CN111588739A - 桑黄提取物的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了桑黄提取物的制备方法及应用。制备桑黄提取物的方法包括：称取桑黄粉末，加入20倍体积60％乙醇，加热，保持沸腾，回流提取1h，得到提取液；对所述提取液进行离心，得到上清液，减压干燥至干，即得所述桑黄提取物。本发明提供的桑黄药材60％醇提取物能够更好地抑制结肠癌细胞SW480的增殖，能够更好地诱导结肠癌细胞SW480的凋亡，诱导结肠癌细胞SW480形成不同程度的G2/M期阻滞，进而抑制癌细胞的增殖。

Description

桑黄提取物的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及中医药领域，具体地，涉及桑黄提取物的制备方法及应用。
背景技术
桑黄又称桑耳，是一种十分珍贵、寄生于桑属(Morus L.)植物木质基材的多年生大型药用真菌。曾经记载于明代李时珍的《本草纲目》中，善于治疗血崩、血淋、脱肛泻血、带下、经闭等症。目前桑黄栽培品在中日韩及部分欧洲国家，多用其防治多种癌症。由于结直肠癌(Colorectal cancer，CRC)是全球高发恶性肿瘤之一，因其死亡率较高，已经严重危害到人类的身体健康。结肠癌的发生原因较为复杂，与多种因素密切相关。对结直肠癌具有疗效的药物还有待研究。
发明内容
为了解决上述问题，本发明公开提供了一种制备桑黄提取物的方法，包括：称取桑黄样品，加入20倍体积60％乙醇，加热，保持沸腾，回流提取1h，得到粗液；对所述粗液进行离心，得到上清液，减压干燥至干，即得所述桑黄提取物。
在上述方法中，其中，所述离心包括以5000r/min离心5min。
本发明还提供了根据上述方法制备的桑黄提取物。
本发明还提供了上述桑黄提取物在抗结肠癌药物中的应用。
相对于桑黄药材水提取物和桑黄药材95％醇提取物，桑黄药材60％醇提取物能够更好地抑制结肠癌细胞SW480的增殖，能够更好地诱导结肠癌细胞SW480的凋亡，诱导结肠癌细胞SW480形成不同程度的G2/M期阻滞，进而抑制癌细胞的增殖。
附图说明
图1示出了三个桑黄提取物的单糖HPLC色谱图，其中，S1空白对照；S295％乙醇提取物；S360％乙醇提取物；S4水提取物；S5混合单糖对照品(色谱峰1-10依次为PMP、甘露糖、氨基葡萄糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖)。
图2示出了桑黄3个提取物对结肠癌细胞SW480增殖的抑制作用，其中，(a)水提取物；(b)60％醇提取物；(c)95％醇提取物(“*”表示p＜0.05；“**”表示p＜0.01)。
图3示出了桑黄2种醇提取物的细胞凋亡图，其中A1-A4为60％桑黄醇提取物；A1为对照组，A2-A4为醇提取物不同剂量组(3μg/mL，30μg/mL，300μg/mL)；B1-B4为95％桑黄醇提取物；B1为对照组，B2-B4为醇提取物不同剂量组(3μg/mL，30μg/mL，300μg/mL)。
图4示出了桑黄60％醇提取物对结肠癌细胞SW480周期阻滞情况图，A为对照组；B为加入提取物300μg/mL；C为加入提取物30μg/mL；D为加入提取物3μg/mL。
具体实施方式
下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本公开，但不以任何方式限制本公开。
本次实验比较了桑黄的水提取物、60％乙醇提取物和95％乙醇提取物对体外培养的结肠癌细胞SW480增殖的抑制作用进行研究，探索桑黄中成分的抑癌机理。
仪器与试剂
LC-20AT岛津高效液相色谱仪，T6新世纪西外可见分光光度计。
结肠癌细胞SW480购于赛百慷生物技术股份有限公司；CCK8试剂购于美仑生物，货号：MA0218-5；p-AKT和mTOR一抗均购于abcam，p-AKT货号：ab38449，浓度：1mg/mL，使用时1:1000稀释，mTOR货号：ab2732，浓度：1mg/mL，使用时1:1000稀释；AKT货号：ab179463，浓度1mg/mL，使用时1:1000稀释；Tubulin购于abcam，货号：ab7291，浓度：1mg/mL，使用时1:2000稀释；胎牛血清购于Gibco，货号：16000-044；RIPA蛋白裂解液购于北京信生元生物医学科技有限公司；BCA蛋白试剂盒购于康为世纪，货号：CW0014S；双光束紫外可见分光光度仪购于Agilent Technologies，型号：Cary 60；流式细胞仪购于BD公司，型号：C6；酶标仪购于Molecular Devices，型号：Spectra Max M5；细胞培养箱购于Thermo，型号：311。
桑黄由吉林省通化三盛农业生物科技有限公司，经北京林业大学戴玉成教授鉴定为菌物界担子菌门伞菌纲锈革孔菌目锈革孔菌科桑黄属杨树桑黄Sanghuangporusvaninii(Liub.)L.W.Zhou&Y.C.Dai。
水提取物制备：称取桑黄样品，加入20倍体积水，加热，保持微沸，回流提取1h。结束回流后，离心(5000r/min)5min，得到上清液，冷冻干燥，即得水提取物。
60％乙醇提取物制备：称取桑黄样品，加入20倍体积60％乙醇，加热，保持微沸，回流提取1h。离心(5000r/min)5min，得到上清液，减压干燥至干，即得60％乙醇提取物。
95％乙醇提取物制备：称取桑黄样品，加入20倍体积95％乙醇，加热，保持微沸，回流提取1h。结束回流后，离心(5000r/min)5min，得到上清液，减压干燥至干即得95％乙醇提取物。
成分分析
1.1硫酸-蒽酮法测定提取物多糖含量
1.1.1蒽酮－硫酸试剂
精密称取蒽酮200mg置100mL容量瓶中，用80％浓硫酸缓慢定容至刻度，边加边搅拌，摇匀，直至蒽酮完全溶解，此时溶液呈黄色透明状。将得到的蒽酮－硫酸试剂放于棕色瓶中置于阴凉处密封保存(临时现配)。使用前冰水中冷却。
1.1.2标准葡萄糖溶液
精密称定D-无水葡萄糖5.02mg，加入纯水定容到50mL，配制成浓度为0.1004mg/mL作为标准葡萄糖溶液。
1.1.3标准曲线
分别量取标准葡萄糖溶液0，0.1，0.3，0.5，0.7，0.9，1.1，1.3，1.5，1.7mL，分别加水至2.0mL，分别加入预先用冰水冷却的蒽酮溶液6mL，混匀，置于沸水浴中加热15min，取出，放入冰浴中冷却15min。以相应的试剂为空白，在625nm波长处测定吸光度。
以葡萄糖浓度(C)为横坐标，A为纵坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程A＝0.0389C+0.0044，r＝0.9992(n＝10)。结果表明，葡萄糖在0～21.335μg/mL范围内线性关系良好。
1.1.4样品测定
精密称定样品约10mg，加入水溶解，定容到50mL。取供试品溶液1.0mL，加水至2.0mL，依据标准曲线的测定方法测定OD值，计算多糖含量，见表1中的3个提取物中多糖测定结果。
表1 3个提取物中多糖的测定结果
Figure BDA0002554287100000041
1.2单糖HPLC分析
1.2.1溶液配制
2mol/L三氟乙酸溶液、0.5mol/L PMP甲醇溶液、0.2mol/L氢氧化钠溶液、0.2mol/L盐酸溶液。
精密称定单糖标准品约5mg，定容至2.5mL。各对照品浓度如下：
葡萄糖2.044mg/mL、核糖2.012mg/mL、半乳糖2.036mg/mL、木糖2.024mg/mL、鼠李糖2.000mg/mL、阿拉伯糖2.020mg/mL、岩藻糖2.040mg/mL、甘露糖2.032mg/mL、氨基葡萄糖2.02mg/mL、葡萄糖醛酸2.008mg/mL、半乳糖醛酸2.012mg/mL。
1.2.2多糖水解
精密称取多糖样品20mg，放入10mL的具塞试管中，加入2moL·L-1三氟乙酸(TFA)溶液8mL，超声溶解，然后放置于110℃烘箱内5h使多糖充分水解，冷却至室温，离心(5000r·min-1，10min)得到的上清液，用旋转蒸发仪将上清液旋干，并用甲醇溶液反复旋蒸3次除去残留的TFA溶液，加入2mL的超纯水溶解定容，即得到多糖水解液。
1.2.3单糖衍生化
吸取对照品混合溶液或多糖水解溶液0.2mL，于具塞25mL比色试管中。依次加入0.5mol·L-1的PMP甲醇溶液和0.2mol·L-1氢氧化钠溶液各0.2mL混匀，置于70℃水浴反应60min，并不时振摇，取出冷却到室温后，加入0.2mol·L-1盐酸0.2mL中和pH至7，加去离子水补充至2mL，加入三氯甲烷5.0mL涡旋萃取，静置分层。上层为水相，得PMP衍生化样品，过0.45μm滤膜，进样。
1.2.4色谱条件
色谱柱Kromasil C18(4.6mm×250mm，5μm)；检测波长:245nm；柱温：30℃；流动相：A为乙腈，溶剂B为0.05mol·L-1磷酸二氢钾溶液(pH 6.8)；流速：1.0mL·min-1。梯度洗脱表见表2，液相色谱图见图1。
表2
Figure BDA0002554287100000051
1.3紫外分光光度法测定总黄酮含量
1.3.1对照品溶液的制备
精密称取芦丁对照品50.00mg，置25mL量瓶中，加甲醇适量，超声溶解，放冷，加甲醇至刻度，摇匀。精密量取10mL，置100mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，得浓度为0.20mg/mL的芦丁对照品溶液。
1.3.2标准曲线
精密量取对照品溶液l mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL，分别置25mL量瓶中，各加水至6.0mL，加5％亚硝酸钠溶液1mL，混匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液l mL，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10mL，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟，以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法(通则0401)，在500nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。Y＝0.0112X-0.0139，r＝0.9999。
1.3.3样品总黄酮测定
精密称定各个样品粗粉25mg，置具塞锥形瓶中，加入甲醇25mL，称定重量，超声30min，放置，待其冷却至室温，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过。精密量取适量，置25mL量瓶中，各加水至6.0mL，加5％亚硝酸钠溶液1mL，混匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液l mL，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10mL，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟，以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法(通则0401)，在500nm波长处测定吸光度。3个提取物中总黄酮的测定结果见表3。
表3 3个提取物中总黄酮的测定结果
Figure BDA0002554287100000061
抗结肠癌试验方法和结果
2.1方法
2.1.1细胞培养：将结肠癌细胞SW480培养在含10％胎牛血清的1640培养液中，细胞在37℃含5％CO2的环境中单层生长，取对数生长期细胞用于实验。
2.1.2测CCK-8(72h)
将结肠癌细胞SW480以每孔1×105个/mL细胞密度接种到96孔细胞培养板中，再将待测的SW480细胞中的上清液倒干净，用PBS清洗两遍，在每孔中分别加入新制100μL的L-15完全培养基和10μL的CCK-8试剂，放入培养箱中，培养3h后使用酶标仪检测光密度(OD)值，吸光度为450nm。
2.1.3细胞凋亡检测
(1)样本预处理：a.收细胞用胰酶消化细胞后，使用PBS轻轻吹打下所有贴壁细胞，并轻轻吹散，收集到离心管中，将离心机条件设定为2600rpm，5min，沉淀细胞，注意，用PBS清洗两遍，离心后将上清液吸干净。b.稀释结合缓冲液时用去离子水稀释10倍。
(2)经过预处理的细胞，用250μL稀释后的结合缓冲液，重新悬浮细胞，用枪轻轻吹打混匀。
(3)吸取50μL的细胞悬浮液到1.5μL离心管中，加入2.5μL Annexin V-FITC，5μL碘化丙啶PI，混匀。
(4)混匀后，室温避光孵育15min。
(5)15min后，使用流式检测凋亡。
2.1.4细胞周期检测
(1)样本预处理：a.收细胞，用胰酶消化细胞后，使用PBS轻轻吹打下所有贴壁细胞，并轻轻吹散，收集到离心管中，将离心机设定为2600rpm，5min，沉淀细胞，注意，用PBS清洗两遍，离心后将上清吸干净。
(2)将经过预处理的细胞加入1mL DNA Staining solution和10μLPermeabilization solution，涡旋震荡5-10s混匀。
(3)室温避光孵育30min。
(4)30min后，使用流式细胞术检测细胞周期。
2.2结果
2.2.1 CCK8细胞增殖实验结果：癌细胞具有增殖能力强、转移速度快的特点，为了证明桑黄提取液是否对人结肠癌细胞SW480增殖具有抑制作用、并呈现明显的剂量依赖性关系，故设计上述实验，研究结果表明，桑黄提取物作用于人结肠癌细胞SW480在72h后，能明显降低细胞存活率，并呈现良好的量效关系，其中浓度为300μg/mL、100μg/mL、33.3μg/mL的剂量组作用显著。其次，与桑黄药材水提取物相比，醇提取物抑制人结肠癌细胞SW480具有更加明显的量效关系，见图2。
2.2.2细胞凋亡检测实验结果：细胞凋亡也是抑制癌细胞增殖的关键环节，在测凋亡实验中通常将Annexin-V与PI搭配使用，可将凋亡细胞与坏死细胞进行区分鉴别，有利于研究不同剂量的桑黄醇提取物能否诱导人结肠癌细胞SW480的凋亡。用流式细胞术来检测不同浓度剂量组对人结肠癌细胞SW480凋亡的影响情况，结果见图3。
桑黄60％醇提取物，从图3(A1-A4)可知，对照组(A1)的细胞凋亡率为0.8％，其中早期细胞的凋亡比例为0.7％、晚期细胞的凋亡比例为0.1％。随着各剂量组药物浓度的增加，细胞凋亡率明显增加；300，30，3μg/mL组的总凋亡率依次为8.3％，3％和2.8％，其中早期凋亡率分别为7.7％，2.7％和2.3％，晚期凋亡率分别为0.6％，0.3％和0.5％。
桑黄95％醇提取物，从图3(B1-B4)可知，对照组(B1)的细胞凋亡率为0.9％，其中早期细胞的凋亡比例为0.8％、晚期细胞的凋亡比例为0.1％。随着各剂量组药物浓度的增加，细胞凋亡率明显增加，300，30，3μg/mL组分别为8.2％，2.6％和1.9％，其中早期凋亡率分别为7.7％，2.7％和2.3％，晚期凋亡率分别为0.6％，0.4％和0.3％。
以上实验数据证明了桑黄2种醇提取物均可诱导人结肠癌细胞SW480发生凋亡，具有较好的剂量效应关系，且60％乙醇提取物效果优于95％乙醇提取物。
2.2.3细胞周期实验结果：细胞周期(cell cycle)是影响细胞增殖的关键因素之一，是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程。为了检测桑黄醇提取物对人结肠癌细胞SW480周期变化的影响，本研究采用流式细胞术检测细胞周期，所用样品为桑黄60％醇提取物。结果见图4。
研究结果显示，3μg/mL与空白对照组相比，其G0/G1期细胞比例降低了6.08％、S期细胞比例降低了1.68％、G2/M期的细胞比例增加了7.75％，即造成G2/M期阻滞。30μg/mL与空白对照组相比，其G0/G1期细胞比例降低了1.82％、S期细胞比例增加了1.21％、G2/M期的细胞比例增加了0.61％，即S期、G2/M期阻滞。300μg/mL与空白对照组相比，其G0/G1期细胞比例降低了9.53％、而S期升高了0.16％、G2/M期增加了9.36％，即S期、G2/M期阻滞。由此可知，不同剂量的桑黄药材60％醇提取物均可诱导人结肠癌细胞SW480形成不同程度的G2/M期阻滞，进而抑制癌细胞的增殖。
由上可知，相对于桑黄药材水提取物和桑黄药材95％醇提取物，桑黄药材60％醇提取物能够更好地抑制结肠癌细胞SW480的增殖，能够更好地诱导结肠癌细胞SW480的凋亡，诱导结肠癌细胞SW480形成不同程度的G2/M期阻滞，进而抑制癌细胞的增殖。
本领域技术人员应理解，以上实施例仅是示例性实施例，在不背离本申请的精神和范围的情况下，可以进行多种变化、替换以及改变。

Claims (4)

1.一种制备桑黄提取物的方法，包括：
称取桑黄粉末，加入20倍体积60％乙醇，加热，保持沸腾，回流提取1h，得到提取液；
对所述提取液进行离心，得到上清液，减压干燥至干，即得所述桑黄提取物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述离心包括以5000r/min离心5min。
3.根据权利要求1或2所述的方法制备的桑黄提取物。
4.根据权利要求3所述的桑黄提取物在抗结肠癌药物中的应用。
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