CN103852542B - 一种基于柱后衍生的低分子量肝素完全降解产物检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于柱后衍生的低分子量肝素完全降解产物检测方法，包括步骤为：将低分子量肝素降解得到完全酶解产物，经过离子对反相色谱进行分离，再进行柱后荧光衍生反应，随之进行荧光检测，分析得到完全酶解产物的组成。通过上述方式，本发明采用离子对反向色谱与柱后荧光衍生联用的方法，既为无紫外吸收的低分子量肝素提供可检测的荧光基团，又可以实现高灵敏度的荧光检测，对低分子量肝素仿制药的研发、生产控制和保障药品安全具有极大的实用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种低分子量肝素完全酶解产物的离子对反相色谱与柱后衍生结合的检测方法，属于药物、原料药、原料检测技术领域。
背景技术
肝素是一种高度硫酸化的线性糖胺聚糖，广泛存在于动物器官和组织中，通过与众多蛋白结合而在生物活性和生理过程中发挥着重要作用。肝素具有抗凝、抗炎、抗过敏、抗病毒、抗癌等生物学功能，并作为一种天然的抗凝血和抗血栓药物，广泛应用于临床疾病治疗，但在长期使用过程中，会引发诸如骨质疏松、血小板减少等副作用。低分子量肝素是肝素分级或由化学法、酶法降解而得到的分子量较小的片段，具有与普通肝素相同的二糖组成单元以及与抗凝血活性相关的五糖序列。低分子量肝素作为近年来国内外研究开发的新型抗血栓药物，与肝素相比，具有体内生物利用度高、半衰期长、副反应少、抗血栓作用强、使用方便和安全等优点，同时又可减轻或避免肝素的不良作用。
高效液相色谱是肝素分析的重要手段，具有分离效率高、分析时间短、样品需要量少、检测限低等特点。目前上市的三种主要低分子量肝素为依诺肝素钠、那屈肝素钙和达肝素钠，其中的依诺肝素钠因其特殊的非还原端结构在232nm下有特征性紫外吸收，而另外两种低分子量肝素既无强紫外吸收，又无荧光基团，故在其色谱检测前通常需要先进行衍生化，使之具有紫外吸收、荧光特性或其它一些可测定的物理化学性质。
荧光衍生与液相色谱结合具有高灵敏度、低检测限、简便可靠等特点，在糖类物质的研究中应用广泛。在肝素寡糖的分离过程中，由于硫酸基团的存在和寡糖本身不带有发色基团，使寡糖的分离和检测较为困难，需要对其进行衍生使其带上紫外或荧光基团，不仅可以提高检测的灵敏度，而且使寡糖带上的疏水基团能降低寡糖的极性，有利于其在反相色谱柱上分离。高效液相色谱中荧光检测器的灵敏度要比紫外检测器高出几个数量级，更适合痕量分析。
柱前荧光衍生是在样品分离之前进行荧光衍生，再根据衍生物性质进行色谱分离和检测。此种方法的缺点是操作过程比较繁琐，容易影响分析的准确性和重复性，衍生反应的副产物可能会对色谱分离造成较大干扰，影响分析结果。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种基于柱后衍生的低分子量肝素完全降解产物检测方法，该方法操作简单、重复性好、分析结果准确。
为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种基于柱后衍生的低分子量肝素完全降解产物检测方法，步骤为：将低分子量肝素降解得到完全酶解产物；将所述完全酶解产物经过离子对反相色谱进行分离，再进行柱后荧光衍生反应，最后进行荧光检测，分析完全酶解产物组成。
在本发明一个较佳实施例中，所述降解过程为用肝素酶I、II和III在20～30℃下降解46～50 h，降解产物经超滤膜过滤后真空减压干燥得到完全酶解产物。
在本发明一个较佳实施例中，所述离子对反相色谱法的过程为在流速为1～5mL/min下用第一流动相和第二流动相洗脱，在流速为0.1～0.8mL/min下用第三流动相和第四流动相进行柱后荧光衍生反应。
在本发明一个较佳实施例中，所述第一流动相的配制过程为将烷基铵类试剂和氯化钠溶于乙腈或甲醇中得到烷基铵类试剂浓度为2～10mM、氯化钠浓度为0.1～0.5M的第一流动相，所述第一流动相的pH值为5.0～6.5。
在本发明一个较佳实施例中，所述第二流动相的配制过程为将烷基铵类试剂和氯化钠溶于乙腈或甲醇中得到烷基铵类试剂浓度为2～10mM、氯化钠浓度为0.4～1.5M的第一流动相，所述第二流动相的pH值为5.0～6.5。
在本发明一个较佳实施例中，所述第三流动相的配制过程为将2-氰基乙酰胺溶解于去离子水中，得到2-氰基乙酰胺质量百分比为1%～5%的第三流动相。
在本发明一个较佳实施例中，所述第四流动相的配制过程为将氢氧化钠溶解于去离子水中，得到氢氧化钠浓度为0.2～1.0M的第四流动相。
在本发明一个较佳实施例中，所述荧光检测的条件为激发波长为346nm，发射波长为410nm。
在本发明一个较佳实施例中，所述分析过程是以8种肝素二糖标准品为对照，对低分子量肝素标准品完全酶解产物和样品完全酶解产物的色谱峰进行归属，以低分子量肝素标准品为参照，比较标准品和样品之间的异同点，分析样品完全酶解产物组成，其中8种二糖标准品分别为ΔUA-GlcNAc、ΔUA-GlcNS、ΔUA-GlcNAc6S、ΔUA2S-GlcNAc、ΔUA-GlcNS6S、ΔUA2S-GlcNS、ΔUA2S-GlcNAc6S、ΔUA2S-GlcNS6S。
本发明的有益效果是：本发明的基于柱后衍生的低分子量肝素完全降解产物检测方法，采用离子对反向色谱与柱后荧光衍生联用的方法，既为无紫外吸收的低分子量肝素提供可检测的荧光基团，又可以实现高灵敏度的荧光检测，谱图中样品响应值更高，具有样品前处理简单、重复性好、分析自动化程度高等优点，对低分子量肝素仿制药的研发、生产控制和保障药品安全具有极大的实用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：
图1是本发明中的8个肝素二糖标准品混合物的荧光检测图；
图2是本发明中的依诺肝素钠标准品完全酶解产物的荧光检测图；
图3是本发明中的依诺肝素钠样品完全酶解产物的荧光检测图；
图4是本发明中的8个肝素二糖标准品混合物、依诺肝素钠标准品完全酶解产物和依诺肝素钠样品完全酶解产物的荧光检测对比图；
图5是本发明中的达肝素钠标准品完全酶解产物的荧光检测图；
图6是本发明中的达肝素钠样品完全酶解产物的荧光检测图；
图7是本发明中的8个肝素二糖标准品混合物、达肝素钠标准品完全酶解产物和达肝素钠样品完全酶解产物的荧光检测对比图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
提供一种低分子量肝素完全酶解产物的检测方法，包括步骤为：
（1）将低分子量肝素钠用肝素酶I、II和III在25℃下降解48 h，降解产物经超滤膜过滤后真空减压干燥，然后用去离子水配制成1mg/mL的待测溶液。
（2）第一流动相的配制：将四丁基硫酸氢铵、氯化钠溶解于体积百分比为8%的乙腈溶液中，制得四丁基硫酸氢铵浓度为5mM、氯化钠浓度为0.1M的第一流动相，并将pH调至5.5。
第二流动相的配制：将四丁基硫酸氢铵、氯化钠溶解于体积百分比为8%的乙腈溶液中，制得四丁基硫酸氢铵浓度为5mM、氯化钠浓度为0.5M的第二流动相，并将pH调至5.5。
第三流动相的配制：将2-氰基乙酰胺溶解于去离子水中，制得2-氰基乙酰胺质量百分比为2%的第三流动相。
第四流动相的配制：将氢氧化钠溶解于去离子水中，制得氢氧化钠浓度为0.65M的第四流动相。
反相色谱条件：采用填料粒径为5μm、色谱柱内径为4.6mm、色谱柱长度为250mm的Supelco
Discovery C18反相色谱柱；在流速为1mL/min，洗脱梯度为0-30min，100-20%第一流动相，0-80%第二流动相；30-60 min，20-0%第一流动相，80-100%第二流动相；在流速为0.1mL/min，用第三流动相和第四流动相对样品进行柱后荧光衍生反应；所述荧光检测的条件为激发波长为346nm，发射波长为410nm。
系统适用性：二糖标准品各色谱峰的拖尾因子不大于1.5；标准品重复进样5次，峰面积的相对标准偏差不大于2.0%；二糖标准品的理论塔板数应不小于3000。
进样：8种肝素二糖标准品进样5次，其中8种二糖标准品分别为ΔUA-GlcNAc、ΔUA-GlcNS、ΔUA-GlcNAc6S、ΔUA2S-GlcNAc、ΔUA-GlcNS6S、ΔUA2S-GlcNS、ΔUA2S-GlcNAc6S、ΔUA2S-GlcNS6S；依诺肝素钠标准品完全酶解产物连续进样3次，依诺肝素钠样品完全酶解产物进样3次；达肝素钠标准品完全酶解产物连续进样3次，达肝素钠样品完全酶解产物分别进样3次。
（3）采用柱后荧光衍生方法，所述柱后衍生反应是在色谱系统内部进行的，反应原理为2-氰基乙酰胺与寡糖的醛基在弱碱环境下共热，产生具有强荧光的产物，流经带有荧光检测器的高效液相色谱仪，检测器在激发波长为346nm、发射波长为410nm的条件下进行检测。
请参阅图1～7，以8种肝素二糖标准品为对照，对低分子量肝素标准品完全酶解产物以及样品完全酶解产物的色谱峰进行归属，以低分子量肝素标准品完全酶解产物为参照，比较标准品和样品之间的异同点，分析样品完全酶解产物组成。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (4)
1.一种基于柱后衍生的低分子量肝素完全降解产物检测方法， 其特征在于， 步骤为：将低分子量肝素降解得到完全酶解产物 ； 将所述完全酶解产物经过离子对反相色谱进行分离， 再进行柱后荧光衍生反应， 最后进行荧光检测， 分析完全酶解产物组成，其中所述离子对反相色谱法的过程为在流速为 1mL/min 下用第一流动相和第二流动相洗脱，在流速为0.1～0.8mL/min下用第三流动相和第四流动相进行柱后荧光衍生反应，所述降解过程为用肝素酶 I、II 和III在20～30℃下降解46～50 h， 降解产物经超滤膜过滤后真空减压干燥得到完全酶解产物；
反相色谱条件包括采用填料粒径为5μm、色谱柱内径为4.6mm、色谱柱长度为250mm的Supelco Discovery C18反相色谱柱，在流速为1mL/min，洗脱梯度为0-30min，100-20%第一流动相，0-80%第二流动相；30-60 min，20-0%第一流动相，80-100%第二流动相；
所述第一流动相的配制过程为将烷基铵类试剂和氯化钠溶于乙腈或甲醇中得到烷基铵类试剂浓度为2～10mM、 氯化钠浓度为0.1 ～ 0.5M的第一流动相， 所述第一流动相的 pH 值为 5.0 ～ 6.5； 所述第二流动相的配制过程为将烷基铵类试剂和氯化钠溶于乙腈或甲醇中得到烷基铵类试剂浓度为2～10mM、 氯化钠浓度为0.4 ～ 1.5M的第二流动相， 所述第二流动相的 pH 值为 5.0 ～ 6.5。
2.根据权利要求 1 所述的检测方法， 其特征在于，
所述第三流动相的配制过程为将2- 氰基乙酰胺溶解于去离子水中， 得到 2- 氰基乙酰胺质量百分比为 2% ～ 5% 的第三流动相。
3.根据权利要求 1 所述的检测方法， 其特征在于，
所述第四流动相的配制过程为将氢氧化钠溶解于去离子水中，得到氢氧化钠浓度为0.2～1.0M的第四流动相。
4.根据权利要求 1 所述的检测方法， 其特征在于，
所述分析过程是以 8 种肝素二糖标准品为对照， 对低分子量肝素标准品完全酶解产物和样品完全酶解产物的色谱峰进行归属， 以低分子量肝素标准品为参照， 比较标准品和样品之间的异同点， 分析样品完全酶解产物组成， 其中 8 种二糖标准品分别为 ΔUA-GlcNAc、ΔUA-GlcNS、ΔUA-GlcNAc6S、ΔUA2S-GlcNAc、 ΔUA-GlcNS6S、 ΔUA2S-GlcNS、 ΔUA2S-GlcNAc6S、 ΔUA2S-GlcNS6S。
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