CN103698426B - 一种降解获得及检测硫酸软骨素和透明质酸二糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药领域涉及一种降解获得及检测硫酸软骨素和透明质酸二糖的方法，包括如下步骤：(1)将硫酸软骨素或透明质酸脱乙酰化，得脱乙酰产物；(2)将脱乙酰产物亚硝酸降解，得硫酸软骨素二糖或透明质酸二糖；(3)将二糖浓缩至干，溶解于水中，调节pH值为碱性，加入吡唑啉酮类衍生试剂，反应完成后用氯仿萃取三次去除多余的衍生试剂；(4)用液相色谱(LC)法或液相色谱质谱联用(LC-MS)法检测衍生后的二糖。本发明化学降解法可将硫酸软骨素或透明质酸完全降解为二糖，可以保存全部的糖醛酸信息，降解条件温和，成本低，操作简单，对实验仪器要求低，检测耗时短，样品消耗量小，灵敏度高，分析结果重复性好。
Description
技术领域
本发明属于医药领域涉及一种降解获得及检测硫酸软骨素和透明质酸二糖的方法。
背景技术
硫酸软骨素(CS)是一类由糖醛酸(葡萄糖醛酸，GlcA或艾杜糖醛酸，IdoA)和N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)为二糖重复单元组成的有硫酸根修饰的线性高分子多糖，GlcA与GalNAc以β-1，3糖苷键相连，IdoA与GalNAc以α-1，3糖苷键相连，双糖单位之间由β-1，4糖苷键相连，包括硫酸软骨素A(CSA)、硫酸软骨素B(CSB)、硫酸软骨素C(CSC)、硫酸软骨素D(CSD)和硫酸软骨素E(CSE)等。已有相关的药物或是保健品上市，如硫酸软骨素片、硫酸软骨素注射液、硫酸软骨素滴眼液、硫酸软骨素胶囊等。不同种类的硫酸软骨素硫酸化程度及硫酸根位置不同，CSA的二糖单位是GlcA-GalNAc4S，主要来源于软骨；CSB的主要二糖单位是IdoA-GalNAc4S，来源于皮肤；CSC的二糖单位是GlcA-GalNAc6S，来源于鲨鱼软骨；CSD的二糖单位是GlcA2S-GalNAc6S，来源于海胆。
透明质酸(Hyaluronic acid，HA)是糖胺聚糖中的一种，属于酸性粘多糖，广泛分布于人体各部位。透明质酸是由葡萄糖糖醛酸(GlcA)和N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)为二糖重复单元组成的高分子线形多糖。GlcA与GlcNAc之间由β-1，3糖苷键相连，双糖单位之间由β-1，4糖苷键相连。分子中两种单糖按1∶1的摩尔比组成，双糖单位可达25000之多，在体内透明质酸的分子量从5KDa到20000KDa不等。透明质酸有多种生物功能，已被开发成多种药物用于眼睛外科手术、关节修复注射液、伤口愈合、外科手术防粘剂等。尤为重要的是，透明质酸具有特殊的保水作用。透明质酸由于其具有独特理化性质和生理功能，在生物材料方面亦得到了广泛应用。
分析不同类型的CS和HA，主要是对其二糖组成进行分析。传统的分析方法是用相应的裂解酶，如硫酸软骨素酶ABC降解，通过强阴离子交换柱分离不同二糖，与市售的二糖标准品比对保留时间进行定性，再通过各二糖标准品对检测器响应值和物质的量的标准曲线进行含量分析，从而确定该多糖的结构。如王皓等采用离子交换色谱从Wistar大鼠肾脏中提取糖胺聚糖，用软骨素酶ABC降解糖胺聚糖中的硫酸软骨素组分，对二糖组成分析(王皓，于广利，赵峡，等.大鼠肾脏糖胺聚糖的种类及二糖组成分析[J].光谱学与光谱分析,2010(9)：2484～2487.)。对于透明质酸的分析，鲍伦军等建立了一种用软骨素酶ABC酶解-高效液相色谱测定鱼翅中的HA的方法(鲍伦军，杨建成，何振华，等.软骨素酶ABC酶解高效液相色谱法测定鱼翅中的透明质酸[J].色谱,2002(06)：557～559.)。但是用酶降解硫酸软骨素时，葡萄糖醛酸(GlcA)及艾杜糖醛酸(IdoA)脱水后形成结构相同的脱水糖醛酸，从而失去了硫酸软骨素中葡萄糖醛酸(GlcA)及艾杜糖醛酸(IdoA)的相对含量信息，而且裂解酶不能将CS或HA完全降解为二糖。酶、强阴离子交换柱和二糖标准品都非常昂贵，并且酶容易失活、性质不稳定，检测步骤繁琐，样品消耗量大，检测时间长，分析结果的重复性差。所以亟需一种高效、操作简单、稳定的检测CS和HA二糖的方法。
发明内容
针对以上现有技术存在的不足，本发明提供一种全面、高效、简单、稳定且成本低的检测硫酸软骨素二糖和透明质酸二糖的方法，本发明的另一目的是提供一种可将硫酸软骨素和透明质素完全降解为相应二糖化学降解方法。
实现上述发明的技术方案是：
1.一种检测硫酸软骨素和透明质酸二糖的方法，包括如下步骤：
(1)将硫酸软骨素或透明质酸脱乙酰化，得脱乙酰硫酸软骨素或脱乙酰透明质酸；
(2)将步骤(1)所得脱乙酰硫酸软骨素或脱乙酰透明质酸亚硝酸降解，得硫酸软骨素二糖或透明质酸二糖；
(3)将步骤(2)所得二糖浓缩至干，溶解于水中，调节pH值为碱性，加入吡唑啉酮类衍生试剂，反应完成后用氯仿萃取三次去除多余的衍生试剂；
(4)用液相色谱(LC)法或液相色谱质谱联用(LC-MS)法检测步骤(3)所得衍生后的二糖。
步骤(3)衍生反应方程式为：
当X＝H，Y＝H时，反应物为PMP；当Y＝H，X＝D时，反应物为D3PMP；当Y＝D，X＝H时，反应物为D5PMP；当Y＝D，X＝D时，反应物为D8PMP。式中的二糖可以是以下提到的任意二糖。
2.一种检测硫酸软骨素和透明质酸二糖的方法，步骤(1)所述的脱乙酰化反应步骤包括：
将硫酸软骨素或透明质酸溶于含有N2H4·H2SO4的N2H4·H2O溶液中，加热使其溶解，然后密封加热到90-110℃，反应5-16h，反应完成后，冻干，除去N2H4得脱乙酰硫酸软骨素或脱乙酰透明质酸。
3.一种检测硫酸软骨素和透明质酸二糖的方法，步骤(2)所述的亚硝酸降解反应步骤包括：
将脱乙酰硫酸软骨素或脱乙酰透明质酸浓缩至干，溶于水中，加入pH为1.5的亚硝酸钠水溶液，在0-5℃条件下反应，调节pH到4.0，加入pH为4.0的亚硝酸，在0-5℃条件下反应，加入氨水终止反应，得硫酸软骨素二糖或透明质酸二糖。
硫酸软骨素脱乙酰及亚硝酸降解反应方程式为：
透明质酸脱乙酰及亚硝酸降解反应方程式为：
本发明与现有技术相比具有以下优点：
(1)可将硫酸软骨素和透明质酸完全降解为二糖，可以保存全部的糖醛酸信息，能够准确并且全面地得到二糖的结构信息。
(2)降解条件温和，成本低，操作简单，对实验仪器要求低。
(3)检测耗时短，可以同时对多种样品进行定量。
(4)样品消耗量小，灵敏度高，分析结果重复性好，每次进样量为ng级别。
附图说明
图1为硫酸软骨素A化学降解所得二糖的D3PMP衍生LC图谱。
图2为硫酸软骨素A和C二糖的PMP、D3PMP、D5PMP、D8PMP衍生总离子流图(A)质谱图(B)。
图3为硫酸软骨素D二糖的D3PMP、D5PMP、D8PMP衍生总离子流图(A)质谱图(B)。
图4为硫酸软骨素E二糖的PMP、D3PMP、D8PMP衍生总离子流图(A)质谱图(B)。
图5为硫酸软骨素A和B二糖的D3PMP、D8PMP衍生总离子流图(A)质谱图(B)。
图6为透明质酸二糖的PMP衍生总离子流图(A)质谱图(B)。
具体实施方式
实施例1-6中硫酸软骨素和透明质酸均购自Sigma公司。
实施例1硫酸软骨素类样品二糖的化学降解方法
(1)将1mg硫酸软骨素溶于500uL含有10％N2H4·H2SO4的N2H4·H2O溶液中，加热使其溶解，然后密封加热到98℃，反应9小时，反应完成后，冻干，除去N2H4得脱乙酰硫酸软骨素；
(2)将步骤(1)所得脱乙酰硫酸软骨素溶于50uL水中，加入50uLpH为1.5的亚硝酸钠水溶液，在0-5℃条件下反应10min后调节pH到4.0，加入50uL pH为4.0的亚硝酸，在0-5℃条件下反应10min，加入30uL氨水终止反应。
实施例2硫酸软骨素类样品二糖的化学降解方法
(1)将1mg硫酸软骨素溶于1mL含有10％N2H4·H2SO4的N2H4·H2O溶液中，加热使其溶解，然后密封加热到90℃，反应5小时，反应完成后，冻干，除去N2H4得脱乙酰硫酸软骨素；
(2)将步骤(1)所得脱乙酰硫酸软骨素溶于50uL水中，加入50uL pH为1.5的亚硝酸钠水溶液，在0-5℃条件下反应10min后调节pH到4.0，加入50uL pH为4.0的亚硝酸，在0-5℃条件下反应10min，加入30uL氨水终止反应。
实施例3硫酸软骨素类样品二糖的化学降解方法
(1)将1mg硫酸软骨素溶于1mL含有10％N2H4·H2SO4的N2H4·H2O溶液中，加热使其溶解，然后密封加热到110℃，反应16小时，反应完成后，冻干，除去N2H4得脱乙酰硫酸软骨素；
(2)将步骤(1)所得脱乙酰硫酸软骨素溶于50uL水中，加入50uLpH为1.5的亚硝酸钠水溶液，在0-5℃条件下反应10min后调节pH到4.0，加入50uL pH为4.0的亚硝酸，在0-5℃条件下反应10min，加入30uL氨水终止反应。
表1硫酸软骨素化学降解产物分析
结果表明，实施例1和实施例3可以将CS完全化学降解，且实施例1所用的时间比实施例3节省了43.8％。实施例2的化学降解产物中仍有5.4％的聚合度大于2的寡糖存在。
实施例4透明质酸类样品二糖的化学降解方法
(1)将1mg透明质酸溶于500uL含有10％N2H4·H2SO4的N2H4·H2O溶液中，加热使其溶解，然后密封加热到98℃，反应9小时，反应完成后，冻干，除去N2H4得脱乙酰透明质酸；
(2)将步骤(1)所得脱乙酰透明质酸溶于50uL水中，加入50uLpH为1.5的亚硝酸钠水溶液，在0-5℃条件下反应10min后调节pH到4.0，加入50uL pH为4.0的亚硝酸，在0-5℃条件下反应10min，加入30uL氨水终止反应。
实施例5透明质酸类样品二糖的化学降解方法
(1)将1mg透明质酸溶于1mL含有10％N2H4·H2SO4的N2H4·H2O溶液中，加热使其溶解，然后密封加热到110℃，反应16小时，反应完成后，冻干，除去N2H4得脱乙酰透明质酸；
(2)将步骤(1)所得脱乙酰透明质酸溶于50uL水中，加入50uLpH为1.5的亚硝酸钠水溶液，在0-5℃条件下反应10min后调节pH到4.0，加入50uLpH为4.0的亚硝酸，在0-5℃条件下反应10min，加入30uL氨水终止反应。
实施例6透明质酸素类样品二糖的化学降解方法
(1)将1mg透明质酸溶于1mL含有10％N2H4·H2SO4的N2H4·H2O溶液中，加热使其溶解，然后密封加热到90℃，反应5小时，反应完成后，冻干，除去N2H4得脱乙酰透明质酸；
(2)将步骤(1)所得脱乙酰透明质酸溶于50uL水中，加入50uLpH为1.5的亚硝酸钠水溶液，在0-5℃条件下反应10min后调节pH到4.0，加入50uLpH为4.0的亚硝酸，在0-5℃条件下反应10min，加入30uL氨水终止反应。
表2透明质酸化学降解产物分析
结果表明，实施例4和实施例5可以将HA完全化学降解，且实施例4所用的时间比实施例5节省了43.8％。实施例6的化学降解产物中仍有3.6％的聚合度大于2的寡糖存在。
实施例7-13中所涉及的化学降解产物的结构及简称：
实施例7-13中在质谱中检测到的质量数：
表3不同硫酸软骨素/透明质酸二糖中在质谱中的质量数
实施例7硫酸软骨素A化学降解所得二糖的D3PMP衍生及LC检测
硫酸软骨素A(CSA)购自Sigma公司
(1)将100ug硫酸软骨素A溶于50uL含有10％N2H4·H2SO4的N2H4·H2O溶液中，加热使其溶解，然后密封加热到98℃，反应9小时，反应完成后，冻干，除去N2H4得脱乙酰硫酸软骨素A；将所得脱乙酰硫酸软骨素A溶于50uL水中，加入50uL pH为1.5的亚硝酸钠水溶液，在0-5℃条件下反应10min后调节pH到4.0，加入50uLpH为40的亚硝酸，在0-5℃条件下反应10min，加入30uL氨水终止反应。
(2)取步骤(1)所得二糖浓缩至干并完全溶解于50uL水中，调节pH值为8，然后加入7uL0.5mol/LD3PMP于70℃条件下密封反应60min，反应完成后用氯仿萃取三次去除未反应的衍生试剂。
(3)LC分析，液相柱0.3×250mm SB-C18柱(5um，Agilent)，流速15uL/min，流动相A为0.01mol/L乙酸铵溶液，流动相B为乙腈，上样量为0.02uL。流动相12％B15min，12％B30min线性增加到20％B，20％B15min，紫外检测器DAD245nm检测。结果见图1。
结果显示，硫酸软骨素A化学降解一共得到1种产物G0T4与理论一致，且该产物在色谱图中显示了很好的峰形。
实施例8硫酸软骨素A及硫酸软骨素C化学降解所得二糖的PMP、D3PMP、D5PMP、D8PMP衍生及LC-MS检测
硫酸软骨素A1，硫酸软骨素A2(CSA1，CSA2)分别购自Sigma公司和Seikagaku公司。
硫酸软骨素C1，硫酸软骨素C2(CSC1，CSC2)分别购自Sigma公司和Seikagaku公司。
(1)取两种不同来源硫酸软骨素A和两种不同来源的硫酸软骨素C各100ug，分别用硫酸软骨素A1，硫酸软骨素A2，硫酸软骨素C1，硫酸软骨素C2表示，按实施例4步骤(1)进行反应。
(2)用PMP、D3PMP、D5PMP和D8PMP按实施例4步骤(2)对降解产物进行衍生，其中硫酸软骨素A1用70uL0.5mol/L PMP衍生，硫酸软骨素A2用70uL0.5mol/L D3PMP衍生，硫酸软骨素C1用70uL0.5mol/L D5PMP衍生，硫酸软骨素C2用70uL0.5mol/L D8PMP衍生。
(3)LC-MS分析，液相柱0.3×250mm SB-C18柱(5um,Agilent)，流速15uL/min，流动相A为0.01mol/L乙酸铵溶液，流动相B为乙腈，上样量为0.02uL。流动相12％B15min，12％B30min线性增加到20％B，20％B15min，紫外检测器DAD245nm检测。上样时将四种衍生产物等量混合上样，上样量为0.02uL。质谱条件：LTQ-XL质谱仪，负离子检测模式。结果见图2。
从图2A的总离子流图中可知，总共得到了2种降解产物。从图2B的各个二糖的质谱图可知，硫酸软骨素A1、A2、C1、C2的二糖组成含量不同，每个质谱图有4组峰，从左至右分别代表硫酸软骨素A1，A2，C1，C2。通过计算相对丰度可知，以硫酸软骨素A1的所有二糖为100％，硫酸软骨素A2中G0T4含量为81％，G0T6含量为93％，硫酸软骨素C1中G0T4含量为41％，G0T6含量为244％，硫酸软骨素C2中G0T4含量为39％，G0T6含量为220％。由此可知，硫酸软骨素A中主要含有G0T4，硫酸软骨素C中主要含有G0Y6。
实施例9硫酸软骨素D化学降解所得二糖的D3PMP、D5PMP、D8PMP衍生及LC-MS检测
硫酸软骨素D1，D2，D3(CSD1，CSD2，CSD3)分别提取自本实验室三种鲨鱼软骨组织。
(1)取3种不同来源硫酸软骨素D各100ug，分表用硫酸软骨素D1，D2，D3表示，按实施例4步骤(1)进行反应。
(2)用D3PMP、D5PMP、和D8PMP按实施例4步骤(2)对降解产物进行衍生，其中硫酸软骨素D1用50ul0.5mol/L D3PMP衍生，硫酸软骨素D2用50ul0.5mol/L D5PMP衍生，硫酸软骨素D3用50ul0.5mol/LD8PMP衍生。
(3)LC-MS分析，液相柱0.3×250mm SB-C18柱(5um，Agilent)，流速15uL/min，流动相A为0.01mol/L乙酸铵溶液，流动相B为乙腈，上样量为0.02uL。流动相12％B15min，12％B30min线性增加到20％B，20％B15min，紫外检测器DAD245nm检测。上样时将三种衍生产物等量混合上样，上样量为0.02uL。质谱条件：LTQ-XL质谱仪，负离子检测模式。结果见图3。
从图3A的总离子流图中可知，总共得到了3种降解产物。从图3B的各个二糖的质谱图可知，硫酸软骨素D1、D2、D3的二糖组成含量不同，每个质谱图有3组峰，从左至右分别代表硫酸软骨素D1，D2，D3。通过计算相对丰度可知，以硫酸软骨素D2的所有二糖为100％，硫酸软骨素D1中G2T6的含量为84％，G0T4含量为83％，G0T6含量为91％，硫酸软骨素D3中G2T6的含量为89％，G0T4含量为89％，G0T6含量为90％。
实施例10硫酸软骨素E化学降解所得二糖的PMP、D3PMP、D8PMP衍生及LC-MS检测方法
硫酸软骨素E1，E2，E3(CSE1，CSE2，CSE3)分别提取自本实验室三种鲨鱼软骨组织。
(1)取3种不同来源硫酸软骨素E各100ug，分表用硫酸软骨素E1，E2，E3表示，按实施例4步骤(1)进行反应。(2)用PMP、D3PMP、和D8PMP按实施例4步骤(2)对降解产物进行衍生，其中硫酸软骨素E1用50ul0.5mol/L PMP衍生，硫酸软骨素E2用50ul0.5mol/L D3PMP衍生，硫酸软骨素E3用50ul0.5mol/L D8PMP衍生。
(3)LC-MS分析，液相柱0.3×250mm SB-C18柱(5um，Agilent)，流速15uL/min，流动相A为0.01mol/L乙酸铵溶液，流动相B为乙腈，上样量为0.02uL。流动相12％B15min，12％B30min线性增加到20％B，20％B15min，紫外检测器DAD245nm检测。上样时将三种衍生产物等量混合上样，上样量为0.02uL。质谱条件：LTQ-XL质谱仪，负离子检测模式。结果见图4。
从图4A的总离子流图中可知，总共得到了3种降解产物。从图4B的各个二糖的质谱图可知，硫酸软骨素E1、E2、E3的二糖组成含量不同，每个质谱图有3组峰，从左至右分别代表硫酸软骨素E1，E2，E3。通过计算相对丰度可知，以硫酸软骨素E1的所有二糖为100％，硫酸软骨素E2中G0T10的含量为81％，G0T4含量为85％，G0T6含量为93％，硫酸软骨素E3中G0T10的含量为82％，G0T4含量为88％，G0T6含量为92％。
实施例11硫酸软骨素A和硫酸软骨素B化学降解所得二糖的D3PMP、D8PMP衍生及LC-MS检测硫酸软骨素A(CSA)购自Sigma公司，硫酸软骨素B(CSB)购自Celsus laboratories公司。
(1)取硫酸软骨素A和硫酸软骨素B各100ug，按实施例4步骤(1)进行反应。
(2)用D3PMP、和D8PMP按实施例4步骤(2)对降解产物进行衍生，其中硫酸软骨素B用50ul0.5mol/LD3PMP衍生，硫酸软骨素A用50ul0.5mol/L D8PMP衍生。
(3)LC-MS分析，液相柱0.3×250mm SB-C18柱(5um,Agilent)，流速15uL/min，流动相A为0.01mol/L乙酸铵溶液，流动相B为乙腈，上样量为0.02uL。流动相12％B15min，12％B30min线性增加到20％B，20％B15min，紫外检测器DAD245nm检测。上样时将两种衍生产物等量混合上样，上样量为0.02uL。质谱条件：LTQ-XL质谱仪，负离子检测模式。结果见图5。
从图5A的总离子流图中可知，总共得到了4种降解产物。从图5B的各个二糖的质谱图可知，硫酸软骨素A、D的二糖组成含量不同，每个质谱图有2组峰，从左至右分别代表硫酸软骨素A和硫酸软骨素B。通过计算相对丰度可知，以硫酸软骨素A的所有二糖为100％，硫酸软骨素B中G0T4含量为65％，G0T6含量为79％。硫酸软骨素B中还含有I2T4和I0T4，而硫酸软骨素A中没有。
实施例12硫酸软骨素A和硫酸软骨素C化学降解所得二糖的PMP、D8PMP标记及LC-MS检测方法硫酸软骨素C(CSC)，硫酸软骨素A(CSA)均购自Sigma公司。
(1)取硫酸软骨素A和硫酸软骨素C各100ug，按实施例4步骤(1)进行反应。
(2)用PMP和D8PMP按实施例4步骤(2)对降解产物进行衍生，其中硫酸软骨素C用50ul0.5mol/L PMP衍生，硫酸软骨素A用50ul0.5mol/L D8PMP衍生。
(3)LC-MS分析，液相柱0.3×250mm SB-C18柱(5um，Agilent)，流速15uL/min，流动相A为0.01mol/L乙酸铵溶液，流动相B为乙腈，上样量为0.02uL。流动相12％B15min，12％B30min线性增加到20％B，20％B15min，紫外检测器DAD245nm检测。上样时将两种衍生产物等量混合上样，上样量为0.02uL。质谱条件：LTQ-XL质谱仪，负离子检测模式。结果见表4。
表4
结果显示：CSC中含有的二糖主要为G0T6，CSA中主要含有G0T4。
实施例13透明质酸化学降解所得二糖的PMP标记及LC-MS检测
透明质酸购自Sigma公司。
(1)将100ug透明质酸溶于50uL含有10％N2H4·H2SO4的N2H4·H2O溶液中，加热使其溶解，然后密封加热到98℃，反应9小时，反应完成后，冻干，除去N2H4得脱乙酰透明质酸，将脱乙酰透明质酸溶于50uL水中，加入50uLpH为1.5的亚硝酸钠水溶液，在0-5℃条件下反应10min后调节pH到4.0，加入50uLpH为4.0的亚硝酸，在0-5℃条件下反应10min，加入30uL氨水终止反应。
(2)用50ul0.5mol/L PMP按实施例4步骤(2)对降解产物进行衍生。
(3)LC-MS分析，液相柱0.3×250mm SB-C18柱(5um,Agilent)，流速15uL/min，流动相A为0.01mol/L乙酸铵溶液，流动相B为乙腈，上样量为0.02uL。流动相12％B15min，12％B30min线性增加到20％B，20％B15min，紫外检测器DAD245nm检测。上样时将两种衍生产物等量混合上样，上样量为0.02uL。质谱条件：LTQ-XL质谱仪，负离子检测模式。结果见图6。
结果显示，HA中含有的二糖为G0m0，与理论一致。
Claims (5)
1.一种检测硫酸软骨素和透明质酸二糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将硫酸软骨素或透明质酸脱乙酰化，得脱乙酰硫酸软骨素或脱乙酰透明质酸；
(2)将步骤(1)所得脱乙酰硫酸软骨素或脱乙酰透明质酸亚硝酸降解，得硫酸软骨素二糖或透明质酸二糖
将脱乙酰硫酸软骨素或脱乙酰透明质酸浓缩至干，溶于水中，加入pH为1.5的亚硝酸钠水溶液，在0-5℃条件下反应，调节pH到4.0，加入pH为4.0的亚硝酸，在0-5℃条件下反应，加入氨水终止反应，得硫酸软骨素二糖或透明质酸二糖，所述的脱乙酰硫酸软骨素或脱乙酰透明质酸水溶液与亚硝酸钠水溶液、亚硝酸、氨水的体积比为1∶1∶1∶0.6；
(3)将步骤(2)所得二糖浓缩至干，溶解于水中，调节pH值为碱性，加入吡唑啉酮类衍生试剂，反应完成后用氯仿萃取三次去除多余的衍生试剂；
(4)用液相色谱(LC)法或液相色谱质谱联用(LC-MS)法检测步骤(3)所得衍生后的二糖；
液相色谱和质谱条件包括，液相柱：Agilent 0.3mm×250mm×5μm SB-C18柱，流速15μL/min；流动相A为0.01mol/L乙酸铵溶液，流动相B为乙腈，流动相12％B15min，12％B30min线性增加到20％B，20％B15min；上样量为0.02μL；紫外检测器DAD 245nm检测或MS检测器；质谱为负离子检测模式。
2.如权利要求1所述的一种检测硫酸软骨素和透明质酸二糖的方法，其特征在于，步骤(1)所述的脱乙酰化反应步骤包括：
将硫酸软骨素或透明质酸溶于含有10％N2H4·H2SO4的N2H4·H2O溶液中，加热使其溶解，然后密封加热到90-110℃，反应5-16h，反应完成后，冻干，除去N2H4得脱乙酰硫酸软骨素或脱乙酰透明质酸，所述的硫酸软骨素或透明质酸与N2H4·H2O溶液的质量体积比(mg/mL)为1∶0.5-1。
3.如权利要求1所述的一种检测硫酸软骨素和透明质酸二糖的方法，其特征在于，步骤(1)所述的脱乙酰化反应步骤包括：
将硫酸软骨素或透明质酸溶于含有10％N2H4·H2SO4的N2H4·H2O溶液中，加热使其溶解，然后密封加热到98℃，反应9h，反应完成后，冻干，除去N2H4得脱乙酰硫酸软骨素或脱乙酰透明质酸，所述的硫酸软骨素或透明质酸与N2H4·H2O溶液的质量体积比(mg/mL)为1∶0.5-1。
4.如权利要求1所述的一种检测硫酸软骨素和透明质酸二糖的方法，其特征在于，步骤(3)所述的硫酸软骨素二糖或透明质酸二糖与吡唑啉酮类衍生试剂的质量比为1∶6-60。
5.如权利要求1所述的一种检测硫酸软骨素和透明质酸二糖的方法，其特征在于，步骤(3)所述的吡唑啉酮类衍生试剂包括1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)，1-苯基-3-氘代甲基-5-吡唑啉酮(D3PMP)，1-氘代苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(D5PMP)，1-氘代苯基-3-氘代甲基-5-吡唑啉酮(D8PMP)中的一种或任意几种联用。
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