CN116298005B - 一种畜肉中κ-卡拉胶的柱前衍生液相色谱串联质谱检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种畜肉中κ‑卡拉胶的柱前衍生液相色谱串联质谱检测方法，所述方法通过对被测样品进行超声波辅助水解，样品中的κ‑卡拉胶水解产物κ‑卡拉胶二糖与衍生化试剂1‑苯基‑3‑甲基‑5‑吡唑啉酮反应生成衍生化产物，用液相色谱串联质谱进行检测。本发明采用的柱前衍生液相色谱串联质谱检测方法简单、快速，结果稳定、准确，无需使用专用色谱柱即可准确检测出畜肉样品中κ‑卡拉胶的存在，对于完善畜肉样品中κ‑卡拉胶检测标准体系，查处畜肉中违规添加κ‑卡拉胶的行为有着重要意义。
Description
技术领域
本发明属于畜产品质量安全检测领域，具体涉及一种畜肉中κ-卡拉胶的柱前衍生液相色谱串联质谱检测方法。
背景技术
卡拉胶(Carrageenan)是从某些红藻(如角叉菜、麒麟菜、杉藻、沙菜等)细胞壁中提取得到的一种水溶性硫酸半乳聚糖，其分子量在105～106Da。卡拉胶具有形成亲水胶体、凝胶、乳化、增稠、成膜、稳定、分散剂等多种特征，按照《GB 2760-2014食品安全国家标准食品添加剂使用标准》规定，在食品生产过程中，卡拉胶可作为乳化剂、增稠剂、稳定剂；但在初级农产品中，向畜肉中注入卡拉胶是属于掺杂掺假的违法行为。
工业化生产的卡拉胶主要有κ-，ι-和λ-三种构型，其中κ-卡拉胶应用较为广泛。畜肉中κ-卡拉胶检测方法主要有液相色谱串联质谱法、近红外透射光谱法和低场核磁共振技术。
CN106556654A公开了一种畜肉中κ-卡拉胶的液相色谱串联质谱检测方法，具体是通过对κ-卡拉胶水解产物κ-卡拉胶二糖进行二级质谱裂解，确定特征碎片离子，进行定性定量检测，从而确定样品中是否含有κ-卡拉胶。该方法的局限性在于：一是κ-卡拉胶二糖在C18色谱柱上保留能力非常弱，如需实现良好的分离效果则需要配置专门的糖基分析专用柱，而目前畜产品中药物残留及非法添加物质检测通用性最广泛的色谱柱为C18色谱柱，专门配置糖基分析专用柱无疑增加了使用成本。二是前处理过程中样品的水解时间过长，样品需在60℃条件下水解16h。
有文献报道液相色谱串联质谱法(张会亮,黄传峰,李佩璇,等.高效液相色谱-质谱法测定畜肉中的卡拉胶[J].食品科学,2019,40(10):298-303)，《中华人民共和国农业行业标准NY/T3876-2021猪肉中卡拉胶的检测液相色谱一串联质谱法》，上述两种方法均采用了与ZL201610884088.7相同的技术路线，且均使用了糖基分析专用柱。有文献报道近红外透射光谱法(孟一,张玉华,许丽丹,等.近红外光谱技术对猪肉注水、注胶的快速检测[J].食品科学,2014,35(8):299-303)，将预测集注水肉和注胶肉的平均光谱分别导入注水量定量模型和注胶量定量模型，预测注水量和注胶量，以此来验证模型的准确性和可靠性。有文献报道低场核磁共振技术(吴艺影,章倩汝,韩剑众,等.基于低场核磁共振技术的注胶肉快速检测[J].肉类研究,2013,27(3):26-29)，是利用氢原子核在磁场中的活动特性，可以追踪待测物质中的氢原子特别是水，包括结合水、不易流动水和自由水，观察水分分布状况及其随着时间的变化而产生的改变，从而获得生物材料中不同状态水分及其各自的相对含量等信息来判别注胶肉与正常肉。上述近红外光谱技术和地场核磁共振技术均需要昂贵的检测仪器设备，需要建立大量的观测数据和数学模型，对实验结果的分析需要很强的专业技术水平，检测成本高，不利于批量检测和应用推广。
尚未有文献报道采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)作为衍生化试剂进行柱前衍生液相色谱串联质谱方法检测畜肉中κ-卡拉胶。
发明内容
为了解决现有技术中存在的缺点，本发明提供了一种畜肉中κ-卡拉胶的柱前衍生液相色谱串联质谱检测方法，该方法操作简单快速，结果准确稳定，便于推广应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种畜肉中κ-卡拉胶的柱前衍生液相色谱串联质谱检测方法，采取超声波辅助水解，超声频率15～25KHz；采取柱前衍生前处理，衍生化试剂为1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)；采取液相色谱串联质谱检测，色谱检测条件为：采用色谱柱为C18柱，柱径2.1～4.6mm，柱长50～250mm，粒径1.8～5μm；流动相A为20mmol/L乙酸铵水溶液，流动相B为甲醇；流动相体积比为84～36:16～64；流动相流速为0.2～1.5mL/min；进样量为5～20μL。质谱检测条件为：负离子模式，多反应监测(MRM)，离子源温度为325℃，毛细管电压为-4000V，喷雾气流量为12L/min，雾化器压力为30psi；母离子m/z＝733.3，子离子m/z＝559.2、299.2、281.1、173.0。
优选的，所述畜肉为猪肉、羊肉或牛肉中的任一种。
优选的，所述超声频率为20KHz。
优选的，所述C18柱的柱径2.1mm，柱长100mm，粒径2.7μm。
优选的，所述流动相A：流动相B体积比为62:38。
优选的，所述流动相流速为0.4mL/min。
优选的，所述的检测方法，包括以下步骤：
S1.标准曲线系列溶液配置：取κ-卡拉胶标准物质，加入去离子水，分别配成浓度为0.2～100mg/L间至少5个浓度梯度的标准曲线系列溶液；
S2.样品水解：取畜肉粉碎成肉糜，加至离心管内，再加入盐酸，超声水解10min，样品水解液离心；
S3.衍生化：取200μL样品水解液上清液转移至离心管，加入氨水100μL，0.5mol/L衍生化试剂1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮200μL，在70℃恒温水浴中反应60min，冷却至室温；标准曲线系列溶液分别量取200μL按本步骤处理；
S4.净化：向冷却后的衍生化试液中加入0.5mL去离子水，再加入1mL二氯甲烷，充分涡旋后离心，弃去下层二氯甲烷，重复二氯甲烷净化操作三次；
S5.检测：移取步骤S4中水相液体，滤膜过滤后注入液相色谱串联质谱仪，记录质谱图。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明采用了超声波辅助水解，水解过程仅需10min，极大地缩短了水解时间。
2、本发明所检测的目标物为结构稳定的κ-卡拉胶二糖与1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)的衍生化物，特征碎片离子稳定且可选择特征碎片离子较多，有利于目标物的定性。
3、本发明采用了柱前衍生法，目标物可在C18色谱柱上得到有效分离，降低了杂质干扰。
4、本发明重现性好、结果准确。
5、本发明方法可准确检测出畜肉样品中κ-卡拉胶的存在，对于完善畜肉样品中κ-卡拉胶检测标准体系，查处畜肉中违规添加κ-卡拉胶的行为有着重要意义。
附图说明
图1为κ-卡拉胶化学结构式；
图2为κ-卡拉胶二糖化学结构式；
图3为PMP衍生化合物的化学结构式；
图4为PMP衍生化合物的碎片离子图；
图5为标准曲线方程及相关系数；
图6为添加有κ-卡拉胶的猪肉对照样品的总离子流图；
图7为添加有κ-卡拉胶的猪肉对照样品的MRM质谱图；
图8为添加有κ-卡拉胶的猪肉对照样品碎片离子丰度比。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行详细、完整的描述，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例1
图1为κ-卡拉胶化学结构式。研究过程中，首先对猪肉样品进行水解，水解液中κ-卡拉胶二糖的化学结构式见图2。κ-卡拉胶二糖与1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生化反应得到衍生化合物，其化学结构式见图3。对添加有κ-卡拉胶的猪肉空白样品进行了检测，实验结果见图4～图8。结果显示，本发明采用的柱前衍生液相色谱串联质谱检测方法能够简单快速、准确地检测出猪肉样品中κ-卡拉胶的存在。
本申请确定了一种新的检测条件，是首次对畜肉中κ-卡拉胶的柱前衍生液相色谱串联质谱检测方法，具体内容如下：
1、色谱条件
液相色谱仪：安捷伦LC 1290Infinity；
色谱柱：Agilent Poroshell 120EC-C18(2.1mm×100mm，2.7μm)；
流动相A：20mmol/L乙酸铵水溶液；
流动相B：甲醇；
流动相A：B体积比为62:38；
流动相流速：0.4mL/min；
进样量：5μL。
2、质谱条件
三重四级质谱仪：安捷伦6460QQQ MS；
离子模式：负离子模式；
监测模式：多反应监测(MRM)；
离子源温度：325℃；
毛细管电压：-4000V；
喷雾气流量：12L/min，
雾化器压力：30psi；
母离子：m/z＝733.3；
子离子：m/z＝559.2、299.2、281.1、173.0。
3、其他试验用品及试剂
超声波均质器：方需科技(上海)有限公司；
试验用水：密理博Merck Milli-Q超纯水机制得，电阻率≥18.2MΩ；
甲醇：美国TEDIA天地试剂公司；
乙酸铵：上海麦克林生化科技有限公司；
κ-卡拉胶：上海麦克林生化科技有限公司；
1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)：上海麦克林生化科技有限公司；
其他化学试剂均购自国药集团化学试剂有限公司；
待测样品：猪肉。
4、具体实施时，检测方法包括以下步骤：
S1.标准曲线系列溶液配置：取κ-卡拉胶标准物质，加入去离子水，分别配成浓度为1mg/L、2mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L、50mg/L 6个浓度梯度的标准曲线系列溶液；
S2.样品水解：取适量猪肉粉碎成肉糜，取2.0g加至50mL离心管内，再加入10mL0.2mol/L盐酸，于超声波均质器超声水解10min，样品水解液8000rpm离心10min；
S3.衍生化：取200μL样品水解液上清液转移至15mL离心管，加入氨水100μL，0.5mol/L衍生化试剂1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)200μL，在70℃恒温水浴中反应60min，冷却至室温；标准曲线系列溶液分别量取200μL按本步骤处理；
S4.净化：向冷却后的衍生化试液中加入0.5mL去离子水，再加入1mL二氯甲烷，充分涡旋后8000rpm离心，弃去下层二氯甲烷，重复二氯甲烷净化操作三次；
S5.检测：移取步骤S4中水相液体，使用孔径为0.22μm的针式滤膜过滤，量取过滤后的液体5μL注入液相色谱串联质谱仪，记录质谱图。
检测结果：如图4～图8所示，添加有κ-卡拉胶的猪肉对照样品中的κ-卡拉胶二糖衍生化物能够被液相色谱串联质谱准确检出，保留时间4.8min，与标准曲线系列保留时间一致。
(1)定性：标准曲线系列母离子的相对分子质量为733.3，在多反应监测(MRM)模式下，4种子离子的相对分子质量分别为559.2、299.2、281.1、173.0。以相对分子质量559.2的子离子为定量离子，其他子离子相对应的丰度比的中位值分别为92.8％(m/z＝299.2)、31.6％(m/z＝281.1)、28.6％(m/z＝173.0)。猪肉对照样品(n＝6)各子离子相对应的丰度比的平均值分别为91.7％(m/z＝299.2)、31.6％(m/z＝281.1)、28.4％(m/z＝173.0)，各子离子丰度比偏差范围均可满足定性要求。
(2)标准曲线线性：6个浓度梯度的标准曲线线性良好，相关系数0.9999。
(3)检出限：标准曲线最低点浓度为1mg/L的检测结果信噪比(S/N)为103.02，按3倍信噪比来计算检出限，可得仪器检出限约为29μg/L。
(4)准确度和精密度：6个添加样品(添加量为2mg/kg)的回收率在92％～103％，相对标准偏差2.13％。
实施例2
研究过程中，首先对羊肉样品进行水解，水解液中κ-卡拉胶二糖与1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生化反应得到衍生化合物。对添加有κ-卡拉胶的羊肉空白样品进行了检测，结果显示，本发明采用的柱前衍生液相色谱串联质谱检测方法能够简单快速、准确地检测出羊肉样品中κ-卡拉胶的存在。
本申请确定了一种新的检测条件，是首次对畜肉中κ-卡拉胶的柱前衍生液相色谱串联质谱检测方法，具体内容如下：
1、色谱条件
液相色谱仪：安捷伦LC 1290Infinity；
色谱柱：Agilent Poroshell 120EC-C18(2.1mm×100mm，2.7μm)；
流动相A：20mmol/L乙酸铵水溶液；
流动相B：甲醇；
流动相A：B体积比为62:38；
流动相流速：0.4mL/min；
进样量：5μL。
2、质谱条件
三重四级质谱仪：安捷伦6460QQQ MS；
离子模式：负离子模式；
监测模式：多反应监测(MRM)；
离子源温度：325℃；
毛细管电压：-4000V；
喷雾气流量：12L/min，
雾化器压力：30psi；
母离子：m/z＝733.3；
子离子：m/z＝559.2、299.2、281.1、173.0。
3、其他试验用品及试剂
超声波均质器：方需科技(上海)有限公司；
试验用水：密理博Merck Milli-Q超纯水机制得，电阻率≥18.2MΩ；
甲醇：美国TEDIA天地试剂公司；
乙酸铵：上海麦克林生化科技有限公司；
κ-卡拉胶：上海麦克林生化科技有限公司；
1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)：上海麦克林生化科技有限公司；
其他化学试剂均购自国药集团化学试剂有限公司；
待测样品：羊肉。
4、具体实施时，检测方法包括以下步骤：
S1.标准曲线系列溶液配置：取κ-卡拉胶标准物质，加入去离子水，分别配成浓度为1mg/L、2mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L、50mg/L 6个浓度梯度的标准曲线系列溶液；
S2.样品水解：取适量羊肉粉碎成肉糜，取2.0g加至50mL离心管内，再加入10mL0.2mol/L盐酸，于超声波均质器超声水解10min，样品水解液8000rpm离心10min；
S3.衍生化：取200μL样品水解液上清液转移至15mL离心管，加入氨水100μL，0.5mol/L衍生化试剂1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)200μL，在70℃恒温水浴中反应60min，冷却至室温；标准曲线系列溶液分别量取200μL按本步骤处理；
S4.净化：向冷却后的衍生化试液中加入0.5mL去离子水，再加入1mL二氯甲烷，充分涡旋后8000rpm离心，弃去下层二氯甲烷，重复二氯甲烷净化操作三次；
S5.检测：移取步骤S4中水相液体，使用孔径为0.22μm的针式滤膜过滤，量取过滤后的液体5μL注入液相色谱串联质谱仪，记录质谱图。
检测结果：添加有κ-卡拉胶的羊肉对照样品中的κ-卡拉胶二糖衍生化物能够被液相色谱串联质谱准确检出，保留时间4.8min，与标准曲线系列保留时间一致。
(1)定性：标准曲线系列母离子的相对分子质量为733.3，在多反应监测(MRM)模式下，4种子离子的相对分子质量分别为559.2、299.2、281.1、173.0。以相对分子质量559.2的子离子为定量离子，其他子离子相对应的丰度比的中位值分别为92.2％(m/z＝299.2)、31.2％(m/z＝281.1)、28.4％(m/z＝173.0)。羊肉对照样品(n＝6)各子离子相对应的丰度比的平均值分别为91.6％(m/z＝299.2)、31.0％(m/z＝281.1)、28.6％(m/z＝173.0)，各子离子丰度比偏差范围均可满足定性要求。
(2)标准曲线线性：6个浓度梯度的标准曲线线性良好，相关系数0.9999。
(3)检出限：标准曲线最低点浓度为1mg/L的检测结果信噪比(S/N)为91.45，按3倍信噪比来计算检出限，可得仪器检出限约为33μg/L。
(4)准确度和精密度：6个添加样品(添加量为2mg/kg)的回收率在89％～107％，相对标准偏差4.09％。
结论：通过实验发现，本发明所采用的柱前衍生液相色谱串联质谱检测方法可以很好地检测出畜肉样品中的κ-卡拉胶，目标物保留时间与标准曲线系列保留时间一致，母离子、子离子、子离子丰度比均能与标准曲线系列相匹配，且畜肉空白样品对照在保留时间位置无干扰；填补了该领域技术的空白。
同时，本发明可作为畜肉中卡拉胶检测标准体系的重要组成部分，丰富和完善畜肉中卡拉胶检测方法；还可以为畜肉中非法掺入其他胶种的检测方法研究工作提供思路。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，均应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种畜肉中κ-卡拉胶的柱前衍生液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于：先对畜肉样品进行预处理，再采取液相色谱串联质谱检测，色谱检测条件为：色谱柱为C18柱，柱径2.1mm，柱长100mm，粒径2.7μm，流动相A为20mmol/L乙酸铵水溶液，流动相B为甲醇，所述流动相A：流动相B体积比为62:38，流动相流速为0.2~1.5mL/min，进样量为5~20μL；质谱检测条件为：负离子模式，多反应监测，离子源温度为325℃，毛细管电压为-4000V，喷雾气流量为12L/min，雾化器压力为30psi；母离子m/z=733.3，子离子m/z=559.2、299.2、281.1、173.0；
所述样品预处理的步骤包括：
（1）样品水解：取畜肉粉碎成肉糜，加至离心管内，再加入盐酸，超声水解10min，超声频率15~25KHz，样品水解液离心；
（2）衍生化：取200μL样品水解液上清液转移至离心管，加入氨水100μL，0.5mol/L衍生化试剂1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮200μL，在70℃恒温水浴中反应60min，冷却至室温；
（3）净化：向冷却后的衍生化试液中加入0.5mL去离子水，再加入1mL二氯甲烷，充分涡旋后离心，弃去下层二氯甲烷，重复二氯甲烷净化操作三次。
2.根据权利要求1所述的一种畜肉中κ-卡拉胶的柱前衍生液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于：所述畜肉为猪肉、羊肉或牛肉中的任一种。
3.根据权利要求1所述的一种畜肉中κ-卡拉胶的柱前衍生液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于：所述超声频率为20KHz。
4.根据权利要求1所述的一种畜肉中κ-卡拉胶的柱前衍生液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于：所述流动相A、流动相B的流速为0.4mL/min。
5.根据权利要求1至4任意一项所述的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1.标准曲线系列溶液配置：取κ-卡拉胶标准物质，加入去离子水，分别配成浓度为0.2~100mg/L间至少5个浓度梯度的标准曲线系列溶液；
S2.样品水解：取畜肉粉碎成肉糜，加至离心管内，再加入盐酸，超声水解10min，样品水解液离心；
S3.衍生化：取200μL样品水解液上清液转移至离心管，加入氨水100μL，0.5mol/L衍生化试剂1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮200μL，在70℃恒温水浴中反应60min，冷却至室温；标准曲线系列溶液分别量取200μL按本步骤处理；
S4.净化：向冷却后的衍生化试液中加入0.5mL去离子水，再加入1mL二氯甲烷，充分涡旋后离心，弃去下层二氯甲烷，重复二氯甲烷净化操作三次；
S5.检测：移取步骤S4中水相液体，滤膜过滤后注入液相色谱串联质谱仪，记录质谱图。
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