CN103728332A - 一种参麦注射液成品质量的鉴别方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种基于氢核磁共振-模式识别技术的参麦注射液检测方法，用于鉴别参麦注射液产品的真伪，也可用于预防性监控本品处方投料、制剂工艺过程和辅料对参麦注射液整体内在质量的影响，该方法是一种快速客观分析参麦注射液整体内在质量的检测技术，可以有效避免参麦注射液常规检测方法仅仅分析复杂体系中部分成分指标存在的缺陷。

Description

一种参麦注射液成品质量的鉴别方法

技术领域

本发明涉及中药注射剂的品质评价方法，具体地说，涉及采用氢核磁共振-模式识别技术对参麦注射液进行鉴别的检测方法，属于对药品进行质量控制分析方法研究的技术领域。

背景技术

目前中药注射剂年销售额已超过200亿元，年使用量达4亿人次，在临床上得到越来越广泛的应用，然而其不良反应发生的报道也日益增多，国家药品不良反应监测中心多次发出中药注射剂严重不良反应警示。因此，中药注射剂的安全性再评价势在必行。考虑到不良反应在一定程度上与药品的整体内在质量存在相关性，中药注射剂的安全性再评价也应该包括其质量控制方法的再评价。

药品质量控制的主要目的是对原料来源、生产过程及产品质量是否稳定进行监控，以保证用药的有效性和安全性，这就要求药品质量控制的分析方法能够满足这种需求。参麦注射液是国家基本药物目录收载的益气复脉类常用复方中成药注射液，由红参、麦冬制成，具有益气固脱，养阴生津，生脉之功效，在临床上得到广泛应用，然而其不良反应和不良事件时有报道。目前参麦注射液的生产厂家有6家，虽然有统一的生产工艺和质量控制标准，但是各厂家间存在原料来源和设备条件不尽相同，加上药材炮制和制剂工艺参数的细微差异，导致不同厂家产品的外观、价格、疗效上存在差异。参麦注射液的中药原料药味数虽少，但其化学成分非常复杂，例如红参中就含有皂苷、挥发油、脂肪酸、甾醇、黄酮、氨基酸等多种类型的化合物成分，而现行参麦注射液药品标准(标准号WS₃-B-3428-98-2010Z)中的技术方法虽然包括了定性定量分析和HPLC指纹图谱(如设立了对多达16个特征成分的信号峰进行检测)，但这些特征成分信号峰只代表在测定波长下有吸收的部分有效成分的情况，仍然不能完全反映参麦注射液的整体构成成分。此外，对制剂的辅料部分也没有进行相应的检测和控制。

本发明针对参麦注射液现行药品标准中鉴别方法的缺陷，提出了以氢核磁共振(¹H-NMR)技术结合模式识别(Pattem Recognition)中的主成分分析或偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)法建立参麦注射液成品的鉴别新方法。

¹H-NMR作为有机化合物结构测定中不可或缺的技术，能够提供足够丰富的任何含有氢的有机化学成分的综合信息。而模式识别(PR)能在复杂的数据中根据其内在的相关性，最大限度的提取出综合性的、有价值的化学成分信息，并转化成直观的样品信息以供分析。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种新的参麦注射液的品质评价方法。

本发明所指的品质评价指标是参麦注射液的总内含物的变化规律。

本发明所用的测定技术是氢核磁共振技术。

本发明所指的数据处理方法是模式识别中的主成分分析或偏最小二乘-判别分析法。

本发明涉及样品采集和前处理，氢核磁共振测定、图谱处理、数据分析以及结果判断方式，由下述步骤及方法完成。

1.基本样品的数量和批次

基本样品的数量不得少于30个，生产批次不得少于10批。

2.基本样品前处理

量取参麦注射液样品，取样范围为0.5mL-30mL，其中优选取量为5mL。将样品溶液加入到大孔吸附树脂柱内，用5mL-300mL蒸馏水冲柱，其中优选为50mL，再以3mL-200mL甲醇冲洗树脂柱，其中优选为30mL，收集甲醇洗脱液，在20℃-80℃温度下减压蒸干，其中优选温度为45℃，残留物用0.4mL-0.6mL DMSO-d₆溶解，其中优选为0.5mL，转入直径5mm核磁管中。上述方法中的样品加量：树脂柱体积：水洗体积：甲醇洗体积的毫升比例大约在1∶2∶10∶6左右。

3.¹H-NMR谱的测试

上述样品在INOVA400核磁共振仪(Varian公司)上测定。测定条件：恒温302K，以DMSO-d₆作为内锁，采样时间域64k，谱宽为-2000-12000Hz，其中优选为7251.6Hz，脉冲间隔为0.00-4.00s，其中优选为3.00s，采样时间3.73s，扫描16-128次，其中优选为32次，采用标准的预饱和脉冲序列(zgpr)压制水峰信号，即获得各样品的¹H-NMR谱。

4.图谱处理及数据采集方法

将步骤3中测定获得各样品¹H-NMR图谱的化学位移值区间(δ0.00-δ9.00)，按每张图谱0.02-0.07化学位移值单位进行分段，其中优选分段单位为0.05化学位移值单位，分段积分(考虑到溶剂峰可能对分析结果产生影响，特将δ2.40-δ2.65段去除)并将积分值进行标准化处理，即得到每个样品的各化学位移值段与相对应的信号峰面积积分值的数据矩阵，对该矩阵进行模式识别技术的偏最小二乘-判别分析，即得到参麦注射液基本样品数据库。

5.鉴别判断方法

5.1建立参麦注射液基本样品的氢核磁共振数据库和二维分布图形

以主成分1的得分值为横坐标，主成分2的得分值为纵坐标绘制二维分布图形，设定95％可信区域(可将95％可信区域外的样品剔出)，绘制二维分布图形并固定，即得参麦注射液基本样品的氢核磁共振数据库和二维分布图形。

5.2参麦注射液的鉴别

首先将待测参麦注射液样品按上述的基本样品前处理、¹H-NMR谱的测试、图谱处理及数据采集方法进行操作，获得对应的数据矩阵，导入由基本样品构成的氢核磁共振数据库和二维分布图形中，观察待测参麦注射液样品在二维分布图形中的分布情况，如待测样品的得分点分布在95％可信区间内，则判定该样品为合格品；如待测样品的得分点分布在95％可信区间之外，则判定该样品为不合格品。

6.基本样品的氢核磁共振数据库的扩充

待测样品经上述的判别后，如为合格品，则将其数据纳入基本样品的氢核磁共振数据库，以扩充数据库和增加基本样品的代表性和判别能力。

本发明的优点和特点是：首次采用氢核磁共振-偏最小二乘法-判别分析方法，以川大华西药业生产的参麦注射液为主，三精升和制药、河北神威药业生产的参麦注射液为辅，建立了参麦注射液基本样品数据库；以随机选取的参麦注射液基本样品做为验证样本对本方法进行验证，以缺辅料样品、缺味样品和仿制品作为测试样本，对本方法进行测试。验证和测试结果表明，该法能准确的判断参麦注射液合格品以及多种类型的不合格品，可以预防性的监控注射液的各种异常，克服现行标准方法的缺陷，同时具有分析周期短，操作简单易行，对环境污染显著降低的特点，故该方法可作为控制参麦注射液内在质量的一种有效方法，并且随着更多合格品数据的不断纳入，训练集样本数量不断加大，数据库的代表性随之增加，判别的准确性也就随之提高，这将能够更加有效的对参麦注射液实施更全面的质量控制。

附图说明

图1是具体实施方式中参麦注射液原液¹H-NMR图；

图2是具体实施方式中经大孔吸附树脂处理后的参麦注射液样品¹H-NMR图；

图3是具体实施方式中三厂家参麦注射液样品¹H-NMR图谱；

图4是具体实施方式中参麦注射液基本样品数据库的PLS-DA主成分1对主成分2的得分散点图(○川大华西药业；▲三精升和制药；●河北神威药业)；

图5是具体实施方式中参麦注射液基本样品、验证样品与缺辅料样品间的PLS-DA主成分1对主成分2的得分散点图(○参麦注射液基本样品；▲验证样品；◆缺辅料样品)；

图6是具体实施方式中参麦注射液基本样品与仿制品、缺味样品间的PLS-DA主成分1对主成分2的得分散点图(○参麦注射液基本样品；▲仿制样品；●缺红参样品；□缺麦冬样品)。

具体实施方式

1.仪器、试剂与样品

仪器：SENCOR-201旋转蒸发仪(上海申顺生物科技有限公司)；INOVA400核磁共振仪(Varian公司)。试剂：甲醇(AR)，D101大孔吸附树脂(成都市科龙化工试剂厂)；氘代二甲亚砜(DMSO-d₆，Cambridge Isotope Laboratories，Inc)；水为去离子水。样品：参麦注射液样品是2010年-2012年间购自于山东、广州、四川等地各大医院的市售品，30批共60个样品溶液中20批由四川川大华西药业股份有限公司(HX1～40)生产、5批由四川三精升和制药有限公司(SJ1～10)生产、5批由河北神威药业有限公司(SW1～10)生产；随机选取其中3批共6个样品为验证样品(HX39～40，SJ9～10，SW9～10)；仿制品(FP1～4)和缺辅料(QF1～QF2)及缺味样品(缺红参QW1～2、缺麦冬QW3～4)均按照参麦注射液生产工艺自制；红参和麦冬药材均购于成都北京同仁堂药店。

2.样品前处理

预试：精密量取参麦注射液5mL置于旋转蒸发仪上，减压蒸干，残留物以DMSO-d₆溶解并进行¹H-NMR测试，结果见图1，由图可知，化学位移值δ3.00-δ4.50之间的糖类物质信号峰很强，掩盖了人参皂苷等其它有效成分的信号，应予去除。本实验采用大孔吸附树脂柱吸附的方法除去糖类物质：将预处理好的D101大空吸附树脂，采用湿法装柱(2cm×15cm)，树脂柱体积10ml。取5ml参麦注射液上样，吸附速率保持1mL／min，先以水冲洗树脂柱，流出液每半个柱体积收集一试管，取样进行Molish反应并观察，以Molish反应成阴性作为判定标准(此时说明糖类物质被冲洗干净)。再以甲醇洗脱树脂柱，洗脱速度1mL／min，收集流出液于旋转蒸发仪蒸干，以残留物质量不再增加作为甲醇用量的标准。将该前处理样品进行¹H-NMR测试，结果见图2，由图可知，样品经大孔吸附树脂处理后，¹H-NMR谱中信号多且分辨率良好，结果满意。图谱显示参麦注射液样品中化合物的信号主要集中在化学位移值δ0.60-δ5.40段，而在化学位移值δ5.40-δ9.00段也有少量信号峰，为了最大限度的从整体上获得参麦注射液样品的化学信息，本实验采集化学位移值δ0.00-δ9.00段的图谱数据信息进行分析。

上述样品前处理方法的优化结果为：样品加量：树脂柱体积：水洗体积：甲醇洗体积的毫升比例大约在1∶2∶10∶6左右。由此确定本实验样品最终前处理方法为：精密吸取参麦注射液5mL，加入到D101大孔吸附树脂柱内，用50mL蒸馏水洗脱后，以30mL甲醇冲洗树脂柱。收集甲醇洗脱液，45℃减压蒸干，残留物用0.5mL DMSO-d₆溶解后，转入核磁管(φ5mm)中，供¹H-NMR检测。每批参麦注射液平行制备两个样品。

3.¹H-NMR测定条件

恒温302K，以DMSO-d₆作为内锁，采样时间域64k，谱宽7251.6Hz，脉冲间隔D1为3.00s，采样时间3.73s，扫描32次，采用标准的预饱和脉冲序列(zgpr)压制水峰信号。

各样品在上述条件下测定¹H-NMR谱后，随机选择各厂家的一个样品¹H-NMR谱图进行重叠(见图3)，由图可知，各厂家谱图既相似，又存在一定差异；而单一谱图提示参麦注射液化合物的成分非常复杂，这些化合物的信号峰重叠严重，如果依靠肉眼观察，仅能从¹H-NMR图谱中获取很有限的信息，为最大限度的获得信息，将样品谱图处理后做偏最小二乘-判别分析(PLS-DA)。

4.图谱及数据处理

将3项下测得的各样品自由衰减(FID)信号导入MestReNova软件进行傅里叶转换获得¹H-NMR图谱。各图谱分别进行象限和基线调整，并以溶剂(DMSO-d₆)化学位移值(δ2.50)为内标进行化学位移值校准。

为得到最佳的分类效果，将图谱分别按照0.04、0.05、0.06及0.1化学位移值单位进行分段积分，进行PLS-DA测试，结果显示以0.05化学位移值段进行积分效果最好，故确定各样品的分段积分方式为：对得到的每张图谱的化学位移值区间(δ0.00-δ9.00)，以每0.05×10^-6化学位移值段进行分段积分，获得与化学位移值段(175段)相应的峰面积积分值，由¹H-NMR图谱可以看出，在化学位移为2.50(δ2.50)处，是DMSO的溶剂峰，而不同的样品，该溶剂峰的大小不一。考虑到溶剂峰有可能对分析结果产生影响，在不影响其他峰的情况下，特将δ2.40-δ2.65段去除。

将获得的每张图谱的积分数据导入Excel软件，采用面积归一化法进行标准化处理，得到参麦注射液样品数据矩阵，供以下的数据分析。

5.数据分析

将4项下得到的各样品数据矩阵导入SIMCA-P11.5软件，进行PLS-DA分析，首先提取主成分，依次提取的主成分为：主成分1，主成分2，依此类推得到各主成分，使各主成分的累积贡献率达到85％，即表示提取的主成分能够代表原变量85％的信息，符合分析要求。

分别以主成分1(PC1)对主成分2(PC2)的得分值为横纵坐标绘制得分散点图并进行相关分析。

6.分析方法的考察

参照中国药典2010年版一部附录XVIII A中药质量标准分析方法验证指导原则，结合本实验的具体情况，对供试品溶液制备方法的重复性、样品的稳定性、图谱处理方法的重复性和仪器精密度进行了考察。结果以夹角余弦值作为判定指标。

6.1供试品溶液制备方法重复性考察

随机取参麦注射液(川大华西药业，批号：110723)，按照2项下方法平行制备6份样品，分别按3、4项下方法测定和处理图谱，得到6组积分值数据。随机以第一组数据为对照，计算6份样品之间的夹角余弦值分别为1.000、0.9998、0.9996、0.9981、0.9944、0.9950。由计算结果可知，夹角余弦值均在0.99以上，说明本实验所采用的供试品溶液制备方法具有良好的重复性。

6.2样品稳定性考察

随机取参麦注射液(川大华西药业，批号：110806)，按照2、3项下方法制备1份样品并每天测定1次，连续测定5天，按4项下图谱处理方法处理，得到5组积分值数据。随机以第三组数据为对照，计算5组数据之间的夹角余弦值分别为0.9990、0.9999、1.000、0.9994、0.9871。计算值均在0.98以上，说明依据本实验的供试品溶液制备方法制备的样品在五天内具有良好的稳定性。

6.3图谱处理方法重复性考察

随机取参麦注射液(川大华西药业，批号：110803)，按照2、3、4项下方法制备1份样品并进行测定，反复处理图谱5次，得到5组积分值数据。随机以其中一组数据为对照，计算这5组数据之间的夹角余弦值，结果均为1.000，说明本实验所采用的图谱处理方法重复性良好。

6.4仪器精密度考察

随机取参麦注射液(川大华西药业，批号：110809)，按照2、3项下方法制备1份样品并反复测定6次，得到该样品的6个¹H-NMR图谱，将图谱按4项下方法处理后得到6组积分值数据。计算6组数据之间的夹角余弦值分别为1.000、0.9999、0.9999、0.9998、0.9999、0.9999，说明本实验所用核磁共振仪精密度良好。

7.结果与判断

7.1三厂家参麦注射液基本样品之间的PLS-DA分析

选取四川川大华西药业参麦注射液样品(编号：HX1～38)、四川三精升和制药参麦注射液样品(编号：SJ1～8)和河北神威药业参麦注射液样品(编号：SW1～8)的数据矩阵54×175(共54个样品，每个样品175个积分段)作为训练集，按照上述5项下方法进行分析，将此数据矩阵导入SIMCA-P11.5软件，进行PLS-DA分析，提取的主成分累积贡献率前6个主成分已达到86.9％(各主成分贡献率为：PC1＝27.1％，PC2＝24.8％，PC3＝17.8％，PC4＝8.9％，PC5＝5.4％，PC6＝2.9％)。以主成分1(PC1)对主成分2(PC2)的得分值为横纵坐标绘制得分散点图见图4。

由图4可知，三个厂家的参麦注射液样品的数据点均落在了95％置信区间内，由此可以说明参麦注射液的产品质量趋于稳定，化学成分相似，且实验操作过程中也没有引入较大误差。因此，这些数据可作为参麦注射液基本样品的数据库，用于进一步分析。另一方面，三个厂家生产的参麦注射液各自有对应的样品数据点集中区域，华西药业生产的参麦注射液样品主要集中在-10＜t[1]＜0且-10＜t[2]＜0区域和0＜t[1]＜20且-6＜t[2]＜+6区域；三精升和制药生产的参麦注射液样品主要集中在-16＜t[1]＜-6且-4＜t[2]＜+5区域；神威药业生产的参麦注射液主要集中在-12＜t[1]＜-3且4＜t[2]＜8区域。说明各厂家生产的参麦注射液在整体质量上存在一定的差异，而同一厂家的制剂由于原料来源和制备工艺相对更稳定，所以差异更小。

7.2参麦注射液基本样品与验证品、缺辅料样品间的PLS-DA分析

将上述参麦注射液基本样品数据库数据(编号：HX1～38，SJ1～8，SW1～8)、验证样品(四川川大华西药业，编号：HX39～40；四川三精升和制药，编号：SJ9～10；河北神威药业：编号：SW9～10)以及缺辅料样品(编号：QF1～QF2)数据构成的数据矩阵(62×175)作为训练集，按照5项下方法进行分析，将此数据矩阵导入SIMCA-P11.5软件，对其进行PLS-DA分析，首先提取主成分，前12个主成分的累积贡献率已达到87.8％(各主成分贡献率为：PC1＝23.0％，PC2＝17.1％，PC3＝8.8％，PC4＝5.4％，PC5＝4.6％，PC6＝5.5％，PC7＝2.6％，PC8＝3.9％，PC9＝6.5％，PC10＝4.9％，PC11＝2.0％，PC12＝3.5％)，以主成分1(PC1)对主成分2(PC2)的得分值为横纵坐标绘制得分散点图见图5。

由图5可知，随机选取的三厂家的验证品(编号：HX39～40，SJ9～10，SW9～10)与参麦注射液基本样品(编号：HX1～38，SH1～8，SW1～8)训练集数据聚集在了一起，说明验证样品与参麦注射液样品化学成分基本一致，为质量合格的产品，故可以将其纳入参麦注射液基本样品训练集数据中，用于进一步分析。而缺辅料样品(编号：QF1～QF2)数据点没有与基本参麦注射液数据聚集在一起，而是落在了95％置信区间之外，说明缺辅料样品与参麦注射液样品存在明显差异，故与之分开。

7.3参麦注射液基本样品与仿制品、缺味样品间的PLS-DA分析

将上述参麦注射液基本样品数据库(编号：HX1～40，SH1～10，SW1～10)数据以及仿制品(编号：FP1～4)、缺味样品(缺红参编号：QW1～2；缺麦冬编号：QW3～4)数据构成的数据矩阵(68×175)作为训练集，按照5项下方法进行分析，将此数据矩阵导入SIMCA-P11.5软件，首先提取主成分，前4个主成分的累积贡献率已达到86.9％(各主成分贡献率为：PC1＝27.2％，PC2＝25.1％，PC3＝17.4％，PC4＝17.2％)，以主成分1(PC1)对主成分2(PC2)的得分值为横纵坐标绘制得分散点图见图6。

由图6可知，三个厂家参麦注射液样品数据点均落在了95％置信区间内，而缺红参样品(编号：QW1～QW2)和缺麦冬样品(编号：QW3～QW4)数据点均落在了95％置信区间之外，由此可以说明缺味样品与参麦注射液基本样品在化学成分上存在明显差异，可以很容易与参麦注射液合格样品分开。参麦注射液仿制品(编号：FP1～FP4)数据点落在了95％置信区间边缘，游离在基本参麦注射液样品训练集之外，说明采用小试设备自制的参麦注射液仿制品与各厂家统一工艺后的大生产样品存在一定差异，这种差异应该是药材产地、工艺设备及操作参数等因素差异的综合效应。

Claims (3)

1.一种参麦注射液成品质量的鉴别方法，该方法步骤如下：

(1)样品处理：量取样品，将样品溶液加入到大孔吸附树脂柱内，用蒸馏水冲柱，再以有机溶剂冲洗树脂柱，收集有机溶剂洗脱液，在一定温度下减压蒸干，残留物用DMSO-d₆溶解后，转入直径5mm核磁管中；

(2)测定方法：是氢核磁共振法；核磁共振仪是指300MHz，400MHz，500MHz，600MHz或以上的仪器；

(3)¹H-NMR谱的测试：将步骤(1)中获得的各样品在核磁共振仪上分析，测定条件：恒温302K，以DMSO-d₆作为内锁，采样时间域64k，谱宽-2000Hz-12000Hz，脉冲间隔D1为0.00-4.00s，采样时间3.73s，扫描16-64次，采用标准的预饱和脉冲序列(zgpr)压制水峰信号，即获得各样品的¹H-NMR谱；

(4)数据处理和分析：是指模式识别技术的主成分分析或偏最小二乘-判别分析法；

(5)定性分析方法：主要是以一定数量的合格参麦注射液成品经上述的样品处理、测定、图谱和数据处理后获得的数据为基础，构成基本样品数据库并验证，以此数据库数据的95％可信区间为基准，对参麦注射液成品进行定性鉴别；将待测样品按相同方法获得的数据与数据库数据比较，如待测样品的数据落在数据库数据的95％可信区间内，则鉴别该样品为合格，如数据落在数据库数据的95％可信区间外，则鉴别为不合格；

所述参麦注射液成品是指以中药红参、麦冬为原料制备的注射液。

2.根据权利要求1所述的鉴别方法，其中在步骤(1)中的样品取样量为0.5mL-30mL，优选5mL；大孔吸附树脂柱为D101型，冲柱的蒸馏水为5mL-300mL，优选50mL，有机溶剂为C1-C6的低级醇，优选为甲醇，洗脱体积为3mL-200mL，优选30mL，洗脱液减压蒸干温度为20℃-80℃，优选45℃，残留物用DMSO-d₆0.4mL-0.6mL溶解，优选0.5mL。其中样品加量：树脂柱体积：水洗体积：甲醇洗体积的毫升比例大约在1∶2∶10∶6左右。

3.根据权利要求1所述的鉴别方法，其中在步骤(3)中，以DMSO-d₆作为内锁扫描32次，谱宽7251.6Hz，脉冲间隔为3.00s。

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