CN102676604A

CN102676604A - 一种连续模拟移动床色谱分离制备高纯度低聚半乳糖的方法

Info

Publication number: CN102676604A
Application number: CN2011100541545A
Authority: CN
Inventors: 刘宗利; 王乃强; 袁卫涛; 栾庆民; 冯志臣; 滕慧; 李庆华; 李双茹
Original assignee: Baolingbao Biology Co Ltd
Current assignee: Baolingbao Biology Co Ltd
Priority date: 2011-03-08
Filing date: 2011-03-08
Publication date: 2012-09-19

Abstract

本发明涉及一种高纯度低聚半乳糖的生产方法。低聚半乳糖发酵液经陶瓷膜超滤、离子交换处理后，采用十床式连续模拟移动床色谱分离制备，产品纯度可达95％以上，很好的实现了低聚半乳糖溶液中单糖、乳糖的完全分离，分离效率高，产品品质得到进一步提升。本发明生产过程所用菌株米曲霉Aspergillus oryzae BLB-21于2009年3月17日保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏号：CGMCC No.2951。

Description

一种连续模拟移动床色谱分离制备高纯度低聚半乳糖的方法

技术领域

本发明涉及功能糖制备领域，特别涉及一种高纯度低聚半乳糖的制备方法。

背景技术

低聚半乳糖(Galacto-oligosaccharides，简称GOS)是一种具有天然属性的非消化性低聚糖，在人类母乳中含量较多，婴儿体内双岐杆菌菌群的建立很大程度上依赖于母乳中的低聚半乳糖成分。同其他非消化性低聚糖相比，低聚半乳糖具有专一性促进肠道内双歧杆菌增值、安全性高、对食品加工热处理稳定等优点，同时由于其生产用原料来源广泛，在食品、保健品等方面具有广泛的应用，生产和应用低聚半乳糖在食品工业领域具有巨大潜力。目前，全球生产低聚半乳糖的厂家主要在日本，我国对低聚半乳糖的生产还未规模化，处于研究阶段。

低聚半乳糖中所含单糖组分如葡萄糖、半乳糖等直接影响其应用价值。葡萄糖组分的存在会妨碍低聚半乳糖促进双歧杆菌的增殖效果；而且，由于葡萄糖不适于糖尿病人、肥胖病人等忌糖人士的食用，也降低了低聚半乳糖在食品、保健品及药品中的应用价值。因此，除去低聚半乳糖中葡萄糖等单糖组分，提高纯度，不但能够促进产品的生理功能的发挥，还可以大大促进其在医药级产品中的应用。因此，提高低聚半乳糖产品纯度、增加产品品质成为当前低聚半乳糖产品开发应用的迫切需求。

现有技术中，有专利文献提到制备含低聚半乳糖的低乳糖乳清粉的方法。其制备了β-半乳糖苷酶粗酶液来处理乳清粉，在降低乳清粉中乳糖的同时得到了高含量的低聚半乳糖。但是对于高含量低聚半乳糖溶液中其他组分如单糖、乳糖等的分离并未提及，要实现工业生产高纯度低聚半乳糖产品，还需要对高含量低聚半乳糖进行进一步分离纯化处理。

另有专利文献中公开了利用固定化酵母去除低聚半乳糖中单糖组分的方法。其应用固定化酵母去除低聚半乳糖溶液中的单糖，除去了葡萄糖，从而提高低聚半乳糖含量。此报导较好的去除了部分单糖组分，但是半乳糖却无法去除，同时双糖组分乳糖并未得到很好的分离。

也有文献提及纳滤纯化低聚糖的方法。但实际生产中，纳滤分离低聚糖，仅适用于单糖与三糖或多糖分离，也就是说纳滤分离低聚糖适用于分子量小于200与大于500之间组分的分离，此报导用以单糖和二糖(分子量分别为180与342)之间的分离效果差、需用较多纯水，同时透析废水浓度极低，回收困难、主产品回收率大大下降，不适于工业化生产。纳滤分离产品纯度为80％时效率较高，性价比合适，随着纯度的进一步提高，分离效率迅速下降，成本升高，因此要得到更高纯度产品还需要采用其他分离方法。

本专利采用十床式连续模拟移动床色谱分离技术，对离子交换处理后的50～65％原料液进行有效制备分离，总柱效高，实现了连续化操作，成功实现了低聚半乳糖和葡萄糖、半乳糖、乳糖组分的分离，低聚半乳糖产品纯度达95％以上。

发明内容

针对现有低聚半乳糖终产品纯度不高等生产问题，本发明提供了十床式连续模拟移动床色谱分离制备95％纯度以上低聚半乳糖产品的方法，提高低聚半乳糖生产转化产率、提高终产品纯度。

本发明具体是通过以下措施实现的：

(1)高产菌株米曲霉Aspeigillus oryzaeBLB-21(已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址：北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，保藏时间为2009年3月17日，保藏号CGMCC No.2951)活化、扩大培养后二级种子以10％(V/V)的量接入到40％乳糖溶液中发酵，发酵罐体积150L，装液量为60％，调节pH5.5，25～40℃发酵30-40h，搅拌转速250rpm，通气量200L/h；

种子培养基：葡萄糖300-500g/L，酵母膏15g/L，琼脂粉15g/L，pH自然(约5.5)，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.5g/L，尿素5g/L；

(2)超滤采用陶瓷膜超滤，去除菌体及发酵液中酶、蛋白质和核酸等大分子物质，初步得到糖组分混合液；

(3)活性炭脱色对超滤后的糖溶液按2％加入活性炭，80℃反应60min，脱色过滤；

(4)离子交换采用强酸性阳离子-弱碱性阴离子-强酸性阳离子交换树脂，温度30-50℃，进样量10L/h，树脂高度1m进行分离脱盐，经HPLC检测可得低聚半乳糖含量为55％的糖溶液。此时糖组分为葡萄糖、半乳糖、乳糖、低聚半乳糖；

(5)色谱分离采用连续模拟移动床色谱分离法，以钙型离子树脂为载体，通过研究树脂层高度、电磁阀控制模拟移动床切换周期、控制流量、流速等参数，采用10床式连续法色谱分离装置(图1)，参数为：树脂柱装填高度为0.65m，分配盘转速为3°/min，进料浓度55-65％，进料温度60-70℃，进料流速1.2-1.8L/h，进水流速2-3L/h，流出液流速1.4-2.0L/h，洗脱液流速1.8-2.8L/h可分离得到95％以上高纯度低聚半乳糖产品。

(6)蒸发浓缩经色谱分离的产品通过六效降膜式蒸发浓缩器得高纯度低聚半乳糖浆；

(7)喷雾干燥采用压力式喷雾干燥塔干燥得高纯度低聚半乳糖固体。

高纯度低聚半乳糖制备生产工艺流程：

斜面种子→一级种子→二级种子→发酵(20-40％乳糖溶液)→

超滤→脱色(活性炭)→离子交换→色谱分离(90％)→蒸发

浓缩→高纯度低聚半乳糖浆→喷雾干燥→高纯度低聚半乳糖固体

本发明发酵法生产低聚半乳糖工艺与现有技术相比，有如下优点：

(1)本专利所得95％以上高纯度低聚半乳糖产品，去除了葡萄糖等单糖和乳糖组分，不仅利于低聚半乳糖产品双歧杆菌增殖等优良生理效用的发挥，而且适用于忌糖人士，具有更加广泛的保健和药用价值；

(2)陶瓷膜超滤，去除菌体效率较传统压滤高；

(3)采用十床式连续模拟移动床色谱分离，分离效果好，产品低聚半乳糖纯度可达95％以上，很好的实现了低聚半乳糖溶液中单糖、乳糖的完全分离，分离效率高，产品品质好。

附图说明

附图1为本发明10床式连续法色谱分离装置结构示意图。

图中：A-J为10根填料柱，1-10依次为10根填料柱的进料口、出料口，a为进料55％低聚半乳糖糖液，b为出料95％低聚半乳糖糖液，c为流出液葡萄糖、半乳糖及乳糖副产品，d为水。

图中，箭头表示液体流动方向。

具体实施方式

实施例1：

菌株BLB-21接入葡萄糖浓度为300g/L的种子液进行扩大培养。二级种子液(浓度：菌丝湿重0.52％)以10％(V/V)的量接入到20％乳糖溶液中发酵，调节pH5.5，25～30℃发酵40h。经超滤初步得到糖组分混合液，活性炭脱色后采用强酸性阳离子-弱碱性阴离子-强酸性阳离子交换树脂，温度30～35℃，进样量10L/h，树脂高度1m进行分离脱盐，经HPLC检测得低聚半乳糖含量为55.24％的糖溶液。此时糖组分为葡萄糖、半乳糖、乳糖、低聚半乳糖。

色谱分离参数为：树脂柱装填高度为0.65m，分配盘转速为3°/min，进料浓度60％，进料温度63℃，进料流速1.4L/h，进水流速2.3L/h，流出液流速1.5L/h，洗脱液流速1.8L/h可分离得到96.74％的高纯度低聚半乳糖产品。

表1 应用10床式模拟移动床色谱分离低聚半乳糖

实施例2

菌株BLB-21接入葡萄糖浓度为400g/L的种子液进行扩大培养。二级种子液(浓度：菌丝湿重0.45％)以10％(V/V)的量接入到30％乳糖溶液中发酵，调节pH5.5，30～35℃发酵30h。经超滤初步得到糖组分混合液，活性炭脱色后采用强酸性阳离子-弱碱性阴离子-强酸性阳离子交换树脂，温度35～40℃，进样量10L/h，树脂高度1m进行分离脱盐，经HPLC检测得低聚半乳糖含量为56.54％的糖溶液。此时糖组分为葡萄糖、半乳糖、乳糖、低聚半乳糖。

参数为：树脂柱装填高度为0.65m，分配盘转速为3°/min，进料浓度62％，进料温度65℃，进料流速1.6L/h，进水流速2.6L/h，流出液流速1.7L/h，洗脱液流速2.2L/h可分离得到96.56％的高纯度低聚半乳糖产品。

表2 应用10床式模拟移动床色谱分离低聚半乳糖

实施例3

菌株BLB-21接入葡萄糖浓度为500g/L的种子液进行扩大培养。二级种子液(浓度：菌丝湿重0.56％)以10％(V/V)的量接入到40％乳糖溶液中发酵，调节pH5.5，35～40℃发酵20h。经超滤初步得到糖组分混合液，活性炭脱色后采用强酸性阳离子-弱碱性阴离子-强酸性阳离子交换树脂，温度45～50℃，进样量10L/h，树脂高度1m进行分离脱盐，经HPLC检测得低聚半乳糖含量为55.72％的糖溶液。此时糖组分为葡萄糖、半乳糖、乳糖、低聚半乳糖。

参数为：树脂柱装填高度为0.65m，分配盘转速为3°/min，进料浓度64％，进料温度67℃，进料流速1.8L/h，进水流速2.9L/h，流出液流速1.9L/h，洗脱液流速2.6L/h可分离得到96.07％的高纯度低聚半乳糖产品。

表3 应用10床式模拟移动床色谱分离低聚半乳糖

Claims

1.一种高纯度低聚半乳糖制备方法，其特征在于：以40％浓度乳糖溶液为原料，采用高产菌株米曲霉Aspeigillus oryzaeBLB-21直接发酵，发酵液经超滤、连续模拟移动床色谱分离等得到95％以上纯度低聚半乳糖产品。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：高纯度低聚半乳糖产品的分离纯化采用陶瓷膜过滤、离子交换、连续模拟移动床色谱分离(10床式回分法)。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：陶瓷膜超滤，可以去除菌体及其中酶、蛋白质和核酸等大分子物质，初步得到糖组分混合液。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于：糖组分混合液采用强酸性阳离子-弱碱性阴离子-强酸性阳离子交换树脂，温度30-50℃，进样量10L/h，树脂高度1m，进行分离脱盐，经HPLC分析检测可得低聚半乳糖含量为55％的糖溶液。此时，糖组分为葡萄糖、半乳糖、乳糖、低聚半乳糖。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于：连续模拟移动床色谱分离法(10柱床回分法)分离糖溶液，参数为：树脂柱装填高度为0.65m，分配盘转速为3°/min，进料浓度55-65％，进料温度60-70℃，进料流速1.2-1.8L/h，进水流速2-3L/h，流出液流速1.4-2.0L/h，洗脱液流速1.8-2.8L/h。可以得到低聚半乳糖纯度为95％以上的产品。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所得产品通过六效降膜式蒸发浓缩器得高纯度低聚半乳糖浆。

7.如对权利要求6所述的方法，其特征在于：高纯度低聚半乳糖浆采用压力式喷雾干燥塔干燥得高纯度低聚半乳糖固体。