CN115144494B - 一种哺乳动物乳中低聚糖的检测方法 - Google Patents

一种哺乳动物乳中低聚糖的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明是一种哺乳动物乳中低聚糖的检测方法，该方法包括如下步骤：(1)将2‑5mL乳去除上层脂肪；(2)取(1)中下清液进一步去除脂肪；(3)取(2)中上清液，加入2‑4倍体积乙醇，混合均匀，去除蛋白质；(4)收集(3)中上清液，蒸发去除乙醇，将得到的混合溶液冻干；(5)将冻干固体溶于去离子水中，与NaBH4混合均匀，反应2h；(6)反应后的混合溶液用石墨化碳固相萃取小柱纯化，得到还原后的低聚糖固体；(7)将(6)中得到的低聚糖固体重新溶于超纯水中，上样HPLC‑QqQ‑MS进行分析。本发明采用HPLC‑QqQ‑MS联用，对不同哺乳动物乳中的低聚糖进行测定，简化了前处理以及分析过程，克服现有处理及分析过程步骤繁琐的缺陷。

Description

一种哺乳动物乳中低聚糖的检测方法
技术领域
本发明涉及低聚糖检测的领域，特别涉及一种哺乳动物乳中低聚糖的检测方法。
背景技术
低聚糖是哺乳动物乳中重要的一类生物活性成分，具有维持肠道微生态平衡、调节机体免疫、抵御致病菌感染等功能。不同哺乳动物来源的低聚糖均显示出潜在的生物活性价值，可作为食品组分添加到医疗或功能性食品中。哺乳动物乳是自然界低聚糖的主要来源，因此对哺乳动物乳中的低聚糖进行检测，是大规模提取低聚糖进而开发新型医疗或功能性食品的必要前提。
目前对母乳中低聚糖的检测报道较多，测定方法主要有液质联用(Porfirio etal.,2020)、高效阴离子交换色谱(Landberg,Lundblad,&1998)、高效液相色谱(McGuire et al.,2017)。其中液质联用使用不同离子源或分离技术与飞行时间质谱(TOF-MS)结合是目前检测到乳中低聚糖种类最多的一种检测技术，可定性检测多达200多种母乳中的低聚糖(Wu,Grimm,German,&Lebrilla,2011；Wu,Tao,German,Grimm,&Lebrilla,2010)。基质辅助激光解吸(MALDI)离子源与TOF-MS联用是目前最常用的母乳低聚糖测定法。
专利申请202011360676.3公开的一种乳中母乳低聚糖的检测方法，包括如下步骤：A)将乳样品采用沉淀剂沉淀蛋白，过滤，得到试样溶液；B)将试样溶液采用滤膜和净化柱净化处理，得到待测液；C)将待测液采用阴离子交换色谱进行测定，得到乳中母乳低聚糖的含量。
高效阴离子交换色谱和高效液相色谱法对低聚糖同分异构体检测效果较差，可测定的低聚糖范围较窄。TOF-MS尽管可检测到数量较多的低聚糖，但该技术的预处理通常需要采用不同前处理手段对乳中的中性和酸性低聚糖分别进行处理，分析过程中也需在不同的离子模式下对中性和酸性低聚糖分别进行检测，因此前处理及分析过程步骤繁琐。并且，TOF-MS无法对同分异构体进行区分(van Leeuwen,2019)，其对乳中低聚糖的检测还依赖于色谱分离技术，在同分异构体无法被完全分离的情况下不能进行准确定性及定量测定。同时，由于其他哺乳动物乳中低聚糖含量低于母乳中的含量，因此当下的报道中适用于检测母乳低聚糖的测定方法未必适用于检测其他哺乳动物乳中的低聚糖。目前未有涉及采用一种检测方法测定多种哺乳动物乳中低聚糖方法的报道。
发明内容
为解决上述问题，本发明的首要目的是提供一种哺乳动物乳中低聚糖的检测方法，该方法采用HPLC-QqQ-MS联用，对不同哺乳动物乳中的低聚糖进行测定，简化了前处理以及分析过程，克服现有处理及分析过程步骤繁琐的缺陷。
本发明的另一个目的是提供一种哺乳动物乳中低聚糖的检测方法，本发明的检测方法结果准确、稳定、可靠。
申请人研究发现，三重四极杆质谱QqQ-MS应用多反应监测技术MRM对目标物质进行确定，低聚糖的同分异构体在无法被完全分离的情况下也可以被QqQ-MS测定，并且QqQ-MS对低聚糖的检测只需在一种离子模式下进行，相比TOF-MS简化了前处理以及分析过程。同时，QqQ-MS具有较高分辨率及灵敏度，检测下限可达到ppb浓度水平，可适用于不同哺乳动物乳中低聚糖含量测定。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种哺乳动物乳中低聚糖的检测方法，包括前处理、液相HPLC及QqQ-MS操作步骤：
1将2-5mL乳在4℃下以4000-6000rpm的速度离心20-30min，去除上层脂肪；
2取1中下清液加入4-5倍体积Folch溶液，混合均匀，在4℃下以4000-6000rpm的速度离心20-30min，进一步去除脂肪；
3取2中上清液，加入2-4倍体积乙醇，混合均匀，于-80℃放置2-4h，在室温解冻后，于4℃下以4000-6000rpm的速度离心20-30min，去除蛋白质；
4收集3中上清液，在35-40℃下旋转蒸发去除乙醇，将得到的混合溶液冻干；
5将冻干固体溶于2-5mL去离子水中，取0.5-1mL水溶液与0.5-1mL 2M NaBH4混合均匀，置于65℃反应2h；
6反应后的混合溶液用石墨化碳固相萃取小柱纯化，在35-40℃下旋转蒸发去除乙醇，将得到的水溶液冻干，得到还原后的低聚糖固体。
7将6中得到的低聚糖固体重新溶于0.5-1mL超纯水中，用0.05M NaCl溶液稀释至2-5mL，加入0.2-0.5mL 2ppm的棉子糖作为内标，过0.22m滤膜后上样HPLC-QqQ-MS进行分析，其中，HPLC-QqQ-MS的色谱柱为多孔石墨碳柱。
进一步地，步骤6中，所述的反应后混合液纯化为采用石墨化碳固相萃取进行纯化，具体操作步骤为：
1石墨化碳固相萃取小柱经6mL超纯水洗涤后，用6mL含0.05％v/vTFA的乙腈溶液80％，v/v活化小柱，再经6mL超纯水洗涤，去除有机溶剂；
2将步骤5中反应后的混合溶液上样到1中活化并洗涤后的小柱中，用20mL超纯水洗涤去除盐分；
3用6mL 20％v/v乙腈溶液洗脱，收集洗脱液；
4用6mL含有0.05％v/vTFA的乙腈溶液20％，v/v洗脱，收集洗脱液。
进一步地，步骤7中，所述的HPLC-QqQ-MS分析为采用HPLC进行分离，具体参数为：
1采用Hypercarb色谱分离柱进行分离，柱温为40℃；
2采用流动相A与流动相B进行梯度洗脱，流动相A为含有0.1％v/v氨水的乙酸铵10mM溶液，流动相B为含有0.1％v/v氨水的乙腈；
3流动相A与流动相B的具体梯度洗脱为：
第0-3分钟，流动相A为99％，流动相B为1％，流速为0.10-0.15mL/min；第3-4分钟，流动相A为99-95％，流动相B为1-5％，流速为0.15mL/min；
第4-20分钟，流动相A为95-83％，流动相B为5-17％，流速为0.15mL/min；
第20-30分钟，流动相A为83-58％，流动相B为17-42％，流速为0.15mL/min；第30-35分钟，流动相A为58-10％，流动相B为42-90％，流速为0.15mL/min；第35-50分钟，流动相A为10％，流动相B为90％，流速为0.15mL/min；第50-51分钟，流动相A为10-99％，流动相B为90-1％，流速为0.15-0.10mL/min；第51-60分钟，流动相A为99％，流动相B为1％，流速为0.10mL/min。
进一步地，步骤7中，所述的HPLC-QqQ-MS分析为采用QqQ-MS作为检测器在正离子模式下进行检测分析，具体参数为：
2’-岩藻糖基乳糖2’FL，离子对为513.2→367.2、513.2→205.1，碰撞能量分别为30V、40V，裂解电压为190V；3-岩藻糖基乳糖3FL，离子对为513.2→367.2、513.2→205.1，碰撞能量分别为30V、40V，裂解电压为150V；二岩藻糖基乳糖DFL，离子对为659.2→513.2、659.2→367.2，碰撞能量分别为30V、50V，裂解电压为200V；3’-唾液酸乳糖3’SL，离子对为658.1→367.2、658.1→205.1，碰撞能量分别为25V、50V，裂解电压为150V；6’-唾液酸乳糖6’SL，离子对为658.1→367.2、658.1→205.1，碰撞能量分别为25V、50V，裂解电压为160V；乳糖-N-新四糖LNnT离子对为732.2→387.9、732.2→367.2，碰撞能量分别为50V、50V，裂解电压为200V；乳糖-N-新六糖LNnH离子对为1097.5→753.4、1097.5→406.2，碰撞能量分别为60V、90V，裂解电压为280V；乳糖-N-岩藻五糖ILNFP I离子对为878.4→367.2、878.4→732.2，碰撞能量分别为60V、50V，裂解电压为240V；乳糖-N-岩藻五糖IILNFP II离子对为878.4→367.2、878.4→732.2，碰撞能量分别为65V、50V，裂解电压为240V；乳糖-N-岩藻五糖IIILNFP III离子对为878.4→387.9、878.4→367.2，碰撞能量分别为65V、70V，裂解电压为250V；岩藻糖基-3’-O-唾液酸乳糖FSL，离子对为804.3→513.2、804.3→367.2，碰撞能量分别为30V、50V，裂解电压为200V；唾液酸乳糖-N-四糖aLST a，离子对为1023.3→732.2、1023.3→406.2，碰撞能量分别为30V、50V，裂解电压为200V；唾液酸乳糖-N-四糖cLST c，离子对为1023.3→732.2、1023.3→406.2，碰撞能量分别为35V、70V，裂解电压为210V；二唾液酸乳糖-N-四糖DSLNT，离子对为1314.5→732.2，碰撞能量分别为60V，裂解电压为250V。
与现有技术相比较，本发明的主要创新在于使用三重四极杆质谱QqQ-MS作为检测器，用以检测多种哺乳动物乳中的低聚糖。本发明所使用的色谱柱为多孔石墨碳柱Hypercarb，该石墨碳柱是一种超强性能的反相柱，对强极性的糖类物质和同分异构体都有很好的分离效果，那个对不同哺乳动物乳中的低聚糖进行测定，克服现有处理及分析过程步骤繁琐的缺陷。
同时，检测结果准确、稳定、可靠。
附图说明
图1是2’FL的QqQ-MS参数调试示意图，其中a为裂解电压调试示意图、b为子离子确认示意图、c为子离子m/z 367.2的碰撞能量调试示意图、d为多反应监测模式下确认最佳裂解电压和碰撞能量示意图。
图2是14种不同低聚糖的HPLC-QqQ-MS检测结果。
图3是以母乳待测样品为溶剂，溶解4种低聚糖标准品绘制的标准曲线。
图4是以牛乳待测样品为溶剂，溶解4种低聚糖标准品绘制的标准曲线。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
以下实施例中，所采用的试剂或者仪器等均能够通过商业途径购得。其中低聚糖标准品包括2’FL、3’SL、6’SL、LNnT和低聚糖参照品纯度低于80％，包括3FL、DFL、FSL、LNFPI、LNFP II、LNFP III、LST a、LST c、LNnH、DSLNT由Glycom丹麦埃斯比约市提供。
实施例1。
2’FL的检测方法。
将2’FL粉末溶于1mL去离子水中，配置浓度为2ppm的溶液。将2’FL溶液与1mL 2MNaBH4溶液混合均匀，置于65℃反应2h。反应后的混合溶液用石墨化碳固相萃取小柱纯化，纯化后于40℃下旋转蒸发去除乙醇，经冻干得到还原后的2’FL固体。冻干的固体重新溶于0.5mL超纯水中，用0.1M NaCl溶液稀释至1mL，过0.22m滤膜后得到2’FL待测样品。
取0.2mL待测样品上样HPLC-QqQ-MS进行QqQ-MS参数确认。根据2’FL与Na的分子量，在正离子模式下确定母离子质量与电荷比m/z为513.2。调试裂解电压140-300V，根据母离子信号的响应值，确定最佳裂解电压为190V，如图1a所示。在子离子扫描模式下，确定2个响应值最高的m/z作为子离子，分别为367.2和205.1，如图1b。调试碰撞能量20-90V，根据子离子信号的响应值，确定最佳碰撞能量分别为30V、40V，如图1c所示。在多反应监测模式下，对确定的最佳裂解电压及最佳碰撞能量进行再一次验证，如图1d所示。
取0.2mL待测样品进行HPLC-QqQ-MS分析。采用Hypercarb保护柱10×2.1mm,3m和Hypercarb色谱分离柱100×2.1mm,3m进行分离，柱温为40oC。使用流动相A与流动相B进行梯度洗脱，流动相A为含有0.1％v/v氨水的乙酸铵10mM溶液，流动相B为含有0.1％v/v氨水的乙腈。梯度洗脱为第0-3分钟，流动相A为99％，流动相B为1％，流速为0.10-0.15mL/min；第3-4分钟，流动相A为99-95％，流动相B为1-5％，流速为0.15mL/min；第4-20分钟，流动相A为95-83％，流动相B为5-17％，流速为0.15mL/min；第20-30分钟，流动相A为83-58％，流动相B为17-42％，流速为0.15mL/min；第30-35分钟，流动相A为58-10％，流动相B为42-90％，流速为0.15mL/min；第35-50分钟，流动相A为10％，流动相B为90％，流速为0.15mL/min；第50-51分钟，流动相A为10-99％，流动相B为90-1％，流速为0.15-0.10mL/min；第51-60分钟，流动相A为99％，流动相B为1％，流速为0.10mL/min。根据2’FL离子对513.2→367.2及513.2→205.1信号，确定2’FL保留时间为15.806min，如图2所示。
实施例2。
3FL的检测方法。
本实施例中检测对象为3FL，其他实施方式与实施例1相同。3FL离子对为513.2→367.2、513.2→205.1，最佳裂解电压为150V，最佳碰撞能量分别为30V、40V，保留时间为8.449min，如图2所示。
实施例3。
3’SL的检测方法。
本实施例中检测对象为3’SL，其他实施方式与实施例1相同。3’SL离子对为658.1→367.2、658.1→205.1，最佳裂解电压为150V，最佳碰撞能量分别为25V、50V，保留时间为15.052min，如图2所示。
实施例4。
6’SL的检测方法。
本实施例中检测对象为6’SL，其他实施方式与实施例1相同。6’SL离子对为658.1→367.2、658.1→205.1，最佳裂解电压为160V，最佳碰撞能量分别为25V、50V，保留时间为9.468min，如图2所示。
实施例5。
DFL的检测方法。
本实施例中检测对象为DFL，其他实施方式与实施例1相同。DFL离子对为659.2→513.2、659.2→367.2，最佳裂解电压为200V，最佳碰撞能量分别为30V、50V，保留时间为18.558min，如图2所示。
实施例6。
LNnT的检测方法。
本实施例中检测对象为LNnT，其他实施方式与实施例1相同。LNnT离子对为732.2→387.9、732.2→367.2，最佳裂解电压为200V，最佳碰撞能量分别为50V、50V，保留时间为17.126min，如图2所示。
实施例7。
FSL的检测方法。
本实施例中检测对象为FSL，其他实施方式与实施例1相同。FSL离子对为804.3→513.2、804.3→367.2，最佳裂解电压为200V，最佳碰撞能量分别为30V、50V，保留时间为12.286min，如图2所示。
实施例8。
LNFP I的检测方法。
本实施例中检测对象为LNFP I，其他实施方式与实施例1相同。LNFP I离子对为878.4→367.2、878.4→732.2，最佳裂解电压为240V，最佳碰撞能量分别为60V、50V，保留时间为16.708min，如图2所示。
实施例9。
LNFP II的检测方法。
本实施例中检测对象为LNFP II，其他实施方式与实施例1相同。LNFP II离子对为878.4→367.2、878.4→732.2，最佳裂解电压为240V，最佳碰撞能量分别为65V、50V，保留时间为12.724min，如图2所示。
实施例10。
LNFP III的检测方法。
本实施例中检测对象为LNFP III，其他实施方式与实施例1相同。LNFP III离子对为878.4→387.9、878.4→367.2，最佳裂解电压为250V，最佳碰撞能量分别为65V、70V，保留时间为12.281min，如图2所示。
实施例11。
LST a的检测方法。
本实施例中检测对象为LST a，其他实施方式与实施例1相同。LST a离子对为1023.3→732.2、1023.3→406.2，最佳裂解电压为280V，最佳碰撞能量分别为30V、75V，保留时间为20.785min，如图2所示。
实施例12。
LST c的检测方法。
本实施例中检测对象为LST c，其他实施方式与实施例1相同。LST c离子对为1023.3→732.2、1023.3→406.2，最佳裂解电压为210V，最佳碰撞能量分别为35V、75V，保留时间为17.912min，如图2所示。
实施例13。
LNnH的检测方法。
本实施例中检测对象为LNnH，其他实施方式与实施例1相同。LNnH离子对为1097.5→753.4、1097.5→406.2，最佳裂解电压为280V，最佳碰撞能量分别为60V、90V，保留时间为24.101min，如图1所示。
实施例14。
DSLNT的检测方法。
本实施例中检测对象为DSLNT，其他实施方式与实施例1相同。DSLNT离子对为1314.5→732.2，最佳裂解电压为250V，最佳碰撞能量为60V，保留时间为21.328min，如图2所示。
实施例15。
母乳中低聚糖的检测。
本实施例中检测对象为一女性产后2个月时母乳中的低聚糖。将5mL母乳在4℃下以6000rpm的速度离心30min，去除上层脂肪。取下清液加入4倍体积Folch溶液，混合均匀，在4℃下以6000rpm的速度离心30min，进一步去除脂肪。取上清液，加入2倍体积乙醇，混合均匀，于-80℃放置4h，在室温解冻后，于4℃下以6000rpm的速度离心30min，去除蛋白质。收集上清液，在40℃下旋转蒸发去除乙醇，将得到的混合溶液冻干。将冻干固体溶于5mL去离子水中，取1mL水溶液与1mL 2M NaBH4混合均匀，置于65℃反应2h。反应后的混合溶液用石墨化碳固相萃取小柱纯化，在40℃下旋转蒸发去除乙醇，将得到的水溶液冻干，得到还原后的低聚糖固体。得到的固体重新溶于1mL超纯水中，用0.05M NaCl溶液稀释至5mL，加入0.5mL 2ppm的棉子糖作为内标，过0.22m滤膜后得到待测母乳样品。待测样品使用HPLC-QqQ-MS进行分析。HPLC-QqQ-MS梯度洗脱及参数设置与实施例1-14相同。可定性检测到此样品中11种不同的低聚糖成分，包括2’FL、3FL、LNnT、3’SL、6’SL、DFL、LNFP III、LNFP II、LNFP I、LSTa和LST c。
分别用待测母乳样品和0.05M NaCl溶液作为溶剂，溶解还原后的低聚糖标准品2’FL、LNnT、3’SL、6’SL，绘制标准曲线，计算母乳样品中的低聚糖含量，用以检验基质效应。结果如表1所示，标准品2’FL、LNnT和6’SL在两种溶剂体系中的偏差都在20％以内，可以忽略基质效应带来的误差。标准品3’SL在两种溶剂体系中的偏差大于20％，不可忽略基质效应带来的误差，只能采用待测样品作为溶剂绘制标准曲线。此方法对母乳样品中四种低聚糖定性及定量下限都在ppm浓度水平。如图3所示，采用待测样品作为溶剂，4个低聚糖标准品的标准曲线线性回归R2值都大于0.99。
表1
实施例16。
牛乳中低聚糖的检测。
本实施例中检测对象为牛乳。其他实施方式与实施例14相同。可定性检测到牛乳中9种不同的低聚糖成分，包括2’FL、3FL、LNnT、3’SL、6’SL、DFL、LNFP III、LNFP II、LNFPI。
用待测牛乳样品作为溶剂，溶解还原后的低聚糖标准品2’FL、LNnT、3’SL、6’SL，绘制标准曲线。如图4所示，4个低聚糖标准品的线性回归R2值都大于0.99。计算牛乳样品中的低聚糖含量，结果如表2所示。
表2
总之，本发明的技术效果为：
1、本发明采用QqQ-MS作为检测器对乳中低聚糖进行检测分析，可在一种离子模式下同时对乳中的中性和酸性低聚糖进行测定，无需分别对乳中的中性和酸性低聚糖进行预处理及检测，极大程度上节省了预处理及检测过程所耗费的时间；
2、本发明采用Hypercarb色谱分离柱，对乳中低聚糖同分异构体具有很好的分离效果，对于无法完全分离的低聚糖，通过QqQ-MS对两对离子对的提取，也可达到检测效果，可适用的低聚糖种类范围广泛；
3、本发明通过试验验证，QqQ-MS作为检测器对乳中不同低聚糖的定性下线可达到35-160ppb浓度水平，对乳中不同低聚糖的定量下线可达到100-630ppb浓度水平，可广泛应用于市场上各类哺乳动物乳产品中低聚糖的检测。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种哺乳动物乳中低聚糖的检测方法，其特征在于方法包括如下步骤：
1，将2-5mL乳在4℃下以4000-6000rpm的速度离心20-30min，去除上层脂肪；
2，取1中下清液加入4-5倍体积Folch溶液，混合均匀，在4℃下以4000-6000rpm的速度离心20-30min，进一步去除脂肪；
3，取2中上清液，加入2-4倍体积乙醇，混合均匀，于-80℃放置2-4h，在室温解冻后，于4℃下以4000-6000rpm的速度离心20-30min，去除蛋白质；
4，收集3中上清液，在35-40℃下旋转蒸发去除乙醇，将得到的混合溶液冻干；
5，将冻干固体溶于2-5mL去离子水中，取0.5-1mL水溶液与0.5-1mL 2MNaBH4混合均匀，置于65℃反应2h；
6，反应后的混合溶液用石墨化碳固相萃取小柱纯化，在35-40℃下旋转蒸发去除乙醇，将得到的水溶液冻干，得到还原后的低聚糖固体；
7，将6中得到的低聚糖固体重新溶于0.5-1mL超纯水中，用0.05M NaCl溶液稀释至2-5mL，加入0.2-0.5mL 2ppm的棉子糖作为内标，过0.22m滤膜后上样HPLC-QqQ-MS进行分析，其中，HPLC-QqQ-MS的色谱柱为多孔石墨碳柱；
采用Hypercarb保护柱10×2.1mm,3m和Hypercarb色谱分离柱100×2.1mm,3m进行分离，柱温为40℃，使用流动相A与流动相B进行梯度洗脱，流动相A为含有0.1％v/v氨水的乙酸铵10mM溶液，流动相B为含有0.1％v/v氨水的乙腈，梯度洗脱为第0-3分钟，流动相A为99％，流动相B为1％，流速为0.10-0.15mL/min；第3-4分钟，流动相A为99-95％，流动相B为1-5％，流速为0.15mL/min；第4-20分钟，流动相A为95-83％，流动相B为5-17％，流速为0.15mL/min；第20-30分钟，流动相A为83-58％，流动相B为17-42％，流速为0.15mL/min；第30-35分钟，流动相A为58-10％，流动相B为42-90％，流速为0.15mL/min；第35-50分钟，流动相A为10％，流动相B为90％，流速为0.15mL/min；第50-51分钟，流动相A为10-99％，流动相B为90-1％，流速为0.15-0.10mL/min；第51-60分钟，流动相A为99％，流动相B为1％，流速为0.10mL/min。
2.根据权利要求1所述的哺乳动物乳中低聚糖的检测方法，其特征在于步骤6中，反应后的混合液纯化为采用石墨化碳固相萃取进行纯化，具体操作步骤为：
1，石墨化碳固相萃取小柱经6mL超纯水洗涤后，用6mL含0.05％v/vTFA的乙腈溶液80％，v/v活化小柱，再经6mL超纯水洗涤，去除有机溶剂；
2，将步骤5中反应后的混合溶液上样到1中活化并洗涤后的小柱中，用20mL超纯水洗涤去除盐分；
3，用6mL 20％v/v乙腈溶液洗脱，收集洗脱液；
4，用6mL含有0.05％v/vTFA的乙腈溶液20％，v/v洗脱，收集洗脱液。
3.根据权利要求1所述的哺乳动物乳中低聚糖的检测方法，其特征在于步骤7中，所述的HPLC-QqQ-MS分析为采用QqQ-MS作为检测器在正离子模式下进行检测分析，具体参数为：
2’-岩藻糖基乳糖2’FL，离子对为513.2→367.2、513.2→205.1，碰撞能量分别为30V、40V，裂解电压为190V；3-岩藻糖基乳糖3FL，离子对为513.2→367.2、513.2→205.1，碰撞能量分别为30V、40V，裂解电压为150V；二岩藻糖基乳糖DFL，离子对为659.2→513.2、659.2→367.2，碰撞能量分别为30V、50V，裂解电压为200V；3’-唾液酸乳糖3’SL，离子对为658.1→367.2、658.1→205.1，碰撞能量分别为25V、50V，裂解电压为150V；6’-唾液酸乳糖6’SL，离子对为658.1→367.2、658.1→205.1，碰撞能量分别为25V、50V，裂解电压为160V；乳糖-N-新四糖LNnT离子对为732.2→387.9、732.2→367.2，碰撞能量分别为50V、50V，裂解电压为200V；乳糖-N-新六糖LNnH离子对为1097.5→753.4、1097.5→406.2，碰撞能量分别为60V、90V，裂解电压为280V；乳糖-N-岩藻五糖ILNFP I离子对为878.4→367.2、878.4→732.2，碰撞能量分别为60V、50V，裂解电压为240V；乳糖-N-岩藻五糖IILNFP II离子对为878.4→367.2、878.4→732.2，碰撞能量分别为65V、50V，裂解电压为240V；乳糖-N-岩藻五糖IIILNFP III离子对为878.4→387.9、878.4→367.2，碰撞能量分别为65V、70V，裂解电压为250V；岩藻糖基-3’-O-唾液酸乳糖FSL，离子对为804.3→513.2、804.3→367.2，碰撞能量分别为30V、50V，裂解电压为200V；唾液酸乳糖-N-四糖aLSTa，离子对为1023.3→732.2、1023.3→406.2，碰撞能量分别为30V、50V，裂解电压为200V；唾液酸乳糖-N-四糖cLSTc，离子对为1023.3→732.2、1023.3→406.2，碰撞能量分别为35V、70V，裂解电压为210V；二唾液酸乳糖-N-四糖DSLNT，离子对为1314.5→732.2，碰撞能量分别为60V，裂解电压为250V。
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