CN102154428B - 一种人参皂苷Rh2的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物领域，具体的说是涉及一种人参皂苷Rh2的制备方法，具体为取活化的德氏乳杆菌保加利亚亚种接种MRS培养基，加入人参总皂苷，在37～39℃发酵240～248h，收集发酵液与皂苷糖苷酶在88～92℃反应240～360h，收集反应液过滤，滤液用大孔树脂吸附70％乙醇洗脱，然后以95％的乙醇提取过滤，滤液干燥得人参皂苷Rh2。本发明所述制备方法操作简单，反应条件温和，利用德氏乳杆菌保加利亚亚种对人参总皂苷进行生物转化、皂苷糖苷酶水解制备人参皂苷Rh2，转化率高，可用于人参皂苷Rh2的大量制备，实现人参皂苷Rh2的产业化。

Description

一种人参皂苷Rh2的制备方法
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体的说是涉及一种人参皂苷Rh2的制备方法。
背景技术
人参为五加科植物人参的根，被人们称为“百草之王”，是驰名中外、老幼皆知的名贵药材，具有滋补强身之功效，在我国和东亚的应用已有数千年。研究发现，人参主要含有皂甙、肽及氨基酸、维生素等物质，其中人参皂苷(Ginsenoside)是人参功效的主要成分，广泛地作用于人体的神经系统、免疫系统，在心血管疾病和肿瘤等疑难杂症的治疗上显示出与众不同的独特效果。现已明确的人参皂苷单体约有40余种，如Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Rg1、Rg2、Rg3、Rh1、Rh2及Re等等。
近年大量研究发现，在体内人参皂苷类成分在生物酶的作用下代谢成为含糖更少、分子量更小、可以被人体直接吸收的Rg3、Rg5、Rh2、Rh3、C-K、原人参二醇、Rg2、Rh1、原人参三醇等稀有活性皂苷，吸收入血发挥治疗作用。因此，Rg3、Rg5、Rh2、Rh3、C-K、原人参二醇、Rg2、Rh1、原人参三醇等稀有活性皂苷，是人参发挥其医疗保健功能的主要活性成分。
1983年北川勋等人首次从红参的原人参二醇组皂苷中发现并以极低的收率(0.001％)分离得到了人参皂苷Rh2(ginsenoside Rh2，GS-Rh2)。许多研究表明，人参皂苷Rh2是人参皂苷主要活性物质经水解后最后产物中抑制癌细胞增殖作用的能力最强的成分，具有诱导癌细胞凋亡、分化及调控细胞周期的抗癌活性，抑制癌细胞增殖和转移的作用，还对人体具有较高的保健功能。
然而，天然人参植物材料中人参皂苷Rh2含量极低(0.0015～0.006％)，所以直接提取难度大、收率低。为此，近年来人们一直努力探索利用具有达玛烷型结构的各种人参皂苷单体化学转化为人参皂苷Rh2的方法。中国专利CN1225366A，在高温高压条件下，碱水解原人参二醇组皂苷，除去部分糖基，获得人参皂苷Rh2。中国专利CN1229086A以酶解法转化获得人参皂苷Rh2，采用皂苷糖苷酶对人参皂苷进行水解，使皂苷分子上的部分糖基被水解生成新的皂苷。上述方法虽可获得人参皂苷Rh2，但转化率很低，难以实现人参皂苷Rh2的产业化。
发明内容
有鉴于此，本发明目的针对现有的人参皂苷Rh2制备方法产率低的缺陷，提供一种转化率高的人参皂苷Rh2的制备方法。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种人参皂苷Rh2的制备方法，包括：
步骤1：取活化的德氏乳杆菌保加利亚亚种接种MRS培养基，加入人参总皂苷，在37～39℃发酵240～248h，其中，所述人参总皂苷加入量为每1L所述MRS培养基加入人参总皂苷10～20g，所述MRS培养基配方为：蛋白胨10.0g/L、牛肉膏10.0g/L、酵母膏5.0g/L、柠檬酸氢二铵2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、吐温80 1.0mL/L、乙酸钠5.0g/L、磷酸氢二钾2.0g/L、硫酸镁0.58g/L、硫酸锰0.25g/L；
步骤2：取步骤1所得发酵液与皂苷糖苷酶在88～92℃反应240～360h，所述皂苷糖苷酶与人参总皂苷的质量比为1∶20～50；
步骤3：收集步骤2所得反应液，过滤，滤液用大孔树脂吸附，70％乙醇洗脱；
步骤4：取步骤3所得洗脱液以95％的乙醇提取，提取液过滤，收集滤液，干燥得人参皂苷Rh2。
本发明所述制备方法以人参总皂苷为反应物，利用德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)对人参总皂苷进行生物转化，其中，人参总皂苷加入量为每1L所述MRS培养基加入人参总皂苷10～20g。所述人参总皂苷为五加科植物人参的根经加工制成的总皂苷，所述人参总皂苷的制备方法为取人参根，切片，加水煎煮两次，煎液滤过，滤液合并，通过D101大孔吸附树脂，水洗脱至无色，再用60％乙醇洗脱，收集60％乙醇洗脱液，滤液浓缩至相对密度为1.06～1.08(80℃)的清膏，干燥，粉碎，即得。
德氏乳杆菌保加利亚亚种是最具经济价值的乳酸菌之一，本发明所述德氏乳杆菌保加利亚亚种为市售菌种，经菌种活化后加入到MRS培养基与人参总皂苷发酵进行生物转化。
本发明所述德氏乳杆菌保加利亚亚种活化为：-70℃保存的德氏乳杆菌保加利亚亚种甘油菌在固体MRS培养基上划线37℃静止培养20～28h，然后挑取单菌落接种于MRS培养基中37℃静止培养20～28h。其中，所述MRS培养基配方为：蛋白胨10.0g/L、牛肉膏10.0g/L、酵母膏5.0g/L、柠檬酸氢二铵2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、吐温80 1.0mL/L、乙酸钠5.0g/L、磷酸氢二钾2.0g/L、硫酸镁0.58g/L、硫酸锰0.25g/L。所述固体MRS培养基为所述MRS培养基加入琼脂18.0g/L，调pH至6.2～6.6，121℃，101Kpa灭菌15min。
优选的，所述活化的德氏乳杆菌保加利亚亚种接种量为所述MRS培养基体积的1.0～1.9％。
本发明所述制备方法步骤2利用皂苷糖苷酶与步骤1所得发酵液反应，水解皂苷糖基制备人参皂苷Rh2。其中，所述皂苷糖苷酶为可水解皂苷糖基的β-葡萄糖苷酶、α-鼠李糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、β-半乳糖苷酶等皂苷糖苷酶。
本发明所述制备方法利用大孔树脂吸附和95％乙醇提取分离得到人参皂苷Rh2，所述大孔树脂为弱极性聚苯乙烯树脂，如AB-8树脂。AB-8树脂对皂苷的吸附容量大于蛋白质和糖类。
本发明所述制备方法还包括对所得人参皂苷Rh2进行纯化步骤。
优选的，以硅胶柱层析法纯化，具体为取步骤4所得滤液，以硅胶柱层析纯化，干燥得人参皂苷Rh2纯品。
本发明利用德氏乳杆菌保加利亚亚种对人参总皂苷进行生物转化、皂苷糖苷酶水解制备人参稀有皂苷Rh2。在一个具体实施方案中，本发明所述制备方法人参皂苷Rh2的转化率为43.2％。实验表明，采用本发明所述制备方法制备人参皂苷Rh2，产物转化率大于40％，纯度大于90％。本发明所述制备方法操作简单，反应条件温和，人参皂苷Rh2转化率高，可用于人参皂苷Rh2的大量制备，实现人参皂苷Rh2的产业化。
具体实施方式
本发明实施例公开了一种人参皂苷Rh2的制备方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。
实施例1：
取5mL活化的德氏乳杆菌保加利亚亚种(L.b-01)接种1L MRS培养基，加入人参总皂苷10g，在37～39℃发酵240～248h，收集发酵液，过滤。然后加入0.5g β-葡萄糖苷酶，在88℃反应240h，反应后收集反应液，过滤。滤液用大孔树脂AB-8吸附，600mL 70％乙醇洗脱。洗脱液以体积分数为95％的乙醇提取，提取液过滤收集滤液，干燥制得人参皂苷Rh24.32g，转化率为43.2％。
实施例2：
取20mL活化的德氏乳杆菌保加利亚亚种(L.b-3)接种1L MRS培养基，加入人参总皂苷15g，在37～39℃发酵240～248h，收集发酵液，过滤。然后加入0.2gα-阿拉伯糖苷酶，在92℃反应360h，反应后收集反应液，过滤。滤液用大孔树脂AB-8吸附，500mL 70％乙醇洗脱。洗脱液以体积分数为95％的乙醇提取，提取液过滤收集滤液，干燥得人参皂苷Rh2，转化率为45.6％。硅胶柱层析纯化，干燥得人参皂苷Rh2纯品4.08g，HPLC检测纯度为96.4％。
实施例3：
取15mL活化的德氏乳杆菌保加利亚亚种(L.b-MYC)接种1L MRS培养基，加入人参总皂苷20g，在37～39℃发酵240～248h，收集发酵液，过滤。然后加入0.3gα-鼠李糖苷酶，在90℃反应280h，反应后收集反应液，过滤。滤液用大孔树脂AB-8吸附，500mL 70％乙醇洗脱。洗脱液以体积分数为95％的乙醇提取，提取液过滤收集滤液，干燥得人参皂苷Rh2，转化率为43.5％。硅胶柱层析纯化，干燥得人参皂苷Rh2纯品4.12g，HPLC检测纯度为97.2％。
实施例4：
取10mL活化的德氏乳杆菌保加利亚亚种(L.b-SP1.1)接种1L MRS培养基，加入人参总皂苷13g，在37～39℃发酵240～248h，收集发酵液，过滤。然后加入0.3gα-鼠李糖苷酶，在90℃反应300h，反应后收集反应液，过滤。滤液用大孔树脂AB-8吸附，400mL 70％乙醇洗脱。洗脱液以体积分数为95％的乙醇提取，提取液过滤收集滤液，干燥得人参皂苷Rh2，转化率为42.7％。硅胶柱层析纯化，干燥得人参皂苷Rh2纯品3.98g，HPLC检测纯度为96.8％。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (4)

1.一种人参皂苷Rh2的制备方法，包括：
步骤1：取活化的德氏乳杆菌保加利亚亚种接种MRS培养基，加入人参总皂苷，在37～39℃发酵240～248h，其中，所述人参总皂苷为五加科植物人参的根经加工制成的总皂苷，其制备方法为取人参根，切片，加水煎煮两次，煎液滤过，滤液合并，通过D101大孔吸附树脂，水洗脱至无色，再用60％乙醇洗脱，收集60％乙醇洗脱液，滤液浓缩至相对密度为1.06～1.08的清膏，干燥，粉碎，即得；
所述人参总皂苷加入量为每1L所述MRS培养基加入人参总皂苷10～20g，所述MRS培养基配方为：蛋白胨10.0g/L、牛肉膏10.0g/L、酵母膏5.0g/L、柠檬酸氢二铵2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、吐温801.0mL/L、乙酸钠5.0g/L、磷酸氢二钾2.0g/L、硫酸镁0.58g/L、硫酸锰0.25g/L；
步骤2：取步骤1所得发酵液与皂苷糖苷酶在88～92℃反应240～360h，所述皂苷糖苷酶为α-鼠李糖苷酶，其与人参总皂苷的质量比为1∶20～50；
步骤3：收集步骤2所得反应液，过滤，滤液用AB-8型大孔吸附树脂吸附，70％乙醇洗脱；
步骤4：取步骤3所得洗脱液以95％乙醇提取，提取液过滤，收集滤液，干燥得人参皂苷Rh2。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述活化的德氏乳杆菌保加利亚亚种接种量为所述MRS培养基体积的1.0～2.0％。
3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，还包括对所得人参皂苷Rh2进行纯化步骤。
4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，所述纯化为以硅胶柱层析纯化。
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