CN101745024A - 一种参麦注射液的质量控制方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及参麦注射液的质量控制方法，包括利用特征性成分龙脑苷鉴别参麦注射液中麦冬的方法和龙脑苷的含量测定方法。鉴别和含量测定均包括以下步骤：制备供试品溶液和对照品溶液，采用反相色谱柱，蒸发光检测器，流动相为甲醇或乙腈水溶液的液相条件进行检测，液相图谱显示供试品溶液的龙脑苷保留时间与对照品一致，含量测定时采用外标两点法计算。本发明的鉴别和含量测定方法供试液处理简单，检测条件均为常用仪器设备，易于推广。完善了参麦注射液质量标准中没有麦冬成分的检测和含量测定的缺陷，对全面提高参麦注射液的质量标准具有显著意义。

Description

一种参麦注射液的质量控制方法

技术领域

本发明涉及一种中药注射液的质量控制方法，包括利用特征性成分鉴别中药注射液中原药材的方法和该特征性成分的含量测定方法，具体地说是利用龙脑苷鉴别参麦注射液中麦冬的方法和龙脑苷的含量测定方法。

背景技术

参麦注射液由红参、麦冬两味药材经过现代工艺提取其有效成分制备而成，红参甘温益气，固脱复脉，为方中君药；麦冬甘寒滋阴，生津利脉，为方中臣药；二药为伍，相得益彰，共奏益气固脱，养阴生津，生脉之功用。参麦注射液的功能主治为益气固脱，养阴生津，生脉，用于治疗气阴两虚型之休克、冠心病、病毒性心肌炎、慢性肺心病、粒细胞减少症。能提高肿瘤病人的免疫机能，与化疗药物合用时，有一定的增效作用，并能减少化疗药物所引起的毒副反应。

现代药理学研究表明：参麦注射液的有效成分主要为皂苷(约为固含量的7.5％)、黄酮类和糖类化合物，其中皂苷类目前已发现有以人参皂苷-Re、Rb1、Rb2、Rg1、Rg3等为代表的39种人参皂苷类成分和以麦冬皂苷D为代表的7种麦冬皂苷类成分，黄酮类目前已发现则主要是麦冬中含有的以甲基麦冬二氢高异黄酮B、2β-羟基甲基麦冬二氢高异黄酮A、2α-羟基甲基麦冬二氢高异黄酮A等为代表的8种高异黄酮类成分。

现执行标准为国家药品标准(修订)颁布件WS3-B-3428-98-2004，其鉴别项中仅有对红参(或红参和麦冬共有)的有效成分人参皂甙Rb1、Rg1、Re对照品的鉴别，而且目前对于参麦注射液的鉴别研究均集中在红参这一味药材中，未见有对麦冬的鉴别研究。

文献显示，麦冬中含有多种有效成分，主要为皂苷类和黄酮类(长春中医学院学报，麦冬化学成分及药理作用的研究现状)，然而发明人发现上述两类成分均难以被鉴别或不具有特征性，这也是参麦注射液中麦冬鉴别项缺失的原因之一。为了解决麦冬鉴别这个问题，发明人经过大量实验研究发现，市售的参麦注射液中均含有一种麦冬中的化学成分——龙脑苷(中国中药杂志，麦冬的化学成分研究)。

龙脑苷结构为龙脑苷(莰醇2-O-芹糖基-(1→6)-葡萄糖苷，英文名：Bomeol 2-O-β-D-apiofuranosyl(1→6)-β-D-glucopyranoside。分子式：C₂₁H₃₆O₁₀，分子重：448，结构式如下：

龙脑苷在麦冬中含量甚微，发明人曾在数百公斤麦冬中仅提取了1.8g的龙脑苷，但是，令人欣喜的是，根据国家标准WS3-B-3428-98-2004制备的参麦注射液中均含有龙脑苷，而红参中却没有这个成分，提示可以利用该成分鉴别参麦注射液中的麦冬。

发明内容

针对龙脑苷，发明人进行了初步的药理学研究：

龙脑苷化合物保护心肌细胞凋亡的测试

细胞凋亡(Apoptosis)亦称程序性细胞死亡(Programmed Cell Death)，它不同于组织坏死或突发性细胞死亡，在机体生命活动中调控着细胞增殖与更新间的平衡，维持组织器官正常生理功能及细胞数量相对稳定(Br J Cancer，1972，26，239)。现代的分子生物学和药理学研究表明，心肌细胞在各种刺激因子的诱导下存在凋亡现象，凋亡的心肌细胞参与了致病的过程，是心肌梗死、心力衰竭、心律失常、心肌病及病毒性心肌炎等多种心血管疾病发生与演变的细胞学基础(心脏杂志，2002，14(4)，347)。

测试原理：在人心肌细胞中加入不同浓度的样品溶液，在缺血/再灌注条件下诱导细胞凋亡，对比不加入样品的空白，评估样品对心肌细胞凋亡的保护作用。

实验方法；将6孔板和载玻片用90％的乙醇消毒，在每个孔里放置7.5×10⁴原代单层心肌细胞(1ml)和2ml DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)培养液，生长1.5天，移除培养液，加2ml I/R Media(致细胞缺血的介质)和样品溶液(20或50μl，对应50μg/ml或250μg/ml)，60分钟后移除培养液，再加入正常的2ml培养液(无色的DMEM)和样品溶液，30分钟后移除液体，用1ml PBS洗3次，加1ml有机溶剂(甲醇-丙酮，1∶1)固定细胞，将6孔板放置冰箱-20℃10分钟，取出加1ml甲醇使细胞渗透，再放入冰箱-20℃10分钟，取出用1ml PBS洗涤3次，移出载波片，用吸墨纸吸干液体，用胶水将有细胞的载波片固定在标记好的载波片上，加一滴PBS到载波片上防止细胞干掉，将载波片放置密闭的玻璃容器10分钟使充分润湿，取出、吸干液体，均匀加200μl Hoechst染色剂于载玻片，将载玻片放置阴暗处10分钟，然后用PBS冲洗掉残余的染色剂，用吸墨纸吸干，加一滴抗褪色剂，用玻片封装，放置冰箱于4℃储存。然后用荧光显微镜(激发光波长352nm，发射光波长461nm)观察细胞凋亡情况。

实验结果：如表1所示，龙脑苷能有效保护由缺血/再灌注引起的细胞凋亡。

上述发现表明，龙脑苷不仅可以用于鉴别，还可以作为有效成分对其进行含量含量测定。

表1、龙脑苷对缺血/再灌注引起的心肌细胞凋亡的保护作用

样本数n＝6，Ctrl＝(空白)对照；I/R：模型对照组。

根据上述发现，本发明提供了一种参麦注射液的质量控制方法，包括通过鉴别龙脑苷鉴别参麦注射液中麦冬的鉴别方法和龙脑苷的含量测定方法。

由于龙脑苷的含量甚微，对其的鉴别方法和测定方法甚为困难，在经过无数次尝试后，发明人终于构建了本发明中的质量控制方法。

本发明的质控方法供试液处理简单，液相检测条件均为目前常用仪器设备，易于推广使用，不仅实现了对参麦注射液中麦冬的鉴别，还提供了龙脑苷的含量测定方法，对全面提高参麦注射液的质量标准具有显著意义。

具体方法如下：

1).麦冬的鉴别：

a供试品溶液的制备：取100ml参麦注射液浓缩至30ml，调节pH至3.0～7.0，加入适量破乳剂，乙酸乙酯萃取4次，每次30～50ml，合并萃取液，将萃取液蒸干，加1～2ml甲醇溶解，作为供试品溶液；

b对照品溶液的制备：称取龙脑苷对照品适量，加甲醇制成对照品溶液；

c液相检测条件：反相色谱柱，蒸发光检测器，流动相为50～55％甲醇水溶液或20～25％乙腈水溶液；

d鉴别：取供试品溶液和对照品溶液各10～20μl，注入液相色谱仪进行鉴别，供试品溶液的龙脑苷保留时间应与对照品溶液主峰保留时间一致；

2).龙脑苷含量测定：

a待测供试品溶液的制备：精密量取本品50毫升，置于125毫升分液漏斗中，加10克乙酸铵，然后加入乙酸乙酯萃取4次，每次加入乙酸乙酯的体积为50毫升，充分摇匀后，依次静置2，1，1，1小时，合并乙酸乙酯层萃取液，浓缩至干后，用甲醇溶解至2毫升容量瓶，定容至刻度，供HPLC分析；

b对照品溶液的制备：称取龙脑苷对照品适量，加甲醇制成对照品溶液；

c液相检测条件：反相色谱柱，蒸发光检测器，流动相为50～55％甲醇水溶液或20～25％乙腈水溶液；

d样品测定：精密吸取10～20μl供试品溶液，注入液相色谱仪进行测定，外标两点法计算含量。

在麦冬的鉴别中，供试品的处理时，可以采用盐酸、硫酸、醋酸或硝酸调节pH值，各种不同浓度的盐酸、硫酸、醋酸或硝酸溶液均可以使用，但是为了使用方便和pH值变化稳定，一般采用10％的盐酸；破乳剂可使用任何不与溶剂发生反应(一般为中性)的电解质均可，比如乙酸铵、硫酸钠、硫酸钾、氯化钾、氯化钠等。

在麦冬的鉴别中，理论上液相检测条件中使用任意反相柱均可，常用的为C₈或C₁₈反相色谱柱。

在龙脑苷含量测定中，理论上液相检测条件中使用任意反相柱均可，常用的为C₁₈反相色谱柱。

附图说明

图1、龙脑苷标准品和各批次参麦注射液(实施例1-3)及红参提取液(实施例4)的HPLC图谱对比

图2、龙脑苷标准品和参麦注射液(实施例5)的HPLC图谱对比

图3、实施例6中线性关系考察

图4、实施例6中专属性考察的HPLC图谱

图5、实施例7中参麦注射液中龙脑苷含量测定的HPLC图谱

具体实施方案

发明的具体实施方案是为了更清楚地说明本发明，不是对本发明技术特征的限制。

实施例1：

样品：10支，规格为每支10ml装，批号0801191，生产厂家：正大青春宝药业有限公司。供试品溶液的制备：取100ml参麦注射液浓缩至30ml，用10％盐酸调节pH为5.0，加入1g氯化钠，乙酸乙酯萃取4次，每次40ml，合并萃取液，将萃取液中蒸干，加1.5ml甲醇溶解，作为供试品溶液；

对照品溶液的制备：称取龙脑苷1mg，加10ml甲醇溶解，作为对照品溶液；

液相检测条件：C₁₈反相色谱柱，蒸发光检测器，流动相为53％甲醇水溶液；

鉴别：取供试品溶液和对照品溶液各20μl，进液相检测，供试品溶液的龙脑苷保留时间应与对照品溶液主峰保留时间一致，t_R对照＝12.3min，t_R样品＝12.2min。

买施例2：

样品：1瓶，规格为每瓶100ml装，批号0910199，生产厂家：正大青春宝药业有限公司。

供试品溶液的制备：取100ml麦冬提取液浓缩至30ml，用10％盐酸调节pH为4.5，加入1g硫酸钠，乙酸乙酯萃取4次，每次30ml，合并萃取液，将萃取液蒸干，加1.5ml甲醇溶解，作为供试品溶液；

液相检测条件：C₁₈反相色谱柱，蒸发光检测器，流动相为53％甲醇水溶液；

鉴别：取供试品溶液和对照品溶液各20μl，进液相检测，供试品溶液的龙脑苷保留时间应与对照品溶液主峰保留时间一致，t_R对照＝12.3min，t_R样品＝12.1min。

实施例3：

样品：10支，规格为每支10ml装，批号0907121，生产厂家：正大青春宝药业有限公司。

供试品溶液的制备：取100ml麦冬提取液浓缩至30ml，用10％盐酸调节pH为3.0，加入1g硫酸钾，正丁醇萃取4次，每次50ml，合并萃取液，将萃取液蒸干，加1.5ml甲醇溶解，作为供试品溶液；

液相检测条件：C₁₈反相色谱柱，蒸发光检测器，流动相为53％甲醇水溶液；

鉴别：取供试品溶液和对照品溶液各20μl，进液相检测，供试品溶液的龙脑苷保留时间应与对照品溶液主峰保留时间一致，t_R对照＝12.3min，t_R样品＝12.1min。

实施例4：

样品：红参提取液，根据参麦注射液的提取工艺提取。

供试品溶液的制备：取100ml红参提取液浓缩至30ml，用10％盐酸调节pH为5.0，加入1g氯化钠，乙酸乙酯萃取4次，每次40ml，合并萃取液，将萃取液中蒸干，加1.5ml甲醇溶解，作为供试品溶液；

液相检测条件：C₁₈反相色谱柱，蒸发光检测器，流动相为53％甲醇水溶液；

鉴别：取供试品溶液和对照品溶液各20μl，进液相检测，发现供试品溶液在对照品溶液主峰保留时间处没有色谱峰出现，说明按照参麦注射液的提取工艺，红参中没有龙脑苷，不干扰麦冬的鉴别。

实施例5：

样品：2瓶，规格为每瓶50ml装，批号0910197，生产厂家：正大青春宝药业有限公司。

供试品溶液的制备：取100ml麦冬提取液浓缩至30ml，用10％盐酸调节pH为5.0，加入1g氯化钠，乙酸乙酯萃取4次，每次30ml，合并萃取液，将萃取液蒸干，加2ml甲醇溶解，作为供试品溶液；

对照品溶液制备：称取龙脑苷1mg，加10ml甲醇溶解，作为对照品溶液；

液相检测条件：C₈反相色谱柱，蒸发光检测器，流动相为25％乙腈水溶液；

鉴别：取供试品溶液和对照品溶液各10μl，进液相检测，供试品溶液的龙脑苷保留时间应与对照品溶液主峰保留时间一致，t_R对照＝16.6min，t_R样品＝16.6min。

实施例6：

仪器与试药

仪器：Waters e2695高效液相色谱仪和Waters 2424ELSD检测器，Empower 2工作站。

溶剂：HPLC分析用乙腈为Merck试剂公司产品，水为乐百氏纯净水；萃取用乙酸乙酯为分析纯，国药集团有限公司产品。

对照品龙脑苷为发明人分离制备所得，纯度为98.08％。

参麦注射液由正大青春宝药业有限公司提供，批号为：0910161，0910172，0910181，0910192，0910201，0910212，0910221，0910232，0910241，0910251，0910261，0910271，0910281，0910291，0910301。

待测供试品溶液的制备：精密量取本品50毫升，置于125毫升分液漏斗中，加10克乙酸铵，然后加入乙酸乙酯萃取4次，每次加入乙酸乙酯的体积为50毫升，充分摇匀后，依次静置2，1，1，1小时，合并乙酸乙酯层萃取液，浓缩至干后，用甲醇溶解至2毫升容量瓶，定容至刻度，供HPLC分析。

空白溶液的制备：除去不加参麦注射液外，其它完全按照供试样品的制备方法制备得空白溶液。

对照溶液的制备：称取龙脑苷1mg，加10ml甲醇溶解，作为对照品溶液；

缺红参阴性对照样溶液的制备：除去不加红参药材，完全按照本品生产工艺和本品供试品溶液的制备方法制备得到缺红参阴性对照溶液。

缺麦冬阴性对照样溶液的制备：除去不加麦冬药材，完全按照本品生产工艺和本品供试品溶液的制备方法制备得到缺麦冬阴性对照溶液。

色谱条件：色谱柱：Alltima C₁₈柱(250×4.6mm，5m)；流动相：乙腈∶水＝22∶78；流速：1ml/min；进样量：20μl；柱温：35℃；ELSD检测(参数设定：漂移管温度60℃，加热动力级别60％，增益150，氮气压力25Psi，时间常数正常)。

线性关系考察对照品溶液的配制：精密称取龙脑苷对照品11.882mg置100ml容量瓶中，加甲醇溶解定容至刻度，摇匀，即得。

分别精密量取对照品溶液2.00、2.50、4.50、5.00、6.00、7.50ml置10ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得。加上对照品溶液直接取样，共得7个浓度对照品溶液。在上述色谱条件下分别精密吸取20μl以上对照品溶液，注入液相色谱仪进行测定，以峰面积的对数(logA)为纵坐标Y，以进样量的对数(logW)为横坐标X进行线性回归，结果见附图3。得线性方程为：Y＝1.387789X+6.02466，r＝0.9997。

线性范围  将标准曲线最低点和最高点的对照品溶液(分别相当于40％和200％浓度)，各进样6次，每次20μl，所得龙脑苷的峰面积见表2，RSD分别为1.8％，1.8％，因此龙脑苷进样量的线性范围为：0.466155-2.33077μg。

表2.线性范围考察列表

精密度考察

重复性试验取同一批次本品(批号0910261)6份，按照供试品溶液制备方法制得6份供试品溶液，分别精密吸取20μl以上供试品溶液，注入液相色谱仪进行测定，计算含量(μg/ml)，测试结果见表3，RSD(n＝6)为3.7％，表明该方法重复性良好。

表3重复性测试含量(μg/ml)结果

中间精密度试验  由两名分析人员于不同日期分别取同一批次本品(批号0910261)各6份，按照供试品溶液制备方法共制得12份供试品溶液，于不同日期按照测定方法进行测定，计算含量(μg/ml)，测试结果见表4，RSD(n＝12)为3.1％，表明该方法中间精密度良好。

表4中间精密度实验数据列表(μg/ml)

稳定性试验取  同一批次本品(批号0910221)按照要求制得的供试品溶液分别在0、1.5、3、4.5、6、7.5、9、10.5、12h精密吸取20μl注入液相色谱仪测定，计算含量(μg/ml)，测试结果见表5，RSD(n＝9)为1.6％，表明供试液至少在12h内稳定。

表5稳定性实验数据列表(μg/ml)

平均值：28.256μg/ml；RSD＝1.6％

回收率试验  精密量取已测含量(以其重复性实验的平均值计，114.584μg)的参麦注射液(批号0910261)6份，每份50.00毫升，每份精密加入对照品溶液2.00ml(精密称定2.810毫克龙脑苷标样，置于50毫升容量瓶中，加5毫升甲醇溶解后，加乙酸乙酯定容至刻度即得，浓度为：55.121μg/ml)，然后按照供试品溶液的制备方法(第一次加乙酸乙酯为48ml，于后萃取步骤相同)，加甲醇定容成5ml，制备成加样回收率供试液，分别精密吸取20μl以上供试品溶液，依法测定，测试结果见表6，加样平均回收率(n＝6)为76.0％，RSD为4.8％，说明该方法具有一定准确度。

表6加样回收率实验数据列表

耐用性(考察柱温的影响)取同一批次供试品溶液(批号09251)通过改变柱温为30℃和40℃时，依法测定，分别进样2次，每次分别精密吸取20μl，测定龙脑苷的峰面积，计算含量(μg/ml)，测试结果见表7，RSD(n＝6)分别为3.6％。表明测定柱温设定在30～40℃结果都是准确的。

表7.耐用性考察：柱温对含量(μg/ml)测定的影响

专属性考察将空白样品溶液(空白样)，龙脑苷对照品溶液(标准样)，缺红参阴性对照样溶液(缺红参样)，缺麦冬阴性对照样溶液(缺麦冬样)，待测供试品溶液(批次0910232)(待测样)，以及待测供试品溶液加龙脑苷对照品溶液混合液(待测和龙脑苷混合样)分别进样分析，分析结果见附图4，空白溶液和缺麦冬阴性对照样溶液在龙脑苷出峰位置无干扰峰，缺红参阴性对照样溶液，待测供试品溶液中龙脑苷出峰保留时间与龙脑苷标样出峰时间一致，且待测供试品溶液和龙脑苷标样混合液在龙脑苷出峰位置表现为单一峰并且峰高比供试品溶液中龙脑苷的峰增高，说明待测供试品溶液中龙脑苷出峰位置为龙脑苷，该峰来自原材料麦冬药材中，不是来自红参药材，且无其它干扰峰。

样品测定

取不同批次的本品按照供试品制备方法制得的供试品溶液，依法测定，外标两点法计算含量，结果见表8和图5。

表8.参麦注射液中龙脑苷的含量(n＝2)

根据15批样品的测定结果，将限度定位“本品含龙脑甙量不得少于1.0μg/ml”。

Claims (6)

1.一种参麦注射液的质量控制方法，其特征在于利用龙脑苷对参麦注射液中的麦冬的鉴别和龙脑苷含量测定方法，包括以下方法：

1).麦冬的鉴别：

a供试品溶液的制备：取100ml参麦注射液浓缩至30ml，调节pH至3.0～7.0，加入适量破乳剂，乙酸乙酯萃取4次，每次30～50ml，合并萃取液，将萃取液蒸干，加1～2ml甲醇溶解，作为供试品溶液；

b对照品溶液的制备：称取龙脑苷对照品适量，加甲醇制成对照品溶液；

c液相检测条件：反相色谱柱，蒸发光检测器，流动相为50～55％甲醇水溶液或20～25％乙腈水溶液；

d鉴别：取供试品溶液和对照品溶液各10～20μl，注入液相色谱仪进行鉴别，供试品溶液的龙脑苷保留时间应与对照品溶液主峰保留时间一致；

2).龙脑苷含量测定：

a待测供试品溶液的制备：精密量取本品50毫升，置于125毫升分液漏斗中，加10克乙酸铵，然后加入乙酸乙酯萃取4次，每次加入乙酸乙酯的体积为50毫升，充分摇匀后，依次静置2，1，1，1小时，合并乙酸乙酯层萃取液，浓缩至干后，用甲醇溶解至2毫升容量瓶，定容至刻度，供HPLC分析；

b对照品溶液的制备：称取龙脑苷对照品适量，加甲醇制成对照品溶液；

c液相检测条件：反相色谱柱，蒸发光检测器，流动相为50～55％甲醇水溶液或20～25％乙腈水溶液；

d样品测定：精密吸取10～20μl供试品溶液，注入液相色谱仪进行测定，外标两点法计算含量。

2.权利要求1所述的参麦注射液的质量控制方法，其特征在于1)麦冬的鉴别步骤a中用盐酸、硫酸、醋酸或硝酸溶液调节pH值至3.0～7.0。

3.权利要求1所述的参麦注射液的质量控制方法，其特征在于1)麦冬的鉴别步骤c中反相色谱柱为C₈反相色谱柱或C₁₈反相色谱柱。

4.权利要求1所述的参麦注射液的质量控制方法，其特征在于1)麦冬的鉴别步骤a中破乳剂为乙酸铵、硫酸钠、硫酸钾、氯化钾或氯化钠中的一种。

5.权利要求1所述的参麦注射液的质量控制方法，其特征在于1)麦冬的鉴别步骤a中萃取液乙酸乙酯用正丁醇代替。

6.权利要求1所述的参麦注射液的质量控制方法，其特征在于2)龙脑苷含量测定步骤c中的色谱条件为：色谱柱：C₁₈柱；流动相：22％乙腈水溶液；流速：1ml/min；进样量：20μl；柱温：35℃；蒸发光检测。

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