CN105723216A - 低聚半乳糖的检测定量方法 - Google Patents

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Abstract

提供从含低聚半乳糖和糊精的试样中简单地以低成本分离4′-GL并对4′-GL和低聚半乳糖正确地进行定量的方法。该方法对含低聚半乳糖和糊精的试样中的低聚半乳糖进行检测定量，所述低聚半乳糖的检测定量方法的特征在于，使所述试样与衍生物化试剂反应，使试样中的糊精和低聚半乳糖衍生物化，接着通过使用C30反相色谱柱的高效液相色谱将该试样中的低聚半乳糖成分分离。

Description

低聚半乳糖的检测定量方法
技术领域
本发明涉及对含低聚半乳糖和糊精的试样中的低聚半乳糖进行检测定量的方法。
背景技术
低聚半乳糖是以半乳糖为主要成分的结合方式不同的寡糖的混合物，一般，通过在乳糖中进行基于β-半乳糖苷酶的转移反应而制造。作为低聚半乳糖的生理效果，被报道了使在肠道内生存的乳酸杆菌增加来调理肠内环境的效果、通过减少肠间膜脂肪而有助于预防生活习惯病等效果，作为特定保健用食品、各种功能性食品或者它们的原材料，从以前开始就被重视。在作为特定保健用食品等的成分使用低聚半乳糖的情况下，为了保证其品质、规格、对作为功能性成分的定量分析数据进行表示等，要求确立正确性高的定量法。
对饮食品中的低聚半乳糖进行定量的方法有如下方法：使β-半乳糖苷酶作用于低聚半乳糖，对由酶解产生的半乳糖进行定量，算出寡糖(非专利文献1)。但是，生成的半乳糖的检测需要使用安装有昂贵的脉冲型电化学检测器的阴离子交换高效液相色谱，有通用性低的问题。另外，在饮食品中含乳糖等营养成分的情况下，不能对由酶处理产生的半乳糖和从乳糖游离的半乳糖进行判断，结果是，低聚半乳糖的定量精度下降。
也存在如下方法：对低聚半乳糖中的特征性成分、例如4′-半乳糖基乳糖(4′-GL；Galβ1-4Galβ1-4Glc)进行定量，根据其量进行逆运算，算出低聚半乳糖的总量。该方法可判明使用的低聚半乳糖中的4′-GL的含量，在该含量稳定而没有批次差异等的情况下特别有效。作为对饮食品试样中的4′-GL进行定量的方法，以往主要使用如下方法：利用凝胶渗透色谱，根据分子的尺寸将饮食品中的其他成分和4′-GL分离。
但是，如上所述，低聚半乳糖大多使用营养成分丰富的饮食品、例如育儿用调制奶粉、发酵乳制品等作为功能性的原材料，在该饮食品中也大多含分子的大小与4′-GL同等的糖质源，所以在凝胶渗透色谱中不能将那些糖质源和4′-GL分离。例如，在想要用凝胶渗透色谱对含作为糊精所含的一种糖类的麦芽三塘的饮食品中的4′-GL进行分离和定量的情况下，因为麦芽三塘和4′-GL的分子大小相同，所以从柱洗脱后的两者的峰重合，因此给4′-GL的定量、即低聚半乳糖的定量带来障碍。
作为用反向色谱检测寡糖的方法，已知使用C8或者C18反相色谱柱的方法(专利文献1)。但是，在使用这些柱尝试进行饮食品中的低聚半乳糖的分离的情况下，不能将饮食品的其他成分和低聚半乳糖成分分离。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：特表2007-523352号公报
非专利文献
非专利文献1：JournalofAOACInternational，Volume85，Number2，March2002，pp.417-423(7)
发明内容
因此，本发明的目的在于：提供从含低聚半乳糖和糊精的试样中简单且低成本地分离4′-GL并对4′-GL和低聚半乳糖正确地进行定量的方法。
本发明人为了解决上述问题进行了锐意研究，结果发现：通过使含低聚半乳糖和糊精的试样与衍生物化试剂反应，使所述试样中的糊精和低聚半乳糖衍生物化，接着，提供于使用C30反相色谱柱的高效液相色谱，从而能将该试样中的低聚半乳糖成分充分分离，由此完成了本发明。
即，本发明提供低聚半乳糖的检测定量方法，其对含低聚半乳糖和糊精的试样中的低聚半乳糖进行检测定量，所述低聚半乳糖的检测定量方法的特征在于，使所述试样与衍生物化试剂反应，使试样中的糊精和低聚半乳糖衍生物化，接着通过使用C30反相色谱柱的高效液相色谱将该试样中的低聚半乳糖成分分离。
根据本发明的检测定量方法，能简单地以低成本将试样中的低聚半乳糖和其他成分分离，能正确地进行低聚半乳糖的定量。通过使用本发明的方法对饮食品等的低聚半乳糖进行检测定量，能对该饮食品等所含的低聚半乳糖的量正确地进行管理，能保证品质，并且能正确地进行各种有效性试验数据的取得、表示等。
附图说明
图1是使用凝胶渗透柱的HPLC的色谱图。
图2是PMP衍生物反相HPLC色谱图(C30)。
图3是PMP衍生物-反相HPLC色谱图(C18反相柱)。
图4是PMP衍生物-反相HPLC色谱图(C8反相柱)。
图5是PMP衍生物反相HPLC色谱图(C30)，磷酸钾缓冲液(pH4)/CH3CN(78/22)。
图6是PMP衍生物反相HPLC色谱图(C30)，磷酸钾缓冲液(pH5)/CH3CN(79/21)。
图7是PMP衍生物反相HPLC色谱图(C30)，磷酸钾缓冲液(pH7)/CH3CN(81/19)。
图8是PMP衍生物反相HPLC色谱图(C30)，磷酸钾缓冲液(pH7)/CH3CN(82/18)。
图9是PMP衍生物反相HPLC色谱图(C30)，磷酸钾缓冲液(pH8)/CH3CN(82/18)。
图10是PMP衍生物反相HPLC色谱图(C30)，磷酸钾缓冲液(pH8)/CH3CN(83/17)。
图11是PMP衍生物反相HPLC色谱图(C30)。
具体实施方式
本发明的检测定量方法是如下方法：在使饮食品等试样中所含的低聚半乳糖衍生物化的基础上提供于使用C30反相色谱柱的高效液相色谱(HPLC)，对试样中的其他成分和低聚半乳糖进行分离和定量。低聚半乳糖用通式：Gal-(Gal)n-Glc(其中，式中Gal是半乳糖残基，Glc是葡萄糖残基，n是0～4的整数)表示，是在分子内含一分子以上半乳糖的2～6糖的混合物。其中，乳糖不含于低聚半乳糖中。
低聚半乳糖的主要成分是在乳糖的非还原末端键合有1个半乳糖的3糖的4′-半乳糖基乳糖(4′-GL)。作为其他的具体成分，可列举Galβ1-3Glc、Galβ1-2Glc、Galβ1-6Glc、Galβ1-6Galβ1-4Glc、Galβ1-6Galβ1-4Galβ1-4Glc、Galβ1-4Galβ1-4Galβ1-4Glc等。在本发明的检测定量方法中，可以将低聚半乳糖作为混合物对其进行检测定量，也可以对各个低聚半乳糖成分进行检测定量，但是从定量的精度的方面出发，优选在以4′-GL为对象将其分离后进行检测定量，根据其量进行逆运算，算出低聚半乳糖的总量。
低聚半乳糖以任何方法得到均可，例如，能使用以乳糖为原料，通过基于乳糖分解酶(β-半乳糖苷酶)的转移反应而制成的低聚半乳糖。也可以在转移反应中，使产生酶的微生物作用于原料。作为含乳糖的原料，例如可列举市售的乳糖、乳汁、奶粉、干酪乳清等。使用的酶只要是能得到低聚半乳糖的酶就没有特别限定，例如可列举使原料中的乳糖水解，使通过分解产生的半乳糖转移到乳糖或葡萄糖的酶，具体地可列举β-半乳糖苷酶、α-半乳糖苷酶。这些酶能单独使用或者组合2种以上使用。酶处理条件没有特别限定，一般原料浓度是10～70％，pH是3～8，酶浓度是0.01～100units/ml，温度是20～70℃，反应时间是2小时～3天较合适。另外，也能使用市售的低聚半乳糖液糖，例如能列举OLIGOMATE55N(オリゴメイト55N)(日本养乐多药品工业株式会社)。另外，也能使用从含低聚半乳糖的天然物中利用通用方法进行离析、精制而得到的低聚半乳糖。含低聚半乳糖的天然物的种类没有任何限定，可列举例如哺乳动物的乳汁。
在本发明中，成为低聚半乳糖的检测定量的对象的试样只要含低聚半乳糖和糊精就没有特别限制，可列举特定保健用食品、功能性食品、健康食品、营养补充食品、婴儿用、幼儿用、孕产妇用、病人用的特殊用途食品、吞咽困难者用食品、育儿用调制奶粉等饮食品、它们的原材料、或者医药品等。其中，在含糖质成分较多的育儿用调制奶粉应用本发明的方法的情况下，能高精度地进行低聚半乳糖的检测定量，因此优选。所谓糊精是3分子以上的葡萄糖聚合的物质的统称。另外，作为糊精的一种有麦芽糊精，所谓麦芽糊精是D-葡萄糖利用α-1,4键而聚合的聚合物，葡萄糖当量不足20，通过淀粉水解而得到。
麦芽糊精含由3分子的葡萄糖构成的麦芽三塘、4分子的葡萄糖聚合的4糖、或者其以上的葡萄糖聚合的多聚糖类。麦芽三塘是3分子的葡萄糖聚合的物质，分子量和分子尺寸与4′-GL相同，一部分羟基的立体结构不同。在饮食品等试样中存在与这样的4′-GL相同大小的分子的情况下，在凝胶渗透色谱等的现有方法中，将4′-GL和麦芽三塘等分离，不能对低聚半乳糖进行定量，但是根据本发明的方法，能将两者充分地分离。所谓葡萄糖当量是将试样中的还原糖表示为葡萄糖并作为相对于固体成分的百分率求出的值。葡萄糖当量最大为100，是指全部固体成分是葡萄糖。葡萄糖当量是表示从淀粉的水解率的指标，葡萄糖当量小、即水解率小的糊精较多地含多聚糖成分。另一方面，葡萄糖当量大、即水解率大的糊精较多地含寡糖类。
在本发明的检测定量方法中，首先使衍生物化试剂与试样反应，使试样中的糖质衍生物化。衍生物化试剂只要能使低聚半乳糖衍生物化就没有特别限制，例如可列举能进行紫外、可见吸收或者荧光检测的疏水性的衍生物，具体地，可列举1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、2-氨基吡啶、2-氨基苯甲酰胺、3-胺醌、4-氨基苯甲酸乙酯、4-氨基苯甲酸丁酯、4-三甲基氨基苯胺(4-トリメチルアンモニウムアニリン)，能使用选自这些的1种。其中，为了充分地进行低聚半乳糖成分的分离，优选使用PMP。
衍生物化如果是例如基于PMP的衍生物化，则通过在试样中添加0.5M的PMP的甲醇溶液和0.6M的NaOH溶液，在70℃下使其反应30分钟，在反应液中添加0.1M盐酸和三氯甲烷，在搅拌后将下层的三氯甲烷除去，能进行衍生物化。虽然低聚半乳糖等糖质是亲水性，但是由于用被疏水性的衍生物化试剂使其衍生物化，从而该衍生物化部分成为疏水性，因此在用于固定相含烷基的高效液相色谱柱的情况下，与亲水性的成分相比，能长时间保持于柱内。
衍生物化处理后的试样提供于高效液相色谱，将试样中的低聚半乳糖成分分离。在本发明中，用于高效液相色谱的柱使用C30反相色谱柱、即固定相含碳数为30的烷基(三十烷基)的柱。这是因为，为了将试样中的低聚半乳糖充分地分离，需要使用碳数为30的柱。更具体地，可列举DevelosilRPAQUEOUS(野村化学株式会社)、DevelosilC30-UG(野村化学株式会社)、InertosilC30S-Select(GLSciencesInc.)。在这些中，从低聚半乳糖的分离能力的方面出发，优选具备具有顺式的烷基的固定相，该固定相具有双键，具体地，优选DevelosilRPAQUEOUS(野村化学株式会社)。认为C30反相色谱柱适于低聚半乳糖成分的分离的理由是，烷基的长度及其立体结构有助于低聚半乳糖和麦芽三塘等的保持时间的变化。
高效液相色谱的流动相中使用的洗脱液只要不对柱、装置给予不良影响，就能没有特别限制地使用，例如能列举仅由水构成的洗脱液、仅由缓冲液构成的洗脱液、水、或者缓冲液和极性有机溶剂的混合液，特别是优选使用缓冲液和极性有机溶剂的混合液。缓冲液和极性有机溶剂的混合比(vol/vol，以下将所有的混合比的单位设为vol/vol)没有特别限定，但是优选缓冲液/极性有机溶剂＝79/21～80/20。这是因为，通过使用这些洗脱液，可充分地进行低聚半乳糖的分离，可得到良好的色谱图。另外，根据同样的理由，缓冲液的pH优选pH4～8，特别是优选pH5～6。
另外，作为缓冲液，优选使用混合液，该混合液包含选自磷酸钾缓冲液、柠檬酸钾缓冲液、甲酸铵缓冲液以及醋酸钾缓冲液中的至少1种和选自作为极性有机溶剂的乙腈、甲醇、乙醇、丙醇以及丁醇中的至少1种，特别是，作为缓冲液优选使用磷酸钾缓冲液和乙腈的混合液，磷酸钾缓冲液的pH优选为5～6，磷酸钾缓冲液和乙腈的混合比优选为磷酸钾缓冲液/乙腈＝79/21～80/20。
高效液相色谱能使用市售的HPLC装置进行，柱的平衡化、流速等诸条件只要基于试样的容量等适当设定即可。在进行了高效液相色谱后，所得到的级分能使用各种检测器进行检测定量。例如能使用紫外吸光度检测器、可见吸光度检测器等吸光度检测器、各种旋光度检测器、荧光检测器等。在本发明中，如果使用紫外吸光度检测器，则简便且定量的精度也高。
作为试样中的低聚半乳糖的检测定量方法，例如可列举下面的方法。首先，在含4′-GL含量已判明的低聚半乳糖的试样中添加水等溶剂使其溶解后，添加适量内标物质，调制试样溶液。另外，将相同的低聚半乳糖和内标物质溶解于水等，调制标准试验液。标准试验液分级稀释，准备例如稀释了10、20、40倍的液体。接着，用PMP等衍生物化试剂使试样溶液和标准试验液衍生物化。衍生物化后的试样溶液和标准试验液分别提供于高效液相色谱，利用检测器得到色谱图。高效液相色谱的条件如上述所示。
根据所得到的标准试验液的结果制作标准曲线。关于分级稀释的各标准试验液，以低聚半乳糖的含量为横轴，以4′-GL和内标物质的面积比为纵轴，利用最小二乘法求出标准曲线，能得到下式(标准曲线)。
面积比(y)＝常数(a)×低聚半乳糖含量(x)
接着，根据试样溶液的结果算出4′-GL和内标物质的面积比，将该面积比代入上述的标准曲线，由此能算出试样中的低聚半乳糖含量。按照前处理阶段的试样的稀释率等，适当地对算出结果进行补充的计算，由此可定量出正确的低聚半乳糖含量。
以下列举实施例进一步详细说明本发明的内容，但是本发明并不限于此。
实施例
比较例1：使用凝胶渗透色谱的4′-GL的定量
(1)试样溶液的调制
称量以低聚半乳糖含量为2.3g/100g的比例含低聚半乳糖液糖(OLIGOMATE55N(オリゴメイト55N)：日本益力多药品工业株式会社)、以1.5g/100g的比例含麦芽糊精的育儿用调制奶粉2.6g，添加少量的温水使其溶解后，放置到变成室温为止，添加蒸馏水制成20ml，制作出溶解奶。将溶解奶4ml装入量瓶，正确地添加含0.1％内标物质的水溶液2ml，用蒸馏水制成20ml，形成为试样溶液(奶粉101(添加GOS))。每20ml溶解奶的低聚半乳糖含量是2.6g×2.3/100＝0.0598g，所以每100ml为0.299g。
此外，育儿用调制奶粉含作为原材料的乳糖、乳清蛋白消化物、棕榈油、全脂奶粉、棕榈仁油分级油、大豆白绞油、低聚半乳糖液糖、酪蛋白钙、麦芽糊精(淀粉糖化物)、精制鱼油、碳酸钙、氯化镁、卵磷脂、磷酸K、氯化钾、磷酸钠、氢氧化钾、乳铁蛋白、V.C、氯化钙、焦磷酸铁、牛磺酸、V.E、硫酸锌、胱氨酸、胞苷酸钠、烟酸、泛酸钙、V.A、硫酸铜、肌苷酸钠、尿苷酸钠、鸟苷酸钠、V.B1、5’-AMP、V.B6、V.B2、叶酸、胡萝卜素、V.D、V.B12，其营养成分如表1所示。表1的碳水化合物含乳糖、低聚半乳糖、糊精、单糖。
表1
育儿用调制奶粉的营养成分(每100g)
(2)安慰剂试样溶液的调制
作为不含低聚半乳糖的育儿用调制奶粉，进行与奶粉101(添加GOS)同样的调制步骤，调制了安慰剂试样溶液(奶粉102(安慰剂))。调制使用的育儿用调制奶粉除了不含低聚半乳糖液糖，以6.2g/100g的比例含麦芽糊精以外，原材料的组成与制作试样溶液(奶粉101(添加GOS))的育儿用调制奶粉相同。奶粉101(添加GOS)含来自低聚半乳糖液糖的乳糖、低聚半乳糖、单糖，合计含4.7g/100g，奶粉101(添加GOS)和奶粉102(安慰剂)的碳水化合物量相同。
(3)低聚半乳糖标准试验液的调制
将低聚半乳糖液糖(OLIGOMATE55N(オリゴメイト55N)：日本养乐多药品工业株式会社)50ml量取到容量瓶中，使得作为低聚半乳糖液糖成为2.0g/100ml，正确地添加含有1％内标物质的水溶液1ml，添加蒸馏水制成50ml，制成标准试验液(OM55N)。
(4)麦芽糊精标准试验液的调制
在容量瓶中量取制造所述育儿用调制奶粉使用的麦芽糊精液糖(高麦芽糖浆)50ml，使得麦芽糊精溶液成为2.0g/100ml，正确地添加含有1％内标物质的水溶液1ml，添加蒸馏水制成50ml，制成标准试验液(麦芽糊精)。
(5)过滤器处理
将试验溶液、安慰剂试验溶液、低聚半乳糖标准试验液以及麦芽糊精标准试验液用0.45μm过滤器过滤，用以下HPLC条件分析。
(6)HPLC分析
柱(Column)：GPC(KS-802)(8.0×300mm)
洗脱液(Eluent)：蒸馏水
流速(Flowrate)：0.5ml/min
检测(Detection)：RI检测器(ShodexSE-201)
柱温度(Columntemp)：80℃
其结果是，如图1所示，麦芽糊精所含的3糖(麦芽三塘：Mal-3)和标准试验液(OM55N)所含的3糖的4′-GL在相同的保持时间从柱洗脱，在凝胶渗透色谱中，麦芽糊精中的麦芽三塘和低聚半乳糖中的4′-GL的峰重叠，不能对4′-GL进行定量。
实施例1：使用C30柱的PMP衍生物―HPLC反相色谱图
与比较例1同样地调制出育儿用调制奶粉的试样溶液、安慰剂试样溶液、低聚半乳糖标准试验液、麦芽糊精标准试验液。将低聚半乳糖标准试验液进一步制成用蒸馏水稀释了10、20、40倍的稀释液。稀释液的低聚半乳糖液糖的浓度分别为0.2g/100ml、0.1g/100ml、0.05g/100ml。
(1)PMP衍生物化
在螺纹口试验管中取试样溶液、低聚半乳糖标准试验液、麦芽糊精标准试验液各100μl，添加0.6M的NaOH水溶液100μl进行搅拌。接着，添加0.5M的PMP甲醇溶液200μl进行搅拌。用70℃加热30分进行PMP衍生物化。在冷却到室温后，添加0.1M的HCl水溶液0.7ml形成弱酸性，用三氯甲烷萃取，将过量的试剂除去。即，添加三氯甲烷约1ml，搅拌30秒以上，以2500rpm离心分离5分钟，将下层的三氯甲烷除去。重复2次同样的操作。将水层用0.45μm过滤器过滤，用以下HPLC条件分析。
(2)HPLC分析条件
柱(Column)：DevelosilRPAQUEOUS(4.6×250mm)(C30)
洗脱液(Eluent)：磷酸钾缓冲液(pH6)/CH3CN(80/20)
流速(Flowrate)：1.0ml/min
检测(Detection)：UV245nm
柱温度(Columntemp)：35℃
其结果是，如图2的虚线所示，在试样溶液(奶粉101)中检测出的4′-GL的峰在安慰剂试样溶液(奶粉102)中没有检测出，在用PMP衍生物化后，提供于使用C30反相色谱柱的高效液相色谱，由此可确认出能将4′-GL和麦芽三塘分离。
(3)低聚半乳糖含量的算出
关于由低聚半乳糖标准试验液制作的稀释液，用与上述同样的分析条件提供于HPLC，使用内标物质和4′-GL的面积比制作低聚半乳糖液糖的标准曲线。HPLC分析的结果如表2所示。
表2
低聚半乳糖标准试验液中的内标物质和4′-GL的面积比
当将低聚半乳糖液糖的含量设为x，将面积比设为y，利用最小二乘法求出标准曲线时，标准曲线是y＝3.9909x。作为该标准曲线的y，代入试样溶液中的内标物质和4′-GL的面积比(0.5526)，考虑到试样溶液的稀释率等，算出试样中的低聚半乳糖量(表3)。具体地，当将y＝0.5526代入标准曲线y＝3.9909x时，x(试样溶液中的低聚半乳糖液糖浓度)成为0.138(g/100ml)。试样溶液是将溶解奶稀释了5倍的液体，所以溶解奶中的低聚半乳糖液糖量成为0.138×5＝0.690(g/100ml)。液糖中的固体成分含量是75％，固体成分中的低聚半乳糖含量是56.4％，所以溶解奶中的低聚半乳糖含量成为0.690×0.75×0.564＝0.292(g/100ml)。溶解奶中的育儿用调制奶粉的浓度是2.6g/20ml，所以在溶解奶100ml中含13g育儿用调制奶粉，其中，含0.292g/100ml的低聚半乳糖，所以可算出每100g育儿奶粉含2.25g/100g的低聚半乳糖，与低聚半乳糖的配合量(2.3g/100g)大致一致。
表3
使用标准曲线算出的低聚半乳糖液糖的含量
比较例2：使用C8、C18柱的PMP衍生物-反相HPLC色谱图
称量以低聚半乳糖含量为2.3g/100g的比例含低聚半乳糖液糖(OLIGOMATE55N(オリゴメイト55N)：日本养乐多药品工业株式会社)、以1.5g/100g的比例含麦芽糊精的育儿用调制奶粉5g，添加少量的温水使其溶解后放置到变成室温为止。正确地添加含有1％内标物质的水溶液1ml，添加蒸馏水制成50ml，形成为试样溶液(奶粉101(添加GOS))。
另外，作为不含低聚半乳糖的育儿用调制奶粉，进行与奶粉101(添加GOS)同样的调制步骤，调制出安慰剂试样溶液(奶粉102(安慰剂))。调制使用的育儿用调制奶粉除了不含低聚半乳糖，以6.2g/100g的比例含麦芽糊精以外，原材料的组成与制作试样溶液(奶粉101(添加GOS))的育儿用调制奶粉相同。
在容量瓶中量取低聚半乳糖液糖50ml，使得低聚半乳糖成为3.0g/100ml，正确地添加含有1％内标物质的水溶液1ml，添加蒸馏水制成50ml，形成为低聚半乳糖标准试验液。
在容量瓶中量取制造所述育儿用调制奶粉使用的麦芽糊精液糖(高麦芽糖浆)50ml，使得麦芽糊精溶液成为2.0g/100ml，正确地添加含有1％内标物质的水溶液1ml，添加蒸馏水制成50ml，形成为标准试验液(麦芽糊精)。
PMP衍生物化
在螺纹口试验管中取试样溶液、低聚半乳糖标准试验液、麦芽糊精标准试验液各100μl，添加0.6M的NaOH水溶液100μl进行搅拌。接着，添加0.5M的PMP甲醇溶液200μl进行搅拌。用70℃加热30分，进行PMP衍生物化。在冷却到室温后，添加0.1M的HCl水溶液0.7ml形成弱酸性，用三氯甲烷萃取，将过量的试剂除去。即，添加三氯甲烷约1ml，搅拌30秒以上，以2500rpm离心分离5分钟，将下层的三氯甲烷除去。重复2次同样的操作。将水层用0.45μm的过滤器过滤，用下述的2个HPLC条件分析。
HPLC分析条件
(1)使用C18柱的HPLC
柱(Column)：InertosilODS-3(4.6×250mm)(C18反相柱)
洗脱液(Eluent)：磷酸钾缓冲液(pH6)/CH3CN(80/20)
流速(Flowrate)：1.0ml/min
检测(Detection)：UV245nm
柱温度(Columntemp)：35℃
(2)使用C8柱的HPLC
柱(Column)：ImtaktUK-8(4.6×150mm)(C8反相柱)
洗脱液(Eluent)：磷酸钾缓冲液(pH6)/CH3CN(80/20)
流速(Flowrate)：1.0ml/min
检测(Detection)：UV245nm
柱温度(Columntemp)：35℃
其结果是，在C18反相色谱柱中，虽然4′-GL和麦芽三塘(Mal―3)分离，但是4′-GL和其他的低聚半乳糖成分的峰重叠，不能分离4′-GL。即，如图3所示，在低聚半乳糖标准试验液(OM55N)和试样溶液(奶粉101)的结果中，在4′-GL的峰处，在顶点部的左侧重叠有别的物质的峰，形成段。
在使用C8反相色谱柱的情况下，虽然4′-GL和麦芽三塘(Mal―3)分离，但是4′-GL和其他的低聚半乳糖成分的峰重叠，可知不能分离(图4)。即，与使用C30反相色谱柱的情况(图2)比较时，在图2中，在4′-GL的与其相邻的左侧有其他的低聚半乳糖成分的峰，与此相对，在图4中，该峰与4′-GL的峰重叠，结果是峰变高。由这样的结果示出：无论在使用C8、C18柱的中的哪个的情况下，都不能对4′-GL进行分离定量。
实施例2：HPLC中的洗脱液的讨论
与比较例2同样，调制试样溶液(奶粉101(添加GOS)、奶粉102(安慰剂))、低聚半乳糖标准试验液以及麦芽糊精标准试验液，与比较例2同样地使各自PMP衍生物化，用以下6种HPLC条件分析。
(1)缓冲液pH4的条件下的HPLC
柱(Column)：DevelosilRPAQUEOUS(4.6×250mm)
洗脱液(Eluent)：磷酸钾缓冲液(pH4)/CH3CN(78/22)
流速(Flowrate)：1.0ml/min
检测(Detection)：UV245nm
柱温度(Columntemp)：35℃
(2)缓冲液pH5的条件下的HPLC
柱(Column)：DevelosilRPAQUEOUS(4.6×250mm)
洗脱液(Eluent)：磷酸钾缓冲液(pH5)/CH3CN(79/21)
流速(Flowrate)：1.0ml/min
检测(Detection)：UV245nm
柱温度(Columntemp)：35℃
(3)缓冲液pH7的条件下的HPLC
柱(Column)：DevelosilRPAQUEOUS(4.6×250mm)
洗脱液(Eluent)：磷酸钾缓冲液(pH7)/CH3CN(81/19)
流速(Flowrate)：1.0ml/min
检测(Detection)：UV245nm
柱温度(Columntemp)：35℃
(4)缓冲液pH7的条件下的HPLC
柱(Column)：DevelosilRPAQUEOUS(4.6×250mm)
洗脱液(Eluent)：磷酸钾缓冲液(pH7)/CH3CN(82/18)
流速(Flowrate)：1.0ml/min
检测(Detection)：UV245nm
柱温度(Columntemp)：35℃
(5)缓冲液pH8的条件下的HPLC
柱(Column)：DevelosilRPAQUEOUS(4.6×250mm)
洗脱液(Eluent)：磷酸钾缓冲液(pH8)/CH3CN(82/18)
流速(Flowrate)：1.0ml/min
检测(Detection)：UV245nm
柱温度(Columntemp)：35℃
(6)缓冲液pH8的条件下的HPLC
柱(Column)：DevelosilRPAQUEOUS(4.6×250mm)
洗脱液(Eluent)：磷酸钾缓冲液(pH8)/CH3CN(83/17)
流速(Flowrate)：1.0ml/min
检测(Detection)：UV245nm
柱温度(Columntemp)：35℃
根据实施例1的结果，在使用pH6的磷酸钾缓冲液的情况下，4′-GL能分离，能进行低聚半乳糖的定量。与此相对，如图5、7～10所示，在使用pH4、7、8的磷酸钾缓冲液的情况下，4′-GL和其他的低聚半乳糖成分的峰重叠，不能对4′-GL进行分离定量。即，在图2中，在4′-GL的与其相邻的左侧有其他的低聚半乳糖成分的峰，与此相对，在使用pH4的磷酸钾缓冲液的情况下，在OM55N的色谱图中，该峰是1个，不能分离4′-GL(图5)。
另外，在使用将磷酸钾缓冲液(pH7)和CH3CN设为81/19的比例的洗脱液的情况下(图7)，在OM55N的色谱图中，在4′-GL的峰的顶点部的右侧重叠有其他的低聚半乳糖成分的峰，结果是，4′-GL的峰的面积变大。
在使用将磷酸钾缓冲液(pH7)和CH3CN设为82/18的比例的洗脱液的情况下(图8)，在OM55N的色谱图中，原来在4′-GL的与其相邻的左侧检测出的峰消失，该峰和4′-GL的峰重叠。
在使用将磷酸钾缓冲液(pH8)和CH3CN设为82/18的比例的洗脱液的情况下(图9)，或者在使用设为83：17的比例的洗脱液的情况下(图10)，当比较OM55N和麦芽糊精的色谱图时，4′-GL能与麦芽三塘、其他的寡糖成分分离，但是当比较OM55N和安慰剂试样溶液(奶粉102)的色谱图时，4′-GL的峰和奶粉102所含的成分的峰一致，可知仅能分离4′-GL。
另一方面，在使用将磷酸钾缓冲液(pH5)和CH3CN设为79/21的比例的洗脱液的情况下(图6)，4′-GL能与麦芽三塘和其他的低聚半乳糖成分分离。
实施例3：将营养食品设为试样的情况下的PMP衍生物-反相HPLC色谱图(C30)
将表4所示的原材料混合，调制营养食品。在10g该营养食品中添加蒸馏水制成50ml后，用20000g×30分进行离心分离，进一步以20000g×30分进行离心分离。在离心分离后，营养食品分离为下层、中间层、上层这3层。分离该中间层，将该分离的试样用0.45μm的过滤器过滤。另一方面，使用OLIGOMATE55(オリゴメイト55)(日本养乐多药品工业株式会社)，与比较例1同样地调制作为标准试样的低聚半乳糖标准试验液。在螺纹口试验管中取过滤的试样和低聚半乳糖标准试验液各100μl，进行减压干固。添加含0.02％内标物质的水溶液100μl，添加0.5M的PMP甲醇溶液200μl进行搅拌。接着，用70℃加热30分，进行PMP衍生物化，用以下的HPLC条件进行分析。
表4
营养食品的组成
HPLC分析条件
柱(Column)：反相色谱柱(DevelosilRPAQUEOUS)(4.6×250mm)
洗脱液(Eluent)：磷酸钾缓冲液(pH6)/CH3CN(80/20)
流速(Flowrate)：1.0ml/min
检测(Detection)：UV245nm
柱温度(Columntemp)：35℃
其结果是，如图11所示，4′-GL的峰在保持时间24.324分出现，可判明从样品所含的其他成分中分离。此外，4′-GL的峰在保持时间24.324分出现，用相同的HPLC分析条件分析低聚半乳糖标准试验液，完成确认。
工业上的可利用性
根据本发明的检测定量方法，能简单地以低成本将试样中的低聚半乳糖和其他成分分离，能正确地进行低聚半乳糖的定量，所以能正确地管理该试样中所含的低聚半乳糖的量，并且能正确地进行各种有效性试验数据的取得、表示等。

Claims (9)

1.一种低聚半乳糖的检测定量方法，其对含低聚半乳糖和糊精的试样中的低聚半乳糖进行检测定量，所述低聚半乳糖的检测定量方法的特征在于，使所述试样与衍生物化试剂反应，使试样中的糊精和低聚半乳糖衍生物化，接着通过使用C30反相色谱柱的高效液相色谱将该试样中的低聚半乳糖成分分离。
2.根据权利要求1所述的低聚半乳糖的检测定量方法，其特征在于，作为在高效液相色谱中使用的洗脱液，使用缓冲液和极性有机溶剂的混合液。
3.根据权利要求2所述的低聚半乳糖的检测定量方法，其特征在于，作为所述缓冲液使用Ph5～6的缓冲液。
4.根据权利要求2或3所述的低聚半乳糖的检测定量方法，其特征在于，所述混合液的缓冲液和极性有机溶剂的混合比(vol/vol)是缓冲液/极性有机溶剂＝79/21～80/20。
5.根据权利要求2～4中的任一项所述的低聚半乳糖的检测定量方法，其特征在于，作为调制所述混合液使用的缓冲液，使用选自磷酸钾缓冲液、柠檬酸钾缓冲液、甲酸铵缓冲液以及醋酸钾缓冲液中的至少1种，作为极性有机溶剂，使用选自乙腈、甲醇、乙醇、丙醇以及丁醇中的至少1种。。
6.根据权利要求1～5中的任一项所述的低聚半乳糖的检测定量方法，含低聚半乳糖和糊精的试样是饮食品。
7.根据权利要求1～6中的任一项所述的低聚半乳糖的检测定量方法，其特征在于，被分离的低聚半乳糖成分是4′-半乳糖基乳糖。
8.根据权利要求1～7中的任一项所述的低聚半乳糖的检测定量方法，其特征在于，作为衍生物化试剂，使用选自1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮、2-氨基吡啶、2-氨基苯甲酰胺、3-胺醌、4-氨基苯甲酸乙酯、4-氨基苯甲酸丁酯、4-三甲基氨基苯胺中的1种。
9.根据权利要求1～8中的任一项所述的低聚半乳糖的检测定量方法，其特征在于，C30反相色谱柱具备具有顺式的烷基的固定相，所述顺式的烷基具有双键。
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