CN116124966B - 一种畜肉中κ-卡拉胶的液相色谱检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种畜肉中κ‑卡拉胶的液相色谱检测方法，具体步骤包括：标准曲线系列溶液配制；超声波辅助水解样品；样品水解产物衍生化；液相色谱检测确定样品中κ‑卡拉胶的含量，采用的液相色谱检测条件为：色谱柱为C18柱，柱径2.1～4.6mm，柱长50～250mm，粒径1.8～5μm；流动相A为20mmol/L磷酸二氢钾水溶液，流动相B为乙腈；流动相体积比为84～60:16～40；流动相流速为0.2～1.5mL/min；检测器为紫外检测器或是二极管阵列检测器，检测波长245～250nm；进样量为5～20μL。本发明采用的液相色谱检测方法简单、快速、检测成本低，能准确检测出畜肉样品中κ‑卡拉胶的存在，对于查处畜肉中违规添加κ‑卡拉胶行为有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于畜产品质量安全检测领域，具体涉及一种畜肉中κ-卡拉胶的液相色谱检测方法。
背景技术
卡拉胶(Carrageenan)是从某些红藻(如角叉菜、麒麟菜、杉藻、沙菜等)细胞壁中提取得到的一种水溶性硫酸半乳聚糖，其分子量在105～106Da。卡拉胶具有形成亲水胶体、凝胶、乳化、增稠、成膜、稳定、分散剂等多种特征，按照《GB 2760-2014食品安全国家标准食品添加剂使用标准》规定，在食品生产过程中，卡拉胶可作为乳化剂、增稠剂、稳定剂；但在初级农产品中，向畜肉中注入卡拉胶是属于掺杂掺假的违法行为。
工业化生产的卡拉胶主要有κ-，ι-和λ-三种构型，其中κ-卡拉胶应用较为广泛。畜肉中κ-卡拉胶检测方法主要有液相色谱串联质谱法、近红外透射光谱法和低场核磁共振技术。
CN106556654A公开了一种畜肉中κ-卡拉胶的液相色谱串联质谱检测方法，具体是通过对κ-卡拉胶水解产物κ-卡拉胶二糖进行二级质谱裂解，确定特征碎片离子，进行定性定量检测，从而确定样品中是否含有κ-卡拉胶。该方法虽然定性准确，但需要配置昂贵的液相色谱串联质谱，检测成本高，不利于批量检测和应用推广。有文献(孟一等.近红外光谱技术对猪肉注水、注胶的快速检测[J].食品科学,2014,35(8):299-303)报道近红外透射光谱法，将预测集注水肉和注胶肉的平均光谱分别导入注水量定量模型和注胶量定量模型，预测注水量和注胶量，以此来验证模型的准确性和可靠性。有文献(吴艺影等.基于低场核磁共振技术的注胶肉快速检测[J].肉类研究,2013,27(3):26-29)报道低场核磁共振技术，是利用氢原子核在磁场中的活动特性，可以追踪待测物质中的氢原子特别是水，包括结合水、不易流动水和自由水，观察水分分布状况及其随着时间的变化而产生的改变，从而获得生物材料中不同状态水分及其各自的相对含量等信息来判别注胶肉与正常肉。上述近红外光谱技术和低场核磁共振技术均需要昂贵的检测仪器设备，需要建立大量的观测数据和数学模型，对实验结果的分析需要很强的专业技术水平，检测成本高，不利于批量检测和应用推广。
κ-卡拉胶本身为高分子聚合物，无法直接使用液相色谱进行定量检测；因此需要对κ-卡拉胶水解，选择合适的衍生化试剂对水解产物κ-卡拉胶二糖进行衍生化，生成含有紫外吸收基团的衍生化物，才能满足液相色谱紫外检测器检测要求。目前尚未有文献报道使用液相色谱柱前衍生法检测畜肉中κ-卡拉胶。
发明内容
本发明的目的是提供一种畜肉中κ-卡拉胶的液相色谱检测方法，简单、快速、检测成本低、定量准确，适合在基层检测机构推广应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种畜肉中κ-卡拉胶的液相色谱检测方法，包括以下步骤：
S1.标准曲线系列溶液配制：取κ-卡拉胶标准物质，加入去离子水，分别配成浓度为1～50mg/L间至少5个浓度梯度的标准曲线系列溶液；
S2.样品水解：取畜肉粉碎成肉糜，加至离心管内，再加入盐酸，超声水解10min，再将样品水解液于8000rpm离心10min；
S3.衍生化：取200μL样品水解液上清液转移至离心管，加入0.5mol/L NaOH溶液100μL，0.5mol/L衍生化试剂1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮200μL，在70℃恒温水浴中反应60min，冷却至室温；标准曲线系列溶液分别量取200μL按本步骤处理；
S4.浓缩净化：向冷却后的衍生化试液中加入0.2mol/L盐酸溶液，调整pH至7.0，摇匀后，氮气吹干；加入0.5mL蒸馏水复溶，再加入1mL二氯甲烷，充分涡旋后8000rpm离心，弃去下层二氯甲烷，重复二氯甲烷净化操作三次；
S5.液相色谱检测：移取步骤S4中水相液体，滤膜过滤后注入液相色谱仪，记录色谱图；
液相色谱检测条件：色谱柱为C18柱，柱径2.1～4.6mm，柱长50～250mm，粒径1.8～5μm；流动相A为20mmol/L磷酸二氢钾水溶液，pH值7.8±0.1，流动相B为乙腈，流动相体积比为84～60:16～40，流动相流速为0.2～1.5mL/min；检测器为紫外检测器或二极管阵列检测器，检测波长245～250nm；进样量为5～20μL。
进一步地，所述畜肉为猪肉、羊肉或牛肉中的任一种。
进一步地，所述超声水解的工作频率为15～25KHz。
进一步地，所述色谱柱的柱径3.9mm，柱长150mm，粒径5μm。
进一步地，所述流动相A：流动相B体积比为62:38。
进一步地，所述流动相A、流动相B的分别为1.0mL/min。
进一步地，所述检测器为紫外检测器，检测波长248nm。
本发明的有益效果：
1.本发明采用了超声波辅助水解，水解过程仅需10min，极大地缩短了水解时间。
2.本发明采用了柱前衍生法，目标物可在C18色谱柱上得到有效分离，降低了杂质干扰。
3.本发明采用了柱前衍生法，衍生化试剂1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)中的紫外吸收基团使得目标物可被紫外检测器或二极管阵列检测器有效检出。
4.本发明重现性好、结果准确。
5.本发明所用检测设备仅需一台液相色谱仪，使用门槛较低，设备价格相对较低，使用成本低、便于在基层检测机构推广应用。
6.本发明方法可准确检测出畜肉样品中κ-卡拉胶的存在，对于完善畜肉中κ-卡拉胶检测标准体系，查处畜肉中违规添加κ-卡拉胶的行为有着重要意义。
附图说明
图1为牛肉空白样品液相色谱图；
图2为标准曲线系列溶液液相色谱图；
图3为添加有κ-卡拉胶的牛肉对照样品液相色谱图；
图4为标准曲线图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行详细、完整的描述，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例1
研究过程中，首先对牛肉样品进行水解，添加有κ-卡拉胶的对照样品中的κ-卡拉胶水解成κ-卡拉胶二糖；κ-卡拉胶二糖与PMP衍生化反应得到衍生化物。使用本发明采用的液相色谱检测方法绘制标准曲线，对牛肉空白样品和添加有κ-卡拉胶的牛肉对照样品进行检测，实验结果见图1-图4。结果显示，本发明采用的液相色谱检测方法能够简单、快速、准确地检测出牛肉样品中κ-卡拉胶的存在，而且检测成本低廉。
本申请确定了一种新的检测条件，是首次对畜肉中κ-卡拉胶的液相色谱检测方法，具体内容如下：
一种畜肉中κ-卡拉胶的液相色谱检测方法，检测条件：
1.色谱条件
色谱柱：Waters Symmetry C18柱(3.9mm×150mm，5μm)；
流动相A：20mmol/L磷酸二氢钾水溶液(三乙胺调节pH值至7.8±0.1)；
流动相B：乙腈；
流动相A：B体积比为62:38；
流动相流速：1.0mL/min；
检测器为紫外检测器，检测波长248nm；
进样量：10μL。
2.其他试验用品及试剂
超声波均质器：方需科技(上海)有限公司；
试验用水：密理博Merck Milli-Q超纯水机制得，电阻率≥18.2MΩ；
乙腈：美国TEDIA天地试剂公司；
κ-卡拉胶：上海麦克林生化科技有限公司；
PMP：上海麦克林生化科技有限公司；
其他化学试剂均购自国药集团化学试剂有限公司；
待测样品：牛肉。
3.具体实施时：
检测方法包括以下步骤：
S1.标准曲线系列溶液配置：取κ-卡拉胶标准物质，加入去离子水，分别配成浓度为1mg/L、2mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L、50mg/L 6个浓度梯度的标准曲线系列溶液；
S2.样品水解：取适量牛肉粉碎成肉糜，取2.0g加至50mL离心管内，再加入10mL0.2mol/L盐酸，于超声波均质器超声水解10min，样品水解液8000rpm离心10min；
S3.衍生化：取200μL样品水解液上清液转移至15mL离心管，加入0.5mol/L NaOH溶液100μL，0.5mol/L1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生化试剂200μL，在70℃恒温水浴中反应60min，冷却至室温；标准曲线系列溶液分别量取200μL按本步骤处理；
S4.浓缩净化：向冷却后的衍生化试液中加入适量0.2mol/L盐酸溶液，调整pH至7.0，摇匀后，氮气吹干；加入0.5mL蒸馏水复溶，再加入1mL二氯甲烷，充分涡旋后8000rpm离心，弃去下层二氯甲烷，重复二氯甲烷净化操作三次；
S5.液相色谱检测：移取步骤S4中水相液体，使用孔径为0.22μm的针式滤膜过滤，量取过滤后的液体10μL注入液相色谱仪，记录色谱图。
检测结果：如图1-图4所示，添加有κ-卡拉胶的牛肉对照样品中的κ-卡拉胶二糖衍生化物能够被液相色谱紫外检测器准确检出，其色谱图目标峰保留时间与标准曲线保留时间偏差符合要求。标准曲线线性良好，相关系数大于0.999。不同浓度添加样品的回收率范围在85.23％～111.05％，相对标准偏差范围在5.62％～10.43％。
表1牛肉样品检测精密度和准确度试验结果(n＝6)
实施例2
研究过程中，首先对猪肉样品进行水解，添加有κ-卡拉胶的对照样品中的κ-卡拉胶水解成κ-卡拉胶二糖；κ-卡拉胶二糖与PMP衍生化反应得到衍生化物。使用本发明采用的液相色谱检测方法绘制标准曲线，对猪肉空白样品和添加有κ-卡拉胶的猪肉对照样品进行检测。结果显示，本发明采用的液相色谱检测方法能够简单、快速、准确地检测出猪肉样品中κ-卡拉胶的存在，而且检测成本低廉。
本申请确定了一种新的检测条件，是首次对畜肉中κ-卡拉胶的液相色谱检测方法，具体内容如下：
一种畜肉中κ-卡拉胶的液相色谱检测方法，检测条件：
1.色谱条件
色谱柱：Waters Symmetry C18柱(3.9mm×150mm，5μm)；
流动相A：20mmol/L磷酸二氢钾水溶液(三乙胺调节pH值至7.8±0.1)；
流动相B：乙腈；
流动相A：B体积比为62:38；
流动相流速：1.0mL/min；
检测器为紫外检测器，检测波长248nm；
进样量：10μL。
2.其他试验用品及试剂
超声波均质器：方需科技(上海)有限公司；
试验用水：密理博Merck Milli-Q超纯水机制得，电阻率≥18.2MΩ；
乙腈：美国TEDIA天地试剂公司；
κ-卡拉胶：上海麦克林生化科技有限公司；
PMP：上海麦克林生化科技有限公司；
其他化学试剂均购自国药集团化学试剂有限公司；
待测样品：猪肉。
3.具体实施时：
检测方法包括以下步骤：
S1.标准曲线系列溶液配置：取κ-卡拉胶标准物质，加入去离子水，分别配成浓度为1mg/L、2mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L、50mg/L 6个浓度梯度的标准曲线系列溶液；
S2.样品水解：取适量猪肉粉碎成肉糜，取2.0g加至50mL离心管内，再加入10mL0.2mol/L盐酸，于超声波均质器超声水解10min，样品水解液8000rpm离心10min；
S3.衍生化：取200μL样品水解液上清液转移至15mL离心管，加入0.5mol/L NaOH溶液100μL，0.5mol/L1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生化试剂200μL，在70℃恒温水浴中反应60min，冷却至室温；标准曲线系列溶液分别量取200μL按本步骤处理；
S4.浓缩净化：向冷却后的衍生化试液中加入适量0.2mol/L盐酸溶液，调整pH至7.0，摇匀后，氮气吹干；加入0.5mL蒸馏水复溶，再加入1mL二氯甲烷，充分涡旋后8000rpm离心，弃去下层二氯甲烷，重复二氯甲烷净化操作三次；
S5.液相色谱检测：移取步骤S4中水相液体，使用孔径为0.22μm的针式滤膜过滤，量取过滤后的液体10μL注入液相色谱仪，记录色谱图。
检测结果：添加有κ-卡拉胶的猪肉对照样品中的κ-卡拉胶二糖衍生化物能够被液相色谱紫外检测器准确检出，其色谱图目标峰保留时间与标准曲线系列保留时间偏差符合要求。标准曲线线性良好，相关系数大于0.999。不同浓度添加样品的回收率范围在84.23％～108.70％，相对标准偏差范围在4.20％～10.40％。
表2猪肉样品检测精密度和准确度试验结果(n＝6)
结论：通过实验发现，本发明所采用的液相色谱检测方法，可以很好地检测出畜肉样品中的κ-卡拉胶，添加样品色谱图目标峰保留时间与标准曲线系列保留时间偏差符合要求，且空白样品在目标峰保留时间位置无干扰；填补了该领域技术的空白。
同时，本发明可作为畜肉中卡拉胶检测标准体系中的可选检测方法，成为畜肉中卡拉胶检测标准体系的重要组成部分；还可为畜肉中非法掺入其他胶种的检测方法研究工作提供思路。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，均应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种畜肉中κ-卡拉胶的液相色谱检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1.标准曲线系列溶液配制：取κ-卡拉胶标准物质，加入去离子水，分别配成浓度为1~50 mg/L间至少5个浓度梯度的标准曲线系列溶液；
S2.样品水解：取畜肉粉碎成肉糜，加至离心管内，再加入盐酸，超声水解10 min，再将样品水解液于8000 rpm离心10 min；
S3.衍生化：取200 μL样品水解液上清液转移至离心管，加入0.5 mol/L NaOH溶液100μL，0.5 mol/L衍生化试剂1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮200 μL，在70℃恒温水浴中反应60min，冷却至室温；标准曲线系列溶液分别量取200 μL按本步骤处理；
S4.浓缩净化：向冷却后的衍生化试液中加入0.2 mol/L盐酸溶液，调整pH至7.0，摇匀后，氮气吹干；加入0.5 mL蒸馏水复溶，再加入1 mL二氯甲烷，充分涡旋后8000 rpm离心，弃去下层二氯甲烷，重复二氯甲烷净化操作三次；
S5.液相色谱检测：移取步骤S4中水相液体，滤膜过滤后注入液相色谱仪，记录色谱图；
液相色谱检测条件：色谱柱为C18柱，柱径3.9mm，柱长150 mm，粒径5 μm；流动相A为20mmol/L磷酸二氢钾水溶液，pH值7.8±0.1，流动相B为乙腈，所述流动相A：流动相B的体积比为62:38，流动相流速为0.2~1.5 mL/min；检测器为紫外检测器或二极管阵列检测器，检测波长245~250 nm；进样量为5~20 μL。
2.根据权利要求1所述的一种畜肉中κ-卡拉胶的液相色谱检测方法，其特征在于：所述畜肉为猪肉、羊肉或牛肉中的任一种。
3.根据权利要求1所述的一种畜肉中κ-卡拉胶的液相色谱检测方法，其特征在于：所述超声水解的工作频率为15~25 KHz。
4.根据权利要求1所述的一种畜肉中κ-卡拉胶的液相色谱检测方法，其特征在于：所述流动相A、流动相B的分别流速为1.0 mL/min。
5.根据权利要求1所述的一种畜肉中κ-卡拉胶的液相色谱检测方法，其特征在于：所述检测器为紫外检测器，检测波长248 nm。
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