WO2007111321A1

WO2007111321A1 - 硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖の分析方法、硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖を含む薬学的組成物および医薬、薬学的組成物および医薬の製造方法、疾患の治療、診断、症状の軽減および予防方法

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Publication number: WO2007111321A1
Application number: PCT/JP2007/056276
Authority: WO
Inventors: Kazuyuki Sugahara
Original assignee: Japan Science And Technology Agency
Priority date: 2006-03-26
Filing date: 2007-03-26
Publication date: 2007-10-04
Also published as: JP4662385B2; JP2011059126A; JPWO2007111321A1; JP5198538B2

Abstract

　硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖の構造を高感度で解析できる分析方法を提供する。また、優れた生物活性を有する硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖を含む薬学的組成物および医薬を提供する。さらに、硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖を含む薬学的組成物および医薬の製造方法、疾患の治療、診断、症状の軽減および予防方法を提供する。　硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖を酵素消化して得られる、モノサッカリド、ジサッカリドまたはトリサッカリドを含む生成物を質量分析する。これにより、硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖を構造解析して生物活性等の品質を評価し、優れた薬学的組成物または医薬を製造することができる。また、本発明の薬学的組成物および医薬は、本発明者らが見出した、コンドロイチン硫酸の腫瘍転移阻害活性、デングウィルス感染阻害活性、増殖因子結合活性等に対応した優れた生物活性を有する。

Description

明細書

硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖の分析方法、硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖を含む薬学的組成物および医薬、薬学的組成物および医薬の製造方法、疾患の治療、診断、症状の軽減および予防方法

技術分野

[0001] 本発明は、硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖の分析方法、硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖を含む薬学的組成物および医薬、薬学的組成物および医薬の製造方法、疾患の治療、診断、症状の軽減および予防方法に関する。

背景技術

[0002] 硫酸化多糖および硫酸化オリゴ糖の中でも、特にコンドロイチン硫酸 (CS)やデルマタン硫酸 (DS)等のグリコサミノダリカン (GAG)は、へパリンやへパラン硫酸 (HS)とともにその生物活性が注目され、盛んに研究されている。例えば、コンドロイチン硫酸 (CS) やデルマタン硫酸 (DS)は、コアタンパク質に共有結合した形でプロテオダリカン (PG) として合成され (非特許文献:!〜 3)、あらゆる組織の細胞表面や細胞外マトリックスに存在していることが報告されている。さらに、こうした CS/DS-PGsは、哺乳類の脳の構成成分であり、神経細胞の接着、移動、分化、神経突起形成や軸索誘導などの調節を通して、神経の発生に関与していることも報告されている（非特許文献 4〜8)。しかしながら、これらグリコサミノダリカンの生物活性等についてはいまだ不明な点が多ぐ基礎医学、応用医学、創薬等の各分野において、さらなる研究が要求されている。

[0003] 例えば、これまでに、へパリンが癌転移の阻害活性を示すことが分かっていたが、出血などの副作用があるため臨床応用には至っておらず、さらに良質な腫瘍転移阻害剤等の研究開発が求められている。また、へパラン硫酸がヘルぺスウィルスゃデングウィルスの感染のレセプターとなるという報告はある力 CSについてはそのような報告はない。

[0004] さらに、 CS等の硫酸化多糖および硫酸化オリゴ糖については、その構造解析につレ、ても、さらなる研究が要求されている。例えば、従来の研究としては、 CS-Eと CS-K をコンドロイチナーゼ ACIIや ACIで消化して硫酸化オリゴ糖とし、 NMR測定により、 Glc A(3S)構造を確認したことが報告されていた (非特許文献 9)。しかし、 CS-Eまたは CS- Kをコンドロイチナーゼ ABC (CSase ABC)で完全に消化すると、前記 GlcA(3S)構造がほとんど消失し、ァニオン交換 HPLCクロマトグラフィー分析による伝統的なジサッカリド分析では検出できなレ、（非特許文献 9)。このため、硫酸化多糖および硫酸化ォリゴ糖の構造について、例えば、前記 NMR測定よりも感度の良い測定方法が求められている。

[0005] ^^特許乂 |#U : The Biochemistry of Glycoproteins and Proteoglycans (Lennarz,

W. J., ed.)， pp. 267-371, Plenum Publishing, New York (1980) 非特許文献 2 : Annu. Rev. Biochem. 47， 385-417 (1991)

非特許文献 3 : Trends Glycosci. Glycotechnol. 12, 321-349 (2000)

非特許文献 4 : Persp. Dev. Neurol. 3， 319-330 (1996)

非特許文献 5 : Physiol. Rev. 80， 1267-1290 (2000)

非特許文献 6 : Arch. Biochem. Biophys. 374, 24-34 (2000)

非特許文献 7 : Curr. Opin. Struct. Biol. 13, 612-620 (2003)

非特許文献 8 : Glycoconj. J. 21， 329-341 (2004)

非特許文献 9 : Sugahara, Κ·， Tanaka, Υ·， Yamada, S. , Seno, N. , and Kitagaw a, H. (1996) J. Biol. Chem. 271(43), 26745-26754.

発明の開示

[0006] したがって、本発明は、硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖の構造を高感度で解析できる分析方法の提供を目的とする。また、本発明は、優れた生物活性を有する硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖を含む薬学的組成物および医薬を提供することを目的とする。さらに、本発明は、硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖を含む薬学的組成物および医薬の製造方法、疾患の治療、診断、症状の軽減および予防方法を提供する。

[0007] 前記課題を解決するために、本発明の分析方法は、硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖を酵素消化して得られる生成物を質量分析する工程を含む分析方法であって、前記酵素消化生成物は、モノサッカリド、ジサッカリドおよびトリサッカリドからなる群から選択される少なくとも一つのサッカリドを含み、前記質量分析により解析される前記サッカリドの構造に基づき前記硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖の構造を解析する分析方法である。

[0008] また、本発明は、前記本発明の分析方法により硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖の構造を解析する工程と、前記硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖をヒトまたは動物の患者に投与する工程とを含む、前記ヒトまたは動物の患者における疾患の治療、診断、症状の軽減または予防をする方法を提供する。

[0009] 次に、本発明の第 1の薬学的組成物は、 CS_K、酸化処理した CS-Kおよび酸化処理した CS-Eからなる群から選択される少なくとも一つを含み、増殖因子結合に関する用途に使用される。そして、本発明の第 2の薬学的組成物は、コンドロイチン硫酸およびその誘導体の少なくとも一方を含み、デングウィルス感染阻害に関する用途に使用される。さらに、本発明の第 3の薬学的組成物は、コンドロイチン硫酸およびその誘導体の少なくとも一方を活性物質として含み、細胞増殖阻害、細胞死誘導、腫瘍細胞増殖阻害、腫瘍細胞浸潤阻害、腫瘍細胞転移阻害、腫瘍細胞遊走阻害、および腫瘍細胞死誘導からなる群から選択される少なくとも一つに関する用途に使用される

[0010] また、本発明の第 1の医薬は、 CS-K、酸化処理した CS-Kおよび酸化処理した cs- Eからなる群から選択される少なくとも一つを含み、増殖因子結合に関する疾患の治療、診断、症状の軽減および予防からなる群から選択される少なくとも一つの用途に使用される。そして、本発明の第 2の医薬は、コンドロイチン硫酸およびその誘導体の少なくとも一方を含み、デングウィルス感染阻害に関する疾患の治療、診断、症状の軽減および予防からなる群から選択される少なくとも一つの用途に使用される。さらに、本発明の第 3の医薬は、コンドロイチン硫酸およびその誘導体の少なくとも一方を活性物質として含み、細胞の増殖に関する疾患の治療、診断、症状の軽減および予防からなる群から選択される少なくとも一つの用途に使用される。

[0011] さらに、本発明は、ヒトまたは動物の患者における増殖因子結合に関する疾患の治療、診断、症状の軽減または予防をする方法であって、 CS-K、酸化処理した CS-Kおよび酸化処理した CS-Eからなる群から選択される少なくとも一つを前記ヒトまたは動物の患者に投与する工程を含む方法を提供する。そして、本発明は、ヒトまたは動物の患者におけるデングウィルス感染阻害に関する疾患の治療、診断、症状の軽減または予防をする方法であって、コンドロイチン硫酸およびその誘導体の少なくとも一方を前記ヒトまたは動物の患者に投与する工程を含む方法を提供する。さらに、本発明は、ヒトまたは動物の患者における細胞の増殖に関する疾患の治療、診断、症状の軽減または予防をする方法であって、コンドロイチン硫酸およびその誘導体の少なくとも一方を活性物質として前記ヒトまたは動物の患者に投与する工程を含む方法を提供する。また、本発明は、増殖因子結合に関する疾患の治療、診断、症状の軽減および予防からなる群から選択される少なくとも一つの用途に使用される医薬を製造するために、 CS-K、酸化処理した CS-Kおよび酸化処理した CS-Eからなる群から選択される少なくとも一つを使用する方法を提供する。さらに、本発明は、デングウイノレス感染阻害に関する疾患の治療、診断、症状の軽減および予防からなる群から選択される少なくとも一つの用途に使用される医薬を製造するために、コンドロイチン硫酸およびその誘導体の少なくとも一方を使用する方法を提供する。さらに、本発明は、細胞の増殖に関する疾患の治療、診断、症状の軽減および予防からなる群から選択される少なくとも一つの用途に使用される医薬を製造するために、コンドロイチン硫酸およびその誘導体の少なくとも一方を活性物質として使用する方法を提供する。

[0012] 前記本発明の分析方法によれば、硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖の構造を高感度で解析できる。したがって、本発明の分析方法は、例えば、硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖を構造解析して生物活性等の品質を評価することにより、前記硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖を含む薬学的組成物または医薬の製造に有用である。また、本発明の薬学的組成物および医薬は、前記特定の硫酸化多糖または硫酸化ォリゴ糖を活性物質として含むことにより、その活性物質に対応した優れた生物活性を有する。なお、多糖またはオリゴ糖を酵素消化すると、通常、二糖 (ジサッカリド）が生成するが、場合によっては、単糖 (モノサッカリド）や三糖（トリサッカリド）が生成するので、本発明はこれらを含む。

図面の簡単な説明

[0013] [図 1]図 1は、コンドロイチナーゼ ABC消化の、ノレイス肺癌 HI 1細胞の転移能に対する効果を示す図である。 [図 2]図 2は、種々の CSァイソフォームによるルイス肺癌 HI 1細胞転移阻害を示す図である。

[図 3]図 3は、ルイス肺癌 H11細胞の転移に対する CS-Eの阻害活性について、コンド口イチナーゼ ABC処理の効果を示す図である。

[図 4]図 4は、ルイス肺癌 H11細胞の転移に対する CS-Eの阻害活性の用量依存性を示す図である。

園 5]図 5は、デングウィルス 2型感染の、コンドロイチン硫酸（CS)製剤による阻害を示す図である。

園 6]図 6は、デングウィルス 2型感染の濃度依存阻害を示す図である。

[図 7]図 7は、化学修飾 (酸化処理)した CS-E製剤の、デングウィルス 2型感染阻害を示す図である。

[図 8]図 8は、精製 CS-Kに対する種々の成長因子および神経栄養性因子の結合を示す図である。

[図 9]図 9は、 GAGs被覆基層上で培養した E16海馬ニューロンの代表的形態および神経突起伸長を示す図であり、図 9 (A)は、増大した神経長および代表的形態を示し、図 9 (B)は、生成した神経突起の定量的分析を示す図である。

[図 10]図 10は、化学修飾 CS-E製剤により刺激したニューロンの代表的形態、およびそれらの神経突起伸長促進活性の定量分析を示す図であり、図 10 (A)は、 CS-E, CS-EPまたは CS-EPAでコートした種々の基層で培養したニューロンの、増加した神経突起長および形態学的特徴を示し、図 10 (B)は、生成した神経突起の定量的分析を示す図である。

[図 11]図 11は、 CS-Kテトラサッカリド (K-K)の CSase ABC消化物における ESト MSスぺクトノレ（200〜700m/z amu間）図である。

[図 12]図 12は、 97における硫酸基（sulfite group)についてのプリカーサ一イオンモードにより得られた ESI-MSスペクトル図である。

[図 13]図 13は、 300[GalNAc(4S)]についてのプリカーサ一イオンモードにより得られた ESI- MSスペクトル図である。

[図 14]図 14は、 ΔΑ-Κテトラサッカリド CSase ABC消化物のァニオン交換 HPLCクロマトグラム図である。

[図 15]図 15は、図 14由来 GalNAc(4S)ピークの ESト MSスペクトル図である。

[図 16]図 16は、 CSase ABC消化し 2-AB標識した CS-Kポリサッカリド製剤のァニオン交換 HPLCクロマトグラム図である。

[図 17]図 17は、 2-AB-標識不飽和 CSジサッカリド標準および GalNAc(4S)標準の、 HP

LC条件 B下におけるァニオン交換 HPLCクロマトグラム図である。

[図 18]図 18は、 2-AB標識後の、 CSases ACIおよび ACII抵抗性 CS-Eテトラサッカリドフラクション CSase ABC消化物のァニオン交換 HPLCクロマトグラム図である。

[図 19]図 19は、 2-AB標識後の、 CSases ACIおよび ACII抵抗性テトラサッカリドフラタシヨン CSase ABC消化物のゲル濾過クロマトグラム図である。

[図 20]図 20は、図 19におけるフラクション 4の ESト MSスペクトル図である。

[図 21]図 21は、 HPLC条件 B下での、図 19におけるフラクション 4のァニオン交換 HPL

Cクロマトグラム図である。

[図 22]図 22は、 HPLC条件 B下での、図 19におけるフラクション 4の、信頼性のある Δ CSジサッカリド標準および 2-AB標識 GalNAc(4S)標準混合物との共クロマトグラフの、ァニオン交換 HPLCクロマトグラム図である。

発明を実施するための最良の形態

本発明の分析方法では、前述の通り、硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖を酵素消化して得られるサッカリドの構造を質量分析により解析する。前記サッカリドは、モノサッカリド（単糖）、ジサッカリド（二糖)およびトリサッカリド（三糖)からなる群から選択される少なくとも一つを含む。前記質量分析により検出される被検出物質は、前記モノサッカリド（単糖）、前記ジサッカリド（二糖)または前記トリサッカリド（三糖）自体を含んでいても良い。前記被検出物質は、例えば、前記モノサッカリド（単糖）、前記ジサッカリド（二糖)または前記トリサッカリド（三糖)が酵素消化により分解される際の分解中間体を含むことが好ましい。前記分解中間体を質量分析により検出することで、前記モノサッカリド（単糖）、前記ジサッカリド（二糖)または前記トリサッカリド（三糖)の構造を、さらに正確に感度良く解析することができる。本発明の分析方法では、さらに高感度な分析のために、例えば、前記質量分析工程に先立ち、前記酵素消化生成物を分画する工程をさらに含むことが好ましい。前記分画に用いる手段は特に限定されないが、例えばゲル濾過クロマトグラフィーがより好ましい。

[0015] また、本発明の分析方法では、前記硫酸化多糖は特に限定されないが、例えば、グリコサミノダリカンが好ましぐコンドロイチン硫酸およびその誘導体のうち少なくとも一方であることがより好ましぐ前記コンドロイチン硫酸力 CS-A、 CS_B、 CS_C、 CS- D、 CS_E、 CS-Kおよび CS_H(DS_E)からなる群力、ら選択される少なくとも一つであることがさらに好ましレ、。前記コンドロイチン硫酸を分解する酵素は、コンドロイチナーゼが好ましぐ例えばコンドロイチナーゼ ABCを含むことがより好ましい。

[0016] 次に、本発明の組成物の製造方法および医薬の製造方法は、前記本発明の分析方法により硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖の構造を解析する工程を含む。前記組成物は、前記硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖を薬学的活性成分として含む組成物であることが好ましい。すなわち、前記本発明の分析方法によれば、例えば、硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖の構造を解析することで、その生物活性等の品質を評価し、実用に適した医薬や組成物を製造することができる。前記薬学的活性成分は、例えば、細胞増殖阻害活性、細胞死誘導活性、腫瘍細胞増殖阻害活性、腫瘍細胞浸潤阻害活性、腫瘍細胞転移阻害活性、腫瘍細胞遊走阻害活性、腫瘍細胞死誘導活性、ウィルス感染阻害活性、デングウィルス感染阻害活性、神経突起伸長促進活性、および増殖因子結合活性力もなる群から選択される少なくとも一つの活性を有することが好ましい。

[0017] 次に、本発明の薬学的組成物および医薬について説明する。

[0018] 本発明の第 1の薬学的組成物は、前記の通り、 CS-K、酸化処理した CS-Kおよび酸化処理した CS-Eからなる群から選択される少なくとも一つを含み、増殖因子結合に関する用途に使用される。また、本発明の第 1の医薬は、前記の通り、 CS_K、酸化処理した CS-Kおよび酸化処理した CS-Eからなる群から選択される少なくとも一つを含み、増殖因子結合に関する疾患の治療、診断、症状の軽減および予防からなる群から選択される少なくとも一つの用途に使用される。

[0019] 本発明者らは、コンドロイチン硫酸（CS)の生物活性について鋭意研究の結果、 CS -K、酸化処理した CS-Kおよび酸化処理した CS-Eが神経突起伸長促進活性および増殖因子結合活性を有し、神経突起伸長促進および増殖因子結合促進の少なくとも一方に関する用途に使用できることを見出し、前記本発明の第 1の薬学的組成物および第 1の医薬の発明に到達した。前記用途としては、例えば、神経突起伸長促進および増殖因子結合促進の少なくとも一方に関する疾患の治療、診断、症状の軽減および予防からなる群から選択される少なくとも一つの用途がある。特に、酸化処理した CS-Kおよび CS-Eは、酸化処理による副作用の軽減で、母体の CS-Kまたは C S-Eよりも臨床等の用途にさらに有用であることが期待される。前記酸化処理は、例えば、過ハロゲン酸による酸化処理が好ましぐ前記過ハロゲン酸は、過ヨウ素酸がより好ましぐまた、前記酸化処理した CS-Kまたは CS-Eが、例えば、酸化処理後、さらにアルカリ処理した CS-Kまたは CS-Eであることがさらに好ましい。

[0020] また、本発明の第 2の薬学的組成物は、前記の通り、コンドロイチン硫酸およびその誘導体の少なくとも一方を含み、デングウィルス感染阻害に関する用途に使用される。そして、本発明の第 2の医薬は、前記の通り、コンドロイチン硫酸およびその誘導体の少なくとも一方を含み、デングウィルス感染阻害に関する疾患の治療、診断、症状の軽減および予防からなる群から選択される少なくとも一つの用途に使用される。

[0021] 従来、コンドロイチン硫酸のデングウィルス感染阻害に関する報告はなかった。しかし、本発明者らは、鋭意研究の結果、コンドロイチン硫酸およびその誘導体がデングウィルス感染阻害活性を有することを見出し、前記本発明の第 2の薬学的組成物および前記本発明の第 2の医薬の発明に到達した。前記本発明の第 2の薬学的組成物および前記本発明の第 2の医薬の使用対象となるコンドロイチン硫酸およびその誘導体は特に限定されないが、ウィルス感染阻害活性、副作用等の観点から、例えば、 CS-A、 CS- B、 CS-C、 CS- D、 CS-E, CS-EP (過ヨウ素酸処理した CS- E)、 CS- EP A (アルカリ処理した CS-EP)、および CS-Kからなる群から選択される少なくとも一つを含むことが好ましい。

[0022] さらに、本発明の第 3の薬学的組成物は、前記の通り、コンドロイチン硫酸およびその誘導体の少なくとも一方を活性物質として含み、細胞増殖阻害、細胞死誘導、腫瘍細胞増殖阻害、腫瘍細胞浸潤阻害、腫瘍細胞転移阻害、腫瘍細胞遊走阻害、および腫瘍細胞死誘導からなる群から選択される少なくとも一つに関する用途に使用される。そして、本発明の第 3の医薬は、前記の通り、コンドロイチン硫酸およびその誘導体の少なくとも一方を活性物質として含み、細胞の増殖に関する疾患の治療、診断、症状の軽減および予防からなる群から選択される少なくとも一つの用途に使用される。これらは、本発明者らが鋭意研究の結果発見したコンドロイチン硫酸の細胞増殖阻害活性等に基づく発明である。前記コンドロイチン硫酸は、特に限定されないが、活性、副作用等の観点から、例えば、 CS_A、 CS-B、 CS_C、 CS_D、および CS-Eからなる群から選択される少なくとも一つを含むことが好ましい。また、前記活性物質は、活性の高さ等の観点から、コンドロイチン硫酸 Eが特に好ましい。前記細胞の増殖に関する疾患は、例えば、脳腫瘍、頭類部癌、神経芽細胞腫、副鼻孔癌、咽頭癌、食道癌、肺癌、胃癌、大腸癌、直腸癌、肝癌、胆道癌、膝癌、前立腺癌、膀胱癌、精巣癌、乳癌、子宮癌、子宮筋腫、子宮頸癌、卵巣癌、急性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、悪性リンパ腫、赤血球増加症、真正多血症、本態性血小板増多症、骨髄腫、骨肉腫、絨毛癌、ホジキン病、非ホジキン病、膠芽種、星状細胞腫、および軟組織肉腫からなる群から選択される少なくとも一つの疾患であることが好ましレ、。また、前記本発明の第 3の医薬は、例えば、抗腫瘍剤、抗癌剤、制癌剤および抗転移剤からなる群から選択される少なくとも一つの用途に使用されることが好ましい。

従来の研究によれば、細胞表面のコンドロイチン硫酸プロテオダリカン (CS-PGs)は、腫瘍細胞の挙動調節に重要な役割を果たしうる（lida, J. , Meijne, A. M. , Knuts on, J. R.， Furcht, L. T.， and McCarthy, J. B. (1996) Cell surface chondr oitin sulfate proteoglycans in tumor cell adhesion, motility and invasion. Se min. Cancer Biol. 7， 155-162)。コンドロイチナーゼ (CSase)ACまたは Bによるメラノーマ細胞の処理は、浸潤および増殖を阻害する（Denholm, E. M" Lin, Y. Q. , and Silver, P. J. (2001) Anti-tumor activities of chondroitinase AC and c hondroitinase B: inhibition of angiogenesis, proliferation and invasion. Eur. J . Pharmacol. 416, 213- 221)。細胞表面の CD44-関連 CS- PGは、タイプ Iコラーゲンにより媒介されるメラノーマ細胞の運動性および浸潤に関し、そして、タイプ Iコラーゲン基層における細胞の運動性および浸潤挙動に必要であり、トランスフォーミング増殖因子 i3により刺激される（Faassen, A. E.， Schrager, J. A., Klein, D. J. , Oe gema, T. R.， Couchman, J. R., and McCarthy, J. B. (1992) A cell surface chondroitin sulfate proteoglycan, immunologically related to CD44, is involv ed in type I collagen-mediated melanoma. J. Cell Biol. 116， 521 - 531および Faassen, A. E.， Mooradian, D. し， Tranquillo, R. T.， Dickinson, R. B.， Le tourneau, P. C.， Oegema, T. R.， and McCarthy, J. B. (1993) Cell surface

CD44-related chondroitin sulfate proteoglycan is required for transforming growth factor-beta-stimulated mouse melanoma cell motility and invasive beh avior on type I collagen. J. Cell Sci. 105， 501— 511)。し力し、コンドロィチン硫酸およびその誘導体、特にコンドロイチン硫酸 E (CS_E)が非常に強い腫瘍細胞転移阻害活性を有すること、および細胞の増殖に関する疾患の治療、診断、症状の軽減、予防等の用途に対し有用であることは従来知られておらず、本発明者等が初めて見出した。

[0024] これら本発明の薬学的組成物および医薬の製造方法は、特に限定されないが、例えば、前記本発明の分析方法によりコンドロイチン硫酸等の構造を解析し、その生物活性等の品質を評価して製造することが好ましい。そのようにすれば、前述の通り、実用に適した医薬や組成物を製造することができるためである。

[0025] なお、本発明では、コンドロイチン硫酸（CS)とは、 CS-Bすなわちデルマタン硫酸（D S)を含み、また、 CS-H(DS-E)も含むものとする。また、「硫酸化多糖または硫酸化ォリゴ糖」とは、天然由来構造のもののみならず、例えば酸化処理等により化学修飾した誘導体も含むものとする。特に、酸化処理した誘導体は、副作用の低減により、医薬や薬学的組成物への応用の有用性が期待できる。前記酸化処理は、例えば、過ョゥ素酸等の過ハロゲン化酸により行うことが好ましぐこの場合の硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖は、例えば CSが好ましぐ CS-Eまたは CS-Kがより好ましい。

[0026] 本発明の薬学的組成物または医薬に含まれる硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖は、中性分子の形態で用いても塩の形態で用いても良ぐ前記塩は、酸付加塩でも塩基付加塩でも良い。前記酸付加塩を形成する酸は、無機酸でも有機酸でも良レヽ。無機酸としては、特に限定されないが、例えば、硫酸、リン酸、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸等が可能である。有機酸も特に限定されないが、例えば、 p—トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、シユウ酸、 p—ブロモベンゼンスルホン酸、炭酸、コハク酸

、クェン酸、安息香酸、酢酸等が可能である。前記塩基付加塩を形成する塩基は、無機塩基でも有機塩基でも良い。無機塩基としては、特に限定されないが、例えば、水酸化アンモニゥム、アルカリ金属水酸化物、アルカリ土類金属水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩等が可能であり、より具体的には、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリゥム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、水酸化力ノレシゥム、炭酸カルシウム等が可能である。有機塩基も特に限定されないが、例えば、エタノーノレアミン、トリェチルァミン、トリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタン等が可能である。硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖の塩の製造方法も特に限定されず、例えば、硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖に、前記のような酸や塩基を公知の方法により適宜付加させる等の方法で製造することができる。

[0027] また、本発明の薬学的組成物または医薬において、硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖の 1回当たりの投与量および投与間隔等は特に限定されず、その目的に応じて適宜選択することができる。それらは、患者の年齢、体重、性別、医学的状態、病状、投与経路、患者の代謝'排泄機能のレベル、使用される剤形、投与される特定の硫酸化多糖および硫酸化オリゴ糖ならびにそれらの塩を含む種々の要素を考慮して、当業者によって選定される。

[0028] 本発明の薬学的組成物または医薬の投与形態は特に限定されず、その目的に応じて、経口的に、または非経口的に投与することができる。経口剤として投与する時の形態は、特に限定されず、通常のおよび腸溶性錠剤、カプセル、ピル、散剤、顆粒剤、エリキシル剤、チンキ剤、溶剤、懸濁剤、シロップ、固体もしくは液体エアロゾル、および乳濁液等、当業者が通常用いる形態を選択することができる。また、非経口投与時の形態も特に限定されず、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、筋肉内投与等、当業者が通常用いる形態を選択することができる。

[0029] 本発明の薬学的組成物または医薬は、例えば、一種類以上の薬学的に許容可能な添加物をさらに含むことが好ましい。すなわち、例えば、硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖を、投与に先立ち、一種類以上の薬学的に許容可能な添加物と共に製剤することが好ましい。前記添加物は、特に限定されないが、例えば、担体、希釈剤、香料、甘味料、滑沢剤、溶解剤、懸濁剤、結合剤、錠剤崩壊剤、およびカプセル化材等の不活性物質である。また、これら以外にも、例えば、医薬の分野で一般に使用されてレ、る任意の添加物を適宜用いても良レ、。

[0030] 前記添加物は、経口投与する場合は、例えば、以下に列挙する物質を使用することができる。担体としては、例えば、ラタトース、デンプン、スクロース、グルコース、炭酸ナトリウム、マンニトール、ソルビトール、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、硫酸力ノレシゥム、メチルセルロース等が可能である。崩壊剤としては、例えば、トウモロコシ粉、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガム、アルギン酸等が可能である。結合剤としては、例えば、ゼラチン、天然糖、ベータラタトース、トウモロコシ甘味料、天然および合成ゴム、アラビアゴム、トラガカントゴム、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ワックス等が可能である。滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸、ォレイン酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、食塩、タルク等が可能である。

[0031] 本発明の薬学的組成物または医薬は、例えば、硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖を、希釈剤と混合しても良いし、担体に封入しても良い。前記担体は、例えば、カブセル、小袋、紙その他の容器の形態が可能である。前記担体は希釈剤を兼ねてもよく、固体でも、半固体でも、ビヒクルとして作用する液体でも良い。また、本発明の医薬の形態は、特に限定されないが、例えば、錠剤、ピル、散剤、ローゼンジ、エリキシノレ、懸濁液、乳濁液、溶液、シロップ、エアロゾル、軟膏、軟 '硬ゼラチンカプセル、坐薬、滅菌注射用液および包装滅菌散剤等の種々の形態が可能である。

[0032] 次に、本発明の種々の実施例について説明する。しかし、本発明は、これらの実施例には限定されない。

実施例 1

[0033] [腫瘍細胞転移阻害]

本実施例は、コンドロイチン硫酸およびその誘導体の少なくとも一方を活性物質として含む前記本発明の第 3の薬学的組成物および医薬の腫瘍細胞転移阻害活性等に関する実施例である。

[0034] 本実施例では、イカ軟骨由来のコンドロイチン硫酸 E (CS-E)およびその他の種々のコンドロイチン硫酸による、ルイス肺癌セルライン HI 1の転移阻害を確認した。腫瘍細胞転移は、腫瘍細胞の接着、遊走および浸潤等を含む一連の複雑な現象に関連する。すなわち、コンドロイチン硫酸またはその誘導体が前記腫瘍細胞の転移を阻害することは、細胞の増殖に関する疾患の治療、診断、症状の軽減、予防等の用途に対する有用性を示す。

[0035] まず、参考実験として、 CSあるいは DSの腫瘍細胞転移への関連性を検証するために、ルイス肺癌の高転移性セルライン Hl l (Munesue, S.， Kusano, Υ·， Oguri, Κ.， Itano, Ν.， Yoshitomi, Υ.， Nakanishi, Η.， Yamashina, I. , and Okayama, M. (2002) The role of syndecan-2 in regulation of actin-cytoskeletal organizat ion of Lewis lung carcinoma-derived metastatic clones. Biochem. J. 363， 20 1-209)をコンドロイチナーゼ ABCプロテアーゼフリー（生化学工業株式会社の商品名）で処理した場合と、非処理の場合の転移能を比較した。具体的には、まず、ノレイス肺癌高転移 HI 1細胞 (4 X 10⁵個)を、 200 μ 1の DMEM (ダルベッコの修飾イーグル培地， Dulbecco' s modified Eagle' s medium)に懸濁させ、 5mIU/mLのコンドロイチナーゼ ABCプロテアーゼフリー（生化学工業株式会社より購入）を加えて (処理）、または何も加えずに（非処理）、 37°Cで 30分間インキュベートした。その後、前記処理または非処理のルイス肺癌 HI 1細胞を、各マウス (n=6)に、尾静脈を通じて注射した。前記癌細胞接種後 3週間で前記マウスを殺し、そして、各マウス肺中の晶結節数に基づき肺転移を評価した。図 1に、前記コンドロイチナーゼ ABC消化の、ルイス肺癌 HI 1 細胞の転移能に対する効果を示す。図示の通り、コンドロイチナーゼ ABC消化の結果、転移能が有意に減少した。このことは、細胞表面の CS/DS鎖が H11細胞の転移工程に関連することを示す。

[0036] 次に、種々の市販の CSおよびデルマタン硫酸（DS)製剤のマウス肺への HI 1転移阻害能を、へパリンと併せて評価した。前記評価は、各 CSまたは DS製剤 100 z gを尾静脈から注射し、その後同じノレートで H11細胞を接種して行った。具体的には、種々の CSまたは DS製剤（各々、 200 μ 1 DMEM中に 100 x g)を各マウス (η=6)にそれぞれ注射し、 30分後、図 1の説明で述べた前記癌細胞（非処理）を接種し、そして、図 1の説明で述べた方法により肺転移を評価した。使用した CSまたは DS製剤は、 CS-A, C S-B, CS-C, CS-Dおよび CS-Eである。また、ゥシ腸管粘膜へパリンを含む 200 μ 1の DMEMを比較例（陽性対照）として用レ、、 200 μ 1の DMEM単独を陰性対照として用いた。図 2に、前記種々の CSァイソフォームによるルイス肺癌 H11細胞転移阻害を示す。図示の通り、試験した CSおよび DS製剤の具体的な阻害活性は、 CS-Eが 90%、 CS- Αが 80%、 CS-Dが 47%および CS-B (または DS)が 30%、へパリンが 62%という数値であつた。このように、試験した CSおよび DS製剤の全てが阻害活性を示した。特に、 CS-E および CS-Aは、陽性対照であるへパリンよりも強力な阻害活性を示し、中でも CS-E は最も強力な阻害活性を示した。

[0037] なお、へパリンは、強力な抗転移能を有することが長年知られている（Folkman, J.，

Langer, R.， Lmhardt, R. J., Haudenschild, し.， and Ί aylor, S. (1983) Angi ogenesis inhibition and tumor regression caused by heparin or a heparin fra gment in the presence of cortisone. Science 221, 719-725， Borsig, L.， Wo ng, R.， Feramisco, J., Nadeau, D. R.， Varki, N. M., and Varki, A. (2001)

Heparin and cancer revisited: mechanistic connections involving platelets, P-selectin, carcinoma mucins, and tumor metastasis. Proc. Natl. Acad. Sci.

U. S. A. 98， 3352-3357, Kragh, M" and Loechel, F. (2005) Non- antト co agulant heparins: a promising approach for prevention of tumor metastasis. Int. J. Oncol. 27， 1159—1167, Stevenson, J. L., Choi, S. H. , and Varki, A. (2005) Differential metastasis inhibition by clinically relevant levels of he parins―— correlation with selectin inhibition, not antithrombotic activity. Clin. Cancer Res. 11, 7003-7011)。実際、本研究でも、図 2の通り、へパリンは 62%の阻害を示した。しかし、前述の通り、へパリンには出血などの副作用があるため臨床応用には至っていない。

[0038] また、ルイス肺癌 H11細胞の転移に対する CS-Eの阻害活性について、コンドロイチナーゼ ABC処理の効果を試験するために、コンドロイチナーゼ ABCによる消化前または消化後の CS— Eについて、図 2の説明で述べた方法により、 H11細胞の肺転移に対する阻害活性を評価した。図 3に、その評価結果を示す。同図に示すとおり、 CS -Eにおける阻害活性の 80%は、 CSase ABC消ィ匕により無効にされた。この結果は、 C S-E製剤において、活性が不純物に由来するという可能性を排除する。

[0039] さらに、 CS-E阻害活性の用量依存性を試験した。具体的には、種々の用量 (10, 5 0， 100, 200および 300 z g)の CS- Eを、各マウス (n=6)について、図 2の説明で述べた方法により肺転移阻害活性を試験した。図 4に、その結果を示す。図示の通り、マウス 1匹あたり 100 μ gまでは用量依存性の阻害を示し、 100 μ gで転移阻害効果が最も高くなつた。

[0040] このように、コンドロイチン硫酸およびその誘導体、特に CS-Eおよび CS-A、中でも C S-Eは、 1つの抗転移薬剤としてへパリンより有望な候補となり得る。また、抗凝血作用等の他の作用も期待できる。

[0041] なお、本実施例において、ルイス肺癌 H11細胞は、京都産業大学の岡山實（Mino ru Okayama)教授力提供を受けた。 C3H/HeNマウス（雌）は、日本エスエルシー株式会社（浜松）から購入した。 CSおよび DS製剤は、特級品（superspecial grade)であり、生化学工業株式会社から購入した。 CS-Eはイカ軟骨由来であり、 CS-Aは鯨軟骨由来であり、 CS-Dは鮫軟骨由来であり、そして、 CS-Bほたは DS)は、ブタの皮膚由来である。

[0042] 以上の通り、本実施例によれば、マウス由来高転移性ルイス肺癌 H11細胞を用い、コンドロイチン硫酸およびその誘導体、特に CS-Eおよび CS-A、中でも CS-Eの腫瘍細胞転移阻害活性を確認することができた。

実施例 2

[0043] [デングウィルス感染阻害]

本実施例は、コンドロイチン硫酸およびその誘導体の少なくとも一方を含む前記本発明の第 2の薬学的組成物および医薬のデングウィルス感染阻害活性等に関する実施例である。

[0044] 本実施例では、各種多硫酸化 CSのデングウィルスに対する感染阻害活性を測定した。本実施例における実験プロトコールは、 Chie Aoki, Kazuya I.P.J. Hidari, Sak l itonori, Akihiro Yamada, Naonori Takahashi, Takesm Kasama, Futoshi Has ebe, Mohammend Alimul Islam, Ken Hatano, Koji Matsuoka, Takao Taki, C hao-Tan Guo, Tadanobu Takahashi, Yuichi Sakano, Takashi Suzuki, Daisei Miyamoto, Mutsumi Sugita, Daiyo Terunuma, Koichi Morita and Yasuo Suzu ki J. Biochem. (Tokyo) in press (2006)に記載の方法「焦点力価アツセィ（Focus -forming assay)」および「デンドリマーによるウイノレス感染阻害（Inhibition of virus i nfection by dendrimers)」に準じて行った。すなわち、具体的には以下の通りである

[0045] (焦点形成アツセィ）

ウィルス力価は、 BHK-21細胞を用いた焦点形成アツセィにより決定した。 BHK-21 細胞は、 96ゥエルプレート上に播種し、そして、 2% FBSを含む DMEM中、 37°Cで 24 時間培養した。培地除去後、血清フリー DMEMで連続的に希釈したウィルス溶液を前記プレート上に播種し、そして、前記細胞を 37°Cで 2時間インキュベートした。前記ウィルス溶液除去後、上敷き培地（1% FBSおよび 0.5%メチルセルロースを含む DME M)を添カ卩し、そして、プレートを 37°Cで 44時間インキュベートした。前記細胞を固定化し、そして、 5%パラホルムアルデヒドおよび 1% NP-40をそれぞれ含む PBSで透過処理した。感染性病巣は、ヒト抗デング抗血清を一次抗体とし、 HRP複合化ャギ抗ヒト免疫グロブリンを二次抗体として検出した。ウィルス感染性は、焦点形成ユニット（FFU) により決定した。

[0046] (デンドリマーによるウィルス感染阻害）

DEN2(最終濃度 l，800FFU/ml)を、扇形、球形およびダンベル形デンドリマーと、指示濃度で予備混合した。前記ウィルスとデンドリマーの予備混合物（125 μ ΐ)を、続いて、 48ゥヱルプレートで増殖させた BHK-21細胞に、 37°Cで 2時間播種した。血清フリ一 DMEMで 3回洗浄後、上敷き培地を添加し、そして、プレートを 37°Cで 43時間インキュペートした。細胞の感染性病巣は、続いて、前述の焦点形成アツセィにより可視化し、そして、光学顕微鏡で計数した。播種ウィルスの最適力価は、 1ゥエルに少なくとも 50の病巣が発現するように予備決定した。

[0047] 上記実験プロトコールに従レ、、デングウィルス 2型感染の、コンドロイチン硫酸（CS) 製剤による阻害を測定した。具体的には、 CS-A， CS-B, CS-C, CS-D, CS_E， CS-K, へパリンまたはへパリン硫酸を 5 μ g/mL濃度で用い、 BHK-21細胞に対するデングウィルス 2型感染を阻害した。へパリンは、陽性対照として用いた。図 5に、その結果を示す。図中の「ウィルス（Virus)」は、デング 2ウィルスエンベロープタンパク質を表し、そして、感染力⁰ /₀ (% of Infectivity)は、インヒビターなしで得られた値との比較で表している。数値は 3回の独立実験の平均値として得た。

[0048] 図 5から分かる通り、いずれの CS製剤もデングウィルス感染に対する阻害活性を示した。特に、 CS-Eおよび CS-Kは、へパリンと同等以上の強力な阻害活性を示した。

[0049] 次に、 CS-Eまたはへパリンのデングウィルス 2型感染に対する阻害効力を測定するために、濃度を次第に減少させて (0-5 μ g/mL範囲)、濃度依存阻害活性を測定した。図 6に、その結果を示す。図中の用語については、図 5と同様である。また、実験プロトコールの詳細も、前記と同様である。図 6から分かる通り、 CS-Eは濃度依存性の阻害活性を示した。

[0050] さらに、酸化処理により化学修飾した CS-E (CS-E誘導体)製剤の、デングウィルス 2 型感染阻害活性を測定した。すなわち、 CS-E, CS-EP (CS-Eを過ヨウ素酸で 120時間処理したもの)および CS-EPA(CS_EPを 1M NaOHで加水分解したもの)を、 5 μ g/m L濃度でデングウィルス 2型感染阻害に用レ、、活性を測定した。図 7に、その結果を示す。同図から分かる通り、 CS-Eのみならず、酸化処理した CS-EPおよび CS-EPAも、有効なデングウィルス 2型感染阻害活性を示した。これら CS-EPおよび CS-EPA等の化学修飾製剤は、酸化処理による副作用の軽減で、母体の CS-Eよりも臨床等の用途にさらに有用であることが期待される。なお、図中の用語については図 5と同様であり、実験プロトコールも前記と同様である。

[0051] なお、本実施例で用いた CS-Eは、実施例 1と同じぐ生化学工業株式会社から購入した。 CS-Kは、当業者であれば、技術常識に基づいて、過度の試行錯誤や複雑高度な実験を行うことなぐカブトガニ軟骨から単離精製することができる。前記単離精製方法としては、具体的には、例えば、 Seno, N.， Yamashiro, S.， and Anno, K . (1974) Biochim. Biophys. Acta 343, 423-426等に記載の方法、あるいは他のプロテオダリカンの単離精製方法と同様の方法を用いることができる。本実施例で用レヽた CS-Kは、 Seno, Ν· , Yamashiro, S.， and Anno, K. (1974) Biochim. Bioph ys. Acta 343, 423-426に記載の方法に準じて単離精製した。すなわち、まず、力ブトガ二の鰓の軟骨部分を他の組織と分離し、小片に切断した後、アセトン処理により脱脂した。この軟骨を乾燥させた後、プロナーゼで徹底消化した。この消化物をトリクロ口酢酸処理し、セチルピリジニゥムクロリドを用いたエタノール沈殿法によりムコ多糖を抽出した。そのムコ多糖を、陰イオン交換樹脂カラム Dowexl (Sigma社の商品名、 X-2、 200-400メッシュ、 C1—フォーム、 2.8cm X 40cm)に力けた。 0.15M NaCl水溶液と 0.5M NaCl水溶液で前記カラムを順次洗浄後、 2.0M NaCl水溶液により CS-Kを溶出させ、透析および凍結乾燥の後、本実施例に用いた。

[0052] 以上の通り、本実施例によれば、培養細胞を用い、コンドロイチン硫酸、特に、 CS- K、 CS-Eおよびその誘導体のデングウィルスに対する感染阻害活性を確認することができた。また、過ヨウ素酸で酸化処理した CS-Kについても、同様の活性を確認した

実施例 3

[0053] [増殖因子結合活性等]

本実施例は、 CS_K、酸化処理した CS-Kおよび酸化処理した CS-Eからなる群から選択される少なくとも一つを含む前記本発明の第 1の薬学的組成物および医薬の増殖因子結合活性等に関する実施例である。

[0054] 本実施例では、まず、精製コンドロイチン硫酸 K (CS-K、カブトガニ由来）の、種々の増殖因子および神経栄養性因子に対する結合活性を測定した。すなわち、ビォチン化 CS-Kをストレプトアビジン被覆センサーチップ上に固定化し、増殖因子および神経栄養性因子との結合を確認した。具体的には、 50ngの HGFまたは種々の因子各 1 OOngを灌流させ、そして、 Nandini, C. D.， Mikami, T.， Ohta, Μ·， Itoh, Ν·， Na mbu, F. A., and Sugahara, K. (2004) J. Biol. Chem. 279(49), 50799—50809 .に記載の方法で、 BIAcoreシステム（商品名）中、ランニングバッファを用レ、、各因子を固定化 CS-Kと 4分間相互作用させて行った。より詳しくは以下のとおりである。

[0055] すなわち、まず、ストレプトアビジン被覆センサーチップ（商品名 BIAcore AB)を、製品マニュアルに従い、 1M NaClと 50mM NaOHを用いて 1分間コンディショニングし、それを 3回繰り返した。ピオチン化 CS-Kをリン酸緩衝食塩水中で灌流し、リン酸緩衝食塩水で、前記センサー表面と 3分間相互作用させた。固定化は、応答ユニット (response units, RU)の増加により確認した。相互作用解析は、前記 CS-Kを固定化したセンサーチップを用い、 BIAcore Jシステム（商品名）により行った。 HGF (50ng) または他の各増殖因子（各 lOOng)は、それぞれ、ランニングバッファ (10mM HEPES- NaOH(pH 7.4), 0.15M NaCl, 3mM EDTA，および 0.005% Tween 20)中において、前記固定化 CS-Kとの結合を確認した。流速は、製品マニュアルに従レ、、中程度の 30 z l/minに保った。各増殖因子は、固定化 CS-Kと 4分間相互作用させ、これを会合段階 (association phase)とした。さらに追加の 2分間で、増殖因子の解離 (解離段階 , dissociation phase)をさせた。その後、 1M NaClを 2分間注入して、前記センサーチップを再生させた。神経栄養性因子（各 lOOng)は、 60 μ 1/minの高い流速で固定化 CS-Kと相互作用させた。会合段階および解離段階は、それぞれ 4分間および 2分間とした。

[0056] 結合の結果として得られた会合段階は、応答ユニット (RU)によって測定した応答として扱った。図 8に、その結果を示す。

[0057] さらに、表面プラズモン共鳴測定装置（商品名 BIAcore)による固定化 CS_Kと増殖因子の相互作用の速度論的解析を行い、動力学的パラメータを決定した。表 1に、その結果を示す。

[0058] [表 1]

Factor K_d

s -1

nM

HGF 4.84 ± 2.85 x 10⁴ 5.79 ± 8·04 χ10-⁴ 11.96

FGF18 1.79土 0.38 xlO⁵ 8.39 ± 4.34 xlO-⁵ 0.47

PTN 1.38 ± 1.25 xlO⁵ 1.09 ± 1.33 xlO ³ 7.89

MK 6.46土 5.44 xlO⁴ 1.32 ± 1.47 xlO"³ 20.43

BDNF 1.42 ± 0.17 xlO⁴ 3.23 ± 1.91 xl0 ³ 227.46

GDNF 1.63 ± 0.56 xlO⁴ 8.84 ± 4.17 xl0³ 542.33

表 1中、動力学的パラメータ ka (会合定数）、 kd (解離定数)および Kd (解離平衡定数）値は、 Nandini, C. D.， Mikami, T.， Ohta, Μ·, Itoh, Ν.， Nambu, F. A., and Sugahara, K. (2004) J. Biol. Chem. 279(49), 50799-50809·と同様、 BIAev aluation 3.1ソフトウェア（商品名）により、 1： 1ラングミュア結合モデルを用レ、、物質輸送により決定した。各因子の結合および解離速度値は、 5の異なる濃度の平均土 S.E .M.として表現した。

[0060] 図 8および表 1から分かる通り、 CS-Kは、各因子に対応した結合活性を示した。

[0061] 次に、 CS-Kの神経突起伸長活性を、 CS-Eと併せて測定した。すなわち、 E16海馬ニューロン (10, 000個細胞ん m²)を、 P-ORN (ポリオル二チン）でプレコートした基層上で 24時間伸長させ、 CS-E (陽性対照）または CS-Kで固定し、そして、 2. Hikino, Μ· ， Mikami, . , raissner, A. , Vilela-bilva, A.E.5. , Pavao, M.b.G. , and Sugaha ra, K. (2003) J. Biol. Chem. 278(44), 43744-43754.に記述の方法により、微小管結合タンパク質 2およびニューロフィラメントを染色した。より詳しくは以下のとおりである。

[0062] まず、 E16マウス胚を解剖して海馬を取り出し、ハンクス液（Hanks ' balanced salt solution)で 10回洗浄し、 0.25%(w/v)トリプシンを含む同じハンクス液を用いて 37°Cで 1 0分間解離させ、続いて穏やかに倍散させた。単一の細胞を、 N2サプリメント (Invitrog en社、日本国、東京)、 O. lmM ピルビン酸塩、 0.1%(w/v)卵白アルブミン、 0.029% L- グノレタミン、 0.2% 炭酸水素ナトリウムおよび 5mM HEPESを含むイーグルの最小必須培地（Eagle ' s minimum essential medium)に再懸濁させた。この細胞を、続いて、 P-ORN (ポリオル二チン）でプレコートした基層上、 10,000個細胞ん m²密度に接種し、組織培養インキュベータ中、 5%CO雰囲気下、 37°Cに保った。 24時間培養後、前記

2

細胞を、 4%(w/v)パラホルムアルデヒドで 30分間固定化し、 PBSで 3回洗浄し、 0.2%(w/ v) Triton X_100 (商品名、 GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社）を含む PBSを用いて室温で 30分間透過処理した。この細胞を、 100倍希釈の抗微小管結合タンパク貧 2 (anti—microtuble— associated protein 2、 Leico i echnologies Inc.社、^ズ¹ ~リ州セントノレイス）および 250倍希釈の抗ニューロフィラメント (anti- neurofilamentシグマ社、ニューロフィラメント Hサブユニットのリン酸化または非リン酸化形態と特異的に反応する)、および 3%(w/v)ゥシ血清アルブミンを含む抗体含有 PBSで免疫染色した。そして、 3，3 '—ジァミノべンジジンを色素源とし、 Vectastain ABCキット (Vector Labora tories Inc.社 (カナダ国 Burlingame)の商品名)で展開した。各培養条件について、 2 回の実験を行った。

[0063] 図 9 (A)に、前記 CS-Eまたは CS-K被覆基層上で培養したニューロン (神経細胞）の、増大した神経長および代表的形態を示す。また、生成した神経突起を定量的に分析した。すなわち、 100個のランダムに選択した個々のニューロンを、各条件下における最長神経細胞の平均長測定に用い、 2回の個別実験により得られた値を、平均土 S.E.M.として表現した。図 9 (B)に、その結果を示す。図 9 (A)および（B)から分力、る通り、 CS-K培養ニューロンは、 CS-Eに匹敵する量および神経長を示した。

[0064] さらに、本実施例では、酸化処理により化学修飾した CS-Eを用い、ニューロンを刺激した。すなわち、 E16マウス由来の海馬ニューロン (10, 000個細胞ん m²)を、 P-ORN および続いて CS-E (陽性対照）、 CS-EP (過ヨウ素酸処理した CS-E)または CS_EPA ( 1M NaOHで処理した CS-EP)でプレコートした種々の基層で 24時間かけて伸長させ、固定し、そして、微小管結合タンパク質 2 (MAP2)およびニューロフィラメントを染色した。より詳しい操作は、前述と同様である。図 10 (A)に、 CS-E, CS-EPまたは CS-E PA被覆基層で培養したニューロンの、増加した神経突起長および形態学的特徴 (代表的形態）を示す。 CS-EPで培養したニューロンは、 CS-Eについて観測したそれと比較して顕著に長い神経突起を示した。一方、 CS-EPA被覆基層上の細胞は、複数の神経突起を示した。

[0065] さらに、生成した神経突起を定量的に分析した。すなわち、 100のランダムに選択した個々のニューロンを、各条件下での最長神経突起長の平均値測定に用い、 2回の個別実験により得られた値を、平均値土 S.E.Mで表した。図 10 (B)に、その結果を示す。同図から分かる通り、化学修飾 (酸化処理）による副作用の軽減が期待される CS -EPおよび CS-EPAも、 CS-Eとほぼ遜色ない神経突起伸長促進活性を示した。

[0066] なお、本実施例において、 CS-Kは、実施例 2と同様の方法で単離精製したものを用いた。 CS-Eは、生化学工業株式会社から購入した。

[0067] 以上の通り、本実施例によれば、マウスの培養海馬ニューロンを用レ、、 CS-Kおよび酸化処理 CS-Eに、神経突起伸長促進活性およびその基盤となると考えられる細胞増殖因子結合活性が存在することを確認することができた。また、同様に、過ヨウ素酸により酸化処理した cs-κおよびさらにアルカリ処理した cs-κについても、同様の活性を認めた。これら CSおよびその誘導体は、培養液中に細胞から分泌される種々の増殖因子と糖鎖が結合し、細胞に提示していると推測され、これらの CSおよびその誘導体自体が増殖因子結合医薬として有効利用できると考えられる。

実施例 4

[0068] [3-0-硫酸化グルクロン酸を含む CS-Kテトラサッカリドのコンドロイチナーゼ ABCによる消化、および分解生成物であるジサッカリド中間体の構造決定]

[0069] 本実施例は、質量分析を用いて硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖の構造を解析する前記本発明の分析方法に関する実施例である。

[0070] 本発明者らは、以前、カブトガニ軟骨から単離した CS-K由来の希少なテトラサッカリド GlcA(3S) β l-3GalNAc(4S) β l_4GlcA(3S) β l_GalNAc(4S) (Κ_Κ)の構造を決定した (Sugahara, K., Tanaka, Y.， Yamada, S., Seno, N., and Kitagawa, H. (1 996) J. Biol. Chem. 271(43), 26745-26754·)。上記テトラサッカリドのコンドロイチナーゼ ABC(CSase ABC)消化は、還元末端から形成される Δ HexA(3S)を含む不安定なジサッカリドユニットを生成し、非還元末端からは、飽和ジサッカリドユニットのみを生ずる。

[0071] 本実施例では、 CSase ABC消化後の Δ HexA(3S) a l_3GalNAc(4S)分解生成物を ESト MSのネガティブイオンモードで分析し、従来の分析方法では検出不可能であつた構造を検出した。

[0072] さらに、検出された構造から、前記 CSase ABC消化において起こりうるメカニズムを推測した。前記推測されるメカニズムの概要は以下の通りである。すなわち、分解（消ィ匕）は、 A HexAユニットからの水分子、二酸化硫黄およびアセチレンの損失に関連する。 A HexA(3S)ユニットからの二酸化硫黄損失の間、 C -C炭素は、舞接炭素 Cおよび Cに水素化物イオンを連続的に与えて 5，6-ジヒドロキシ -6- [GalNAc(3S)-4-ォキシ] -へキサ -1-イン- 3,4-ジオンを形成し、 SP²混成となる。さらに、分解工程中においては、中間体である 1-ヒドロキシ _l-[GalNAc(3S)-4-ォキシ] -ブタ -3-イン- 2-オンを生じ、前記中間体は、最終生成物として GalNAc(4S)を与える。ただし、この推測は、本発明をなんら限定するものではない。 [0073] 以下、本実施例における分析方法および前記推測されるメカニズムについて、さらに詳しく説明する。

[0074] [CS-Kテトラサッカリドの CSase ABCによる消ィ匕]

まず、実施例 2と同様の方法により、カブトガニ軟骨から CS-Kを単離した。その CS- Kを、 bugahara, Κ·， Shigeno, Κ·， Masuda, Μ., rujn, Ν· , Kurosaka, A., and Takeda, K. (1994) Carbohydr. Res. 255, 145-163.に記述されている方法で消化して CS-Kテトラサッカリドを調製した。すなわち、まず、 50mgの CS-Kを、 2.0mLの 0. 05M Tris ' HCl緩衝液（pH8.0、 60mM酢酸ナトリウムおよび 100 μ g/mLゥシ血清アルブミンを含む）中、 0.9ユニットのコンドロイチナーゼ ABC (生化学工業株式会社より購入）により 37°Cで 22時間消化した。その後、 0.1ユニットのコンドロイチナーゼ ABCを追加してさらに 18時間消化した。反応は、波長 232nmにおける UV吸収で追跡した。この反応混合物に 1M Ac〇Hをカ卩えて pHを 6.5に調整し、 100°Cで 1分間煮沸して反応を停止させた。この消化物を、 Sephadex G-15 (GEヘルスケアバイオサイエンス社の商品名）カラムでゲルろ過した。溶出液には、 0.25M NH HCO -7% 1—プロパノール水

4 3

溶液を用いた。ゲルろ過物に水を加え、エバポレーシヨンにより脱塩し、再度水に溶解させ、 HPLCにより精製して目的のテトラサッカリドを得た。この CS-Kテトラサッカリド (K-K)[GlcA(3S) i3 1- 3GalNAc(4S) i3 1- 4GlcA(3S) i3 1- GalNAc(4S)](0.5nmol)を、 Sugah ara, K., Shigeno, K. , Masuda, M., Fujn, N., Kurosaka, A., and Takeda, K . (1994) Carbohydr. Res. 255， 145-163.に記述されている標準条件（CS-Kテトラサッカリド 0.5nmolに対するコンドロイチナーゼ ABCの使用量 40 し、温度 37°C、緩衝液中）で 10分間、 5mIU/mL コンドロイチナーゼ ABC (生化学工業株式会社カ購入）により消化した。その反応混合物を、ナトリウム化に基づくピーク（sodiated peaks )を抑制するために、 0. 1 %酢酸を含む 50%ァセトニトリルに溶解させて溶液 (90: 10) とし、 ESト MSのネガティブモードにかけた。図 11に、 CS-Kテトラサッカリド (K-K)の CS ase ABC消化物における ESI-MSスペクトル（200〜700m/z amu間）を示す。図 12に、 97における硫酸基（sulfite group)についてのプリカーサ一イオンモードにより得られた ESI-MSスペクトルを示す。図 13に、 300[GalNAc (4S)]についてのプリカーサ一イオンモードにより得られた ESI-MSスペクトルを示す。 [0075] 上記分析の結果として、 CSase ABCにより消ィ匕された CS-Kテトラサッカリド (K-K)は、還元末端からは、主要な不飽和ジサッカリドは何も生成しなかった。 584.8におけるピークの存在（図 11)は、飽和の CS-Kジサッカリドユニットであるとアサインすることが出来る。本発明者らは、 A HexA(3S)ひ 1- 3GalNAc(4S)ユニットについて可能性のある分解生成物ピークを 300.3に同定し、そして、 1つの中間体のピークを 382に同定した。 CSオリゴサッカリド類は、それらの構造に関係なぐ全て硫酸基 (sulfate group)を含む。そのため、本発明者らは、ネガティブイオンモードにおいて 97を硫酸基（sulfite group)のプリカーサ一イオンと分析した。その結果、主要なピークが 300.3， 382.4 に得られ、そして、検出可能な中間体ピークが 440.5に得られた（図 12)。さらに、 300 におけるプリカーサ一イオンピークは、 358.1， 382.0, 416.3および 440.1に、可能性のある親中間体単独としての主要ピークを与えた（図 13)。

[0076] 上記 ESト MSスペクトルに基づき、本発明者らは、 Δ HexA(3S) α 1- 3GalNAc(4S)の分解において可能性のあるメカニズムを、下記スキーム 1、 2および 3のように推測した。ただし、前述の通り、この推測は、本発明をなんら限定するものではない。

[0077] [化 1]

CS-Kテトラサッカリド（K-K)

理論分子質量: 539.03 理論分子質量: 585.00 分解 (被検出ピーク 584.8) 中間体

(被検出）

QalNAc(4S)

(被検出）スキーム

理論分子質量: 383.05 理論分子質量: 359.05 理論分子質量: 301.05 スキ一ム 2

上記スキーム 1、 2および 3についての説明は、以下の通りである。すなわち、まず、 GlcA(3S) β l-3GalNAc(4S) β l-4GlcA(3S) β 1- GalNAc(4S) [Κ_Κ]の CSase ABC酵素による消化は、不安定なジサッカリドユニット Δ Κ (化合物 3)を生じた。 ESI-MSスぺタトルによれば、さらに多くのフラグメントピークが明らかになった。それらは、 CSase ABC消化後に生じる分解した低分子量および不安定な中間体である可能性があり、本発明者らは、 GalNAc(4S) (化合物 9)に加え、アセチレン中間体すなわち 1_ヒドロキシ -l-[GalNAc(3S)-4-ォキシ] -ブタ -3-イン- 2-オン (ィ匕合物 7)と同定した。最初に親テトラサッカリドから遊離した A HexA(3S) a l-3GalNAc(4S)は、不安定であり、隣接する β -不飽和酸 (Cおよび C )を攻撃する 3-0硫酸エステル基（sulfate group)の影響

4 5

により分解した (スキーム 2)。 C炭素は隣接する C炭素の電子を吸引し、それにより

5 4

Δ ΗΘΧΑ環は開裂し、そして、続いて、 C炭素に隣接する C炭素も、水分子が脱離し

4 3

て化合物 5が形成されるまでこの工程に関与する（スキーム 3)。 HexAユニットにおいて高い歪みのかかった Cおよび C炭素は、 SO分子を喪失して 5

3 4 2 ，6 -ジヒドロキシ -6-[

GalNAc(3S)_4 -ォキシ]-へキサ- 1_イン- 3，4 -ジオン（化合物 5)に達することで SP²となること力 S示される。前記中間体 5は、さらに、熱的に不安定であり、同様の方式でのァセチレン脱離により、すぐに 3，4-dihydroxy_2_oxo-4-[GalNAc(3S)-4-oxy]_butanal6 を形成する。一般的には、 P 接するひ-ケトカルボアルデヒドは、不安定である。そのために、中間体 6は、水分子の脱離により安定な中間体 1 -ヒドロキシ _l-[GalNAc(3S) -4-ォキシ] -ブタ _3 -イン- 2_オン (化合物 7)を形成する。化合物 7は、 ESI-MSスぺタトノレ中において、プリカーサ一イオンモードスペクトルにより得られた GalNAc(4S)とともに、 m/z 382amuとして見出された。前記中間体 7は、アセチレンの遊離により中間体 8すなわち 2-ヒドロキシ -2-[GalNAc(3S)-4-ォキシ] -ァセトアルデヒドを与える。前記中間体 8は、すぐに水分子およびアセチレン基を失い、安定化合物 GalNAc (4S) (ィ匕合物 9)を最終生成物として与える。

[0081] なお、多くの文献は、光化学反応中、アジド溶液中に捕捉することによる C-グリコシノレ- α _アミノ酸の調製について、 C-グリコシルアセチレンを強力かつべターな中間体として、その使用に脚光を当てている（(a) Dondoni, A., Giovannini, P. P., and Massi, A. (2004) Organic Letters, 6(17), 2929-2932、 (b) Dondoni, A., Mario tti, G.， and Marra, A. (2002) J. Org. Chem. 67, 4475-4486 および (c) Don doni, A., and Marra, A. (2000) Chem. 100, 4395—4421.)。このことも、 GalNAc -〇-アセチレン形成がグリコプロテイン生合成の出発原料であるというメカニズムの推測の理由付けとなる。また、このメカニズムは、 3-〇-硫酸化 A HexA分解に対し一般的に適用可能である可能性がある。

[0082] 以上の通り、本実施例では、カブトガニ軟骨から得られた 3-〇-硫酸化グルクロン酸を含むテトラサッカリド GlcA(3S) β l-3GalNAc(4S) β 1- 4GlcA(3S) β l_GalNAc(4S)を C Sase ABCにより消化した後の分解において、中間体と考えられる 1_ヒドロキシ _ 1_[G alNAc(3S)-4-ォキシ] -ブタ -3-イン- 2-オンを同定した。また、 GalNAc(4S)を最終生成物として与える前記分解工程中にぉレ、て推測されるメカニズムにつレ、ては、前述の通りである。

実施例 5

[0083] [種々の GAGsの構造解析]

[0084] 本実施例は、質量分析を用いて硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖の構造を解析する前記本発明の分析方法に関する実施例である。本実施例では、 CS-Kのみならず CS-Eについても酵素消化（分解）物の ES卜 MSによる分析を行レ、、 3-0-硫酸化グノレクロン酸を含むジサッカリドを検出した。これにより、本発明の分析方法が種々の硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖に適用可能であることを示した。なお、 CS-Kは、前記と同様に調製したものを用い、 CS-Eは市販品を用いた。

[0085] 前述の通り、 CS-Kおよび CS-Eをコンドロイチナーゼ ACIIや ACIで消化して硫酸化オリゴ糖とし、 NMR測定することにより、 CS-Kがグルクロン酸 3-0-硫酸 [GlcA(3S)]を多く含むことが報告されていた。コンドロイチナーゼ ABC(CSase ABC)消化による GlcA( 3S)の分解のため、 GlcA(3S)は、ァニオン交換 HPLCクロマトグラフィー分析による伝統的なジサッカリド分析では検出できなレ、（非特許文献 9)。本実施例では、 CS-Kおよび CS-Eの CSase ABC消化（分解）物を質量分析することにより、 GlcA(3S)を検出した。具体的には、 CS-Kおよび CS-Eの CSase ABC消化後における消化（分解）物に含まれる、分解中間体と思われる物質をモニターすることにより、有意な量の GlcA(3S)を含むことを確認した。

[0086] 第一に、標準的な Δ Α-Κテトラサッカリド [ A HexAひ l-3GalNAc(4S) β 1-4 GlcA(3S ) β l-3GalNAc(4S)] (Kinoshita, A. , Yamada, S.， Haslam, M. S. , Morris, H. R. , Dell, A. , and Sugahara K. (1997) J. Biol. Chem. 272, 19656-19665)を、モデル化合物として CSase ABCで消ィヒし、そして、その消化物を、優れた感度および分解能のためにフルオロフオア 2-ABで標識した（Kinoshita, A. , and Sugahara, K.

(1999) Anal. Biochem. 269, 367-378)。続いて、前記生成物を、ァニオン交換 H PLCおよびァミノ結合シリカ PA-03カラム (株式会社ヮイエムシィ（日本国、京都）の YM C-Pack PA (商品名）)を用レ、、下記フローチャート 1に記載の伝統的条件 Aで分析した。

[0087] [数 1] フローチヤ一ト 1 ：標準的 M-Kテトラサッカリド [MfexA a l-3GalNAc (4S) j3 1- 4GlcA (3S) β

l-3GalNAc (4S) ]または力ブトガニ軟骨由来 CS - K

I

CSase ABC消化

i

2-AB標識

i

2 - ABのク口口ホノレム抽出

4

HPLC条件 Aを用、たァュオン交換 HPLC HPLC条件 A：

緩衝液 A= 1 M NaH₂P0₄,緩衝液 B = 16 m NaH₂P0₄

勾配： 60分間に対し B濃度 100%〜47%

1

Superdexぺプチドカラムを用いたゲル'濾過 HPLCによる分画

Ϊ

収集した GalNAc (4S)フラクション

I

エバポレーシヨンの繰り返しによる脱塩

i

エレクトロスプレーイオン化マススぺクトロメトリー（ESI-MS)による GalNAc (4S)

フラクションの分子質量測定

[0088] 図 14に、 Δ Α-Κテトラサッカリド CSase ABC消化物のァニオン交換 HPLCクロマトグラムを示す。図示の通り、前記 CSase ABC消ィ匕物は、 Δ Α[ Δ HexA a l-3GalNAc(4S) ]ジサッカリドユニットおよび Δ Ο[ Δ ΗΘΧΑひ 1- 3GalNAc]を、モル比 45.7:54.3で含んでいた。このピークをさらにキャラクタライズするために、 CSase ABC消化物の一定分量を、ゲル濾過でフラクション化（分画）した（フローチャート 1)。前記フラクションを集め、 ESI-MSにかけた。図 15に、その ESI-MSスペクトルを示す。図示の通り、前記 ESI-M S (ネガティブイオンモード）の特性は、 m/z 420に主なシグナルを示した。これは、 2- ABで標識した一硫酸化 GalNAcの分子量に対応する。このシグナルが示す物質については、必ずしも全てが明らかではないが、 A HexA a l-3GalNAc(4S)の分解に由来する物質であり、 CSase ABCの GalNAc(4S)に対する作用により生成されたと考えるのが合理的である。この生成メカニズムは、例えば、実施例 4で述べたように推測される。

[0089] 第二に、 CS-Kの試験サンプルを、前記フローチャート 1に示す工程に従って CSase

ABC消ィ匕に力けた。図 16に、このようにして CSase ABC消化し 2-AB標識した CS_K ポリサッカリド製剤のァニオン交換 HPLCクロマトグラムを示す。図示の通り、この HPL C特性は、 GalNAc(4S)の位置にピークの存在を示した。このことは、 ESI-MSにより確認された（データ示さず）。 Δ Aピークに観測されたスモールショルダーは、以下に述ベる通り GalNAc(4S,6S)と推測される。また、下記表 2に、 HPLCにより決定した CS-K の糖組成を示す。

[0090] [表 2]

CSaseABC消化物

組成物 CS-E由来テトラサッカリド

CS-K

フラクション *

pmol%

Δ0 6.5 ND

AC 3.6 ND

ΔΑ 29.7 29.4

△D 1.9 ND

ΔΕ 18.8 ND

GalNAc (4S) 10.4 59.2

GalNAc (4S, 6S) 29.1 11.4

全量 100 100 カブトガニ軟骨由来 CS-K組成物と、 CSases ACIおよび ACII抵抗性 CS- Eテ

トラサッカリドフラクションを示す。 CS-Kおよび前記テトラサッカリドフ

ラクシヨンは、それぞれ CSase ABCで消化した。各消化物は、 2-ABで標識

し、ァニオン交換 HPLCで分析した。

* CSases ACIおよび ACII抵抗性テトラサッカリドフラクション

[0091] 2-AB-標識 Δ 0ユニットおよび 2-AB-標識 GalNAc(4S)の保持時間は互いに近レ、。このため、本発明者らは、ァニオン交換 HPLCにおいてこれらのピークをより良く分解するために、前記フローチャート 1に示した伝統的条件 Aを HPLC条件 Bに改変した測定も行った。 HPLC条件 Aと HPLC条件 Bとの相違点は、緩衝液勾配である。具体的には、 HPLC条件 Aでは、緩衝液 A (1M NaH PO )と緩衝液 B (16mM NaH PO )の勾配を

2 4 2 4

、 60分間に対し緩衝液 B濃度 100%〜47%としたのに対し、 HPLC条件 Bでは、最初の 20 分間は緩衝液 B濃度 100%とし、次の 40分間は 47%に減少させた。図 17に、 2-AB-標識不飽和 CSジサッカリド標準および GalNAc(4S)標準の、 HPLC条件 B下におけるァニオン交換 HPLCクロマトグラムを示す。図示の通り、 HPLC条件 B下では、 Δ Οユニットの 2- AB誘導体および GalNAc(4S)が良く分解された。

[0092] 第三に、イカ軟骨由来の CS-Eを分析した。

[0093] イカ軟骨が約 10%の GlcA(3S)を含むことは知られており、そして、 lOOmgの CS-Eを CS ase ACIIで徹底消化した後、テトラサッカリド Δ A_L[ Δ HexA a l-3GalNAc(4S) β 1-4 GlcA(3S) β l-3GalNAc(6S)], Δ A-K[ Δ HexA a l-3GalNAc(4S) β 1- 4GlcA(3S) β 1-3 GalNAc(4S)], Δ A-M[ A HexA a 1- 3GalNAc(4S) β 1- 4GlcA(3S) β l-3GalNAc(4S,6S) ], Δ E-K[ Δ HexA a l_3GalNAc(4S，6S) β l_4GlcA(3S) β l_3GalNAc(4S)]および Δ E -M[ Δ HexA a l_3GalNAc(4S，6S) β l_4GlcA(3S) β l_3GalNAc(4S，6S)]が 285， 243, 508， 48および 195mgの収量で得られ、 GlcA(3S)含有構造が単離されている（Kinoshi ta， A. , Yamada, S.， Haslam, M.S. , Khoo, K.H. , Sugiura, M.， Morris, R.H. , Dell, A.， and Sugahara, K. (2004) Biochemistry 43, 11063- 11074)。本発明者らは、今回、下記フローチャート 2により CS-Eの消ィ匕（分解）生成物を分析した。そして、 CSases ACIおよび ACII抵抗性テトラサッカリドフラクションの 2-AB標識後におけるァニオン交換 HPLCクロマトグラフィーで、 GalNAc(6S)および GalNAc(4S，6S)であると推定される 2つの生成物をさらに検出するという進歩があった。図 18に、 2-AB標識後の、 CSases ACIおよび ACII抵抗性 CS-Eテトラサッカリドフラクション CSase ABC 消化物のァニオン交換 HPLCクロマトグラムを示す。

[数 2]

フローチヤ一ト 2

イカ軟骨 CS- E l mg、生化学工業株式会社、コード No. 400678

I

CSases ACIおよび ACIIによる消化

I

Sephadex G~15カラムによるゲル'濾過ク口マトグラフィー

i

CSases ACIおよび ACII抵抗性テトラサッカリドフラクションの収集

I

エバポレーシヨンの繰り返しによる脱塩

I

CSases ACIおよび ACII抵抗性テトラサッカリドフラクションの CSase ABC消化

I

2-AB標識

I

2 - ABのクロロホノレム抽出

4

HPLC条件 Aを用いたァニオン交換 HPLC

HPLC条件 A : 緩衝液 A 1 M NaH₂P0₄ , 緩衝液 Β 16 mM NaH₂P0₄

勾配： 60分間に対し B濃度 100%〜47%

I

Superdexぺプチドカラムを用 V、たゲル濾過 HPLCによる分画

I

GalNAc (4S) , GalNAc (4S, 6S)と推定されるフラクションの収集

I

エバポレーシヨンによる脱塩

4

1 . エレクトロスプレーイオン化マススぺクトロメトリー（ESI-MS)のネガティ

ブモードを用いた GalNAc (4S) , GalNAc (4S, 6S)フラクションの分子質量測定

2 . HPLC条件 Bを用いた、 GalNAc (4S, 6S)と推定される生成物のァ-オン交換 HPCL

HPLC条件 B ;

最初の 20分間は B濃度 100%とし、次の 40分間は 47%に減少させた。この条件下で、 Δ0および GalNAc (4S)のピークを分離させた。 CSase ABCは、 Δ A— Kおよび Δ E— Kから GalNAc(4S)を、 Δ A-Lから GalNAc(6S)を、 Δ A-Mおよび Δ E-Mから GalNAc(4S，6S)を、 1.00： 0.98： 2.42のモル比で生じさせた。

GlcA(3S)を含むと思われるテトラサッカリドフラクションは、第一に、 CS-Eを CSases A CIと ACIIの混合物で消化して得た。これは、 GlcA(3S)に対する N-ァセチルガラタトサミン結合が、前記 2つの酵素に抵抗性であり、前記酵素に抵抗性のテトラサッカリドフラタシヨン中に濃縮されやすいためである。したがって、上記フローチャート 2の通り、その後のステップで、前記抵抗性テトラサッカリドフラクションを、 GlcA(3S)_含有構造の分析に用いた。 [0096] しかしながら、 Δ Α-L, Δ Α-Μおよび Δ Ε-Μ由来の GalNAc(4S)， GalNAc(6S)および/または GalNAc(4S，6S)は、内部シーケンスのみならず、 CS-Eポリサッカリド鎖の非還元末端力も生成されている可能性がある。それゆえに、対照実験で、前記 CS-E ポリサッカリド製剤を CSases ACIと ACIIの混合物により消化したところ、ァニオン交換 HPLCの GalNAc(4S)， GalNAc(6S)または GalNAc(4S，6S)部位には、何のピークも与えなかった。この結果は、 CS-Eが、ポリサッカリド鎖の非還元末端に、感知できるほどの量の GalNAc(4S), GalNAc(6S)または GalNAc(4S,6S)を含まなレ、ことを示す。

[0097] さらに、 CS- Eサンプル中の GlcA(3S)-結合 GalNAc(6S)および GalNAc(4S,6S)を GlcA( 3S)_結合 GalNAc(4S)とともに検出するために、 CSases ACIおよび ACIIに抵抗性の C S-Eテトラサッカリドフラクションを CSase ABC消ィ匕に力、け、 2-ABで標識した。続いて、この 2-AB標識消化物の一定分量を、 0.2M炭酸水素アンモニゥムを溶出剤として用レ、た Superdex (GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社の商品名）ペプチドカラムによるゲル濾過で分画した。図 19に、このゲル濾過のクロマトグラムを示す。

[0098] 図 19に示すフラクション 1〜5を個別に採取し、そして、各フラクションを ESト MSにかけた。ネガティブモードによる前記 ESI-MSでは、フラクション 1は未同定分子イオンシグナルを示し、一方、フラクション 2および 3は、それぞれ、 2-ABで標識した二硫酸化および一硫酸化ジサッカリドに対応する分子イオンシグナルを示した（データ示さず）。フラクション 5は、 m/z 420に主なシグナルを示した。これは、 2-ABで標識したー硫酸化 GalNAcの分子量に対応する。このことは、 GalNAc(4S)もしくは GalNAc(6S)または両方に対応する生成物が、 Δ Α-Κおよび Δ Ε-Κまたは Δ Α-Lの分解に由来することを示している。図 20に、図 19におけるフラクション 4の ESト MSスペクトルを示す。図示の通り、フラクション 4では、前記スペクトルは、 m/z 522に分子イオンシグナルを示した。これは、 2-ABで標識した一ナトリウム化二硫酸化 GalNAcの分子質量に対応する。この生成物は、 Δ Α-Μおよび Δ Ε-Μの CSase ABC消化後の分解により生じた GalN Ac(4S,6S)であると考えるのが合理的である。

[0099] 本発明者らは、前記ゲル濾過 HPLCによるフラクション 4の溶出位置にさらに注目し、前記フローチャート 2に記載の通り、前記フラクション 4の一定分量をァニオン交換 H PLCに力けた。図 21に、図 19におけるフラクション 4の、フローチヤ一卜 2に記載の HP LC条件 B下でのァニオン交換 HPLCクロマトグラムを示す。図示の通り、 HPLC特性は、 Δ Aの溶出位置に単一の主要なピークを示した。

[0100] さらに、図 19におけるフラクション 4を、 HPLC条件 B下でのァニオン交換 HPLCクロマトグラフィ一により、信頼性のある Δ CSジサッカリド標準および 2-AB標識 GalNAc(4S )標準混合物との共クロマトグラフィーにかけた。図 22に、そのクロマトグラムを示す。図示の通り、このクロマトグラムは、 ΔΑのショルダーピークとして特異的に、 A Cと Δ Α の間のフラクション 4ピーク溶出を示した。このピークのモルパーセンテージは、表に示す通り、 ACIおよび ACIIに抵抗性のテトラサッカリドフラクションにおけるジサッカリド組成物全量の 29%に相当する。これは、 ΔΑ-Μおよび Δ Ε-Μユニットの両方に由来する GalNAc(4S,6S)の検出についての最初の報告である。対照実験として、 CS-Eポリサッカリド製剤を CSases ACIおよび ACIIの混合物で消化したところ、ァニオン交換 HPL Cでは GalNAc(4S,6S)溶出位置に何の有意なピークも与えなかった。このことは、前述の通り、 CS-Eはポリサッカリド鎖の非還元末端に検出可能な量の GalNAc(4S，6S)を含まないことを示す。興味深いことに、 CS-Kの CSase ABC消化物もまた Δ Aにショルダ一ピークを示した。このショルダーピークは、 CS-Kの Mユニットに由来する GalNAc(4S， 6S)を表すと思われる。

[0101] 以上の結果は、本実施例においてフローチャート 1および 2等で述べた工程が、 Δ A-Kおよび Δ E-K由来の GalNAc(4S)と Δ A-Mおよび Δ E-Mシーケンス由来の GalNA c(4S,6S)の検出および定量を可能にすることを明確に示す。すなわち、本発明の分析方法は、単純へルぺスウィルス感染を阻害する強力な生物活性を有する CS-Eおよび CS-K製剤の質の確認に適用できる。なお、 CS-Eおよび CS-Kの単純ヘルぺスゥイノレス感染阻害については、 Bergefall, K., Trybala, Ε·, Johansson, M., Uyama,

T.， Naito, S.， Yamada, S.， Kitagawa, H., Sugahara, K., and Bergstrom, T . (2005) J. Biol. Chem. 280, 32193- 32199および Bergefall, K., Trybala, E.， Johansson, M., Uyama, T.， Naito, S.， Yamada, S.， Kitagawa, H.， Sugahara,

K., Bergestrom, T. (2005) in Abstract or international Symposium on "Pro teoglycans in signaling， Sep. 7-11, 2005, Stockholm, Sweden, abstract 81 に記載されている。 [0102] 以上の通り、本実施例によれば、質量分析を用い、 GlcA(3S)含有二糖単位を高感度で簡易に検出し、 CS-Eと CS-Kにおけるその含量を決定することに成功した。産業上の利用可能性

[0103] 以上説明した通り、本発明によれば、硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖の構造を高感度で解析できる分析方法を提供することができる。本発明の分析方法によれば、硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖の生物活性の基盤となりうる構造、例えばコンドロィチン硫酸中に含まれる GlcA(3S)構造等を高感度で簡易に検出することができる。これにより、例えば、癌転移阻害、ウィルス感染阻害等の基盤となっている構造を解明することで、癌転移、ウィルス感染のメカニズム解明等の基礎医学分野への応用も期待できる。また、前記のような構造を検出することで、硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖の生物活性等の品質を評価し、抗癌剤、制癌剤、抗ウィルス薬開発等の創薬分野に応用することができる。

[0104] また、本発明によれば、優れた生物活性を有する硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖を含む薬学的組成物および医薬を提供することができる。本発明の薬学的組成物および医薬は、前記特定の硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖を活性物質として含むことにより、その活性物質に対応した優れた生物活性を有し、その生物活性や副作用の軽減により、種々の分野への適用が可能である。例えば、酸化処理による副作用の軽減は、 GAGのみならず、糖脂質、糖タンパク質等の糖鎖生物学、基礎医学、応用医学、創薬分野、糖鎖工学に新しい分野を切り開く突破口となると考えられる。

Claims

請求の範囲

[I] 硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖を酵素消化して得られる生成物を質量分析する工程を含む分析方法であって、前記酵素消化生成物は、モノサッカリド、ジサッカリドおよびトリサッカリドからなる群から選択される少なくとも一つのサッカリドを含み、前記質量分析により解析される前記サッカリドの構造に基づき前記硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖の構造を解析する分析方法。

[2] 前記質量分析工程に先立ち、前記酵素消化生成物を分画する工程をさらに含む請求の範囲 1に記載の分析方法。

[3] 前記分画に用いる手段がゲル濾過クロマトグラフィーである請求の範囲 2に記載の分析方法。

[4] 前記硫酸化多糖がグリコサミノダリカンである請求の範囲 1に記載の分析方法。

[5] 前記グリコサミノダリカンがコンドロイチン硫酸およびその誘導体のうち少なくとも一方である請求の範囲 4に記載の分析方法。

[6] 前記コンドロイチン硫酸力 CS-A、 CS-B、 CS-C、 CS-D、 CS_E、 CS-Kおよび CS-H

(DS-E)からなる群から選択される少なくとも一つである請求の範囲 5に記載の分析方法。

[7] 前記コンドロイチン硫酸を消化する酵素が、コンドロイチナーゼである請求の範囲 5 に記載の分析方法。

[8] 前記コンドロイチナーゼが、コンドロイチナーゼ ABCを含む請求の範囲 7に記載の分析方法。

[9] 請求の範囲 1に記載の分析方法により硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖の構造を解析する工程を含む、前記硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖を含む組成物の製造方法。

[10] 請求の範囲 9に記載の製造方法により製造される組成物。

[II] 前記硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖を薬学的活性成分として含む請求の範囲 1 0に記載の組成物。

[12] 前記薬学的活性成分が、細胞増殖阻害活性、細胞死誘導活性、腫瘍細胞増殖阻害活性、腫瘍細胞浸潤阻害活性、腫瘍細胞転移阻害活性、腫瘍細胞遊走阻害活性、腫瘍細胞死誘導活性、ウィルス感染阻害活性、デングウィルス感染阻害活性、神経突起伸長促進活性、および増殖因子結合活性力なる群から選択される少なくとも一つの活性を有する請求の範囲 11に記載の組成物。

[13] 請求の範囲 1に記載の分析方法により硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖の構造を解析する工程を含む、前記硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖を含む医薬の製造方法。

[14] 請求の範囲 13に記載の製造方法により製造される医薬。

[15] CS_K、酸化処理した CS-Kおよび酸化処理した CS-Eからなる群から選択させる少なくとも一つを含み、増殖因子結合に関する用途に使用される薬学的組成物。

[16] 前記酸化処理が、過ハロゲン酸による酸化処理である請求の範囲 15に記載の薬学的組成物。

[17] 前記過ハロゲン酸が、過ヨウ素酸である請求の範囲 16に記載の薬学的組成物。

[18] 前記酸化処理した CS-Kまたは CS-Eが、酸化処理後、さらにアルカリ処理した CS-K または CS-Eである請求の範囲 15に記載の薬学的組成物。

[19] コンドロイチン硫酸およびその誘導体の少なくとも一方を含み、デングウィルス感染阻害に関する用途に使用される薬学的組成物。

[20] CS-A、 CS- B、 CS- C、 CS- D、 CS-E, CS- EP (過ヨウ素酸処理した CS-E)、 CS- EPA ( アルカリ処理した CS-EP)、および CS-Kからなる群から選択される少なくとも一つを含む請求の範囲 19に記載の薬学的組成物。

[21] コンドロイチン硫酸およびその誘導体の少なくとも一方を活性物質として含み、細胞増殖阻害、細胞死誘導、腫瘍細胞増殖阻害、腫瘍細胞浸潤阻害、腫瘍細胞転移阻害、腫瘍細胞遊走阻害、および腫瘍細胞死誘導からなる群から選択される少なくとも一つに関する用途に使用される薬学的組成物。

[22] 前記コンドロイチン硫酸力 CS_A、 CS- B、 CS_C、 CS_D、および CS-Eからなる群から選択される少なくとも一つを含む請求の範囲 21に記載の薬学的組成物。

[23] 前記活性物質がコンドロイチン硫酸 E (CS-E)である請求の範囲 21に記載の薬学的組成物。

[24] CS_K、酸化処理した CS-Kおよび酸化処理した CS-Eからなる群から選択される少なくとも一つを含み、増殖因子結合に関する疾患の治療、診断、症状の軽減および予防からなる群から選択される少なくとも一つの用途に使用される医薬。

[25] 前記酸化処理が、過ハロゲン酸による酸化処理である請求の範囲 24に記載の医

[26] 前記過ハロゲン酸が、過ヨウ素酸である請求の範囲 25に記載の医薬。

[27] 前記酸化処理した CS-Kまたは CS-Eが、酸化処理後、さらにアルカリ処理した CS-K または CS-Eである請求の範囲 24に記載の医薬。

[28] コンドロイチン硫酸およびその誘導体の少なくとも一方を含み、デングウィルス感染阻害に関する疾患の治療、診断、症状の軽減および予防からなる群から選択される少なくとも一つの用途に使用される医薬。

[29] CS_A、 CS- B、 CS_C、 CS- D、 CS-E, CS-EP (過ヨウ素酸処理した CS- E)、 CS- EPA ( アルカリ処理した CS-EP)、および CS-Kからなる群から選択される少なくとも一つを含む請求の範囲 28に記載の医薬。

[30] コンドロイチン硫酸およびその誘導体の少なくとも一方を活性物質として含み、細胞の増殖に関する疾患の治療、診断、症状の軽減および予防からなる群から選択される少なくとも一つの用途に使用される医薬。

[31] 前記コンドロイチン硫酸力 CS-A、 CS_B、 CS_C、 CS_D、および CS-Eからなる群から選択される少なくとも一つを含む請求の範囲 30に記載の医薬。

[32] 前記活性物質がコンドロイチン硫酸 E (CS-E)である請求の範囲 30に記載の医薬。

[33] 前記細胞の増殖に関する疾患が、脳腫瘍、頭頸部癌、神経芽細胞腫、副鼻孔癌、咽頭癌、食道癌、肺癌、胃癌、大腸癌、直腸癌、肝癌、胆道癌、膝癌、前立腺癌、膀胱癌、精巣癌、乳癌、子宮癌、子宮筋腫、子宮類癌、卵巣癌、急性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、悪性リンパ腫、赤血球増加症、真正多血症、本態性血小板増多症、骨髄腫、骨肉腫、絨毛癌、ホジキン病、非ホジキン病、膠芽種、星状細胞腫、および軟組織肉腫からなる群から選択される少なくとも一つの疾患である請求の範囲 30に記載の医薬。

[34] 抗腫瘍剤、抗癌剤、制癌剤および抗転移剤からなる群から選択される少なくとも一つの用途に使用される請求の範囲 30に記載の医薬。

[35] 請求の範囲 1に記載の分析方法により硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖の構造を解析する工程と、前記硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖をヒトまたは動物の患者に投与する工程とを含む、前記ヒトまたは動物の患者における疾患の治療、診断、症状の軽減または予防をする方法。

[36] 前記ヒトまたは動物の患者における疾患が、増殖因子結合に関する疾患、デンダウィルス感染阻害に関する疾患、または細胞の増殖に関する疾患である請求項 35に記載の方法。

[37] ヒトまたは動物の患者における増殖因子結合に関する疾患の治療、診断、症状の軽減または予防をする方法であって、 CS_K、酸化処理した CS-Kおよび酸化処理した CS-Eからなる群から選択される少なくとも一つを前記ヒトまたは動物の患者に投与する工程を含む方法。

[38] 前記酸化処理が、過ハロゲン酸による酸化処理である請求の範囲 37に記載の方法。

[39] 前記過ハロゲン酸が、過ヨウ素酸である請求の範囲 38に記載の方法。

[40] 前記酸化処理した CS-Kまたは CS-Eが、酸化処理後、さらにアルカリ処理した CS-K または CS-Eである請求の範囲 37に記載の方法。

[41] ヒトまたは動物の患者におけるデングウィルス感染阻害に関する疾患の治療、診断、症状の軽減または予防をする方法であって、コンドロイチン硫酸およびその誘導体の少なくとも一方を前記ヒトまたは動物の患者に投与する工程を含む方法。

[42] 前記コンドロイチン硫酸力 CS-A、 CS-B、 CS-C、 CS_D、 CS-Eおよび CS-Kからなる群から選択される少なくとも一つであり、前記コンドロイチン硫酸誘導体力 CS-EP ( 過ヨウ素酸処理した CS-E)および CS-EPA (アルカリ処理した CS-EP)の少なくとも一方である請求の範囲 41に記載の方法。

[43] ヒトまたは動物の患者における細胞の増殖に関する疾患の治療、診断、症状の軽減または予防をする方法であって、活性物質としてコンドロイチン硫酸およびその誘導体の少なくとも一方を前記ヒトまたは動物の患者に投与する工程を含む方法。

[44] 前記コンドロイチン硫酸力 CS_A、 CS- B、 CS_C、 CS_D、および CS-Eからなる群から選択される少なくとも一つを含む請求の範囲 43に記載の方法。

[45] 前記活性物質がコンドロイチン硫酸 E (CS-E)である請求の範囲 43に記載の方法。

[46] 前記細胞の増殖に関する疾患が、脳腫瘍、頭頸部癌、神経芽細胞腫、副鼻孔癌、咽頭癌、食道癌、肺癌、胃癌、大腸癌、直腸癌、肝癌、胆道癌、膝癌、前立腺癌、膀胱癌、精巣癌、乳癌、子宮癌、子宮筋腫、子宮類癌、卵巣癌、急性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、悪性リンパ腫、赤血球増加症、真正多血症、本態性血小板増多症、骨髄腫、骨肉腫、絨毛癌、ホジキン病、非ホジキン病、膠芽種、星状細胞腫、および軟組織肉腫からなる群から選択される少なくとも一つの疾患である請求の範囲 43に記載の方法。

[47] 増殖因子結合に関する疾患の治療、診断、症状の軽減および予防からなる群から選択される少なくとも一つの用途に使用される医薬を製造するために、 CS-K、酸化処理した CS-Kおよび酸化処理した CS-Eからなる群から選択される少なくとも一つを使用する方法。

[48] 前記酸化処理が、過ハロゲン酸による酸化処理である請求の範囲 47に記載の使用方法。

[49] 前記過ハロゲン酸が、過ヨウ素酸である請求の範囲 48に記載の使用方法。

[50] 前記酸化処理した CS-Kまたは CS-Eが、酸化処理後、さらにアルカリ処理した CS-K または CS-Eである請求の範囲 47に記載の使用方法。

[51] デングウィルス感染阻害に関する疾患の治療、診断、症状の軽減および予防からなる群から選択される少なくとも一つの用途に使用される医薬を製造するために、コンドロイチン硫酸およびその誘導体の少なくとも一方を使用する方法。

[52] 前記コンドロイチン硫酸力 CS-A、 CS-B、 CS-C、 CS_D、 CS-Eおよび CS-Kからなる群から選択される少なくとも一つであり、前記コンドロイチン硫酸誘導体が、 CS-EP ( 過ヨウ素酸処理した CS-E)および CS-EPA (アルカリ処理した CS-EP)の少なくとも一方である請求の範囲 51に記載の使用方法。

[53] 細胞の増殖に関する疾患の治療、診断、症状の軽減および予防からなる群から選択される少なくとも一つの用途に使用される医薬を製造するために、コンドロイチン硫酸およびその誘導体の少なくとも一方を活性物質として使用する方法。

[54] 前記コンドロイチン硫酸力 CS-A、 CS- B、 CS-C、 CS_D、および CS-Eからなる群から選択される少なくとも一つを含む請求の範囲 53に記載の使用方法。

[55] 前記活性物質がコンドロイチン硫酸 E (CS-E)である請求の範囲 53に記載の使用方法。

[56] 前記細胞の増殖に関する疾患が、脳腫瘍、頭頸部癌、神経芽細胞腫、副鼻孔癌、咽頭癌、食道癌、肺癌、胃癌、大腸癌、直腸癌、肝癌、胆道癌、陴癌、前立腺癌、膀胱癌、精巣癌、乳癌、子宮癌、子宮筋腫、子宮類癌、卵巣癌、急性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、悪性リンパ腫、赤血球増加症、真正多血症、本態性血小板増多症、骨髄腫、骨肉腫、絨毛癌、ホジキン病、非ホジキン病、膠芽種、星状細胞腫、および軟組織肉腫からなる群から選択される少なくとも一つの疾患である請求の範囲 53に記載の使用方法。

[57] 前記医薬が、抗腫瘍剤、抗癌剤、制癌剤および抗転移剤からなる群から選択される少なくとも一つである請求の範囲 53に記載の使用方法。