CN113325102A - 一种虾肉中硝基呋喃类兽药检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速的虾肉中硝基呋喃代谢物残留检测的UPLC‑FLD分析方法。该分析方法包括如下步骤：1)将均质的虾肉样品中加入酸水溶液后在超声下进行解离，离心得上清液A；2)将上清液A在氮气保护下进行浓缩，得浓缩样B；3)在浓缩样B中依次加入荧光衍生试剂、乙腈和稀酸水溶液，并在恒温超声下进行辅助衍生；4)将衍生完成后的溶液进行低温高速离心，过膜上机测试。本发明通过使用恒温超声辅助衍生技术，将硝基呋喃代谢物和新的荧光衍生试剂进行快速衍生，最后使用荧光检测器进行检测。本发明的前处理过程大幅缩短了衍生反应时间，大幅减少了有机试剂的使用，且操作步骤简单高效，此外高荧光衍生试剂能够明显提高检测灵敏度，实现了硝基呋喃类兽药的快速，简单且准确的检测。
Description
发明领域
本发明涉及食品中兽药的检测方法。具体的说，本发明涉及一种虾肉中硝基呋喃类兽药残留的测定方法。
背景技术
虾肉因其清淡爽口，且含有丰富的蛋白质、脂肪、碳水化合物、钙、铁、磷等营养成分而广受消费者喜爱。我国是全球对虾养殖的第一大生产国，这些年对虾的出口保持稳定的增长，但在这过程中因违禁兽药被检出而遭相关部门通报的情况也相对增加，特别是关于虾肉中硝基呋喃类兽药残留方面。硝基呋喃类药物是一类人工合成的广谱性抗生素，早期曾广泛用于虾类养殖生产中以预防和治疗肠胃炎等动物性疾病，但研究表明食用含有硝基呋喃兽药残留的虾肉会使人体有致癌致畸等严重风险，使得包括中国在内的很多国家明确禁止使用硝基呋喃类兽药。但由于其价格便宜且药效明显，使得这类药物的违规使用屡禁不止。
目前，液相色谱质谱联用法(LC-MS)因在检测肉类食品中硝基呋喃类兽药残留时具有很好地定性和定量的能力，在少数发达国家已将该方面的检测列为常规检测项目。但该检测方法中质谱仪器价格昂贵，检测成本高等问题使得其无法在发展中国家进行规模化的推广使用。此外，现有检测方法中大多按照国标GB/T 21311-2007对虾肉中硝基呋喃类兽药的残留量进行检测，但在预处理过程中，样品衍生要在37 ℃水浴下持续16 h，并且要精准调节样品pH，还需用乙酸乙酯进行净化，萃取再浓缩。繁琐的步骤使得前处理过程花费时间长、步骤繁琐且检测效率低，这使得开发出快速、简单且高效的前处理方法势在必行。
因地区发展不平衡等诸多原因，欠发达地区很难将质谱方法用于实际虾肉样品的硝基呋喃兽药残留的检测过程中。基于此，开发虾肉中硝基呋喃类兽药残留的高效液相色谱-荧光检测的分析方法，在不使用昂贵的质谱检测的同时获得样品检测的高灵敏度，这将为欠发达地区的水产食品安全提供保障。同时有助于提升发展中地区虾肉出口的综合竞争力，为当地企业出口水产品提供品质保证的同时也可以减少贸易纠纷。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种虾肉中硝基呋喃类药物的测定方法，以解决现有的国标GB/T 21311-2007对肉类食品进行前处理过程中前处理时间长、检测过程繁琐复杂和检测效率低的问题，并且建立了相对便宜的液相色谱-荧光检测法对样品进行检测，保证高灵敏度的同时，大幅的缩短了衍生时间并且简化了检测步骤，获得的检测结果稳定且可靠。
本发明是通过以下技术方案进行实现的：
一种虾肉中硝基呋喃类代谢物残留的检测方法，该分析方法包括以下步骤：
（1）将均质的虾肉样品加入离心管中，再加入酸水溶液后在超声下进行解离，再通过离心转移上清液；
（2）将步骤（1）中的上清液在氮气保护下进行浓缩；
（3）将步骤（2）中得到的浓缩样中依次加入荧光衍生试剂、乙腈和稀酸水溶液，并在恒温超声下进行辅助衍生，衍生完成后加入碱性溶液进行混合；
（4）将步骤（3）中衍生完成后的溶液进行低温高速离心，过膜上机测试。
其中，步骤（1）中虾肉的质量为2.00 g。
优选地，步骤（1）中酸溶液的浓度选为0.2 mol/L，加入体积为10 mL。
优选地，步骤（1）中超声解离温度选为20~70 ℃，超声解离时间选为5~50 min。
更为优选地，步骤（1）中超声解离温度选为40℃，超声解离时间选为20 min。
优选地，步骤（1）中的离心转速为6000 r/min，离心时间为5 min。
优选地，步骤（1）中的上清液移取5 mL。
优选地，步骤（2）中的样品浓缩温度为50℃。
优选地，步骤（3）中的荧光衍生试剂为4-二苯胺基苯甲醛。
优选地，步骤（3）中衍生试剂4-二苯胺基苯甲醛的体积为50 uL，浓度为2~10mmol/L。
更为优选地，步骤（3）中衍生试剂4-二苯胺基苯甲醛的体积为50 uL，浓度为8mmol/L。
优选地，步骤（3）中加入的色谱纯乙腈体积为200 uL。
优选地，步骤（3）中酸性水溶液体积为200 uL，pH=1.0~3.0。
更为优选地，步骤（3）中酸性水溶液体积为200 uL，pH=1.0。
优选地，步骤（3）中恒温超声辅助衍生过程中的衍生时间选为5~80 min，衍生温度选为20~70 ℃。
更为优选地，步骤（3）中恒温超声辅助衍生过程中的衍生时间选为20 min，衍生温度选为50℃。
优选地，步骤（3）中加入的碱性溶液为NaOH溶液，浓度为0.5 mol/L，体积为50 uL。
优选地，步骤（4）中低温高速离心操作中，温度选为4℃，转速为10000 r/min。
通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下效果：
与现有的衍生方法对比，本发明在前处理过程中使用几乎未见报道的恒温超声辅助衍生技术，用于加快虾肉中四种硝基呋喃代谢物的衍生反应，使得20 min完成衍生反应（常规为16 h）,大幅缩短了前处理过程的时间。
本发明优化了虾肉中硝基呋喃代谢物的前处理步骤，过程中不需要进行繁琐的pH调节并且无需使用有机试剂，简化了实验步骤的同时减少了有机试剂对环境的污染。
本发明首次提出了使用4-二苯胺基苯甲醛作为新的荧光衍生试剂，并且将其应用于虾肉中四种硝基呋喃代谢物的衍生反应中，使得衍生反应能够快速的反应完全，得到的代谢衍生物具有显著的荧光强度且性质稳定。
本发明中所得的代谢衍生物具有很强的荧光强度，使用超高效液相色谱-荧光检测法对代谢衍生物进行检测将具有很高的灵敏度。使用荧光检测法能够满足虾肉中硝基呋喃代谢物检测灵敏度的同时为替代价格昂贵的质谱进行推广应用提供了依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为虾肉中四种硝基呋喃代谢衍生物混标的色谱图（色谱峰AMOZ-DABA，SEM-DABA，AHD-DABA和AOZ-DABA分别为呋喃它酮，呋喃西林，呋喃妥因和呋喃唑酮代谢物的衍生物）。
图2为虾肉中未添加四种硝基呋喃代谢物的空白色谱图。
具体实施方式
下面进一步列举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域技术人员根据本发明阐述的原理做出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适范围内的选择，而并非要限定于下文示例的具体数据。
如图1、图2所示的一种虾肉中的硝基呋喃代谢物残留的检测方法，包括以下实施例子：
实施例1
称取2.00 g均质虾肉样品于50 mL离心管中，加入10 mL的0.2 mol/L的HCl，涡旋2min，将该样品置于40 ℃的恒温超声反应器中解离20 min，随后在6000 r/min的转速下离心5 min，移取5 mL上清液，并且将该上清液在氮气保护下于50 ℃进行浓缩。
在浓缩液中依次加入50 uL，8 mmol/L的4-二苯胺基苯甲醛，200 uL的乙腈和200uL的pH=1.0的盐酸水溶液，涡旋2 min后，将混合反应液置于50 ℃的恒温超声反应器中衍生标记20 min，衍生结束后加入50 uL，0.5 mol/L的NaOH中和反应液的酸碱性，再涡旋1min后将反应液在4 ℃，10000 r/min的转速下离心10 min，移取清液过膜后上机检测。
实施例2
称取1.00 g均质虾肉样品于50 mL离心管中，加入5 mL的0.2 mol/L的HCl，涡旋2min，将该样品置于40 ℃的恒温超声反应器中解离20 min，随后在6000 r/min的转速下离心5 min，移取所有的上清液，并且将该上清液在氮气保护下于50 ℃进行浓缩。
在浓缩液中依次加入50 uL，8 mmol/L的4-二苯胺基苯甲醛，200 uL的乙腈和200uL的pH=1.0的盐酸水溶液，涡旋2 min后，将混合反应液置于50 ℃的恒温超声反应器中衍生标记20 min，衍生结束后加入50 uL，0.5 mol/L的NaOH中和反应液的酸碱性，再涡旋1min后将反应液在4 ℃，10000 r/min的转速下离心10 min，移取清液过膜后上机检测。
实施例3
称取2.00 g均质虾肉样品于50 mL离心管中，加入10 mL的0.2 mol/L的HCl，涡旋2min，将该样品置于60 ℃的恒温超声反应器中解离10 min，随后在6000 r/min的转速下离心5 min，移取5 mL上清液，并且将该上清液在氮气保护下于60 ℃进行浓缩。
在浓缩液中依次加入50 uL，8 mmol/L的4-二苯胺基苯甲醛，200 uL的乙腈和200uL的pH=1.0的盐酸水溶液，涡旋2 min后，将混合反应液置于50 ℃的恒温超声反应器中衍生标记20 min，衍生结束后加入50 uL，0.5 mol/L的NaOH中和反应液的酸碱性，再涡旋1min后将反应液在4 ℃，10000 r/min的转速下离心10 min，移取清液过膜后上机检测。
实施例4
称取2.00 g均质虾肉样品于50 mL离心管中，加入10 mL的0.2 mol/L的HCl，涡旋2min，将该样品置于40 ℃的恒温超声反应器中解离20 min，随后在6000 r/min的转速下离心5 min，移取5 mL上清液，并且将该上清液在氮气保护下于50 ℃进行浓缩。
在浓缩液中依次加入50 uL，8 mmol/L的4-二苯胺基苯甲醛，200 uL的乙腈和200uL的pH=1.0的盐酸水溶液，涡旋2 min后，将混合反应液置于40 ℃的恒温超声反应器中衍生标记40 min，衍生结束后加入50 uL，0.5 mol/L的NaOH中和反应液的酸碱性，再涡旋1min后将反应液在4 ℃，10000 r/min的转速下离心10 min，移取清液过膜后上机检测。
实施例5
称取2.00 g均质虾肉样品于50 mL离心管中，加入10 mL的0.2 mol/L的HCl，涡旋2min，将该样品置于40 ℃的恒温超声反应器中解离20 min，随后在10000 r/min的转速下离心3 min，移取5 mL上清液，并且将该上清液在氮气保护下于60 ℃进行浓缩。
在浓缩液中依次加入50 uL，8 mmol/L的4-二苯胺基苯甲醛，200 uL的乙腈和200uL的pH=1.0的盐酸水溶液，涡旋2 min后，将混合反应液置于50 ℃的恒温超声反应器中衍生标记20 min，衍生结束后加入50 uL，0.5 mol/L的NaOH中和反应液的酸碱性，再涡旋1min后将反应液在4 ℃，12000 r/min的转速下离心5 min，移取清液过膜后上机检测。
实施例1~5所用的检测仪器为戴安Ultimate-3000超高效液相色谱，其具体检测条件如表1所示。
表1
实施例中1~5中四种硝基呋喃代谢物工作溶液（AMOZ、SEM、AHD、AOZ）的配制方法为：精确移取四种硝基呋喃代谢物标准品粉末各1.00 mg，加入乙腈进行溶解后，再转移至10 mL的容量瓶中，稀释至刻度后得到四种代谢物的标准储备液浓度为100 ug/mL，转移至10 mL的棕色试剂瓶中（-20℃状态下保存备用，有效期3个月），随后移取标准储备液100 uL于10 mL的容量瓶中，再加入乙腈进行稀释和定容，所得四种硝基呋喃代谢物混标的浓度为1.0 ug/mL。
以空白虾肉作为测试样本，按照本发明提出的检测方法在0.5、1、5 ug/kg 三个浓度水平上进行加标回收率测试，实验每个样品重复六次实验，通过外标法来计算每个分析样本的浓度，并计算样本的加标回收率和相对标准偏差，实验数据见表2。
表2
表3
表4
表2中的实验相关数据说明，样品的重现性好，精密度在标准要求的6%以下，该方法得到的检测数据稳定、可靠。
表3中的实验相关数据说明，对真实样品进行检测，发现样品中SEM和AHD有检出，可知该方法能够很好地应用于实际样品的检测中。
以上实施例为本发明的部分实施方式，并不限制于本发明。对本领域技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下做出的若干改进和变型，也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种虾肉中硝基呋喃类代谢物残留的检测方法，其特征在于，该方法通过以下方法步骤建立：
（1）在均质的虾肉样品中加入稀盐酸溶液进行恒温超声解离，再通过离心转移上清液；
（2）将步骤（1）的上清液在氮气流下进行浓缩；
（3）在步骤（2）的浓缩样中依次加入新的荧光衍生试剂、乙腈和稀酸水溶液，并在恒温超声下进行辅助衍生，衍生结束后加入碱性溶液进行中和；
（4）对步骤（3）混合后的溶液进行高速冷冻离心，取澄清溶液过膜进行检测。
2.根据权利要求1所述的虾肉中硝基呋喃代谢物残留的前处理方法，其特征在于：步骤1)中使用恒温超声装置进行酸解处理，酸解温度和时间分别为40 ℃和20 min。
3.根据权利要求1所述的虾肉中硝基呋喃代谢物残留的前处理方法，其特征在于：步骤3)中选用新的荧光衍生试剂为4-二苯胺基苯甲醛。
4.根据权利要求1所述的虾肉中硝基呋喃代谢物残留的前处理方法，其特征在于：步骤3)中浓缩液中依次加入50 uL，2~10 mmol/L的4-二苯胺基苯甲醛，200 uL乙腈和200 uL，pH=1.0~3.0 的盐酸水溶液。
5.根据权利要求1或4所述的虾肉中硝基呋喃代谢物残留的前处理方法，其特征在于：步骤3)中浓缩液中依次加入50 uL，8.0 mmol/L的4-二苯胺基苯甲醛，200 uL乙腈和200uL，pH=1.0 的盐酸水溶液。
6.根据权力要求1所述的虾肉中硝基呋喃代谢物残留的前处理方法，其特征在于：步骤3)中使用恒温超声辅助衍生技术对新的荧光衍生试剂和四种硝基呋喃代谢物进行辅助衍生。
7.根据权利要求1所述的虾肉中硝基呋喃代谢物残留的前处理方法，其特征在于：步骤3)中样品超声辅助衍生频率为45、80、100 KHz，衍生温度为20~70 ℃，衍生时间为5~80min。
8.根据权利要求1或6所述的虾肉中硝基呋喃代谢物残留的前处理方法，其特征在于：步骤3)中样品超声辅助衍生频率为45 KHz，衍生温度为50 ℃，衍生时间为20 min。
9.根据权利要求1所述的虾肉中硝基呋喃代谢物残留的前处理方法，其特征在于：步骤3)中使用的碱性溶液为NaOH溶液，其浓度为0.5 mol/L，加入体积为50 uL。
10.根据权利要求1所述的虾肉中硝基呋喃代谢物残留的前处理方法，其特征在于：步骤4)中将样品在4℃，10000 r/min的转速下离心10 min，澄清溶液过膜后在激发波长为260nm，发射波长为500 nm处进行检测。
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| CN114527223A (zh) * | 2022-01-11 | 2022-05-24 | 王猛 | 一种水产品中硝基呋喃类兽药检测方法 |
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