CN107782833B - 一种确定芪白平肺颗粒指纹图谱的方法及其指纹图谱 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种确定芪白平肺颗粒指纹图谱的方法及其指纹图谱，以甲醇溶液分别对芪白平肺颗粒样品和五味子醇甲进行提取，得到样品溶液和参照物溶液，以五味子醇甲、咖啡酸、阿魏酸、五味子甲素、五味子乙素、五味子酯甲为对照品，对样品溶液和参照物溶液进行高效液相色谱分析，得到其指纹图谱。利用本发明所提供的方法所建立的芪白平肺颗粒指纹图谱，能有效地表征芪白平肺颗粒的质量，有利于全面监控药材的质量。同时，本发明方法具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好等优点。该方法可快速、准确地鉴别产品的真伪优劣。
Description
技术领域
本发明属于中药质量鉴定技术领域，特别是涉及确定芪白平肺颗粒指纹图谱的方法，以及利用该方法建立的芪白平肺颗粒指纹图谱。
背景技术
中药指纹图谱是指某些中药材或中药制剂经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性。“整体性”和“模糊性”为其显著特点。
中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性。中药及其制剂均为多组分复杂体系，因此评价其质量应采用与之相适应的，能提供丰富鉴别信息的检测方法，建立中药指纹图谱将能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价。
中药及其制剂均为多组分复杂体系，因此评价其质量应采用与之相适应的，能提供丰富鉴别信息的检测方法，但现行的显微鉴别、理化鉴别和含量测定等方法都不足以解决这一问题，建立中药指纹图谱将能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价。这也正好符合中医药整体学说。在此基础上，如果进一步开展谱效学研究，可使中药质量与其药效真正结合起来，有助于阐明中药作用机理。总之，中药指纹图谱的研究和建立，对于提高中药质量，促进中药现代化具有重要意义。
芪白平肺颗粒是由人参、黄芪、五味子、川芎、薤白、葶苈子、地龙共七味药组成的中药复方制剂，具有补气，温阳，化瘀等功效，为治疗慢性阻塞性肺疾病(chronicobstructive pulmonary disease，COPD)的临床经验方，适用于COPD急性发作期及缓解期。目前关于该复方的中药指纹图谱未见报道。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种确定芪白平肺颗粒指纹图谱的方法。
本发明的第二目的是提供一种芪白平肺颗粒指纹图谱。
为了实现上述第一目的，本发明提供一种确定芪白平肺颗粒指纹图谱的方法，其包括以下步骤：
步骤1：用甲醇溶液分别对芪白平肺颗粒样品和五味子醇甲进行提取，得到样品溶液和参照物溶液；
步骤2：对样品溶液和参照物溶液进行高效液相色谱分析；分别精密吸取样品溶液与参照物溶液各10μl，注入液相色谱仪测定，记录100min图谱；
高效液相色谱条件如下：
色谱柱：选自Waters XBridge C18(4.6×250mm，5μm)、Phenomenex Luna C18(4.6×250mm，5μm)和Kromasil C18(4.6×250mm，5μm)任一种；
以甲醇为流动相A，以0.2％甲酸为流动相B，按如下条件进行梯度洗脱：时间0～100分钟，流动相A(％)5→95，流动相B(％)95→5；
理论板数按五味子醇甲峰计算不低于6000；
流速为0.8ml/min～1.2ml/min；
柱温为25℃～35℃；
检测波长为250nm。
具体地，在步骤1中，样品溶液制备具体过程：将芪白平肺颗粒研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇，超声提取或回流提取30min，放冷，摇匀，离心，取上清液，即得。
参照物溶液制备具体过程：精密称定五味子醇甲，加50％甲醇制成五味子醇甲溶液，即得。
步骤一选择用超声提取，提取溶剂体积为芪白平肺颗粒取样量12.5倍的50％甲醇。所述五味子醇甲溶液浓度为95.61μg·mL-1。
进一步地，所述高效液相色谱条件，流速选为1.0ml/min，柱温选为30℃。
进一步地，在得到的所述指纹图谱中，包括1-25号峰，其中，12号峰为咖啡酸，13号峰为阿魏酸，22号峰为五味子醇甲作为参照峰，23号峰为五味子酯甲，24号峰为五味子甲素，25号峰为五味子乙素，其相对保留时间分别为0.355～0.44、0.49～0.60、1.00、1.05～1.3、1.12～1.4、1.15～1.48。
具体地，咖啡酸、阿魏酸、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的相对峰面积分别为3.293～4.025、1.977～2.416、1.00、0.343～0.419、0.343～0.419、0.870～1.064、0.367～0.449。
进一步地，1号峰、2号峰、3号峰、4号峰、5号峰、6号峰、7号峰、8号峰、9号峰、10号峰、11号峰、14号峰、15号峰、16号 峰、17号峰、18号峰、19号峰、20号峰、21号峰，其相对保留时间分别为0.065～0.085、0.075～0.100、0.085～0.11、0.10～0.125、0.105～0.135、0.145～0.185、0.115～0.245、0.205～0.255、0.220～0.275、0.268～0.335、0.325～0.40、0.495～0.610、0.565～0.695、0.595～0.735、0.615～0.755、0.640～0.785、0.715～0.88、0.735～0.905、0.85～1.05。
具体地，1号峰、2号峰、3号峰、4号峰、5号峰、6号峰、7号峰、8号峰、9号峰、10号峰、11号峰、14号峰、15号峰、16号峰、17号峰、18号峰、19号峰、20号峰、21号峰，其相对峰面积分别为0.339～0.414、1.028～1.256、1.522～1.860、2.141～2.617、3.462～4.231、0.784～0.958、0.558～0.682、0.511～0.625、0.339～0.415、0.862～1.054、0.831～1.016、1.514～1.851、0.242～0.295、0.696～0.850、0.647～0.790、0.453～0.554、0.925～1.131、0.207～0.253、0.628～0.767。
本发明还提供了根据上述确定芪白平肺颗粒指纹图谱的方法所建立的芪白平肺颗粒的指纹图谱，其特征在于：
所述指纹图谱中，12号峰为咖啡酸，13号峰为阿魏酸，22号峰为五味子醇甲作为参照峰，23号峰为五味子酯甲，24号峰为五味子甲素，25号峰为五味子乙素，其相对保留时间分别为0.355～0.44、0.49～0.60、1.00、1.05～1.3、1.12～1.4、1.15～1.48；其相对峰面积分别为3.293～4.025、1.977～2.416、1.00、0.343～0.419、0.343～0.419、0.870～1.064、0.367～0.449。
进一步地，所述指纹图谱中，1号峰、2号峰、3号峰、4号峰、5号峰、6号峰、7号峰、8号峰、9号峰、10号峰、11号峰、14号峰、15号峰、16号峰、17号峰、18号峰、19号峰、20号峰、21号峰，其相对保留时间分别为0.065～0.085、0.075～0.100、0.085～0.11、0.10～0.125、0.105～0.135、0.145～0.185、0.115～0.245、0.205～0.255、0.220～0.275、0.268～0.335、0.325～0.40、0.495～0.610、0.565～0.695、0.595～0.735、0.615～0.755、0.640～0.785、0.715～0.88、0.735～0.905、0.85～1.05；其相对峰面积分别为0.339～0.414、1.028～1.256、1.522～1.860、2.141～2.617、3.462～4.231、0.784～0.958、0.558～0.682、0.511～0.625、0.339～0.415、0.862～1.054、0.831～1.016、1.514～1.851、0.242～0.295、0.696～0.850、0.647～0.790、0.453～0.554、0.925～1.131、0.207～0.253、0.628～0.767。
本发明的有益效果是：
1、用本发明所提供的方法所建立的芪白平肺颗粒指纹图谱，能有效地表征芪白平肺颗粒药物的质量，有利于全面监控药材的质量。
2、指纹图谱注重各个构成指纹特征峰的前后顺序和相互关系，注重整体面貌特征，既避免了因测定个别化学成分而判定芪白平肺颗粒整体质量的片面性，又减少了为质量达标而认为处理的可能性。
3、本发明方法具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好等优点。
4、该方法可快速、准确地鉴别产品的真伪优劣。
附图说明
图1为芪白平肺颗粒色谱柱选择指纹图谱；
图2为芪白平肺颗粒波长选择指纹图谱；
图3为不同柱温的考察；
图4为不同流速的考察；
图5为延长时间测试滞后峰图谱；
图6芪白平肺颗粒指纹图谱中色谱峰来源指认；
图7为芪白平肺颗粒指纹图谱中色谱峰的指认，
12.咖啡酸 13.阿魏酸 22.五味子醇甲 23.五味子酯甲 24.五味子甲素 25.五味子乙素；
图8为专属性试验图谱(A-不含川芎的阴性样品、B-不含五味子的阴性样品、C-混合对照品、D-供试品)；
图9为五味子醇甲标准曲线；
图10为咖啡酸标准曲线；
图11为阿魏酸标准曲线；
图12为五味子甲素标准曲线；
图13为五味子乙素标准曲线；
图14为五味子酯甲标准曲线；
图15为芪白平肺颗粒对照指纹图谱；
图16为芪白平肺颗粒指纹色谱图，
12.咖啡酸 13.阿魏酸 S.五味子醇甲 23.五味子酯甲 24.五味子甲素 25.五味子乙素。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
1指纹图谱和含量测定
1.1仪器与试药
Ultimate 3000HPLC，DAD紫外检测器(美国赛默飞世尔科技公司)；MettlerAE240电子分析天平(瑞士梅特勒公司)；Mettler XP6型电子分析天平(瑞士梅特勒公司)；Centrifuge 5415D高速离心机(德国Eeppendorf公司)；Milli-Q Academic纯水机(美国密理博公司)；KQ-250DB型超声波清洗仪(昆山超声仪器有限公司)。
五味子醇甲对照品(批号：110857-201513，含量以99.9％计)、咖啡酸对照品(批号：110885-200102)、阿魏酸对照品(批号：110773-201313，含量以99.6％计)、五味子甲素对照品(批号：110764-201513，含量以99.5％计)、五味子乙素对照品(批号：110765-201512，含量以99.0％计)、五味子酯甲(批号：111529-201505，含量以95.3％计)。甲醇(色谱纯，美国天地公司)，水为超纯水，其余试剂均为分析纯(南京化学试剂公司)。
1.2药品来源
本实验研究用芪白平肺颗粒由江苏康缘药业股份有限公司生产。1.3参照物的选择
芪白平肺颗粒指纹图谱为针对处方中五味子醇甲、咖啡酸、阿魏酸、五味子甲素、五味子乙素、五味子酯甲建立的指纹图谱，因此选择保留时间适中、分离较好的五味子醇甲作为参照物。
1.4色谱检测条件
(1)色谱柱的选择
比较了使用Waters XBridge C18(4.6×250mm，5μm)、Phenomenex Luna C18(4.6×250mm，5μm)和Kromasil C18(4.6×250mm，5μm)三种色谱柱对指纹图谱的影响，结果色谱柱变化对检测的6指标成分分离度和峰形无明显差异。结果见图1。
(2)检测波长的选择
通过DAD检测器在190～400nm范围进行全波长扫描，结果发现在250nm波长时，色谱峰多，可代表的信息较全面，色谱峰基线平稳且各色谱峰分离较好，因此选择250nm作为指纹图谱的采集波长同时作为五味子醇甲、咖啡酸、阿魏酸、五味子甲素、五味子乙素、五味子酯甲6个成分含量测定的波长。见图2。
(3)柱温的考察
试验比较了柱温为25℃、30℃、和35℃所得图谱，结果柱温变化对检测的6指标成分分离度和峰形无明显差异，结果见图3。
(4)流速的考察
比较了流速为0.8ml/min、1.0ml/min和1.2ml/min所得图谱，结果流速为1.0ml/min时所检测的6个指标成分分离度和峰形较好，结合指纹图谱中各共有峰的分离情况，选择流速为1.0ml/min，结果见图4。
(5)滞后峰测试
延长测试时间至120min，结果100min后无色谱峰，因此在芪白平肺颗粒指纹图谱测定时，色谱条件适宜，无滞后成分影响样品测定，结果见图5。
综上所述，确定芪白平肺颗粒指纹图谱和含量含量测定色谱条件 为：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，以0.2％甲酸为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱，流速为1.0ml·min-1；检测波长为250nm；柱温30℃，进样量10μL，理论板数按五味子醇甲峰计算不低于6000。
分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录100min图谱，即得。
1.5供试品溶液的制备
(1)提取方法的选择
取本品研细，取2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇25ml，分别超声提取和回流提取30min，放冷，摇匀，离心，取上清液，即得，6个指标成分以含量表示，结果见表1。
结果表明，回流提取与超声提取指标成分含量测定结果无明显差异，超声提取较为简单，因此本品指纹图谱及含量测定提取方法超声提取法。
表1 提取方式考察结果
(2)提取时间的选择
取本品研细，取2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇25ml，分别超声提取20min，30min和40min，放冷，摇匀，离心，取上清液，即得，6个指标成分以含量表示，结果见表2。
结果表明，提取时间为30min即可，故提取时间确定为30min。
表2 提取时间考察结果
(3)提取溶剂的选择
取本品研细，取2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入50％甲醇、甲醇、乙醇各25ml，超声提取30min，放冷，摇匀，离心，取上清液，即得，6个指标成分以含量表示，结果见表3。
结果表明，提取溶剂为50％甲醇，色谱峰较多，指标成分含量高，故提取溶剂为50％甲醇。
表3 提取溶剂考察结果
(4)提取溶剂用量的选择
取本品研细，取2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入50％甲醇、20ml，25ml，50ml超声提取30min，放冷，摇匀，离心，取上清液，即得，6个指标成分以含量表示，结果见表4。
结果表明，提取溶剂为25ml时已提取完全，故选择溶剂用量为25ml。
表4 提取溶剂用量考察结果
1.6相关性研究
通过与处方中的七味药材制备的样品图谱比较，结果显示1号峰来源于地龙，2、3号峰来源于地龙和人参，4号峰来源于人参、五味子和川芎，5号峰来源于人参、薤白、川芎和地龙，6、8、22、23、24、25号峰来源于五味子，7号峰来源于黄芪和五味子，9号峰来源于人参和薤白，10号峰来源于薤白和葶苈子，11、12、13、15、16号峰来源于川芎，14号峰来源于黄芪和葶苈子，17、18、19、20、21号峰来源于黄芪。见图6。
1.7色谱峰指认
用对照品进行对比，指认出12号峰为咖啡酸，13号峰为阿魏酸，22号峰为五味子醇甲，23号峰为五味子酯甲，24号峰为五味子甲素，25号峰为五味子乙素。见图7。
1.8专属性试验
由“1.6”可知6个指标成分来自于川芎和五味子，故分别取缺川芎和五味子的阴性样品按供试品溶液的制备方法制得阴性供试品溶液，按上述方法进行测定。结果阴性样品对本品中上述6个指标成分的含量测定无干扰，结果见图8。
1.9线性关系考察
精密称取五味子醇甲、咖啡酸、阿魏酸、五味子甲素、五味子乙素、五味子酯甲对照品适量，加50％甲醇制成含五味子醇甲95.61μg·mL-1、咖啡酸108.02μg·mL-1、阿魏酸115.33μg·mL-1、五味子甲素104.17μg·mL-1、五味子乙素92.45μg·mL-1、五味子酯甲89.77μg·mL-1的混合对照品溶液，将其作为母液用50％甲醇等比稀释，分别精密吸取10μl，注入液相色谱仪，测定，结果见表5-10。以对照品的峰面积为纵坐标(Y)，以对照品浓度为横坐标(X)进行线性拟合，绘制标准曲线，结果图9-14。各对照品线性范围、回归方程和相关系数见表11。
表5 五味子醇甲线性关系考察结果
表6 咖啡酸线性关系考察结果
表7 阿魏酸线性关系考察结果
表8 五味子甲素线性关系考察结果
表9 五味子乙素线性关系考察结果
表10 五味子酯甲线性关系考察结果
表11 各对照品线性范围、回归方程和相关系数
1.10精密度试验
(1)对照品溶液精密度试验
精密吸取同一混合对照品溶液(五味子醇甲11.95μg·mL-1、咖啡酸13.50μg·mL-1、阿魏酸14.42μg·mL-1、五味子甲素13.02μg·mL-1、五味子乙素11.56μg·mL-1、五味子酯甲11.22μg·mL-1)注入高效液相色谱仪，连续进样6次，测定其峰面积，结果表明精密度良好，见
表12。
表12 对照品溶液精密度考察结果
(2)样品精密度试验
取本品(批号为150301)，研细，取2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇25ml，超声提取30min，即得。注入高效液相色谱仪，连续进样6次，供试品溶液中各共有峰的相对保留时间见表13，6个指标成分峰面积结果见表14。又以第1次进样所得指纹图谱做为对照计算后5次进样所得指纹图谱的相似度，结果相似度均大于0.9。结果表明该方法精密度良好。
表13 样品精密度考察结果(共有峰的相对保留时间)
表14 五味子醇甲、咖啡酸、阿魏酸、五味子甲素、五味子乙素、五味子酯甲精密度考察结果
上述结果表明精密度良好。
1.11稳定性试验
(1)对照品溶液稳定性试验
精密吸取同一混合对照品溶液(五味子醇甲11.95μg·mL-1、咖啡酸13.50μg·mL-1、阿魏酸14.42μg·mL-1、五味子甲素13.02μg·mL-1、五味子乙素11.56μg·mL-1、五味子酯甲11.22μg·mL-1)，分别于0h、2h、6h、10h、14h、18h和24h注入高效液相色谱仪，记录其峰面积，结果表明对照品溶液室温放置24h内稳定性良好，见表15。
表15 对照品溶液稳定性考察结果
(2)供试品溶液稳定性试验
取本品(批号为150301)，研细，取2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇25ml，超声提取30min，即得。分别于0h、2h、6h、10h、14h、18h和24h注入高效液相色谱仪，记录其峰面积，供试品溶液中各共有峰的相对保留时间结果见表16，6个指标成分峰面积结果见表17。又以0小时进样所得指纹图谱为对照计算相似度，相似度结果均大于0.9，表明供试品溶液室温24小时内稳定性良好。
表16 样品稳定性考察结果(各共有峰的相对保留时间)
表17 五味子醇甲、咖啡酸、阿魏酸、五味子甲素、五味子乙素、五味子酯甲稳定性考察结果
1.12重复性试验
取批号为150301的芪白平肺颗粒，按上述供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，同法制备供试品溶液6份，依法测定，供试品溶液中各共有峰的相对保留时间结果见表18，6个指标成分含量结果见表19。又以第1份样品所得指纹图谱做为对照计算另5份样品所得指纹图谱的相似度，结果相似度均大于0.9。结果表明该方法重复性良好。
表18 样品重复性考察结果(各共有峰的相对保留时间)
表19 五味子醇甲、咖啡酸、阿魏酸、五味子甲素、五味子乙素、五味子酯甲重复性考察结果(mg/g)
根据以上方法学考察结果，芪白平肺颗粒指纹图谱及含量测定方法精密度、重复性、稳定性均较好。
1.13加样回收率试验
取同一供试品(批号150301)，研细，取1g，取9份，精密称定，置具塞锥形瓶中，3份一组，分别精密加入混合对照品溶液(五味子醇甲195.58μg·ml-1、咖啡酸417.35μg·ml-1、阿魏酸302.11μg·ml-1、五味子甲素209.64μg·ml-1、五味子乙素131.50μg·ml-1、五味子酯甲152.08μg·ml-1)0.8ml、1.0ml、1.2ml，精密加入50％甲醇25ml，超声提取30min，即得，注入高效液相色谱仪，计算回收率。结果表明该方法能准确测定样品中五味子醇甲、咖啡酸、阿魏酸、五味子甲素、五味子乙素、五味子酯甲的含量，见表20-25。
表20 五味子醇甲加样回收率试验结果
表21 咖啡酸加样回收率试验结果
表22 阿魏酸加样回收率试验结果
表23 五味子甲素加样回收率试验结果
表24 五味子乙素加样回收率试验结果
表25 五味子酯甲加样回收率试验结果
1.14样品含量测定
根据上述含量测定方法测定10批芪白平肺颗粒中上述6个成分的含量，结果见表26。
表26 10批芪白平肺颗粒含量测定结果(mg·g-1)
1.15芪白平肺颗粒指纹图谱检测及对照指纹图谱的获得
收集十批芪白平肺颗粒样品，按上述供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，依法测定，计算各共有峰的相对保留时间、主要峰的相对峰面积和相似度，结果见表27-29，用相似度软件以这十批样品指纹图谱为基础获得“共有模式”作为对照指纹图谱，见图15。
表27 芪白平肺颗粒指纹图谱样品测定结果(共有峰的相对保留时间)
表28 芪白平肺颗粒指纹图谱样品测定结果(主要色谱峰的相对峰面积)
表29 芪白平肺颗粒指纹图谱样品测定结果(相似度)
十批芪白平肺颗粒指纹图谱与对照指纹图谱计算相似度，其结果均大于0.90，暂定芪白平肺颗粒用芪白平肺颗粒指纹图谱与对照指纹图谱经相似度软件计算，相似度不得低于0.90。根据十批指纹图谱中各共有峰相对峰面积和相对保留时间，暂定本品指纹图谱中各共有峰相对峰面积和相对保留时间应符合表30的限度范围。
表30 各共有峰相对峰面积和相对保留时间限度范围
2.芪白平肺颗粒指纹图谱标准草案
【指纹图谱】取本品，照【含量测定】项下的方法试验，记录100min图谱。
本品指纹图谱的主要特征：
1.供试品指纹图谱与质量标准所附的对照指纹图谱经计算软件计算，相似度不得低于0.90。
2.供试品指纹图谱(图16)中25个共有峰，其中12号峰、13号峰、S峰、23号峰、24号峰和25号峰应分别与相应的参照物峰保留时间一致，以五味子醇甲参照物峰相应的峰为S峰，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积，应符合表31规定。注：计算软件为国家药典委员会提供中药色谱指纹图谱相似度评价系统。
表31 各共有峰相对峰面积和相对保留时间限度范围
【含量测定】照高效液相色谱法(2010年版中国药典一部附录ⅥD)测定。
色谱条件与系统适应性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，以0.2％甲酸为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱，流速为1.0ml·min-1；检测波长为250nm；柱温30℃，进样量10μL，理论板数按五味子醇甲峰计算不低于6000。
对照品溶液的制备 精密称定五味子醇甲、咖啡酸、阿魏酸、五味子甲素、五味子乙素、五味子酯甲对照品适量，加50％甲醇制成含五味子醇甲95.61μg·mL-1、咖啡酸108.02μg·mL-1、阿魏酸115.33μg·mL-1、五味子甲素104.17μg·mL-1、五味子乙素92.45μg·mL-1、五味子酯甲89.77μg·mL-1的混合对照品溶液，即得。
供试品溶液的制备 取装量差异项下本品，研细，取2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇25ml，超声提取30min，即得。
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
以上实施方式不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。
Claims (8)
1.一种确定芪白平肺颗粒指纹图谱的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤，
步骤1：用甲醇溶液分别对芪白平肺颗粒样品和五味子醇甲进行提取，得到样品溶液和参照物溶液；
步骤2：对样品溶液和参照物溶液进行高效液相色谱分析；分别精密吸取样品溶液与参照物溶液各10μl，注入液相色谱仪测定，记录100min指纹图谱；
高效液相色谱条件如下：
色谱柱：选自规格为4.6×250mm、5μm的Waters XBridge C18，规格为4.6×250mm、5μm的Phenomenex Luna C18和规格为4.6×250mm、5μm的Kromasil C18中的任一种；
以甲醇为流动相A，以0.2％甲酸为流动相B，按如下条件进行梯度洗脱：时间0～100分钟，流动相A(％)5→95，流动相B(％)95→5；
理论板数按五味子醇甲峰计算不低于6000；
流速为0.8ml/min～1.2ml/min；
柱温为25℃～35℃；
检测波长为250nm。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
在步骤1中，样品溶液制备具体过程：将芪白平肺颗粒研细，取本品适量，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入50％甲醇超声提取或回流提取30min，放冷，摇匀，离心，取上清液，即得；
参照物溶液制备具体过程：精密称定五味子醇甲，加50％甲醇制成五味子醇甲溶液。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤一选择用超声提取，提取溶剂体积为芪白平肺颗粒取样量12.5倍的50％甲醇；所述五味子醇甲溶液浓度为95.61μg·mL-1。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱条件中，流速选为1.0ml/min，柱温选为30℃。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，得到的所述指纹图谱包括1-25号峰，其中，12号峰为咖啡酸，13号峰为阿魏酸，22号峰为五味子醇甲作为参照峰，23号峰为五味子酯甲，24号峰为五味子甲素，25号峰为五味子乙素，其相对保留时间分别为0.355～0.44、0.49～0.60、1.00、1.05～1.3、1.12～1.4、1.15～1.48。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述咖啡酸、阿魏酸、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的相对峰面积分别为3.293～4.025、1.977～2.416、1.00、0.343～0.419、0.870～1.064、0.367～0.449。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在所述指纹图谱中，1号峰、2号峰、3号峰、4号峰、5号峰、6号峰、7号峰、8号峰、9号峰、10号峰、11号峰、14号峰、15号峰、16号峰、17号峰、18号峰、19号峰、20号峰、21号峰，其相对保留时间分别为0.065～0.085、0.075～0.100、0.085～0.11、0.10～0.125、0.105～0.135、0.145～0.185、0.115～0.245、0.205～0.255、0.220～0.275、0.268～0.335、0.325～0.40、0.495～0.610、0.565～0.695、0.595～0.735、0.615～0.755、0.640～0.785、0.715～0.88、0.735～0.905、0.85～1.05。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述1号峰、2号峰、3号峰、4号峰、5号峰、6号峰、7号峰、8号峰、9号峰、10号峰、11号峰、14号峰、15号峰、16号峰、17号峰、18号峰、19号峰、20号峰、21号峰，其相对峰面积分别为0.339～0.414、1.028～1.256、1.522～1.860、2.141～2.617、3.462～4.231、0.784～0.958、0.558～0.682、0.511～0.625、0.339～0.415、0.862～1.054、0.831～1.016、1.514～1.851、0.242～0.295、0.696～0.850、0.647～0.790、0.453～0.554、0.925～1.131、0.207～0.253、0.628～0.767。
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