CN103869002A

CN103869002A - 一种测定低聚凤梨参糖胺聚糖含量的分析方法

Info

Publication number: CN103869002A
Application number: CN201210530128.XA
Authority: CN
Inventors: 严启新; 于琳; 梁慧; 曾伟珍; 康晖; 王兵; 冯汉林
Original assignee: Shenzhen Neptunus Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Shenzhen Neptunus Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2012-12-11
Filing date: 2012-12-11
Publication date: 2014-06-18
Anticipated expiration: 2032-12-11
Also published as: CN103869002B

Abstract

本发明公开了一种测定低聚凤梨参糖胺聚糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)分别制备低聚凤梨参糖胺聚糖的供试品溶液和凤参素对照样品溶液；(2)利用高效液相色谱对低聚凤梨参糖胺聚糖的供试品溶液进行分析；色谱条件为：Shodex Ohpak SB-804HQ型凝胶色谱柱；流动相为0.08-0.12mol/L氯化钠；柱温为34～36℃；流速0.3～0.7ml/min；检测波长：206nm±2nm；进样量：20-30μl；(3)根据高效液相色谱分析结果计算低聚凤梨参糖胺聚糖的含量。

Description

一种测定低聚凤梨参糖胺聚糖含量的分析方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种测定低聚凤梨参糖胺聚糖含量的分析方法。本发明是基于申请人于2009年11月6日提交的申请号为200910110114.0、名称为“低聚岩藻糖化糖胺聚糖及其制备方法”以及2009年11月25日提交的申请号为200910109861.2、名称为“低聚凤梨参糖胺聚糖及其制备方法”的发明专利的进一步发明，所述专利申请的全文以参考文献的形式结合于本发明说明书。

背景技术

低聚凤梨参糖胺聚糖，是指一类从棘皮动物体壁或内脏中提取获得的，具有类似于硫酸软骨素主链结构，但具有侧链硫酸岩藻糖取代的糖胺聚糖衍生物(J Biol Chem，1988，263(34)：18176-83和J Biol Chem，1991，266(21)：13530-6)。岩藻糖化糖胺聚糖的结构特征为，含有摩尔比范围为0.7～1.3的葡萄糖醛酸基和乙酰氨基半乳糖基或其硫酸酯，并且含有岩藻糖或其硫酸酯基，岩藻糖硫酸酯基与乙酰氨基半乳糖硫酸酯的摩尔比范围为0.5～2.5；低聚岩藻糖化糖胺聚糖是指重均分子量为6000～20000Da范围内的岩藻糖化糖胺聚糖。低聚凤梨参糖胺聚糖(dTHG)是凤梨参(Thelenota ananas)来源的岩藻糖化糖胺聚糖(THG)的解聚产物，其具有如下式所示的结构：

式(I)中：-OR为羟基(-OH)、硫酸酯基(-OSO₃ ^-)、或为如式(II)所示的硫酸酯化岩藻糖基：

式(II)中：-OR定义同式(I)。

其中：单糖组成包括N-乙酰氨基半乳糖(GalNAc)、葡萄糖醛酸(GlcUA)、岩藻糖(Fuc)、或其硫酸酯(以-OSO₃ ^-表示)，以摩尔比计，GalNAc∶GlcUA∶Fuc∶-OSO₃ ^-的比例约为1∶(1±0.3)∶(1±0.3)∶(3.5±0.5)，dTHG的重均分子量(Mw)为约8000～20000Da。优选的分子量范围为10000～18000Da，更优选为12000～16000Da。

本申请人上述两项发明专利分别阐述了低聚岩藻糖化糖胺聚糖和低聚凤梨参糖胺聚糖制备工艺及活性，但未对其含量测定进行报道。糖胺聚糖一方面不具备糖的紫外吸收特征，同时又有几个糖的片段，而对于此类糖的纯化分析研究，常规分析方法很难解决实际问题。糖胺聚糖含量测定方法的复杂性及难度具体体现在糖胺聚糖结构比蛋白质和核酸的结构更为复杂；其中糖胺聚糖的一级结构是指糖基的组成、糖基排列顺序、相邻糖基的连接方式、异头碳构型以及糖链有无分支、分支的位置与长短等，大多数糖胺聚糖是由一个氨基己糖和一个己糖醛酸组成的二糖单元依据有规则的排列形成的直链多糖，然而其二糖单元也呈不均一性；糖胺聚糖的二级结构是指多糖骨架链间以氢键结合的各种聚合体；糖胺聚糖链一级结构的重复顺序由于糖单位的羟基、羧基、氨基以及硫酸基之间的非共价相互作用，导致有序的二级结构空间有规则而粗大的构象，即是糖胺聚糖链的三级结构；糖胺聚糖的四级结构是指多聚链间非共价键结合形成的聚集体。

糖胺聚糖的常用分析方法是比色法为测定，但该方法操作步骤繁琐，操作复杂，产物的比色度会不稳定，结果重复性差，要求的灵敏度较高。且所测定的经常是代表某一基团的结构，对于代表总体多糖的含量，准确性不一定高。其中，以分子中某一基团的含量来定量糖胺聚糖的方法有：测定己糖醛酸的Carbazole法和测定己糖胺的Elson-Mor-gan法；这两种方法都要用强腐蚀性酸，且反应需在高温下进行[刘义钱，糖胺聚糖的分析测定方法，水产科学，2005，4(5)：46-49)]。

组织化学方法是测定糖胺聚糖最原始的方法。Karls-son曾利用糖胺聚糖和阿尔辛蓝结合与分解的性能检测糖胺聚糖含量。后来，有利用阿尔辛蓝(Alcianblue)、1，9-二甲基亚甲蓝(1，9-dimethylmethylene blue)和天青A(azure A)等染色剂直接比色法定性、定量分析糖胺聚糖。阿尔辛蓝比色法灵敏度不及后两者，且在高盐溶液中结果不够准确，仅仅可以应用于提取分离的初步筛选过程中。经过改进后的二甲基亚甲蓝比色法不仅灵敏度高，而稳定性和测量范围都得到了提高。天青A比色法灵敏度很高，但是反应条件要求高。[王长云，管华诗，李八方.糖胺聚糖研究概况与展望.生物程进展，1995，15(6)：2-10；刘义钱，糖胺聚糖的分析测定方法，水产科学，2005忙4(5)：46-49]

糖胺聚糖片段中总糖醛酸的测定：现阶段用得最多的是硫酸-间羟联苯法和硫酸-咔唑比色法：多糖经硫酸水解后，分别与间羟联苯和咔唑显色，再根据颜色深浅进行比色定量分析，前者对中性糖的抗干扰能力优于后者，但后者对硫酸的质量要求非常高，如试剂级硫酸中含有金属离子及氧化剂，可产生异常的绿色反应而使测定失败，这种情况极为常见。余世鑫等对硫酸咔唑法进行优化，改变了硫酸的浓度及加热方式，加入了适当浓度的硼酸盐，提高了测定的准确性和精确性[余世鑫，顾小曼，孙长庚，等.分光光度法测定莼菜多糖中的葡萄糖醛酸.分析化学，1997，2(59)：113]；郭欣采用硫酸咔唑法与间羟联苯法进行酸性多糖中糖醛酸的比较测定，认为间羟联苯法更好，主要是各浓度的葡萄糖溶液与间羟联苯无交叉颜色反应[郭欣，高向东，杨晓兵.酸性多糖中的葡萄糖醛酸与中性糖的含量测定，中国生化药物杂志，2004，2(52)：100-101.]。

比色法测定总糖胺聚糖的操作步骤繁琐，例如利用糖胺聚糖独特的聚阴离子特性，在一定pH值和离子强度下，与氯化十六烷基吡啶溶液反应所生沉淀在680nm波长处的吸收度与其浓度呈线性关系进行比色测定，蛋白质、聚乙烯醇等化学试剂对其影响较小。但是，需仔细调节pH值和离子强度，操作相对繁琐；后来发现糖胺聚糖与阳离子染料发生特异性静电结合，形成不溶或可溶性复合物，引起染料溶液光吸收性质改变，产生减色吸收和异染特征。目前用得较多的染料有阿利新蓝、1，9-二甲基甲基蓝和甲苯胺蓝等，这些染料在强酸性溶液中只与硫酸根相互作用，主要用于含硫酸基糖胺聚糖的测定，其他阴离子化合物如DAN和RNA等对其几乎没有影响。硫酸软骨素、肝素，透明质酸等均采用此分析方法，可见该分析方法操作上极其繁琐，复杂[熊双丽，金征宇，糖胺聚糖的物化分析鉴定方法，安徽农业科学2005，33(12)：2373-2375]。

部分液相色谱方法的前处理非常繁琐，且流动相复杂，有的需要特殊的色谱柱，成本代价较大。如某些GAGs可以利用特异性酶降解的二糖产物定量，有些GAGs还可以用四、六糖或更大的寡糖产物定量，如HA。玻璃酸酶有多种来源，可水解或降解底物，得到饱和或不饱和的寡糖。某些玻璃酸酶(EC4.2.2.1)消化HA得到Δ4，5不饱和四糖、六糖的产物可定量HA。用高效糖柱，用玻璃酸酶(上海生化制药厂生产，羊睾丸提取)降解HA的钠盐，40℃酶解16h，选择[0.02mol/LNaH2PO4-0.06mol/L(NH4)2SO4(1∶1)]的混合液-水(18∶82)为流动相，检测波长193nm。计算峰面积与含量的相关系数，从而测定多糖含量，从该分析方法可以看出，其分析前处理非常繁琐，且流动相复杂，有的需要特殊的色谱柱，成本代价较大。[肖英，贺艳丽等，液相色谱法在糖胺聚糖及其衍生物寡糖研究中的应用，中国生化药物杂志，2004，25(4)：250-252]

现有技术中尚没有有关利用高效液相色谱方来对低聚凤梨参糖胺聚糖进行分析测定的报道，本文首次建立了该产品的分析方法。

发明内容

在现有技术的基础上，本发明通过反复摸索，建立了一套完善且快速准确的分析方法，可应用于分离和鉴定低聚凤梨参糖胺聚糖。本发明的具体技术方案为：

一种测定低聚凤梨参糖胺聚糖分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)分别制备低聚凤梨参糖胺聚糖的供试品溶液和凤参素对照样品溶液；

(2)利用高效液相色谱分析低聚凤梨参糖胺聚糖的供试品溶液的含量；

色谱条件为：Shodex Ohpak SB-804HQ型凝胶色谱柱；流动相为0.08-0.12mol/L氯化钠；柱温为34～36℃；流速0.3～0.7ml/min；检测波长：206nm±2nm；进样量：：20-30μl；

(3)根据高效液相色谱分析结果计算低聚凤梨参糖胺聚糖的含量。

进一步地，上述分析方法的色谱条件优选：Shodex Ohpak SB-804HQ型凝胶色谱柱；流动相为0.1mol/L氯化钠；柱温为35℃；流速0.5ml/min；检测波长：206nm；进样量：25μl。

附图说明

图1是凤参素含量测定方法的线性关系图。

图2是低聚凤梨参糖胺聚糖对照品的含量测定图谱。

图3是低聚凤梨参糖胺聚糖样品的含量测定图谱。

具体实施方式

以下结合实施例进一步说明本发明的优点和特点，不应理解为是对本发明权利要求的限制。其中，使用的试剂和仪器除特殊说明以外，均为普通市售。

凤参素对照品：根据专利200910109861.2所述方法制备低聚凤梨参糖胺聚糖，采用HPLC方法鉴定纯度，以不同分子量右旋糖酐标准和已知分子量的标准品测定其分子量，聚凤梨参糖胺聚糖含量大于99％。

注射用冻干凤参素制剂：根据专利200910109861.2所述方法制备低聚凤梨参糖胺聚糖，按常规方法制备冻干制剂。

【实施例1】色谱柱的选择

色谱条件与系统适用性：凝胶色谱柱，分别选用Shodex Ohpak SB-804HQ，Viscotek，TOSOHTSK-gel，Agilent PL Aquagel-OH等四种凝胶色谱柱。以0.1mol/L氯化钠为流动相；流速为0.5ml/min；柱温为35℃；示差检测器温度为35℃。理论板数按右旋糖酐D2峰计算应不低于1000。

测定法：注射用冻干凤参素制剂，批号为：20071201，取内容物，精密称取适量(约相当于凤参素100mg)，至10ml量瓶中，加0.1mol/L氯化钠溶液溶解，稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；另取经五氧化二磷减压干燥至恒重的凤参素对照品适量，精密称定，用0.1mol/L氯化钠溶液溶解并稀释制成每1ml含凤参素10mg的溶液，作为对照品溶液。分别精密量取上述两种溶液各25ul，注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法以峰面积计算，即得。

结果显示：不同型号的色谱柱，对本品的保留行为不同，Viscotek，TOSOHTSK-gel色谱柱对样品无保留，快速出色谱峰，影响测定，Shodex OhpakSB-804HQ色谱柱的对称性较Agilent PL Aquagel-OH色谱峰的对称性好，故选用Shodex Ohpak SB-804HQ凝胶色谱柱的进行分离。

【实施例2】流速的选择

色谱条件与系统适用性：Shodex Ohpak SB-804HQ凝胶色谱柱；分别以0.10mol/L氯化钠为流动相；流速分别为0.2ml/min，0.3ml/min，0.5ml/min，0.7ml/min，0.8ml/min，柱温为35℃；示差检测器温度为35℃。理论板数按右旋糖酐D2峰计算应不低于1000。

结果显示：不同流速条件下，色谱峰的对称性存在差异，其中以的流速0.3～0.7ml/min的色谱峰对称性较好，其中流速以0.5ml/min为最优。(对称因子在0.8～1.2之间)。

【实施例3】流动相比例选择

色谱条件与系统适用性：Shodex Ohpak SB-804HQ凝胶色谱柱；分别以0.07mol/L，0.08mol/L，0.10mol/L，0.12mol/L，0.13mol/L氯化钠为流动相；流速为0.5ml/min；柱温为35℃；示差检测器温度为35℃。理论板数按右旋糖酐D2峰计算应不低于1000。

结果显示：不同氯化钠浓度流动相，色谱峰的对称性不同，其中以0.08-0.12mol/L氯化钠浓度流动相，色谱峰的对称性较好，其中以0.10mol/ml氯化钠浓度流动相色谱峰的对称性最后(对称因子在0.8～1.2之间)。

【实施例4】柱温的选择

色谱条件与系统适用性：Shodex Ohpak SB-804HQ凝胶色谱柱；以0.10mol/L氯化钠为流动相；流速为0.5ml/min；柱温为35℃；示差检测器温度为33℃，34℃，35℃，36℃，37℃，理论板数按右旋糖酐D2峰计算应不低于1000。

结果表明：不同柱温的条件下，色谱峰的对称性不同，其中以柱温34～36℃，色谱峰对称性较好，其中以柱温35℃条件下，色谱峰对称性最好(对称因子在0.8～1.2之间)。

【实施例5】进样量选择

色谱条件与系统适用性：Shodex Ohpak SB-804HQ凝胶色谱柱；以0.10mol/L氯化钠为流动相；流速为0.5ml/min；柱温为35℃；示差检测器温度为35℃，，理论板数按右旋糖酐D2峰计算应不低于1000。

测定法：注射用冻干凤参素制剂，批号为：20071201，取内容物，精密称取适量(约相当于凤参素100mg)，至10ml量瓶中，加0.1mol/L氯化钠溶液溶解，稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；另取经五氧化二磷减压干燥至恒重的凤参素对照品适量，精密称定，用0.1mol/L氯化钠溶液溶解并稀释制成每1ml含凤参素10mg的溶液，作为对照品溶液。分别精密量取上述两种溶液各5ul，10ul，15ul，20ul，25ul，30ul，35ul注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法以峰面积计算，即得。

结果表明：不同进样体积，色谱峰峰面积和峰宽不同，进样体积5ul时，色谱峰峰面积较小，其中以20～30ul峰面积和峰宽较好，由于当体积过大，为30ul时候，样品色谱峰的峰宽较大，整个色谱峰出峰时间较长，与其他峰的分离度较差(分离度大于1.5)。

波长选择：本品主要是看多糖的分离及分析，为检测其他杂质，因此，本品选择在206nm±2nm处检测其杂质成分，就可达到目的。

【实施例6】快速测定低聚凤梨参糖胺聚糖分析方法验证

检测方法的选择与依据

1照高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录VD)测定。

鉴于凤参素为大分子聚糖类物质，本法采用高效凝胶色谱(HPGPC)柱。凤参素仅在短波长处存在紫外吸收，其λmax约206nm，UV监测器可以检测但影响因素较多，鉴于此，本方法采用示差折光检测器检测，同时联用UV检测器作为监测。

2仪器及色谱条件

色谱仪：Agileng 1100系列

色谱柱：Shodex Ohpak SB-804HQ凝胶色谱柱；

进样量：25μl

流动相：0.1mol/L氯化钠

洗脱条件：流速0.5ml/min；柱温为35℃

检测器：Agileng 1100型示差检测器；Agileng 1100紫外检测器

3方法学考察

3.1标准曲线制备与线性范围考察

(1)方法

配制标准品贮备液：精密称取凤参素对照品(约500mg)，以流动相配制浓度约25mg/ml的贮备液(25.220mg/ml)。

配制系列浓度标准品溶液：分别量取贮备液0.4、2、3、4、6、8ml，以流动相稀释至10ml制成浓度约1，5，7.5，10，15，20，25mg/ml的溶液(1.009、5.044、7.566、10.088、15.132、20.176、25.220mg/ml)。

检测：系列浓度标准品溶液各25μl注入液相色谱仪，记录色谱图及峰面积。

(2)结果

系列浓度标准品溶液的HPGPC检测记录的峰面积见表1。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，得RID回归方程为A＝316675C-21835(R2＝0.9999)，见图1A；得VWD回归方程为A＝4765.8C+786.28(R2＝0.9996)，见图1B。

表1浓度线性范围

(3)结论：

在浓度约1～25mg/ml范围内，凤参素峰面积与浓度呈良好线性关系。

3.2进样精密度考察

方法：取对照品溶液(取经五氧化二磷减压干燥至恒重的凤参素对照品适量，精密称定，用0.1mol/L氯化钠溶液溶解并稀释制成每1ml含凤参素10mg的溶液，作为对照品溶液)连续进样5次，记录色谱峰面积，计算RSD

结果与结论：结果见表2，可见方法进样精密度良好。

表2进样精密度试验

3.3溶液稳定性考察

方法：取供试品溶液(注射用冻干凤参素制剂，批号为：20060401，取内容物，精密称取适量(约相当于凤参素100mg)，至10ml量瓶中，加0.1mol/L氯化钠溶液溶解，稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液)分别在溶液配制后0、2、4、6、8、12、16小时取25μl进样，记录色谱峰面积，计算RSD。

结果与结论：结果见表3。实验结果表明，该溶液在16小时内基本保持稳定。

表3溶液稳定性考察试验结果

3.4回收率试验

方法：精密称取凤参素对照品约40、50、60mg，置10ml量瓶中，另取已知含量的凤参素样品，分别取40、50、60mg，置上述10ml量瓶中，计算回收率。

结果：见表4。

表4回收率试验结果

3.5重复性考察

方法：取同一批号供试品样品6份(20060401)，记录色谱峰面积，计算RSD结果：见表5。

表5重复性试验测定结果

3.6检测限考察

方法：精密称取凤参素对照品21.46mg，用流动相稀释2000倍，取25μl注入液相色谱仪。

结果：在上述条件下测得凤参素的最小检出量为268.25ng，以上总之，通过精密度，重复性，稳定性，线性关系，回收率，综合确认了该分析方法的合理性，同时，色谱图无其他杂质，该方法灵敏度较高，可用于凤参素的含量检查。

【实施例7】原料样品中低聚凤梨参糖胺聚糖含量测定

方法一：色谱条件与系统适用性：Shodex Ohpak SB-804HQ凝胶色谱柱；以0.08mol/L氯化钠为流动相；流速为0.3ml/min；柱温为35℃；示差检测器。理论板数按D2计算应不低于1000。

方法二：色谱条件与系统适用性：Shodex Ohpak SB-804HQ凝胶色谱柱；以0.12mol/L氯化钠为流动相；流速为0.7ml/min；柱温为36℃；示差检测器。理论板数按D2计算应不低于1000。

方法三：色谱条件与系统适用性：Shodex Ohpak SB-804HQ凝胶色谱柱；以0.11mol/L氯化钠为流动相；流速为0.6ml/min；柱温为35℃；示差检测器。理论板数按D2计算应不低于1000。

取三批低聚凤梨参糖胺聚糖样品(根据专利200910109861.2所述方法制备而成)，批号分别为20070504，20070601，20070602，分别精密称取适量(约100mg)，至10ml量瓶中，加0.1mol/L氯化钠溶液溶解，并稀释至刻度，滤过，取续滤液作为供试品溶液；另取经五氧化二磷干燥至恒重的凤参素对照品适量，精密称定，用0.1mol/L氯化钠溶液溶解并稀释制成每1ml含凤参素10mg的溶液，作为对照品溶液。分别精密量取上述两种溶液各25ul，注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法以峰面积计算，即得。

结果三批样品不同方法检测结果见表6。

表6三批样品含量测定结果

由此可见在不同范围下的所测定的偏差很小，可用于该方法的准确测定。

【实施例8】制剂样品中低聚凤梨参糖胺聚糖含量测定

色谱条件与系统适用性：Shodex Ohpak SB-804HQ凝胶色谱柱；以0.1mol/L氯化钠为流动相；流速为0.5ml/min；柱温为35℃；示差检测器温度为35℃。理论板数按右旋糖酐D2峰计算应不低于1000。

测定法：注射用冻干凤参素制剂，批号分别为：20071201、20071202、200701203)10瓶，精密称定装量，取内容物，精密称取适量(约相当于凤参素100mg)，至10ml量瓶中，加0.1mol/L氯化钠溶液溶解，稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；另取经五氧化二磷减压干燥至恒重的凤参素对照品适量，精密称定，用0.1mol/L氯化钠溶液溶解并稀释制成每1ml含凤参素10mg的溶液，作为对照品溶液。分别精密量取上述两种溶液各25ul，注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法以峰面积计算，即得。

结果三批样品检测结果见表7。

表7三批样品含量测定结果

Claims

1.一种测定低聚凤梨参糖胺聚糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(2)利用高效液相色谱对低聚凤梨参糖胺聚糖的供试品溶液进行分析；

色谱条件为：Shodex Ohpak SB-804HQ型凝胶色谱柱；流动相为0.08-0.12mol/L氯化钠；柱温为34～36℃；流速0.3～0.7ml/min；检测波长：206nm±2nm；进样量：20-30μl；

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，

所述色谱条件为：Shodex Ohpak SB-804HQ型凝胶色谱柱；流动相为0.1mol/L氯化钠；柱温为35℃；流速0.5ml/min；检测波长：206nm；进样量：25μl。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备包括：

取100重量份的待测低聚凤梨参糖胺聚糖样品，加入流动相溶液至10体积份，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对照样品溶液的制备包括：

取凤参素对照品，用流动相溶液溶解并稀释制成每1ml含凤参素10mg的溶液，作为对照品溶液。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述低聚凤梨参糖胺聚糖样品为注射用冻干凤参素制剂或低聚凤梨参糖胺聚糖原料。