌种，可通过常规的商业途径获得。在本公开的一个或多个实施方式中，多粘类芽孢杆菌编号为JB115。
步骤(2)中，发酵条件为：发酵时间为2～3d，发酵温度为常温或室温(优选25～35℃)，搅拌或摇床培养。发酵时间2～3天，足以使桑黄子实体中多糖充分溶出，可溶性固形物含量增加最明显，并且多粘类芽孢杆菌可以利用培养基中的营养物质快速生长和分泌一定含量的多糖物质，进一步提高了多糖得率。若是发酵时间短于2天，桑黄多糖的溶出率较低以及多粘类芽孢杆菌并没有成长起来；发酵时间长于3天，营养基质不充足，需要消耗桑黄子实体的多糖，使得桑黄多糖得率较低。
步骤(2)中，纤维素降解菌的接种量为1～1.5％(每100g培养基接种1～1.5mL菌液)，1mL菌液含有的菌种如下：枯草芽孢杆菌、地衣芽胞杆菌和炭黑曲霉的数量分别为(1～2)×1010cfu、(2～4)×1010cfu和(1～2)×1010cfu。
步骤(2)中，多粘类芽孢杆菌的接种量为0.5～1％(每100g培养基接种0.5～1mL菌液)，1mL菌液含有(2～4)×1010cfu的多粘类芽孢杆菌。
步骤(3)中，离心条件为：4000～5000rpm离心5～10min。
步骤(4)中，超滤膜截留分子量范围是10000～15000Da，经过测定，选择此范围的截留分子量，可以提高多糖的产率以及多糖的活性较高。
步骤(5)中，优选的，体系中乙醇的体积分数为80～85(v/v)％，处理时间为30～60min。发明人发现，当乙醇溶液体积分数为80～85(v/v)％，使得多糖产品的纯度较高。
在本公开的第二个方面，提供采用上述方法制备得到的桑黄多糖产品。
在本公开的第三个方面，提供所述桑黄多糖产品在制备抗肿瘤或抗氧化药物或保健品中的应用。
与本发明人知晓的相关技术相比，本公开其中的一个技术方案具有如下有益效果：
(1)本公开采用发酵的技术方法对桑黄子实体进行预处理，不仅能够使桑黄自身的多糖溶出率得到提高，而且在发酵过程中加入了共生发酵菌种，进一步提高了多糖得率和多糖的活性。
(2)采用本公开的方法，桑黄多糖产品中多糖的含量高。
附图说明
构成本公开一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。
图1是本公开实施例1的分析样品的高效液相色谱图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，本文所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本公开的技术方案。
本公开中，多糖得率(％)＝纯度×粗多糖样品质量/子实体干粉重量×100％。
实施例1
一种桑黄多糖的提取方法，该方法包括以下步骤：
(1)将成熟的干燥桑黄Phellinus igniarius子实体粉碎，研磨，过100目筛，加蔗糖和水混合均匀，制备培养基；其中，桑黄粉、蔗糖和水的加入量为5kg：2.5kg：5L。
(2)采用的纤维素降解菌是由枯草芽孢杆菌CICC 10088、地衣芽胞杆菌CICC10831和炭黑曲霉CICC 41254组成的复合菌种；
将纤维素降解菌和多粘类芽孢杆菌JB115接种至步骤(1)中的培养基中，发酵60h，发酵温度为室温，大约30℃，摇床培养，摇床转速150rpm；
其中，纤维素降解菌的接种量为:每100g培养基接种1.5mL纤维素降解菌液，每mL菌液中含有2×1010cfu枯草芽孢杆菌CICC 10088、2×1010cfu地衣芽胞杆菌CICC 10831和1×1010cfu炭黑曲霉CICC 41254；多粘类芽孢杆菌的接种量为：每100g培养基接种1mL多粘类芽孢杆菌液，每mL菌液中含有3×1010cfu的多粘类芽孢杆菌。
(3)发酵结束后，发酵产物装入离心瓶中，4000rpm离心10min，离心后，收集上清液，洗涤沉淀，并将洗涤液合并至上清液中。
(4)将步骤(3)中获得的混合液进行超滤脱盐和浓缩，超滤膜截留分子量范围是10000Da，得到含有多糖的浓缩液；向浓缩液中加入浓缩液体积的3倍的水，混合均匀，为下一步的醇沉做准备。
(5)向步骤(4)的体系中加入无水乙醇，混匀，使体系中的乙醇体积分数为80v/v％，沉淀多糖，处理时间40min；处理结束后，6000rpm离心20min，得到沉淀，再用体积分数为95％的乙醇溶液洗涤沉淀两次，去除杂蛋白，洗涤后6000rpm离心20min，离心后得到的沉淀即为桑黄多糖产物。
(6)将步骤(5)中的桑黄多糖产物进行冷冻干燥，即为桑黄多糖产品。
将0.2g桑黄多糖产品溶于5mL蒸馏水后得到分析样品，进行高效液相色谱分析，结果如图1所示，从图中可知，多糖成分并不是单一的多糖种类。
经过检测，桑黄多糖产品的纯度为75.3％，得率为8.5w/w％，采用南京信帆生物总抗氧化能力t-aoc试剂盒测定总的抗氧化能力(FRAP法)为24.6U/mL。
实施例2
一种桑黄多糖的提取方法，该方法包括以下步骤：
(1)将成熟的干燥桑黄Phellinus igniarius子实体粉碎，研磨，过100目筛，加蔗糖和水混合均匀，制备培养基；其中，桑黄粉、蔗糖和水的加入量为6kg：1.5kg：6L。
(2)采用的纤维素降解菌是由枯草芽孢杆菌CICC 10088、地衣芽胞杆菌CICC10831和炭黑曲霉CICC 41254组成的复合菌种；
将纤维素降解菌和多粘类芽孢杆菌JB115接种至步骤(1)中的培养基中，发酵48h，发酵温度为室温，大约30℃，摇床培养，摇床转速120rpm；
其中，纤维素降解菌的接种量为:每100g培养基接种1mL纤维素降解菌液，每mL菌液中含有2×1010cfu枯草芽孢杆菌CICC 10088、2×1010cfu地衣芽胞杆菌CICC 10831和1×1010cfu炭黑曲霉CICC 41254；多粘类芽孢杆菌的接种量为：每100g培养基接种0.5mL多粘类芽孢杆菌液，每mL菌液中含有3×1010cfu的多粘类芽孢杆菌。
(3)发酵结束后，发酵产物装入离心瓶中，4000rpm离心10min，离心后，收集上清液，洗涤沉淀，并将洗涤液合并至上清液中。
(4)将步骤(3)中获得的混合液进行超滤脱盐和浓缩，超滤膜截留分子量范围是12000Da，得到含有多糖的浓缩液；向浓缩液中加入浓缩液体积的4倍的水，混合均匀，为下一步的醇沉做准备。
(5)向步骤(4)的体系中加入无水乙醇，混匀，使体系中的乙醇体积分数为85v/v％，沉淀多糖，处理时间30min；处理结束后，6000rpm离心15min，得到沉淀，再用体积分数为95％的乙醇溶液洗涤沉淀两次，去除杂蛋白，洗涤后6000rpm离心20min，离心后得到的沉淀即为桑黄多糖产物。
(6)将步骤(5)中的桑黄多糖产物进行冷冻干燥，即为桑黄多糖产品。
经过检测，桑黄多糖产品的纯度为75.0％，得率为7.9w/w％，采用南京信帆生物总抗氧化能力t-aoc试剂盒测定总的抗氧化能力(FRAP法)为23.5U/mL。
实施例3
一种桑黄多糖的提取方法，该方法包括以下步骤：
(1)将成熟的干燥桑黄Phellinus igniarius子实体粉碎，研磨，过100目筛，加蔗糖和水混合均匀，制备培养基；其中，桑黄粉、蔗糖和水的加入量为3kg：1kg：5L。
(2)采用的纤维素降解菌是由枯草芽孢杆菌CICC 10088和地衣芽胞杆菌CICC10831组成的复合菌种；
将纤维素降解菌和多粘类芽孢杆菌JB115接种至步骤(1)中的培养基中，发酵72h，发酵温度为室温，大约30℃，摇床培养，摇床转速150rpm；
其中，纤维素降解菌的接种量为:每100g培养基接种1.5mL纤维素降解菌液，每mL菌液中含有2×1010cfu枯草芽孢杆菌CICC 10088和3×1010cfu地衣芽胞杆菌CICC 10831；多粘类芽孢杆菌的接种量为：每100g培养基接种1mL多粘类芽孢杆菌液，每mL菌液中含有3×1010cfu的多粘类芽孢杆菌。
(3)发酵结束后，发酵产物装入离心瓶中，4000rpm离心10min，离心后，收集上清液，洗涤沉淀，并将洗涤液合并至上清液中。
(4)将步骤(3)中获得的混合液进行超滤脱盐和浓缩，超滤膜截留分子量范围是10000Da，得到含有多糖的浓缩液；向浓缩液中加入浓缩液体积的2倍的水，混合均匀，为下一步的醇沉做准备。
(5)向步骤(4)的体系中加入无水乙醇，混匀，使体系中的乙醇体积分数为80v/v％，沉淀多糖，处理时间30min；处理结束后，6000rpm离心20min，得到沉淀，再用体积分数为95％的乙醇溶液洗涤沉淀两次，去除杂蛋白，洗涤后6000rpm离心20min，离心后得到的沉淀即为桑黄多糖产物。
(6)将步骤(5)中的桑黄多糖产物进行冷冻干燥，即为桑黄多糖产品。
经过检测，桑黄多糖产品的纯度为62.8％，得率为6.2w/w％，采用南京信帆生物总抗氧化能力t-aoc试剂盒测定总的抗氧化能力(FRAP法)为20.8U/mL。
实验例1
一种桑黄多糖的提取方法，该方法包括以下步骤：
(1)将成熟的干燥桑黄Phellinus igniarius子实体粉碎，研磨，过100目筛，加5倍桑黄粉质量的热水100℃提取4h；提取之后过滤得到提取液，如此提取两次，合并提取液。
(2)将步骤(1)中获得的混合液进行超滤脱盐和浓缩，超滤膜截留分子量范围是10000Da，得到含有多糖的浓缩液；向浓缩液中加入浓缩液体积的3倍的水，混合均匀。
(3)向步骤(2)的体系中加入无水乙醇，混匀，使体系中的乙醇体积分数为80v/v％，沉淀多糖，处理时间40min；处理结束后，6000rpm离心20min，得到沉淀，再用体积分数为95％的乙醇溶液洗涤沉淀两次，去除杂蛋白，洗涤后6000rpm离心20min，离心后得到的沉淀即为桑黄多糖产物。
(4)将步骤(3)中的桑黄多糖产物进行冷冻干燥，即为桑黄多糖产品。
经过检测，桑黄多糖产品的纯度为25.3％，得率为2.5w/w％，采用南京信帆生物总抗氧化能力t-aoc试剂盒测定总的抗氧化能力(FRAP法)为5.3U/mL。
实验例2
一种桑黄多糖的提取方法，该方法包括以下步骤：
(1)将成熟的干燥桑黄Phellinus igniarius子实体粉碎，研磨，过100目筛，加蔗糖和水混合均匀，制备培养基；其中，桑黄粉、蔗糖和水的加入量为5kg：1kg：5L。
(2)采用的纤维素降解菌是由枯草芽孢杆菌CICC 10088、地衣芽胞杆菌CICC10831和炭黑曲霉CICC 41254组成的复合菌种；
将纤维素降解菌接种至步骤(1)中的培养基中，发酵60h，发酵温度为室温，大约30℃，摇床培养，摇床转速150rpm；
其中，纤维素降解菌的接种量为:每100g培养基接种1.5mL纤维素降解菌液，每mL菌液中含有2×1010cfu枯草芽孢杆菌CICC 10088、2×1010cfu地衣芽胞杆菌CICC 10831和1×1010cfu炭黑曲霉CICC 41254。
(3)发酵结束后，发酵产物装入离心瓶中，4000rpm离心10min，离心后，收集上清液，洗涤沉淀，并将洗涤液合并至上清液中。
(4)将步骤(3)中获得的混合液进行超滤脱盐和浓缩，超滤膜截留分子量范围是10000Da，得到含有多糖的浓缩液；向浓缩液中加入浓缩液体积的3倍的水，混合均匀，为下一步的醇沉做准备。
(5)向步骤(4)的体系中加入无水乙醇，混匀，使体系中的乙醇体积分数为80v/v％，沉淀多糖，处理时间40min；处理结束后，6000rpm离心20min，得到沉淀，再用体积分数为95％的乙醇溶液洗涤沉淀两次，去除杂蛋白，洗涤后6000rpm离心20min，离心后得到的沉淀即为桑黄多糖产物。
(6)将步骤(5)中的桑黄多糖产物进行冷冻干燥，即为桑黄多糖产品。
经过检测，桑黄多糖产品的纯度为75.3％，得率为5.5w/w％，采用南京信帆生物总抗氧化能力t-aoc试剂盒测定总的抗氧化能力(FRAP法)为12.1U/mL。
上述实施例为本公开较佳的实施方式，但本公开的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本公开的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本公开的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种桑黄多糖的提取方法，其特征是，该方法包括以下步骤：
(1)将成熟的桑黄子实体粉碎，过筛，加蔗糖和水，制备培养基；其中，过筛后的桑黄粉、蔗糖和水的加入量为(3～6)kg：(0.5～3)kg：(5～8)L；
(2)将纤维素降解菌和多粘类芽孢杆菌接种至步骤(1)中的培养基中，发酵一定时间；所述纤维素降解菌为复合菌，复合菌为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、地衣芽胞杆菌Bacillus licheniformis和炭黑曲霉Aspergillus carbonarius的混合物；纤维素降解菌的接种量为1～1.5％，1mL菌液含有的菌种如下：枯草芽孢杆菌、地衣芽胞杆菌和炭黑曲霉＝(1～2)×1010cfu、(2～4)×1010cfu、(1～2)×1010cfu；
多粘类芽孢杆菌的接种量为0.5～1％，1mL菌液含有(2～4)×1010cfu的多粘类芽孢杆菌；
(3)发酵结束后，固液分离菌体和不溶于水的杂质，得到溶有多糖的发酵液；洗涤固液分离的沉淀，将洗涤液合并至溶有多糖的发酵液中；
(4)将步骤(3)获到的混合液进行超滤去除盐、小分子杂质及色素，得到含有多糖的浓缩液；向浓缩液中加入浓缩液体积的2～4倍的水，混合均匀；超滤膜截留分子量范围是10000～15000Da；
(5)采用乙醇溶液沉淀，体系中乙醇的体积分数为80～85(v/v)％，处理时间为30～60min，得到桑黄多糖产品。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是，步骤(1)中，过100～120目筛。
3.如权利要求1所述的方法，其特征是，步骤(2)中，发酵条件为：发酵时间为2～3d，发酵温度为常温或室温，搅拌或摇床培养。
4.如权利要求1所述的方法，其特征是，步骤(3)中，离心条件为：4000～5000rpm离心5～10min。
5.采用权利要求1～4中任一项所述的方法制备得到的桑黄多糖产品。
6.权利要求5所述的桑黄多糖产品在制备抗肿瘤或抗氧化药物或保健品中的应用。
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